Способ выделения и очистки нафтохиноновых противогрибковых антибиотиков астолидов а и в

Изобретение относится к способу получения антибиотиков. Противогрибковые антибиотики астолиды А и В экстрагируют из мицелия штамма Streptomyces hygroscopicus ВКПМ Ас2079. Способ включает экстракцию биомассы полярными органическими растворителями с ультразвуковой обработкой, а также хроматографическую процедуру разделения астолидов А и В с использованием обращенно-фазовых сорбентов. Способ позволяет повысить выход и чистоту астолидов А и В. 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и химии природных соединений, а именно к способу получения биологически активных веществ, обладающих антифунгальной активностью и цитотоксичностью.

Предшествующий уровень техники

Микроорганизмы обладают высочайшей способностью к развитию резистентности к антибиотикам, что преставляет растущую угрозу в современном здравоохранении. Особенную тревогу вызывают грибковые патогены, которые вызывают смертельные инвазивные микозы, способы лечения которых ограничены тремя известными классами антибиотиков. Эти классы включают азолы, которые игибируют биосинтез эргостерола, эхинокандины, ингибирующие биосинтез клеточной стенки, и мембрано-активные полиены [Revie, N.M.; Iyer, K.R.; Robbins, N.; Cowen, L.E. Antifungal drug resistance: evolution, mechanisms and impact. Current Opinion in Microbiology 2018, 45, 70-76], причем темп возникновения резистентности к этому ограниченному числу антифунгальных препаратов в последнее время принимет беспрецедентный масштаб [Fisher, М.С.; Hawkins, N.J.; Sanglard, D.; Gurr, S.J. Worldwide emergence of resistance to antifungal drugs challenges human health and food security. Science 2018, 360, 739]. Таким образом, поиск новых антифунгальных препаратов и разработка лекарственных средств на их основе является крайне актуальной задачей.

Ранее был обнаружен новый штамм-продуцент нафтохиноновых антибиотиков астолидов А и В, обладающих выраженной противогрибковой активностью в отношении широкого спектра грибов и дрожжей [Alferova, V.A.; Novikov, R.A.; Bychkova, О.P.; Rogozhin, E.A.; Shuvalov, M.V.; Prokhorenko, I.A.; Sadykova, V.S.; Kulko, A.B.; Dezhenkova, L.G.; Stepashkina, E.A.; et al. Astolides A and B, antifungal and cytotoxic naphthoquinone-derived polyol macrolactones from Streptomyces hygroscopicus. Tetrahedron 2018, 74, 7442-7449]. Также был разработан метод культивирования штамма и метод выделения индивидуальных антибиотиков астолидов А и В [Патент RU 2 681 828 С1].

Астолиды А, В имеют структуру, изображенную на формуле 1, и принадлежат к классу нафтохиноновых полиольных макролидов [Алферова, В.А.; Шувалов, М.В.; Коршун, В.А.; Тюрин, А.П. Нафтохиноновые полиольные макролиды из природных источников. Известия Академии Наук. Серия Химическая 2018, 5, 955-966.]. Широкий спектр биологической активности - антипролиферативная, антифунгальная, противопаразитарная, иммуносупрессорная - позволяет рассматривать нафтохиноновые полиольные макролиды как перспективную основу для разработки соответствующих лекарственных средств. Благодаря своим необычным биологическим свойствам и структурым особенностям, антибиотики этого структурного класса вызывают существенный интерес в последние годы [-Victoria, I.; Oves-Costales, D.; Lacret, R.; Martin, J.; -Hidalgo, M. et al. Structure elucidation and biosynthetic gene cluster analysis of caniferolides A-D, new bioactive glycosylated 36-membered polyol macrolides from the marine-derived Streptomyces caniferus CA-271066. Org. Biomol. Chem. 2019, 17, 2954-2971; Takeuchi, Т.; Hatano, M.; Umekita, M.; Hayashi, C.; Wada, S.; Nagayoshi, M.; Sawa, R.; Kubota, Y.; Kawada, M.; Igarashi, M.; et al. ATP Depletion Assay Led to the Isolation of New 36-Membered Polyol Macrolides Deplelides A and В from Streptomyces sp.MM581-NF15. Org. Lett. 2017, 19, 4207-1210].

Раскрытие изобретения

Сущность изобретения заключается в новом способе извлечения антифунгальных антибиотиков астолидов А и В из культуры штамма-продуцента, включающем отделение мицелия, экстракцию мицелия с обработкой ультразвуком, жидкостно-жидкостную экстракцию водной фазы и флеш-хроматографию на обращенно-фазовом сорбенте с дальнейшей препаративной хроматографией.

Найденный метод обеспечивает более полное выделение антибиотиков из культуры штамма-продуцента. Средняя эффективность нового метода составляет 60-90% (суммарный выход вещества при выделении по отношению к содержанию в культуре), что позволяет использовать его для работы с низкопродуктивными линиями штамма-продуцента и отходами производства. При этом эффективность ранее описанного метода выделения не превышала 25%, в том числе из-за того, что мицелий не обрабатывался. В примерах 1-2 приведены данные для линий со сниженной продуктивностью (менее 20 мг/л); в примере 3 - для линии с нормальной продуктивностью (20-40 мг/л). Во всех случаях описанный препаративный подход показал свою применимость и высокую эффективность. Также следует отметить более простое аппаратурное оформление данного метода в сравнении с ранее описанным: он не требует использования высокоэффективной жидкостной хроматографии на заключительном этапе очистки, а позволяет ограничиться изократическим элюированием при среднем давлении.

Осуществление изобретения

Пример 1. Выделение астолидов из культуральной жидкости штамма Streptomyces hygroscopicus 18 (ВКПМ Ас2079)

По ранее описанной методике было получено 0,7 л культуры продуцента. После центрифугирования (4000g, 10 мин) водную фазу декантировали и экстрагировали н-бутанолом (2×200 мл). Мицелий (36 г сырой биомассы) суспендировали в метаноле (150 мл) и озвучивали на ультразвуковой бане (40 кГц, 60 Вт, 30 мин при температуре 25°С). Метанольный экстракт декантировали, упаривали в вакууме с помощью роторного испарителя. Экстракт из водной фазы также упаривали досуха в вакууме. Температура бани при упаривании не должна превышать 50°С, в противном случае наблюдается деградация антибиотика. Массы после упаривания: бутанольный экстракт - 0,44 г, спиртовой экстракт - 0,51 г.

Объединенные экстракты растворяли в минимальном количестве метанола и наносили на октадецил-силикагель (использовался сорбент Macherey-Nagel POLYGOPREP 100-50С18, колонка с внутр. диаметром 4 см, высота слоя сорбента 4 см) «сухим» способом: сорбент (10-15% общего количества) добавляли небольшими порциями к метанольному раствору, при перемешивании, затем полученную взвесь высушивали в вакууме роторного испарителя и наносили остаток ровным слоем на верх хроматографической колонки. Элюировали смесью ацетонитрила с водой (по 200 мл, содержащих 30, 45 и 60% ацетонитрила). Активные вещества содержались только во фракции с 60% ацетонитрила. Данную фракцию упаривали в вакууме до удаления ацетонитрила (темп, бани не выше 35°С), полученный водный раствор замораживали и лиофильно высушивали в вакууме.

Полученный концентрат массой 28 мг растворяли в 1 мл 50% ацетонитрила и хроматографировали на препаративной колонке Waters ХВridge Prep C18 5 μm OBD 19×150 мм, детекция по поглощению при 250 нм, элюент - 45% ацетонитрил в воде (изократическое элюирование), скорость потока - 6 мл/мин. Фракции, содержащие чистые астолиды А и Б, собирали отдельно, упаривали в вакууме до удаления ацетонитрила (темп, бани не выше 35°С), остаток замораживали и лиофильно высушивали. В результате получали 7,1 мг астолида А (чистота 98,5%), и 7.0 мг астолида Б (чистота 99,0%).

Пример 2. Выделение астолидов из культуральной жидкости штамма Streptomyces hygroscopicus 18 (ВКПМ Ас2079)

По ранее описанной методике было получено 1,0 л культуры продуцента. После центрифугирования (4000 g, 10 мин) водную фазу декантировали и экстрагировали изо-бутанолом (2×250 мл). Мицелий (45 г сырой биомассы) суспендировали в этаноле (200 мл) и озвучивали на ультразвуковой бане (40 кГц, 60 Вт, 30 мин при температуре 22°С). Этанольный экстракт декантировали с мицелия, упаривали в вакууме роторного испарителя. Экстракт из водной фазы также упаривали досуха в вакууме (температура бани при упаривании не должна превышать 50°С). Массы после упаривания: бутанольный экстракт - 0,81 г, спиртовой экстракт - 0,92 г.

Объединенные экстракты растворяли в минимальном количестве метанола и наносили на октадецил-силикагель (использовался сорбент Quingdao Hi-Tech BANGKAI 100А 40-60 мкм C18, колонка с внутр. диаметром 5 см, высота слоя сорбента 4 см) «сухим» способом как описано в Примере 1. Элюировали смесью ацетонитрила с водой (по 200 мл, содержащих 30, 45 и 60% ацетонитрила). Активные вещества содержались только во фракции с 60% ацетонитрила. Данную фракцию упаривали в вакууме до удаления ацетонитрила (темп, бани не выше 35°С), остаток замораживали и лиофилизовали.

Полученный концентрат массой 33 мг растворяли в 1 мл 50% ацетонитрила и хроматографировали на препаративной колонке Waters ХВ ridge Prep C18 5 μm OBD 19×150 мм, детекция по поглощению при 250 нм, элюент - 45% ацетонитрил в воде (изократическое элюирование), скорость потока - 6 мл/мин. Фракции, содержащие чистые астолиды А и Б, собирали отдельно, упаривали в вакууме до удаления ацетонитрила (темп, бани не выше 35°С), остаток замораживали и лиофилизовали. В результате получали 9,6 мг астолида А (чистота 98,7%), и 7,6 мг астолида Б (чистота 99,3%).

Пример 3. Выделение астолидов из культуральной жидкости штамма Streptomyces hygroscopicus 18 (ВКПМ Ас2079)

По ранее описанной методике было получено 1,1 л культуры продуцента. После центрифугирования (4000 g, 10 мин) водную фазу декантировали и экстрагировали н-бутанолом (2×250 мл). Мицелий (42 г сырой биомассы) суспендировали в этаноле (200 мл) и озвучивали на ультразвуковой бане (40 кГц, 60 Вт, 30 мин при температуре 24°С). При меньшем времени экстракции наблюдается заниженный выход антибиотика. Этанольный экстракт декантировали с мицелия, упаривали в вакууме роторного испарителя. Экстракт из водной фазы также упаривали досуха в вакууме. Температура бани при упаривании не должна превышать 50°С. Массы после упаривания: бутанольный экстракт - 0,77 г, спиртовой экстракт - 1,08 г.

Объединенные экстракты растворяли в минимальном количестве метанола и наносили на метилированный силикагель (использовался сорбент Merck Silanized silica С2 40-60 мкм, колонка с внутр. диаметром 5 см, длина слоя сорбента 4 см) «сухим» способом. Элюировали смесью ацетонитрила с водой (по 200 мл, содержащих 20, 35 и 50% ацетонитрила). Фракцию с 50% ацетонитрила упаривали в вакууме до удаления ацетонитрила (темп, бани не выше 35°С), остаток замораживали и лиофилизовали.

Полученный концентрат массой 56 мг растворяли в 2 мл 50% ацетонитрила и хроматографировали на препаративной колонке Waters XBridge Prep C18 5 μm OBD 19×150 мм, детекция при 250 нм, элюент - 42% ацетонитрил в воде (изократическое элюирование), скорость потока - 6 мл/мин. Фракции, содержащие чистые астолиды А и Б, собирали отдельно, упаривали в вакууме до удаления ацетонитрила (темп, бани не выше 35°С), остаток замораживали и лиофилизовали. В результате получено 9,8 мг астолида А (чистота 98,5%), и 20,4 мг астолида Б (чистота 99,5%).

Промышленная применимость

Изобретение может быть использовано для выделения астолидов А и В для применения в медицине и ветеринарии, в качестве лекарственного средства, а также в научно-исследовательских лабораториях.

Способ выделения и очистки нафтохиноновых противогрибковых антибиотиков астолидов А и В, отличающийся дополнительной экстракцией полярными органическими растворителями с ультразвуковой обработкой из мицелия штамма S. hygroscopicus ВКПМ Ас2079 сырца антибиотиков астолидов А и В, обогащением сырца антибиотиков астолидов А и В с помощью флеш-хроматографии на обращенно-фазовом сорбенте, разделением обогащенного сырца антибиотиков на индивидуальные антибиотики астолиды А и В путем препаративной хроматографии на обращенно-фазовой колонке при среднем давлении до 50 бар в изократических условиях.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Amycolatopsis rifamycinica, обладающий способностью продуцировать тетраценомицин Х, депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2086.

Группа изобретений относится к применению штамма Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 в комбинации со штаммом Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 для изготовления состава для улучшения качества спермы у субъекта, а также составу, содержащему указанные штаммы.
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и касается клеточной линии карциномы легких мыши СРХ-1, предназначенной для разработки вакцины. Опухолевая линия СРХ-1 возникла спонтанным мутированием из карциномы легких Льюиса (LLC) мышей в процессе длительного пересева.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены штаммы споробразующих бактерий-антагонистов с антифузариозной активностью (варианты), биопрепарат для защиты сельскохозяйственных культур от фузариоза, способ изготовления биопрепарата и способ защиты сельскохозяйственных культур от фузариоза.

Изобретение относится к штамму бактерий Bacillus cereus, предназначенному для получения пробиотического препарата. Штамм бактерий Bacillus cereus (DPRK-17) депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) под номером RCAM04578.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079. Питательная среда для культивирования бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 содержит пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, горох шлифованный, предварительно обработанный автоклавированием, карбонат кальция, фосфат калия и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штаммы Lactobacillus reuteri CECT-8605 и Bifidobacterium breve CECT 8606, обладающие способностью поглощать холестерин; композиция, фармацевтический продукт, корм или продукт питания, содержащие указанные штаммы; способ получения пробиотических штаммов с повышенной способностью поглощать холестерин, включающий этап инактивации клеток или этап культивирования клеток при рН от 6 до 9, и способ получения микроорганизма с повышенной способностью поглощать холестерин, включающий приведение Bifidobacterium breve CECT 8606 в контакт c белковым экстрактом из Lactobacillus reuteri CECT-8605.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены матрица, содержащая жизнеспособные непатогенные Escherichia coli, и способ получения матрицы.

Изобретение относится к штамму Lactobacillus salivarius CJLS1511, к кормовой добавке для домашних животных, содержащей указанный микроорганизм или его инактивированные бактериальные клетки, корму для домашних животных, содержащему указанную кормовую добавку, и к способу получения инактивированных бактериальных клеток указанного штамма.

Группа изобретений относится к фармацевтической микробиологии, в частности, к количественному определению стрептомицина и гентамицина в лекарственных средствах. Предложен способ количественного определения гентамицина и стрептомицина в лекарственных средствах турбидиметрическим методом и жидкая питательная среда для культивирования микроорганизмов при количественном определении гентамицина и стрептомицина в лекарственных средствах.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Amycolatopsis rifamycinica, обладающий способностью продуцировать тетраценомицин Х, депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2086.

Изобретение относится к способу получения антибиотиков. Противогрибковые антибиотики астолиды А и В экстрагируют из мицелия штамма Streptomyces hygroscopicus ВКПМ Ас2079. Способ включает экстракцию биомассы полярными органическими растворителями с ультразвуковой обработкой, а также хроматографическую процедуру разделения астолидов А и В с использованием обращенно-фазовых сорбентов. Способ позволяет повысить выход и чистоту астолидов А и В. 3 пр.

Наверх