Пептидные композиции

Изобретение относится к полипептидным соединениям, которые являются модуляторами (такими как агонисты и антагонисты) рецептора меланокортина-4 (MC4R), а также к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения. Описанные здесь соединения представляют собой полипептиды структурной формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли. Значения и предпочтительные значения переменных, присутствующих в структурной формуле (I), определены в формуле изобретения. Полипептиды могут быть использованы для лечения расстройств, чувствительных к модуляции MC4R, где расстройство представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2, ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром, мужскую эректильную дисфункцию, женское половое расстройство, неалкогольную жировую дистрофию печени или неалкогольный стеатогепатит. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

 

Родственная заявка

Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США № 61/790469, поданной 15 марта 2013 года. Содержание вышеуказанной заявки полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Уровень техники ИЗОБРЕТЕНИЯ

Такие расстройства, как ожирение, метаболический синдром, инсулинорезистентность и диабет, значительно увеличивают национальные расходы на здравоохранение и могут оказывать серьезное влияние на качество жизни страдающих от них пациентов, их семей и лиц, ухаживающих за такими пациентами. Заболеваемость указанными расстройствами растет, приближаясь к эпидемическим значениям. Соответственно, существует потребность в композициях и способах лечения указанных расстройств.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к полипептидным соединениям, которые являются модуляторами рецептора меланокортина-4 (MC4R), а также к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения.

В конкретном варианте осуществления полипептидное соединение представляет собой выделенный полипептид структурной формулы (I):

или его фармацевтически приемлемую соль,

где:

R1 обозначает Н или С1-С6 ацил;

R2 обозначает -NR3R4, или -OR5, где каждый из R3, R4 и R5 независимо обозначает Н или C1-С6 алкил;

А1 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Arg, Lys, Orn, His, Nle, Phe, Val, Leu, Trp, Tyr, Ala, Ser, Thr, Gln, Asn, Asp, Glu или TzAla; или

А1 обозначает фрагмент, выбранный из необязательно замещенного С1-С12 алкила, необязательно замещенного С6-С18 арила, необязательно замещенного C5-С18 гетероарила, аралкила, в котором арильная часть представляет собой необязательно замещенный С6-С18 арил, а алкильная часть представляет собой необязательно замещенный С1-С12 алкил, или гетероаралкила, где гетероарильная часть представляет собой необязательно замещенный С5-С18 гетероарил, а алкильная часть представляет собой необязательно замещенный С1-С12 алкил;

каждый из А2 и А8 независимо обозначает остаток аминокислоты, выбранный из Cys, hCys, Pen, Asp, Glu, Lys, Orn, Dbu или Dpr, где пары А2 и А8 выбирают таким образом, чтобы обеспечить возможность образования ковалентной связи между соответствующими боковыми цепями;

А3 отсутствует или обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Ala, Tle, Val, Leu, Ile, Cha, Pro, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Phe, Gln, Sar, Gly, Asn, Aib или остаток Y, где Y обозначает аминокислоту, имеющую одну из следующих структурных формул:

где:

каждый из R11 и R12 независимо обозначает Н, -СН3, фенил или бензил;

каждый из R21, R22, R23 и R24 независимо обозначает Н, -СН3, -CF3, фенил, бензил, F, Cl, Br, I, -OCH3 или -ОН;

каждый из R31, R32, R33, R34, R41, R42 и R43 независимо обозначает Н, -СН3, -CF3, фенил, бензил, F, Cl, Br, I, -OCH3 или -ОН;

А4 отсутствует или обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Atc, Ala, QAla, Aib, Sar, Ser, Thr, Pro, Hyp, Asn, Gln, необязательно замещенного His, Trp, Tyr, Lys, Arg, sChp, или остаток Х, где Х обозначает аминокислоту, имеющую одну из следующих структурных формул:

где:

каждый из R51 и R52 независимо обозначает Н, -СН3, фенил или бензил;

каждый из R61, R62, R63 и R64 независимо обозначает Н, -СН3, -CF3, фенил, бензил, F, Cl, Br, I, -OCH3 или -ОН;

каждый из R71, R72, R73, R74, R81, R82 и R83 независимо обозначает Н, -СН3, -CF3, фенил, бензил, F, Cl, Br, I, -OCH3 или -ОН;

А5 обозначает необязательно замещенный Phe, необязательно замещенный 1-Nal, или необязательно замещенный 2-Nal;

А6 обозначает Arg; и

А7 обозначает Trp,

где любой аминокислотный остаток может находиться в L- или в D-конфигурации, при условии, что:

1) А3 и А4 одновременно не отсутствуют;

2) если А4 обозначает аминокислоту, А3 отличается от Aib или Gly; и

3) если А4 обозначает His, а А5 обозначает D-Phe или 2-Nal, А3 отличается от D-аминокислоты или L-Ala;

4) если каждый из А2 и А8 независимо выбран из Cys, hCys или Pen, то:

(a) если А4 отсутствует, А3 отличается от L-His;

(b) если А3 отсутствует, А4 отличается от L-His; и

(c) если А4 обозначает His, А3 отличается от Glu, Leu или Lys.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения расстройства, чувствительного к модуляции MC4R, у индивидуума, нуждающегося в лечении. Данный способ включает в себя введение индивидууму эффективного количества описанного здесь модулятора MC4R. В конкретном варианте осуществления расстройство, чувствительное к модуляции MC4R, включает в себя диабет 1 типа, диабет 2 типа, ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром, мужскую эректильную дисфункцию, женское половое расстройство, неалкогольную жировую дистрофию печени, неалкогольный стеатогепатит, расстройства, связанные с токсикоманией, в том числе связанные с алкоголизмом расстройства приема пищи, кахексия, воспаление и тревожность.

В некоторых вариантах осуществления соединения и композиции настоящего изобретения обладают более высокой селективностью и активностью в отношении MC4R и рецептора меланокортина-3 (MC3R), чем в отношении рецептора меланокортина-1 (MC1R).

Соединения и композиции настоящего изобретения могут способствовать уменьшению или устранению таких нежелательных побочных эффектов, как увеличение артериального давления, увеличение частоты сердечных сокращений, нежелательное влияние на половое возбуждение и увеличение пигментации кожи.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже приведено описание иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Используемые термины

Для определения пептидов используют традиционную номенклатуру, в соответствии с которой N-концевую аминогруппу изображают слева, а С-концевую карбоксильную группу изображают справа.

В соответствии с данным описанием, термин "аминокислота" включает в себя как природные, так и неприродные аминокислоты. Если не указано иначе, все аминокислоты и их остатки, входящие в состав описанных здесь соединений, могут находиться в D- или L-конфигурации.

Соединения настоящего изобретения, подходящие для осуществления описанных здесь способов, могут содержать один или несколько хиральных центров и, следовательно, могут существовать в виде разных стереоизомерных форм. Все стереоизомеры и их смеси входят в объем настоящего изобретения. Рацемические соединения можно разделить на индивидуальные энантиомеры методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с хиральной стационарной фазой, с использованием методов, известных специалистам в данной области. Кроме того, можно разделить промежуточные хиральные соединения и использовать их для получения хиральных соединений настоящего изобретения.

Описанные здесь соединения могут существовать в виде одной или нескольких таутомерных форм. Все таутомеры и их смеси входят в объем настоящего изобретения.

Если не указано иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют традиционные значения, известные рядовым специалистам в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Все упомянутые здесь публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей их полноте.

Символ Значение
Abu α-аминомасляная кислота
Ас ацильная группа
Aib α-аминоизомасляная кислота

Ala или A аланин
Arg или R аргинин
Asn или N аспарагин
Asp или D аспарагиновая кислота
Atc 2-аминотетралин-2-карбоновая кислота
Cha β-циклогексилаланин
sChp 1-амино-4-фенилциклогексан-1-карбоновая кислота
Cys или С цистеин
hCys гомоцистеин
Dbu 2,4-диаминомасляная кислота
Dpr 2,3-диаминопропионовая кислота
Gln или Q глутамин
Glu или Е глутаминовая кислота
Gly или G глицин
His или Н гистидин
Hyp гидроксипролин
Ile или I изолейцин
Leu или L лейцин
Lys или K лизин
Met или M метионин
1-Nal (1-нафтил)аланин
2-Nal (2-нафтил)аланин
Nle норлейцин
Orn орнитин
Pen пеницилламин
Phe или F фенилаланин
Про или P пролин
QAla хинолинилаланин или 2-амино-3-(хинолин-3-ил)пропановая кислота
Sar саркозин (N-метилглицин)

Ser или S серин
Tle трет-лейцин (трет-бутилглицин)
TzAla 3-(1,2,4-триазол-1-ил)-L-Ala
Thr или Т Треонин
Trp или W триптофан
Tyr или Y тирозин
Val или V валин
ВНА бензгидриламин
Boc трет-бутилоксикарбонил
But третичный бутил
DIPEA N,N-диизопропилэтиламин
DTT дитиотреитол
Fmoc флуоренилметилоксикарбонил
HBTU 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат
MCR4 рецептор меланокортина-4
Mtt 4-метилтритил
NMP N-метилпирролидон
OBut третичный бутокси
OPip 2-фенилизопропил
Pbf 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил
Trt тритил
TIS триизопропилсилан
TFA трифторуксусная кислота

Если не указано иначе, все сокращенные наименования (например, Ala) аминокислот в данном описании относятся к аминокислотным остаткам, то есть, к структуре -NH-C(R)(R')-СО-, где каждый из R и R', независимо от других, обозначает водород или боковую цепь аминокислоты (например, в случае Ala R = CH3, а R'= Н, или R и R' могут быть соединены с образованием циклической системы).

Обозначение "Ас" или "NH2" на конце полипептида означает, что соответствующий конец является ацилированным или амидированным, соответственно.

Термин "ковалентная связь между боковыми цепями аминокислот" означает, что каждая из боковых цепей двух рассматриваемых аминокислотных остатков содержит функциональную группу, способную образовывать ковалентную связь с другой функциональной группой. Примеры таких связей включают в себя дисульфидные мостики, образованные боковыми цепями Cys, hCys или Pen, а также амидные связи, образованные аминогруппой боковой цепи одной аминокислоты и карбоксильной группой боковой цепи другой аминокислоты, такой как, например, Asp, Glu, Lys, Orn, Dbu или Dpr. В иллюстративных вариантах осуществления аминокислоты можно выбрать попарно так, чтобы между их боковыми цепями могла образоваться ковалентная связь. При образовании ковалентной связи между боковыми цепями аминокислот может происходить циклизация полипептида. Такой циклический полипептид может быть указан либо структурной формулой, либо с помощью сокращенного обозначения "c()" или "цикло()". Например, "-c(Cys-Cys)-" или "-цикло(Cys-Cys)-" обозначает структуру:

тогда как "-c(Asp-Lys)-" или "-цикло(Asp-Lys)-" обозначает структуру:

Термин "алкил", используемый отдельно или как часть более крупного фрагмента, такого как "гидроксиалкил", "алкоксиалкил", "алкиламин" относится к линейной или разветвленной, насыщенной алифатической группе, содержащей указанное количество атомов углерода, как правило, от 1 до 12 атомов углерода. Более конкретно, алифатическая группа может содержать от 1 до 8, от 1 до 6 или от 1 до 4 атомов углерода. Данный термин иллюстрируется такими группами, как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, н-гексил и т.п.

"Галогеналкил" представляет собой алкильную группу, замещенную одним или несколькими атомами галогена.

Термин "галоген" включает в себя фтор, хлор, бром или иод.

"Циано" представляет собой группу -CN.

"Ph" обозначает фенильную группу.

Термин "карбонил" относится к двухвалентной группе -C(O)-.

Термин "арил", используемый отдельно или как часть более крупного фрагмента, такого как "аралкил", относится к ароматической карбоциклической группе размером от 6 до 18 атомов углерода, содержащей один цикл, или несколько конденсированных циклов. Термин "арил" также включает в себя ароматический карбоцикл (карбоциклы), сопряженный с циклоалкильными или гетероциклоалкильными группами. Примеры арильных групп включают в себя фенил, бензо[d][1,3]диоксол, нафтил, фенантренил и т.п.

Термин "арилокси" относится к группе -OAr, где О обозначает атом кислорода, а Ar обозначает арильную группу, описанную выше.

"Аралкил" представляет собой алкил, в котором, по меньшей мере, один алкильный атом водорода замещен арильным фрагментом, таким как бензил, -(CH2)2фенил, -(CH2)3фенил, -СН(фенил)2 и т.п.

Термин "гетероарил", используемый отдельно или как часть более крупного фрагмента, такого как "гетероаралкил", относится к 5-18-членной моноциклической, бициклической или трициклической гетероароматической системе, содержащей от одного до четырех циклических гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы. Термин "гетероарил" также включает в себя гетероароматический цикл (циклы), сопряженный с циклоалкильными или гетероциклоалкильными группами. Конкретные примеры гетероарильных групп включают в себя пиридил, необязательно замещенный пирролил, пиримидинил, фурил, тиенил, имидазолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, изотиазолил, пиразолил, 1,2,3-триазолил, 1,2,4-триазолил, 1,2,3-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,2,5-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил, 1,3,4-триазинил, 1,2,3-триазинил, бензофурил, [2,3-дигидро]бензофурил, изобензофурил, бензотиенил, бензотриазолил, изобензотиенил, индолил, изоиндолил, 3Н-индолил, бензимидазолил, имидазо[2-а]пиридил, бензотиазолил, бензоксазолил, хинолизинил, хиназолинил, фталазинил, хиноксалинил, циннолинил, нафтиридинил, пиридо[3,4-b]пиридил, пиридо[3,2-b]пиридил, пиридо[4,3-b]пиридил, хинолил, изохинолил, тетразолил, 1,2,3,4-тетрагидрохинолил, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолил, пуринил, птеридинил, карбазолил, ксантенил, бензохинолил и т.п.

Термин "гетероаралкил" относится к алкилу, в котором, по меньшей мере, один алкильный атом водорода замещен гетероарильным фрагментом, таким как -СН2-пиридинил, -СН2-пиримидинил и т.п.

Термин "алкокси" относится к группе -O-R, где R обозначает "алкил", "циклоалкил", "алкенил" или "алкинил". Примеры алкоксигрупп включают в себя, например, метокси, этокси, этенокси и т.п.

"Гидроксиалкил" и "алкоксиалкил" представляют собой алкильные группы, замещенные гидроксилом и алкоксильной группой, соответственно.

Термин "амино" относится к -NH2; "алкиламин" и "диалкиламин" представляют собой группы -NHR и -NR2, соответственно, где R обозначает алкильную группу. Термины "циклоалкиламин" и "дициклоалкиламин" относятся к -NHR и -NR2, соответственно, где R обозначает циклоалкильную группу. "Циклоалкилалкиламин" представляет собой -NHR, где R обозначает циклоалкилалкильную группу. "[Циклоалкилалкил][алкил]амин" представляет собой -N(R)2, где один R обозначает циклоалкилалкил, а другой R обозначает алкил.

Термин "ацил" относится к R"-C(O)-, где R" обозначает Н, алкил, замещенный алкил, гетероалкил, замещенный гетероалкил, алкенил, замещенный алкенил, арил, алкиларил или замещенный алкиларил, и обозначается в общей формуле конкретного варианта осуществления как "Ас".

Подходящие заместители "алкила", "арила", "гетероарила" и т.п. включают в себя фрагменты, введение которых приводит к образованию стабильного соединения настоящего изобретения. Примеры подходящих заместителей могут быть выбраны из группы, включающей в себя галоген, -CN, -ОН, -NH2, (C14)алкил, (C14)галогеналкил, арил, гетероарил, (С37)циклоалкил, (5-7-членный)гетероциклоалкил, -NH(C1-C6)алкил, -N((C1-C6)алкил)2, (C1-C6)алкокси, (C1-C6)алкоксикарбонил, -CONH2, -OCONH2, -NHCONH2, -N(C1-C6)алкилCONH2, -N(C1-C6)алкилCONH(C1-C6)алкил, -NHCONH(C1-C6)алкил, -NHCON((C1-C6)алкил)2, -N(C1-C6)алкилCON((C1-C6)алкил)2, -NHC(S)NH2, -N(C1-C6)алкилC(S)NH2, -N(C1-C6)алкилC(S)NH(C1-C6)алкил, -NHC(S)NH(C1-C6)алкил, -NHC(S)N((C1-C6)алкил)2, -N(C1-C6)алкилC(S)N((C1-C6)алкил)2, -CONH(C1-C6)алкил, -OCONH(C1-C6)алкил-CON((C1-C6)алкил)2, -C(S)(C1-C6)алкил, -S(O)p(C1-C6)алкил, -S(O)PNH2, -S(O)pNH(C1-C6)алкил, -S(O)PN((C1-C6)алкил)2, -CO(C1-C6)алкил, -OCO(C1-C6)алкил, -C(O)O(C1-C6)алкил, -OC(O)O(C1-C6)алкил, -C(O)H или -CO2H. Более конкретно, заместители могут быть выбраны из галогена, -CN, -ОН, -NH2, (C14)алкила, (С14)галогеналкила, (С14)алкокси, фенила и (С37)циклоалкила. В контексте данного изобретения термин "замещение" также включает в себя случаи замещения атома водорода атомом дейтерия. p обозначает целое число, равное 1 или 2.

Замещенный Phe может содержать от одного до пяти заместителей на любых ароматических атомах углерода, причем заместители могут быть выбраны из F, Cl, Br, I, -СН3, -ОН, -CN, амина, -NO2 или -OCH3. Примеры подходящих заместителей включают в себя Phe(2'-F), Phe(2'-Cl), Phe(2'-Br), Phe(2'-I), Phe(2'-CN), Phe(2'-CH3), Phe(2'-OCH3), Phe(2'-CF3), Phe(2'-NO2), Phe(3'-F), Phe(3'-Cl), Phe(3'-Br), Phe(3'-I), Phe(3'-CN), Phe(3'-CH3), Phe(3'-OCH3), Phe(3'-CF3), Phe(3'-NO2), Phe(4'-F), Phe(4'-Cl), Phe(4'-Br), Phe(4'-I), Phe(4'-CN), Phe(4'-CH3), Phe(4'-OCH3), Phe(4'-CF3), Phe(4'-NO2), Phe(4'-t-Bu), Phe(2',4'-diF), Phe(2',4'-diCl), Phe(2',4'-diBr), Phe(2',4'-diI), Phe(2',4'-di-CN), Phe(2',4'-di-CH3), Phe(2',4'-di-OCH3), Phe(3',4'-diF), Phe(3',4'-diCl), Phe(3',4'-diBr), Phe(3',4'-diI), Phe(3',4'-di-CN), Phe(3',4'-di-CH3), Phe(3',4'-di-OCH3), Phe(3',5'-diF), Phe(3',5'-diCl), Phe(3',5'-diBr), Phe(3',5'-diI), Phe(3',5'-di-CN), Phe(3',5'-diCH3), Phe(3',5'-di-OCH3) или Phe(3',4',5'-triF).

Замещенный His содержит от одного до трех заместителей на любых замещаемых циклических атомах, причем подходящие заместители могут быть выбраны из F, Cl, Br, I, -СН3, -ОН, -CN, амина, -NO2, бензила или -OCH3. Примеры включают в себя 1-метилгистидин и 3-метилгистидин.

Обозначение "(аминокислота)n" указывает на то, что аминокислота повторяется n раз. Например, обозначение "(Pro)2" или "(Arg)3" указывает на то, что остатки пролина или аргинина повторяются, соответственно, два или три раза.

Фармацевтически приемлемые соли раскрытых здесь соединений включены в настоящее изобретение. Например, соль кислоты и соединения, содержащего аминогруппу или другую основную группу, можно получить путем взаимодействия соединения с подходящей органической или неорганической кислотой, с получением фармацевтически приемлемых анионогенных солевых форм. Примеры анионогенных солей включают в себя ацетаты, бензолсульфонаты, бензоаты, бикарбонаты, битартраты, бромиды, кальций эдетаты, камсилаты, карбонаты, хлориды, цитраты, дигидрохлориды, эдетаты, эдисилаты, эстолаты, эзилаты, фумараты, глицептаты, глюконаты, глутаматы, гликоллиларсанилаты, гексилрезорцинаты, гидробромиды, гидрохлориды, гидроксинафтоаты, иодиды, изотионаты, лактаты, лактобионаты, малаты, малеаты, манделаты, мезилаты, метилсульфаты, мукаты, напсилаты, нитраты, памоаты, пантотенаты, фосфаты/дифосфаты, полигалактуронаты, салицилаты, стеараты, субацетаты, сукцинаты, сульфаты, таннаты, тартраты, теоклаты, тозилаты, триэтиодиды и трифторацетаты.

Соли соединений, содержащих кислотную функциональную группу, можно получить путем взаимодействия с подходящим основанием. Соответствующие фармацевтически приемлемые соли, которые можно получить путем взаимодействия с основаниями, дающими фармацевтически приемлемые катионы, включают в себя соли щелочных металлов (особенно натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (особенно кальция и магния), соли алюминия и соли аммония, а также соли, образованные физиологически приемлемыми органическими основаниями, такими как триметиламин, триэтиламин, морфолин, пиридин, пиперидин, пиколин, дициклогексиламин, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, 2-гидроксиэтиламин, бис-(2-гидроксиэтил)амин, три-(2-гидроксиэтил)амин, прокаин, дибензилпиперидин, дегидроабиетиламин, Ν,Ν'-бисдегидроабиетиламин, глюкамин, N-метилглюкамин, коллидин, хинин, хинолин и основные аминокислоты, такие как лизин и аргинин.

Описанные соединения можно вводить индивидууму в сочетании с приемлемым фармацевтическим носителем в составе фармацевтической композиции. Тип подлежащей для введения композиции соединения (например, раствор, эмульсия, капсулы) варьирует в зависимости от выбранного способа введения. Подходящие фармацевтические носители могут включать в себя инертные ингредиенты, которые не взаимодействуют с соединением. Для получения фармацевтических композиций можно использовать стандартные методы, например, описанные в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Фармацевтические носители, подходящие для парентерального введения, включают в себя, например, стерильную воду, физиологический раствор, бактериостатический солевой раствор (физиологический раствор, содержащий примерно 0,9% мг/мл бензилового спирта), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Хенкса, раствор Рингера-лактат и тому подобное. Способы заключения композиций в капсулы (например, из твердого желатина или циклодекстрана) известны в данной области (Baker, et al, "Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986).

В данном описании фраза "расстройство, чувствительное к модуляции рецептора меланокортина-4" относится к любому расстройству, которое можно лечить путем активации (агонистической) или ингибирования MC4R. Примеры таких расстройств подробно описаны ниже.

В данном описании термин "модулятор" относится к соединениям, способным взаимодействовать с рецептором-мишенью и оказывать влияние на его биологическую функцию. Примеры модуляторов включают в себя полные агонисты, частичные агонисты, нейтральные антагонисты и обратные агонисты.

В данном описании термин "агонист" относится к любому химическому соединению, природному или синтетическому, которое при взаимодействии (например, при связывании) с мишенью, здесь с MC4R, повышает сигнальную активность MC4R до уровня выше фонового. Агонист может представлять собой суперагонист (т.е. соединение, способное продуцировать более высокий максимальный ответ, чем эндогенный агонист рецептора-мишени, и, следовательно, имеющее эффективность более 100%), полный агонист (т.е. соединение, которое вызывает максимальный ответ после связывания с рецептором и его активации) или частичный агонист (т.е. соединение, способное активировать рецептор, но не способное вызвать максимальный ответ рецепторной системы). Примеры агонистов MC4R подробно описаны ниже.

В настоящем описании термин "антагонист" относится к любому химическому соединению, которое при взаимодействии (например, при связывании) с мишенью, здесь с MC4R, блокирует в дозозависимой манере сигнальную активность соединения-агониста MC4R.

В настоящем описании термин "обратный агонист" относится к любому химическому соединению, которое при взаимодействии (например, при связывании) с мишенью, здесь с MC4R, уменьшает в дозозависимой манере фоновый уровень сигнальной активности MC4R.

В настоящем описании термин "эффективное количество" относится к количеству терапевтического средства, или сочетания терапевтических средств, которое является терапевтически или профилактически достаточным для лечения целевого расстройства. Примеры эффективного количества обычно находятся в диапазоне примерно от 0,0001 мг/кг массы тела до 500 мг/кг массы тела. Иллюстративный диапазон включает в себя дозы примерно от 0,0001 мг/кг массы тела до 500 мг/кг. Например, эффективное количество может варьировать примерно от 0,005 мг/кг до 500 мг/кг. В других примерах диапазон может составлять примерно от 0,0001 мг/кг до 5 мг/кг. В следующих примерах эффективное количество может варьировать примерно от 0,01 мг/кг массы тела до 50 мг/кг массы тела, или от 0,01 мг/кг массы тела до 20 мг/кг массы тела.

В настоящем описании термин "индивидуум" относится к млекопитающему, предпочтительно к человеку, но может также относиться к животному, нуждающемуся в лечении, которое включает в себя домашних животных (таких как собаки, кошки и т.п.), сельскохозяйственных животных (таких как коровы, овцы, свиньи, лошади и т.п.) и лабораторных животных (таких как крысы, мыши, морские свинки и т.п.).

В настоящем описании термин "другое средство" включает в себя любой активный фармацевтический ингредиент (API), который в сочетании с описанным здесь пептидом повышает терапевтический эффект описанного здесь пептида отдельно или в синергизме с описанным здесь пептидом (т.е. их совместное действие превышает аддитивный эффект). В настоящем описании термин "повышенный терапевтический эффект" включает в себя улучшенный терапевтический профиль, отличный от синергизма. Примеры повышенных терапевтических эффектов включают в себя уменьшение эффективной дозы описанного здесь пептида, увеличение терапевтического окна описанного здесь пептида и т.д. Можно вводить одно или несколько других средств. Примеры других средств подробно описаны ниже.

Другое средство можно вводить до введения описанного здесь пептида, одновременно с введением такого пептида, или после введения такого пептида. Соответственно, описанный здесь пептид и другое средство можно вводить вместе в составе одной композиции, или их можно вводить в составе разных композиций, например, одновременно или последовательно. Например, если описанный здесь пептид и другое средство вводят последовательно в составе разных композиций, описанный здесь пептид можно вводить до или после другого терапевтического средства. Кроме того, описанный здесь пептид и другое средство можно вводить с использованием одинаковых или разных схем ведения. Например, описанный здесь пептид и другое терапевтическое средство могут иметь разные периоды полужизни и/или могут действовать в разных временных масштабах, так что описанный здесь пептид можно вводить чаще, чем другое терапевтическое средство, или наоборот. И наконец, описанный здесь пептид можно вводить раньше другого средства, что приводит к дополнительному повышению терапевтической эффективности в результате последовательного применения обоих терапевтических средств. И описанный здесь пептид, и другое средство можно вводить однократно или длительно.

Эффективного количества в способах или композициях настоящего изобретения можно достичь путем совместного введения первого количества соединения, обладающего модуляторной активностью в отношении MC4R, или его фармацевтически приемлемой соли, и второго количества, по меньшей мере, одного другого средства. В одном варианте осуществления каждый из описанного здесь пептида и второго средства вводят в соответствующем эффективном количестве (т.е. каждый вводят в количестве, которое является терапевтически эффективным в случае раздельного введения). В другом варианте осуществления каждый из описанного здесь пептида и второго средства вводят в количестве, которое само по себе не обеспечивает терапевтический эффект (субтерапевтическая доза). В следующем варианте осуществления описанный здесь пептид вводят в эффективном количестве, а другое средство вводят в субтерапевтической дозе. В следующем варианте осуществления описанный здесь пептид можно ввести в субтерапевтической дозе, тогда как второе средство вводят в эффективном количестве. В иллюстративном варианте осуществления сочетание описанного здесь пептида и другого средства оказывает повышенный терапевтический эффект, или синергический эффект по сравнению с описанным здесь пептидом или другим средством, используемыми по отдельности.

Наличие синергического эффекта можно определить с помощью соответствующих методов анализа взаимодействия лекарственных средств. Подходящие способы включают в себя, например, уравнение Sigmoid-Emax (Holford, N. H. G. and Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)), уравнение аддитивности Loewe (S., Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol. Pharmacol. 114: 313-326 (1926)), а также уравнение для определения медианного эффекта (Chou, T. C. and Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)). Каждое из указанных выше уравнений можно использовать с применением экспериментальных данных для получения соответствующего графика, помогающего проанализировать эффекты сочетания лекарственных средств. Соответствующие графики, построенные с помощью указанных выше уравнений, включают в себя кривые зависимости концентрация-эффект, изоболограммы и кривые показателя аддитивности, соответственно.

В настоящем описании термин "лечение" включает в себя достижение, частичное или практически полное, задержки, подавления или предотвращения развития клинических симптомов, связанных с целевым расстройством. Например, термин "лечение" включает в себя достижение, частичное или существенное, одного или нескольких из следующих результатов: частичное или полное снижение массы тела (которое можно измерить, например, с помощью индекса массы тела, BMI); облегчение или улучшение клинических симптомов или показателей, связанных с ожирением, таких как диабет типа 2, преддиабетическое состояние, уровень гемоглобина A1C (Hb1Ac) в крови выше 6%, гиперинсулинемия, гиперлипидемия, нечувствительность к инсулину, непереносимость глюкозы и т.д.; задержка, подавление или предотвращение развития ожирения и связанных с ожирением показателей; или задержка, подавление или предотвращение, частично или полностью, возникновения или развития ожирения или связанных с ожирением показателей. Задержка, подавление или предотвращение развития ожирения включает в себя, например, задержку, подавление или предотвращение у индивидуума, имеющего нормальный вес, развития ожирения. Термин "лечение" также включает в себя частичное или полное снижение риска ишемической болезни сердца, инсульта и диабета (например, типа 2), связанного с метаболическим синдромом, а также облегчение или улучшение клинических симптомов или признаков метаболического синдрома, таких как один или несколько из пяти перечисленных выше показателей. Например, термин "лечение" включает в себя задержку, ингибирование или предотвращение развития параметров, связанных с метаболическим синдромом, таких как резистентность к инсулину, клиренс глюкозы и параметры сердечно-сосудистых заболеваний, включающие в себя частоту сердечных сокращений и уровень артериального давления, болезнь суставов, воспаление, апноэ во сне, переедание и другие расстройства пищевого поведения, включающие в себя булимию, поддерживающую терапию при хирургической операции по поводу уменьшения массы тела и поддерживающую терапию для уменьшения массы тела перед ортопедической хирургией. Термин "профилактическое лечение" относится к лечению, предпринимаемому до появления клинических симптомов целевого расстройства с целью предотвращения, подавления или уменьшения частоты его проявления.

Расстройство, чувствительное к модуляции MC4R

Примеры расстройств, чувствительных к модуляции MC4R, включают в себя острые и хронические воспалительные заболевания, такие как общее воспаление, воспалительные заболевания кишечника, воспаление мозга, сепсис и септический шок; заболевания с аутоиммунным компонентом, такие как ревматоидный артрит, подагрический артрит и рассеянный склероз; метаболические заболевания и медицинские состояния, сопровождающиеся увеличением массы, такие как ожирение, расстройства приема пищи и синдром Прадера-Вилли; метаболические заболевания и медицинские состояния, сопровождающиеся потерей массы, такие как анорексия, булимия, истощение, обусловленное СПИДом, кахексия, кахексия, обусловленная раком, и истощение у немощных пожилых людей; диабет и связанные с ним состояния и осложнения, такие как ретинопатия; неопластическая пролиферация, включающая в себя рак кожи и рак предстательной железы; медицинские состояния репродуктивных или половых органов, такие как эндометриоз и маточное кровотечение у женщин, половая дисфункция, эректильная дисфункции и снижение полового ответа у женщин; заболевания или состояния, возникающие в результате лечения или инсульта в организме, такие как отторжение трансплантата, ишемия и реперфузионное повреждение, лечение травм спинного мозга и ускорение заживления ран, а также потеря массы, вызванная химиотерапией, лучевой терапией, временной или постоянной иммобилизацией или диализом; сердечно-сосудистые заболевания или состояния, такие как геморрагический шок, кардиогенный шок, гиповолемический шок, сердечно-сосудистые расстройства и сердечная кахексия; легочные заболевания или состояния, такие как острый респираторный дистресс-синдром, хроническая обструктивная болезнь легких, астма и легочный фиброз; меры по повышению иммунной толерантности и предотвращению угрозы для иммунной системы, например, связанные с определенными видами аллергии или отторжением органного трансплантата; лечение дерматологических заболеваний и состояний, таких как псориаз, истощение пигментации кожи, акне, образование келоидов и рак кожи; поведенческие состояния и расстройства, состояния и расстройства центральной нервной системы или неврологические состояния и расстройства, такие как тревожность, депрессия, ухудшение памяти и дисфункция памяти, модуляция ощущения боли и лечение невропатической боли; состояния и заболевания, связанные с потреблением алкоголя, злоупотреблением алкоголем и/или алкоголизмом; а также почечные состояния или заболевания, такие как почечная кахексия или натрийурез. Другие примеры включают в себя нормализующую или гомеостатическую активность у индивидуума, включающую в себя высвобождение тироксина, синтез и высвобождение альдостерона, регуляцию температуры тела, артериального давления, частоты сердечных сокращений, тонуса сосудов, мозгового кровотока, уровня глюкозы в крови, костного метаболизма, формирования или развития костной ткани, массы яичников, развития плаценты, секреции пролактина и ФСГ, внутриматочного развития плода, родов, сперматогенеза, секреции кожного сала и феромонов, нейропротекции и роста нервов, а также модуляцию мотивации, способности к обучению и других поведенческих параметров. Другие примеры включают в себя переедание, булимию или другие расстройства пищевого поведения.

В иллюстративных вариантах осуществления расстройства, чувствительные к модуляции рецептора MC4R, включают в себя диабет 1 типа, диабет 2 типа, ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания или дисбаланс липопротеидов низкой плотности/липопротеидов высокой плотности/триглицеридов, неалкогольную жировую дистрофию печени и расстройства, связанные с токсикоманией.

В иллюстративных вариантах осуществления расстройства, чувствительные к модуляции рецептора MC4R, включают в себя диабет 1 типа, диабет 2 типа, ожирение, резистентность к инсулину или метаболический синдром.

Ожирение

В настоящем описании термин "ожирение" относится к индивидууму, индекс массы тела (BMI) которого составляет примерно 30 кг/м2 или выше, например, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 кг/м2, или больше. В конкретных вариантах осуществления индивидуум, страдающий от ожирения, имеет BMI в пределах, определенных как "ожирение" Центром контроля заболеваний. См. URL http://www.cdc.gov/obesity/defining.html, последнее обращение 28 октября 2011 года. Например, в некоторых вариантах осуществления считается, что взрослый человек страдает от ожирения, если его BMI≥30,0 кг/м2.

Диабет и связанные с ним расстройства

В иллюстративных вариантах осуществления индивидуумы, которых можно лечить с помощью способов настоящего изобретения, страдают от расстройств, связанных с диабетом, или имеют повышенный риск развития таких расстройств. Термин "расстройства, связанные с диабетом" относится к диабету (в том числе типа 1 (OMIM 222100) и типа 2 (OMIM 125853)), резистентности к инсулину и метаболическому синдрому.

В иллюстративных вариантах осуществления индивидуум, подлежащий лечению, страдает от диабета (типа 1 или типа 2), резистентности к инсулину или метаболического синдрома. В иллюстративных вариантах осуществления расстройство включает в себя диабет, например, диабет 2 типа. В иллюстративных вариантах осуществления индивидуум страдает от диабета 2 типа, или имеет повышенный риск развития диабета 2 типа, в соответствии с определением Всемирной организации здравоохранения и Международной диабетической федерации в разделе "Определение и диагностика сахарного диабета и промежуточной гипергликемии", опубликованном в 2006 году, который включен в настоящее описание в качестве ссылки во всей своей полноте. В иллюстративных вариантах осуществления у индивидуума, страдающего от диабета, уровень глюкозы в плазме натощак ≥126 мг/дл, или 2-часовой уровень глюкозы в плазме крови (через 2 часа после перорального введения 75 г глюкозы) ≥200 мг/дл. В иллюстративных вариантах осуществления у диабетического или преддиабетического индивидуума наблюдаются повышенные уровни гликированного гемоглобина, например, они могут превышать 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6% или более от общего гемоглобина. В иллюстративных вариантах осуществления диабетического или преддиабетического индивидуума можно идентифицировать или дополнительно охарактеризовать путем анализа генетических полиморфизмов (в том числе, например, полиморфизмов, обуславливающих изменение уровня экспрессии, например, повышение или понижение уровня экспрессии, и/или изменение кодирующих последовательностей), в одном или нескольких генах из приведенных ниже в таблице 1, или вблизи указанных генов:

В иллюстративных вариантах осуществления другие гены, которые можно использовать для идентификации или дополнительной характеристики индивидуумов, подлежащих лечению с помощью способов настоящего изобретения, включают в себя FTO (OMIM 610966), JAZF1 (OMIM 606246) и HHEX (OMIM 604420).

В иллюстративных вариантах осуществления индивидуум, подлежащий лечению с помощью способов настоящего изобретения, страдает от диабета 1 типа. В иллюстративных вариантах осуществления индивидуум с диабетом 1 типа характеризуют путем анализа С-пептида, например, у такого индивидуума уровень С-пептида натощак составляет менее чем примерно 1,0 нмоль/л, например, менее чем 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4 нмоль/л, или меньше, например, менее чем 0,33, 0,25, 0,2 или 0,1 нмоль/л. В иллюстративных вариантах осуществления уровень С-пептида измеряют после перорального введения глюкозы (через 2 часа после перорального введения 75 г глюкозы) и детектируют увеличение менее чем на 0,54 нмоль/л, например, менее чем на 0,50, 0,45, 0,40, 0,35, 0,30, 0,25, 0,20, 0,15 или 0,10 нмоль/л. Отклоняющийся от нормы уровень глюкозы натощак (110-125 мг/дл) или ухудшенную толерантность к глюкозе (через 2 часа после перорального введения 75 г глюкозы: 140-199 мг/дл) можно использовать для идентификации или дальнейшей характеристики снижения функции бета-клеток у индивидуумов с диабетом 1 типа. В иллюстративных вариантах осуществления диабет типа 1 идентифицируют или дополнительно характеризуют по наличию аутоантител к антигенам островковых клеток и/или инсулину, например, аутоантител, направленных против GAD 65 кДа (OMIM 138275) и/или фосфатаза-родственной молекулы IA-2.

Резистентность к инсулину

В иллюстративных вариантах осуществления расстройство представляет собой "резистентность к инсулину", которую можно идентифицировать с помощью любых средств, известных в данной области, и охарактеризовать пониженной способностью инсулина уменьшать уровень глюкозы в крови. В иллюстративных вариантах осуществления, резистентность к инсулину определяют или дополнительно характеризуют по наличию одного или нескольких полиморфизмов (включающих в себя, например, полиморфизмы, приводящие к изменению уровней экспрессии, например, к повышению или понижению уровней экспрессии, а также к образованию вариантов генных продуктов кодирующих последовательностей, таких как белки) в одном или нескольких из следующих генов: RETN, PTPN1, TCF1 (OMIM 142410; см, например, полиморфизм 0011), PPP1R3A (OMIM 600917; см, например, полиморфизмы 0001, 0003), PTPN1 (OMIM 176885 ; см, например, полиморфизм 0001), ENPP1 (OMIM 173335; см, например, полиморфизм 0006), IRS1 (OMIM 147545; см, например, полиморфизм 0002), EPHX2 (OMIM 13281 1; см, например, полиморфизм 0001), ген лептин (OMIM 164160, см., например, полиморфизмы 0001 и 0002), ген рецептора лептина (OMIM 601007 см., например, полиморфизмы 0001, 0002, 0004, и 0005), или ген рецептора инсулина (INSR, OMIM 147670 см., например, полиморфизмы 0001-0037).

Метаболический синдром

В иллюстративных вариантах осуществления расстройство представляет собой метаболический синдром. В соответствии с данным описанием термин "метаболический синдром" относится к группе симптомов, которые возникают вместе и увеличивают риск ишемической болезни сердца, инсульта и диабета 2 типа. Согласно Американской ассоциации кардиологов и Национального института сердца, легких и крови, считается, что метаболический синдром (также называемый синдром X) присутствует, если у индивидуума наблюдается три или более из следующих симптомов:

1) Артериальное давление равно или выше 130/85 мм рт.ст.;

2) Уровень сахара (глюкозы) в крови натощак равен или превышает 100 мг/дл;

3) Большая окружность талии (длина вокруг талии):

- у мужчин - 40 дюймов или более;

- у женщин - 35 дюймов или более;

4) Низкий холестерин HDL:

- у мужчин - ниже 40 мг/дл;

- у женщин - ниже 50 мг/дл;

5) Уровень триглицеридов равен или превышает 150 мг/дл.

Метаболический синдром можно диагностировать путем определения у индивидуума кровяного давления, уровня глюкозы в крови, уровня холестерина HDL, уровня холестерина LDL, уровня общего холестерина и уровня триглицеридов.

В иллюстративных вариантах осуществления индивидуум имеет центральное ожирение (окружность талии ≥80 см у женщин; ≥90 см у мужчин Азии, а также Южной и Центральной Америки, и ≥94 см у всех других мужчин), BMI>30 кг/м2, повышенный уровень триглицеридов (≥150 мг/дл, или специальное лечение этой липидной аномалии), пониженный уровень холестерина HDL (<40 мг/дл у мужчин, <50 мг/дл у женщин, или специальное лечение этой липидной аномалии), повышенное кровяное давление (sBP≥130 мм рт.ст. или dBP≥85 мм рт.ст., или лечение ранее диагностированной гипертонии), или повышенный уровень глюкозы в плазме натощак (FPG≥100 мг/дл или существующий диагноз диабета 2 типа), в том числе их сочетания. В иллюстративных вариантах осуществления индивидуум, подлежащий лечению с помощью способов настоящего изобретения, страдает от метаболического синдрома, или имеет повышенный риск метаболического синдрома, определенного Международной Диабетической Федерацией в "The IDF consensus worldwide definition of the metabolic syndrome", опубликованном в 2006 году, который включен в данный документ в качестве ссылки в полном объеме, т.е. индивидуум имеет центральное ожирение (как описано выше, и/или BMI>30 кг/м2), и любые два симптома из повышенного уровня триглицеридов, пониженного уровня холестерина HDL, повышенного кровяного давления, или повышенного уровня глюкозы в плазме натощак. В иллюстративных вариантах осуществления метаболический синдром характеризуется, или дополнительно характеризуется, наличием у индивидуума мутации в локусе, выбранном из 3q27 (см., например, OMIM 605552) и/или 17pl2 (см., например, OMIM 605572).

Расстройства, вызванные мутациями MC4R

Настоящее изобретение относится к способу лечения расстройства у индивидуума, страдающего от ослабленного ответа MC4R на α-меланокортин-стимулирующий гормон (α-MSH). Способ включает в себя введение эффективного количества агониста рецептора меланокортина-4 (MC4R). В иллюстративном варианте осуществления индивидуум является гетерозиготным носителем мутации MC4R, приводящей к ослабленному ответу MC4R на α-меланокортин-стимулирующий гормон (α-MSH). Поскольку гетерозиготные носители сохраняют способность отвечать на природный лиганд MC4R, лечение MC4R-ассоциированных заболеваний у гетерозиготных носителей путем введения агониста MC4R не требует знания типа мутации MC4R.

В одном иллюстративном варианте осуществления заболевание представляет собой ожирение, например, MC4R-ассоциированное ожирение. В другом иллюстративном варианте осуществления расстройство представляет собой метаболический синдром.

Продукт человеческого гена MC4R (hMC4R) представляет собой хорошо охарактеризованный белок, кодируемый геномной последовательностью с номером доступа в GenBank CH471077. Мутации в рецепторе MC4R являются причиной тяжелого ожирения в детском возрасте. В популяции несовершеннолетних с выявленным ожирением встречаемость носителей мутаций MC4R составляет примерно 2,5%, причем наивысшая встречаемость, составляющая 6%, наблюдается среди детей, страдающих тяжелым ожирением. Люди с мутациями MC4R имеют более или менее одинаковый фенотип, как описано для мышей с мутацией в гене рецептора МС4. Такие люди имеют четкую гиперфагию, гиперинсулинемию, повышенную жировую массу, сопровождающуюся безжировой компонентой массы тела, повышенную минеральную плотность кости и повышенную линейную скорость роста, без каких-либо изменений в уровнях кортизола, гонадотропина, гормонов щитовидной железы и половых стероидных гормонов. В отличие от удаления рецептора МС4, гиперфагия и гиперинсулинемия, как правило, имеют тенденцию к уменьшению с возрастом человека. Подобно мышам с нокаутом MC4R, гетерозиготные носители имеют промежуточный фенотип по сравнению с гомозиготными носителями. Проявившаяся гиперфагия, наблюдающаяся при испытательном приеме пищи, является менее тяжелой, чем у людей с дефицитом лептина. Степень дисфункции рецептора МС4, определяемая с помощью анализов in vitro, может предсказать количество пищи, проглоченной во время испытательного приема пищи индивидуумом, несущим указанную конкретную мутацию, и коррелирует с появлением и тяжестью фенотипа ожирения. По меньшей мере, 90 разных мутаций рецептора МС4 связаны с ожирением и могут быть обнаружены другие мутации рецептора МС4, приводящие к появлению подобного фенотипа ожирения.

Примеры мутаций MC4R, которые вызывают ожирение у человека, описаны в Farooqi et al., The Journal of Clinical Investigation, July 2000, vol. 106 (2), pp. 271-279 и Vaisse et al., The Journal of Clinical Investigation, July 2000, vol. 106(2), pp. 253-262, соответствующие части которых включены в настоящее описание посредством ссылки.

Другие мутации, способные вызвать ожирение у человека, включают в себя R18H, R18L, S36Y, P48S, V50M, F51L, E61K, I69T, D90N, S94R, G98R, I121T, A154D, Y157S, W174C, G181D, F202L, A219V, I226T, G231S, G238D, N240S, C271R, S295P, P299L, E308K, I317V, L325F и 750DelGA, как описано в Xiang et al, "Pharmacological characterization of 30 human melanocortin-4 receptor polymorphisms with the endogenous proopiomelanocortin-derived agonists, synthetic agonists, and the endogenous agouti-related protein antagonist", Biochemistry, 2010 Jun 8; 49(22):4583-600, соответствующие части которого включены в настоящее описание посредством ссылки.

Другие примеры мутаций, которые могут вызывать ожирение у человека, включают в себя мутации, перечисленные в онлайн-каталоге менделеевской наследственности человека (OMIM), представляющим собой базу данных генов и генетических нарушений человека, под регистрационным номером 155541 (MC4R) (точнее, под регистрационными номерами 155541.0001-155541.0023) в URL http://omim.org/entry/155541. Типичные примеры мутаций включают в себя 4-BP DEL, NT631; 4-BP INS, NT732; TYR35TER; ASP37VAL; SER58CYS; ILE102SER; ASN274SER; 1-BP INS, 112A; 4-BP DEL, 211CTCT; ILE125LYS; ALA175THR; ILE316SER; TYR287TER; ASN97ASP; 15-BP DEL (кодоны delta88-92); и SER127LEU. Соответствующие части базы данных OMIM включены в данный документ в качестве ссылки.

В иллюстративных вариантах осуществления мутация MC4R приводит к сохранению сигнальной активности MC4R.

Мутации в геномной последовательности, кодирующей MC4R, можно обнаружить с помощью методов, хорошо известных рядовому специалисту в данной области техники. Например, геномную последовательность можно клонировать с использованием нуклеотидных праймеров, таких как, например, праймеры, описанные в Farooqi et al, The Journal of Clinical Investigation, July 2000, vol. 106 (2), pp. 271-279 и Vaisse et al, The Journal of Clinical Investigation, July 2000, vol. 106(2), pp. 253-262, после чего клонированную последовательность можно анализировать с использованием коммерчески доступных секвенаторов и программного обеспечения.

Активность MC4R можно измерить с помощью способов, хорошо известных рядовому специалисту в данной области техники. Например, клетки временно трансфицируют клонированной ДНК MC4R, трансфицированные клетки приводят в контакт с агонистом MC4R (например α-MSH) и измеряют уровень внутриклеточного цАМФ, вторичного мессенджера MC4R, методом электрохемилюминесценции, описанным, например, в Roubert et al, Journal of Endocrinology (2010) 207, pp. 177-183. Уменьшение сигнала MC4R можно установить путем сравнения уровня внутриклеточного цАМФ, продуцируемого в ответ на конкретный агонист MC4R дикого типа и мутантным MC4R.

Модуляторы MC4R (например, агонисты) также можно использовать для лечения пациентов, страдающих от других расстройств, таких как пониженный тон природных агонистов MC4R. Примеры таких пациентов включают в себя индивидуумов, гетерозиготных или гомозиготных по мутациям в генах, играющих важную роль в лептин-зависимом пути (Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism, 2006; 2; 6; 318 and NEng J Med: 2007; 356; 3; 237), пропиомеланокортиновом процессинге (Nature Genetics, 1998, 155; Cell Metabolism, 2006; 3; 135; Annals Acad Med, 2009, 38; 1; 34), или по мутациям в генах, кодирующих конвертазы прогормонов.

Режимы введения

Введение соединения или его фармацевтически приемлемой соли, или композиции, содержащей соединение или фармацевтически приемлемую соль соединения настоящего изобретения, используемое для осуществления описанных в данном документе способов, можно проводить непрерывно, ежечасно, четыре раза в день, три раза в день, два раза в день, один раз в день, один раз в два дня, два раза в неделю, один раз в неделю, раз в две недели, раз в месяц, или раз в два месяца, или больше, или с использованием некоторых других периодических режимов введения.

Примеры введения соединения, или композиции, содержащей соединение или фармацевтически приемлемую соль соединения настоящего изобретения, включают в себя, без ограничения, периферическое введение. Примеры периферического введения включают в себя пероральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутривенное, ректальное, трансдермальное, трансбуккальное, сублингвальное, ингаляционное, легочное или трансназальное введение.

Сочетанная терапия

Описанный здесь пептид можно использовать для лечения любого из заболеваний, чувствительных к модуляции MC4R, путем введения его в сочетании с одним или несколькими другими фармацевтически активными соединениями ("другое средство"). Такое сочетанное введение можно осуществлять с использованием стандартной лекарственной формы, которая содержит один или несколько пептидов, описанных в данном документе, и одно или несколько других средств, такие стандартные лекарственные формы включают в себя таблетки, капсулы, спрей, ингаляционный порошок, жидкости для инъекций и т.п. Альтернативно сочетанное введение можно осуществлять путем введения двух разных лекарственных форм, одна из которых содержит один или несколько описанных здесь пептидов, а другая лекарственная форма содержит одно или несколько других средств. В данном случае лекарственные формы могут быть одинаковыми или разными. Ниже приведены неограничивающие примеры сочетанных способов лечения.

Описанный здесь пептид можно использовать в сочетании с одним или несколькими другими средствами, подходящими для лечения разных расстройств, связанных с изменением массы тела и режима питания, таких как ожирение и/или избыточный вес. В частности, другое средство может представлять собой лекарство от ожирения, которое влияет на расход энергии, гликолиз, глюконеогенез, глюкогенолиз, липолиз, липогенез, абсорбцию жиров, отложение жиров, выделение жиров, механизмы голодания, и/или насыщения, и/или жажды, аппетит/мотивацию, прием пищи или моторику желудочно-кишечного тракта. Лекарственные средства, которые снижают потребление энергии, включают в себя, в частности, разные фармакологические средства, называемые анорексигенными средствами, которые используются в качестве вспомогательных средств для поведенческой терапии в программах снижения веса.

Как правило, общая доза средств или лекарств, подавляющих ожирение, при применении в сочетании с одним или несколькими из описанных здесь пептидов, может находиться в диапазоне от 0,1 до 3000 мг/день, предпочтительно примерно от 1 до 1000 мг/день, более предпочтительно примерно от 1 до 200 мг/день, причем указанную дозу можно вводить в один прием, или ее можно разделить на 2-4 приема. Однако точная доза определяется лечащим врачом и зависит от таких факторов, как активность вводимого соединения, возраст, масса, состояние пациента и его способность отвечать на лечение.

Один или несколько из описанных здесь пептидов можно использовать в сочетании с одним или несколькими другими средствами, используемыми для лечения диабета.

В дополнение или альтернативно один или несколько из описанных здесь пептидов можно дополнительно объединить с одним или несколькими другими средствами, используемыми для лечения болезней, расстройств и состояний, связанных с ожирением и/или избыточным весом, таких как резистентность к инсулину; нарушенная толерантность к глюкозе; диабет типа 2; метаболический синдром; дислипидемия (в том числе гиперлипидемия); гипертония; сердечные расстройства (например, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда); сердечно-сосудистые заболевания; неалкогольная жировая дистрофия печени (в том числе неалкогольный стеатогепатит); болезни суставов (в том числе вторичный остеоартрит); гастроэзофагеальный рефлюкс; апноэ во сне; атеросклероз; инсульт; макро и микро сосудистые заболевания; стеатоз (например, печени); желчные камни; и расстройства желчного пузыря.

Другое средство

Одно или несколько других средств могут быть выбраны, например, из группы, включающей в себя

инсулин и аналоги инсулина;

средства, усиливающие секрецию инсулина, в том числе сульфонилмочевины (например, глипизид), и прандиальные регуляторы уровня глюкозы (иногда называемые "стимуляторы секреции кратковременного действия"), такие как, например, меглитиниды (репаглинид и натеглинид);

средства, улучшающие действие инкретина: инкретин, инкретиномиметик, средства, улучшающие функцию инкретина, например, GLP-1, GIP; агонисты GLP-1 (например, экзенатид и лираглутид (VICTOZA)), ингибиторы DPP-4 (например, вилдаглиптин, саксаглиптин и ситаглиптин)

средства, повышающие чувствительность к инсулину, включающие в себя агонисты гамма-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPARγ), такие как тиазолидиндионы (например, пиоглитазон и розиглитазон), а также средства с любым сочетанием активности в отношении PPAR альфа, гамма и дельта;

средства, модулирующие баланс глюкозы в печени, такие как бигуаниды (например метформин), ингибиторы фруктоза-1,6-бифосфатазы, ингибиторы гликогенфосфорилазы, ингибиторы киназы гликогенсинтазы и активаторы глюкокиназы;

средства, направленные на снижение/замедление абсорбции глюкозы из кишечника, такие как ингибиторы альфа-глюкозидазы (например, миглитол и акарбоза);

средства, которые являются антагонистами действия глюкагона, или уменьшают его секрецию, такие как аналоги амилина (например, прамлинтид);

средства, предотвращающие реабсорбцию глюкозы в почках, такие как ингибиторы натрий-зависимого транспортера глюкозы 2 (SGLT-2) (например, дапаглифлозин);

средства, предназначенные для лечения осложнений длительной гипергликемии, такие как ингибиторы альдозоредуктазы (например, эпалрестат и ранирестат);

средства, используемые для лечения осложнений, связанных с микроангиопатиями;

средства против дислипидемии, такие как ингибиторы HMG-КоА-редуктазы (статины, например, розувастатин), а также другие средства, снижающие уровень холестерина;

агонисты PPARα (фибраты, например гемфиброзил и фенофибрат);

средства, способствующие выведению желчных кислот (например, холестирамин);

ингибиторы абсорбции холестерина (например, растительные стерины (такие как фитостерины), синтетические ингибиторы);

ингибиторы транспортного белка холестериновых эфиров (СЕТР); ингибиторы илеальной транспортной системы желчных кислот (ингибиторы IBAT);

смолы, связывающие желчные кислоты;

никотиновая кислота (ниацин) и ее аналоги;

антиоксиданты, такие как пробукол;

омега-3 жирные кислоты;

антигипертензивные средства, включающие в себя антагонисты адренергических рецепторов, такие как бета-блокаторы (например, атенолол), альфа-блокаторы (например, доксазозин) и смешанные альфа/бета-блокаторы (например, лабеталол);

агонисты адренергического рецептора, в том числе агонисты альфа-2 (например, клонидин);

ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента (ACE) (например, лизиноприл), блокаторы кальциевых каналов, такие как дигидропиридины (например, нифедипин), фенилалкиламины (например, верапамил) и бензотиазепины (например, дилтиазем);

антагонисты рецептора ангиотензина II (например, кандесартан); антагонисты рецептора альдостерона (например, эплеренон);

адренергические средства центрального действия, такие как центральные агонисты альфа (например, клонидин); и диуретические средства (например, фуросемид);

модуляторы гемостаза, в том числе антитромботические средства, такие как активаторы фибринолиза;

антагонисты тромбина;

ингибиторы фактора VIIa; антикоагулянты, такие как антагонисты витамина K (например варфарин), гепарин и его низкомолекулярные аналоги, ингибиторы фактора Ха и непосредственные ингибиторы тромбина (например, аргатробан); антитромбоцитарные средства, такие как ингибиторы циклооксигеназы (например, аспирин), ингибиторы рецептора аденозиндифосфата (АДФ) (например, клопидогрель), ингибиторы фосфодиэстеразы (например, силостазол), ингибиторы гликопротеина IIB/IIA (например, тирофибан) и ингибиторы обратного захвата аденозина (например, дипиридамол);

средства против ожирения, такие как средства, подавляющие аппетит (например, эфедрин), в том числе норадренергические средства (например, фентермин) и серотонинергические средства (например, сибутрамин), ингибиторы липазы поджелудочной железы (например, орлистат), модуляторы микросомального транспортного белка (МТР), ингибиторы диацилглицеринацилтрансферазы (DGAT) и антагонисты рецепторов каннабиноидов (CB 1) (например, римонабант);

средства, модифицирующие пищевое поведение, такие как модуляторы рецептора орексина и модуляторы меланиноконцентрирующего гормона (MCH);

модуляторы нейропептида Y (NPY)/рецептора NPY;

модуляторы киназы пируватдегидрогеназы (PDK);

модуляторы серотониновых рецепторов;

модуляторы лептина/рецептора лептина;

модуляторы грелина/рецептора грелина;

средства, усиливающие функцию бета-клеток;

средства, стимулирующие расход энергии (например, стимуляторы бета-адренергических рецепторов, агонисты UCP-1, модуляторы и стимуляторы бурого жира);

средства, вызывающие лизис адипоцитов (например, антитела);

никотин или средства от никотиновой зависимости;

эстроген, природный или синтетический модулятор рецептора эстрогенов;

модулятор μ-опиоидного рецептора; и

средства, модулирующие транспорт моноаминов, такие как селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (SSR1) (например флуоксетин), ингибиторы обратного захвата норадреналина (NARI), ингибиторы обратного захвата норадреналина-серотонина (SNRI), блокаторы тройного обратного захвата моноаминов (например, тесофенсин) и ингибиторы моноаминоксидазы (MAOI) (например, толоксатон и амифламин), или их фармацевтически приемлемые соли.

В иллюстративном варианте осуществления введение агониста MC4R и другого средства можно проводить одновременно, последовательно или раздельно с приемом диеты с очень низким содержанием калорий (VLCD), или низкокалорийной диеты (LCD).

Выделенные полипептиды настоящего изобретения

В иллюстративном варианте осуществления выделенные полипептиды (например, агонисты MC4R) представляют собой соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли: Выделенный полипептид нижеследующей структурной формулы (I):

или его фармацевтически приемлемая соль,

где:

R1 обозначает Н или С1-С6 ацил;

R2 обозначает -NR3R4, или -OR5, где каждый из R3, R4 и R5 независимо обозначает Н или C1-С6 алкил;

А1 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Arg, Lys, Orn, His, Nle, Phe, Val, Leu, Trp, Tyr, Ala, Ser, Thr, Gln, Asn, Asp, Glu или TzAla; или

А1 обозначает фрагмент, выбранный из необязательно замещенного С1-С12 алкила, необязательно замещенного С6-С18 арила, необязательно замещенного C5-С18 гетероарила, аралкила, в котором арильная часть представляет собой необязательно замещенный С6-С18 арил, а алкильная часть представляет собой необязательно замещенный С1-С12 алкил, или гетероаралкила, где гетероарильная часть представляет собой необязательно замещенный С5-С18 гетероарил, а алкильная часть представляет собой необязательно замещенный С1-С12 алкил;

каждый из А2 и А8 независимо обозначает остаток аминокислоты, выбранный из Cys, hCys, Pen, Asp, Glu, Lys, Orn, Dbu или Dpr, где пары А2 и А8 выбирают таким образом, чтобы обеспечить возможность образования ковалентной связи между соответствующими боковыми цепями;

А3 отсутствует или обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Ala, Tle, Val, Leu, Ile, Cha, Pro, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Phe, Gln, Sar, Gly, Asn, Aib, или остаток Y, где Y обозначает аминокислоту, имеющую одну из следующих структурных формул:

где:

каждый из R11 и R12 независимо обозначает Н, -СН3, фенил или бензил;

каждый из R21, R22, R23 и R24 независимо обозначает Н, -СН3, -CF3, фенил, бензил, F, Cl, Br, I, -OCH3 или -ОН;

каждый из R31, R32, R33, R34, R41, R42 и R43 независимо обозначает Н, -СН3, -CF3, фенил, бензил, F, Cl, Br, I, -OCH3 или -ОН;

А4 отсутствует или обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Atc, Ala, QAla, Aib, Sar, Ser, Thr, Pro, Hyp, Asn, Gln, необязательно замещенного His, Trp, Tyr, Lys, Arg, sChp, или остаток Х, где Х обозначает аминокислоту, имеющую одну из следующих структурных формул:

где:

каждый из R51 и R52 независимо обозначает Н, -СН3, фенил или бензил;

каждый из R61, R62, R63 и R64 независимо обозначает Н, -СН3, -CF3, фенил, бензил, F, Cl, Br, I, -OCH3 или -ОН;

каждый из R71, R72, R73, R74, R81, R82 и R83 независимо обозначает Н, -СН3, -CF3, фенил, бензил, F, Cl, Br, I, -OCH3 или -ОН;

А5 обозначает необязательно замещенный Phe, необязательно замещенный 1-Nal, или необязательно замещенный 2-Nal;

А6 обозначает Arg; и

А7 обозначает Trp,

где любой аминокислотный остаток может находиться в L- или в D-конфигурации.

В иллюстративных вариантах осуществления А3 отсутствует или обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Ala, Tle, Val, Leu, Ile, Cha, Pro, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Phe, Gln, Sar, Gly, Asn или Aib; а А4 отсутствует или обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Atc, Ala, QAla, Aib, Sar, Ser, Thr, Pro, Hyp, Asn, Gln, необязательно замещенного His, Trp, Tyr, Lys, Arg, sChp, или остаток Х, где Х обозначает аминокислоту, имеющую нижеследующую структурную формулу:

Остальные переменные имеют значения и предпочтительные значения, определенные выше и ниже в применении к формуле (I).

В иллюстративных вариантах осуществления каждый из А3 и А4 независимо обозначает остаток аминокислоты, выбранной из аминокислот, представленных следующими структурными формулами:

Остальные переменные имеют значения и предпочтительные значения, определенные выше и ниже в применении к формуле (I).

В иллюстративных вариантах осуществления А3 и А4 не отсутствуют одновременно. Остальные переменные имеют значения и предпочтительные значения, определенные выше и ниже в применении к формуле (I).

В иллюстративных вариантах осуществления, если А4 обозначает аминокислоту, А3 отличается от Aib или Gly. Остальные переменные имеют значения и предпочтительные значения, определенные выше в применении к формуле (I).

В иллюстративных вариантах осуществления, если А4 обозначает His, а А5 обозначает D-Phe или 2-Nal, А3 отличается от D-аминокислоты или L-Ala. Остальные переменные имеют значения и предпочтительные значения, определенные выше в применении к формуле (I).

В иллюстративных вариантах осуществления, если каждый из А2 и А8 выбран из Cys, hCys или Pen, то: (a) если А4 отсутствует, А3 отличается от L-His; (b) если А3 отсутствует, А4 отличается от L-His; и (c) если А4 обозначает His, А3 отличается от Glu, Leu или Lys. Остальные переменные имеют значения и предпочтительные значения, определенные выше в применении к формуле (I).

В иллюстративных вариантах осуществления: 1) А3 и А4 не отсутствуют одновременно; 2) если А4 обозначает аминокислоту, А3 отличается от Aib или Gly; и 3) если А4 обозначает His, а А5 обозначает D-Phe или 2-Nal, А3 отличается от D-аминокислоты или L-Ala; 4) если каждый из А2 и А8 выбран из Cys, hCys или Pen, то: (a) если А4 отсутствует, А3 отличается от L-His; (b) если А3 отсутствует, А4 отличается от L-His; и (c) если А4 обозначает His, А3 отличается от Glu, Leu или Lys. Остальные переменные имеют значения и предпочтительные значения, определенные выше в применении к формуле (I).

В другом варианте осуществления полипептидов формулы (I), А4 обозначает L-аминокислоту. В других вариантах осуществления А4 отсутствует. Остальные переменные имеют значения и предпочтительные значения, определенные выше в применении к формуле (I).

В иллюстративных вариантах осуществления А5 может представлять собой необязательно замещенный 1-Nal или необязательно замещенный 2-Nal, например, необязательно замещенный D-2-Nal. А5 может быть замещен по любому из пяти ароматических атомов углерода заместителем, выбранным из F, Cl, Br, I, -СН3, -ОН, -CN, амин, -NO2 или -OCH3.

В следующем варианте осуществления полипептидов формулы (I) A5 представляет собой необязательно замещенный D-Phe. А5 может быть замещен по любому из пяти ароматических атомов углерода заместителем, выбранным из F, Cl, Br, I, -СН3, -ОН, -CN, амин, -NO2 или -OCH3. Подходящие примеры А5 включают в себя, без ограничения, остаток D-аминокислоты, выбранный из: Phe, Phe(2'-F), Phe(2'-Cl), Phe(2'-Br), Phe(2'-I), Phe(2'-CN), Phe(2'-CH3), Phe(2'-OCH3), Phe(2'-CF3), Phe(2'-NO2), Phe(3'-F), Phe(3'-Cl), Phe(3'-Br), Phe(3'-I), Phe(3'-CN), Phe(3'-CH3), Phe(3'-OCH3), Phe(3'-CF3), Phe(3'-NO2), Phe(4'-F), Phe(4'-Cl), Phe(4'-Br), Phe(4'-I), Phe(4'-CN), Phe(4'-CH3), Phe(4'-OCH3), Phe(4'-CF3), Phe(4'-NO2), Phe(4'-t-Bu), Phe(2',4'-diF), Phe(2',4'-diCl), Phe(2',4'-diBr), Phe(2',4'-diI), Phe(2',4'-di-CN), Phe(2',4'-di-CH3), Phe(2',4'-di-OCH3), Phe(3',4'-diF), Phe(3',4'-diCl), Phe(3',4'-diBr), Phe(3',4'-diI), Phe(3',4'-di-CN), Phe(3',4'-di-CH3), Phe(3',4'-di-OCH3), Phe(3',5'-diF), Phe(3',5'-diCl), Phe(3',5'-diBr), Phe(3',5'-diI), Phe(3'; 5'-di-CN), Phe(3',5'-diCH3), Phe(3',5'-di-OCH3) или Phe(3',4',5'-triF). Остальные переменные имеют значения и предпочтительные значения, определенные выше в применении к формуле (I).

В другом варианте осуществления полипептидов формулы (I) A5 обозначает необязательно замещенный D-2-Nal. А5 может быть замещен по любому из пяти ароматических атомов углерода заместителем, выбранным из F, Cl, Br, I, -СН3, -ОН, -CN, амин, -NO2 или -OCH3.

В следующем варианте осуществления полипептидов формулы (I) А4 обозначает His, необязательно замещенный по любому замещаемому положению заместителем, выбранным из F, Cl, Br, I, -СН3, -ОН, -CN, амин, -NO2, бензила или -OCH3. Остальные переменные имеют значения и предпочтительные значения, определенные выше в применении к формуле (I).

В конкретном варианте осуществления соединения настоящего изобретения представляют собой полипептиды формулы (I), которые характеризуются EC50 в отношении MC4R, составляющим примерно от 0,01 нМ до 10 нМ, например 0,01-3 нМ, при этом соотношение EC50(MC1R)/EC50(MC4R) составляет, по меньшей мере, 10.

В другом варианте осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя полипептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В следующем варианте осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя полипептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В другом варианте осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя полипептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В следующем варианте осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя полипептид, представленный формулой (I), где А4 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Atc, Ala, QAla, Aib, Sar, Ser, Thr, Pro, Hyp, Asn, Gln, необязательно замещенного His, Trp, Tyr, Lys, Arg, sChp, или остаток Х. Примеры таких пептидов включают в себя пептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В иллюстративных вариантах осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя пептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В другом варианте осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя полипептиды, представленные формулой (I), где А3 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Tle, Val, Leu, Ile, Cha, Pro, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Phe, Gln, Sar, Gly, Asn или Aib; а А4 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Atc, Ala, QAla, Aib, Sar, Ser, Thr, Pro, Hyp, Asn, Gln, замещенного His, Trp, Tyr, Lys, Arg, sChp, или остаток Х. Примером таких полипептидов является полипептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемая соль.

В следующем варианте осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя полипептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В следующем варианте осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя полипептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В следующем варианте осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя полипептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В следующем варианте осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя полипептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемую соль.

В другом варианте осуществления полипептиды настоящего изобретения включают в себя полипептид, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

или его фармацевтически приемлемую соль.

ПРИМЕРЫ

Синтез пептидов

Пептиды настоящего изобретения получают путем традиционного твердофазного пептидного синтеза. Пептидную цепь удлиняют постадийно, начиная с производного С-концевой аминокислоты, присоединенного к соответствующему твердому носителю-смоле, подходящему для пептидного синтеза. Для синтеза пептида, содержащего С-концевую амидную функциональную группу, в качестве твердого носителя используют амидную смолу Ринка MBHA. Для синтеза пептида, содержащего свободную С-концевую карбоксильную функциональную группу, можно использовать такие смолы, как 2-хлортритилхлоридная смола, смола Ванга, или смола Меррифилда, способные к образованию эфирной связи с Fmoc-аминокислотой. Большинство указанных, содержащих сложноэфирную связь, конъюгатов Fmoc-аминокислота-смола являются коммерчески доступными от разных источников и широко используются, когда это целесообразно.

Синтез дисульфид-циклизованных пептидов

Линейное амидное производное дисульфид-содержащего циклического пептида собирают, используя Fmoc-химию, на твердофазном пептидном синтезаторе. Fmoc-Амидную смолу Ринка помещают в реакционный сосуд и оставляют набухать в NMP. Затем ее обрабатывают 20% пиперидином в NMP в течение 15 минут и трижды промывают NMP. Смолу тестируют на положительную оценку в тесте Кайзера (Kaiser, E., Colescot, R.L., Bossinge, C.D. & Cook, P.I. Anal. Biochem., 1990, 34: 595-598). Смолу ресуспендируют в NMP и смешивают с Fmoc-производным первой С-концевой аминокислоты и HOBt. Реакцию сочетания инициируют путем добавления реагента HBTU и DIPEA. После перемешивания в течение 2-3 часов завершение реакции сочетания подтверждают путем получения отрицательного результата в тесте Кайзера, с использованием небольшой аликвоты смолы, взятой из реакционной смеси. Затем смолу промывают три раза NMP. После этого группу Fmoc удаляют, как описано ранее, и весь цикл повторяют с Fmoc-производным второй С-концевой аминокислоты, как описано. Такой же цикл реакций повторяют последовательно для каждой следующей аминокислоты. Хлораниловый тест на окрашивание (Vojkovsky, T. Pept. Res, 1995, 8: 236-237) используют вместо теста Кайзера для анализа удаления защитной группы Fmoc с остатка пролина в пептидной последовательности, а также для тестирования завершения реакции сочетания аминокислоты с пролином (отрицательный результат в хлораниловом тесте). В случае пептидов, содержащих N-концевую ацетильную группу, после удаления защитных групп Fmoc пептидную смолу обрабатывают в течение 10 минут уксусным ангидридом и пиридином. После получения отрицательного результата в тесте Кайзера смолу промывают NMP, дихлорметаном и сушат в вакууме. Для синтеза указанных пептидов используют Fmoc-производные аминокислот. В случае аминокислот, содержащих три функциональные группы, используют следующие производные: Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-hCys(Trt)-OH, Fmoc-Pen(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(But)-ОН, Fmoc-His(L-Me)-ОН, Fmoc-His(3-Me)-OH и Fmoc-Glu(O-But)-ОН.

Чтобы отщепить пептид от смолы, а также для удаления защиты с функциональных групп боковой цепи, конъюгат пептид-смола помещают в смесь: 2% TIS/5% воды/5% (масс/объем) DTT/88% ТФУ. Раствор оставляют перемешиваться в течение 3,5 часов и затем фильтруют. Фильтрат смешивают с холодным безводным этиловым эфиром. Осадок собирают центрифугированием. Растворитель декантируют и осадок пептида ресуспендируют в свежем эфире. Обработку эфиром повторяют еще два раза. Пептид сушат в вакууме. Неочищенный линейный пептидный продукт разводят до концентрации 2 мг/мл 5% уксусной кислотой и по каплям при интенсивном перемешивании добавляют 0,5М иод/метанол до достижения стойкого бледно-желтого окрашивания раствора. Раствор перемешивают еще 10 минут. Затем избыток иода гасят путем добавления при перемешивании 1М тиосульфата натрия до обесцвечивания смеси. Раствор циклического пептида лиофилизируют и неочищенный порошок очищают методом препаративной ВЭЖХ, используя колонку с обращенной фазой С-18. Фракции, содержащие очищенный продукт, объединяют и лиофилизируют. Пептиды анализируют методом масс-спектрометрии, используя технику ионизации электрораспылением, и идентифицируют по корректной массе.

Синтез лактам-циклизованных пептидов

Циклические лактам-содержащие пептиды также синтезируют с помощью стандартных методов твердофазного пептидного синтеза. В случае пептидов, содержащих С-концевой Dpr, смолу Fmoc-Dpr(Mtt)-BHA переносят в реактор твердофазного пептидного синтезатора. Группу Fmoc удаляют, как описано выше, и следующую Fmoc-защищенную аминокислоту, например, такую как Fmoc-Trp(Boc)-OH, присоединяют к смоле посредством стандартных реакций сочетания. Защитную группу Fmoc удаляют и остальные аминокислоты добавлены по отдельности в правильной последовательности, повторяя реакции сочетания и удаления защитных групп до завершения синтеза аминокислотной последовательности. Для присоединения глутаминовой кислоты используют Fmoc-Glu(OPip). Полностью собранный пептид ацетилируют по N-концу, как в способе, описанном ранее для дисульфид-содержащих пептидов. Затем удаляют ортогональные защитные группы с боковых цепей. Например, ортогональные защитные группы с конъгата пептид-смола, содержащего Glu, боковая цепь которого защищена 2-фенилизопропиловым (OPip) сложным эфиром, или Dpr, боковая цепь которого защищена 4-метилтритилом (Mtt), отщепляют путем обработки 1% ТФУ в дихлорметане. После удаления защитных групп конъюгат пептид-смола суспендируют в NMP и обрабатывают HBTU/DIPEA. После циклизации (отрицательный результат в тесте Кайзера) конъюгат пептид-смола промывают дихлорметаном и сушат. Отщепление циклического пептида от смолы, а также любых оставшихся защитных групп проводят с использованием трифторуксусной кислоты (ТФУ) в присутствии воды и 1,2-этандитиола (EDT). Продукт осаждают путем добавления холодного безводного эфира и собирают центрифугированием. Конечную очистку проводят методом ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой С-18. Очищенный пептид лиофилизируют и определяют его массу методом масс-спектрометрии с использованием технологии электронного распыления.

Примеры соединений настоящего изобретения приведены в таблице 2.

Радиолигандные анализы связывания:

Анализы связывания рецептора с целью определения константы связывания (Kd) или ингибирующей концентрации (IC50) путем вытеснения радио-меченого лиганда из комплекса с рецептором циклическим пептидом настоящего изобретения можно проводить с помощью любого способа, известного в данной области.

В качестве примера, препараты клеточных мембран для анализа связывания получают из клеток СНО-K1, трансфицированных с целью стабильной экспрессии рецепторов hMC подтипов 1, 3, 4 или 5. Конкурентное ингибирование связывания [125I](Tyr2)-(Nle4-D-Phe7)-alpha-MSH ([125I]-NDP-α-MSH) проводят в полипропиленовых 96-луночных планшетах. Коротко говоря, клеточные мембраны (1-10 мкг белка/лунку), полученные по описанному выше способу, инкубируют в 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, содержащем 0,2% BSA, 5 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2 и 0,1 мг/мл бацитрацина, с использованием возрастающих концентраций тестируемого соединения и 0,1-0,3 нМ [125I]-NDP-α-MSH в течение примерно 120 минут при 37°С. Связанный лиганд [125I]-NDP-α-MSH отделяют от свободного [125I]-NDP-α-MSH фильтрацией через планшеты с фильтром из стекловолокна GF/C (Unifilter®, Meriden, CT, USA), предварительно замоченные в 0,1% (масс/объем) полиэтиленимине (PEI). Фильтры промывают три раза 50 мМ Трис-HCl, pH 7,4, при температуре примерно 0-4°С, и затем анализировали на радиоактивность. Результаты анализа связывания обрабатывают с помощью компьютерного нелинейного регрессионного анализа.

Анализ стимуляции циклического АМФ:

Агонистический или антагонистический статус циклического пептида настоящего изобретения определяют с помощью функциональных анализов, которые можно проводить любым способом, известным в данной области.

Электрохемилюминесцентный (ECL) анализ

Уровни внутриклеточного циклического АМФ (цАМФ), стимулированного пептидами, определяют в дозо-зависимой манере с помощью электрохемилюминесцентного (ECL) анализа (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA; далее называемый "MSD"). Коротко говоря, клетки СНО-К1, стабильно экспрессирующие подтипы рецептора hMC, суспендируют в буфере RMPI 1640® для анализа (буфер RMPI 1640, содержащий 0,5 мМ IBMX и 0,2% белковой смеси (блокатор А MSD)). Трансгенные клетки СНО-К1, стабильно экспрессирующие рецептор hMC подтипов 1, 3, 4 или 5, распределяют в количестве примерно 7000 клеток/лунку в 384-луночные планшеты Multi-Array (MSD), содержащие встроенные углеродные электроды и покрытые антителами против цАМФ. После добавления возрастающих концентраций тестируемых соединений клетки инкубируют в течение примерно 40 минут при 37°С. Добавляют буфер для лизиса клеток (HEPES-забуференный физиологический раствор, содержащий MgCl2 и Triton X-100®, рН 7,3), содержащий 0,2% белковой смеси и 2,5 нМ TAG™ рутений-меченого цАМФ (MSD), после чего клетки инкубируют в течение примерно 90 минут при комнатной температуре. В конце второго периода инкубации добавляют буфер для считывания (трис-забуференный раствор, содержащий сореагент ECL и Triton X-100, рН 7,8) и сразу определяют уровни цАМФ в клеточных лизатах путем детекции ECL с помощью ридера Sector Imager 6000 reader® (MSD). Результаты обрабатывают с помощью компьютерного анализа нелинейной регрессии (XL fit; IDBS) и выражают в виде значений ЕС50. ЕС50 представляет собой концентрацию агонистического соединения, необходимую для получения ответа, составляющего 50% от максимального, например, 50% от максимального уровня цАМФ, определенного с помощью описанного выше анализа.

Анализ путем измерения уровня цАМФ:

Клетки, трансфицированные человеческим МС4-R, выращивают до слияния в 96-луночных планшетах (помещая примерно 250000 клеток на лунку). Клетки обрабатывают с тройными повторами 0,2 мМ изобутилметилксантином (IBMX) и сортируют в зависимости от концентрации пептида или, альтернативно, пептида в присутствии 20 нМ NDP-MSH. Клетки обрабатывают одинаковым образом и образцы, содержащие только 20 нМ NDP-MSH, используют в качестве положительных контролей в объеме 200 мкл. В качестве отрицательного контроля используют пустые образцы, содержащие только буфер. После инкубации в течение одного часа при 37°С клетки лизируют путем добавления 50 мкл буфера для лизиса клеток. Общее количество цАМФ, накопленное в 250 мкл указанной инкубационной среды, количественно определяют с использованием коммерчески доступного набора для анализа цАМФ при низких значениях рН (Amersham Biosciences) в соответствии с методом, предлагаемым поставщиком набора. Пептид, вызывающий накопление цАМФ в таком же диапазоне или выше, как и альфа-MSH, используемый в качестве положительного контроля, считают агонистом. Строят график с использованием результатов, полученных для агониста, кривую подгоняют и определяют значения ЕС50. Пептид, вызывающий накопление в том же диапазоне, что и отрицательный контроль (пустой буфер в отсутствии альфа-MSH), считается неэффективным в тестируемой концентрации. Пептид, вызывающий пониженное накопление, считается антагонистом, если наблюдается ингибирование уровня цАМФ по сравнению с уровнем, индуцируемым альфа-MSH, также используемым в анализе. Подобный анализ можно проводить с использованием клеток, экспрессирующих hMC-1R, hMC-3R и hMC-5R.

Измерение накопления цАМФ с помощью β-галактозидазной (β-Gal) репортерной системы:

Используют систему считывания хемилюминесценции с комплементацией фрагментов ферментов (EFC) и с применением β-галактозидазы (β-Gal) в качестве системы функционального репортера. Данная аналитическая система, использующая разные системы рецепторов меланокортина, является коммерчески доступной (система для анализа цАМФ Hunter GPCR, Discoverx Corp, Fremont, CA). В указанном анализе используют фермент β-Gal, который расщепляется на два комплементарных фрагмента; ЕА - ферментный акцептор и ED - ферментный донор. В данном анализе фрагмент ED, гибридизованный с цАМФ, конкурирует с цАМФ, продуцируемым клетками, за связывание с цАМФ-специфичными антителами. Затем добавляют ЕА, образующий активный β-Gal с несвязанным ED-цАМФ. Затем образовавшийся активный фермент конвертирует хемилюминесцентный субстрат, генерируя сигнал, который регистрируют на стандартном ридере для микропланшетов.

Коротко говоря, в планшет высевают 10000 клеток на лунку, инкубируют в течение ночи и затем каждую лунку (клетки инкубируют с 10 мкл буфера для анализа) инкубируют с 4-кратными серийными концентрациями тестируемого соединения в буфере для клеточного анализа (5 мкл) и цАМФ-специфичным антителом (5 мкл) в течение 30 мин при 37°С. Затем добавляют буфер для лизиса клеток (20 мкл), содержащий конъюгат фрагмента фермента ED-цАМФ и репортерный субстрат (Emerald II-Galacton Star, 5:1), после чего инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 20 мкл реагента, содержащего фрагмент ЕА β-Gal. После инкубации в течение 120 мин при комнатной температуре измеряют хемилюминесценцию с помощью планшет-ридера (Envision) и результаты используют для вычисления значений ЕС50 тестируемых пептидов.

Результаты представлены в таблице 3.

Хотя настоящее изобретение конкретно демонстрируется и описывается со ссылкой на иллюстративные варианты его осуществления, специалисты в данной области могут осуществить разные изменения формы и деталей изобретения, не отступая от его объема, определенного в прилагаемой формуле изобретения.

1. Выделенный полипептид нижеследующей структурной формулы (I):

или его фармацевтически приемлемая соль,

где R1 обозначает Н или С16 ацил;

R2 обозначает -NR3R4 или -OR5, где каждый из R3, R4 и R5 независимо обозначает Н или C16 алкил;

А1 обозначает Arg;

каждый из А2 и А8 независимо обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Cys, hCys или Pen;

А3 обозначает D-Ala;

А4 отсутствует или обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Pro, Asn, Gln, Trp, Tyr и Arg;

А5 обозначает D-Phe;

А6 обозначает Arg и

А7 обозначает Trp,

где любой аминокислотный остаток может находиться в L- или в D-конфигурации, если не указано иное.

2. Выделенный полипептид по п.1, где А4 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Pro, Asn, Gln, Trp, Tyr и Arg.

3. Полипептид по п.1 или 2, где А4 обозначает L-аминокислоту.

4. Полипептид по п.1 или 2, где А4 отсутствует.

5. Полипептид по п.1 или 2, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 2);

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 7);

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 8);

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Trp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 7),

или его фармацевтически приемлемая соль.

6. Полипептид по п.1 или 2, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

Ac-Arg-цикло[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 14)

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2 (SEQ ID NO: 17);

Ac-Arg-цикло[Pen-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2 (SEQ ID NO: 18),

или его фармацевтически приемлемая соль.

7. Полипептид по п.1 или 2, где А4 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из Pro, Asn и Gln.

8. Полипептид по п.7, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Trp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 9);

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 8);

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 7);

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Arg-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 38);

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Tyr-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 39);

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-D-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 40);

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 2),

или его фармацевтически приемлемая соль.

9. Полипептид по п.1 или 2, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

Ac-Arg-цикло[D-Pen-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2 (SEQ ID NO: 53);

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2 (SEQ ID NO: 17);

Ac-Arg-цикло[Pen-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2 (SEQ ID NO: 54);

Ac-Arg-цикло[D-hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 55),

или его фармацевтически приемлемая соль.

10. Полипептид по п.1 или 2, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 8) или

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 7),

или его фармацевтически приемлемая соль.

11. Полипептид по п.1 или 2, представленный одной из нижеследующих структурных формул:

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-OH (SEQ ID NO: 68) или

Ac-Arg-цикло[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-OH (SEQ ID NO: 69),

или его фармацевтически приемлемая соль.

12. Способ лечения расстройства, чувствительного к модуляции MC4R у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий в себя введение указанному индивидууму эффективного количества полипептида по п.1 или 2 или его фармацевтически приемлемой соли.

13. Способ по п.12, в котором расстройство, чувствительное к модуляции MC4R, представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2, ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром, мужскую эректильную дисфункцию, женское половое расстройство, неалкогольную жировую дистрофию печени или неалкогольный стеатогепатит.

14. Фармацевтическая композиция, модулирующая MC4R у индивидуума, содержащая эффективное количество полипептида по п.1 или 2 или его фармацевтически приемлемую соль, в фармацевтически приемлемом носителе.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области фармакологии. Предложены новые аналоги апелина и их терапевтическое применение.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены стабильный поперечно-сшитый p53 пептидомиметический макроцикл, способ его получения и его применение.

Изобретение относится к новым соединениям формулы I и их фармацевтически приемлемым солям, их способам получения ферментацией микроорганизма, принадлежащего видам Streptomyces (PM0626271/MTCC 5447), и к фармацевтическим композициям, содержащим одно или несколько соединений формулы I в качестве активного ингредиента.

Изобретение относится к RGD-содержащим циклическим пептидомиметикам; конъюгатам указанных пептидомиметиков и функциональной группы, выбранной из флуоресцентных зондов, фотосенсибилизаторов, хелатирующих агентов или цитотоксических агентов; и фармацевтическим композициям, содержащим эти конъюгаты.

Изобретение относится к соединениям формулы (I) и их фармацевтически приемлемым солям, которые применяют для изготовления лекарства для лечения или профилактики состояния, при котором полезно ингибирование карбоксипептидазы U.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептидным аналогам α-MSH и γ-MSH, чтоможет быть использовано в медицине. Пептидные аналоги содержат аминокислотную последовательность человеческого α-MSH или γ-MSH, или их вариантов, и имеют разветвленный аминокислотный зонд в N-концевой части пептида, используются в фармацевтических композициях для связывания и активации рецепторов меланокортина MC1r и/или MC3r.

Изобретение относится к стабильным пептидным аналогам альфа-меланоцитстимулирующего гормона (α-MSH), которые имеют сродство к рецептору меланокортина 1 (MC1R), фармацевтическим препаратам пептидных аналогов α-MSH, а также к способам применения этих аналогов для лечения заболеваний в медицине и в ветеринарии, связанных с MC1R.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, где X представляет собой СН; представляет собой L представляет собой связь; R представляет собой конденсированную циклическую группу, указанную в п.1 формулы изобретения, где каждая группа, представленная R, является независимо и необязательно замещенной одним, двумя, тремя, четырьмя или пятью R8; каждый R1 независимо представляет собой дейтерий, F, Cl, Br или I; R2 представляет собой C1-6 алкил или С3-6 циклоалкил; каждый R8 независимо представляет собой дейтерий, F, Cl, Br, I, -L1-C(=O)OR15, -L1-S(=O)tR16, -C(=O)N(R17)S(=O)2R16 или -C(=O)N(R17)-L3-S(=O)2OR15; каждый R15 независимо представляет собой Н, дейтерий или C1-6алкил; каждый R16 независимо представляет собой C1-6алкил; каждый R17 независимо представляет собой Н или дейтерий; каждый L1 независимо представляет собой связь или C1-6 алкилен; каждый L3 независимо представляет собой связь или С1-4 алкилен; n является 0, 1 или 2; каждый t независимо является 0, 1 или 2.

Изобретение относится к профилактике или лечению дисбиоза микробиоты у ребенка. Раскрыто применение Lactobacillus reuteri для профилактики или лечения дисбиоза микробиоты у ребенка в возрасте до примерно трех лет, который подвержен риску или страдает дисбиозом микробиоты, где введение L.

Изобретение относится к полипептидным соединениям, которые являются модуляторами рецептора меланокортина-4, а также к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения. Описанные здесь соединения представляют собой полипептиды структурной формулы или их фармацевтически приемлемые соли. Значения и предпочтительные значения переменных, присутствующих в структурной формуле, определены в формуле изобретения. Полипептиды могут быть использованы для лечения расстройств, чувствительных к модуляции MC4R, где расстройство представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2, ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром, мужскую эректильную дисфункцию, женское половое расстройство, неалкогольную жировую дистрофию печени или неалкогольный стеатогепатит. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

Наверх