Гальванически функционализированные сенсоры

Авторы патента:


Гальванически функционализированные сенсоры
Гальванически функционализированные сенсоры

Владельцы патента RU 2725803:

Ф. ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH)

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен биосенсор и способ определения аналита, а также способ изготовления биосенсора. Биосенсор содержит подложку, рабочий электрод с находящейся в проводящем контакте с медиаторным слоем электропроводящей площадкой и находящийся в диффузионном контакте с медиаторным слоем и содержащий оксидазу ферментный слой. Причем медиаторный слой получен электроосаждением, включает содержащий MnO2 электрокаталитический агент. Способ изготовления включает электроосаждение на часть проводящей площадки содержащего электрокаталитический агент медиаторного слоя и осаждение содержащего оксидазу ферментного слоя на часть медиаторного слоя. Способ определения аналита включает введение пробы в контакт с ферментным слоем биосенсора, замыкание содержащей рабочий электрод, медиаторный слой и противоэлектрод электрической цепи, приложение напряжения к замкнутой электрической цепи, измерение протекающего тока и определение аналита в пробе. Изобретения обеспечивают получение прочно соединенного медиаторного слоя с нижележащей поверхностью, отсутствие связанных с нанесением указанного слоя методом сеткографии технических сложностей, получение низких нулевых токов, а также возможность точно задать размер рабочего электрода и количества осажденного медиатора. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

 

Настоящее изобретение относится к биосенсору для определения аналита, содержащему подложку, рабочий электрод, имеющий электропроводящую площадку, находящуюся в проводящем контакте с медиаторным слоем, и ферментный слой, содержащий оксидазу и находящийся в диффузионном контакте с медиаторным слоем, причем медиаторный слой получен электроосаждением и содержит электрокаталитический агент, в частности состоит из него. Настоящее изобретение также относится к способу изготовления биосенсора, включающему обеспечение подложки, имеющей по меньшей мере одну проводящую площадку, электроосаждение по меньшей мере на часть проводящей площадки медиаторного слоя, содержащего электрокаталитический агент, в частности состоящего из него, и осаждение ферментного слоя по меньшей мере на часть медиаторного слоя. Кроме того, настоящее изобретение относится к применениям и способам, относящимся к предлагаемому биосенсору.

Определение концентрации одного или нескольких аналитов, таких как глюкоза, в одной или нескольких физиологических жидкостях (жидкостях организма), таких как интерстициальная жидкость и/или кровь, является важной составной частью лечения и/или профилактики многих заболеваний. В частности, определение концентрации глюкозы в крови, а также соответствующее лечение является значимой частью распорядка дня для многих диабетиков. Из уровня техники известно, что для повышения удобства управления диабетом и во избежание чрезмерных ограничений в повседневной жизни существуют портативные устройства, предназначенные, например, для измерения концентрации глюкозы в крови во время работы, досуга или других видов деятельности вдали от дома. В частности, известны электрохимические методы измерения с использованием сенсоров, полностью или частично имплантируемых в ткань организма пользователя и способных обеспечивать непрерывные или периодические измерения концентрации аналита. Примеры такого рода имплантируемых сенсорных элементов раскрыты в публикациях WO 2007/071562 Al, US 2011/0021889 Al, US 2010/0230285 Al, WO 2005/078424 A1 или в международной заявке PCT/EP2011/072732.

Тест-элементы для электрохимического определения концентрации по меньшей мере одного аналита в физиологической жидкости, например для определения концентрации глюкозы в крови и/или интерстициальной жидкости, обычно содержат по меньшей мере один рабочий (индикаторный) электрод, а также по меньшей мере один противоэлектрод. Кроме того, сенсорный элемент при необходимости (т.е. факультативно) может содержать по меньшей мере один электрод сравнения (опорный электрод). Вместе с тем, в альтернативных вариантах исполнения электрод сравнения может не использоваться и/или может быть совмещен с противоэлектродом. В отношении возможных электродных материалов, используемых как для рабочего электрода, так и для противоэлектрода, а также в отношении возможных электрохимических измерительных схем для определения концентрации аналита с применением соответствующих амперометрических систем можно обратиться к публикации WO 2007/071562 A1. Вместе с тем, возможны и другие типы измерительных схем, позволяющих определять концентрацию аналита по результату сравнения потенциалов электродов.

В типичных конструкциях электрохимических сенсоров противоэлектрод предусмотрен для замыкания электрической цепи на рабочий электрод. Для этого, как правило, используются, токи окислительно-восстановительных реакций (редокс-токи) и/или - в меньшей степени - емкостные зарядные токи. Рабочий электрод обычно содержит по меньшей мере одно индикаторное вещество, способное вступать в реакцию окисления или реакцию восстановления с аналитом. Во многих случаях индикаторное вещество содержит по меньшей мере один фермент, такой как глюкозооксидаза (GOD). В случае если аналитическая реакция включает реакцию окисления на рабочем электроде, противоэлектрод, как правило, обеспечивает протекание реакции восстановления для замыкания электрической цепи. Эффективное окисление или восстановление аналита может требовать высокого сверхпотенциала, что несет с собой опасность возникновения нежелательных побочных реакций. Соответственно, в архитектуру рабочих электродов обычно включают катализаторы (медиаторы), которыми могут быть, в принципе, биологические катализаторы (ферменты) или неорганические катализаторы. Например, в качестве электрокатализатора для окисления пероксидов, в частности пероксида водорода (H2O2), нашел применение диоксид марганца (MnO2). Кроме того, для повышения уровня сигнала предпринимались попытки увеличения поверхности электрода, например путем электроосаждения нескольких слоев металла, как предлагается в публикации US 2007/227907 A1.

Из уровня техники известны различные электродные схемы. Так, в публикации US 2009/0198117 A1 раскрыто имплантируемое в организм млекопитающего сенсорное устройство для определения аналита. Сенсорное устройство содержит базовый слой, проводящий слой, расположенный на базовом слое, воспринимающий аналит слой и модулирующий аналит слой, расположенный на воспринимающем аналит слое. Проводящий слой содержит рабочий электрод, включающий в себя множество проводящих нанотрубок. Воспринимающий аналит слой содержит оксидоредуктазу, расположенную на проводящих нанотрубках. Оксидоредуктаза генерирует пероксид водорода в присутствии определяемого аналита. Модулирующий аналит слой модулирует диффузию аналита через него.

Как упоминалось выше, известно несколько комбинаций электродов. Так, в трехэлектродных схемах, помимо рабочего электрода и противоэлектрода, предусмотрен по меньшей мере один электрод сравнения, независимый от противоэлектрода. Потенциал противоэлектрода в этом случае обычно может регулироваться независимо от потенциала электрода сравнения. Как подробнее поясняется в WO 2007/071562 A1, может быть предусмотрен потенциостатический контроллер, который, с одной стороны, обеспечивает требуемую разность потенциалов или напряжение между рабочим электродом и электродом сравнения, а с другой стороны, выполнен так, чтобы ток, аналитической реакции, протекающей на рабочем электроде, балансировался соответствующим обратным процессом на противоэлектроде, чем замыкается электрическая цепь. Для второй задачи противоэлектрод должен быть настроен на потенциал, при котором в результате соответствующей электродной реакции на противоэлектроде генерируется соответствующий и необходимый ток.

Таким образом, процесс, происходящий на противоэлектроде, можно сравнить с процессом гальваностатической потенциометрии. Противоэлектрод в общем случае достигает потенциала, при котором окислительно-восстановительный процесс генерирует требуемый ток. В случае если этот окислительно-восстановительный процесс одной окислительно-восстановительной системы недостаточен для выработки подходящего тока, участвующие в реакции вещества сократятся, и противоэлектрод будет переходить на потенциал следующей окислительно-восстановительной реакции, пока сумма всех парциальных токов не станет достаточной для генерирования подходящего обратного тока для балансирования аналитической реакции на рабочем электроде.

Потенциал противоэлектрода, а также электродные реакции на противоэлектроде, как правило, зависят от множества факторов. Так, влияние оказывает поверхность самого противоэлектрода, например площадь этой поверхности, шероховатость электрода и/или другие свойства поверхности. Далее, присутствие окислительно-восстановительных веществ и соответствующий сверхпотенциал на противоэлектроде будет влиять на вышеупомянутые свойства противоэлектрода, а также концентрацию окислительно-восстановительных веществ и окислительно-восстановительный потенциал и сверхнапряжение процесса.

В частном случае сенсоров для непрерывного мониторирования аналита in vivo (в живом организме) эти сенсоры обычно окружены кровью и/или интерстициальной жидкостью. Как упоминалось выше, в большинстве известных биосенсоров используются протекающие на рабочем электроде аналитические окислительные реакции, в которых окисляется аналит, такой как глюкоза. В качестве примера, глюкоза окисляется под воздействием ферментов с образованием восстановленных побочных продуктов, таких как H2O2. Поскольку большинство составных частей крови и интерстициальной жидкости присутствуют в восстановленной форме, число веществ, способных к восстановлению при типичных измерениях in vivo, ограничено. В качестве примеров можно привести следующие способные к восстановлению вещества, указанные в порядке их соответствующих окислительно-восстановительных потенциалов: кислород, H2O2, H2O. Количество кислорода, как правило, довольно ограничено, в частности при измерениях in vivo, особенно в интерстициальной жидкости. За счет капсулирования сенсорного элемента, имплантированного в ткань организма, доставка кислорода к рабочему электроду с течением времени может уменьшиться еще сильнее. В результате электродной реакции, такой как восстановление O2 и/или ферментативная реакция, может генерироваться H2O2. H2O обычно широко доступна при высоких концентрациях. Однако использование воды в качестве восстанавливаемого вещества обычно предполагает образование газообразного H2. Такое газообразование может приводить к уменьшению смачивающей способности электрода, что обычно усиливает вышеупомянутые эффекты. Кроме того, образование газа может приводить к отрыву мембраны, обычно покрывающей рабочий электрод, и даже может приводить к полному отделению мембраны и/или электрода.

Как правило, сенсоры, используемые in vivo, изготавливают, используя подложку, содержащую подходящие электрические выводы для образования необходимых электродов, и нанося на подложку методом сеткографии пасту, содержащую эталонный состав для электрода сравнения, и пасту, содержащую реакционный состав для рабочего электрода, в рамках двух отдельных процессов, например сеткографических процессов, см., например, публикацию US 2004/007461 A1. Эта процедура требует трудоемкого контроля качества реагентов и их смесей. Кроме того, сеткографические процессы требуют применения нескольких этапов сушки и сами по себе ненадежны в том отношении, что могут приводить к получению сенсоров, которые снабжены печатным слоем не полностью или от которых часть нанесенного слоя отслаивается, в частности при использовании гибкой подложки. Кроме того, сеткографический процесс требует присутствия растворителей, следовые количества которых после сушки могут оставаться и вносить искажения в результаты измерения. В частности, такой часто используемый растворитель, как монобутиловый эфир диэтиленгликоля (DEGMBE), трудно удалить полностью, и во время изготовления он может окисляться в перекисное соединение, обычно создающее помехи в работе сенсоров, предназначенных для обнаружения пероксидов, например сенсоров глюкозы с применением состава на основе глюкозооксидазы/H2О2. Кроме того, при сеткографическом нанесении реакционного состава фермент (например глюкозооксидаза) и медиатор (например MnO2, используемый для катализа окисления H2O2), хотя и диспергированы, но обычно присутствуют в реакционном составе в виде агрегатов, в результате чего H2O2 для определения аналита сначала должен диффундировать из ферментного агрегата в агрегат MnO2, что уменьшает скорость и чувствительность определения за счет уменьшения эффективности захвата.

В качестве альтернативной архитектуры для рабочего электрода было предложено сначала наносить электроосаждением на металл электрода слой металла, содержащий фермент, а в качестве другого слоя наносить электроосаждением медиатор электронного перехода (EP 0368209 A1).

Решаемая задача

Таким образом, в основу настоящего изобретения была положена задача предложить биосенсор, который можно было бы по меньшей мере частично имплантировать в ткань организма и который был бы полностью или частично лишен рассмотренных выше недостатков известных сенсорных элементов. В частности, сенсорный элемент должен быть усовершенствован с учетом проблем, связанных с сеткографическим нанесением реакционных составов и/или эталонных составов.

Раскрытие сущности изобретения

Эта задача решена в биосенсоре и относящихся к нему способах, охарактеризованных в соответствующих независимых пунктах формулы изобретения. Предпочтительные варианты выполнения биосенсора и осуществления способа изготовления биосенсора раскрыты описании и в зависимых пунктах формулы изобретения.

Соответственно, настоящее изобретение относится к биосенсору для определения аналита, содержащему подложку, рабочий электрод, имеющий электропроводящую площадку, находящуюся в проводящем контакте с медиаторным слоем, и ферментный слой, содержащий оксидазу и находящийся в диффузионном контакте с медиаторным слоем, причем медиаторный слой получен электроосаждением и содержит электрокаталитический агент.

В тексте описания и формулы изобретения термины "имеет", "содержит", "включает (в себя)" или любые их грамматические разновидности употребляются неисключительным образом, оставляя соответствующие формулировки открытыми. Таким образом, эти термины могут использоваться как в ситуации, в которой в соответствующем объекте в контексте изобретения отсутствуют какие-либо иные признаки, кроме признака, вводимого этими терминами, так и в ситуации, в которой также присутствует один или несколько других признаков. В качестве примера: выражения "А имеет Б", "А содержит Б" и "А включает в себя Б", могут использоваться как в ситуации, в которой в объекте А отсутствуют другие элементы, кроме Б (т.е. в ситуации, в которой А состоит из Б и только из Б), так и в ситуации, в которой в объекте А, помимо Б, присутствует один или несколько других элементов, например, элемент В, элементы Г и Д или другие дополнительные элементы.

Далее, ниже по тексту выражения "предпочтительно", "более предпочтительно", "наиболее предпочтительно", "особенно", "преимущественно", "в частности", "прежде всего" или аналогичные выражения используются в отношении факультативных признаков, не ограничивая альтернативных возможностей. Поэтому признаки, вводимые этими выражениями, являются факультативными, т.е. необязательными, и предполагается, что они никоим образом не ограничивают объем патентных притязаний. Как должно быть понятно специалисту, осуществление изобретения возможно с использованием альтернативных признаков. Аналогичным образом, признаки, вводимые выражениями "в частности", "прежде всего", "в одном варианте осуществления изобретения" или аналогичными выражениями, предполагаются факультативными и не подразумевают каких бы то ни было ограничений в отношении альтернативных вариантов осуществления изобретения, в отношении объема правовой охраны изобретения и в отношении возможностей комбинирования вводимых таким образом признаков с другими факультативными или обязательными признаками изобретения. Кроме того, если не оговорено иное, слова "примерно", "приблизительно" или "около", предваряющие указание того или иного значения, означают применимость технических допусков на указанное значение, общепринятых в соответствующей области техники; в одном варианте осуществления изобретения эти слова указывают на то, что допустимые отклонения указанного значения составляют ±20%.

Под биосенсором в контексте изобретения понимается устройство, содержащее рассмотренные в данном описании средства. В одном варианте осуществления изобретения биосенсор соответственно содержит подложку, рабочий (индикаторный) электрод, находящийся в проводящем контакте с медиаторным слоем, и ферментный слой, содержащий оксидазу и находящийся в диффузионном контакте с медиаторным слоем, как это указано в других местах данного описания.

В одном варианте осуществления изобретения биосенсор представляет собой имплантируемый биосенсор. Так, в одном варианте осуществления изобретения биосенсор также содержит диффузионную мембрану и/или обеспечивающий биосовместимость слой. Под диффузионной мембраной в контексте изобретения понимается полимер, допускающий диффузию аналита, т.е. позволяющий аналиту диффундировать через себя, в частности полимер толщиной от 1 до 100 мкм, прежде всего - толщиной от 2,5 до 50 мкм. В одном варианте осуществления изобретения диффузионная мембрана содержит биосовместимый полимер, в частности полимер, полученный полимеризацией мономеров бутилметакрилата (BUMA) и/или 2-гидроксиэтилметакрилата (HEMA), или состоит из такого биосовместимого полимера. В еще одном варианте осуществления изобретения диффузионная мембрана допускает диффузию аналита, но не высокомолекулярных компонентов, содержащихся в анализируемой среде, например в физиологической жидкости. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения диффузионная мембрана, в частности, допускает диффузию молекул с молекулярной массой менее 10 кДа, в частности - менее 5 кДа, прежде всего - менее 1 кДа. Так, в одном варианте осуществления изобретения диффузионная мембрана представляет собой полупроницаемую мембрану, в частности диализную мембрану, прежде всего биосовместимую диализную мембрану. Под обеспечивающим биосовместимость слоем в контексте изобретения понимается крайний внешний слой биосенсора, содержащий биосовместимый материал или состоящий из него. В одном варианте осуществления изобретения биосовместимый материал представляет собой материал, не вызывающий реакции организма, например инертный материал. В одном варианте осуществления изобретения биосенсор полностью покрыт обеспечивающим биосовместимость слоем, за исключением отверстия, закрытого диффузионной мембраной. В еще одном варианте осуществления изобретения биосенсор покрыт обеспечивающим биосовместимость слоем полностью. В одном варианте осуществления изобретения указанное отверстие расположено вблизи рабочего электрода, а диффузионная мембрана отделяет рабочий электрод, медиаторный слой и ферментный слой от анализируемой среды. Кроме того, в частном случае, когда биосенсор является имплантируемым, он обычно может содержать дополнительные электрические и электронные средства, включая, например, источник энергии, такой как аккумуляторная батарея, и/или модуль связи для обмена информацией с внешним устройством, например для передачи измеряемых значений аналита. Средства, подходящие для реализации источников энергии и модулей связи, широко известны в технике.

Разумеется, что биосенсор может содержать и другие средства, подходящие с точки зрения специалиста. В одном варианте осуществления изобретения биосенсор представляет собой электрохимический биосенсор; таким образом, биосенсор может содержать дополнительные электрические выводы и контакты. В одном варианте осуществления изобретения биосенсор содержит дополнительные электроды, которыми могут быть электроды, обладающие описанными признаками, или электроды, отличающиеся от них конструктивно и/или функционально. Дополнительные электроды могут быть приспособлены, например, для использования при контроле заполнения, в качестве датчика температуры и т.п. В одном варианте осуществления изобретения биосенсор также содержит противоэлектрод, в еще одном варианте осуществления изобретения также содержит электрод сравнения и противоэлектрод. Из уровня техники известно, что биосенсор может содержать три электрода, каждому из которых соответствует рабочий (индикаторный) электрод, противоэлектрод и электрод сравнения ("трехэлектродная схема"); или биосенсор может содержать два электрода, одним из которых является рабочий электрод, а вторым - противоэлектрод и электрод сравнения ("двухэлектродная схема"). Как указано выше, биосенсор также может содержать дополнительные электроды.

Под аналитом в контексте изобретения понимается химическое соединение, присутствующее в жидкости, в частности физиологической жидкости. В одном варианте осуществления изобретения жидкость представляет собой исследуемую пробу, как указано в других местах данного описания. В одном варианте осуществления изобретения аналит представляет собой органическую молекулу, в частности органическую молекулу, способную участвовать в окислительно- восстановительной реакции в присутствии фермента в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления изобретения аналит представляет собой молекулу, связанную с метаболизмом субъекта, т.е. молекулу, образующуюся и/или расходуемую в ходе по меньшей мере одной химической реакции, протекающей по меньшей мере в одной ткани указанного субъекта. Также в одном варианте осуществления изобретения аналит представляет собой низкомолекулярное химическое соединение, в частности химическое соединение с молекулярной массой менее 5000 а.е.м. (5000 Да; 1 а.е.м. = 1,66×10-27 кг), в частности с молекулярной массой менее 1000 а.е.м., прежде всего менее 500 а.е.м. То есть, в одном варианте осуществления изобретения аналит не является биологической макромолекулой. В еще одном варианте осуществления изобретения аналит выбран из перечня, состоящего из малата, этанола, аскорбиновой кислоты, холестерина, глицерина, мочевины, 3-гидроксибутирата, лактата, пирувата, кетонов, креатинина и т.п., преимущественно аналитом является глюкоза.

Термины "проба" и "исследуемая проба" в контексте изобретения относятся к образцу физиологической жидкости, к образцу выделенных клеток, к образцу ткани или органа либо к образцу промывочной среды, полученной с наружной или внутренней поверхности тела. В одном варианте осуществления изобретения проба представляет собой пробу физиологической жидкости. В контексте изобретения под физиологической жидкостью понимаются любые жидкости организма субъекта, в отношении которых известно или предполагается, что они содержат аналит по смыслу настоящего изобретения, в том числе такие жидкости, как кровь, плазма, интерстициальная жидкость, слезная жидкость, моча, лимфа, цереброспинальная жидкость, желчь, кал, пот и слюна. В одном варианте осуществления изобретения физиологической жидкостью является кровь, сыворотка или плазма. Пробы физиологических жидкостей можно брать широко известными методами, в том числе, например, путем прокола вены или артерии, прокола кожи и т.п. В одном варианте осуществления изобретения физиологическую жидкость для определения в ней аналита отбирают из организма субъекта, и в подобном варианте предлагаемый в изобретении биосенсор используется в рамках метода, осуществляемого in vitro (вне организма). В еще одном варианте осуществления изобретения, когда биосенсор представляет собой имплантируемый биосенсор, физиологическая жидкость содержится в организме субъекта, и в подобном случае физиологическая жидкость представляет собой, в частности, кровь или интерстициальную жидкость, так что в подобном варианте предлагаемый в изобретении биосенсор используется в рамках метода, осуществляемого in vivo (в живом организме).

В контексте изобретения под подложкой понимается несущий элемент (основа), который в целом может иметь любую форму, например форму полоски. Подходящие материалы и геометрии подложек известны из уровня техники. В одном варианте осуществления изобретения подложка является гибкой. В одном варианте осуществления изобретения подложка имеет слоистую структуру с одним, двумя или более слоями, в частности гибкую слоистую структуру. Подложка в общем случае может изготавливаться из любого подходящего материала, например пластмассового материала и/или слоистого материала и/или бумажного материала и/или керамического материала. В качестве альтернативы этим материалам или в дополнение к ним могут использоваться другие материалы, такие как металлы или тонкопленочные структуры. В одном варианте осуществления изобретения подложка представляет собой изолирующий слой, и случае, если подложка выполнена из металла, этот металл в одном варианте осуществления изобретения покрыт изолирующим слоем. В одном варианте осуществления изобретения подложка содержит гибкую печатную плату либо полиимид или состоит из них.

Термин "электрод", в принципе, известен в технике как относящийся к электрическому проводнику, используемому для установления контакта с неметаллической частью электрической цепи. Специалисту известно множество материалов и геометрий, используемых в биосенсоре в качестве электродов, например, из публикаций WO 2007/071562 A1, US 2009/0178923 A1, US 2011/0196216 A1 и US 2015/0099954 A1, полное содержание которых включено в данное описание путем ссылки. В одном варианте осуществления изобретения электрод предлагаемого в изобретении биосенсора содержит по меньшей мере одну электропроводящую площадку и по меньшей мере одну проводящую дорожку. Под проводящей площадкой в контексте изобретения понимается небольшая масса металла, образующая часть электрода, на котором протекает аналитическая реакция (в случае, если площадка является площадкой рабочего электрода), обратная реакция (в случае, если площадка является площадкой противоэлектрода) или эталонная реакция (в случае, если площадка является площадкой электрода сравнения). В контексте изобретения выражение "реакция протекает на проводящей площадке электрода" означает протекание реакции в слое, находящемся в проводящем контакте, в частности в непосредственном контакте, с указанной проводящей площадкой, например в медиаторном слое или в слое Ag/AgCl. В одном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна электропроводящая площадка и/или проводящая дорожка состоит из некорродирующего материала с высокой проводимостью, в частности из благородного металла, включая золото, серебро, платину и палладий или их сплав, или из графита. В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна проводящая площадка и/или проводящая дорожка содержит по меньшей мере один золотой слой, в частности состоит из золота. Как должно быть понятно специалисту, по меньшей мере одна электропроводящая площадка и/или проводящая дорожка может содержать несколько слоев, например два слоя или более двух слоев. Так, в одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна проводящая площадка и/или проводящая дорожка электрода может содержать слой меди и слой золота. В одном варианте осуществления изобретения электрод получен путем гальванического осаждения слоя золота на медную электродную структуру, в частности полученную литографическим формированием проводящих дорожек на подложке. В еще одном варианте осуществления изобретения проводящая дорожка (электрическое соединение) токопроводящим образом соединяет проводящую площадку, например, с соединителем, содержащимся в измерительном устройстве. Проводящая площадка и проводящая дорожка, в принципе, могут иметь любую подходящую геометрию.

В одном варианте осуществления изобретения электрод, в частности рабочий электрод, выполнен с возможностью входа в контакт с пробой, в частности физиологической жидкостью, внутри ткани организма, либо непосредственно, либо по меньшей мере через одну полупроницаемую мембрану. Так, в одном варианте осуществления изобретения электрод расположен таким образом, чтобы входить в контакт по меньшей мере с одним содержащимся в физиологической жидкости электролитом и/или растворителем, таким как вода. Электрод может представлять собой или может содержать одну или несколько проводящих площадок (полей электрода), которые могут полностью или частично находиться в контакте с физиологической жидкостью или входить в контакт с физиологической жидкостью. Таким образом, каждое поле электрода может обеспечивать по меньшей мере одну поверхность раздела (интерфейс) с физиологической жидкостью, например, либо находящуюся в контакте непосредственно с тканью организма, содержащей физиологическую жидкость, либо входящую в контакт с физиологической жидкостью посредством по меньшей мере одной мембраны, которая может быть полностью или частично проницаемой для физиологической жидкости или для одного или нескольких ее компонентов. Контакт с одним или несколькими полями электрода может обеспечиваться посредством одного или нескольких подходящих контактных соединений, также называемых проводящими дорожками. Так, одно контактное соединение или одна проводящая дорожка может обеспечивать электрическое контактирование ровно одного электрода или множества из двух или более электродов. По меньшей мере один электрод, в одном варианте осуществления изобретения, может иметь ровно один непрерывный участок поверхности, которая может быть приспособлен для входа в контакт с физиологической жидкостью внутри ткани организма. В биосенсоре может быть предусмотрен один или несколько электродов одного типа. Электрическое контактирование каждого электрода может обеспечиваться по меньшей мере одним контактным соединением. При наличии более чем одного электрода одного типа контактирование электродов может обеспечиваться одним или несколькими контактными соединениями. Таким образом, электрическое контактирование двух или более электродов одного типа может обеспечиваться одним и тем же контактным соединением. В качестве альтернативы, для контактирования электродов могут быть предусмотрены отдельные контактные соединения, например по меньшей мере по одному отдельному контактному соединению на каждый электрод.

Каждый электрод может быть выполнен так, чтобы на нем могла протекать электрохимическая реакция, в которой может участвовать физиологическая жидкость или ее часть, например электролит и/или аналит. Таким образом, электрод может быть выполнен с возможностью протекания на нем реакции окисления или реакции восстановления.

Биосенсор может содержать ровно один рабочий электрод или несколько рабочих электродов. Если предусмотрено более одного рабочего электрода, по меньшей мере один из указанных рабочих электродов должен содержать электропроводящую площадку, находящуюся в проводящем контакте с медиаторным слоем, причем медиаторный слой получен электроосаждением, т.е. является электроосажденным медиаторным слоем, и содержит электрокаталитический агент. Кроме того, биосенсор может содержать ровно один противоэлектрод или несколько противоэлектродов. При наличии одного или нескольких дополнительных электродов сравнения, может быть предусмотрен ровно один электрод сравнения или может быть предусмотрено несколько электродов сравнения.

В одном варианте осуществления изобретения биосенсор представляет собой биосенсор для определения аналита, в частности для определения аналита в пробе. В еще одном варианте осуществления изобретения указанная проба является пробой от субъекта. Под определением аналита в контексте изобретения понимается обнаружение или измерение количества аналита, в частности полуколичественное или количественное. В одном варианте осуществления изобретения определение аналита включает оценивание количества электронов, высвобождающихся или поглощаемых на рабочем электроде при контактировании предлагаемого в изобретении биосенсора со средой, предположительно содержащей аналит. Методы оценивания количества электронов, высвобождающихся или поглощаемых на рабочем электроде, известны из уровня техники. В одном варианте осуществления изобретения количество высвобождающихся или поглощаемых электронов оценивается посредством потенциостатического измерения.

Под рабочим электродом в общем случае понимается электрод в электрохимической ячейке, на котором протекает интересующая реакция. В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере одна электропроводящая площадка рабочего электрода находится в проводящем контакте с медиаторным слоем, как указано в других местах данного описания. В одном варианте осуществления изобретения рабочий электрод имеет множество электропроводящих площадок, также называемых полями электрода. В еще одном варианте осуществления изобретения множество электропроводящих площадок представляет собой множество полей, описанных в цитируемой выше публикации US 2011/196216 A1. В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна проводящая площадка, в частности по меньшей мере две проводящие площадки, прежде всего половина проводящих площадок, предпочтительно все проводящие площадки (поля) рабочего электрода находится(-ятся) в проводящем контакте с одним медиаторным слоем или несколькими медиаторными слоями. В одном варианте осуществления изобретения проводящие площадки рабочего электрода находятся в проводящем контакте с одним и тем же медиаторным слоем, например за счет контакта со связным медиаторным слоем, покрывающим все проводящие площадки и соединяющие их соединения. В еще одном варианте осуществления изобретения проводящие площадки одного или нескольких рабочих электродов находятся в проводящем контакте по меньшей мере с двумя отдельными или различными медиаторными слоями, причем под отдельными медиаторными слоями понимаются разделенные в пространстве медиаторные слои, одинаковые по составу, а под различными медиаторными слоями понимаются медиаторные слои, различающиеся составом. В одном варианте осуществления изобретения рабочий электрод представляет собой электрод биосенсора, на котором происходит окисление пероксида, в частности пероксида водорода; соответственно, в одном варианте осуществления изобретения рабочий электрод представляет собой анод.

Под противоэлектродом в общем случае понимается электрод в электрохимической ячейке, на котором протекает реакция, обратная интересующей реакции; таким образом, противоэлектрод предпочтительно представляет собой электрод, используемый для замыкания электрической цепи, включающей рабочий электрод, во время измерения. Средства и методы изготовления противоэлектрода широко известны в технике, например из цитируемых выше публикаций. В одном варианте осуществления изобретения противоэлектрод расположен с противоположной рабочему электроду стороны подложки, как описано, в частности, в цитируемой выше публикации US 2015/099954 A1; в одном варианте осуществления изобретения противоэлектрод содержит содержащую золото или состоящую из золота проводящую площадку, которая в подобном случае может быть или может не быть дополнительно функционализирована.

Материал противоэлектрода также может содержать по меньшей мере один окислительно-восстановительный материал противоэлектрода, способный участвовать по меньшей мере в одной окислительно-восстановительной реакции, и/или может содержать один или несколько электропроводящих материалов, например один или несколько металлов. В контексте изобретения под окислительно-восстановительной реакцией понимается реакция, один участник которой восстанавливается, а другой участник - окисляется. Таким образом, под окислительно-восстановительным материалом понимается материал, содержащий по меньшей мере один восстанавливаемый, т.е. способный к восстановлению, компонент и по меньшей мере один окисляемый, т.е. способный к окислению, компонент. В качестве примера, окислительно- восстановительный материал противоэлектрода может содержать одну или несколько из следующих окислительно-восстановительных систем: Ag/AgCl, Hg/HgCl2 и Mn(II)/Mn(IV). По меньшей мере один электропроводящий материал может образовывать по меньшей мере одну электропроводящую поверхность, которая, в одном варианте осуществления изобретения, является электрически поляризуемой поверхностью и которая может быть выполнена с возможностью протекания на ней одной или нескольких окислительно-восстановительных реакций с одним или несколькими компонентами, содержащимися в физиологической жидкости.

Термин "электрод сравнения" известен специалисту как относящийся к электроду, приспособленному для того, чтобы обеспечивать известный и постоянный в широком спектре условий потенциал, используемый в качестве эталонного потенциала, в частности за счет обеспечения окислительно- восстановительной системы, имеющей известный и постоянный электродный потенциал. В принципе, методы получения электрода сравнения известны специалисту, например, из цитируемых выше публикаций. В одном варианте осуществления изобретения электрод сравнения находится в проводящем контакте со слоем эталонного материала, в частности эталонного материала, имеющего известный и постоянный в широком спектре условий электродный потенциал. В одном варианте осуществления изобретения эталонный материал содержит по меньшей мере один из следующих металлов: серебро (Ag), медь (Cu), марганец (Mn), свинец (Pb), ртуть (Hg), никель (Ni), кобальт (Co), висмут (Bi), рений (Re) и теллур (Te), в частности содержит один из указанных металлов. В одном варианте осуществления изобретения эталонный материал содержит указанный металл, металлы или их сплав в ионной форме, в элементарной форме или в ионной и элементарной форме. В еще одном варианте осуществления изобретения эталонный материал содержит указанный металл, металлы или их сплав в ионной и элементарной форме. В одном варианте осуществления изобретения эталонный материал содержит указанный металл, металлы или их сплав в элементарной форме, причем эталонный материал, содержащий указанный металл, металлы или их сплав в ионной и элементарной форме, получают на месте путем частичного электрохимического окисления указанной элементарной формы. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения эталонный материал содержит по меньшей мере один из указанных металлов в ионной форме в виде оксида или хлорида, в еще одном варианте осуществления изобретения содержит по меньшей мере один из указанных металлов в элементарной и в ионной форме, в еще одном варианте осуществления изобретения содержит по меньшей мере один из указанных металлов (i) в элементарной форме и (ii) в виде оксида или в виде хлорида. В одном варианте осуществления изобретения электрод сравнения представляет собой электрод Ag/AgCl, полученный стандартными методами, в еще одном варианте осуществления изобретения электрод сравнения представляет собой электрод Ag/AgCl, полученный на месте путем электрохимического окисления серебра в присутствии ионов хлорида.

В одном варианте осуществления изобретения биосенсор не содержит электрода сравнения; в частности, в таком варианте осуществления изобретения биосенсор содержит противоэлектрод, содержащий окислительно - восстановительный материал противоэлектрода, который одновременно функционирует в качестве описанного выше эталонного материала.

В одном варианте осуществления изобретения эталонный материал, в частности эталонный материал, описанный выше, наносят на электрод сравнения электроосаждением, т.е. в частности за счет полуреакции гальванической ячейки. В одном варианте осуществления изобретения эталонный материал, в частности серебро, электроосаждают на электрод сравнения в элементарной форме, а затем частично окисляют с получением эталонного материала, содержащего указанный металл, металлы или их сплав в ионной и элементарной форме. Методы электроосаждения серебра на золотой электрод, в принципе, известны в технике и дополнительно описываются в примерах, приведенных ниже в данном описании. В одном варианте осуществления изобретения серебро электроосаждают из раствора нитрата серебра, в частности имеющего концентрацию от 1 мкМ (микромоль на литр) до концентрации насыщения при комнатной температуре (25°C), в частности от 100 мкМ до концентрации насыщения при комнатной температуре. В одном варианте осуществления изобретения осаждение выполняют потенциостатически, т.е. путем приложения постоянного напряжения. Специалисту известно, как определять напряжения, подходящие для потенциостатического осаждения. В одном варианте осуществления изобретения прикладывают напряжение от -60 мВ до -150 мВ, в частности от -65 мВ до -120 мВ. В еще одном варианте осуществления изобретения осаждение выполняют гальваностатически, т.е. регулируя ток из условия достижения подходящей скорости осаждения, которая, в частности, является постоянной на протяжении времени осаждения. В одном варианте осуществления изобретения гальваностатическое осаждение оптимизируют путем нахождения оптимального диапазона токов по кривой ток-потенциал, установленной для процесса осаждения. Как должно быть понятно специалисту, количеством электроосажденного материала, в частности толщиной слоя, можно управлять, регулируя ток и/или время осаждения.

Термин "проводящий контакт" понятен специалисту. В одном варианте осуществления изобретения проводящим контактом является контакт, допускающий перенос электрического заряда от первого участвующего в контакте элемента во второй участвующий в контакте элемент, который может быть опосредован промежуточным проводящим соединением, например электролитом или в особенности проводником электронов, например металлом. В контексте изобретения термин "электропроводящий" в общем случае относится к удельной проводимости (электропроводности) σ, обычно выражаемой в См/м или 1/Ом·м и составляющей по меньшей мере 1·100 См/м, предпочтительно по меньшей мере 1· 103 См/м и более предпочтительно по меньшей мере 1·105 См/м. Далее, в контексте изобретения термин "электроизолирующий" относится к удельной проводимости (электропроводности), не превышающей 1·10-1 См/м, предпочтительно не превышающей 1·10-2 См/м и наиболее предпочтительно не превышающей 1·10-5 См/м. В еще одном варианте осуществления изобретения проводящий контакт является непосредственным контактом; таким образом, в одном варианте осуществления изобретения проводящий контакт между рабочим электродом и медиаторным слоем, используемым в настоящем изобретении, является непосредственным контактом. То есть, в одном варианте осуществления изобретения проводящая площадка рабочего электрода по меньшей мере частично покрыта медиаторным слоем, в частности непосредственно контактируя с указанным медиаторным слоем. Соответственно, в еще одном варианте осуществления изобретения проводящий контакт между электродом сравнения и эталонным материалом, используемым в настоящем изобретении, является непосредственным контактом. То есть, в одном варианте осуществления изобретения проводящая площадка электрода сравнения по меньшей мере частично покрыта эталонным материалом, в частности непосредственно контактируя с указанным эталонным материалом.

Аналогично, под диффузионным контактом в контексте изобретения понимается контакт, допускающий диффузию соединения, в частности соединения, имеющего молекулярную массу, указанную для аналита в других местах описания, из первого участвующего в контакте элемента во второй участвующий в контакте элемент, т.е. контакт, позволяющий этому соединению диффундировать из первого во второй элемент. Так, в одном варианте осуществления изобретения диффузионный контакт представляет собой контакт, опосредованный промежуточным составом, допускающим диффузию соединения из первого участвующего в контакте элемента во второй участвующий в контакте элемент. В еще одном варианте осуществления изобретения диффузионный контакт представляет собой непосредственный контакт; таким образом, в одном варианте осуществления изобретения диффузионный контакт между медиаторным слоем и ферментным слоем представляет собой непосредственный контакт. То есть, в одном варианте осуществления изобретения медиаторный слой, находящийся в проводящем контакте с проводящей площадкой рабочего электрода, по меньшей мере частично покрыт эталонным материалом, в частности непосредственно контактирует с эталонным материалом.

В контексте изобретения под медиаторным слоем понимается слой, содержащий электрокаталитический агент. Под электрокаталитическим агентом в контексте изобретения понимается неорганическое химическое соединение, катализирующее электрохимическую реакцию, в частности реакцию восстановления или реакцию окисления на электроде. В одном варианте осуществления изобретения указанный катализ представляет собой уменьшение сверхпотенциала, требуемого для протекания указанной электрохимической реакции по сравнению с некатализированной реакцией, и/или представляет собой увеличение скорости протекания электрохимической реакции по сравнению с некатализированной реакцией. В частности, выражение "увеличение скорости протекания электрохимической реакции" относится к скорости реакции на единицу площади поверхности электрода, в частности на единицу площади поверхности рабочего электрода; таким образом, в одном варианте осуществления изобретения электрокатализ не увеличивает площади поверхности электрода, в частности площади поверхности рабочего электрода. В одном варианте осуществления изобретения электрокаталитический агент является селективным, т.е. электрокаталитический агент специфически или полуспецифически катализирует электрохимическую реакцию конкретного соединения или класса соединений, например пероксидов. В одном варианте осуществления изобретения электрокаталитический агент содержит марганец, в частности ионы марганца, в частности ионы марганца (IV). В одном варианте осуществления изобретения электрокаталитический агент содержит оксид марганца (IV) (MnO2).

В одном варианте осуществления изобретения медиаторный слой, используемый при осуществления настоящего изобретения, содержит дополнительные компоненты, например усиливающие адгезию соединения, один или несколько металлов или сплавов в качестве проводящего материала и т.п. В еще одном варианте осуществления изобретения медиаторный слой, используемый при осуществлении настоящего изобретения, не содержит иных компонентов, чем электрокаталитический агент, например, не содержит пероксидов органических эфиров, в частности не содержит органических эфиров, прежде всего не содержит органических растворителей. В одном варианте осуществления изобретения медиаторный слой состоит из электрокаталитического агента; так, медиаторный слой состоит из MnO2.

В одном варианте осуществления изобретения медиаторный слой, в частности электрокаталитический агент, описанный выше, электроосаждают на рабочий электрод или рабочий электроды, т.е., в частности, за счет полуреакции гальванической ячейки. Методы электроосаждения электрокаталитического агента, охарактеризованного в данном описании, в принципе, известны в технике. Как указано в других местах данного описания, в одном варианте осуществления изобретения электрокаталитический агент представляет собой марганец, в частности представляет собой MnO2. В таком случае электрокаталитический агент, т.е. MnO2, можно электроосаждать, например, из водного раствора сульфата марганца. Значения pH и напряжения, подходящие для электроосаждения металла или его определенной соли, можно получить, например, из диаграммы Пурбэ. В одном варианте осуществления изобретения осаждение выполняют потенциостатически, т.е. путем приложения постоянного напряжения. Специалисту известно, как определять подходящие для электроосаждения условия, в частности напряжения для потенциостатического осаждения, как показано, например, в примерах. Например, в одном варианте осуществления изобретения MnO2 можно электроосаждать из раствора MnSO4, имеющего pH от 3 до 8, в частности pH от 5 до 7, при потенциале от 1 до 4 В, в частности от 3,0 до 3,5 В относительно электрода Ag/AgCl. В еще одном варианте осуществления изобретения осаждение выполняют гальваностатически, т.е. регулируя ток из условия достижения подходящей скорости осаждения, которая, в частности, является постоянной на протяжении времени осаждения. В одном варианте осуществления изобретения гальваностатическое осаждение оптимизируют путем нахождения оптимального диапазона токов по кривой ток- потенциал, установленной для процесса осаждения. Как должно быть понятно специалисту, количеством электроосажденного материала, в частности толщиной слоя, можно управлять, регулируя ток и/или время осаждения. В одном варианте осуществления изобретения, как показано в примерах, MnO2 можно осаждать из раствора, содержащего ионы Mn(II), в частности MnSO4 или MnCl2, при постоянном токе, составляющем от 1 до 15 мкА, в частности от 4 до 12,5 мкА. В еще одном варианте осуществления изобретения, как показано в примерах, Ag можно осаждать из раствора, содержащего ионы Ag(I), в частности AgNO3, при постоянном токе, составляющем от 10 до 300 мкА, в частности от 25 до 275 мкА. Как понятно специалисту, ток, подходящий для электроосаждения на конкретный электрод, зависит от множества других параметров, включая площадь поверхности электрода, геометрию электрода, геометрию прикладываемого электрического поля, в частности относительное положение противоэлектрода, и т.п.

Под ферментом в контексте изобретения понимается биологическая макромолекула, в частности полипептид, катализирующий в присутствии аналита химическую реакцию, в результате которой образуется или расходуется соединение, электрохимическое преобразование которого катализируется электрокаталитическим агентом, как указано в других местах данного описания. В одном варианте осуществления изобретения фермент представляет собой оксидазу; в еще одном варианте осуществления изобретения фермент в присутствии аналита производит пероксид, в частности производит пероксид водорода; так, в одном варианте осуществления изобретения фермент представляет собой оксидазу, производящую пероксид водорода, например глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4), гексозооксидазу (КФ 1.1.3.5), холестериноксидазу (КФ 1.1.3.6), галактозооксидазу (КФ 1.1.3.9), алкогольоксидазу (КФ 1.1.3.13), L- гулонолактоноксидазу (КФ 1.1.3.8), НАДФН-оксидазу (образующую H2O2, КФ 1.6.3.1), НАДН-оксидазу (образующую H2O2, КФ 1.6.3.3) или каталазу (КФ 1.11.1.6). В одном варианте осуществления изобретения фермент представляет собой глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4).

Под ферментным слоем в контексте изобретения понимается слой, содержащий фермент, охарактеризованный выше. В одном варианте осуществления изобретения ферментный слой содержит дополнительные компоненты, в частности дополнительный полипептид, например белок- носитель, который может применяться в по существу фиксированной пропорции с ферментом. Под белком-носителем в контексте изобретения понимается белок или смесь белков, не обладающий(-ая) по меньшей мере каталитической активностью, производящей соединение, определяемое предлагаемым в изобретении биосенсором; в частности, белок-носитель не имеет известной ферментативной активности и/или представляет собой термоинактивированный белок. В одном варианте осуществления изобретения фермент и белок-носитель распределены по ферментному слою по существу равномерным образом. Как правило, ферментный слой является тонким, например, имеет толщину от 1 до 10 мкм, в частности от 2 до 5 мкм. Ферментные слои такой толщины можно получать, например, электроосаждением или сеткографией. Как должно быть понятно, в частном случае нанесения ферментного слоя методом сеткографии фермент может быть диспергирован в составе, содержащем другие добавки, включая наполнители, растворители, медиаторы адгезии и прочие добавки, широко известные в технике. В типичном варианте осуществления изобретения ферментный слой является очень тонким, например, имеет толщину, составляющую около 1 мкм, около 0,5 мкм, около 0,25 мкм или около 0,1 мкм. Ферментные слои такой толщины можно получать путем дозирования или напыления фермента, а возможно, и добавок, которые могут быть растворены в подходящем растворителе, например, в воде или водном буфере.

Биосенсор также может содержать по меньшей мере один электроизолирующий материал. Электроизолирующий материал можно наносить на подложку, например, покрывая подложку одним или несколькими слоями по меньшей мере одного электроизолирующего материала. В качестве примера, электроизолирующий материал может содержать одну или несколько электроизолирующих смол. Так, подложку можно полностью или частично покрывать одним или несколькими слоями электроизолирующей смолы. В качестве дополнения или альтернативы могут использоваться другие типы изолирующих материалов, полностью или частично покрывающих подложку. По меньшей мере один электроизолирующий материал можно наносить на подложку непосредственно или опосредованно, например методами нанесения покрытий. Опять же, в качестве дополнения или альтернативы, электроизолирующий материал может быть частью самой подложки. Так, сама подложка может быть полностью или частично изготовлена по меньшей мере из одного электроизолирующего материала. В качестве примера, подложка может быть полностью или частично изготовлена из изолирующего пластмассового материала, такого как изолирующий сложный полиэфир, и/или может быть полностью или частично изготовлена из такого изолирующего материала, как бумага и/или изолирующий керамический материал.

Что касается преимуществ изобретения, во время работы над созданием изобретения была установлена возможность электроосаждения медиаторного слоя, например слоя MnO2, на рабочий электрод биосенсора, причем такое электроосаждение ведет к получению однородного, прочно сцепленного с нижележащей поверхностью слоя, имеющего большую поверхность. Также изобретение позволяет обойтись без технических сложностей, связанных с нанесением указанного слоя методом сеткографии. Кроме того, поскольку новый способ не требует использование для сеткографии пасты, содержащей монобутиловый эфир диэтиленгликоля (DEGMBE), в медиаторном слое не присутствуют эфиры, окисленные в перекисные соединения, а значит, нулевые токи (токи при нулевой концентрации аналита) новых сенсоров очень низки. По той же причине новые биосенсоры также не требуют предварительного контроля перед началом эксплуатации. Кроме того, благодаря применению предлагаемого в изобретении способа размер рабочего электрода может быть задан точнее, поскольку исключается разброс параметров, обусловленный применением сеткографии. Кроме того, во время гальванического осаждения может быть точнее задано количество осаждаемого медиатора. Это позволяет уменьшить изменчивость изделий, например тест-полосок для определения аналита, от партии к партии.

Приведенные выше определения применимы, с соответствующими изменениями, к нижеследующему описанию. Дополнительные определения и пояснения, приведенные ниже, также относятся, с соответствующими изменениями, ко всем вариантам осуществления изобретения, рассмотренным в данном описании.

Объектом настоящего изобретения также является способ изготовления биосенсора, включающий:

а) обеспечение подложки, имеющей по меньшей мере одну проводящую площадку, б) электроосаждение по меньшей мере на часть проводящей площадки медиаторного слоя, содержащего электрокаталитический агент, в частности состоящего из него, и

в) осаждение ферментного слоя, содержащего оксидазу, по меньшей мере на часть медиаторного слоя.

Предлагаемый в изобретении способ изготовления биосенсора в одном варианте его осуществления может включать шаги, дополнительные к указанным выше. Такие дополнительные шаги могут относиться, например, к гальваническому нанесению проводящей площадки на подложку для шага а), или к нанесению еще одного слоя на шаге б), до или после него. Кроме того, один или несколько указанных шагов может выполняться автоматизированным оборудованием. Кроме того, способ изготовления биосенсора может дополнительно включать применение метода нанесения покрытия, например одного или нескольких из следующих методов: метод печати или метод дозирования. Метод печати может включать любой метод печати, такой как сеткография, струйная печать, трафаретная печать, офсетная печать, тампонная печать или любой иной метод печати, или любую комбинацию таких методов. В качестве дополнения или альтернативы могут применяться и другие методы нанесения покрытий.

Кроме того, предлагаемый способ изготовления биосенсора может включать дополнительные шаги, например по меньшей мере один дополнительный шаг формирования на подложке по меньшей мере одной проводящей площадки и/или по меньшей мере одной проводящей дорожки противоэлектрода, нанесение покрытия, при котором на проводящую площадку наносят дополнительный слой и/или при котором на проводящую площадку противоэлектрода наносят материал противоэлектрода, используя по меньшей мере один метод нанесения покрытия, например по меньшей мере один метод печати и/или по меньшей мере один метод дозирования. В случае использования метода печати вышеупомянутый по меньшей мере один метод печати может включать одну или несколько различных разновидностей методов печати. В одном варианте осуществления изобретения метод печати включает по меньшей мере один метод сеткографии. Эталонный материал и/или материал противоэлектрода можно наносить в виде пасты, как указано выше. Эталонный материал и/или материал противоэлектрода также можно наносить в виде покрытия, подавая материал в одно или несколько отверстий в электроизолирующем материале, например по меньшей мере одним из методов печати и дозирования, в частности методом сеткографии. В качестве дополнения или альтернативы, после покрытия электропроводящего материала сенсора и/или электропроводящего материала противоэлектрода, например методом печати и/или дозирования, можно наносить изолирующий материал.

Далее, настоящее изобретение относится к биосенсору, изготовленному или изготавливаемому предлагаемым в изобретении способом.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению предлагаемого в изобретении биосенсора для определения аналита в пробе.

Настоящее изобретение также относится к способу определения аналита в пробе, включающему:

а) введение пробы в контакт с ферментным слоем биосенсора, содержащего:

- подложку,

- рабочий электрод, имеющий электропроводящую площадку, находящуюся в проводящем контакте с электроосажденным медиаторным слоем, содержащим электрокаталитический агент, в частности состоящим из него,

- ферментный слой, содержащий оксидазу и находящийся в диффузионном контакте с медиаторным слоем, и

- по меньшей мере один противоэлектрод,

б) замыкание электрической цепи, содержащей рабочий электрод, медиаторный слой и противоэлектрод,

в) приложение напряжения к замкнутой на шаге б) электрической цепи, измерение протекающего в результате тока, и

г) определение аналита в пробе по результату измерения.

Предлагаемый в изобретении способ определения аналита может осуществляться in vitro в отношении пробы, взятой у субъекта, или может осуществляться in vivo, если биосенсор имплантирован в организм субъекта. Кроме того, предлагаемый способ определения аналита может включать шаги, дополнительные к указанным выше. Такие дополнительные шаги могут относиться, например, к получению пробы или имплантации биосенсора для шага а), либо к выполнению калибровок и/или вычислений на основании значений, полученных на шаге в). Кроме того, один или несколько указанных шагов может выполняться автоматизированным оборудованием.

В контексте изобретения под субъектом понимается позвоночное животное. В одном варианте осуществления изобретения субъектом является млекопитающее, в частности мышь, крыса, кошка, собака, хомяк, морская свинка, овца, коза, свинья, корова или лошадь. В частности, субъектом является примат. Прежде всего, субъектом является человек. В одном варианте осуществления изобретения субъект страдает или предположительно страдает заболеванием или состоянием, связанным с поддающимся измерению отклонением по меньшей мере одного аналита от нормального значения. В еще одном варианте осуществления изобретения субъект страдает или предположительно страдает диабетом, в частности диабетом второго типа.

Предлагаемый в изобретении способ определения аналита также может включать амперометрическое измерение, например, если при введении содержащей аналит пробы в контакт с биосенсором аналит, фермент и электрокаталитический агент участвуют в реакции, приводящей к тому, что аналит либо восстанавливается (получает по меньшей мере один электрон), либо окисляется (отдает по меньшей мере один электрон). Как правило, аналит окисляется. После завершения этой реакции между рабочим электродом и противоэлектродом может быть приложена разность электрических потенциалов. Так, в одном варианте осуществления изобретения после начала реакции между электродами при помощи источника питания (например, аккумуляторной батареи) создают разность потенциалов и при помощи токоизмерительного прибора измеряют, например, возникающий при анализе ток в установившемся состоянии. Измеренный ток может быть соотнесен с концентрацией аналита; например, величина тока, в частности измеренная в квазиустановившемся состоянии, может быть соотнесена с количеством присутствующего продукта реакции, а следовательно, с количеством аналита в пробе. Прикладываемую разность потенциалов выбирают так, чтобы на поверхности рабочего электрода происходило электроокисление по меньшей мере одного продукта реакции. Рабочий электрод, используемый в соответствии с настоящим изобретением, находится в тесном контакте, в частности в непосредственном контакте, с медиаторным слоем биосенсора, что делает возможным быстрое окисление или восстановление продукта реакции на рабочем электроде. В целом, аналитами, ферментами и продуктами их реакции являются вещества, указанные выше. В одном варианте осуществления изобретения биосенсором (используемым при осуществлении способа) является предлагаемый в изобретении биосенсор.

Все источники информации, цитируемые в данном описании, включены в него путем ссылки в отношении всего их содержания и конкретных сведений, указанных в данном описании.

Исходя из вышеизложенного, предпочтительными являются следующие варианты осуществления изобретения:

Вариант 1: Биосенсор для определения аналита, содержащий подложку, рабочий электрод, имеющий электропроводящую площадку, находящуюся в проводящем контакте с медиаторным слоем, и ферментный слой, находящийся в диффузионном контакте с медиаторным слоем, причем медиаторный слой получен электроосаждением и содержит электрокаталитический агент, в частности состоит из него.

Вариант 2: Биосенсор по варианту 1, в котором электрокаталитический агент представляет собой агент, катализирующий по меньшей мере одну электрохимическую реакцию путем уменьшения, в частности селективного уменьшения, сверхпотенциала, требуемого для протекания электрохимической реакции, и/или путем увеличения скорости протекания электрохимической реакции.

Вариант 3: Биосенсор по варианту 1 или 2, в котором электрокаталитический агент содержит марганец, в частности в ионной форме.

Вариант 4: Биосенсор по одному из вариантов 1 -3, в котором электрокаталитический агент содержит оксид марганца (IV) (MnO2).

Вариант 5: Биосенсор по одному из вариантов 1 -4, в котором медиаторный слой состоит из марганца и/или из MnO2, в частности состоит из MnO2.

Вариант 6: Биосенсор по одному из вариантов 1-5, в котором медиаторный слой не содержит пероксидов органических эфиров, в частности не содержит органических эфиров, прежде всего не содержит органических растворителей.

Вариант 7: Биосенсор по одному из вариантов 1 -6, в котором рабочий электрод имеет множество электропроводящих площадок, из которых по меньшей мере одна площадка, в частности по меньшей мере две площадки, в частности половина площадок, в частности все площадки, находится(-ятся) в проводящем контакте с медиаторным слоем, находящимся в диффузионном контакте с ферментным слоем.

Вариант 8: Биосенсор по одному из вариантов 1 -7, также содержащий противоэлектрод, в частности также содержащий электрод сравнения и противоэлектрод.

Вариант 9: Биосенсор по варианту 8, в котором противоэлектрод расположен с противоположной рабочему электроду стороны подложки.

Вариант 10: Биосенсор по варианту 8 или 9, в котором электрод сравнения содержит слой эталонного материала.

Вариант 11: Биосенсор по варианту 10, в котором эталонный материал является электроосажденным.

Вариант 12: Биосенсор по варианту 10 или 11, в котором эталонный материал содержит по меньшей мере один из следующих металлов: серебро (Ag), медь (Cu), марганец (Mn), свинец (Pb), ртуть (Hg), никель (Ni), кобальт (Co), висмут (Bi), рений (Re) и теллур (Te), в частности содержит один из указанных металлов.

Вариант 13: Биосенсор по одному из вариантов 10 -12, в котором эталонный материал содержит по меньшей мере один металл в ионной и/или в элементарной форме.

Вариант 14: Биосенсор по одному из вариантов 10-13, в котором эталонный материал содержит серебро, в частности содержит хлорид серебра.

Вариант 15: Биосенсор по одному из вариантов 1-14, в котором ферментный слой содержит фермент, образующий в присутствии аналита пероксид.

Вариант 16: Биосенсор по одному из вариантов 1-15, в котором пероксидом является пероксид водорода.

Вариант 17: Биосенсор по одному из вариантов 1-16, в котором аналитом является глюкоза.

Вариант 18: Биосенсор по одному из вариантов 1-17, в котором ферментный слой содержит глюкозооксидазу.

Вариант 19: Биосенсор по одному из вариантов 1-18, представляющий собой электрохимический биосенсор.

Вариант 20: Биосенсор по одному из вариантов 1-19, представляющий собой имплантируемый биосенсор.

Вариант 21: Биосенсор по одному из вариантов 1-20, также содержащий диффузионную мембрану.

Вариант 22: Биосенсор по одному из вариантов 1-21, также содержащий обеспечивающий биосовместимость слой.

Вариант 23: Биосенсор по одному из вариантов 1-22, в котором проводящая площадка содержит по меньшей мере один золотой слой, в частности состоит из золота, прежде всего состоит из электроосажденного золота.

Вариант 24: Биосенсор по одному из вариантов 1-23, в котором проводящий контакт и/или диффузионный контакт представляют собой непосредственный контакт.

Вариант 25: Способ изготовления биосенсора, включающий:

а) обеспечение подложки, имеющей по меньшей мере одну проводящую площадку,

б) электроосаждение по меньшей мере на часть проводящей площадки медиаторного слоя, содержащего электрокаталитический агент, в частности состоящего из него, и

в) осаждение ферментного слоя по меньшей мере на часть медиаторного

слоя.

Вариант 26: Способ по варианту 25, в котором медиаторный слой содержит марганец, в частности в ионной форме.

Вариант 27: Способ по варианту 25 или 26, в котором медиаторный слой содержит оксид марганца (IV) (MnO2).

Вариант 28: Способ по одному из вариантов 25-26, в котором медиаторный слой состоит из марганца или из MnO2, в частности состоит из MnO2.

Вариант 29: Способ по одному из вариантов 25-27, также включающий обеспечение подложки, также содержащей электрод сравнения и/или противоэлектрод, в частности также содержащей электрод сравнения и противоэлектрод.

Вариант 30: Способ по одному из вариантов 25-29, в котором после осаждения ферментного слоя осаждают диффузионную мембрану.

Вариант 31: Способ по варианту 29 или 30, также включающий осаждение слоя эталонного материала на электрод сравнения.

Вариант 32: Способ по одному из вариантов 29-31, также включающий электроосаждение слоя эталонного материала на электрод сравнения.

Вариант 33: Способ по одному из вариантов 25-32, в котором осаждение ферментного слоя включает осаждение фермента, образующего пероксид в присутствии аналита.

Вариант 34: Способ по одному из вариантов 25-33, в котором ферментный слой осаждают дозированием, напылением или сеткографией.

Вариант 35: Биосенсор, изготовленный или изготавливаемый способом по одному из вариантов 25-34.

Вариант 36: Применение биосенсора по одному из вариантов 1-24 для определения аналита в пробе.

Вариант 37: Способ определения аналита в пробе, включающий:

а) введение пробы в контакт с ферментным слоем биосенсора, содержащего:

- подложку,

- рабочий электрод, имеющий электропроводящую площадку, находящуюся в проводящем контакте с электроосажденным медиаторным слоем, содержащим электрокаталитический агент, в частности состоящим из него,

- ферментный слой, находящийся в диффузионном контакте с медиаторным слоем, и

- по меньшей мере один противоэлектрод,

б) замыкание электрической цепи, содержащей рабочий электрод, медиаторный слой и противоэлектрод,

в) приложение напряжения к замкнутой на шаге б) электрической цепи, измерение протекающего в результате тока, и

г) определение аналита в пробе по результату измерения.

Вариант 38: Способ по варианту 37, в котором биосенсор представляет собой биосенсор по одному из вариантов 1-24.

Описание чертежей

Фиг. 1: Гальваностатическая хроноамперометрия осаждения Ag при 250 мкА в примере 1. Ось X: время t, с; ось Y: потенциал ∆U, В.

Фиг. 2: Стабильность электродного потенциала, создаваемого электроосаждением серебра, за которым следует электроокисление в хлоридсодержащем растворе. Показано изменение во времени потенциала относительно электрода из MnO2; прерывистая линия: только Ag (до окисления) сплошная линия: AgCl (после окисления). Ось X: время t, с; ось Y: потенциал ∆U, В.

Фиг. 3: Определение напряжения осаждения для осаждения MnO2 из раствора MnSO4; гальваностатическая циклическая вольтаммограмма MnSO4 при потенциале 350 мВ относительно Ag/AgCl/0,15 М Cl-. Ось X: ток I, А; ось Y: потенциал ∆U, В.

Фиг. 4: Функциональность электроосажденного слоя MnO2 при катализе электрохимического окисления H2O2. В моменты времени 100 с, 280 с, 430 с и 550 с добавляли H2O2, после чего следовало спорадическое перемешивание (100 с), умеренное перемешивание (280 с), интенсивное перемешивание (430 с) и интенсивное перемешивание путем переворачивания всей сенсорной ячейки (550 с). Ось X: время t, с, ось Y: ток I, А.

Нижеследующие примеры лишь иллюстрируют возможности осуществления изобретения. Они не должны толковаться как ограничивающие объем охраны изобретения.

Пример 1: Осаждение серебра на подложку: электрод сравнения

На потенциостате/гальваностате Autolab PGSTAT128N использовали трехэлектродную схему (рабочий электрод, электрод сравнения, противоэлектрод; все электроды имели площадки из золота). При помощи гальваностатической хронопотенциометрии при -250 мкА (фиг. 1) удалось получить особенно высокую скорость осаждения серебра из раствора нитрата серебро на электродную площадку из золота; осаждение начинается приблизительно при -120 мВ (относительно золотого псевдоэталона в растворе AgNO3). Осажденное блестящее серебро было видно в микроскоп. Количество осажденного вещества определяли следующим образом: заряд Q = 180 с×250 мкА = 45 мКл; количество вещества n = Q/F = (45 E-3 Кл)/96484 Кл/моль = 460 нмоль. Соответственно, серебро можно селективно гальванически осаждать на площадку электрода сравнения.

Пример 2: Стабильность потенциала после частичного окисления

Для проверки пригодности к использованию в качестве электрода сравнения покрытый серебром электрод сравнения из примера 1 испытали на стабильность потенциала. Электрод вначале показал ожидаемый эталонный потенциал (приблизительно 275-325 мВ относительно диоксида марганца) без окисления; однако потенциал был нестабилен. После короткого (10 секунд) гальваностатического окисления при 1 мкА в растворе, содержавшем ионы хлорида, потенциал относительно MnO2 был по существу постоянным. Отношение Ag/AgCl регулировали посредством количества прикладываемого заряда. На фиг. 2 использовали осаждение Ag зарядом 45 мКл (пример 1) (прерывистая линия) и окисление до AgCl лишь зарядом 10 мкКл (сплошная линия), что существенно уменьшило дрейф потенциала.

Пример 3: Осаждение MnO2 на подложку: рабочий электрод

MnO2 осаждали на несколько площадок сенсорного электрода, выполненного по двухэлектродной схеме (рабочий электрод, электрод сравнения/противоэлектрод, отдельный сенсорный электрод сравнения не использовался) с использованием гальваностатической циклической вольтаммограммы (CV) от 0 до 15 мкА (относительно электрода сравнения/противоэлектрода в Mn2+); потенциал осаждения составлял 3,4 В, причем использовался электрод сравнения = противоэлектрод с дискообразным приложением напряжения при 2 В на противоэлектроде сенсора (фиг. 3). В этих условиях MnO2 осаждался на все площадки рабочего электрода. Соответственно, гальваническое осаждение MnO2 является возможным.

Пример 4: Испытание на функциональность (H2O2-окисление)

Функциональность электроосажденного MnO2 при H2O2-окислении и функциональность электрода сравнения Ag/AgCl были проведены хроноамперометрией при 350 мВ относительно эталона сенсора и с добавлением H2O2. Как показано на фиг. 4, сенсор демонстрирует зависимый от H2O2 сигнал при 350 мВ. Примечательно, что нулевой ток очень мал (приблизительно 50 пA).

Кроме того, изменение нулевого тока не наблюдается, поскольку гальванически осажденный электрод не содержит пероксидов эфиров из растворителя пасты монобутилового эфира диэтиленгликоля (DEGMBE).

1. Биосенсор для определения аналита, содержащий подложку, рабочий электрод, имеющий электропроводящую площадку, находящуюся в проводящем контакте с медиаторным слоем, и ферментный слой, содержащий оксидазу и находящийся в диффузионном контакте с медиаторным слоем, причем медиаторный слой получен электроосаждением и содержит электрокаталитический агент, в частности состоит из него, причем электрокаталитический агент содержит MnO2.

2. Биосенсор по п.1, в котором электрокаталитический агент представляет собой агент, катализирующий по меньшей мере одну электрохимическую реакцию путем уменьшения, в частности селективного уменьшения, сверхпотенциала, требуемого для протекания электрохимической реакции, и/или путем увеличения скорости протекания электрохимической реакции.

3. Биосенсор по п.1 или 2, в котором медиаторный слой состоит из MnO2.

4. Биосенсор по п.1, в котором рабочий электрод имеет множество электропроводящих площадок, из которых по меньшей мере одна площадка, в частности по меньшей мере две площадки, в частности половина площадок, в частности все площадки, находится(-ятся) в проводящем контакте с медиаторным слоем, находящимся в диффузионном контакте с ферментным слоем.

5. Биосенсор по п.1, также содержащий противоэлектрод, в частности также содержащий электрод сравнения и противоэлектрод, причем противоэлектрод расположен, в частности, с противоположной рабочему электроду стороны подложки.

6. Биосенсор по п.5, в котором электрод сравнения содержит слой эталонного материала, в частности электроосажденного эталонного материала.

7. Биосенсор по п.6, в котором эталонный материал содержит серебро, в частности содержит серебро и хлорид серебра.

8. Биосенсор по п.1, в котором ферментный слой содержит фермент, образующий в присутствии аналита пероксид, в частности пероксид водорода.

9. Биосенсор по п.1, в котором аналитом является глюкоза.

10. Биосенсор по п.1, представляющий собой имплантируемый биосенсор.

11. Способ изготовления биосенсора, включающий:

а) обеспечение подложки, имеющей по меньшей мере одну проводящую площадку, образующую рабочий электрод,

б) электроосаждение по меньшей мере на часть проводящей площадки рабочего электрода медиаторного слоя, содержащего электрокаталитический агент, в частности состоящего из него, причем электрокаталитический агент содержит MnO2, и

в) осаждение ферментного слоя, содержащего оксидазу, по меньшей мере на часть медиаторного слоя.

12. Способ по п.11, в котором используют подложку, также имеющую электрод сравнения и/или противоэлектрод, в частности также имеющую электрод сравнения и противоэлектрод.

13. Способ по п.11 или 12, в котором на электрод сравнения электроосаждают слой эталонного материала.

14. Способ по п.11, в котором осаждают ферментный слой, содержащий фермент, образующий в присутствии аналита пероксид, причем ферментный слой осаждают, в частности, методом дозирования, напыления или сеткографии.

15. Применение биосенсора по одному из пп. 1-10 для определения аналита в пробе.

16. Способ определения аналита в пробе, включающий:

а) введение пробы в контакт с ферментным слоем биосенсора, содержащего:

- подложку,

- рабочий электрод, имеющий электропроводящую площадку, находящуюся в проводящем контакте с электроосажденным медиаторным слоем, содержащим электрокаталитический агент, в частности состоящим из него, причем электрокаталитический агент содержит MnO2,

- ферментный слой, содержащий оксидазу и находящийся в диффузионном контакте с медиаторным слоем, и

- по меньшей мере один противоэлектрод,

б) замыкание электрической цепи, содержащей рабочий электрод, медиаторный слой и противоэлектрод,

в) приложение напряжения к замкнутой на шаге б) электрической цепи, измерение протекающего в результате тока и

г) определение аналита в пробе по результату измерения.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области инструментального контроля с использованием регистраций магнитных аномалий. Сущность изобретения заключается в том, что способ бесконтактного выявления месторасположения и степени опасности концентраторов механических напряжений в металле ферромагнитного сооружения содержит этапы, на которых осуществляют увеличение статистической информации на единицу длины обследуемой ферромагнитной конструкции.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен аппарат для электрофоретического разделения и блоттинга (варианты), система для электрофоретического разделения и блоттинга макромолекул, а также способ разделения и переноса макромолекул на мембрану для блоттинга после разделения.

Изобретение относится к области измерительной техники, а именно к устройствам для воспроизведения и передачи единиц массовой концентрации газов в жидких средах, предназначенных для поверки и калибровки анализаторов газов и других аналитических приборов, измеряющих содержание растворенных газов в жидкой среде.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ обнаружения конформационно измененной полимеразы нуклеиновой кислоты.

Изобретение относится к области микро- и наноэлектроники и может быть использовано при изготовлении газовых сенсоров нового поколения. Предложен способ изготовления газового сенсора, содержащего корпус, установленную в нем на основании гетероструктуру, в которой формируют газочувствительный слой на основе механоактивированого порошка оксида цинка, контактные площадки, соединенные с выводами корпуса, помещенными в изолятор, и штуцер, обеспечивающий контакт детектируемого газа с газочувствительным слоем.

Изобретение относится к области газового анализа, в частности к детектирующим устройствам, применяемым для регистрации и измерения различных веществ в газовой среде.

Изобретение относится к области измерительной техники и может быть использовано для измерения при помощи дифференциального датчика. Сущность: дифференциальный датчик содержит, по меньшей мере, два преобразователя, которые связаны с общим выходом датчика и выполнены с возможностью подачи на них сигналов возбуждения.

Изобретение относится к авиационной технике, в частности к беспилотным аппаратам вертолетного типа, входящим в состав робототехнических и дистанционно управляемых комплексов, предназначенных для выполнения различного вида работ в труднодоступных или опасных для здоровья человека условиях, например, для контроля состояния или выполнения ремонтных работ на линиях электропередач, в местах с высоким фоном радиоактивных излучений и др.

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано для измерения влажности сыпучих веществ. Устройство для измерения влажности сыпучих веществ содержит корпус, приемник - емкостный преобразователь влажности, состоящий из двух равных секций и содержащий общий электрод и два активных электрода равных площадей, электрическую измерительную схему, при этом один из активных электродов разделен на несколько электродов с самостоятельными выводами.

Изобретение относится к контролю неравномерной коррозии внутренней поверхности трубопроводов и может быть использовано в системах диагностики и защиты трубопроводов и оборудования от внутренней коррозии.

Группа изобретений относится к медицинской технике, а именно к способу программирования графических индикаторов глюкометра в системе для измерения гликемии. При этом устанавливают связь между глюкометром и компьютерным устройством.
Наверх