Способ прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии



Способ прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии
Способ прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии
G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)
G01N2800/50 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2725132:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и предназначено для прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии. Образец ДНК, выделенный из венозной крови пациента, исследуют по полиморфизмам генов GRIN1 (rs1126442) и GRIN2A (rs1969060). Для каждого из указанных полиморфизмов устанавливают гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние генотипов АА и GG исследуемых генов. Далее проводят сопоставление выявленных гомозиготных генотипов с таблицей индексов индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии для конкретного генотипа. При значении индекса более 1,03 делают вывод о высоком индивидуальном риске развития посттравматической эпилепсии. При значении, равном или менее 1,03, - об отсутствии индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии. Изобретение обеспечивает повышение точности прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии. 2 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, эпилептологии и может быть использовано для оценки индекса индивидуального риска формирования эпилепсии после перенесенной черепно-мозговой травмы.

Эпилепсия является одним из распространенных неврологических заболеваний. В последнее время большое внимание уделяется клеточно-молекулярным механизмам эпилептогенеза, где важную роль играют NMDA-рецепторы. NMDA-рецепторный комплекс состоит из двух NR1 и двух NR2 субъединиц, кодируемых генами GRIN1 и GRIN2A. По данным литературы известны генетические ассоциации гена GRIN2A с роландической эпилепсией, электрическим эпилептическим статусом во сне (ESES) и синдромом Драве [Батышева Т.Т, Квасова О.В., Трепилец С.В., Бадалян О.В., Бурд С.Г., Трепилец В.М., Балканская С.В., Глазкова С.В., Платонова А.Н. Методические рекомендации №27 «Современные подходы к диагностике и лечению детей, ассоциированных с электрическим эпилептическим статусом медленного сна ESES», Москва, 2015; 5-10; Белоусова Е.Д. Генетика эпилепсии: зачем и как обследовать детей с эпилепсией. Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. 2014; (спецвыпуск 1):4-8]. Частота встречаемости пациентов с эпилепсией в популяции по разным оценкам составляет 0,52% (данные ВОЗ).

Существует множество факторов риска, способствующих формированию эпилепсии. Одним из основных является черепно-мозговая травма (ЧМТ). По данным ВОЗ, частота развития посттравматической эпилепсии (ПТЭ) достигает 20%. В связи с этим актуален поиск прогностических маркеров развития ПТЭ.

Известны способы прогнозирования развития симптоматической эпилепсии после перенесенных вирусных энцефалитов с учетом клинических симптомов в сочетании с изменениями на электроэнцефалограмме (ЭЭГ) и фокальными поражениями коры головного мозга по данным нейровизуализирующих исследований [Wang-Tso Lee, Tsui-Wen Yu et al. Risk factors for postencephalitic epilepsy in children: a hospital-based study in Taiwan // Eur J of Paediatr Neurol, 2007; 11: 302-309].

Недостатки данного способа: наличие разнообразных клинических симптомов, дифференцирующих особенности заболевания у конкретного пациента; способ не учитывает выраженность воспалительных компонентов, которые являются основой патогенеза нейроинфекций.

Известен способ прогнозирования риска развития симптоматической эпилепсии при нейроинфекциях у детей, заключающийся в оценке риска развития эпилепсии путем определения уровня альфа-1 антитрипсина в цереброспинальной жидкости и выявления очаговой эпилептиформной активности при 2-часовом ЭЭГ-мониторинге в остром периоде заболевания [Патент РФ №2652967 Аксенова А.И., Горелик Е.Ю., Войтенков В.Б., Скрипченко Н.В.]. К недостаткам указанного способа относится инвазивность метода, необходимость госпитализации пациента.

В патентных источниках отсутствуют способы прогнозирования риска развития эпилепсии после перенесенной ЧМТ. Существует ряд критериев, с помощью которых возможен прогноз развития ПТЭ. Отмечается зависимость развития эпилептической болезни от тяжести черепно-мозговой травмы, от локализации эпилептического очага, наличия очаговых изменений по данным КТ и МРТ, соответствующая им эпилептиформная и пароксизмальная активность на ЭЭГ. Однако не всегда имеющиеся критерии сопровождаются развитием ПТЭ, что может свидетельствовать о роли наследственной предрасположенности к эпилептическим припадкам.

Технический результат: объективизация способа, доступность, повышение точности прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии.

Указанный результат достигается путем определения генетических маркеров в ДНК больного ПТЭ методом полимеразной цепной реакции, с последующим сопоставлением с таблицей индексов индивидуального риска (ИИР) развития посттравматической эпилепсии для конкретного генотипа. При значении ИИР более 1,03 делают вывод о высоком индивидуальном риске развития ПТЭ, равном или менее 1,03 - об отсутствии индивидуального риска развития ПТЭ.

Способ осуществляют следующим образом:

У обследуемого больного проводится забор венозной крови в объеме 5-7 мл в пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта, независимо от приема пищи. Затем проводится выделение ДНК из полученных проб при помощи коммерческого набора ДНК-Экстран-1 ЗАО «Синтол», Россия. Для этого в 1,5 мл пробирку (Eppendorf) вносят 100 мкл анализируемого образца крови и 300 мкл лизирующего раствора (0,5% раствор саркозила и протеиназы К 20 мг/мл в ацетатном буфере рН 7,5) для гемолиза эритроцитов. Далее добавляют сорбент (каолин), перемешивают на вортексе в течение 5 секунд и осаждают капли центрифугированием при 1000 об/мин, трижды повторяют процедуру промывки пробы от белков и липидов, удаляя надосадочную жидкость. Нуклеиновые кислоты остаются на сорбенте. Затем проводится экстракция адсорбированных ДНК ТЕ-буфером (смесь 10 мМ трис- HCI и 1 мМ ЭДТА (рН=8,0).

Экстракт подвергают центрифугированию, полученная надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Полученный препарат ДНК готов к внесению в реакционную смесь для полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems, США, где в качестве праймеров использованы участки ДНК: гена GRIN1 (rs 1126442) и GREN2A (rs 1969060). Проводят реакцию амплификации, которая достигается тем, что для исследования аллелей каждого гена у отдельного человека готовят реакционную смесь. В каждую лунку планшетки вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров и зондов для выбранных генов: GRIN1 (rs 1126442) и GRIN2A (rs 1969060). В планшетку в каждую лунку добавляют остальные компоненты, необходимые для осуществления ПЦР, согласно инструкции коммерческого набора 2,5 х Реакционная смесь для проведения ПЦР (ЗАО «Синтол», Россия), нуклеотиды (дезоксинуклеотидтрифосфаты: по 10 мМ д АТФ, д ТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCI- буфера, 500 мМ КCI, 40 мМ MgCI2) и Tag F полимеразы. Соответственно объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Планшетка плотно закрывается и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификация и детекция осуществляется на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad, США. Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов). Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С). Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96. По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние генов GRIN1 и GRIN2A в исследуемом участке ДНК Т (-3499) С методом аллельной дискриминации. Возможны два варианта состояния гена: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда имеются два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливают гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние генов GRIN1 (rs 1126442) и GRIN2A (rs 1969060).

Прогнозирование индивидуального риска развития ПТЭ оценивают по гомозиготному состоянию генов пациента. Проводят сопоставление выявленных гомозиготных генотипов АА и GG гена GRIN2A (rs 1969060), генотипа АА гена GRIN1 (rs 1126442) с таблицей индексов индивидуального риска (ИИР) развития ПТЭ. При значении ИИР более 1,03 делают вывод о высоком индивидуальном риске развития ПТЭ, равном или менее 1,03 - об отсутствии индивидуального риска развития ПТЭ.

Способ апробирован при исследовании 138 пациентов с верифицированным диагнозом эпилепсия (66 человек с ПТЭ, 72 человека с идиопатической эпилепсией (ИЭ), а также 66 человек с перенесенной ЧМТ без развития эпилепсии), у которых проведен подсчет распределения генотипов (в абсолютном и процентном соотношении) для каждого гена в группах, как представлено в таблице 1.

Для определения ИИР по каждому генотипу была предварительно рассчитана частота встречаемости генотипов в популяции, участвующих в развитии заболевания в зависимости от среднего популяционного риска, значение которого известного как 0,52%: средний популяционный риск / процентное соотношение генотипа в общей популяции (пример расчета частоты встречаемости генотипа АА гена GRIN2A в популяции: 0,52% / 6,5%=0,08%).

Также рассчитывался средний популяционный риск для конкретного генотипа по формуле: частота встречаемости генотипа в популяции + средний популяционный риск: (средний популяционный риск для генотипа АА гена GRIN2A: 0,08%+0,52%=0,6%).

Используя данное значение, проведен расчет ИИР развития заболевания у обследуемых: 0,52% / 0,6%=1,15 (ИИР для генотипа АА гена GRIN 2А). При значении ИИР более 1,03 достоверно увеличивается индивидуальный риск развития эпилепсии, менее или равном 1,03 - риск развития заболевания отсутствует, прогноз благоприятный. Данный расчет индекса индивидуального риска проведен для каждого генотипа (таблица 2).

Как видно из таблицы 2, преобладает гомозиготный генотип АА гена GRIN1 у пациентов во всех группах, что указывает на высокий риск развития эпилепсии, в том числе после полученной ЧМТ, в отличие от других генотипов.

У пациентов с ИЭ и ПТЭ преобладает гомозиготный генотип АА гена GRIN2A, а у пациентов с ИЭ - гомозиготный генотип GG гена GRIN2A. Следовательно, при наличии генотипов GG и/или АА гена GRIN2A констатируется высокий риск развития эпилепсии, в том числе посттравматической.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1

Пациент В., 40 лет. Диагноз: Последствия тяжелой ЧМТ, хроническая субдуральная гематома, перелом затылочной кости от 2016 г, атактический, астено-невротический синдромы. Три года назад, был избит, получил травму с потерей сознания. Был доставлен в нейрохирургическое отделение, где установлен диагноз ЧМТ средней степени тяжести, ушиб головного мозга, субдуральное кровоизлияние, перелом затылочной кости. При проведении КТ головного мозга выявлена субдуральная гематома. Через 3 месяца после перенесенной ЧМТ разворачивается первый локализованный приступ с последующими билатеральными тонико-клоническими судорогами, с постприступной амнезией. Наследственный анамнез по эпилептической болезни не отягощен. Осмотрен неврологом, противоэпилептические препараты не принимал. По данным МРТ: кистозно-атрофические изменения. Признаки хронической субдуральной гематомы. ЭЭГ не выявила эпилептиформную активность. Неврологический статус: сухожильные рефлексы с рук и ног равные. Чувствительность не нарушена. В позе Ромберга неустойчив, координаторные пробы выполняет неуверенно. Эмоционально лабилен: раздражителен, вспыльчив, периодически использует адаптол, с положительным эффектом. В ходе наблюдения за пациентом повторных пароксизмальных событий не отмечается.

Проведена ПЦР, которая выявила наличие гомозиготного генотипа GG гена GRIN2A (rs 1969060), ИИР равен 1,01, что свидетельствует об отсутствии риска развития посттравматической эпилепсии.

Пример 2

Пациент С., 33 года. Диагноз: Последствия ЧМТ средней степени тяжести от 2016 года, дебют посттравматической эпилепсии, тонико-клонические приступы. Неоднократно в анамнезе присутствуют ЧМТ легкой степени тяжести, по данным медицинской документации констатируются сотрясения головного мозга, последнее 2 года назад, был избит.После ЧМТ в течение нескольких часов потеря сознания. Был доставлен в нейрохирургическое отделение, где при помощи КТ выявлены признаки наружной заместительной гидроцефалии, при проведении ЭЭГ регистрировалось региональное замедление бифронтально, без эпилептиформной активности. Через 1 год на фоне стрессовой ситуации на работе, разворачивается первый приступ с потерей сознания, сопровождающийся судорогами, приступ амнезирован. При повторном проведении ЭЭГ эпилептиформная активность не выявлена. Через 6 месяцев развивается повторный тонико-клонический приступ. При очередном ЭЭГ-обследовании зарегистрирован очаг эпилептиформной активности (комплексы острая-медленная волна) в лобных отведениях. При дальнейшем наблюдении данные пароксизмы не повторялись. Неврологический статус без очаговой неврологической симптоматики. Походка обычная. Эмоциональный фон лабильный: пациент раздражителен, вспыльчив, отмечает трудности при засыпании. Методом ПЦР у данного пациента выявлен гомозиготный генотип АА гена GRIN1 (rs 1126442), ИИР равен 1,15, что соответствует высокому риску развития посттравматической эпилепсии.

Пример 3

Пациент, 41 г. Диагноз: Посттравматическая эпилепсия после перенесенной ЧМТ (2014 г.), фокальные приступы с переходом в билатеральные тонико-клонические, медикаментозная ремиссия 2 года. Четыре года назад, перенес ЧМТ, упал в подъезде, кратковременно терял сознание. Доставлен в нейрохирургическое отделение, проведена КТ, которая не выявила очаговых нарушений ткани головного мозга. При проведении ЭЭГ выявляется пароксизмальная активность, истинной эпилептиформной активности не регистрируется. В связи с полученными данными ЭЭГ-обследования, был назначен финлепсин 200 мг в сутки, в течение 6 месяцев. Затем препарат был отменен. Через 1 месяц после отмены препарата развивается первый приступ потери сознания, с дальнейшей амнезией. Еще через 3 месяца, после стрессовой ситуации на работе и на фоне недостатка ночного сна, развивается второй эпилептический приступ. При проведении ЭЭГ эпилептиформная активность также не обнаружена. Затем приступы разворачивались с регулярностью 1 раз в 3-4 месяца. Наследственность по эпилепсии не отягощена. Назначен вновь препарат финлепсин в дозе 800 мг в сутки (с постепенной титрацией дозы), на фоне чего приступы были купированы. Отмечается ремиссия в течение 2-х лет. Неврологический статус без патологических изменений. Эмоциональный фон спокойный.

Методом ПЦР выявлен гомозиготный генотип АА гена GRIN1 (rs 1126442), ИИР равен 1,15, риск развития ПТЭ - высокий.

Способ прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии, характеризующийся тем, что образец ДНК, выделенный из венозной крови пациента, исследуют по полиморфизмам генов, используя в качестве праймеров участок ДНК генов GRIN1 (rs1126442) и GRIN2A (rs1969060), для каждого из указанных полиморфизмов устанавливают гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние генотипов АА и GG исследуемых генов, далее проводят сопоставление выявленных гомозиготных генотипов АА гена GRIN1 (rs1126442), или АА гена GRIN2A (rs1969060), или GG гена GRIN2A (rs1969060) с таблицей 2 для конкретного генотипа и при значении индекса более 1,03 делают вывод о высоком индивидуальном риске развития посттравматической эпилепсии, равном или менее 1,03, - об отсутствии индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ сокультивирования iPS-EC клеток, перицитов и астроцитов для формирования клеточной модели гематоэнцефалического барьера (ГЭБ).

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики цирроза печени (стадии F4) в исходе хронического вирусного гепатита C путем иммунологического обследования пациента, который включает исследование крови пациента перед началом терапии с целью определения показателей клеточного иммунитета с высоким коэффициентом информативности Кульбака (J), где при снижении количества клеток CD19+ с J=2,7 и клеток CD56+ с J=10,0 в сочетании с повышением количества клеток CD45+CD4+CD119+ с J=30,4 и клеток CD 119+ с J=8,2 диагностируют цирроз печени (стадия F4).
Изобретение позволяет у девушек 18-25 лет, проживающих в северных регионах и приравненных к ним территориях, прогнозировать развитие остеопении путем определения в сыворотке крови концентрации витамина 1,25(OH)2-D и С-концевого телопептида коллагена I, с последующей оценкой полученных результатов согласно заданному алгоритму.

Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики инфекционных болезней и сопутствующих им патологических состояний организма, и может быть использовано для прогнозирования отсутствия регресса фиброза печени у больных хроническим гепатитом С без отягощенного преморбидного фона после терапии препаратами прямого противовирусного действия.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, энзимологии, биотехнологии и медицины и предназначено для получения ДНК-аптамеров. Способ включает: (а) предварительное обогащение комбинаторной ДНК-библиотеки путем образования ее комплекса с иммобилизованной белковой мишенью (альфа-фетопротеин человека; АФП) и проведения раундов селекции; (б) образование комплекса полученной библиотеки с раствором нативного (неиммобилизованного) АФП; (в) отделение комплексов ДНК/АФП от несвязавшихся ДНК-олигонуклеотидов методом акриламидного электрофореза; (г) экстракцию связавшейся с АФП ДНК из акриламидного геля при 37°С; (д) термическую диссоциацию оставшейся в виде комплекса с АФП ДНК из геля при 60°С; (е) амплификацию ДНК после термической диссоциации.

Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования развития тромбоэмболических осложнений (ВТЭО) у женщин при носительстве мутации гена протромбина [F2(20210)GA], где определяют активность протромбина и при его значении 174,8% и выше прогнозируют риск развития ВТЭО, при этом активность протромбина выражается в международных единицах (ME) или процентах, причем 1 МЕ/мл соответствует 100% активности.

Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования развития тромбоэмболических осложнений (ВТЭО) у женщин при носительстве мутации гена протромбина [F2(20210)GA], где определяют активность протромбина и при его значении 174,8% и выше прогнозируют риск развития ВТЭО, при этом активность протромбина выражается в международных единицах (ME) или процентах, причем 1 МЕ/мл соответствует 100% активности.

Изобретение относится к способу оценки содержания свинца в мышечной ткани овец при хроническом поступлении с рационом, который заключается в том, что на основании концентрации металла в шерсти и фекалиях определяют уровни его накопления в мышечной ткани, используя формулу Cm=Cw×0.33×Се-0.304, где: Cm - концентрация свинца в мышечной ткани (мг/кг), Cw - концентрация свинца в шерсти (мг/кг), Се - концентрация свинца в фекалиях (мг/кг).

Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования риска инфаркта миокарда или смертельного исхода у субъекта после инфаркта миокарда, а также к мониторингу эффективности лечения инфаркта миокарда.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для диагностики преэклампсии у беременных в сроки 24-40 недель беременности. Для этого у беременной женщины в сроке 24-40 недель определяют среднее артериальное давление (СрАД) и уровень средней сухой массы тромбоцитов.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике. Раскрыта тест-система для одновременной детекции гуморальных маркеров инфицирования герпесвирусами человека, включающая иммуносорбент в виде тест-полосок (стрипов), на каждой из которых в виде отдельных линий нанесены следующие антигены: гес антиген gG-1 HSV-1; гес антиген gG-2 HSV-2; нативный антиген VZV; гес антиген gE VZV; гес антигены EBV: ядерный - EBNA (Epstein Barr Nuclear Antigen), ранний - EA (Early Antigen) и капсидный - VCA (Viral Capsid Antigen); гес мозаичный антиген CMV, содержащий последовательности белков рр150, рр52, рр28 и gB; гес большой структурный фосфопротеин (Large structural protein) Ul1 вируса HHV-6; гес гликопротеин В (gB) вируса HHV-7; гес мозаичный антиген HHV-8, содержащий последовательности белков ORF65 и ORF8 (К8).

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и предназначено для прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии. Образец ДНК, выделенный из венозной крови пациента, исследуют по полиморфизмам генов GRIN1 и GRIN2A. Для каждого из указанных полиморфизмов устанавливают гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние генотипов АА и GG исследуемых генов. Далее проводят сопоставление выявленных гомозиготных генотипов с таблицей индексов индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии для конкретного генотипа. При значении индекса более 1,03 делают вывод о высоком индивидуальном риске развития посттравматической эпилепсии. При значении, равном или менее 1,03, - об отсутствии индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии. Изобретение обеспечивает повышение точности прогнозирования индивидуального риска развития посттравматической эпилепсии. 2 табл., 3 пр.

Наверх