Способ регистрации результата реакции полимеризации днк и устройство для его реализации

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложено устройство для регистрации изменения электрического поля в процессе катализируемой молекулой фермента биохимической реакции и способ определения нуклеотидной последовательности фрагмента молекулы нуклеиновой кислоты. Устройство содержит одноатомный зарядовый центр на основе атома переходного металла переменной валентности, координированного с тридентатным терпиридиновым лигандом, левый и правый металлические электроды и связанную ковалентной связью с тридентатным терпиридиновым лигандом непроводящую линкерную группировку. Способ включает обеспечение условий для иммобилизации имеющей сродство к нуклеиновой кислоте молекулы полимеразы с образцом, обеспечение условий для функциональной активности полимеразы, регистрацию факта разделения зарядов, определение временных интервалов между каждым последующим зарегистрированным фактом разделения зарядов и определение нуклеотидной последовательности. Изобретения обеспечивают повышение точности и производительности секвенирования нуклеиновых кислот. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 ил., 7 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области технологии конструирования сенсоров для регистрации малых величин электрического поля, в т.ч. для регистрации фактов разделения одной пары зарядов в результате реакции полимеризации ДНК/РНК (см. [1]), когда один электрон остается на полимеризуемом фрагменте ДНК/РНК, а один протон выделяется в водный раствор. Раскрываемое изобретение может найти применение для определения нуклеотидной последовательности (секвенирования) нуклеиновых кислот. Кроме того, варианты исполнения элементов базовой конструкции молекулярного зарядочувствительного одноэлектронного сенсора могут найти применение для измерения параметров одномолекулярных биохимических реакций, идущих с разделением или перераспределением зарядов.

Уровень техники

Анализ результатов реакции полимеризации ДНК/РНК используется тем или иным способом в большинстве современных технологий секвенирования ДНК/РНК (Illumina, Ion Torrent, PacBio и т.д.), общее название этих способов: секвенирование синтезом (sequencing by synthesis, SBS). Предлагаемый к рассмотрению способ регистрации результатов реакции полимеризации ДНК/РНК основан на способности оригинальной конструкции зарядочувствительного сенсора, содержащего атом переходного металла, изменять величину туннельного тока в зависимости от величины поляризационного заряда Qg на нем (наведенного внешним электрическим полем) в соответствии с собственной модуляционной характеристикой [3].

Из области техники известно изобретение компании Roswell (США), оформленное рядом патентов [4], [5], [6] и другие, суть которого в том, что считывают сигналы (ток между двумя электродами через мостик из полимерной молекулы к которому через линкер присоединена полимераза) в ходе реакции полимеризации ДНК известного олигонуклеотида (молекула-шаблон), называя этот процесс калибровкой, а потом эти сигналы сравнивают с сигналами, которые получены тем же способом при полимеризации неизвестного фрагмента ДНК. Основное же утверждение состоит в том (приведено в патенте US 10036064 B2), что полимеразы принимают различную конформацию при встраивании нуклеотидов различных видов в ходе реакции полимеризации нуклеиновых кислот, и эти конформационные изменения полимеразы могут модулировать электрический ток через молекулу-мостик между двумя электродами. Эта молекула-мостик обладает свойством модулировать свою проводимость в зависимости от угла ее скручивания (конформации), с ней через линкер связана полимераза. Тем самым, конформация полимеразы при встраивании нуклеотидов в ходе реакции полимеризации нуклеиновых кислот через линкер конформирует молекулу-мостик, чем обеспечивается формирование последовательно модулированных сигналов, специфичных для анализируемой нуклеотидной последовательности. Для расшифровки получаемых сигналов, предварительно, тем же способом, выполняют калибровку сигналов, - анализируют нуклеотидную последовательность молекулы-шаблона (заказного олигонуклеотида). Следует заметить, что нативные полимеразы имеют, как правило, небольшую естественную поляризацию, но предпочтение в рассматриваемом изобретении отдается применению модифицированных полимераз, в т.ч. есть вариант модификации, когда включаются дополнительные заряды в структуру полимеразы. Можно спорить о потребительских качествах реализации рассматриваемого изобретения, в т.ч числе о влиянии ввода дополнительных зарядов в полимеразу на качество ее работы по полимеризации нуклеиновых кислот, - актуально то, что есть принципиальные отличия в конструкции сенсоров Roswell и ООО ГАММА-ДНК [2], и в принципах их работы. В сенсоре Roswell применяется механическая передача конформации полимеразы в ходе реакции полимеризации нуклеиновой кислоты к проводящей полимерной молекуле, расположенной между двумя электродами; в свою очередь, проводимость полимерной молекулы зависит от собственной конформации. Таким образом, электрический ток (макро-величины) между двумя электродами сенсора через полимерную молекулу модулируется ее конформацией, которую ей обеспечивает конформация полимеразы, которая механически связана с полимерной молекулой линкером. Т.е. основным элементом сенсора является полимерная макро-молекула, меняющая свою проводимость в зависимости от собственной конформации.

Из области техники известно изобретение Ion Torrent (США), оформленное рядом патентов [7] и другие, суть которого в том, что сенсор зарядочувствительных ячеек матрицы содержит полевой транзистор, имеющий пороговое напряжение и плавающий затвор с пассивацией, чувствительной к анализируемому веществу, причем пороговое напряжение существенно зависит от анализируемого вещества. Чувствительный пассивирующий слой и захваченный заряд на плавающем затворе полевого транзистор формируют выходной сигнал, зависящий от порогового напряжения. В каждой ячейке матрицы сенсоров предполагается расположение микроразмерного шарика с полимерным покрытием, на которое иммобилизованы тысячи клонов одного фрагмента нуклеиновой кислоты, каждый из клонов связан с молекулой полимеразы. На поверхность ячеек матрицы поочередно, циклически, добавляют растворы только с нуклеотидами одного вида. В ячейках, в которых полимеразы встраивают комплементарные нуклеотиды в клоны фрагмента нуклеиновой кислоты из поданного раствора, - происходит выделение ионов водорода в раствор: по одному от каждого клона. Огромное количество ионов водорода в ячейке закисляет раствор над поверхностью сенсора примерно на величину 0,02 pH, что выше порогового напряжения транзистора сенсора, - и сенсором формируется выходной сигнал соответствующий тому событию, что сейчас определено имя нуклеотида в секвенируемой последовательности клона фрагмента нуклеиновой кислоты, которое комплементарно имени вида нуклеотидов, которые поданы в последнем растворе. Принципиальное отличие сенсора ООО ГАММА-ДНК от сенсора Ion Torrent состоит в функциональной возможности регистрировать результат (изменение электрического поля) разделение всего одной пары зарядов от встраивания комплементарного нуклеотида в ходе реакции полимеризации одного фрагмента нуклеиновой кислоты, что не достижимо для транзистора сенсора Ion Torrent.

Из области техники известно изобретение Pacific Biosciences (США), оформленное патентом [8], в котором также применяется способ севенирования синтезом (SBS) с применением электронного сеснсора. Суть этого изобретения в том, что один комплекс, содержащий фермент полимеразу и матричную нуклеиновую кислоту, прикреплен к элементу электронного наноразмерного сенсора или расположен рядом с ним; в результате подачи рабочего раствора на сенсор, содержащего аналоги нуклеотидов (нуклеотиды с метками, индивидуальными для каждого вида нуклеотидов, присоединенными к фосфатной части нуклеотидов), начинается реакция полимеризации нуклеиновой кислоты: в результате встраивания нуклеотида с меткой - метка отщепляется от нуклеотида в активном центре полимеразой и изменяет (модулирует) величину постоянно измеряемого сенсором электрического сигнала (измеряется величина электрического тока между истоком и стоком в наноразмерном полевом транзисторе сенсора), а нуклеотид встраивается в полимеризуемую нуклеиновую кислоту. Метка нуклеотида может изменять импеданс или емкость, или/и сопротивление раствора над областью затвора наноразмерного полевого транзистора на величину, индивидуальную для нуклеотидов каждого вида. Выходной сигнал сенсора постоянно во времени мониторится внешней схемой, по величине модуляции (индивидуальной для каждого вида нуклеотидов) сигнала судят об имени встраиваемого нуклеотида.

Сущность изобретения.

Задачей заявляемого технического решения является создание способа и устройства регистрации изменения электрического поля в процессе биохимической реакции, катализируемой молекулой фермента. В частности, такие способ и устройство можно применить для регистрации реакции полимеризации нуклеиновых кислот и секвенирования нуклеиновых кислот.

Указанная задача решается путем применения одноатомного транзистора (ОАТ) для регистрации изменения электрического поля в процессе биохимической реакции, катализируемой молекулой фермента, при этом ОАТ состоит по меньшей мере из следующих структурных элементов: (1) тридентатного терпиридинового лиганда, координированного с одноатомным зарядовым центром на основе атома переходного металла переменной валентности, содержащего не менее двух свободных электронов на внешней оболочке, при этом лиганд или зарядовый центр выполнены с возможностью иммобилизации молекулы фермента вблизи зарядового центра; (2) по меньшей мере двух металлических электродов; (3) по меньшей мере одной непроводящей линкерной группировки, связанной ковалентной связью с тридентатным терпиридиновым лигандом, соединяющей указанные электроды и обеспечивающей возможность иммобилизации лиганда вблизи электродов за счет образования ковалентной связи между линкерной группировкой и по меньшей мере одним из электродов, при этом длина указанной линкерной группировки варьируется в пределах от 2 до 6 нм.

В некоторых вариантах осуществления изобретения применение комплекса ОАТ характеризуется тем, что биохимической реакцией является реакция полимеризации нуклеиновой кислоты, и ферментом, катализирующим реакцию, является полимераза, имеющая сродство к нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах осуществления изобретения применение комплекса ОАТ характеризуется тем, что ОАТ дополнительно содержит управляющий электрод из металла, потенциалом на котором, вместе с заданием разности потенциалов на левом и правом электродах, задается такая рабочая точка ОАТ, которая обеспечивает максимальную чувствительность ОАТ при регистрации изменения электрического поля. В некоторых вариантах осуществления изобретения применение комплекса ОАТ характеризуется тем, что образование ковалентной связи между линкерной группировкой и электродом происходит за счет включения в линкерную группировку серосодержащей группировки, выбранной из следующего списка: тиольная, дисульфидная, циклическая дисульфидная, тиоацетатная. В некоторых вариантах осуществления изобретения применение комплекса ОАТ характеризуется тем, что атомом переходного металла переменной валентности является Zn, Cd, Pt, Pd, Ru, Rh, Ni, Co или Cu.

Указанная задача также решается путем создания устройства для регистрации изменения электрического поля в процессе биохимической реакции, катализируемой молекулой фермента, содержащего по меньшей мере: (а) одноатомный зарядовый центр на основе атома переходного металла переменной валентности, содержащего не менее двух свободных электронов на внешней оболочке, координированный с тридентатным терпиридиновым лигандом, при этом лиганд или зарядовый центр обеспечивают иммобилизацию вблизи зарядового центра молекулы фермента; (б) левый и правый металлические электроды, при этом электроды и зарядовый центр расположены с возможностью образовывать два сверхмалых последовательно соединенных туннельных перехода: между левым электродом и атомом металла, и между этим же атомом металла и правым электродом; (в) по меньшей мере одну непроводящую линкерную группировку, связанную ковалентной связью с тридентатным терпиридиновым лигандом, и удерживающую атом металла вблизи разрыва между левым и правым электродами, при этом длина указанной линкерной группировки варьируется в пределах от 2 до 6 нм.

В некоторых вариантах осуществления изобретения данное устройство характеризуется тем, что биохимической реакцией является реакция полимеризации нуклеиновой кислоты, и ферментом, катализирующим реакцию, является полимераза, имеющая сродство к нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах осуществления изобретения данное устройство характеризуется тем, что оно дополнительно содержит управляющий электрод из металла, потенциалом на котором, вместе с заданием разности потенциалов на левом и правом электродах, задается такая рабочая точка устройства, которая обеспечивает максимальную чувствительность устройства при регистрации изменения электрического поля. В некоторых вариантах осуществления изобретения данное устройство характеризуется тем, что образование ковалентной связи между линкерной группировкой и электродом происходит за счет включения в линкерную группировку серосодержащей группировки, выбранной из следующего списка: тиольная, дисульфидная, циклическая дисульфидная, тиоацетатная. В некоторых вариантах осуществления изобретения данное устройство характеризуется тем, что атомом переходного металла переменной валентности является Zn, Cd, Pt, Pd, Ru, Rh, Ni, Co или Cu.

Указанная задача также решается путем создания способа определения нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, включающий по меньшей мере следующие стадии: (а) получают образец, приготовленный из указанной молекулы нуклеиновой кислоты, представляющий собой множество фрагментов нуклеиновой кислоты; (б) получают комплекс ОАТ, состоящий из следующих структурных элементов: (1) тридентатного терпиридинового лиганда, координированного с одноатомным зарядовым центром на основе атома переходного металла переменной валентности, содержащего не менее двух свободных электронов на внешней оболочке, при этом лиганд или зарядовый центр выполнены с возможностью иммобилизации молекулы полимеразы, имеющей сродство к нуклеиновой кислоте, вблизи зарядового центра; (2) по меньшей мере двух металлических электродов; (3) по меньшей мере одной непроводящей линкерной группировки, связанной ковалентной связью с тридентатным терпиридиновым лигандом, соединяющей указанные электроды и обеспечивающей возможность иммобилизации лиганда вблизи электродов за счет образования ковалентной связи между линкерной группировкой и по меньшей мере одним из электродов, при этом длина указанной линкерной группировки варьируется в пределах от 2 до 6 нм; (в) обеспечивают иммобилизацию одного из фрагментов нуклеиновой кислоты и молекулы полимеразы, имеющей сродство к нуклеиновой кислоте, на комплексе ОАТ, при этом иммобилизация сохраняет функциональность полимеразы и обеспечивает нахождение полимеразы вблизи комплекса ОАТ в течение всего процесса определения нуклеотидной последовательности; (г) обеспечивают условия для функциональной активности указанной полимеразы, заключающейся в катализе присоединения нуклеотидов к растущей цепи нуклеиновой кислоты, где условия для функциональной активности полимеразы включают: добавление смеси двух или более видов немеченых дезоксирибонуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из дезоксиаденозинтрифосфата, дезоксигуанозинтрифосфата, дезоксицитидинтрифосфата и дезокситимидинтрифосфата вблизи комплекса ОАТ, или добавление смеси двух или более видов немеченых рибонуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из аденозинтрифосфата, гуанозинтрифосфата, цитидинтрифосфата и уридинтрифосфата вблизи комплекса ОАТ, при этом в указанной смеси нуклеотид одного вида присутствует в значительно меньшей концентрации, чем нуклеотиды других видов; (д) регистрируют при помощи комплекса ОАТ факт разделения зарядов, происходящий в результате встраивания полимеразой нуклеотида в растущую цепь нуклеиновой кислоты, и определяют временные интервалы между каждым последующим зарегистрированным фактом разделения зарядов; (е) по меньшей мере однократно повторяют стадии (г) и (д), при этом при каждом повторении вид нуклеотида, присутствующего в добавляемой смеси нуклеотидов в значительно меньшей концентрации по сравнению с другими видами, изменяется; (ж) определяют нуклеотидную последовательность указанной молекулы нуклеиновой кислоты, основываясь на анализе определенных на стадиях (д) и (е) временных интервалов между каждым зарегистрированным фактом разделения зарядов, где разделения зарядов произошли в результате встраивания полимеразой указанных немеченых нуклеотидов в растущую цепь нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ определения нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты характеризуется тем, что образец, приготовленный из молекулы нуклеиновой кислоты, представляет собой множество закольцованных фрагментов нуклеиновой кислоты.

Стадии (а), (г), (е), (ж) указанного способа определения нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты реализуются как описано в патенте РФ № 2679494 ([2]).

Некоторые варианты изобретения включают в себя описанный выше способ, в котором указанные в (а) закольцованные фрагменты нуклеиновой кислоты имеют по меньшей мере один одноцепочечный участок (см. Фиг. 1А и 1Б); указанные в (б и в) комплексы, дополнительно включают секвенирующий праймер, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную указанному одноцепочечному участку; и условия для функциональной активности полимеразы дополнительно включают условия, обеспечивающие образование дуплекса секвенирующего праймера с комплементарным участком указанного закольцованного одноцепочечного фрагмента дезоксирибонуклеиновой кислоты (см. Фиг. 1А и 1Б).

В некоторых вариантах изобретения указанные в (а) закольцованные фрагменты не имеют одноцепочечных участков способных образовать дуплекс с секвенирующим праймером (см. Фиг. 1В), поэтому указанные в (б и в) комплексы не включают секвенирующий праймер (см. Фиг. 1В); а синтез ДНК инициируется полимеразой с искусственно созданного свободного 3’ конца в одной из цепей двухцепочечного закольцованного фрагмента.

Некоторые варианты изобретения включают в себя описанный выше способ, в котором нуклеиновой кислотой является ДНК; полимеразой, имеющей сродство к нуклеиновой кислоте, является ДНК полимераза, и нуклеотидами, добавляемыми на стадиях (в) и (д), являются дезоксиаденозинтрифосфат, дезоксигуанозинтрифосфат, дезоксицитидинтрифосфат или дезокситимидинтрифосфат. ДНК полимераза, пригодная для осуществления способа, включает по меньшей мере следующие ферменты: полимераза Phi29, большой фрагмент Bst ДНК полимеразы, полимераза VentR™, большой фрагмент Bsm ДНК полимеразы, Klenow фрагмент ДНК полимеразы I.

Другие варианты изобретения включают в себя описанный выше способ, в котором полимеразой, имеющей сродство к нуклеиновой кислоте, является РНК полимераза; и нуклеотидами, добавляемыми на стадиях (в) и (д), являются аденозинтрифосфат, гуанозинтрифосфат, цитидинтрифосфат и/или уридинтрифосфат.

Указанная задача также решается путем создания устройства, которое способно регистрировать результаты реакции полимеризации нуклеиновых кислот, как это описано выше. Устройство для регистрации результатов реакции полимеризации нуклеиновых кислот содержит: 1) по меньшей мере одну ячейку с сенсором и схемой обработки сигнала сенсора; 2) микрофлюидное устройство для обеспечения подачи рабочих растворов к сенсору ячейки; 3) устройство управления режимами работы микрофлюидного устройства, сенсором ячейки и обработкой, отображением данных. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения устройство характеризуется тем, что 1) поверхность сенсора пригодна для иммобилизации полимеразного комплекса; 2) сенсор регистрирует факты разделения одной пары зарядов в водном растворе, происходящие в результате встраивания полимеразой каждого нуклеотида в полимеризуемый фрагмент ДНК комплекса; 3) устройство обработки сигнала сенсора формирует сигналы, соответствующие зарегистрированным фактам разделения пар зарядов в аналоговом или, предпочтительно, в цифровом формате. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения устройство характеризуется тем, что содержит: 1) матрицу ячеек сенсоров и схему обработки сигналов сенсоров ячеек; 2) микрофлюидное устройство для обеспечения подачи рабочих растворов к сенсорам ячеек матрицы; 3) устройство управления режимами работы микрофлюидного устройства, матрицей ячеек сенсоров, сенсорами ячеек и обработкой сигналов сенсоров ячеек матрицы, отображением обработанных сигналов в формате аналоговых или цифровых данных. Механизмы разделения пары зарядов и индуцирования заряда на поверхности затвора полевого транзистора в ходе реакции полимеризации фрагмента ДНК и регистрации результата его образования описаны, например, в работах Надара Пурманда [1], [9].

При использовании заявляемого изобретения достигаются следующие технические результаты:

- предложенное устройство (сенсор) обеспечивает повышение точности регистрации по времени и по амплитуде изменения электрического поля в процессе биохимической реакции, происходящей с разделением или перераспределением зарядов, и катализируемой молекулой фермента;

- предложенное способ регистрации результатов реакции полимеризации обеспечивает повышение точности и производительности (увеличение темпа полимеризации без повышения уровня ошибок) секвенирования нуклеиновых кислот за счет повышения вероятности регистрации фактов разделения зарядов, повышения точности определения времени разделения каждой пары зарядов в ходе реакции полимеризации нуклеиновых кислот.

Технический результат достигается за счет: 1) повышения зарядовой чувствительности сенсора до долей заряда электрона в полосе частот, соответствующей темпу некоторых биохимических реакций, например, реакции полимеризации нуклеиновой кислоты, при комнатной температуре за счет особенностей его конструкции; 2) расположения атома металла на минимальном расстоянии от обоих электродов транзистора сенсора; 3) функционирования фермента (расположения активного центра - места разделения пары зарядов) внутри ДЭС (в т.ч. за счет малой ионной силы раствора), на минимальном расстоянии от атома металла внутри ОАТ сенсора.

Краткое описание чертежей.

Прилагаемые чертежи, которые включены в состав настоящего описания и являются его частью, иллюстрируют варианты осуществления изобретения и совместно с вышеприведенным общим описанием изобретения и нижеприведенным подробным описанием вариантов осуществления служат для пояснения принципов настоящего изобретения.

На Фиг. 1 показано расположение друг относительно друга комплекса ОАТ и биологического комплекса (полимераза-ДНК), при котором они, совместно функционируя, реализуют один из вариантов настоящего изобретения.

На Фиг. 2 показана схема возможного варианта метода пробоподготовки биологического комплекса. (А) Схема процесса получения библиотеки ковалентно-замкнутых (закольцованных) молекул в форме «гантели» (“dumbbell”). (Б) Ковалентно-замкнутые молекулы ДНК в форме «гантели» были очищены из реакционной смеси. (В) Полимеразные комплексы вместе с продуктами ДНК синтеза (слева) были эффективно удалены с поверхности действием имидазола (справа).

На Фиг. 3 показана схема получения одного из вариантов комплекса ОАТ с двумя линкерными группировками.

На Фиг. 4 показана общая схема строения одного из вариантов комплекса ОАТ. М = Zn, Cd, Pt, Pd, Ru, Rh, Ni, Co, Cu; “S” = тиольная, дисульфидная, циклическая дисульфидная, тиоацетатная группа; X - неорганический однозарядный анион (галогенид, нитрат, ацетат); n= 2 или 3; m= 1 или 2.

На Фиг. 5 показана конструкция одного из вариантов комплекса ОАТ.

На Фиг. 6 показан один из вариантов связывания молекулы полимеразы с молекулярным комплексом, входящим в состав ОАТ.

На Фиг. 7 показаны типичные вольт-амперная А) и управляющая характеристики Б) ОАТ; вольт-амперная характеристика ОАТ имеет характерную область кулоновской блокады (сплошная линия см. Фиг. 7А) при напряжениях |V_off| < e/C (C- полная емкость атома металла) между левым и правым электродами и нулевом напряжении на управляющем электроде; при напряжениях Vg на управляющем электроде, соответствующих СgVg=Qg = е/2 + ne туннелирование возможно при любых напряжениях V и, в этом случае, вольтамперная характеристика транзистора не имеет блокадного участка (пунктирная линия см. Фиг. 7А); небольшое изменение заряда на атоме металла dQ, которое может быть существенно меньше, чем заряд электрона е, приводит к заметному изменению dI тока транзистора (Фиг. 7Б) и может быть зарегистрировано.

Подробное раскрытие изобретения.

Определения и термины.

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, примененные в настоящем описании изобретения.

В описании данного изобретения слова «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные слова далее по тексту, за исключением специально оговариваемых случаев, не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Одноатомный транзистор (ОАТ), - структура, состоящая из двух сверхмалых последовательно соединенных туннельных переходов, между которыми расположен атом металла, и, оптимально, управляющего электрода; набор из значений напряжения между левым и правым электродом и напряжения на управляющем электроде называют рабочей точкой ОАТ; для настройки ОАТ на максимальную чувствительность к изменению величины электрического поля производятся измерения набора вольт-амперных характеристик при разных значениях напряжений на управляющем электроде, и среди набора напряжений между левым и правым электродом и напряжениями на управляющем электроде выбирают такие значения этих напряжений, которые соответствуют максимальной крутизне вольт-амперной характеристики ОАТ; установка рабочей точки ОАТ в состояние, которое обеспечивает максимальную крутизну вольт-амперной характеристики ОАТ, обеспечивает, как правило, и максимальную чувствительность ОАТ к изменениям электрического поля.

Комплексом ОАТ называется полимерная молекула с атомом (атомами) металла, иммобилизованная на поверхность вблизи электродов ОАТ таким образом, чтобы удерживать атом металла в зазоре между электродами или рядом с зазором, с одной стороны, и выполнять функцию линкера для биологического комплекса - с другой стороны. Комплекс ОАТ состоит из тридентатного терпиридинового лиганда, координированного с одноатомным зарядовым центром на основе атома переходного металла переменной валентности, содержащего не менее двух свободных электронов на внешней оболочке, соединенного с несколькими непроводящими линкерными группировками для соединения с электродами и/или с биологическим комплексом.

Под биологическим комплексом следует понимать комплекс «фермент-субстрат», образуемый при прохождении биохимической реакции. В предпочтительном варианте изобретения, биологическим комплексом является соединение «полимераза-фрагмент ДНК», в котором применяется полимераза, которая модифицирована таким образом, чтобы иметь возможность соединения с линкером комплекса ОАТ посредством химических связей.

Терпиридин (2,2 '; 6', 2 "-терпиридин) представляет собой гетероциклическое соединение, получаемое из пиридина. Терпиридин представляет собой тридентатный лиганд, который связывает металлы в трех меридиональных сайтах, образуя два смежных 5-членных хелатных MN2C2 кольца. Терпиридин образует комплексы с большинством ионов переходных металлов.

Одна или несколько непроводящих линкерных группировок в составе ОАТ несут вспомогательную функцию и предназначены для прикрепления (адсорбции) одноатомного зарядового центра на основе атома переходного металла переменной валентности, координированного с тридентатным терпиридиновым лигандом, вблизи двух металлических электродов таким образом, чтобы обеспечить возможность образовывать два сверхмалых последовательно соединенных туннельных перехода: между первым электродом и атомом переходного металла, и между этим же атомом переходного металла и вторым электродом. Предпочтительно, прикрепление обеспечивается за счет образования ковалентной связи. Например, образование ковалентной связи между линкерной группировкой и электродом может происходить за счет включения в линкерную группировку серосодержащей группировки, выбранной из следующего списка: тиольная, дисульфидная, циклическая дисульфидная, тиоацетатная. Возможно использование как одной линкерной группировки, соединяющей первый и второй электроды, так и использование двух линкерных группировок, связанных с лигандом, одна из которых обеспечивает прикрепление к первому электроду, а другая ко второму. Эти группировки могут быть одинаковыми или разными.

Для иммобилизации молекулы фермента вблизи одноатомного зарядового центра на основе атома переходного металла переменной валентности, координированного с тридентатным терпиридиновым лигандом, могут быть использованы различные варианты линкеров. В одном из вариантов, фермент содержать, или может быть направленно модифицирован, чтобы содержать группы, образующие химические связи непосредственно с атомом переходного металла (как это показано на Фиг. 6). В других вариантах, терпиридиновый лиганд или атом переходного металла может соединяться с молекулой фермента через короткий линкер, предпочтительно, с образованием ковалентных связей. Такой линкер должен обеспечивать иммобилизацию активного центра фермента вблизи терпиридинового лиганда и зарядового центра в течение биохимического процесса, предпочнительно на расстоянии в несколько нанометров.

Сенсором называется электронное устройство на основе ОАТ, выходная характеристика которого модулируются в результате образования одной пары несвязанных зарядов, находящейся в непосредственной близости от поверхности сенсора, и образуемой в результате биохимической реакции, например, в результате встраивания полимеразой нуклеотида в полимеризуемый фрагмент ДНК.

Зарядочувствительный одноэлектронный молекулярный сенсор по настоящему изобретению модулирует туннельный ток между своими электродами под действием внешнего электрического поля, соответствующего долям электрона при комнатной температуре и может быть применен для регистрации фактов разделения пары зарядов в результате биохимической реакции, например, при встраивании каждого нуклеотида в полимеризуемый фрагмент нуклеиновой кислоты.

Ячейкой называется электронное устройство, включающее в себя сенсор и подводящие электроды, необходимые для функционирования сенсора, в котором изолирующим слоем закрыты от рабочего раствора все поверхности, кроме тех, которые подготовлены специально для иммобилизации комплекса ОАТ.

Матрицей ячеек сенсоров называется упорядоченный массив из ячеек, организованный в виде строк и столбцов, как правило, в форме квадрата или прямоугольника, обеспечивающий подвод токов и напряжений, необходимых для работы сенсоров, обеспечивающие вывод выходного сигнала сенсора от каждой ячейки матрицы за ее границы, для последующей, например, аналого-цифровой обработки.

Процессивность (англ. processivity) - это способность фермента осуществлять последовательность химических реакций, без высвобождения субстрата. В случае полимеразы процессивность это среднее число нуклеотидов, добавляемое ферментом к растущей цепи за одно связывание с поверхностью матрицы микросхемы.

Под нуклеотидом в описании данного изобретения следует понимать, в зависимости от варианта реализации, как рибонуклеотиды, например, аденозинтрифосфат, гуанозинтрифосфат, цитидинтрифосфат и уридинтрифосфат, обозначаемые ATP, GTP, CTP, UTP), так и дезоксирибонуклеотиды, например, дезоксиаденозинтрифосфат, дезоксигуанозинтрифосфат, дезоксицитидинтрифосфат и дезокситимидинтрифосфат (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). В предпочтительных вариантах изобретения используются нуклеотиды, не содержащие меток и модификаций.

Под разделением зарядов, происходящим в результате встраивания полимеразой нуклеотида в растущую цепь нуклеиновой кислоты, следует понимать разделение одной пары зарядов (присоединение электрона к растущей цепи нуклеиновой кислоты и выделение иона водорода в раствор), которое объективно происходит всякий раз, когда происходит встраивание нуклеотида в полимеризуемый фрагмент ДНК или РНК.

Под рабочим раствором понимается водный раствор, содержащий все необходимые вещества для обеспечения выполнения реакции полимеризации одноцепочечных фрагментов ДНК, находящихся в составе комплекса «полимераза-фрагмент ДНК», иммобилизованного на поверхности сенсора ячейки матрицы микросхемы. Рабочий раствор и реакционная смесь - синонимы в настоящем тексте.

ДЭС - двойной электрический слой, образующийся в растворе на границе раздела твердое тело - раствор.

Термин «вблизи» означает в непосредственной близости, на расстоянии нескольких нанометров.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Реализация изобретения в одном из вариантов осуществления заключается в совместном функционировании сенсора (комплекса ОАТ) и биологического комплекса, расположенных друг относительно друга таким образом, как показано на Фиг. 1.

Предлагаемый способ регистрации результата реакции полимеризации нуклеиновых кислот основан на следующих закономерностях. Во-первых: в результате встраивания полимеразой каждого комплементарного нуклеотида в полимеризуемый фрагмент ДНК/РНК происходит разделение зарядов [1]: один электрон остается на полимеризуемом фрагменте ДНК/РНК, а один протон выделяется в водный раствор. Во-вторых, сразу после разделения зарядов электрон и ион водорода индуцируют на поверхности электронного сенсора противозаряды одинаковой величины, но противоположного знака, которые компенсируют друг друга, но только на то время, пока ион водорода не удалится от места своего образования на некоторое расстояние в результате тепловой диффузии и действия электрического поля, сформированного зарядом электрода смещения ячейки. После чего на поверхности электронного сенсора остается некомпенсированный противозаряд, индуцированный электроном [1], результат воздействия которого на электронный сенсор преобразуется последним в электрический сигнал и регистрируется последующей схемой усиления и обработки сигнала, как факт разделения зарядов (факт встраивания нуклеотида). В-третьих, результаты регистрации фактов разделения зарядов будут иметь хорошую повторяемость, если разделение зарядов в ячейке матрицы происходят в одном и том же месте ячейки относительно сенсора этой ячейки, при одинаковых условиях реакции для каждого встраиваемого нуклеотида.

В одном из вариантов воплощения изобретения предлагаемый способ регистрации результата реакции полимеризации нуклеиновых кислот можно реализовать, например, при помощи следующих действий:

(а) получить образец нуклеиновой кислоты, представляющий собой множество закольцованных фрагментов нуклеиновой кислоты; сделать это возможно методом, как показано в Примере 1.

(б) получить биологический комплекс, состоящий по крайней мере из указанных закольцованных фрагментов нуклеиновой кислоты и полимеразы, имеющей сродство к нуклеиновой кислоте; сделать это возможно методом, как это показано в Примере 2.

(в) получить (изготовить) сенсор на основе ОАТ; сделать это возможно методом, как это показано в Примере 3.

(г) получить комплекс ОАТ; сделать это возможно методом, как это показано в Примере 4.

(д) подготовить поверхность сенсора на основе ОАТ к иммобилизации биологического комплекса с участием комплекса ОАТ; сделать это возможно методом, как это показано в Примере 5.

(е) иммобилизовать биологический комплекс на подготовленную к иммобилизации поверхность сенсора, при которой сохраняется функциональность полимеразы и обеспечивается нахождение полимеразы в составе биологического комплекса вблизи поверхности; сделать это возможно методом, как это показано в Примере 6.

(ж) обеспечить условия для функциональной активности указанной полимеразы по полимеризации закольцованного фрагмента нуклеиновой кислоты, заключающейся в катализе присоединения нуклеотидов к растущей цепи нуклеиновой кислоты; сделать это возможно методом, как это показано в Примере 7.

(з) сформировать сенсором сигнал, соответствующий фактам разделения зарядов, происходящих в результате встраивания полимеразой нуклеотидов в растущую цепь закольцованного фрагмента нуклеиновой кислоты.

Предпочтительный вариант реализации изобретения заключается в масштабировании ячейки сенсора в форму матрицы ячеек сенсоров, причем каждая ячейка содержит чувствительный к заряду наносенсор (сенсор на основе ОАТ), усилитель и аналого-цифровой преобразователь сигнала; каждая ячейка обеспечивается тройным комплексом «полимераза-праймер-матрица ДНК» и условиями присоединения тройного комплекса к поверхности наносенсора, приводящих к образованию множества наносенсоров с иммобилизованными на их поверхности одиночными тройными комплексами; обеспечивают указанные тройные комплексы условиями для проведения реакции полимеризации и регистрируют факты разделения каждой пары зарядов, сопровождающих включение нуклеотида в полимеризуемый фрагмент одноцепочечной нуклеиновой кислоты.

Так как в природе многие биохимические реакции производятся с разделением или перераспределением зарядов, способ и устройство по настоящему изобретению могут быть применены для регистрации результатов не только реакции полимеризации нуклеиновых кислот, но и других биохимических реакций.

Биохимические реакции с участием белковых ферментов происходят с разделением пар зарядов либо с перераспределением зарядов на поверхности реагирующих веществ. Например, класс реакций, в которых оксидаза взаимодействует с субстратом, характеризуется переносом электронов и протонов водорода с одного вещества на другое, при этом акцептором водорода является кислород, кофакторами реакции являются медь, железо, которые в активном центре оксидаз участвуют в переносе электронов. Примером такой реакции может быть процесс тканевого дыхания в митохондриях, где электроны, высвобождаемые из молекул различных субстратов при их полном окислении в клетке, переносятся на кислород с образованием метаболической воды:

О₂ + 4H⁺ +4e^- -> 2H₂O

Fe³⁺ + e^- -> Fe²⁺ / Fe2+ - e^- -> Fe3+

Cu²⁺ + e^- -> Cu¹⁺ / Cu¹⁺ - e^- -> Cu²⁺

Другими примерами подобных реакций являются, например, реакции фосфорилирования с участием ферментов киназ, или реакции дефосфорилирования с участием ферментов фосфатаз. При осуществлении изобретения для этих реакций лиганд или зарядовый центр на основе атома переходного металла переменной валентности должны быть выполнены с возможностью иммобилизации молекулы фермента вблизи зарядового центра. Для получения технического результата по настоящему изобретению важно, чтобы активный центр фермента, где происходит процесс разделения заряда, находился вблизи комплекса ОАТ (на дистанции 2-6 нм) в течение всего процесса протекания биохимической реакции.

Существуют примеры экспериментального использования моно- и биядерных металлических комплексов с органическими лигандами для создания одноэлектронных молекулярных транзисторов [10], [11]. Возможность получения монолигандных терпиридиновых комплексов с пяти- и шести-координированными ионами переходных металлов, способных к последующей координации дополнительных лигандов, показана в ряде работ последних лет. Так, в статье [12] описаны цинксодержащие монотерпиридиновые комплексы, в работах [13], [14] - близкие по структуре комплексы никеля, в работах [15], [16] - комплексы меди, родия и рутения. Комплексы кобальта, никеля и палладия с замещенными терпиридиновыми лигандами представлены в [17], комплексы с кобальтом, золотом, серебром, цинком и кадмием, описаны в статье [18]. Возможность препаративного синтеза родиевых и рутениевых комплексов серосодержащих терпиридинов показана в работах [19], [20].

Формирование ОАТ сенсором сигналов, соответствующих фактам разделения зарядов в ходе биохимической реакции происходит следующим образом.

Ключевым свойством ОАТ является его весьма высокая чувствительность к изменению заряда на атоме металла (см. Фиг. 1). Даже небольшое изменение заряда на атоме металла ∂Q, которое может быть существенно меньше, чем заряд электрона е, приводит к заметному изменению ∂I тока транзистора и может быть зарегистрировано. Это свойство одноэлектронного транзистора позволяет использовать его как уникальный электрометр с субэлектронной чувствительностью [24].

Вольтамперная характеристика этого устройства имеет характерную область кулоновской блокады (сплошная линия см. Фиг. 7А) при напряжениях |V| < Voff = e/C_Σ (C_Σ = C₁ + C₂ + Cg) - полная емкость атома металла, включающая С1, С2 - емкости между атомом металла и левым, и правым электродами, соответственно, Сg - емкость между атомом металла и управляющим электродом) и нулевом напряжении на управляющем электроде, когда туннелирование электронов не происходит ввиду энергетической невыгодности такого процесса.

При напряжениях Vg на управляющем электроде, соответствующих СgVg=Qg = е/2 +ne туннелирование возможно при любых напряжениях V и, в этом случае, вольтамперная характеристика транзистора не имеет блокадного участка (пунктирная линия см. Фиг. 7Б).

В связи с этим зависимость тока транзистора I (V=const) от величины поляризационного заряда Qg на атоме металла, получившая название модуляционной характеристики, имеет вид периодической функции с периодом по заряду в один электрон е, т.е. I(Q0+e) = I(Q0). Процесс коррелированного туннелирования электронов при напряжениях порядка Voff и менее характерен тем, что электроны приходят и уходят с атома металла транзистора последовательно один за другим. По этой причине транзистор назван одноэлектронным.

Уровень формируемого полезного сигнала сенсором на основе ОАТ в наибольшей степени определяется эффективной собственной емкостью Ceff металлического центра ОАТ. Расчет собственной эффективной емкости центрального металлического атома родия (Rh) и его ближайшего окружения в ОАТ дает величину равную C_Rh eff ~= 1,3 нм = 1,4х10^-19 Ф [25], [26], [27], что соответствует характерной кулоновской энергии Ec = (e²/2*C_Rh eff) ~= 1,1 эВ, что более чем в 40 раз превышает величину тепловых флуктуаций при комнатной температуре k_BT ~= 0,026 эВ. Такое большое значение характерной кулоновской энергии центрального металлического атома ОАТ обеспечивает работу сенсора в одноэлектронном режиме при комнатной температуре. Электрически этот атом металла связан с электродами стока и истока [28], [29] посредством одноэлектронного туннелирования. В роли туннельных барьеров выступают органические цепочки с одинарными химическими связями. Поскольку одночастичные волновые функции металлических электродов частично делокализованы в хвосты ОАТ на глубину L_Эл дел ~ 6Å, длина эффективного туннельного барьера может быть определена как L_Тун ~ 13Å. Высота эффективного туннельного барьера может быть определена как разница между положение LUMO одночастичного уровня ОАТ в нейтральном зарядовом состоянии и одночастичного электронного уровня последнего заполненного локализованного уровня на атоме металла, например, родия. Расчет, проведенный для ОАТ дает U_Тун эфф ~= 0,8 эВ. Оценка туннельного сопротивления левого и правого туннельных переходов между электродами и ОАТ соответственно: R ~ R_Q*exp(2*(2mU_Тун эфф)^1/2)*L_Тун/h ~= 2 ГоМ. Ранее, в реальных экспериментах с молекулами подобной ОАТ туннельное сопротивление одноатомных транзисторов было зарегистрировано на уровне R = 100 МоМ…10 ГоМ >> h/e² [30], ]31]. Подобные величины туннельных сопротивлений в случае коррелированного туннелирования электронов через атом металла в ОАТ соответствуют классическим туннельным барьерам в смысле малости прозрачности туннельных барьеров, что позволяет пренебречь квантовыми флуктуациями заряда, вызванными делокализацией электронов в системе электрод, органическая цепочка, металлический центр, например, на атоме родия в ОАТ, и использовать понятие зарядового состояния ОАТ [32]. В этом случае электронные одночастичные волновые функции молекулы и электродов стока и истока слабо связаны в смысле перекрытия “хвостов волновых функций” [33], [34]. Влияние внешнего электрического поля при напряженностях меньше внутриатомных приводит к штарковскому линейному сдвигу одночастичных электронных уровней ОАТ. В первом приближении можно считать, что с приложенной к туннельным электродам сенсора разностью потенциалов VT и заданию потенциала затвора VG происходит синхронное повышение или понижение электронных одночастичных энергетических уровней ОАТ в соответствующих зарядовых состояниях . Меняя туннельный VT и управляющий потенциалы VG, изменяется состав одночастичных энергетических уровней, участвующих в туннельном транспорте. Необходимо также учесть, что в процессе прихода и ухода электронов на металлический зарядовый центр ОАТ происходит изменение кулоновской энергии этого центра и, как следствие, эффективный сдвиг одночастичных электронных энергетических уровней.

Туннельные электроды сенсора находятся в термодинамически равновесном состоянии. В указанных условиях процесс туннельного транспорта электронов через хвосты ОАТ происходит некогерентным образом, т.е. информация о фазе волновой функции протуннеллировавшего электрона достаточно быстро теряется. В этом случае перенос электронов между электродами сенсора на ОАТ можно рассматривать как последовательность независимых актов туннелирования электронов. Электрон уходит (приходит) из какого-то одночастичного состояния в электроде и приходит (уходит) на один из электронных одночастичных электронных уровней ОАТ. Участие того или иного электронного одночастичного уровня, связанного с металлическим центром, определяется заданным электрическим смещением туннельных электродов и потенциалом управляющего затвора. В целом, можно говорить о том, что лишь только часть одночастичных электронных уровней ОАТ участвует в электронном транспорте.

Работа сенсора на основе ОАТ заключается в изменении проводимости (сопротивления) в системе туннельные электроды - ОАТ при разделении зарядов рядом с металлическим центром (родием). Поскольку в результате разделения зарядов в ДЭС высвобождается свободный протон, то для оценки полезного сигнала оценим изменение сопротивления транзистора R при его появлении. Изменение электрического потенциала в области нахождения атома родия можно оценить как ∆U_Эфф = e²/4πεε₀r_Rh-p.

Тогда изменение сопротивления можно определить как

∆R ~ ∆U_ЭффRL_Тун. Точное значение диэлектрической проницаемости ДЭС находится между относительной диэлектрической проницаемостью вакуума Ɛ = 1 и относительной диэлектрической проницаемостью рабочего раствора Ɛ ≈ 30. При r_Rh-p = 5 нм среднее изменение сопротивления транзистора составит 7%.

Для высокой чувствительности регистрации изменения сопротивления сенсора выбирается участок на границе кулоновского блокадного ромба ОАТ на диаграмме стабильности дифференциальной проводимости. В зависимости от выбранной рабочей точки ОАТ на диаграмме стабильности может происходить как увеличение сопротивления, так и его уменьшение. Возможность регистрации свободного протона обуславливается тем, что время его жизни составляет десятки микросекунд, тогда как время жизни электрона в молекуле относительно туннельных процессов составляет наносекунды. Таким образом в течение времени жизни протона происходит около тысячи туннельных событий, что достаточно для регистрации изменения проводимости системы.

Необходимо отметить, что туннельные эффекты в ОАТ будут работать наиболее эффективно при постоянном нахождении зарядового центра и каталитического центра фермента на расстоянии от 2 нм до 6 нм от электродов.

Представленные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.

Пример 1. Получение библиотеки закольцованных фрагментов нуклеиновой кислоты.

В качестве примера была сконструирована библиотека из двуцепочечного фрагмента ДНК, взятого в качестве модели фрагментов ДНК, получаемых из образца содержащего ДНК человека. Такой модельный фрагмент ДНК был получен с помощью ПЦР используя 10 нг олигонуклеотида Ультрамера длиной 177 пар нуклеотидов (п.н.) (Integrated DNA Technologies Inc., США), который служил матрицей для ПЦР. Реакция проводилась в реакционной смеси в объеме 50 мкл, содержащем смесь 2х Q5 Polymerase (New England Biolabs, Inc., США), 10 нг матрицы, и 500 нМ прямого и обратного ПЦР праймеров. Термоциклирование проводилось в следующих условиях: 98 °C 30 сек; затем 30 циклов – 98 °C 10 сек, 58 °C 30 сек, 72 °C 40 сек; далее 72 °C 2 мин. По завершению ПЦР двухцепочечные продукты были очищены, используя набор для очистки ДНК и элюированы в 50 мкл 50 мМ Трис pH 8.0. Схема процесса получения библиотеки ковалентно-замкнутых (закольцованных) молекул в форме «гантели» (“dumbbell”) [21] приведена на Фиг. 2А.

Для добавления аденозина (А) к 3’ концам 16 пикомолей (пм) ПЦР продукта были смешаны с Exo-мутантом Фрагмента Кленова ДНК полимеразы I (5 единиц/микролитр, NEB) в буффере NEB2 содержащем 0.1 мМ АТФ и реакция продолжалась 30 мин при 37°C. По завершению реакции продукты были очищены, используя набор для очистки ДНК и элюированы 50 мкл 50 мМ Трис pH 8.0. Дальнейшее лигирование адаптера-«шпильки» к обоим концам ПЦР продукта должно привести к получению ковалентно-замкнутой структуры в форме «гантели» служащей матрицей для синтеза ДНК полимеразой фага Phi29 по механизму «репликации катящегося кольца».

Лигирование проводилось следующим образом: к 4 пМолям ПЦР продукта с выступающими А-концам добавляли 50-кратный избыток (200 пМ) адаптера-«шпильки» и инкубировали в течении 2-х часов при комнатной температуре в 100 микролитрах ДНК лигазного буфера, содержащего 30 единиц/микролитр T4 ДНК лигазы (New England Biolabs, Inc., США). После инактивации ДНК лигазы при 65°С в течении 10 минут.

Для избавления от остатков ПЦР продукта, не имеющих ни одного пришитого адаптера или только один адаптер, а также избытков адаптера-«шпильки», к лигазной смеси были добавлены 250 единиц Экзонуклеазы III (Lucigen Inc., США) и 30 единиц Экзонуклеазы VII (New England Biolabs, Inc., США), и реакция расщепления продолжалась 60 мин при 37°C. Реакция была остановлена добавлением ЭДТА до конечной концентрации 25 мМ.

Ковалентно-замкнутые молекулы ДНК в форме «гантели» были очищены из реакционной смеси используя NucleoSpin® Gel и PCR Clean-Up Kit (Clontech, Takara Co., Япония), см. Фиг. 2Б.

Перечень последовательностей, которые применяли в экспериментах, которые приведены в качестве Примеров:

SEQ ID NO:2 - Прямой ПЦР праймер 5’-/Phos/CATGTAGTGTACGATCCGACTT-3’

SEQ ID NO:3 - Обратный ПЦР праймер 5’-TCCATAGCAGGCTTGGACCT-3’

SEQ ID NO:4 - Олигонуклеотид-«мостик» 5’-GTACACTACATGTCCATAGCAGGCTTG-3’

SEQ ID NO:5 - Адаптер «шпилька» 5’-ATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATT-3’

SEQ ID NO:6 - Праймер для секвенирования 3’-AAGGAGGAGGAGGCAACAACA-5’

Пример 2. Получение комплекса, состоящего из закольцованных фрагментов нуклеиновой кислоты, праймера для секвенирования и полимеразы.

Для получения тройных комплексов «Полимераза-Праймер-ДНК Матрица» сначала 0.2 пикомоля ковалентно-замкнутых молекул ДНК в форме «гантель» смешивали с 0.4 пикомоля праймера для секвенирования (предварительно нагретого до 85°С и быстро охлажденного на льду) в буфере 10 мМ Трис pH8.0/25 мМ NaCl/0.1 мМ ЭДТА и смесь инкубировали течении 60 мин при 20°С. Далее добавляли 0.6 пикомоля ДНК полимеразы фага Phi29 несущей [HIS]6-таг (шесть гистидинов добавленых к С-концу последовательности полимеразы необходимых для иммобилизации тройного комплекса на поверхности сенсора), и смесь инкубировали 30 минут при 30°C. В результате этого были получены тройные комплексы «Полимераза-Праймер-Матрица».

Пример 3. Изготовление конструкции сенсора на основе ОАТ.

На подложке из высокоомного кремния или оксида кремния изготавливается нанопровод с боковыми затворами из золота методом магнетронного напыления золота через маску, созданную с помощью электронной литографии [10]. Нанопровод создается со сужением в центральной части Lсуж = 15-20 нм с минимальным поперечным сечением Sсеч = 40 х 25 нм². После создания электродов боковые затворы и подводящие электроды закрываются защитным слоем диэлектрика Al2O3 или SiO2 для предотвращения возникновения ионных токов, толщиной Hзащ = 10-20 нм, оставляя открытой только центральную часть нанопровода (сужение). Длина открытой части по оси нанопровода обычно составляет от Lнм = 40-80 нм и определяется используемыми материалами и методом напыления. После нанесения защитного слоя на изготавливаемую структуру производится осаждение комплекса ОАТ в растворе на не закрытую диэлектриком поверхность нанопровода. Поверхностная концентрация ОАТ на всю площадь нанопровода должна находиться в диапазоне Ƞ ~ 5-10 шт. Зацепление молекул комплекса ОАТ с поверхностью золота осуществляется с помощью тиольной группы путем образования ковалентных связей. После осаждения комплекса ОАТ производится процесс образования нанозазора, например, методом электроразрыва нанопровода. Разрыв осуществляется за счет пропускания постоянного электрического тока через золотой нанопровод c постепенно увеличивающимся напряжением сток-исток (с шагом Vшаг = 20-40 мВ). Обратная связь для электромиграции обеспечивается за счет управляющей, компьютеризированный системы. На каждом шаге задания напряжения сток-исток производится автоматической измерение сопротивления золотого нанопровода. По достижению заданного сопротивления нанопровода, напряжение сток-исток отключается и нанопровод разрывается в области максимального сужения по инерции, - за счет существенного нагрева в этой области. О достижении разрыва может свидетельствовать сопротивление разорванного провода из золота, которое существенно превышает квантовое сопротивление R >> R_Q = h/e². В результате разрыва нанопровода 1 (подводящие электроды 3, электроды затворов 2 и основная часть нанопровода 1 защищены от раствора изолятором, например, окислом кремния (см. Фиг. 5)) образуется зазор шириной Dзаз = 3-5 нм. Причем, электрод с одной стороны зазора может иметь тупой конец, электрод с другой стороны зазора может иметь острый конец. Разная форма окончаний электродов стока и истока после процесса электромиграции определяется использованием постоянного напряжения и тока и образованием объемного заряда перед сужением нанопровода в процессе электромиграции. Форма окончаний электродов стока и истока может быть и одинаковой, если использовать переменный ток для процедуры электромиграции. Непосредственно после образования разрыва в ходе процедуры электромиграции происходит эффект самосборки сенсора на основе ОАТ за счет самопроизвольного замыкания молекулами комплекса ОАТ электродов стока и истока. После выполнения всех указанных операций сенсор готов к работе как сверхчувствительный зарядовый сенсор.

Пример 4. Синтез комплекса ОАТ.

Задача синтеза комплекса ОАТ решается способом получения координационного соединения переходного металла с органическим лигандом общей формулы 1:

где X - линкер, соединенный с бензольным ядром в положениях 2, 4-, 3, 4- или 3, 5-, содержащий 1-3 фрагмента, выбранные из группы, включающей С6-С12 алкил, арил, гетероцикл, простые эфирные группы, сложноэфирные группы, амидные группы; Y выбран из группы, включающей тиол, дисульфид, тиоацетат; ион переходного металла M выбран из группы, включающей платину, палладий, родий, рутений, медь, кобальт, никель, цинк; Z выбран из группы, включающей галогенид (фтор, хлор, бром и иод), нитрат, молекула воды; количество анионов n = 2 или 3, m = 1 или 2, характеризующегося тем, что 1±0.1 мольных экв. соответствующего органического лиганда, полученного исходя из ацетилпиридина и бензальдегида с 2-мя дополнительными заместителями в бензольном кольце, и 1±0.1 мольных экв. соответствующей соли переходного металла MZ_n (безводной или в виде кристаллогидрата) растворяют в смеси одноатомного спирта и воды, взятой в количестве 10 мл на 0.5±0.1 ммоль, и нагревают при температуре 40-80°С в течение 30±10 мин после достижения раствором указанной температуры, затем смесь охлаждают до комнатной температуры, выпавший осадок отфильтровывают в вакууме со стеклянным пористым фильтром и колбой Бунзена и высушивают в вакууме при 20-40°С до достижения осадком постоянной массы.

Предметом данного изобретения является органический лиганд и его металлический комплекс, обладающий свойством выполнять функцию одноэлектронного молекулярного транзистора в составе комплекса ОАТ, представляющий собой соединение общей формулы 1.

Для применения в составе наносенсора предпочтительным вариантом является следующая модификация комплекса ОАТ с двумя линкерными группировками.

Получение ((4-([2,2':6',2''-терпиридин]-4'-ил)-1,3-фенилен)бис(окси))бис(ундекан-11,1-диил) бис(5-(1,2-дитиолан-3-ил)пентаноат родий(III) трихлорида (1.1) представлено на Фиг. 3.

Смесь 1,05 г (1 ммоль, 1±0.1 экв.) соответствующего органического лиганда ((4-([2,2':6',2''-терпиридин]-4'-ил)-1,3-фенилен)бис(окси))бис(ундекан-11,1-диил)бис(5-(1,2-дитиолан-3-ил)пентаноата и 0,26 г (1 ммоль, 1±0.1 экв.) тригидрата хлорида родия в 10 мл смеси этанол-вода (1:1 по объему) с добавлением 2-3 капель хлороформа нагревали до кипения и выдерживали при этой температуре при перемешивании в течение 4 ч, после чего охлаждали до комнатной температуры, выпавший осадок отфильтровывали на стеклянном фильтре, промывали последовательно хлороформом, спиртом, водой и высушивали в вакууме масляного насоса при комнатной температуре до достижения постоянной массы. Выход составил 61%. Т. пл. _. > 300°С. Получение было подтверждено спектром ЯМР:

¹Н NMR (400 MHz, DMSO-d₆), δ, ppm (J, Hz): 1.85-1.95 (м, 2H, CH₂), 1.75-1.85 (м, 2H, CH₂), 2.14 (s, 3H, NCH₃), 1.25-1.75 (м, 48H, CH₂), 2.30 (дт, J=6.6, 1.5 Гц, 2Н, СН₂С(О)), 2.36 (т, J=6.6, 2Н, СН₂С(О)), 3.13 (м, 2H, HCS), 3.53 (м, 2H, HCS), 3.62 (м, 2H, HCS), 4.03 (м, 8H, HСО), 7.34 (д, J = 8.4 Гц, 4H, ArH), 7.54 (т, J = 7.8 Гц, 4H, tpyH),. 7.94 (д, J = 7.8 Гц, 4H, tpyH), 8.39 (т, J = 7.8 Гц, 4H, tpyH), 8.47 (д, J = 8.4 Гц, 4H, ArH), 9.21 (д, J = 7.8 Гц, 4H, tpyH), 9.54 (c, 4H, tpyH). Найдено, %: С 55.93; H 6.33; N 3.34. C₅₉H₈₃Cl₃N₃O₆RhS₄. Вычислено, %: C, 55.89; H, 6.60; N, 3.31.

Пример 5. Подготовка поверхности сенсора на основе ОАТ к иммобилизации биологического комплекса.

Непосредственно перед началом процедуры электромиграции (применение которой описано в Примере 3) часть нанопровода из золота, которая не защищена диэлектриком от контакта с водным раствором, должна быть подготовлена к иммобилизации биологического комплекса. Для этого незащищенную окислом кремния часть золотого нанопровода промывают раствором «пиранья», и после этого - многократно дистиллированной водой, выдерживают в растворе ((4-([2,2':6',2''-терпиридин]-4'-ил)-1,3-фенилен)бис(окси))бис(ундекан-11,1-диил) бис(5-(1,2-дитиолан-3-ил)пентаноат родий(III) трихлорида (1.1), или другого металлического комплекса общей формулы 1 (см. Пример 4), в диметилформамиде или диметилсульфоксиде (концентрация 2,5-3,0х10-4 М) в течение 24 часов, после чего сенсор с нанопроводом из золота несколько раз промывают диметилформамидом или диметилсульфоксидом и высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Пример 6. Иммобилизация биологического комплекса «Полимераза-Праймер-Матрица» на поверхность сенсора ОАТ.

Для связывания тройного комплекса с поверхностью сенсора используется способность [His]6-тэга, находящегося на С-конце молекулы полимеразы, образовывать стабильную химическую связь с металлокомплексом, сформированным на заданном участке сенсора [23]. Примером металлокомплекса является Cu2+ или Ni2+-NTA комплекс, представляющий головную группу одного из алканов в смешанном самособирающемся монослое на поверхности золота, или головную группу полиэтиленгликолевой «щетки» покрывающую участок сенсора. В данном примере тройные комплексы связываются с Cu2+/PEG ZeroBkg поверхностью (MicroSurfaces Inc., США). Для этого тройные комплексы, находящиеся в загрузочном буфере (30 мМ HEPES pH 7.5/150 мM хлорид натрия/1 mM ДTT), добавляли на Cu2+/PEG поверхность, интегрированную в проточную ячейку, и инкубировали при +4°С 12 часов. Далее, проточная ячейка промывалась загрузочным буфером, чтобы удалить не связавшиеся с поверхностью тройные комплексы, а затем Полимеразным буфером (30 мМ HEPES pH 7.5/75 мM хлорид натрия/1 mM ДTT, и 250 нМ каждого из дЦТФ, дАТФ, дТТФ). После чего иммобилизованные комплексы находятся в состоянии готовности начать синтез ДНК (секвенирование).

Присоединение полимеразы с комплексом ОАТ происходило путем замещения неорганических лигандов Z при ионе металла комплекса ОМТ на азотные группы, присутствующие в гистидиновых фрагментах [His]6-тэга полимеразы, как показано на Фиг. 6. Возможны и другие варианты присоединения, позволяющие иммобилизовать полимеразу и обеспечить нахождение полимеразы вблизи комплекса ОАТ в течение всего процесса определения нуклеотидной последовательности.

Пример 7. Полимеризация закольцованного фрагмента нуклеиновой кислоты.

Иммобилизованная полимераза сохраняет полную функциональную активность, включая способность к синтезу и вытеснению цепи ДНК.

Тройные комплексы «Полимераза-Праймер-Матрица», иммобилизованные через химическую связь между поли-гистидинами на С-конце полимеразы и функционализированной металлокомплексом поверхностью сенсора, и находящиеся в Полимеразном буфере (30 мМ HEPES pH 7.5/150 мM хлорид натрия/1 mM ДTT, и 250 нМ каждого из дЦТФ, дАТФ, дТТФ) как указано в Примере 6, находятся в стадии готовности начать синтез ДНК, так как отсутствует первый на очереди для встраивания в цепь ДНК нуклеотид трифосфат, так как матрицей для синтеза служили закольцованные в форме «гантель» молекулы ДНК (см. Пример 1). Реакция синтеза инициировалась добавлением Полимеразного буфера, содержащего все четыре дНТФ и 5 мМ хлорида магния, и продолжалась 60 минут при 30°С. Реакция останавливалась добавлением ЭДТА до конечной концентрации 20 мМ, и продукты реакции синтеза ДНК по механизму «репликации катящегося кольца» были визуализированы их окрашивании интеркалирующим в ДНК красителем SYBR Gold и флуоресцентной микроскопии при 20х увеличении (микроскоп Аксиоверт, Zeiss) (см. Фиг. 2В, левая панель). Таким образом, иммобилизованная на поверхности полимераза показала функциональную активность на твердой поверхности. Чтобы подтвердить специфичность химического связывания тройного комплекса с металлокомплексом поверхности, после получения фотографий продуктов ДНК синтеза проточная ячейка промывалась раствором 0.5 М имидазола, чтобы разрушить связь Cu2+-полиГистидин. Как и ожидалось полимеразные комплексы вместе с продуктами ДНК синтеза были эффективно удалены с поверхности действием имидазола (см. Фиг. 2В, правая панель).

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Используемая литература.

[1] Pourmand N, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2006 Apr 25;103(17):6466-70.

[2] Патент РФ № 2679494 от 11.02.2019г. на «Способ безметочного одномолекулярного секвенирования ДНК и устройство для его реализации».

[3] Гуторов М.А., Кашин В.В., Колесов В.В., Шорохов В.В., ООО «ГАММА-ДНК», Россия, Москва: Сверхчувствительный зарядовый сенсор для задач одномолекулярного секвенирования» Наука России: Цели и задачи. Сборник научных трудов, по материалам XII международной научно-практической конференции 10 декабря 2018 г. Часть 1 Изд. НИЦ «Л-Журнал», 2018, стр.5.

[4] US 9,829,456 Bl Nov. 28, 2017 «METHOD OF МAКING А MULТI-ELECTRODE STRUCTURE USABLE IN MOLECULAR SENSING DEVICES».

[5] US 10,036,064 В2 Jul. 31, 2018 «BIOMOLECULAR SENSORS AND METHODS».

[6] US 2018/0305727 Al Oct. 25, 2018 «ENZYМAТIC CIRCUITS FOR MOLECULAR SENSORS».

[7] US 7,948,015 В2 Мау 24, 2011 «METHODS AND APPARATUS FOR MEASURING ANALYTES USING LARGE SCALE FET ARRAYS».

[8] US 2015/0065353 A1 Mar. 5, 2015 «REAL-TIME ELECTRONIC SEQUENCING».

[9] 103(17):6466-70; Pourmand N, et al., A label-free CMOS DNA microarray based on charge sensing, in Proceedings of the IEEE Instrumentation and Measurement Technology Conference, Victoria, BC, Canada, May 12-15, 2008.

[10] Coulomb blockade and the Kondo effect in single atom transistors, J. Park, A.N. Pasupathy, J.I. Goldsmith, Nature, 417, 722-725, 2002/

[11] Kondo resonance in a single-molecule transistor, W. Liang, M.P. Shores, M. Bockrath et all, Nature, 417, 725-7292002.

[12] Urease inhibitory activities of ZnBr2 and ZnI2 complexes of terpyridine derivatives: Systematic investigation of aryl substituents on urease inhibitory activities, A. N. Kharat, A. Bakhoda, G. Bruno, H. A. Rudbari, Polyhedron 45, 9-14,2012.

[13] New complexes of 6,6-dimethyl-2,2:6,2-terpyridine with Ni(II) ions: Synthesis, structure and magnetic properties, A. Gorczyn'ski, M. W. Chorab, M. Kubicki, M. Korabik, V. Patroniak,. Polyhedron 77, 17-23, 2014.

[14] Ni(II) complexes of 4-(2-pyridyl)-2,2:6,2-terpyridine: Structure of mono- and bis-chelates containing anionp interactions, S. K. Padhi, R. Sahu, V. Manivannan, Polyhedron, 27, 2221-2225, 2008.

[15] Chiral C1-symmetric 2,2:6,2-terpyridine ligands: Synthesis, characterization, complexation with copper(II), rhodium(III) and ruthenium(II) ions and use of the complexes in catalytic cyclopropanation of styrene, C.-T. Yeung, W.-S. Lee, C.-S. Tsang, S.-M.n Yiu, W.-T. Wong, W.-Y. Wong, H.-L. Kwong, Polyhedron, 29, 1497-1507, 2010.

[16] Structural, spectroscopic and magnetic properties of new copper(II) complexes with a terpyridine ligand, M. W. Chorab, A. R. Stefankiewicz, A. Gorczyn'ski, M. Kubicki, J. Kłak, M. J. Korabik, V. Patroniak, Polyhedron, 30, 233-240, 2011.

[17] Water-soluble NNN-pincer complexes of cobalt, nickel and palladium: Solid-state structures and catalytic activity. J, Heidebrecht, C, Gendy, B, S. Gelfand, R, Roesler, Polyhedron, 143, 138-143, 2018.

[18] Complexation behavior of 6,6-dimethyl-2,2:6,2-terpyridine ligand with Co(II), Au(III), Ag(I), Zn(II) and Cd(II) ions: Synthesis, spectroscopic characterization and unusual structural motifs, A. Bocian, D. Brykczyn'ska, M. Kubicki, Z. Hnatejko, M. W.-Chorab, A. Gorczyn'ski, V. Patroniak, Polyhedron, 157, 249-261, 2019.

[19] Mononuclear ruthenium(II) and rhodium(III) complexes with S-[4-(2,2:6’,2’’-terpyridin-4’-yl)phenoxy]butyl ethanethioate and 4’-[4-(1,2-dithiolane-3-yl)butylcarboxy)phenyl]-2,2’:6’,2’’-terpyridine, E. K. Beloglazkina, E. A. Manzheliy, A. A. Moiseeva, O. A. Maloshitskaya, N. V. Zyk, D. A. Skvortsov, I. A. Osterman, P. V. Sergiev, O. A. Dontsova, Y. A.Ivanenkov, M. S.Veselov, A. G. Majouga, Polyhedron, 107, 27-37; 2016.

[20] Mononuclear ruthenium(II) and rhodium(III) complexes with S-[4-(2,2:6’,2’’-terpyridin-4’-yl)phenoxy]butyl ethanethioate and 4’-[4-(1,2-dithiolane-3-yl)butylcarboxy)phenyl]-2,2’:6’,2’’-terpyridine, E. K. Beloglazkina, A. G.Majouga, E. A. Manzheliy, A. A.Moiseeva, Y. V. Lin’kova, N. V. Zyk, Polyhedron, , 85, 800-808, 2015.

[21] D.Erie, N.Sinha, W.Olson, R.Jones, and K.Breslauer. A dumbbell-shaped, double-hairpin structure of DNA: a thermodynamic investigation, Biochemistry, 1987, v.26, pp.7150-7159.

[22] A Coulomb Blockade in a Nanostructure Based on Single Intramolecular Charge Center, V.R. Gaydamachenko, E.K. Beloglazkina, R.A. Petrov, S.A. Dagesyan, I.V. Sapkov, E.S. Soldatov, Moscow University Physics Bulletin, 73(2), 193-198, 2018.

[23] Hochuli, E.; Bannwarth, W.; Döbeli, H.; Gentz, R.; Stüber, D. (1988). "Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent". Bio/Technology. 6 (11), pp.1321-1325.

[24] Likharev K.K. Single-electron devices and their applications //Proceedings of the IEEE. 1999. Т. 87. №. 4. С. 606-632.

[25] Studying the possibility of building a single-electron transistor based on a molecule with a monatomic charge center, A.A. Parshintsev, V.V. Shorokhov, E.S. Soldatov, Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics 81 (1), 38-42/

[26] Characteristics of Electron Transport in Molecular Single-Atom Transistors Based on Atoms of Sc, Cr, Ru, Rh, and Pt, A.A. Parshintsev, V.V. Shorokhov, E.S. Soldatov, Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics 83 (1), 6-11, 2019/

[27] Electron Transport in a Single-Electron Molecular Transistor with an Rh, Ru, or Pt Single-Atom Charge Center, A.A. Parshintsev, V.V. Shorokhov, E.S. Soldatov, Moscow University Physics Bulletin 73 (5), 493-500).

[28] Simulation of characteristics of a molecular single-electron tunneling transistor with a discrete energy spectrum of the central electrode, V.V. Shorokhov, P. Johansson, E.S. Soldatov, Journal of applied physics, 91 (5), 3049-3053, 2002.

[29] Theoretical study of characteristics of a molecular single-electron transistor, V.V. Shorokhov, E.S. Soldatov, O.V. Snigirev, Thin Solid Films 464, 445-451.

[30] Molecular clusters as building blocks for nanoelectronics: the first demonstration of a cluster single-electron tunnelling transistor at room temperature, S.P. Gubin, Yu.V. Gulayev, G.B. Khomutov, V.V. Kislov, V.V. Kolesov, E.S. Soldatov, K.S. Sulaimankulov and A.S. Trifonov, Nanotechnology, 13(2), 2002.

[31] Gold nanoparticle single-electron transistor simulation, Y.S. Gerasimov, V.V. Shorokhov, E.S. Soldatov, O.V. Snigirev, International Conference Micro-and Nano-Electronics 2012 8700, 870015/

[32] Single-electron devices and their applications, K.K. Likharev, Proceedings of the IEEE, 87(4), 1999).

[33] Correlated single-electron tunneling via mesoscopic metal particles: Effects of the energy quantization DV Averin, AN Korotkov, Journal of low temperature physics, 80 (3-4), pp. 173-185, 1990.

[34] Charge sensitivity of the single electron tunneling transistor with discrete energy spectrum, D.V. Averin, Journal of Applied Physics 73, 2593, 1993.

1. Устройство для регистрации изменения электрического поля в процессе биохимической реакции, катализируемой молекулой фермента, содержащее по меньшей мере: (а) одноатомный зарядовый центр на основе атома переходного металла переменной валентности, содержащего не менее двух свободных электронов на внешней оболочке, координированного с тридентатным терпиридиновым лигандом, при этом лиганд или зарядовый центр выполнены с возможностью обеспечения иммобилизации молекулы фермента вблизи зарядового центра; (б) левый и правый металлические электроды, при этом электроды и зарядовый центр расположены с возможностью образовывать два последовательно соединенных туннельных перехода, обеспечивающих возможность туннелирования электронов между левым электродом и атомом металла, и между этим же атомом металла и правым электродом; (в) по меньшей мере одну непроводящую линкерную группировку, связанную ковалентной связью с тридентатным терпиридиновым лигандом, и удерживающую атом металла вблизи разрыва между левым и правым электродами, при этом длина указанной линкерной группировки варьируется в пределах от 2 до 6 нм.

2. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что дополнительно содержит управляющий электрод из металла, потенциалом на котором, вместе с заданием разности потенциалов на левом и правом электродах, задается такая рабочая точка устройства, которая обеспечивает максимальную чувствительность устройства при регистрации изменения электрического поля.

3. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что биохимической реакцией является реакция полимеризации нуклеиновой кислоты, и ферментом, катализирующим реакцию, является полимераза, имеющая сродство к нуклеиновой кислоте.

4. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что атомом переходного металла переменной валентности является Zn, Cd, Pt, Pd, Ru, Rh, Ni, Co или Cu, и образование ковалентной связи между линкерной группировкой и электродом происходит за счет включения в линкерную группировку серосодержащей группировки, выбранной из: тиольная, дисульфидная, циклическая дисульфидная, тиоацетатная.

5. Способ определения нуклеотидной последовательности фрагмента молекулы нуклеиновой кислоты, включающий по меньшей мере следующие стадии:

(а) получают образец, приготовленный из указанного фрагмента молекулы нуклеиновой кислоты;

(б) обеспечивают условия для иммобилизации молекулы полимеразы, имеющей сродство к нуклеиновой кислоте, с указанным образцом на устройстве по п. 1, при этом иммобилизация сохраняет функциональность полимеразы и обеспечивает нахождение полимеразы вблизи зарядового центра устройства по п.1 в течение всего процесса определения нуклеотидной последовательности;

(в) обеспечивают условия для функциональной активности указанной полимеразы, заключающейся в катализе присоединения нуклеотидов к растущей цепи нуклеиновой кислоты, где условия для функциональной активности полимеразы включают:

добавление смеси двух или более видов немеченых дезоксирибонуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из дезоксиаденозинтрифосфата, дезоксигуанозинтрифосфата, дезоксицитидинтрифосфата и дезокситимидинтрифосфата вблизи устройства по п.1, или добавление смеси двух или более видов немеченых рибонуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из аденозинтрифосфата, гуанозинтрифосфата, цитидинтрифосфата и уридинтрифосфата вблизи устройства по п.1, при этом в указанной смеси нуклеотид одного вида присутствует в меньшей концентрации, чем нуклеотиды других видов;

(г) регистрируют при помощи устройства по п. 1 факт разделения зарядов, происходящий в результате встраивания полимеразой нуклеотида в растущую цепь нуклеиновой кислоты, и определяют временные интервалы между каждым последующим зарегистрированным фактом разделения зарядов;

(д) по меньшей мере однократно повторяют стадии (в) и (г), при этом при каждом повторении вид нуклеотида, присутствующего в добавляемой смеси нуклеотидов в меньшей концентрации по сравнению с другими видами, изменяется;

(е) определяют нуклеотидную последовательность указанного фрагмента молекулы нуклеиновой кислоты, основываясь на анализе определенных на стадиях (г) и (д) временных интервалов между каждым зарегистрированным фактом разделения зарядов, где разделения зарядов произошли в результате встраивания полимеразой указанных немеченых нуклеотидов в растущую цепь нуклеиновой кислоты.

6. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что образец, приготовленный из фрагмента молекулы нуклеиновой кислоты, представляет собой закольцованный фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты.