Жидкая питательная среда для культивирования микроорганизмов при определении гентамицина и стрептомицина в лекарственных средствах и способ их определения турбидиметрическим методом

Группа изобретений относится к фармацевтической микробиологии, в частности, к количественному определению стрептомицина и гентамицина в лекарственных средствах. Предложен способ количественного определения гентамицина и стрептомицина в лекарственных средствах турбидиметрическим методом и жидкая питательная среда для культивирования микроорганизмов при количественном определении гентамицина и стрептомицина в лекарственных средствах. Предложена питательная среда для культивирования Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р и осуществления способа количественного определения стрептомицина и гентамицина. Способ предусматривает выращивание Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р в пробирках с питательной средой, содержащей панкреатический гидролизат казеина, гидролизат мяса ферментативный, дрожжевой экстракт, хлорид натрия, натрий фосфорнокислый 2-замещеный, калий фосфорнокислый 1-замещеный, 40 %-ный стерильный раствор глюкозы и дистиллированную воду в заданном количестве компонентов с добавлением испытуемого образца лекарственного средства и в пробирках с добавлением соответствующего ему стандартного образца в течение 4,5 ч. Затем определяют оптическую плотность при длине волны 530 нм с последующим определением гентамицина или стрептомицина путем сравнения степени угнетения роста бактериальной популяции в результате воздействия испытуемого образца лекарственного средства и стандартного образца. Предложенные изобретения позволяют повысить чувствительность метода и сократить длительность процесса определения гентамицина и стрептомицина. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 7 пр.

 

Группа изобретений относится к медицине и фармацевтической микробиологии, в частности к способам количественного определения гентамицина и стрептомицина в лекарственных средствах, а также к питательным средам для турбидиметрии, и может быть использована при определении активности лекарственных средств на основе гентамицина и стрептомицина как в процессе их производства для оценки качества при выпуске, так и в ходе их исследований с целью подтверждения соответствия требованиям нормативной документации.

Антибиотики являются одной из наиболее широко востребованных групп лекарственных средств, находящих применение в различных областях клинической медицины. Одной из первых групп антибиотиков, введенных в медицинскую практику, является группа аминогликозидов. Среди аминогликозидных антибиотиков к числу наиболее важных в практическом отношении относятся гентамицин и стрептомицин. Оценивая место и значение гентамицина и стрептомицина в современной антибиотикотерапии бактериальных инфекций, необходимо отметить, что лекарственные средства на их основе по-прежнему остаются препаратами выбора, предназначенными для лечения тяжелых форм инфекционно-воспалительных заболеваний, вызываемых чувствительными к ним микроорганизмами. Гентамицин чаще всего используют при инфекциях, вызываемых возбудителями, устойчивыми к другим антибиотикам широкого спектра действия. Комбинация гентамицина с β-лактамными и гликопептидными антибиотиками позволяет получить синергетический эффект и повышение бактерицидной активности против штаммов синегнойной палочки, энтеробактерий, фекальных стрептококков. Лекарственные препараты на основе гентамицина находят применение в офтальмологии (в виде глазных капель), эффективны при инфекционных поражениях мочевыводящей системы. Часто гентамицин применяют местно в форме крема или растворов для лечения инфицированных ран, ожогов и кожных повреждений. Лекарственные препараты на основе стрептомицина используют в комбинированной терапии туберкулеза. Стрептомицин обладает эффективным действием в отношении некоторых особо опасных высококонтагиозных моноинфекций (чума, туляремия, бруцеллез) [1, 2].

Вместе с тем, учитывая достаточно серьезные нежелательные реакции (ото- и нефротоксичность, нейромышечная блокада), которые могут возникнуть в результате передозировки гентамицина и стрептомицина, а также особую осторожность при использовании противомикробных препаратов из-за стремительного распространения антибиотикорезистентности микроорганизмов в результате применения некачественных антибиотиков и неизбирательного их использования, необходимо особое внимание уделять вопросам обеспечения качества антибактериальных препаратов [1]. Одним из основных показателей качества антибиотиков является их количественное определение.

В настоящее время известны различные методы количественного определения гентамицина и стрептомицина в лекарственных средствах на их основе: физико-химические методы - спектральные, хроматографические, электрохимические; биологические - метод диффузии в агар, метод серийных разведений, турбидиметрический метод.

Среди спектральных методов известен флуориметрический метод определения гентамицина в липосомальной форме. Способ основан на реакции между аминогруппой в молекуле гентамицина и о-фталевым альдегидом, протекающей в щелочной среде [3].

Известен способ количественного определения гентамицина в фармацевтических препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием с использованием для этих целей постколоночный синтез производных с о-фталевым альдегидом [4].

Известен спектрофотометрический способ определения стрептомицина в лекарственных препаратах с использованием цианоацетамида в аммиачной среде при 100°С. Диапазон определяемых концентраций составляет 8-80 мкг/мл [5].

Общим недостатком описанных физико-химических методов анализа при количественном определении гентамицина и стрептомицина, ввиду особенностей химического строения данных антибиотиков, является необходимость длительной пробоподготовки: проведение реакции дериватизации или различного вида обработки образцов с целью получения комплексных соединений или ассоциатов, а также использование токсичных растворителей. Кроме того, не всегда с их помощью можно определить истинное значение биологической активности антибиотика, порождая тем самым ложные выводы об эффективности антибактериальных препаратов. При незначительной деградации антибиотиков вследствие воздействия физических факторов (повышенная влажность, температура) снижение активности антибиотиков невозможно обнаружить химическими методами. В такой ситуации для количественного определения рекомендованы биологические методы, такие как метод диффузии в агар и турбидиметрический метод.

В Европейской и Американской фармакопеях применяются обе разновидности биологического метода. Однако в Европейской фармакопее описана только общая схема анализа количественного определения антибиотиков турбидиметрическим методом с указанием лишь тест-микроорганизма и питательной среды. А в Американской фармакопее приведена более подробная методика количественного определения антибиотиков турбидиметрическим методом, но включены не все антибиотики группы аминогликозидов (отсутствуют гентамицин, фрамицетин и др.).

Следует подчеркнуть, что для воспроизведения методики необходимо подробное описание условий проведения анализа с указанием не только тест-микроорганизма и питательной среды, но также обязательного приведения данных по количеству посевного материала, требуемого для инокуляции питательной среды, времени и температуры инкубации, растворителя, необходимого при подготовке фармакопейного стандартного образца и испытуемого лекарственного средства (т.е. соединения, в котором растворяется конкретный анализируемый антибиотик), и, что в особенности важно, диапазона концентраций, для которых зависимость «логарифм концентрации - ответ» является линейной. Линейный отклик обычно происходит в ограниченном диапазоне концентраций антибиотика и определенной фазе роста тест-микроорганизма (фаза логарифмического роста).

В отечественной фарамакопейной практике из биологических методов используется только метод диффузии в агар. В качестве ближайшего аналога (прототипа) выбран биологический способ количественного определения гентамицина в лекарственных средствах методом диффузии в агар. Сущность данного способа состоит в способности молекул гентамицина диффундировать в агаризованной питательной среде и образовывать зоны угнетения роста чувствительного к нему тест-микроорганизма Staphylococcus epidermidis АТСС 12228. При этом для количественного определения гентамицина используют 3×1 модель метода и готовят три концентрации стандартного образца и центральную концентрацию испытуемого образца. Чувствительность метода составляет 1 мкг/мл [6].

К недостаткам этого способа следует отнести: длительность проведения анализа (18-20 ч); трудоемкость; зависимость аналитического сигнала от свойств антибиотика (его растворимости, молекулярной массы и т.п.), не связанных с его активностью; чувствительность тест-культур к качеству используемого агара, что может негативно отразиться на результатах анализа (смена серии агара в питательной среде может привести к малым (по величине диаметра), нечетким, трудночитаемым или двойным зонам, а также к полному или частичному прекращению зонообразования) и потребовать дополнительной корректировки; сложность автоматизации.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) выбран биологический способ количественного определения стрептомицина в лекарственных средствах турбидиметрическим методом. Сущность данного способа состоит в способности стрептомицина в разной степени (в зависимости от концентрации стрептомицина) угнетать рост чувствительного к нему тест-микроорганизма Klebsiella pneumoniae АТСС 10031 в жидкой питательной среде. Недостатком рассматриваемого способа является не очень высокая чувствительность (7,5 мкг/мл). При этом для количественного определения стрептомицина используют стандартную кривую (5×1 модель метода) и готовят пять концентраций стандартного образца и центральную концентрацию испытуемого образца [7].

Необходимо отметить, что использование в рассматриваемых прототипах стандартной кривой (3×1 модель метода для гентамицина и 5×1 модель метода для стрептомицина) создает необходимость коррекции полученных данных, что делает расчеты сложными и создает предпосылки к возникновению ошибок, а также не дает информации о параллельности между прямой линией стандартного образца и прямой линией испытуемого образца (препарата), которая является важной с точки зрения получения более достоверных результатов [8].

В связи с этим, актуальной является разработка биологического экспрессного способа, позволяющего с высокой чувствительностью определять содержание как гентамицина, так и стрептомицина в лекарственных средствах.

Для разработки биологического способа прежде всего необходимо подобрать или разработать состав питательной среды, которая, с одной стороны, должна соответствовать питательным потребностям тест-микроорганизмов, обеспечивая их хороший рост, а с другой стороны, отвечать требованиям, предъявляемым к питательным средам в зависимости от выбранного метода определения биологической активности антибиотиков. Так, при проведении испытания методом диффузии в агар состав среды может оказывать влияние на диффузию антибиотика, а при использовании турбидиметрического метода существенное значение имеет цвет среды и ее прозрачность.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) заявляемого продукта выбрана питательная среда «С», описанная в Европейской фармакопее. Питательная среда «С» представляет собой жидкую питательную среду, содержащую в качестве белковой основы пептон (6 г/л) и мясной экстракт (1,5 г/л), углеводную основу в виде глюкозы (1 г/л) и дрожжевого экстракта (3,0 г/л), а также хлорид натрия (3,5 г/л), гидрофосфат калия (3,68 г/л), дигидрофосфат калия (1,32 г/л).

Недостатками питательной среды «С» являются:

1. Питательная среда в качестве белковой основы содержит пептон, однако не указано какой конкретно пептон необходимо использовать. А под пептонами подразумевается большое количество компонентов сред, отличающихся по составу и питательной ценности [9].

Предположительно в питательной среде «С», описанной в Европейской фармакопее, предложен пептон как перевар, полученный с применением пепсина, или сырья, содержащего пепсин. Недостатком таких пепсинных пептонов является неглубокий гидролиз белков, в результате которого образуются плохо усваиваемые микроорганизмами высокомолекулярные полипептиды.

2. Рассматриваемая в качестве прототипа среда содержит в своем составе дорогостоящий компонент импортного производства - мясной экстракт, недоступный широкой сети лабораторий, занимающихся стандартизацией и контролем качества лекарственных средств на основе антибиотиков.

В этой связи разработка недорогих стандартизованных по составу питательных сред, содержащих компоненты отечественного производства, для количественного определения как гентамицина, так и стрептомицина (антибиотиков группы аминогликозидов) турбидиметрическим методом, является актуальной.

Техническим результатом при реализации заявляемых изобретений является разработка состава жидкой питательной среды для культивирования микроорганизмов при количественном определении как гентамицина, так и стрептомицина в лекарственных средствах (далее - жидкая питательная среда для турбидиметрии) и способа их количественного определения турбидиметрическим методом, характеризующегося повышенной чувствительностью, сокращением длительности процесса количественного определения и экономических затрат.

При этом жидкая питательная среда отвечает всем требованиям, предъявляемым к средам для турбидиметрии, т.е. является прозрачной, не интенсивно окрашенной и способной обеспечить высокую скорость роста тест-микроорганизмов за счет присутствия в ней постоянного легкоусваиваемого аминокислотного состава и ростостимулирующих добавок.

Сущность изобретения в отношении заявляемого продукта заключается в том, что жидкая питательная среда для турбидиметрии в качестве питательной белковой основы содержит панкреатический гидролизат казеина (ПГК) и гидролизат мяса ферментативный (ГМФ), а также стимулирующую рост тест-микроорганизмов добавку - дрожжевой экстракт, в следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Панкреатический гидролизат казеина	6,0
Гидролизат мяса ферментативный	1,5

Дрожжевой экстракт

1,5

Хлорид натрия	3,5
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный	3,68
Калий фосфорнокислый 1-замещенный	1,32
Дистиллированная вода	до 1 л

Дополнительно в состав питательной среды для турбидиметрии введена глюкоза (стерильный 40% раствор) в соотношении 1:400.

В состав разработанной жидкой питательной среды для турбидиметрии включены все ингредиенты, способствующие удовлетворению питательных потребностей тест-микроорганизмов.

В заявляемой жидкой питательной среде для турбидиметрии в качестве основного источника белка используется ПГК. ПГК получают в процессе ферментативного гидролиза из казеина, отличающегося от других источников белка (например, мясной ткани) постоянством состава и содержанием всех основных аминокислот и витаминов.

В качестве источника углеводов в заявляемую жидкую питательную среду для турбидиметрии добавляют глюкозу (1,0 г/л) и дрожжевой экстракт (1,5 г/л). Дрожжевой экстракт дополнительно является источником витаминов, макро- и микроэлементов.

Данные, приведенные в Таблице 1, подтверждают, что состав заявляемой жидкой питательной среды для турбидиметрии достаточен для удовлетворения функции энергообеспечения и роста микробной популяции.

Заявляемое содержание дрожжевого экстракта приводит к удешевлению среды по сравнению с прототипом, так как в прототипе рассматриваемый компонент используется в количестве 3 г/л.

Включение в состав среды фосфатного буфера (натрий фосфорнокислый 2-замещенный, калий фосфорнокислый 1-замещенный) обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении подобных питательных сред, способных обеспечить достаточную буферную емкость в физиологически важном диапазоне рН.

Для большинства микроорганизмов оптимальной является питательная среда, соответствующая 0,5% раствору натрия хлорида. Для достижения такого результата в среду добавляют хлорид натрия в количестве 3,5 г/л.

Жидкую питательную среду для турбидиметрии готовят следующим образом.

Взвешивают все ингредиенты в приведенном выше соотношении и растворяют в дистиллированной воде. Полученный раствор кипятят до полного растворения ингредиентов и устанавливают рН 7,2±0,2 с помощью 20% раствора натрия гидроксида. Для достижения прозрачности жидкую питательную среду подвергают фильтрованию. В результате процесса фильтрации решаются одновременно несколько принципиально важных технологических задач: непосредственная фильтрация питательной среды и ее осветление. Фильтруют жидкую питательную среду через фильтрующую ткань (шелк), предварительно смоченную горячей дистиллированной водой, достигая таким приемом сокращения времени фильтрации и уменьшения потери среды. Сверху фильтровальной ткани, сложенной в виде конуса, укладывают шестислойный фильтр из бумаги. После фильтрации полученной среды перед ее розливом, в случае необходимости, проводят коррекцию рН. Готовую среду разливают в 0,25 л бутылки по 100,0±10,0 мл и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С и давлении 0,11±0,01 МПа в течение 15 мин.

Раствор глюкозы готовят и стерилизуют отдельно и вносят в стерильную жидкую питательную среду перед посевом инокулята для избежания карамелизации глюкозы и приобретения средой темной окраски, а также снижения уровня рН:

глюкоза	40 г
дистиллированная вода	до 100 мл

Далее смешивают стерильные растворы, добавляя к 1000 мл стерильной жидкой питательной среды 2,5 мл стерильного 40% раствора глюкозы.

Заявляемую жидкую питательную среду для турбидиметрии оценивают по биологическим показателям (чувствительность, характер роста и стабильность морфологических признаков микроорганизмов) (Таблица 1) и по физико-химическим показателям (Таблица 2) в соответствии с МУК 4.2.2316-08 [10].

При определении биологических показателей жидкой питательной среды для турбидиметрии используют суточные культуры тест-микроорганизмов, выращенные в соответствии с рекомендациями, изложенными в паспортах штаммов. Взвесь тест-микроорганизмов для посева готовят в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида, используя отраслевой стандартный образец мутности 42-28-85-П ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Затем серийными десятикратными разведениями в том же растворе, перенося 0,5 мл взвеси каждого тест-микроорганизма в пробирки, содержащие 4,5 мл раствора, доводят до разведения 10^-7, тщательно перемешивая взвесь и меняя пипетку после каждого разведения. Из данного разведения взвеси тест-микроорганизмов высевают по 0,1 мл стерильной бактериологической пипеткой в 3 пробирки с жидкой питательной средой для турбидиметрии. Выращивание производят при 37±1°С до появления визуально определяемого роста. Экспериментальные данные представлены в Примерах 1, 2.

Таким образом, разработанная жидкая питательная среда для турбидиметрии может использоваться для культивирования микроорганизмов, используемых в качестве тест-штаммов в биологических методах анализа.

Преимуществом данной жидкой питательной среды является ее светлая окраска, прозрачность, высокая чувствительность, характеризующая ее питательные ценности, простота приготовления, невысокая стоимость, благодаря использованию компонентов только отечественного производства.

Сущность изобретения в отношении заявляемого способа количественного определения как гентамицина, так и стрептомицина в лекарственных средствах заключается в том, что в способе применяется турбидиметрический метод и используется разработанная жидкая питательная среда. Количественное содержание как гентамицина, так и стрептомицина определяют турбидиметрическим методом с использованием 3×3 модели параллельных линий путем сравнения степени угнетения роста бактериальной популяции тест-микроорганизма S. aureus АТСС 6538 Р в разработанной жидкой питательной среде для турбидиметрии в результате воздействия испытуемого образца и стандартного образца фармакопейного качества в определенных концентрациях.

В заявляемом изобретении способ определения гентамицина и стрептомицина турбидиметрическим методом реализуется следующим образом.

Пробоподготовка

В зависимости от выбранного аттестованного стандартного образца фармакопейного качества (далее - стандартный образец) и его биологической активности (выраженной в мкг/мг для USP RS или IU/vial для EPCRS) готовят основной раствор стандартного образца из расчета 1 мг/мл, используя стерильный растворитель (буферный раствор, рН 8,0) следующего состава, г/л:

Натрий фосфорнокислый 2-замещенный	10,99
Калий фосфорнокислый 1-замещенный	0,68
Дистиллированная вода	до 1 л

Концентрация (активность) основного раствора стандартного образца будет выражаться далее в IU/мл или в мкг/мл.

Из основного раствора стандартного образца путем разведения готовят рабочие растворы стандартного образца С₁, С₂, С₃ необходимой концентрации.

Готовят основной раствор испытуемого образца таким образом, чтобы его активность была близка к активности основного раствора стандартного образца. Затем готовят рабочие растворы испытуемого образца Т₁, Т₂, Т₃ необходимой концентрации, учитывая, что они должны быть близки к концентрациям рабочих растворов стандартного образца С₁, С₂, С₃.

Для приготовления основных и рабочих растворов испытуемого образца используют стерильный растворитель (буферный раствор, рН 8,0) того же состава.

В заявляемом изобретении тест-микроорганизм S. aureus АТСС 6538 Р инкубируют в заявляемой жидкой питательной среде для турбидиметрии при 37±1°С в течении 24 ч. В день испытания полученную культуру разбавляют для достижения мутности суспензии 25±2% (коэффициент пропускания) с использованием спектрофотометра при длине волны 580 нм. Полученную суспензию используют в качестве посевного материала. На каждые 1000 мл жидкой питательной среды прибавляют 10 мл посевного материала. Затем 9 мл инокулированной среды вносят в пробирку объемом 20 мл и добавляют 1 мл рабочего раствора стандартного образца с соответствующей концентрацией (для гентамицина C₁=0,67, С₂=1 и С₃=1,5 мкг/мл; для стрептомицина C₁=3,75, С₂=5,63 и С₃=8,43 мкг/мл) или 1 мл рабочего раствора испытуемого образца с соответствующей приблизительной концентрацией (для гентамицина T₁=0,67, Т₂=1 и Т₃=1,5 мкг/мл; для стрептомицина Т₁=3,75, Т₂=5,63 и Т₃=8,43 мкг/мл).

Одновременно готовят отрицательный контроль (9 мл стерильной питательной среды для турбидиметрии и 1 мл буферного раствора, рН 8,0) и положительный контроль (9 мл инокулированной среды и 1 мл буферного раствора, рН 8,0). Контрольные пробирки используют для настройки спектрофотометра и контроля роста тест-микроорганизма.

Для каждой концентрации рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов используют 6 повторностей. Все пробирки (18 пробирок, содержащие рабочие растворы стандартного образца; 18 пробирок, содержащие рабочие растворы испытуемого образца, а также положительный контроль) инкубируют при 37±1°С в течение 4,5 ч.

После завершения процесса инкубации размножение микроорганизмов останавливают добавлением 0,5 мл 12%-ного раствора формальдегида в каждую из пробирок, в том числе с положительными и отрицательными контролями. Оптическую плотность взвеси тест-микроорганизма S. aureus АТСС 6538 Р во всех пробирках определяют при длине волны 530 нм.

Расчет биологической активности как гентамицина, так и стрептомицина основан на линейной зависимости степени угнетения роста бактериальной популяции в зависимости от логарифма концентрации. Эту связь отражает уравнение линейной регрессии:

у=а+b*х,

где а - свободный член линейной регрессии;

b - угловой коэффициент линейной регрессии;

х - логарифм концентрации.

Определение биологической активности при использовании 3×3 модели параллельных линий проводят путем сравнения линий дозозависимости стандартного и испытуемого образцов (т.е. сравнения степени угнетения роста бактериальной популяции в результате воздействия испытуемого образца и стандартного образца в определенных концентрациях).

После измерения оптической плотности взвеси тест-микроорганизма S. aureus АТСС 6538 Р рассчитывают следующие вспомогательные характеристики:

1. Суммы оптической плотности взвеси тест-микроорганизма S. aureus АТСС 6538 Р по каждой из концентраций и по всем концентрациям стандартного и испытуемого образцов:

S₁, S₂ и S₃ - суммарные ответы на малую, среднюю и большую концентрацию стандартного образца;

U₁, U₂ и U₃ - суммарные ответы на малую, среднюю и большую концентрацию испытуемого образца;

S=S₁+S₂+S₃ - суммарный ответ на стандартный образец;

U=U₁+U₂₊U₃ - суммарный ответ на испытуемый образец.

2. Среднюю оптическую плотность взвеси тест-микроорганизма S. aureus АТСС 6538 Р стандартного и испытуемого образцов:

где n - число ответов в группе;

3. Линейные контрасты для стандартного и испытуемого образцов:

L_S=S₃-S₁; L_U=U₃-U₁

Если через I обозначить десятичный логарифм знаменателя прогрессии разведения, то угловой коэффициент линейной регрессии для стандартного и испытуемого образцов при условии их параллельности рассчитывается по формуле:

b=L_S+L_U/4nI

где - величина, на которую найденная биологическая активность испытуемого образца отличается от его ожидаемой биологической активности (в логарифмическом виде);

где M_U - десятичный логарифм биологической активности испытуемого образца;

A_U - ожидаемая биологическая активность испытуемого образца.

Тогда найденная биологическая активность испытуемого образца R_U=10^Mu.

Математическую и статистическую обработку результатов осуществляют с применением дисперсионного анализа в соответствии с существующими рекомендациями [6].

Проводя оценку достоверности значений, полученных при количественном определении как гентамицина, так и стрептомицина турбидиметрическим методом с использованием 3×3 модели параллельных линий, необходимо учитывать, что взаимосвязь между логарифмом доз и оптической плотностью взвеси тест-микроорганизма S. aureus АТСС 6538 Р должна быть представлена в виде прямой линии во всем диапазоне исследованных концентраций; прямая линия испытуемого образца должна быть параллельна соответствующей прямой линии стандартного образца (Фиг. 1, 2).

Существенные отличительные признаки заявляемой группы изобретений:

1) Жидкая питательная среда для культивирования микроорганизмов при количественном определении как гентамицина, так и стрептомицина в лекарственных средствах турбидиметрическим методом является прозрачной, не интенсивно окрашенной (что достигается использованием приема раздельной стерилизации раствора глюкозы и других основных ингредиентов заявляемой питательной среды) и способной обеспечить хорошие условия для быстрого роста тест-микроорганизмов за счет высокопитательного состава (присутствия постоянного легкоусваиваемого аминокислотного состава и ростостимулирующих добавок).

2) Количественное определение как гентамицина, так и стрептомицина проводят турбидиметрическим (биологическим) методом, позволяющим получить данные об их количественном содержании в лекарственных средствах, в том числе и в случае возможного снижения их активности, которое не может быть определено химическими и физико-химическими методами (при изменении под воздействием разнообразных физических факторов).

3) Способ прост, чувствителен по сравнению с прототипами (позволяет определять гентамицин в лекарственных средствах на существенно низком уровне - 0,67 мкг/мл; стрептомицин - 3,75 мкг/мл), экономичен (за счет уменьшения затрат на приготовление жидкой питательной среды для турбидиметрии и термостатирование), экспрессен (позволяет получить данные по количественному содержанию как гентамицина, так и стрептомицина в лекарственных средствах на его основе в течение 4-5 ч благодаря использованию высокопитательной по составу разработанной жидкой питательной среды для турбидиметрии и предварительного выращивания в ней тест-микроорганизма, что позволяет уменьшить лаг-фазу и оптимизировать время инкубации).

4) Способ количественного определения как гентамицина, так и стрептомицина в лекарственных средствах турбидиметрическим методом обеспечивает объективность и точность (за счет инструментального способа регистрации аналитического сигнала с помощью спектрофотометра), а также возможность выполнения статистической обработки данных.

5) Способ может быть легко автоматизирован с использованием современного инструментального оборудования с компьютерным управлением и обработкой результатов с помощью программных обеспечений Microsoft Office Excel и CombiStats, version 5.0.

6) Способ может быть использован для количественного определения гентамицина в разных лекарственных формах (раствор для инъекций, капли глазные, крем для наружного применения).

7) Способ может быть использован для количественного определения стрептомицина в лекарственной форме - порошок.

Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1-2):

Фиг. 1. Зависимость оптической плотности взвеси тест-микроорганизма S. aureus АТСС 6538 Р от концентрации гентамицина.

Фиг. 2. Зависимость оптической плотности взвеси тест-микроорганизма S. aureus АТСС 6538 Р от концентрации стрептомицина.

Возможность применения группы изобретений показана следующими примерами:

Пример 1. Рост грамположительных тест-микроорганизмов S. aureus АТСС 6538 Р и S. epidermidis АТСС 12228 в заявляемой жидкой питательной среде для турбидиметрии.

S. aureus АТСС 6538 Р выращивают в жидкой питательной среде. При этом у тест-микроорганизма сохраняется стабильность основных биологических свойств: культуральных (равномерное помутнение среды без образования пленки и осадка), морфологических (грамположительные кокки в виде гроздей), биохимических (оксидазоотрицательны, каталазоположительны). Чувствительность среды составляет 10^-7.

S. epidermidis АТСС 12228 выращивают в жидкой питательной среде. При этом у тест-микроорганизма наблюдается рост в виде равномерного помутнения среды, однако менее интенсивный по сравнению со S. aureus АТСС 6538 Р. Последнее может быть связано с более длительной лаг-фазой S. epidermidis АТСС 12228, так как он метаболически менее активен.

Пример 2. Рост грамотрицательных тест-микроорганизмов K. pneumoniae АТСС 13883 и Е. coli АТСС 8739 в заявляемой жидкой питательной среде для турбидиметрии.

K. pneumoniae АТСС 13883 выращивают в жидкой питательной среде. У используемого тест-микроорганизма сохраняется стабильность основных биологических свойств: культуральных (равномерное помутнение среды без образования пленки и осадка), морфологических (грамотрицательные неподвижные палочки), биохимических (оксидазоотрицательны, каталазоположительны). Чувствительность среды составляет 10^-7.

E. coli АТСС 8739 выращивают в жидкой питательной среде. У используемого тест-микроорганизма сохраняется стабильность основных биологических свойств: культуральных (равномерное помутнение среды без образования пленки и осадка), морфологических (грамотрицательные палочки), биохимических (оксидазоотрицательны, каталазоположительны). Чувствительность среды составляет 10^-7.

Таким образом, Примеры 1 и 2 показывают, что разработанная жидкая питательная среда может использоваться для культивирования микроорганизмов, используемых в качестве тест-штаммов при турбидиметрическом методе анализа.

Пример 3. Количественное определение гентамицина в растворе для внутривенного и внутримышечного введения (40 мг/мл) турбидиметрическим методом с использованием 3×3 модели параллельных линий и заявляемой жидкой питательной среды для турбидиметрии.

Жидкую питательную среду и растворитель (буферный раствор, рН 8,0) готовят в соответствии с описанием изобретения.

Приготовление основного и рабочих растворов стандартного образца.

Содержимое флакона (17352 IU/vial, 25 мг) стандартного образца (EPCRS) гентамицина сульфата растворяют в 25 мл буферного раствора, рН 8,0 и получают основной раствор стандартного образца с концентрацией (активность) гентамицина 694,08 IU/мл (что соответствует 694,08 мкг/мл) количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0 (основной раствор стандартного образца гентамицина с концентрацией 347,04 мкг/мл). 14,41 мл основного раствора стандартного образца гентамицина с концентрацией 347,04 мкг/мл переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0 (основной раствор стандартного образца гентамицина с концентрацией 100 мкг/мл).

Рабочие растворы стандартного образца:

С₁ (0,67 мкг/мл) - 0,67 мл основного раствора стандартного образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

С₂ (1,0 мкг/мл) - 1,0 мл основного раствора стандартного образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

С₃ (1,5 мкг/мл) - 1,5 мл основного раствора стандартного образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Приготовление основного и рабочих растворов испытуемого образца (из 5 ампул):

Перемешивают содержимое 5 ампул. 1 мл испытуемого образца помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0 (основной раствор испытуемого образца с предполагаемой концентрацией 400 мкг/мл). 12,5 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 400 мкг/мл помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0 (основной раствор испытуемого образца с концентрацией 100 мкг/мл).

Рабочие растворы испытуемого образца:

Т₁ (0,67 мкг/мл) - 0,67 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Т₂ (1,0 мкг/мл) - 1,0 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Т₃ (1,5 мкг/мл) - 1,5 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Испытание и расчет результатов проводят в соответствии с описанием изобретения.

Результат испытания: среднее содержание гентамицина в лекарственном препарате - 39,16 мг/мл.

Пример 4. Количественное определение гентамицина в глазных каплях (3 мг/мл) турбидиметрическим методом с использованием 3×3 модели параллельных линий и заявляемой жидкой питательной среды для турбидиметрии.

Жидкую питательную среду и растворитель (буферный раствор, рН 8,0) готовят в соответствии с описанием изобретения.

Приготовление основного и рабочих растворов стандартного образца проводят так же, как и в Примере 3.

Приготовление основного и рабочих растворов испытуемого образца (из 5 флаконов-капельниц):

Перемешивают содержимое 5 флаконов-капельниц. 1,67 мл испытуемого образца помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0 (основной раствор испытуемого образца с предполагаемой концентрацией 100 мкг/мл).

Рабочие растворы испытуемого образца:

T₁ (0,67 мкг/мл) - 0,67 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Т₂ (1,0 мкг/мл) - 1,0 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Т₃ (1,5 мкг/мл) - 1,5 мл основного раствора испытуемого образцах концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Испытание и расчет результатов проводят в соответствии с описанием изобретения.

Результат испытания: среднее содержание гентамицина в лекарственном препарате - 2,9 мг/мл.

Пример 5. Количественное определение гентамицина в креме для наружного применения (0,1%, что соответствует 1 мг гентамицина в 1 г препарата) турбидиметрическим методом с использованием 3×3 модели параллельных линий и заявляемой жидкой питательной среды для турбидиметрии.

Жидкую питательную среду и растворитель (буферный раствор, рН 8,0) готовят в соответствии с описанием изобретения.

Приготовление основного и рабочих растворов стандартного образца проводят так же, как и в Примере 3.

Приготовление основного и рабочих растворов испытуемого образца (из 5 туб):

Точную навеску испытуемого образца (1,00000 г) помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл, добавляют 1 мл спирта этилового 96%, помещают на водяную баню с температурой 40°С и тщательно перемешивают до растворения основы и образования однородной эмульсии. Полученную смесь количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл посредством 3 порций растворителя (буферный раствор, рН 8,0), предварительно профильтровав каждую порцию раствора через бумажный фильтр. Объем раствора в мерной колбе доводят до метки буферным раствором, рН 8,0 (основной раствор испытуемого образца с предполагаемой концентрацией 20 мкг/мл).

Рабочие растворы испытуемого образца:

T₁ (0,67 мкг/мл) - 0,67 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 20 мкг/мл помещают в мерную колбу на 20 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Т₂ (1,0 мкг/мл) - 1,0 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 20 мкг/мл помещают в мерную колбу на 20 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Т₃ (1,5 мкг/мл) - 1,5 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 20 мкг/мл помещают в мерную колбу на 20 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Испытание и расчет результатов проводят в соответствии с описанием изобретения.

Результат испытания: среднее содержание гентамицина в 1 г лекарственного препарата - 0,97 мг.

Примеры 3, 4 и 5 показывают возможность применения заявляемых жидкой питательной среды и способа для количественного определения гентамицина в лекарственных средствах турбидиметрическим методом.

Пример 6. Количественное определение стрептомицина (не менее 730 мкг в пересчете на сухое вещество) в порошке для приготовления раствора для внутримышечного введения турбидиметрическим методом с использованием 3×3 модели параллельных линий и заявляемой жидкой питательной среды для турбидиметрии.

Жидкую питательную среду и растворитель (буферный раствор, рН 8,0) готовят в соответствии с описанием изобретения.

Приготовление основного и рабочих растворов стандартного образца.

Около 26 мг (точная навеска) стандартного образца (USP RS с активностью 754 мкг/мг) стрептомицина сульфата растворяют в 20 мл буферного раствора, рН 8,0 и получают основной раствор стандартного образца с концентрацией (активность) стрептомицина 980,02 мкг/мл. Затем 10,2 мл переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0 (основной раствор стандартного образца стрептомицина с концентрацией 100 мкг/мл).

Рабочие растворы стандартного образца:

C₁ (3,75 мкг/мл) - 3,75 мл основного раствора стандартного образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

С₂ (5,63 мкг/мл) - 5,63 мл основного раствора стандартного образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

С₃ (8,43 мкг/мл) - 8,43 мл основного раствора стандартного образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Приготовление основного и рабочих растворов испытуемого образца (из 5 флаконов):

Около 26 мг (точная навеска) испытуемого образца (с предполагаемой активностью 765 мкг/мг) стрептомицина сульфата растворяют в 20 мл буферного раствора, рН 8,0 и получают основной раствор стандартного образца с концентрацией (активность) стрептомицина 994,5 мкг/мл. Затем 10,1 мл переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0 (основной раствор испытуемого образца стрептомицина с предполагаемой концентрацией 100 мкг/мл).

Рабочие растворы испытуемого образца:

Т₁ (3,75 мкг/мл) - 3,75 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Т₂ (5,63 мкг/мл) - 5,63 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Т₃ (8,43 мкг/мл) - 8,43 мл основного раствора испытуемого образца с концентрацией 100 мкг/мл помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки буферным раствором, рН 8,0.

Испытание и расчет результатов проводят в соответствии с описанием изобретения.

Результат испытания: содержание стрептомицина в лекарственном препарате в пересчете на сухое вещество - 753 мкг/мг.

Пример 6 показывает возможность применения заявляемых жидкой питательной среды и способа для количественного определения стрептомицина в лекарственных средствах турбидиметрическим методом.

Пример 7. Оценка чувствительности и экспрессности способа, а также подтверждение того, что заявляемый способ количественного определения как гентамицина, так и стрептомицина в лекарственных средствах турбидиметрическим методом с использованием разработанной жидкой питательной среды обеспечивает получение достоверных результатов.

Результаты проведенного дисперсионного анализа данных, полученных в Примерах 3 и 6, подтверждают правильность полученных данных: значительную регрессию (р<0,01), характеризующую статистическую значимость дозозависимости, параллельность двух линий регрессии («Параллельность»), линейность дозозависимости («Линейность», «Квадратичность» и «Разность квадратичностей») (Таблицы 3, 4).

Сравнительная оценка чувствительности и времени, затраченного на проведение анализа при количественном определении гентамицина и стрептомицина в лекарственных средствах с помощью прототипов и заявляемого способа (Таблица 5), показывает преимущество последнего в отношении рассматриваемых характеристик.

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации.

Фиг. 1. Зависимость оптической плотности взвеси тест-микроорганизма S. aureus АТСС 6538 Р от концентрации гентамицина

Примечание. Уравнения линейной регрессии и значения коэффициентов детерминации:

у=-1,0466х+0,3968; R²=0,9984 для стандартного образца;

у=-0,9898х+0,4074; R²=1 для испытуемого образца.

Фиг. 2. Зависимость оптической плотности взвеси тест-микроорганизма S. aureus АТСС 6538 Р от концентрации стрептомицина

Примечание. Уравнения линейной регрессии и значения коэффициентов детерминации:

у=-0,7737х+1,1827; R²=0,9959 для стандартного образца;

у=-0,7717х+1,1887; R²=0,9982 для испытуемого образца.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Vakulenko S., Mobashery S. Versatility of Aminoglycosides and Prospects for Their Future. Clinical Microbiology Reviews. 2003. V. 16(3). P. 430-150.

2. Навашин С.М., Фомина И.П., Сазыкин Ю.О. Антибиотики группы амииогликозидов. М.: Медицина, 1977.

3. Gubernator J. et al. A simply and sensitive fluorometric method for determination of gentamicin in liposomal suspension. Int. J. Pharm. 2006. V. 327. P. 104-109.

4. Fabre H. et al. Determination of aminoglicosides in pharmaceutical formulations - II. High-performance liquid chromatography. J. Pharm. Biomed. Anal. 1989. V. 7(12). P. 1711-1718.

5. Zakhari N.A. Spectrophotometric assay of certain aminoglycosides using cyanoacetamide. Analytical letters. 1990. V. 23(10). P. 1843-1856.

6. Lourenco F.R. et al. Comparison of three experimental designs employed in gentamicin microbiological assay through agar diffusion. Braz. J. Pharm. Sci. 2009. V. 45(3). P. 559-566.

7. United States Pharmacopoeia USP 38-NF33. 2015. 5089 p.

8. ОФС.1.1.0014.15 «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами». Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.

9. Дятлов И.А., Кутырев В.В., Храмов М.В. Питательные среды для выделения, культивирования и идентификации возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы. М., 2012.

10. МУК 4.2.2316-08. Методы контроля бактериологических питательных сред. М.: Роспотребнадзор, 2008.

1. Жидкая питательная среда для культивирования микроорганизмов при количественном определении гентамицина или стрептомицина в лекарственных средствах турбидиметрическим методом, содержащая в качестве питательной белковой основы панкреатический гидролизат казеина и гидролизат мяса ферментативный, в качестве стимулирующих рост тест-микроорганизмов добавок дрожжевой экстракт и глюкозу при следующем соотношении компонентов:

панкреатический гидролизат казеина	6,0 г/л
гидролизат мяса ферментативный	1,5 г/л
дрожжевой экстракт	1,5 г/л
хлорид натрия	3,5 г/л
натрий фосфорнокислый 2-замещенный	3,68 г/л
калий фосфорнокислый 1-замещенный	1,32 г/л
дистиллированная вода	до 1 л
глюкоза, стерильный 40% раствор	2,5 мл.

2. Способ количественного определения гентамицина или стрептомицина в лекарственных средствах турбидиметрическим методом с использованием жидкой питательной среды по п. 1, предусматривающий выращивание в этой питательной среде тест-микроорганизма Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р в пробирках с добавлением испытуемого образца лекарственного средства и в пробирках с добавлением соответствующего ему стандартного образца в течение 4,5 ч при 37±1°С, определение оптической плотности взвеси тест-микроорганизма Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р во всех пробирках при длине волны 530 нм с последующим определением количества гентамицина или стрептомицина путем сравнения степени угнетения роста бактериальной популяции тест-микроорганизма Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р в результате воздействия испытуемого образца лекарственного средства и стандартного образца.