Штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol. для получения биомассы клеток

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой Штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol., полученный в условиях in vitro, идентифицированный и депонированный во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институте физиологии растений РАН, регистрационный номер 96. Штамм используется для получения биомассы клеток Phlojodicarpus sibiricus и отличается наличием как рыхлых, так и плотных участков ткани, окраской каллусов преимущественно бело-желтого цвета, причем, в процессе культивирования наблюдается появление коричневых участков каллусной ткани. Жизнеспособность клеток в течение цикла составляет не ниже 70 %. 3 ил., 1 табл.

 

Штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol. для получения биомассы клеток

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, культивированию клеток растения вздутоплодника сибирского и может быть использовано для получения биомассы клеток Phlojodicarpus sibiricus.

Вздутоплодник сибирский зарегистрирован в Государственном Реестре лекарственных средств РФ в качестве лекарственного растительного сырья. Корневища и корни вздутоплодника сибирского обладают вазодилатирующими (сосудорасширяющими), гипотензивными, адренолитическими и спазмолитическими свойствами и использовались при производстве препаратов спазмолитического действия «Димидин» и «Фловерин», а также комплексного препарата сердечно-сосудистого действия «Сафинор». В настоящее время производство названных препаратов приостановлено из-за отсутствия сырья. В свою очередь, вздутоплодник сибирский занесен в Красную книгу Якутии. Заготовка его в природе может привести к уничтожению природных популяций.

Из литературы также известно, что корни растения вздутоплодника накапливают тяжелые металлы: цинк, никель, селен и молибден, соответственно, использование растений, произрастающих на не контролируемых участках, может нести большой риск для здоровья человека (см. Алексеева С.И. Перспективы получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского // Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты: Годичное собрание ОФР, науч. конф. и школа для мол. уч., 18-24 сент. 2017 г., Судак: сб. мат. докл. / Отв. ред. Вл.В. Кузнецов – М: Изд-во АНО «Центр содействия научной, образовательной и просветительской деятельности «Соцветие», 2017. - 393 с).

Вздутоплодник сибирский растет по склонам сопок, в танацетовых степях и среди разнотравья лесостепей, моховолишайниковой тундре и в сухих руслах рек (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.). Ареал произрастания вздутоплодника сибирского делят на три фрагмента: селенгинский, даурский и забайкальский. Существуют отдельные очаги произрастания растения на территориях Красноярского края, Читинской и Иркутской областей, в Якутии и на западе Амурской области. Основные запасы лекарственного сырья вздутоплодника сибирского находятся в Читинской области.

Корни и корневища вздутоплодника сибирского содержат кумарины и пиранокумарины (винсадин и дигидросамидин, изофлоидикарпин, скополетин, умбеллиферон), эфирные масла, гликозиды (мениантин и мелиатин), флавоновые гликозиды (рутин, гиперозид), уксусная и изовалериановая кислота, крахмал. Эфирное масло вздутоплодника сибирского в качестве основных компонентов содержит: лимонен, у-терпинен, терпинолен, спатуленол, гермакрен D, виридифлорол, ß-барбатен, 5-кадинен и ß-акорадиен. Растение концентрирует железо, цинк, никель, селен и молибден (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.).

Кроме того, известен способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) в условиях in vitro (см. RU № 2666920, кл. А01Н 4/00, опубл. 13.09.2018).

При этом авторами из открытых источников не обнаружено сведений о способах получения каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) с характерными морфологическими параметрами и отсутствием сезонной зависимости их получения.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) в условиях in vitro.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм каллусной культуры клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) впервые получен в условиях in vitro.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, стабилизацию ростовых параметров и морфологических характеристик культур клеток.

Штамм культуры клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институте физиологии растений РАН, 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35, регистрационный номер 96.

Предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу взяты асептические проростки, выращенные из семян вздутоплодника сибирского, которые помещают в агаризованную питательную среду в качестве экспланта. В результате был получен штамм каллусной культуры клеток со следующими биотехнологическими характеристиками: жизнеспособность 70 %, индекс роста 4,14, продуктивность 0,29 г/(л×сут), в стандартных условиях не обладает морфогенным потенциалом.

Таким образом, каллусные культуры клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) получены из асептических проростков, выращенных из семян вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) южно-якутской популяции.

Заявленное решение иллюстрируется чертежом, где на фигуре 1 представлено изображение каллусной культуры клеток P. sibiricus листового происхождения; на фигуре 2 - каллусной культуры клеток P. sibiricus гипокотильного происхождения; на фигуре 3 - каллусной культуры клеток P. sibiricus корневого происхождения.

Семена стерилизовали 0,5 % раствором натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты («Жавельон/НовелтиХлор», Франция) в течение 10 мин, промывали стерильной дистиллированной водой и высевали на агаризованную среду Мурасиге-Скуга (MS) без добавления фитогормонов. Семядольные листья, гипокотили и корни асептических проростков использовали для получения каллусной культуры клеток.

Каллусную культуру клеток индуцировали на чашках Петри с агаризованной средой MS, дополненной 2,4-Д (1 мг/л) и БАП (0,5 мг/л).

Состав агаризованной питательной среды:

NH4NO3 1650 мг/л
KNO3 1900 мг/л
MgSO4x7H2O 370 мг/л
KH2PO4 170 мг/л
CaCl2x2H2O 440 мг/л
H3BO3 6,2 мг/л
MnSO4x4H2O 22,3 мг/л
ZnSO4x4H2O 8,6 мг/л
KI 0,83 мг/л
Na2MoO4x2H2O 0,25 мг/л
CuSO4x5H2O 0,025 мг/л
CoCl2x6H2O 0,025 мг/л
FeSO4x7H2O 27,8 мг/л
Na-ЭДТА 37,3 мг/л
Инозитол 100 мг/л
Тиамин 0,1 мг/л
Пиридоксин 0,5 мг/л
Никотиновая кислота 0,5 мг/л
Сахароза 30 г/л
Агар 8 г/л

Получены каллусные культуры клеток листового, гипокотильного и корневого происхождения (см. фиг. 1, 2, 3).

Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. Цикл субкультивирования составляет 4 недели. При пересеве используют 1/3 каллусных культур.

В первичной каллусной культуре (первые 2 цикла культивирования) наблюдали ризогенез, в процессе отбора морфогенный потенциал исчез. В последующие циклы культивирования в стандартных условиях (согласно паспорту) каллусная культура характеризируется преобладанием клеток меристемоподобного типа.

Анализ роста каллусной культуры клеток вздутоплодника сибирского проводили по показателю сухой биомассы.

Индекс роста (I):

I=Xmax/X0, где Xmax и X0 – количество биомассы в начале цикла выращивания и максимальное ее значение, соответственно.

Индекс роста по сухой массе(Ims):

Ims=5,8/1,4=4,14

Удельная скорость роста (µ, сут.-1) равна тангенсу угла наклона экспоненциальной фазы ростовой кривой в полулогарифмической системе координат:

µ=tgα/t, где t – время культивирования (сут.-1)

Удельная скорость роста по сухой массе:

µms=(1,53-0,33)/12=0,1 сут.-1

Время удвоения биомассы (τ, сут.) – зависимость между удельной скоростью роста и временем удвоения: τ=ln2/µ.

Время удвоения биомассы по показателю сухой массы:

τms=ln2/ 0,1 сут.-1= 6,9 сут.

Продуктивность P – максимальное значение Pi = (Xi − Xo) / (ti −to), где Xo и Xi − содержание сухой биомассы в начале культивирования и в момент времени ti , соответственно. Результаты представлены в таблице.

Штамм вздутоплодника сибирского обладает следующими признаками: наличие как рыхлых, так и плотных участков ткани; окраска каллусов была преимущественно бело-желтого цвета, в процессе культивирования наблюдалось появление коричневых участков каллусной ткани. Жизнеспособность клеток в течение цикла составила не ниже 70%.

Таким образом, была впервые получена каллусная культура клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.). Удобство такого способа получения каллусов состоит в отсутствии сезонной зависимости от роста интактных растений и в сохранении их природного ареала.

Таблица

Производные параметры роста каллусных культур клеток

вздутоплодника сибирского

Показатель роста Производные параметры роста
I µ* (сут.-1) τ, (сут.) P, г/(л×сут)
Сухая биомасса 4,14 0,1 6,9 0,29

Штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol., регистрационный номер ВККК ВР 96, для получения биомассы клеток.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии и медицине и представляет собой способ формирования кластера клеток, включающий: (i) объединение популяции гетерогенных клеток почки и популяции биоактивных клеток, где популяция гетерогенных клеток почек содержит клетки, полученные из биоптата почки или из целой почки млекопитающего или происходящие из культуры клеток in vitro, полученных из биоптата почки или целой почки млекопитающего, и где популяция биологически активных клеток (а) содержит популяцию эндотелиальных клеток, полученных не из почек, или популяцию эндотелиальных клеток-предшественников, полученных не из почек, и (b) выделена из источника, происходящего из взрослой особи, или из клеточной линии, происходящей из взрослой особи, и (ii) культивирование популяции гетерогенных почечных клеток и популяции биоактивных клеток в трехмерной культуральной системе, содержащей вращающиеся колбы до образования кластера клеток, где популяцию гетерогенных клеток почки и популяцию биоактивных клеток культивируют независимо в течение первого периода времени, а затем объединяют и культивируют в трехмерной культуральной системе в течение второго периода времени, где второй период времени составляет не менее 24 часов.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к грызуну для оценки потери функции длинной межгенной некодирующей РНК (дпнРНК), содержащему в своем геноме модифицированный эндогенный локус дпнРНК, способу его получения, а также к его клетке, ткани и эмбриону и способу их получения.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к противоопухолевым пептидным вакцинам, и может быть использовано в медицине для лечения или профилактики рака.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к клеточному сфероиду для создания костных тканей и тканеинженерных конструкций, используемых для восполнения костных дефектов, и биотрансплантату для регенерации костной ткани при хирургическом лечении деструктивных, дегенеративно-дистрофических, травматических или врожденных поражений костной ткани.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению вещества, содержащего ген Н1foo, матричную РНК Н1foo или протеин Н1foo, для улучшения качества индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана молекула нуклеиновой кислоты, содержащая, в направлении транскрипции 5' → 3': (a) промотор, (b) транскрибируемую последовательность нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты для введения транскрибируемой последовательности нуклеиновой кислоты и (c) последовательность нуклеиновой кислоты, которая, будучи транскрибированной под контролем промотора (a), кодирует 3'-нетранслируемую область транскрипта, которая в естественных условиях не связана с нуклеиновой кислотой (b), причем указанная 3'-нетранслируемая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая выбрана из группы, состоящей из: (c-1) последовательности нуклеиновой кислоты 3'-нетранслируемой области FCGRT, ее фрагмента или варианта указанных последовательности нуклеиновой кислоты или фрагмента, (c-2) последовательности нуклеиновой кислоты 3'-нетранслируемой области LSP1, ее фрагмента или варианта указанных последовательности нуклеиновой кислоты или фрагмента, (c-3) последовательности нуклеиновой кислоты 3'-нетранслируемой области CCL22, ее фрагмента или варианта указанных последовательности нуклеиновой кислоты или фрагмента, (c-4) последовательности нуклеиновой кислоты 3'-нетранслируемой области AES, ее фрагмента или варианта указанных последовательности нуклеиновой кислоты или фрагмента, (c-5) последовательности нуклеиновой кислоты 3'-нетранслируемой области PLD3, ее фрагмента или варианта указанных последовательности нуклеиновой кислоты или фрагмента, (c-6) последовательности нуклеиновой кислоты некодирующей РНК MTRNR1, ее фрагмента или варианта указанных последовательности нуклеиновой кислоты или фрагмента, (c-7) последовательности нуклеиновой кислоты 3'-нетранслируемой области HLA-DRB4, ее фрагмента или варианта указанных последовательности нуклеиновой кислоты или фрагмента и (c-8) любой комбинации двух или более последовательностей нуклеиновой кислоты, фрагментов и/или вариантов, обозначенных под номерами (c-1), (c-2), (c-3), (c-4), (c-5), (c-6) и (c-7), где последовательности нуклеиновой кислоты (b) и (c) под контролем промотора (a) могут быть транскрибированы с образованием общего транскрипта, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, транскрибированная с последовательности нуклеиновой кислоты (c), является активной в отношении повышения эффективности трансляции и/или стабильности последовательности нуклеиновой кислоты, транскрибированной с транскрибируемой последовательности нуклеиновой кислоты (b).

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения модельной иммортализованной линии клеток, содержащей поверхностно-экспонированную трансмембранно-заякоренную форму В-клеточного рецептора (BCR) патологических лимфоцитов неходжкинских лимфом (НХЛ) человека в формате одноцепочечного антитела (scFv), слитного с константным доменом иммуноглобулина человека класса IgG1 (Fc) и трансмемранным якорем, для разработки персонифицированных подходов к терапии лимфопролиферативных заболеваний человека.

Изобретение относится к биотехнологии и касается эукариотических клеток, подходящих для рекомбинантного продуцирования представляющего интерес продукта, где функция продукта экспрессии эндогенного гена C12orf35 в указанной клетке ингибируется, что приводит к повышению ее продуктивности, то есть к повышению уровня рекомбинантной экспрессии представляющего интерес полипептида.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению трансплантата для лечения лимбальной недостаточности. Способ включает механическую очистку аллогенной склеры, ее замачивание в 6% растворе перекиси водорода и выдерживание 4 часа (достигается разрушение тканевых пигментов, липидных структур и обеззараживание), затем промывают стерильной дистиллированной водой и замораживают при температуре -20°C 2 часа (что позволяет разрушить клеточные мембраны).

Изобретение относится к области биологии, а именно к линии клеток С-НAlb, продуцирующих рекомбинантный белок альбумин человека. Линия клеток С-НAlb, трансформированных плазмидой phAlb, кодирующей альбумин человека, депонирована во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Н-179.

Изобретение относится к биохимии и медицине и представляет собой способ формирования кластера клеток, включающий: (i) объединение популяции гетерогенных клеток почки и популяции биоактивных клеток, где популяция гетерогенных клеток почек содержит клетки, полученные из биоптата почки или из целой почки млекопитающего или происходящие из культуры клеток in vitro, полученных из биоптата почки или целой почки млекопитающего, и где популяция биологически активных клеток (а) содержит популяцию эндотелиальных клеток, полученных не из почек, или популяцию эндотелиальных клеток-предшественников, полученных не из почек, и (b) выделена из источника, происходящего из взрослой особи, или из клеточной линии, происходящей из взрослой особи, и (ii) культивирование популяции гетерогенных почечных клеток и популяции биоактивных клеток в трехмерной культуральной системе, содержащей вращающиеся колбы до образования кластера клеток, где популяцию гетерогенных клеток почки и популяцию биоактивных клеток культивируют независимо в течение первого периода времени, а затем объединяют и культивируют в трехмерной культуральной системе в течение второго периода времени, где второй период времени составляет не менее 24 часов.
Наверх