Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур

Авторы патента:

C12Q1/70 - использующие вирусы или бактериофаги

C12Q1/18 - испытания материала на антимикробную активность

C12Q1/02 - использующие жизнеспособные микроорганизмы

Владельцы патента RU 2723188:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН "ЕНИИВИ" Роспотребнадзора) (RU)

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, биологии. Предложен способ оценки специфической активности бактериофагов в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток, предусматривающий осуществление в течение 1 часа совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл. После чего проводят оценку результата по сравнению с контролем без бактериофага. Изобретение обеспечивает сокращение времени проведения реакции. 4 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, биологии. Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток проводят совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл, результат учитывают в течение 1 часа. Использование способа позволяет проводить оценку эффективности лечебно-профилактического бактериофага в меньшем объеме препарата - 0,2 мл и сократить время проведения реакции до 1 часа.

За последние годы практически не появилось новых антибактериальных препаратов (АБП), в то время как устойчивость к «старым» АБП неуклонно растет и во многих случаях уже достигла критической отметки. В этой связи ключевыми задачами являются разработка и внедрение в клиническую практику дополнительных средств борьбы с инфекционными заболеваниями, в качестве которых, несомненно, можно рассматривать бактериофаги.

Доступность и эффективность фаготерапии находит все более широкое применение этого метода в клинической практике, включая тяжелые формы инфекционной патологии, так как антимикробный эффект бактериофагов обусловлен внедрением их в бактериальную клетку без нарушения нормальной микрофлоры. Простота культивирования, короткий период генерации, высокий выход фагового потомства и возможность точного количественного учета способствуют не только успешно решать многие проблемы молекулярной генетики и общей вирусологии, но и позволяют широко использовать бактериофаги с диагностической и лечебно-профилактической целью при оказании медицинской помощи.

При этом актуальным в клинической практике является получение быстрого результата, поскольку постановка реакции по оценке фагочувствительности установленного патогена дополнительно требует определенного времени.

В настоящее время известен способ определения чувствительности выделенного микроорганизма к бактериофагу путем посева бактериальной культуры на агаризиванную питательную среду (Методические рекомендации «Принципы использования бактериофагов для борьбы с инфекциями с оказанием медицинской помощи» М. 2014 г.). О чувствительности бактериальной культуры к фагу судят по образованию зон лизиса в местах нанесенной на плотную питательную среду суспензии бактериофага. Результаты оценивают по пятибалльной шкале (по количеству «крестов»): «++++» прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста, «+++» зона лизиса с единичными колониями вторичного роста, «++» образование зоны лизиса с большим количеством колониями вторичного роста, «+» низкая активность, «-» отсутствие литической активности.

Недостатками этого способа является постановка теста в искусственно созданных условиях на синтетических питательных средах (in vitro) и получение результата через 18-24 часов.

Техническим результатом представленного изобретения является приближение условий культивирования к организму человека (in vivo), а также быстрота получения ответа с меньшими затратами.

Ближайшим прототипом изобретения является патент № 2296163 от 2012 г. «Способ оценки специфической активности бактериофагов» (авторы: Тихолов Р.М., Афиногенова А.Г., Кравцов А.Г., Афиногенов Г.Е.).

Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 часов тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебным бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом, в состав которого входит соответствующий используемой тест-культуре микроорганизма фаг, а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем.

Недостатками метода является объем бактериофага (1,8 мл), что экономически затратно и постановка эксперимента в течение 2-х часов, что не позволяет отнести представленную методику к экспресс-методу диагностики.

Результат изобретения достигается за счет того, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток по сравнению с контролем проводят совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебно-профилактическим бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом в объеме 0,2 мл в течение 1 часа.

Способ осуществляется следующим образом.

Из пробирок на покровное стекло с монослоем легочных фибробластов (ЛЭЧ-3) эмбриона человека, сливают ростовую среду и добавляют 0,2 мл препарата бактериофага и 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 10⁸ КОЕ/мл. Пробирки с покровным стеклом инкубируют 1 часа при 37 ± 1 °С, периодически встряхивая. Затем клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий 3-х кратно ФР (фосфатным буфером с pH 7,2). Препараты (покровное стекло) фиксируют 96° спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Исследуют микроскопически, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем. В контрольной пробирке с покровным стеклом с монослоем ЛЭЧ-3 проводят совместное ингибирование 0,2 мл поддерживающей среды Игла МЕМ с 0,2 мл суточной культуры тест-штамма. Интенсивность процесса адгезии оценивают по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя - микробную нагрузку (МН) - определяют по формуле МН=ИА×ПК%. Процент адгезии микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%.

В качестве примера использовали официальные препараты стафилококковый, синегнойный бактериофаг (псевдомонас аеругиноза) и экспериментальную серию бактериофага «Дифаг» против Аcinetobacter baumannii и Pseudomonas aeriginosa.

Пример 1. Определение бактериолитической активности препаратов: стафилококкового бактериофага в отношении S.aureus №456, синегнойного бактериофага против Ps.aeriginosa № 461, двухкомпонентного бактериофага «Дифаг» в отношении A. baumannii № 31 на культуре клеток (КК) ЛЭЧ-3. Среда для культивирования тест-микроорганизма - мясо-пептонный бульон (МПБ), для культивирования фибробластов - питательная среда Игла МЕМ.

В пробирку на покровное стекло с монослоем ЛЭЧ- 3 наносят 0,2 мл суточной культуры соответствующего микроорганизма в дозе ~1,5х10⁸ КОЕ/мл (0,5 по МакФарланду) с добавлением 0,2 мл бактериофага с литической активностью 10^-5-^-7(опытный инокулят). В качестве контрольного инокулята использовали смесь 0,2 мл питательной среды Игла МЕМ с 0,2 мл суточной тест-культуры соответствующего микроорганизма в той же дозе, помещенную в пробирку на покровное стекло с монослоем ЛЭЧ-3. Пробирки инкубировали 1 часа при t 37 ± 1 °С, периодически встряхивая, затем клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов 3-х кратно ФР, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент адгезии микроба по сравнению с соответствующим контролем без бактериофага по показателю микробной нагрузки (таблица 1,2,3).

Таблица 1.

Адгезивная активность S.aureus в присутствии специфического стафилококкового бактериофага.

	Показатели процесса адгезии S.aureus
ИА	ПК%	МН	% адгезии от контроля
опыт:
КК + бактерий +бактериофаг	10	10	100	1,3
контроль:
КК+ бактерий	25	30	750	100

Примечание: КК- клеточная культура

Таблица 2.

Адгезивная активность P.aeriginosa в присутствии специфического синегнойного бактериофага

	Показатели процесса адгезии P.aeriginosa
ИА	ПК%	МН	% адгезии от контроля
опыт:
КК + бактерий + бактериофаг	2	7	14	2,3
контроль:
КК+ бактерий	10	30	300	100

Таблица 3.

Адгезивная активность A.baumannii в присутствии специфического бактериофага «Дифаг»

	Показатели процесса адгезии A.baumannii
ИА	ПК%	МН	% адгезии от контроля
опыт:
КК + бактерий +бактериофаг	5	5	25	5,3
контроль:
КК+ бактерий	16	30	480	100

Как видно из данных таблиц, процент адгезии тест-штаммов достоверно снизился относительно контроля соответственно: S.aureus на 98,7%, P.aeriginosa на 97,7%, A.baumannii на 94,7%.

Снижение адгезивной активности бактерий происходило за счет бактериолитического эффекта бактериофага. Это подтверждали результатами проведенного дополнительного теста.

Производили высев инокулятов из пробирок на чашки Петри с МПА (мясо-пептонный агар) до начала инкубации и после 1 часа термостатирования при t=37 ± 1°С (таблица 4). Результаты высева инокулятов из соответствующих контрольных и опытных пробирок.

Таблица 4.

Присутствие тест-штамма микроорганизма в МПБ

(в контроле и в опыте)

	Наличие микроорганизмов в МПБ* (КОЕ/мл)
S.aureus	P.aeriginosa	A.baumannii
	контроль	опыт	контроль	опыт	контроль	опыт
Инкубация микроорганизма без бактериофага (контроль)	5^.10⁸	4^.10⁸	4^.10⁸	3^.10⁸	3^.10⁸	2^.10⁸
Инкубация микроорганизма с бактериофагом (опыт)	0	0	0	0	0	0

* Учёт результата по высеву на мясо-пептонный агар.

Представленные в таблице данные свидетельствуют об отсутствии жизнеспособных клеток микроорганизмов как в контрольной, так и в опытной пробирках после 1 часа инкубации. Отсутствие роста микрофлоры на плотной питательной среде в контроле связано со 100% адгезией тест-штаммов к культуре клеток фибробластов в пробирках. В то же время отсутствие роста тест-культур на МПА после 1 часа инкубации в опыте свидетельствует о гибели тест-штаммов за счет бактериолитического действия бактериофага в связи с отсутствием адгезированных клеток микроорганизмов к культуре клеток фибробластов в пробирках.

Способ оценки специфической активности бактериофагов в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток, отличающийся тем, что в течение 1 часа осуществляют совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл, после чего проводят оценку результата по сравнению с контролем без бактериофага.

Изобретение относится к биохимии. Описано моноклональное антитело или его фрагмент, которое связывается с белком P респираторно-синцитиального вируса человека (RSV), отличающееся тем, что данное моноклональное антитело или его фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №:1 или SEQ ID №: 5 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №: 2 или SEQ ID №: 6.

Пестивирус // 2710041

Изобретение относится к биотехнологии. Описан выделенный вирус, который является членом пестивирусов, для диагностики и лечения заболевания, вызванного пестивирусом, отличающийся тем, что а) вирус является возбудителем врожденного тремора группы А-II у свиней, а б) вирус имеет вирусный геном, содержащий ген, кодирующий оболочечный белок Erns, ген, кодирующий оболочечный белок E2, и ген, кодирующий оболочечный белок E1, при этом нуклеотидная последовательность гена Erns имеет уровень идентичности, составляющий по меньшей мере 80% по отношению к нуклеотидной последовательности, как показано в SEQ ID NO:1, и/или нуклеотидная последовательность гена E2 имеет уровень идентичности, составляющий по меньшей мере 80% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и/или нуклеотидная последовательность гена Е1 имеет уровень идентичности, составляющий по меньшей мере 80% по отношению к нуклеотидной последовательности, как показано в SEQ ID NO:5.

Использование молекулярных маркеров il-3, il-33 и il12ρ40 для характеристики степени тяжести респираторных инфекций, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом человека и метапневмовирусом человека // 2707549

Изобретение относится к биотехнологии и определению респираторных заболеваний с помощью молекулярных маркеров в качестве средства прогнозирования развития случаев респираторных инфекций.

Способ и устройство для обнаружения бактерий // 2704245

Группа изобретений относится к ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов. Раскрыт способ обнаружения бактерий, включающий обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению; добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий; фильтрацию полученной реакционной смеси; обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате; обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате; обработку полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения, и вывод результатов обнаружения пользователю.

Штамм с/2014 вируса мачупо - возбудителя боливийской геморрагической лихорадки, предназначенный для лабораторной оценки эффективности медицинских средств защиты в отношении данного возбудителя // 2699525

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки (БГЛ), вариант природного штамма Carvallo, адаптированный к морским свинкам и вызывающий у них зависимую от вводимой дозы вируса гибель.

Способ прогнозирования безрецидивной и общей выживаемости у впч16-позитивных больных раком шейки матки // 2694834

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования безрецидивной и общей выживаемости у ВПЧ 16-позитивных больных раком шейки матки.

Способ определения специфической активности антирабического иммуноглобулина на клеточной культуре с применением атомно-силовой микроскопии // 2688334

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии. Изобретение раскрывает способ определения специфической активности антирабического иммуноглобулина.

Культуры с повышенной устойчивостью к фагам // 2687148

Изобретение относится к области пищевой промышленности. Описан способ получения заквасочной культуры, включающей по крайней мере два различных устойчивых к бактериофагам вариантных штамма Streptococcus thermophiles.

Кассета, предназначенная для получения плазмидных векторов, используемых для создания клеток-продуцентов вирусоподобных частиц (впч) вируса гриппа // 2680703

Изобретение относится к биотехнологии. Разработана кассета генов, несущая гены вируса гриппа субтипов А(Н1N1) и A(H3N2) и типа В - НА, M1 и NA, кодирующие белки вируса гриппа, предназначенная для последующего получения плазмидного вектора для трансдукции клеток млекопитающих, которые в дальнейшем использовались для создания клеток-продуцентов вирусоподобных частиц (ВПЧ) вируса гриппа.

Лентивирусная плазмида (варианты), способ ее получения (варианты), набор праймеров для получения лентивирусного плазмидного вектора (варианты) // 2680537

Изобретение относится к биотехнологии. Разработаны лентивирусные векторы, несущие кассету генов белков вируса гриппа субтипов A(H1N1) и A(H3N2) и типа В, кодирующих последовательности белков вируса гриппа для трансдукции клеток млекопитающих.

Мультирезистентный штамм бактерий acinetobacter baumannii для стандартизации оценки эффективности разрабатываемых антимикробных препаратов и дезинфицирующих средств // 2711922

Изобретение относится к области микробиологии, дезинфектологии, биотехнологии. Штамм Acinetobacter baumannii 5720 депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под регистрационным номером В-8561.