Способ получения низкомолекулярного гепарина

Изобретение относится к технологии получения низкомолекулярного гепарина щелочной деполимеризацией бензилового эфира высокомолекулярного гепарина натрия. Предложенный способ предусматривает получение бензетониевой соли гепарина взаимодействием высокомолекулярного гепарина с бензетония хлоридом с образованием гепарината бензетония. Затем отмывают гепаринат бензетония от избытка непрореагировавшего бензетония хлорида многократной дробной экстрацией последнего водой очищенной с промежуточной фильтрацией водой на воронке Бюхнера с бумажным фильтром или без промежуточного выделения продукта фильтрацией на воронке с применением лабораторного устройства для отмывки порошковых продуктов химических реакций от примесей. Проводят этерификацию полученного гепарината бензетония бензилированием в апротонном растворителе и получают сложный бензиловый эфир гепарина в две стадии: получение неполного бензилового эфира гепарина взаимодействием с 16-17 вес.% раствором ацетата натрия в метаноле и осаждение продукта насыщенным раствором ацетата натрия в метаноле. После проводят деструкциию макромолекулы гепарина щелочной деполимеризацией и формирование восстанавливающих и невосстанавливающих концевых групп гидролизованых фрагментов гепарина взаимодействием с сильным восстановителем. Изобретение направлено на улучшение качества за счет снижения содержания примесей в готовом продукте, увеличение выхода и снижение трудоемкости производства в сравнении с аналогом. 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к технологии получения фармацевтической субстанции низкомолекулярного гепарина (НМГ) щелочной деполимеризацией бензилового эфира коммерческого высокомолекулярного гепарина натрия.

Уровень техники

Гепарин - органопрепарат, получаемый из легких или мукозы - слизистой оболочки крупного рогатого скота или свиней. Он является прямым антикоагулянтом и используется для приготовления лекарственных форм, применяемых для профилактики и терапии тромбоэмболических заболеваний, тромбообразования при операциях на сердце и кровеносных сосудах, при остром инфаркте миокарда, а также для поддержания жидкого состояния крови в аппаратах искусственного кровообращения и гемодиализа.

Коммерческий нефракционированный гепарин (НФГ) представляет собой смесь сульфатированных полисахаридов различной структуры с молекулярной массой от 3000 до 30000 Да (фиг. 1). От длины молекулы гепарина и величины ее заряда зависит фармакокинетика и фармакодинамика лекарственного препарата, а также способность гепарина взаимодействовать с белками крови и клетками организма [Кедик С.А. и др. Методы синтеза и свойства низкомолекулярных гепаринов / Биофармацевтический Журнал, 2018, Т. 10, №2, с. 10-22].

Наряду с несомненными достоинствами препараты НФГ обладают серьезными недостатками, такими как: риск возникновения геморрогических кровотечений, аллергических реакций, обострения остеопороза, необходимостью повторных инъекций и др. [Лукашин Б.П. и др. Гепарин и гепариноиды: источники получения, структура и биологические эффекты / Вестник Российской военно-медицинской академии, 2007, №4(20), с. 141-147]. Таких недостатков лишены разработанные в последние годы препараты на основе субстанций низкомолекулярных гепаринов (НМГ), среди которых наиболее востребованы препараты на основе субстанций дальтепарина (фрагмин), эноксапарина (клексан) и надропарина кальция (фраксипарин), основные характеристики которых приведены ниже.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения низкомолекулярного гепарина, раскрытый в документе [патент RU2670767 С9, опубликован 25.10.2018], включающий, в частности:

- на стадии получения гепарината бензетония проводят многократную промывку гепарината бензетония от избытка бензетония хлорида, которая сопровождается многократной фильтрацией целевого продукта на воронке Бюхнера с бумажным фильтром;

- стадию синтеза бензилового эфира гепарина проводят в две последовательные стадии осаждения бензилового эфира гепарината бензетония (БЭГБ) с фильтрацией на воронке Бюхнера и получением неполного бензилового эфира гепарина взаимодействием БЭГБ с насыщенным раствором ацетата натрия в метаноле.

Среди недостатков этого способа следует отметить то, что многократная отмывка гепарината бензетония с промежуточной фильтрацией и перезагрузкой влажного осадка для проведения следующей операции приводит к существенной потере целевого продукта. То же необходимо отметить и при проведении стадии бензелирования гепарината бензетония.

Другим существенным недостатком этого способа является то, что продукт, получаемый на стадии бензелирования, содержит большое количество примесей ацетата бензетония и ацетата натрия, что значительно осложняет проведение последующих процессов и приводит к потере целевого продукта.

Раскрытие сущности изобретения

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в преодолении недостатков ближайшего аналога.

Технический результат заключается в снижении содержания примесей в готовом продукте, увеличении выхода полупродуктов на отдельных стадиях производства и снижении трудоемкости производства.

Техническая задача решается и технический результат достигается способом получения низкомолекулярного гепарина, включающим стадии, в соответствии с которыми:

(а) получают бензетониевую соль гепарина взаимодействием высокомолекулярного гепарина с бензетония хлоридом с образованием гепарината бензетония,

(б) отмывают гепаринат бензетония от избытка непрореагировавшего бензетония хлорида многократной дробной экстрацией последнего водой очищенной с промежуточной фильтрацией водой на воронке Бюхнера с бумажным фильтром или без промежуточного выделения продукта фильтрацией на воронке с применением лабораторного устройства для отмывки порошковых продуктов химических реакций от примесей,

(в) проводят этерификацию полученного гепарината бензетония бензилированием в апротонном растворителе,

(г) получают сложный бензиловый эфир гепарина в две стадии: получение неполного бензилового эфира гепарина взаимодействием с 16-17 вес. % раствором ацетата натрия в метаноле и осаждение продукта насыщенным раствором ацетата натрия в метаноле,

(д) проводят деструкцию макромолекулы гепарина щелочной деполимеризацией и

(е) формируют восстанавливающие и невосстанавливающие концевые группы гидролизованых фрагментов гепарина взаимодействием с сильным восстановителем.

В одном из вариантов осуществления способа на стадии получения неполного бензилового эфира гепарина бензилированием гепарината бензетония с последующим взаимодействием с насыщенным раствором ацетата натрия в метаноле проводят без промежуточного осаждения бензилового эфира гепарината бензетония.

В еще одном варианте осуществления способа полученный неполный бензиловый эфир гепарина очищают от примесей ацетата натрия и бензетония хлорида экстракцией метанолом в экстракторе Сокслета.

И в еще одном варианте осуществления способа реакцию восстановления концевых групп гидролизованых фрагментов гепарина проводят взаимодействием с сильным восстановителем в присутствии активного адсорбента и сильного электролита.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана химическая структура фрагмента макромолекулы гепарина.

На фиг. 2 показана схема реакции получения гепарината бензетония (установление защиты сульфогрупп).

На фиг. 3 показана схема реакции бензелирования гепарината бензетония.

На фиг. 4 показана схема реакции снятия бензетониевой защиты сульфогрупп.

На фиг. 5 показана схема реакции щелочного гидролиза.

Осуществление изобретения

Представленные далее примеры демонстрируют возможность осуществления изобретения с достижением технического результата. Данные примеры носят иллюстрирующий характер и никоим образом не должны ограничивать заявленный объем притязаний.

Пример 1. Получение гепарината бензетония (ГБ). Схема реакции приведена на фиг. 2.

В стакане вместимостью 250 мл, помещенном на регулируемую нагревательную плитку с приводом магнитной мешалки, наливают 65±0,5 мл 0,2М раствора натрия хлорида и прибавляют 5,0 г коммерческого высокомолекулярного гепарина (ММ_ср=15000 Да). Температуру повышают до 35-40°С и производят растворение в течение 35-45 мин. После полного растворения гепарина устанавливают рН=8,5±0,1.

В другом стакане готовят раствор 9,15 г бензетония хлорида в 60±0,5 мл воды очищенной при комнатной температуре при перемешивании, избегая вспенивания раствора. После полного растворения устанавливают рН=5,8±0,5. Раствор помещают в капельную воронку. Температуру в стакане с раствором гепарина повышают до 60±1°С и к нему при перемешивании прикапывают раствор бензетония хлорида в течение 30-45 мин. Реакцию продолжают еще 50-60 мин.

Образовавшуюся суспензию количественно переносят в воронку Шотта вместимостью 150 мл, помещенную в ультразвуковую ванну лабораторного устройства для отмывки порошковых продуктов химических реакций от посторонних примесей (ЛУУЗ) [патент RU 186728 U1, опубликован 30.01.2019], и производят озвучивание при температуре 50-55°С в течение 15-20 мин. После окончания процесса раствор отсасывают в приемную колбу и в нем определяют содержание бензетония хлорида по калибровочному графику. Для последующих промывок в воронку Шотта устройства с осадком наливают по 50 мл воды очищенной и процесс повторяют. Отмывку продолжают до остаточного содержания отмываемого бензетония хлорида в промывной воде менее 7 мг/мл (табл. 2).

В результате отмывки получают 20,9 г влажного продукта, который выгружают в чашку Петри и высушивают в лиофильной сушилке (Иней-6, ФГБУН ИБП РАН). Выход гепарината бензетония (ГБ) с влагосодержанием 7,0% составляет 15,5 г.

Пример 2.

2.1. Бензилирование гепарината бензетония

Схема реакции приведена на фиг. 3.

В двугорлую колбу вместимостью 500 мл, помещенную в водяную баню на платформе регулируемой нагревательной плитки с приводом магнитной мешалки, наливают 75 мл N,N-диметилформамида и загружают туда 15,5 г гепарината бензетония, полученного на предыдущей стадии (в примере 1). Горло заглушают притертой пробкой. Устанавливают температуру 37±1°С и перемешивают содержимое до полного растворения ГБ. В другом горле устанавливают капельную воронку, в которую наливают 86 мл бензилхлорида (БХ) и после полного растворения ГБ прикапывают БХ в течение 30-45 мин. Реакцию продолжают при комнатной температуре 12 ч. После окончания реакции содержимое реактора охлаждают до комнатной температуры и проводят реакцию снятия бензетониевой защиты сульфгрупп. Для этого к полученному прозрачному раствору прикапывают при перемешивании два объема насыщенного 16,5 вес. %-ного раствора ацетата натрия в метаноле (16,5 г ацетата натрия/100 г метанола) при интенсивном перемешивании. Полученную суспензию перемешивают 2 ч и осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера. Осадок влажным передают на стадию очистки от ацетата бензетония и избытка ацетета натрия. Количество осадка, содержащего неполный бензиловый эфир высокомолекулярного гепарина и примеси ацетата бенетония и ацетата натрия, составляет 21±3 г.

2.2. Очистка бензилового эфира гепарина от примесей.

Схема получения гепарината бензетония приведена на фиг. 4.

Очистку неполного бензилового эфира от избытка ацетата натрия и ацетата бензетония проводят экстракцией примесей в экстракторе Сокслета. В патрон аппарата помещают осадок с предыдущей стадии, а в куб экстрактора наливают 250 мл сухого метанола, включают обогрев и производят экстракцию ацетата бензетония и натрия ацетата, периодически отбирая пробы экстракта для определения содержания ацетата натрия в экстракте. Процесс экстракции заканчивают при остаточном содержании натрия ацетата в экстракте менее 0,7 мг/мл.

Очищенный от примесей порошок высушивают в вакууме при давлении 0,09±0,05 МРа и температуре 30±3°С. Выход сухого неполного бензилового эфира гепарина составляет 6,27 г.

Пример 3. Гидролиз неполного бензилового эфира гепарина.

Схема реакции гидролиза приведена на фиг. 5.

В стакан вместимостью 250 мл, помещенный на платформу магнитной мешалки, наливают 100 мл воды очищенной и загружают туда 6,27 г неполного бензилового эфира гепарина. В стакан помещают якорь магнитной мешалки и производят растворение порошка при перемешивании и температуре 35±5°С.После полного растворения порошка температуру раствора повышают до 60±2°С и устанавливают рН=11-11,5 свежеприготовленным 0,5М раствором NaOH. В раствор добавляют 3 г подготовленного фильтрперлита (ГОСТ 30566) и 350 мг NaCl и с помощью капельной воронки прикапывают 18-20 мл свежеприготовленного 1М раствора NaOH, поддерживая рН на уровне 11-11,5. Реакцию гидролиза продолжают 45 мин после чего устанавливают рН=6±0,2 10%-ной HCl. Полученную суспензию отфильтровывают на воронке Бюхнера с фильтром «белая лента». Прозрачный фильтрат охлаждают в холодильнике до температуры ниже 10°С и осаждают двумя объемами холодного метанола. Полученную суспензию оставляют для созревания на 5-10 ч. Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера с фильтром «белая лента» и высушивают в вакууме при температуре 40°С до постоянного веса. Выход продукта составляет 4,8 г.

Пример 4. Боргидрирование сырца низкомолекулярного гепарина натрия.

В стакан вместимостью 100 мл, снабженный мешалкой, наливают 50 мл воды очищенной и при перемешивании прибавляют 4,8 г продукта, полученного в примере 3. После полного растворения порошка устанавливают рН=7,6±0,2, и прибавляют 0,80 г боргидрида натрия. Реакцию продолжают в течение 50-60 мин. По окончании реакции устанавливают рН=4,0±0,2 добавлением 10 вес. %-ной соляной кислоты при перемешивании в течение 10 мин, после чего добавлением 1М раствора гидроксида натрия устанавливают рН=6,0±0,2. Полученный раствор фильтруют через мембрану с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат охлаждают до температуры 0-4°С в течение 30-60 мин. Охлажденный фильтрат помещают в стакан вместимостью 200 мл и осаждают продукт охлажденным метанолом (150-200 мл). Раствор помещают в холодильник и оставляют для созревания осадка на 3 ч. Надосадочную жидкость декантируют, и образовавшийся осадок дважды промывают по 30 мл этанола для отмывки его от примеси метанола. Осадок отделяют на воронке Бюхнера и высушивают в вакууме при температуре 35±2°С до постоянной массы. Выход продукта составляет 4,6 г.

В таблице 3 приведены результаты анализа полученного образца, выполненные согласно методикам, описанным в ГФ XIV 2018 г. [XIV издание Государственной фармакопеи Российской Федерации, Т.1 (2018)].

Таким образом, предложенный в настоящем изобретении способ позволяет увеличить выход готового продукта (до 15-20%) за счет сокращения потерь при выделении и очистке промежуточных продуктов от посторонних примесей, а также улучшить качество и значительно сократить трудоемкость процесса.

1. Способ получения низкомолекулярного гепарина, отличающийся тем, что включает следующие стадии, в соответствии с которыми:

(а) получают бензетониевую соль гепарина взаимодействием высокомолекулярного гепарина с бензетония хлоридом с образованием гепарината бензетония,

(б) отмывают гепаринат бензетония от избытка непрореагировавшего бензетония хлорида многократной дробной экстрацией последнего водой очищенной с промежуточной фильтрацией водой на воронке Бюхнера с бумажным фильтром или без промежуточного выделения продукта фильтрацией на воронке с применением лабораторного устройства для отмывки порошковых продуктов химических реакций от примесей,

(в) проводят этерификацию полученного гепарината бензетония бензилированием в апротонном растворителе,

(г) получают сложный бензиловый эфир гепарина в две стадии: получение неполного бензилового эфира гепарина взаимодействием с 16-17 вес.% раствором ацетата натрия в метаноле и осаждение продукта насыщенным раствором ацетата натрия в метаноле,

(д) проводят деструкцию макромолекулы гепарина щелочной деполимеризацией и

(е) формируют восстанавливающие и невосстанавливающие концевые группы гидролизованных фрагментов гепарина взаимодействием с сильным восстановителем.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии получения неполного бензилового эфира гепарина бензилированием гепарината бензетония с последующим взаимодействием с насыщенным раствором ацетата натрия в метаноле проводят без промежуточного осаждения бензилового эфира гепарината бензетония.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученный неполный бензиловый эфир гепарина очищают от примесей ацетата натрия и бензетония хлорида экстракцией метанолом в экстракторе Сокслета.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию восстановления концевых групп гидролизованных фрагментов гепарина проводят взаимодействием с сильным восстановителем в присутствии активного адсорбента и сильного электролита.