Микросферы гидролизованного крахмала с эндогенными заряженными лигандами

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтической промышленности, в частности к биоразлагаемой микросфере для обеспечения гемостаза и адгезии тромбоцитов с диаметром 10-2000 мкм, содержащей поперечно сшитый гидролизованный крахмал, связанный с по меньшей мере одним типом лиганда посредством сложноэфирной связи, образованной гидроксильной группой глюкозного фрагмента крахмала и карбоксильной группой лиганда, при этом в среднем 0,05-1,5 лиганда связано с каждым глюкозным фрагментом крахмала, где лиганд является эндогенной положительно заряженной молекулой с молекулярной массой менее 1000 Да, содержащей по меньшей мере одну функциональную аминогруппу, и выбран из аминокислот и азотсодержащих органических кислот. Также предложены применение указанной микросферы в гемостазе и способ осуществления гемостаза путем введения эффективного количества предложенных микросфер млекопитающему, имеющему кровоточащую рану. Группа изобретений обеспечивает первичный и продолжительный гемостаз, а также тромбоцитостимулирующий эффект. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 5 ил.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к биоразлагаемым микросферам гидролизованного крахмала с эндогенными заряженными лигандами, присоединенными к нему. Изобретение также относится к материалу, состоящему из таких микросфер, а также к применению микросфер или материалов в гемостазе, заживлении ран, выращивании клеток и эмболизации сосудов.

Предпосылки изобретения

Крахмал, разветвленный полимер глюкозы (состоящий из глюкозных цепочек с α4-связями, соединенных с разветвленными участками с α6-связями), является природным веществом, содержащимся в растениях и животных, где он выполняет функцию накопителя энергии. Полимер состоит из амилозы (состоящей из длинных цепочек и слаборазветвленной) и амилопектина (сильноразветвленного и состоящего из коротких цепочек).

Разлагаемые микросферы крахмала (DSM) образованы из поперечно сшитых цепочек крахмала. Разлагаемые микросферы крахмала применяют для временной окклюзии сосудов, также с одновременным введением цитотоксических препаратов и без него (лечение опухолей и профилактика кровотечений) в течение многих лет, а также используют для местного и интраоперационного гемостаза.

Микросферы крахмала разлагаются in vivo амилазой плазмы на олигосахариды, мальтозу и, в конечном итоге, на глюкозу, которая участвует в нормальном метаболизме.

Микрочастицы крахмала или модифицированного крахмала известны из уровня техники, например, в документах US 6060461 и WO 2009/091549, т.е. для биосовместимого гемостаза.

Кроме того, документ U.S. 3812252 относится к гидролизованному крахмалу и его применению для лечения ран, в том числе хронических.

Заживление раны является сложным процессом, при котором кожа или другой орган восстанавливается после травмы. Классическая модель заживления раны делится на четыре последовательных, но пересекающихся, этапа: (1), кровоостанавливающий (гемостатический), (2) воспалительный, (3) пролиферативный, (4) реконструктивный.

Гемостаз является основным этапом в процессе заживления ран, в результате которого останавливается процесс кровотечения. Через несколько минут после повреждения кожи или другого органа, кровяные тельца (тромбоциты) активируются и агрегируются в месте повреждения для формирования фибринового сгустка.

Когда происходит повреждение эндотелия, эндотелиальные клетки перестают тормозить свертывание и начинают выделять факторы свертывания крови, которые вызывают гемостаз после травмы. Гемостаз состоит из трех основных этапов: 1) сужение сосудов, 2) временное блокирование тромбом, и 3) свертывание крови путем преобразования фибриногена в фибрин и образование сгустка, который закупоривает отверстие, пока ткани восстанавливаются.

В воспалительной фазе бактерии и инородные тела фагоцитируются и удаляются, и факторы, вызвавшие миграцию и деление клеток, участвуют в пролиферативной фазе.

Приблизительно через 2-3 дня фибробласты начинают входить в область раны, отмечая наступление пролиферативной фазы еще до того, как воспалительная фаза закончилась. Эта фаза характеризуется ангиогенезом, отложением коллагена, формированием грануляционной ткани, эпителизацией и сокращением раны. При ангиогенезе образуются новые кровеносные сосуды, необходимые для подачи кислорода и питательных веществ к месту раны для поддержки поздних стадий заживления раны. Одновременно фибробласты начинают накапливаться в месте раны, их количество достигает пика через 1-2 недели после травмы. До конца первой недели, фибробласты являются основными клетками в ране.

В первые 2-3 дня после повреждения, фибробласты, главным образом, пролиферируют и мигрируют, при этом позже они являются основными клетками, которые выстилают коллагеновую матрицу в месте раны. Изначально фибробласты используют фибриновый струп, образованный во время воспалительной фазы, чтобы мигрировать сквозь него, прилипая к фибронектину. Фибробласты затем накапливают основное вещество на дне раны, а потом коллаген, к которому они могут прилипнуть для миграции. Грануляционная ткань, растущая из основания раны, начинает созревать в ране уже во время фазы воспаления, и продолжает расти, пока дно раны не будет покрыто. Грануляционная ткань состоит из новых кровеносных сосудов, фибробластов, воспалительных клеток, эндотелиальных клеток, миофибробластов и из компонентов новой, временной внеклеточной матрицы. Реэпителизация эпидермиса происходит, когда эпителиальные клетки пролиферируют и "ползут" поверх дна раны, обеспечивая покров для основной новообразованной ткани.

Выращивание клеток - это процесс, при котором клетки выращиваются в контролируемых условиях. Историческое развитие и способы выращивания клеток тесно переплетены с таковыми для выращивания тканей и органов. Выращивание клеток - это процесс, при котором клетки выращивают в контролируемых условиях. Выращивание клеток животных стало обычной лабораторной методикой в середине 1900-х годов, но концепция сохранения живых клеточных линий, отделенных от их первоначальной ткани была открыта в 19-м веке. Выращивание ткани заключается в росте тканей и/или клеток отдельно от организма. Это, как правило, поддерживается с применением жидкой, полутвердой или твердой среды для роста, такой, как бульон или агар. В этом описании выращивание клеток и выращивание тканей будут использоваться, как синонимы.

Некоторые клетки естественно обитают в суспензии, не привязываясь к поверхности, такие как клетки, которые существуют в кровотоке. Такие клетки могут быть выращены в суспензии. Однако, большинство клеток, полученные из твердых тканей зависимы от опорной точки, так называемые прилипающие клетки. Для прилипающих клеток необходима поверхность, такая, как пластиковая подложка для выращивания ткани или микроносители, чтобы расти дальше. Микроносители для выращивания прилипающих клеток доступны, как, например, микросферы декстрана. Когда прилипающие клетки собирают или пассируют (транспорт субкультуры), клетки должны быть отделены от поверхности, где они выросли. Обычно это делается путем добавления смеси трипсин-EDTA к культуре.

Эмболизация (закупорка) сосудов используется в качестве минимально инвазивной альтернативой хирургии. Целью эмболизации является предотвращение притока крови к области тела, создавая ишемию, которая может эффективно уменьшить опухоль или блокировать аневризмы.

Процедуру проводят, как эндоваскулярную процедуру, консультант рентгенологи в интервенционном кабинете. Общепринято, что для большинства пациентов, чтобы лечение проводилось с небольшим или нулевым седативным эффектом, хотя это во многом зависит от органа подвергающегося эмболизации.

Доступ к органу достигают посредством проволочного направителя и катетера (катетеров). Применяемая искусственный эмболия является, как правило, одним из следующих способов: в виде металлической спирали, гидроспирали, частиц, пены или затора.

Средства, применяемые при эмболизационной терапии, такие, как жидкие эмболические средства, которые могут течь через сложные сосудистые структуры. Примеры этого: этиодол, приготовленный из йода и макового масла, который является очень вязким веществом и обычно используется для хемоэмболизации, особенно при гепатомах; склеротирующие средства, которые укрепляют эндотелиальную выстилку сосудов и этанол.

Дисперсные эмболические средства также используются для эмболизации прекапиллярных артериол и мелких артерий. Gelfoam® временно закупоривает сосуды на 5 недель. Микросферы - широко применяемые средства, как для щадящей эмболизации, так и для хемоэмболизации. Поливиниловый спирт (PVA) и микросферы акриложелатина не разлагаются /л-vivo, поэтому они постоянно находятся в пациенте. В зависимости от ситуации применяют микросферы различных размеров, в диапазоне от приблизительно 50 мкм до приблизительно 1,2 мм в диаметре.

Сущность изобретения

В некоторых случаях оно может представлять интерес для изменения свойств биоразлагаемых микросфер крахмала. Настоящее изобретение предлагает способы изменения биоразлагаемости биоразлагаемых микросфер крахмала; близости биоразлагаемых микросфер крахмала к биологическим системам и/или его компонентам; степени набухания биоразлагаемых микросфер крахмала; скорости набухания биоразлагаемых микросфер крахмала; сжимаемости/эластичности биоразлагаемых микросфер крахмала и/или селективности химического взаимодействия с ионами и молекулами в/на биоразлагаемых микросферах крахмала. Биологические системы и/или их компоненты, описанные выше, могут составлять, например, орган или клетку или их компоненты; бактерии; вирусы; белки и ферменты; полисахариды; липиды; малые молекулы и/или ионы.

Таким образом, настоящее изобретение относится к биоразлагаемой микросфере диаметром 10-2000 мкм, содержащей поперечно сшитый гидролизованный крахмал, с которым через связь через группу сложного эфира карбоновой кислоты связан по меньшей мере один тип лиганда, где указанный лиганд является эндогенной заряженной молекулой с молекулярной массой менее 1000 Да, содержащей по меньшей мере одну дополнительную функциональную группу карбоновой кислоты и/или по меньшей мере одну функциональную аминогруппу, и где в гидролизованном крахмале в среднем 0,05-1,5 лиганда связано с каждым глюкозным фрагментом.

Настоящее изобретение также относится к различным применениям и приложениям этой микросферы.

Описание изобретения

Микросферы, согласно изобретению, включают поперечно сшитый крахмал, подвергнутый кислотному гидролизу. Микросферы могут быть получены из крахмала, подвергнутого кислотному гидролизу, путем эмульгирования раствора крахмала в органический растворитель, такой как толуол или дихлорэтан. Полиглюкозные цепи поперечно сшиваются сшивающим реагентом, таким, как эпихлоргидрин, образуя эфирные связи с глицерином (1,3-диокси-пропан-2-ол), как показано ниже, формируя разлагаемые микросферы крахмала (DSM).

DSM разлагаются in vivo амилазой на олигодекстрины и, в конечном итоге, на глюкозу. Поперечные сшивки остаются в олигосахаридах переменного размера. Судьба их in vivo все еще неизвестна, но вполне вероятно, что они либо выводятся с мочой или фильтруются из ретикулоэндотелиальной системы и распадаются.

Микросферы являются биологически разлагаемыми, определенными, как материал, который разлагается и/или метаболизируется и выводится из организма в физиологических (in vivo) условиях. В этом случае физиологические (in vivo) условия охватывают животных, в частности, позвоночных и более конкретно млекопитающих.

По сути, биоразлагаемые микросферы крахмала полностью распадаются и выводятся из их физиологической среды, такой, как человеческое тело. В зависимости от назначения, микросферы приспособлены распадаться в определенное время, подходящее для использования по назначению. Это время может варьироваться от нескольких минут до 3 месяцев, более предпочтительно до 1 месяца.

Размер биоразлагаемых микросфер, согласно изобретению, находится в микромасштабе, а точнее от 10 мкм до 2000 мкм.

Свойства DSM могут быть изменены путем присоединения лигандов к DSM, и, в частности, к гидроксильным группам глюкозы. Свойства DSM зависят от выбора лигандов, а также от числа лигандов, присоединенных к крахмалу.

Лиганды присоединены к DSM через сложноэфирную связь к глюкозным мономерам DSM. Для того чтобы присоединение лигандов к гидролизованному крахмалу через эту сложноэфирную связь было возможным, лиганды должны содержать по меньшей мере одну карбоксильную группу, то есть по меньшей мере одну -СООН группу, способную образовывать сложноэфирную связь. Сложноэфирная связь может подвергаться химическому или ферментативному гидролизу in vivo, а использование таких связей приводит к биоотделяемым лигандам.

Кроме того, лиганды должны быть эндогенными веществами, которые заряжены при физиологических значениях рН, т.е. при рН 6-8. В дополнение к функциональной группе карбоновой кислоты, используемой для осуществления присоединения лиганда к гидролизованному крахмалу через связь через группу сложного эфира карбоновой кислоты, лиганды должны содержать по меньшей мере одну дополнительную группу карбоновой кислоты и/или по меньшей мере одну первичную, вторичную, третичную или четвертичную функциональную аминогруппу. Поскольку лиганды являются эндогенными соединениями, DSM, таким образом, распадаются на эндогенные соединения, которые метаболизируются и/или выводятся.

Лиганд может, таким образом, быть положительно заряженным, отрицательно заряженным или цвиттер-ионом, т.е. как положительно, так и отрицательно заряженным одновременно. Лиганды могут также иметь неполярные (гидрофобные) части для дальнейшего изменения свойств DSM. Далее, можно использовать смесь различных лигандов.

Заряженные лиганды требуют противоионы. Когда лиганд положительно заряжен, противоион будет отрицательно заряжен, а когда лиганд отрицательно заряжен, противоион будет положительно заряжен. Этот противоион может быть физиологически активным противоионом. Если лиганд цвиттер-ионный, он содержит в себе свой собственный противоион.

Эндогенные лиганды должны быть, кроме того, малыми молекулами с молекулярной массой менее 1000 Да.

С каждым глюкозным фрагментом в DSM в среднем 0,05-1,5 лиганда может быть связано в соответствии с изобретением. Молярное отношение лиганда к глюкозе, таким образом, от 1,5:1 до 1:20 в DSM.

Лиганд может быть выбран из группы, состоящей из аминокислот, других азотсодержащих органических кислот и двухосновных кислот.

Лиганды, которые могут быть предпочтительнее для некоторых вариантов осуществления изобретения приведены в таблице 1.

В таблице 1 показаны предпочитаемые лиганды. R в структурных формулах - мономер глюкопиранозила, приведенного ниже, в гидролизованном крахмале. R² представляет собой лиганд в любых возможных позициях - 2,3 и/или 6 - в глюкозном фрагменте DSM, как приведено ниже.

Описанная выше микросфера может быть применена в гемостазе, заживлении раны, выращивании клетки in vitro и эмболизации сосудов. Описанная выше микросфера может также быть применена для производства биоразлагаемого материала, пригодного для применения при заживлении раны.

Эти различные приложения обсуждается ниже. Гемостаз

В некоторых вариантах осуществления для применения в гемостазе лиганды, присоединенные к микросферам, предпочтительно положительно заряжены или цвиттер-ионные.

В некоторых вариантах осуществления лиганды, присоединенные к микросферам, предпочтительно положительно заряжены. Применяемый противоион, тогда, может быть эллаговой кислотой.

Для гемостаза микросферы, согласно изобретению, должны предпочтительно иметь средний диаметр от 10 мкм до 200 мкм.

При применении для гемостаза микросферы, согласно изобретению, могут быть добавлены на/в рану в виде порошка, раствора или прикреплены к поддерживающей структуре, такой, как марля.

Заживление раны

Микросферы могут применять для производства материала для заживления раны. Этот материал должен иметь трехмерную структуру, состоящую из микросфер и пустот между микросферами.

Благодаря пустотам материал будет проницаемыми для газов и жидкостей и, таким образом, не гелеобразующим при контакте с жидкостями.

Тот факт, что материал является не гелеобразующим материалом означает, что можно избежать пленкообразующего слоя, когда материал применяется на/в ране, и, таким образом, что возможно предотвратить отек, собирающийся под слоем; способствовать эффективному транспорту кислорода и питательных веществ, а также допускается беспрепятственная миграция клеток и эффективная передача давления на или из основной ткани.

Микросферы в материале могут быть однородной фракцией. Для создания пустот между микросферами во многих случаях предпочтительно, чтобы микросферы в материале были достаточно гомогенными по размеру. Если микросферы должны быть неоднородными по размеру, пустоты будут заполнены более мелкими микросферами, создавая, тем самым, более прочную структуру, которая будет вредна для предусмотренного эффекта материала. Если микросферы из гомогенной части фракции, то размер микросфер должен, по меньшей мере, для некоторых вариантов осуществления, различаться не более чем на ± 15% от среднего. Например, во фракции микросфер 300 мкм, отдельные микросферы могут быть от 255 до 345 мкм. Размер пустот, т.е. пространство между ближайшими сферами одинакового размера, упакованных вместе, может быть рассчитан, как ((2/квадратный корень из 3)-1)≈0,155 диаметра микросферы.

Материал может состоять из одной части твердой пористой трехмерной сетки.

Микросферы могут быть прикреплены к основе подложки, тем самым иммобилизируя микросферы. Такая основа может быть обычной марлей или полимерным пенным материалом.

По меньшей мере, для некоторых вариантов осуществления для применения при заживлении ран, лиганды, присоединенные к микросферам, предпочтительно, положительно заряжены.

По меньшей мере, для некоторых вариантов осуществления для применения при заживлении ран, лиганды, присоединенные к микросферам, предпочтительно, положительно заряжены и гидрофобны.

Для заживления ран микросферы, согласно изобретению, предпочтительно, имеют средний диаметр от 200 мкм до 2000 мкм.

Предпочтительно, пустоты в материале имеют диаметр от 30 мкм до 300 мкм, а более предпочтительно от 100 мкм до 300 мкм. Пустоты должны быть хотя бы 30 мкм, поскольку это дает возможность прохождению клеток тканей и пучков нервных клеток, которые, как правило, 20-30 мкм в диаметре.

Кроме того, характеристика поверхности материала стимулирует адгезию и пролиферацию клеток. Это включает в себя сродство клетки к поверхности материала и подходящую для прилипания упругость материала.

Биоразлагаемый материал, пригодный для заживления ран, согласно изобретению, в частности, повышает присоединяемость клетки, миграцию и пролиферацию, в стандартном уходе по заживлению ран, или в процедуре NPWT (лечения ран отрицательным давлением) специально для третьей и четвертой фаз процесса заживления ран, а именно пролиферативной и реконструктивной фаз.

Трехмерная структура биоразлагаемого материала, пригодного для заживления ран, согласно изобретению, уменьшает образование рубцовой ткани. Понимая, что рубцовая ткань характеризуется скорее однонаправленным отложением коллагена, матрица, которая в состоянии воздействовать на неупорядоченное отложение коллагена, вероятно должна снижать образование рубцов. В совокупности, этот материал, в соответствии с настоящим изобретением, стимулирует и способствует постоянному росту новой и здоровой грануляционной ткани.

В заживлении раны может быть полезным замедлить биоразлагаемость материала на от 2 дней до 2 недель, выбрав соответствующий (соответствующие) лиганд (лиганды). Это дает возможность достаточного исцеления без необходимости смены повязки, если это не является необходимым по иным причинам.

При применении в заживлении ран или уходе за раной материал, согласно изобретению, может быть добавлен на/в рану в виде порошка, раствора, приклеенного к структуре основы, такой, как марля или твердая цельная сеть.

Материал согласно изобретению может также являться частью повязки на ране.

Было показано, что при нанесении 2 мм слоя негелеобразующих биоразлагаемых сфер крахмала со средним диаметром 200 мкм с положительно заряженной поверхностью на дно раны получается очень хорошая грануляция с ростом клеток до 500 мкм в течение четырех дней.

Выращивание клеток in vitro

Для применения в выращивании клеток in vitro, микросферы предпочтительно имеют средний диаметр от 200 до 1000 мкм, более предпочтительно от 200 до 500 мкм.

Для некоторых вариантов осуществления для выращивания клеток in vitro, лиганды, предпочтительно, положительно заряжены.

Пустоты важны для клеточных культур, поскольку они позволяют эффективное прохождение для прилипающих и растущих клеток, а также позволяют создать эффективную транспортировку матрицы роста и более крупных молекул в культуре.

Эмболизация сосудов

Для эмболизации сосудов, микросфера, согласно изобретению, предпочтительно имеет средний диаметр от 10 до 1200 мкм.

Для применения в эмболизации сосудов, лиганды присоединенные к микросферам, предпочтительно отрицательно заряженными, по меньшей мере, в некоторых вариантах осуществления.

Отрицательный заряд может быть использован, чтобы ионно связать катионный цитостатический препарат, который затем составляет противоион, для лечения опухолей. Такие цитостатические препараты включают в себя доксорубицин, иринотекан, топотекан, эпирубицин, митомицин, цисплатин и сорафениб.

Микросферы, согласно любому из вариантов осуществления изобретения, как описано выше, и, как указано в формуле изобретения, могут применяться в способах повышения, содействия или проведения гемостаза, заживления ран и/или эмболизации сосудов. Кроме того, материал по любому из вариантов осуществления изобретения, как описано выше, и, как указано в формуле изобретения, может быть применен в способе для облегчения или проведения заживления ран.

Микросферы или материал, соответственно, затем вводится в количестве, эффективном для млекопитающих, таких как человек, нуждающийся в гемостазе, заживлении раны и/или эмболизации сосудов. Это может быть человек, страдающий от кровотечения раны или некоторых других видов ран, внутренних, или внешних, таких, как на коже.

Под "введением" подразумевается, что микросферы или материал, согласно изобретению, вводят в контакт с участком, где гемостаз, заживление раны и/или эмболизация сосудов необходимы. В случае ранения, в целях гемостаза и заживления раны, материал может, например, быть помещен в полость раны или на ее поверхность. В случае заживления раны, DSM могут быть представлены в виде порошка, суспензии или мази. В случае гемостаза, DSM могут быть применены в виде сухого порошка или включены в марлю или в подкладку. В случае эмболизации DSM предпочтительно суспендированы в подходящей среде, такой как физиологический раствор.

В этом контексте "эффективное количество" означает количество, которое будет иметь положительное влияние на гемостаз, заживление ран и/или эмболизацию сосудов.

Микросферы, согласно изобретению, также могут быть использованы в способах повышения, содействия или проведения in vitro выращивания клеток. Микросферы, согласно изобретению, можно добавить к подходящей среде для выращивания. Клетки для выращивания также добавляют к этой среде. Микросферы можно добавить к среде для выращивания одновременно с клетками, перед добавлением клеток или после добавления клеток. Затем клетки оставляют размножаться. Как объяснялось выше, выращивание клеток в этой спецификации также включает выращивание ткани.

Микросферы, согласно любому из вариантов осуществления изобретения, как описано выше, и, как указано в формуле изобретения, могут быть дополнительно использованы в повышении, облегчении или осуществлении гемостаза, заживлении ран и/или эмболизации сосудов.

Микросферы, согласно любому из вариантов осуществления изобретения, как описано выше, и, как указано в формуле изобретения, могут применяться для получения медицинского устройства или фармацевтической композиции.

Микросферы, согласно любому из вариантов осуществления изобретения, как описано выше, и, как указано в формуле изобретения, могут быть произведены специально для использования в повышении, облегчении или осуществлении гемостаза, заживлении ран и/или эмболизации сосудов.

Везде в описании и формуле изобретения, слова "включать" и "содержать", и вариации слов, например, "включая" а "содержит", означает "включая, но не ограничиваясь", и они не предназначены для исключения других фрагментов, добавок, компонентов, целых или стадий.

Везде в описании и формуле изобретения в этой спецификации, единственное охватывает множественное число, если только контекст не требует иного. В частности, если единственное число используется в описании, должно быть понятно, что рассматривают множественное так же, как и единственное, если контекст не требует иного.

Признаки, целые, характеристики, соединения, химические фрагменты или группы, описанные в сочетании с определенным аспектом, вариантом осуществления или примером изобретения, следует понимать как применимые к любому другому аспекту, варианту осуществления или примеру, описанному здесь, если только они совместимы с ними.

Краткое описание графических материалов

Изобретение более подробно описано ниже в примерах, которые ссылаются на графические материалы, где:

На фиг. 1 представлены схематический рисунок разлагаемой микросферы крахмала (DSM) и химические модификации, осуществленные в данном исследовании.

На фиг. 2 представлено, что набухание микросфер можно считать подчиняющимся диффузии Фика с начальной высокой скоростью набухания, которая экспоненциально убывает:

где k = константа набухания первого порядка, и Y_∞ = увеличение объема при максимальном набухании.

На фиг. 3 представлена адгезия тромбоцитов. На фиг. 3А представлены фазовый контраст и флуоресцентные микрофотографии, показывающие DSM и прикрепленные к DSM тромбоциты в соответствии с различно модифицированными партиями. Фиг. 3В представлены крупным планом сочленение между двумя агрегированными DSM (партия 4) и агрегатами тромбоцитов, прикрепленных к DSM. Изображено с применением микроскопии дифференциального интерференционного контраста (DIC).

На фиг. 4 представлено in vivo изучение трех партий DSM. Партии 5, 6 и 9 были оценены на экспериментальной модели кровотечения (почечная травма) на крысах, у которых не свертывалась кровь. У всех животных, обработанных партией 9, имел местопервичный гемостаз, у 29% было повторное кровотечение в течение 20 мин наблюдения. Другие партии продемонстрировали значительно меньшую гемостатическую эффективность, только у некоторых животных был достигнут первичный гемостаз.

На фиг. 5 представлена кровопотеря в соответствии с партией для обработки в экспериментальных исследованиях in vivo. Потерю крови измеряли взвешиванием излишней крови, собранной в марлю. Была значительная разница в потере крови между различными партиями (р=0,001), где партия 5 была немодифицированными DSM, партия 6 доказала активацию коагуляции и DSM в партии 9 с адсорбировали тромбоциты.

Примеры

Разлагаемые микросферы крахмала (DSM) были подготовлены эмульгированием поперечным сшиванием гидролизованного крахмала с эпихлоргидрином в толуоле. DSM впоследствии неоднократно промывали с этанолом, затем дистиллированной водой и, наконец, последовательно обезвоживали с увеличением концентрации этанола и сушили в течение ночи при 60°С.

Детали приготовления DSM

2 г гидроксида натрия растворяют в 280 мл очищенной воды и 2 г боргидрида натрия добавляют и растворяют. 153 г гидролизованного крахмала растворяют при медленном перемешивании в течение по меньшей мере 2 часов. 20 г поверхностно-активного вещества (Rhodafac РА17) растворяют в 450 г толуола. Раствор крахмала затем добавляют и эмульгируют в растворе толуола, температуру повышают до 70°С и эмульсию перемешивают до получения желаемого распределения капель по размерам. 22 г эпихлоргидрина добавляют и поперечное сшивание производят в течение 5 часов. Смесь охлаждают до комнатной температуры и ему дают отстояться, после чего супернатант декантируют.DSM подвергают тройной промывке 95%-ным этанолом, одной промывке 0,8%-ной уксусной кислотой, затем 4 промывкам очищенной водой и, наконец, обезвоживают абсолютным этанолом перед сушкой при 60°С в вентилируемом сушильном шкафу.

Определение степени замещения (DS)

Степень замещения определяют, как среднее число замещений в глюкозном мономере.

Метод щелочного омыления, с последующим титрованием избытка щелочи, использовали для определения степени замещения. К образцу 250 мг DSM добавили 10 мл 0,50 М NaOH, и оставили при комнатной температуре на 72 ч, периодически встряхивания. Избыток NaOH оттитровали 0,50 М HCl с применением фенолфталеина в качестве индикатора.

Определение разлагаемости амилазой

Образец DSM (3-6 мг) разбавили фосфатным буфером, рН=7 (5 мл), а затем добавили 400 мкл слюны человека, потом инкубация при 37°С в течение 4 часов. Образец выдерживали в течение 20 мин или центрифугировали, а затем небольшой образец брали со дна и анализировали под микроскопом, чтобы определить наличие или отсутствие микросфер.

Общая методика замещения DSM двухосновными кислотами (примеры, перечисленные в таблице 1)

DSM (1 г) суспендировали в DMF (10 мл), к этой смеси добавляли ангидрид янтарной кислоты (154 мг, 1,54 ммоль) и пиридин (124 мкл, 1,60 ммоль). Смесь перемешивали и нагревали до 90°С в течение ночи, а затем материал промывали трижды 40 мл этанола, потом 5 мл насыщенного раствора NaHCO₃, а затем трижды 30 мл воды. Материал обезвоживали этанолом и высушивали в сушильном шкафу при температуре 60°С. Этот материал проанализировали с помощью ИК-спектроскопии при идентификации карбонила сложноэфирной группы при длине волны 1730 см^-1.

DS: 0,25 (определяли, как описано выше).

Разрушаем α-амилазой (определяли, как описано выше).

Общая методика замещения DSM сложными эфирами

Модификация бетаином

Бетаин (1,66 г, 10,8 ммоль) и CDI (1,75 г, 10,8 ммоль) смешали с 50 мл DFM и нагрели до 80°С в течение 2 часов. Затем добавили DSM (5 г) и повысили температуру до 90°С, смесь перемешивали в течение ночи. Смесь промывали этанолом (250 мл) два раза, разбавленной соляной кислотой (250 мл) и два раза водой (250 мл). Материал обезвоживали этанолом и высушивали в течение ночи при температуре 60°С.

Использование ИК-спектроскопии (FTIR) с идентификацией карбонила сложноэфирной группы при длине волны 1751 см^-1.

DS: 0,23 (определяли, как описано выше).

Разрушаем α-амилазой (определяли, как описано выше).

Модификация диметилглицином

Как в примере с бетаином выше, но применяли DSM (2 г), N,N-диметилглицин гидрохлорид (430 мг, 3,1 ммоль) и CDI (500 мг, 3,1 ммоль).

Использование ИК-спектроскопии (FTIR) с идентификацией карбонила сложноэфирной группы при длине волны 1753 см^-1.

DS: 0,24 (определяли, как описано выше).

Разрушаем α-амилазой (определяли, как описано выше).

Модификация N_a-ацетил-L-аргинином

Как в примере с бетаином выше, но применяли DSM (2 г), N_α-ацетил-L-аргинин (623 мг, 2,5 ммоль) и CDI (400 мг, 2,5 ммоль). Использование ИК-спектроскопии (FTIR) с идентификацией карбонила сложноэфирной группы при длине волны 1748 см^-1.

DS: 0,24 (определяли, как описано выше).

Разрушаем α-амилазой (определяли, как описано выше).

Модификация пролином

Как в примере с бетаином выше, но применяли DSM (1 г), Вос-Pro-ОН (266 мг, 1,2 ммоль) и CDI (200 мг) с последующим снятием защиты с третбутилоксикарбонила с помощью трифторуксусной кислоты (TFA).

Использование ИК-спектроскопии (FTIR) с идентификацией карбонила сложноэфирной группы при длине волны 1743 см^-1.

Разрушаем α-амилазой (определяли, как описано выше).

Модификация глицином

Как в примере с бетаином выше, но применяли DSM (1 г), Boc-Gly-OH (216 мг, 1,2 ммоль) и CDI (200 мг) с последующим снятием защиты с третбутилоксикарбонила с помощью трифторуксусной кислоты.

Использование ИК-спектроскопии (FTIR) с идентификацией карбонила сложноэфирной группы при длине волны 1748 см^-1.

Разрушаем α-амилазой (определяли, как описано выше).

Модификация фенилаланином

Как в примере с бетаином выше, но применяли DSM (1 г), Boc-Phe-OH (327 мг, 1,2 ммоль) и CDI (200 мг) с последующим снятием защиты с третбутилоксикарбонилас помощью трифторуксусной кислоты.

Использование ИК-спектроскопии (FTIR) с идентификацией карбонила сложноэфирной группы при длине волны 1743 см^-1.

Разрушаем α-амилазой (определяли, как описано выше).

Неотщепляемые поверхностные модификации, применяемые в исследовании зарядовых эффектов

Модификации поверхности показаны на фиг. 1.

Октенилсукцинат (отрицательный и гидрофобный)

80 г DSM суспендировали в очищенной воде, N-октенил ангидрид янтарной кислоты (Pentagon) добавляли к 0,08 г/г сухих DSM и реакция продолжалась еще в течение 3 часов. рН поддерживали выше 7,4 добавлением 0,75 М NaOH. Полученный материал промывали 8 раз 2000 мл очищенной воды, а затем обезвоживали этанолом с увеличением концентрации этанола и наконец сушили в течение ночи при 60°С (Hui Rea. Preparation and properties of octenyl succinic anhydride modified potato starch. Food Chemistry2009; 114:81-6).

Карбоксиметилирование (негативное)

50 г DSM суспендировали в очищенной воде; хлоруксусную кислоту добавляли к 0,1 г/г сухих DSM и реакция продолжалась в течение 5 ч при температуре 70°С. Перед добавлением хлоруксусную кислоту растворяли в воде и нейтрализовали 1 М NaOH. Полученный материал промывали 6 раз 2000 мл очищенной воды, а затем обезвоживали этанолом с увеличением концентрации этанола и наконец сушили в течение ночи при 60°С (Tomaski Р, Schilling, С.Н. Chemical modificationg of starch. Adv Carbohydr Chem Biochem 2004; 59:175-403).

Ацетилирование (гидрофобное)

50 г DSM суспендировали в очищенной воде, уксусный ангидрид добавляли к 0,05 г/г сухих DSM. Ангидрид уксусной кислоты добавляли по каплям и рН поддерживали между 7,3 и 7,8 добавлением 0,75 М NaOH. Полученный материал промывали 7 раз 2000 мл очищенной воды, а затем обезвоживали с увеличением концентрации этанола и наконец сушили в течение ночи при 60°С (Sathe SK, Salunkhe, D.K. Isolation, Partial Characterisation and Modification of the Great Northern Bean (Phaseolus vulgaris L.) Starch. J Food Sci1981; 46:617-21).

Диэтиламиноэтилхлорид, Aldrich (положительный)

50 г DSM суспендировали в очищенной воде, 0,375 моль гидрохлорида DEAE добавляли и температуру повысили до 60°С. Добавляли 250 мл 3 М раствора гидроксида натрия и реакцию проводили при температуре 60°С в течение одного часа. После DSM промывали 20 л очищенной воды на воронке Бюхнера. После DSM обезвоживали и сушили, как указано выше (Manousos М, Ahmed М, Torchio С, Wolff J, Shibley G, Stephens R, et al. Feasibility studies of oncornavirus production in microcarrier cultures. In Vitro1980 Jun; 16(6):507-15).

Эллаговая кислота (адсорбированная/абсорбированная отрицательно)

Эллаговая кислота (Alfa Aesar) была пассивно адсорбирована с применением двух различных способов. Способ 1: 0,1 мМ эллаговой кислоты растворяли в воде и затем смешивали с DSM. Способ 2: 0,1 мМ эллаговой кислоты растворяли в этаноле, а затем смешивали с DSM (Ratnoff OD, Saito Н. Interactions among Hageman factor, plasma prekallikrein, high molecular weight kininogen, and plasma thromboplastin antecedent. Proc Natl Acad Sci USA 1979 Feb; 76(2):958-61). Промывка и осушка, как указано выше. Эллаговая кислота положительно адсорбирована/абсорбирована, и не подходит для измерения заряда.

Различные поверхностные модификации произвели при помощи стандартных протоколов модификаций (не оптимизированных). Отобранные модификации для доказательства концепции кровоостанавливающего действия in vitro и in vivo не оценивали на предмет токсикологической приемлемости для людей.

Поверхностный заряд

Уровень поверхностного заряда измеряли на PCD 02, детекторе зарядов частиц .

Разработка

Девять различно измененных DSM перемещали случайным образом и убрали названия. Информацию о модификациях, не направляли исполнителям исследований.

Характеристика DSM

Морфологию микросфер крахмала определяли путем наблюдения в микроскоп (AxioObserver Z1, Zeiss), а диаметры сфер измеряли для по меньшей мере пяти в каждом из девяти партий. Абсорбцию определили путем измерения диаметра до и через определенные промежутки времени (1, 3, 9, 15 и 30 с) после добавления 100 мкл фосфатного буфера. По меньшей мере пять сфер из каждой партии измеряли, а их объем был рассчитан из предположения, что DSM были полностью сферическими. Набухание микросфер происходит за счет диффузии воды в полимер и его гидратации - процесс, который приводит к равновесию при максимальной релаксации поперечно сшитых цепей крахмала. Следовательно, можно предположить, что процесс диффузии подчиняется закону Фика с высокой начальной скоростью набухания, которая экспоненциально убывает. Данные, таким образом, могут быть описаны уравнением:

где k - константа набухания первого порядка и Y_∞ - увеличение объема при максимальном набухании.

In-vitro адгезия тромбоцитов

Для изучения возможного сродства/взаимодействия между различными партиями DSM и факторами известной значимости для процесса коагуляции, исследовали адгезию тромбоцитов к различным партиями DSM. 450 мкл гепаринизированной обогащенной тромбоцитами плазмы добавляли в пробирки, содержащие 1 мкг DSM, а затем перемешивали в орбитальном встряхивателе в течение 20 минут при 500 оборотах в минуту. После этого DSM тщательно промывали в PBS. неоднократно давая DSM осесть на дно и заменить супернатант на свежий PBS, а затем взболтать пробирку. Прилипающие к DSM тромбоциты затем фиксировали 3,7%-ным параформальдегидом PFA в натрий-фосфатном буфере PBS и пермеабилизировали с использованием 0,1% Triton-X в PBS, и, наконец, флуоресцентно окрашивали Alexa 546-фаллоидином. Тщательная промывка проводилась между каждым этапом в процедуре. Изображения DSM и флуоресцентных тромбоцитов были получены с помощью AxioObserver Z1 (Zeiss) флуоресцентного микроскопа и программного обеспечения AxioVision (Zeiss) для обработки изображений.

In vivo пробное исследование в экспериментальной модели почечного кровотечения

Исследование было проведено в соответствии с руководящими принципами надлежащей лабораторной практики и утверждено в Местном университетском комитете этики при экспериментах на животных. Три различных партии из DSM были выбраны на основе результатов лабораторных исследований in-vitro, описанных выше. Одну нейтральную партию, одну партию, которая активировала коагуляцию, и затем одну партию с адгезионными свойствами тромбоцитов выбрали для испытаний in-vivo. Исследователь, проводящий испытания, выбирал партии в случайном порядке и вслепую. Двадцать один взрослый аклиматизированый самец крысы линии Sprauge-Dawley (средний вес 342 г, iqr: 314-360), имевший свободный прием пищи и воды, находился под наркозом (Hynorm, Janssen Pharma, Belgium and Midazolam Hameln, Pharma Hameln, GmbH). После катетеризации яремной вены (для внутривенной инъекции) провели поперечную лапаротомию. Левую почку вскрыли почечные сосуды зажали на две минуты после внутривенной инъекции нефракционированного гепарина (UH, LEO Pharma A/S, Дания) 200 ме/кг. Затем, боковую треть почки резецировали и 1 мл выбранных вслепую DSM наносили на кровоточащуюповерхность почки, после чего перешли к ручному компрессу (марлевый компресс между порошком крахмала и пальцем исследователя), а зажим сосуда остановили. Компресс удерживали в течение 2 минут, а затем убрали для контроля гемостаза. Если происходило кровотечение, компресс накладывали и контролировали гемостаз каждую минуту. Первичный гемостаз был определен, когда имело место отсутствие видимых кровотечений в течение 20 минут из почечной резекции. Животные с гемостазом наблюдались еще 20 минут на предмет возможного повторного кровотечения. Всех животных подвергли эвтаназии с внутривенной инъекцией фенобарбитуровой кислоты и этанола. Потерянную кровь собрали и взвесили. Конечными точками исследования являются: способность к получению первичного гемостаза, время гемостаза, частота повторных кровотечений и потери крови.

Статистика

Данные для описания представлены средними значениями и отдельными или среднеквадратичными диапазонами (iqr). Непараметрический тест провели, так как распределение данных неравномерно. Критерий X² рассчитан по факторным таблицам и дисперсионный анализ Крускала-Уоллиса использовали для сопоставления непарных данных. Значимым считали значение р<0,05.

Пользовались программным обеспечением SPSS 17,0 для Mac и Windows (www.spss.com).

Результаты

Модификации DSM

Поверхностные заряды приведены в таблице 2. Процедуру синтеза не оптимизировали и карбоксиметилирование не привело к существенному поверхностному заряду. Ожидается, что ацетилированиене измененит поверхностный заряд, тогда как другие способы должны привести к значительным положительным и отрицательным поверхностным зарядам.

Характеристика крахмальных сфер

Существовала значительная разница в начальном диаметре между партиями (р=0,006), партией 6, в которой наименьший размер сфер (средний диаметр 54 мкм, iqr: 38-58), и партией 2 с наибольшим размером сфер (средний диаметр 72 мкм, iqr: 67-76). После добавления фосфатного буфера все партии быстро увеличились в объеме (фиг. 2), а после 30 с их объем увеличился в 5-25 раз по сравнению с начальным объемом (таблица 3). Величина набухания значительно отличается между партиями (р=0,001).

Стимуляция тромбоцитов

Была очевидна адгезия тромбоцитов к DSM в трех модифицированных партиях (№4, 7 и 9), в то время как остальная часть - партий DSM не влияет на тромбоциты вовсе (фиг. 3). Результаты были подтверждены использованием БоТП (PRP) от трех различных доноров.

Случайное и проводящееся вслепую пробное экспериментальное исследование на живом организме

У всех животных, получавших партию 9, имел местопервичный гемостаз, по сравнению с 14-43% случаев первичного гемостаза с другими партиями (фиг. 4). Время гемостаза также отличалось между группами (р=0,044), для получавших партию 9 животных оно меньше (в среднем 2 мин: iqr: 2-3:20), тогда как партия 6 требует в среднем 6 мин (n=3) и партия 5 требует в среднем 10 мин (n=1), прежде чем у них перекатилось кровотечение. Два животных, получавших партию 9, были единственными с повторным кровотечением (р=NS, по сравнению с другими партиями). Получавшие партию 9 животные имели меньшую потерю крови (в среднем 1 г, iqr: 0,4-1,2) по сравнению с другими партиями (партия 5: 5 г, 4,3-6,7, партия 6: 5,3 г, 2,2-8,6), р=0,001 (фиг. 5).

Постулируемое кровоостанавливающее действие DSM за счет поглощения жидкости (и малых молекул) из крови и концентрации эндогенных факторов свертывания крови на сферах может зависеть от быстрого и значительного набухания микросфер. Все партии в этом исследовании быстро увеличились в объеме после добавления фосфатного буфера, но и скорость и набухание в целом отличаются между составами. Набухание зависит от релаксации полиглюкозных цепей, когда они обезвоживаются. Это ограничено количеством поперечных сшивок и способствует отталкиванию заряженных лигандов. Однако, мы не смогли обнаружить никаких четких корреляций с измеряемой характеристикой (например, зарядом). Низкая поперечная сшиваемость и значительное и быстрое набухание ведут к быстрому распаду и, следовательно, увеличение объема не будет опасным, даже если применяется оперативно в местах, где пространство ограничено в конце процесса. В этом исследовании быстрая абсорбция жидкости и набухание DSM не было достаточным для гемостаза in vivo, только у 1 из 7 животных, принимавших немодифицированные микросферы, имел местопервичный гемостаз.

DSM с лучшим гемостатическим потенциалом in vivo показали такие же наилучшие тромбоцитостимулирующие свойства. Тромбоциты прилипали к положительно заряженным DSM, партии (4, 7 и 9), подготовленные с диэтиламиноэтилом (DEAE), что соответствует описанному прилипанию тромбоцитов к поверхности, имеющей положительный заряд (Lee JH, Khang G, Lee JW, Lee HB. Platelet adhesion onto chargeable functional group gradient surfaces. J Biomed Mater Res 1998 May;40(2): 180-6). He проводили объективной количественной оценки числа тромбоцитов, которые прилипли к соответствующей DEAE-модифицированной партии, но при оценке невооруженным взглядом не было явного различия в степени адгезии тромбоцитов между партиями 4, 7 и 9, даже если была измерена разница в зарядах между партиями 4 и 9. Диэтиламиноэтил (DEAE) хлорид вступает в реакцию с гидроксогруппами на поверхности DSM, создавая DEAE группы, которые положительно заряжены при физиологическом значении рН. DEAE лиганды делают микросферы неподдающимися биоразложению и, возможно, не пригодными для использования человеком. Тем не менее, в качестве доказательства правильности концепции отличить, может ли сфера стать пригодной для адгезиитромбоцитов, хотя это не имеет никакого клинического значения для гемостаза, DEAE-модификация была ценной. Быстрая и эффективная стимуляция тромбоцитов имеет решающее значение для быстрого гемостаза, осуществляемого природным тромбом из агрегированных тромбоцитов. Тромбоциты также необходимы для эффективного усиления и распространения тромбина - процесса сильно катализируемого поверхностью стимулированных тромбоцитов, давая в результате сеть фибрина, которая стабилизирует первичный тромб.

1. Биоразлагаемая микросфера для обеспечения гемостаза и адгезии тромбоцитов с диаметром, составляющим 10-2000 мкм, содержащая поперечно сшитый гидролизованный крахмал, с которым посредством сложноэфирной связи, образованной карбоксильной группой лиганда и гидроксильной группой глюкозного фрагмента в поперечно сшитом крахмале, связан по меньшей мере один тип лиганда, где указанный лиганд является эндогенной положительно заряженной молекулой с молекулярной массой менее 1000 Да, содержащей по меньшей мере одну функциональную аминогруппу, и где указанный лиганд выбран из группы, состоящей из аминокислот и азотсодержащих органических кислот, и где в гидролизованном крахмале в среднем 0,05-1,5 лиганда связано с каждым глюкозным фрагментом.

2. Микросфера по п.1, где лиганд представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аргинина, гистидина, лизина, глицина, пролина, аланина, изолейцина, лейцина, фенилаланина, триптофана, тирозина, валина, серина, аспарагина, глутамина, треонина, или азотсодержащую органическую кислоту, выбранную из группы, состоящей из бетаина, карнитина, креатина, метилглицина и диметилглицина.

3. Микросфера по п.2, где лиганд выбран из группы, состоящей из пролина, валина, фенилаланина, глицина, бетаина и диметилглицина.

4. Микросфера по п.1, где лиганд имеет физиологически активный противоион.

5. Микросфера по п.4, отличающаяся тем, что противоион представляет собой эллаговую кислоту.

6. Применение микросферы по любому из пп.1-5 в гемостазе, где микросфера имеет средний диаметр 10-200 мкм.

7. Применение по п.6, отличающееся тем, что лиганд имеет физиологически активный противоион, который представляет собой эллаговую кислоту.

8. Способ осуществления гемостаза путем введения эффективного количества микросфер по любому из пп.1-5 млекопитающему, имеющему кровоточащую рану.