Способ диагностики возбудителей острых респираторных вирусных инфекций

Изобретение относится к области биохимии, иммунологии и медицины, в частности к средствам диагностики острых респираторных вирусных инфекций. Раскрыт способ дифференциальной диагностики возбудителей респираторных вирусных инфекций, включающий: обработку лизирующим буферным раствором образца перед внесением в тест-систему; приготовление аналитической пробы — предварительное смешивание биологического образца и детектирующих моноклональных антител в конечной концентрации последних по 1 мкг/мл каждого; блокировку активных групп на подложке биочипа, представляющего собой белковый чип для одновременного определения в образце вируса гриппа А, вируса гриппа В Викторианской и Ямагатской линий, аденовируса, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 2 и 3 типов, содержащий моноклональные антитела к указанным вирусам, при этом белковый чип представляет собой подложку с активированными альдегидными группами или аминосилановую подложку, при этом блокировка проводится в два этапа; внесение и одностадийную инкубацию приготовленной аналитической пробы в биочипе; определение наличия вирусов в образце путём иммунофлуоресцентного анализа с установлением уровня флуоресценции. Изобретение обеспечивает упрощение процедуры анализа, сокращение времени постановки анализа, повышение чувствительности и специфичности метода одновременной детекции нескольких вирусов. 3 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 7 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биохимии, иммунологии и медицины, в частности, к средствам диагностики острых респираторных вирусных инфекций. Предлагаемое изобретение может найти применение в аналитической биохимии, иммунологии и медицине, в частности, при диагностике возбудителей острых респираторных вирусных инфекций в условиях стационара или амбулаторно.

Предшествующий уровень техники

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) - группа острых инфекционных заболеваний органов дыхания, главной особенностью которых является воздушно-капельный путь передачи. ОРВИ встречаются повсеместно и являются самыми распространёнными инфекционными заболеваниями, объединяющими грипп, парагрипп, респираторно-синцитиальную инфекцию, риновирусную и аденовирусную инфекции, а также другие инфекции, вызывающие катаральные воспаления верхних дыхательных путей.

В настоящее время проблема выявления и лечения ОРВИ стоит крайне остро. Так, в 2015 году было выявлено 17,2 миллиардов случаев ОРВИ во всём мире. По данным ВОЗ, в 2018-2019 гг., например, только заболеваемость вирусами гриппа типа А и В достигла 1 миллиарда, из которых от 3 до 5 миллионов представляют собой тяжёлые случаи, в результате которых от связанных с гриппом респираторных осложнений умерло от 290000 до 650000 человек. Вирусы гриппа типа А и В (ВГА и ВГВ) относятся к семейству Orthomyxoviridae. Указанные вирусы циркулируют в природных резервуарах, вызывая инфекцию у человека, птиц, многих видов млекопитающих, и являются причиной сезонных эпидемий и периодических пандемий, которые уносят миллионы жизней.

При этом, существуют и другие опасные для человека вирусы, например, аденовирус (АдВ), респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), вирусы парагриппа 2 и 3 типа (ВПГ). Следует отметить, что инфекции, вызываемые указанными вирусами, имеют сходную симптоматику. Например, вирус гриппа вызывает жар, головную боль, насморк (ринит), кашель, боль в теле или суставах. Подобные симптомы свойственны и в случае заболевания аденовирусом, и вирусами парагриппа. Это состояние может продолжаться 3-5 дней, при этом иммунитет может быть ослаблен, что приводит к осложнению в виде дополнительных инфекций бактериального или вирусного типа.

Клиническая картина при инфицировании вирусами, вызывающими ОРВИ, весьма похожа, однако для лечения, диагностики и прогноза течения заболевания существенное значение имеет определение патогена. Несмотря на то, что лечение ОРВИ в большинстве случаев ограничено применением средств симптоматической терапии, а также препаратами неспецифической профилактики, подтверждение диагноза у пациентов с тяжёлым течением позволяет проводить высокоэффективное специфическое противовирусное лечение (например, препаратами амантадинового ряда или озельтамивиром в случае подтверждения диагноза грипп). Наиболее распространённые вирусы, вызывающие ОРВИ: вирусы гриппа типа А и В, аденовирус, респираторно-синцитиальный вирус, вирусы парагриппа 2 и 3 типа - имеют разное строение, состав и жизненный цикл, что обуславливает выбор специфической терапии.

Таким образом, при сезонном вирусном заболевании для последующего успешного лечения желательно точно и быстро определить патоген, при этом, в случае ОРВИ принципиально важно, чтобы диагностика была проведена в кратчайшие сроки и включала в себя определение нескольких вирусов одновременно.

В настоящее время в качестве тест-систем распространены диагностические системы на основе биологических чипов (микрочипов, биочипов). В основе принципа работы белковых биочипов лежат те же принципы, что и у традиционных иммуноферментных методов (ИФА), однако формат биочипа позволяет одновременно детектировать сотни белков с использованием малых объёмов реагентов и образцов. Концепция и методология такого подхода заключается в том, что на твёрдую подложку в матричном порядке наносятся и иммобилизуются белки (антитела), способные к специфическому связыванию соответствующего антигена (вируса), с последующей визуализацией этого связывания.

Для визуализации связывания антитела с антигеном (аналитом) используют флуоресцентную метку, конъюгированную с антителами, так что интенсивность флуоресценции прямо пропорционально коррелирует с количеством антигена в исследуемом образце.

В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяют на:

- лизатные - в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

- рекомбинантные - в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;

- пептидные - использующие химически синтезированные фрагменты белков.

В современной литературе описаны многочисленные тест-системы, основанные на применении ИФА. Например, патент RU 2599890 описывает многопараметрическую диагностическую тест-систему, предназначенную для выявления рака молочной железы и рака яичников. Такая система содержит набор реагентов, биологический биочип для определения концентраций нескольких опухолеассоциированных антигенов: АФП, ХГЧ, РЭА, СА125, СА15-3 и СА19-9 в образце сыворотки крови человека, набор калибровочных проб в лиофилизованной форме, изготовленных на основе стабилизированной пулированной донорской сыворотки крови человека, состоящий из нескольких калибровочных проб, содержащих одновременно все анализируемые онкомаркеры, и нулевой калибровочной пробы, не содержащей указанных онкомаркеров и представляющей собой стабилизированную пулированную сыворотку здоровых доноров, абсорбированную на аффинных сорбентах, проявляющую систему, набор буферных растворов и инструкцию по проведению анализа.

Система включает набор для диагностики нескольких антигенов, при этом в качестве образца используется образец сыворотки крови человека. Биочип представляет собой микроматрицу, расположенную на поверхности подложки, состоящую из полусферических гелевых ячеек с ковалентно иммобилизованными антителами, каждое из которых специфично к одному из анализируемых онкомаркеров, причём в каждой отдельной ячейке иммобилизовано только одно индивидуальное вещество. Однако, данная система предназначена для выявления только онкоассоциированных маркеров и не предназначена для выявления вирусных заболеваний.

В патенте RU 2298796 описывается другая диагностическая система на основе биологического биочипа для параллельного определения множества показателей (шести опухолевых маркеров, в частности, AFP, CEA, PSA, свободного PSA, CA125, CA153). Система содержит смешанный раствор двух или более белков, приготовленный в определённых соотношениях концентраций и содержащий люминесцентные метки, т.е. реакционный раствор, серии смешанных растворов белков, которые должны быть определены, в известных и возрастающих концентрациях, т.е. стандартные образцы растворов, и раствор для промывки белковых чипов. Состав указанных стандартных образцов растворов включает 40-60% фетальной бычьей сыворотки, различные очищенные антигены в высоких концентрациях и 0,02-0,1‰ NaN₃ или фосфатно-солевой буферный раствор (KH₂PO₄-Na₂HPO₄) 0,05 M при рН 7,0-7,8, 2-30% БСА, 1,5-2,5% сахарозы, 0,02-0,1‰ NaN₃ и различные очищенные антигены в высоких концентрациях. Согласно примерам, данную систему также использовали для выявления онкомаркеров.

Патент US6881835 описывает тест-систему для определения ОРВИ на основе ПЦР с использованием специфичных нуклеиновых последовательностей.

Среди тест-систем для исследования образцов назофарингеальных мазков известны системы BINAX Now (производитель Alere Inc., Waltham, MA, США), Directigen EZ Flu A and B (производитель - Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, США) и другие. Однако, данные тест-системы представляют собой диагностикумы только для определения вирусов гриппа типа А и В и не позволяют определять другие вирусы.

Таким образом, существует потребность в быстром и точном определении типа вирусов, вызывающих острые респираторные вирусные инфекции, с минимальной обработкой исследуемого клинического образца, например, мазка из носовой полости.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает способ дифференциальной диагностики возбудителей острых респираторных вирусных инфекций, включающий анализ клинического образца (назофарингеального мазка), обработанного лизирующим раствором, с использованием биологического биочипа, на наличие в нём вирусов гриппа типа А и В, аденовируса, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 2 и 3 типа, содержащего высокоспецифичные моноклональные антитела к белкам указанных вирусов, при этом

- диагностический биочип представляет собой твёрдую подложку, содержащую альдегидные группы, посредством которых на поверхности биочипа иммобилизованы моноклональные антитела в концентрации 250 мкг/мл к вышеобозначенным вирусам;

- блокировка активных групп на подложке биочипа проводится в два этапа: восстановление активных альдегидных групп раствором, представляющим собой 0,4% NaHB₄, 20% этанол в ФСБ, и связывание возможных невосстановившихся альдегидных групп 1% БСА в 20 мМ Na₂HPO₄;

- анализ заключается в одностадийной одновременной инкубации образца (аналита) с детектирующими моноклональными антителами на поверхности биочипа; предварительно смешанные образец и детектирующие антитела представляют собой аналитическую пробу;

- концентрация детектирующих (биотинилированных) моноклональных антител в аналитической пробе составляет 1 мкг/мл;

- время инкубации белкового биочипа с аналитической пробой составляет 16 часов (в течение ночи). При таком времени инкубации предел обнаружения аналита для вируса гриппа А составляет не более 2 нг/мл, однако линейный диапазон, позволяющий количественно выявлять заявленный аналит (ВГА) будет узким, в пределах 2-8 нг/мл. Значения свыше 8 нг/мл будут детектироваться неколичественно;

- температура инкубации аналитической пробы с биочипом составляет 37°С;

- рабочий объём аналитической пробы, инкубируемой на биочипе, составляет 100 мкл;

- визуализация специфического связывания антиген-антитело проводится методом иммунофлуоресценции путём инкубации биочипа с раствором стрептавидина-Cy5 в ФСБ в концентрации 1 мкг/мл (после инкубации биочипа с аналитической пробой и последующей промывки);

Описанный способ диагностики возбудителей острых респираторных вирусных инфекций предназначен для определения вирусов в клиническом материале, который представляет собой мазок из носовой полости (полученный от пациента и потенциально содержащий ВГА, ВГВ, ВПГ2, ВПГ3, АдВ или РСВ).

В одном из вариантов способ включает использование тест-системы, содержащей антитела для определения вирусов гриппа А и В, аденовируса, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 2 и 3 типа, в концентрации 250 мкг/мл, в количестве 320 пиколитров.

В одном из вариантов тест-система содержит белковый чип, который может представлять собой подложку с альдегидными группами или аминосилановую подложку, включающий антитела в буферном растворе, содержащем 20 мМ Na₂HPO₄, 0,005% бромфеноловый голубой, 0,5% глицерин.

Технический результат изобретения заключается в упрощении процедуры анализа, сокращении времени постановки анализа, повышении чувствительности и специфичности метода одновременной детекции нескольких патогенов (вирусов).

Описание фигур

Фиг. 1. Показана схема биочипа, содержащего 14 субэрреев.

Фиг. 2. Хроматограмма полученных антител.

Фиг. 3. Гель-электрофореграмма полученных антител.

Фиг. 4. Сравнение чувствительности тест-системы при проведении одностадийного и двухстадийного анализа.

Фиг. 5. Оптимизация проведения анализа с использованием тест-системы при различных параметрах.

Фиг. 5А. График зависимости величины флуоресцентного сигнала от концентрации антитела и времени инкубации.

Фиг. 5В. График зависимости уровня флуоресценции, соответствующего концентрации образца (на примере ВГА), в зависимости от температуры проведения анализа.

Фиг. 5С. График зависимости уровня флуоресценции, соответствующего количеству образца в ячейке, в зависимости от объёма гибридизационной смеси.

Фиг. 5D. Диаграмма рассеяния, представленная для каждой концентрации образца (на примере ВГА), при детекции биотинилированными антителами в разных концентрациях.

Фиг. 6. Оценка специфичности способа с помощью тест-системы для детекции ОРВИ.

Фиг. 7. Результаты гибридизации клинических образцов, содержащих ВГА в различных концентрациях, с использованием и без использования лизирующего буферного раствора для пробоподготовки назофарингеальных мазков.

Фиг. 7А. Исследование различных лизирующих буферных растворов для обработки образцов.

Фиг. 8. Изображение тест-системы после гибридизации с полученными от пациентов образцами.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает способ дифференциальной диагностики возбудителей острых респираторных вирусных инфекций, включающий анализ с использованием биологического биочипа клинических образцов, обработанных лизирующим раствором, на наличие в них вирусов гриппа (типа А и В), аденовируса, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 2 и 3 типа, содержащего высокоспецифичные моноклональные антитела к белкам указанных вирусов, при этом:

- диагностический биочип представляет собой твёрдую подложку, содержащую альдегидные группы, посредством которых на поверхности биочипа иммобилизованы моноклональные антитела в концентрации 250 мкг/мл к вышеобозначенным вирусам;

- блокировка активных подложек биочипа проводится в два этапа: восстановление активных альдегидных групп до спиртов раствором, представляющим собой 0,4% NaHB₄, 20% этанол в ФСБ, и связывание возможных невосстановившихся альдегидных групп 1% БСА в 20 мМ Na₂HPO₄;

- анализ заключается в одностадийной одновременной инкубации образца (аналита) с детектирующими моноклональными антителами на поверхности биочипа; предварительно смешанные образец и детектирующие антитела представляют собой аналитическую пробу;

- концентрация детектирующих (биотинилированных) моноклональных антител в аналитической пробе составляет 1 мкг/мл;

- время инкубации белкового биочипа с аналитической пробой составляет 16 часов (в течение ночи). При таком времени инкубации предел обнаружения аналита для вируса гриппа А составит не более 2 нг/мл, однако линейный диапазон, позволяющий количественно выявлять заявленный аналит (ВГА), будет узким, в пределах 2-8 нг/мл. Значения свыше 8 нг/мл будут детектироваться неколичественно;

- температура инкубации аналитической пробы с биочипом составляет 37°С;

- рабочий объём аналитической пробы, инкубируемой на биочипе, составляет 100 мкл;

- визуализация специфического связывания антиген-антитело проводится методом иммунофлуоресценции путём инкубации биочипа с раствором стрептавидина-Cy5 в ФСБ в концентрации 1 мкг/мл (после инкубации биочипа с аналитической пробой и последующей промывки);

Описанный способ диагностики возбудителей острых респираторных вирусных инфекций предназначен для определения вирусов в клиническом материале, который представляет собой мазок из носовой полости (полученный от пациента и потенциально содержащий ВГА, ВГВ, ВПГ2, ВПГ3, АдВ или РСВ).

В одном из вариантов способ включает использование тест-системы, содержащей антитела для определения вирусов гриппа А и В, аденовируса, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 2 и 3 типа, в концентрации 250 мкг/мл, в количестве 320 пиколитров.

В одном из вариантов тест-система содержит белковый чип, который может представлять собой подложку с альдегидными группами или аминосилановую подложку, включающий антитела в буферном растворе, содержащем 20 мМ Na₂HPO₄, 0,005% бромфеноловый голубой, 0,5% глицерин.

Технический результат изобретения заключается в упрощении процедуры анализа, сокращении времени постановки анализа, повышении чувствительности и специфичности метода одновременной детекции нескольких патогенов (вирусов).

Антитела согласно настоящему изобретению включают моноклональные антитела к вирусам, в частности, к вирусу гриппа типа А, вирусу гриппа типа В Викторианской и Ямагатской линий, аденовирусу, респираторно-синцитиальному вирусу, вирусам парагриппа 2 и 3 типа. В качестве примеров вирусов гриппа типа А и В могут рассматриваться следующие штаммы: A/California/07/09 (H1N1pdm09); A/Texas/50/12 (H3N2), B/Massachusetts/2/12 (В/Yam) и B/Brisbane/46/15 (В/Vic).

Также антитела могут представлять собой антитела к вирусу гриппа А всех субтипов (циркулирующих преимущественно в человеческой популяции), а также к вирусу гриппа В вне зависимости от эволюционной линии. Идеальной мишенью для получения моноклональных антител (МКА) к гриппу является белок NP. Белок NP - это высококонсервативный структурный РНК-связанный белок вирусной частицы, который индуцирует образование кросс-протективного иммунитета к ВГА различных субтипов.

ВПГ - оболочечные вирусы, геном которых представлен одноцепочечной отрицательной РНК, кодирующей шесть ключевых структурных белков. Два гликопротеина - рецепторный белок гемагглютинин-нейраминидаза (HN) и белок слияния (F) - обнаружены на поверхности вирусной частицы. Моноклональные антитела к двум этим вирусным белкам были использованы для конструирования диагностических систем для дифференциальной типоспецифической диагностики парагриппозной инфекции.

РСВ человека существует в виде одного серотипа, но состоит из двух антигенных групп (А и В). Оболочку вириона РСВ формируют два основных трансмембранных гликопротеина: белок G, ответственный за специфическое прикрепление вирусной частицы к поверхности клетки, и белок слияния F, обуславливающий синтез вируснейтрализующих антител. F-белок является наиболее консервативным, процент гомологии его аминокислотной последовательности между A и B группами составляет 91%. G-белок, напротив, является наиболее вариабельным из всех белков РСВ, степень гомологии его составляет 53-58%. С учётом представленных данных наиболее рациональным для выявления РСВ представляется использование МКА к консервативному F-белку.

У людей встречаются 57 серотипов аденовирусов (АдВ от 1 до 57), входящих в семь серогрупп (от A до G). В формировании наружной оболочки аденовирусов участвует семь белков, однако основным структурным компонентом является гексоновый белок. Гексон составляет около 60% массы вириона. Вариабельность аминокислотного состава гексона составляет менее 15%. Гексон содержит консервативные участки, формирующее родо-, группо- и типоспецифические антигенные детерминанты. Кроме того, в инфицированных клетках гексон синтезируется в избытке: только 20-30% белка используется для сборки вирусных частиц. Это даёт возможность сравнительно легко получать гексон в нативной форме и использовать полученные к нему МКА для детекции аденовируса различных серотипов в клиническом материале.

Используемые антитела могут быть получены различными способами, например, рекомбинантными методами (генно-инженерными методами), культивированием гибридомы, методами иммунизации животных и получением асцитов.

Используемая для биочипа подложка может быть из стекла (керамики), металла или полимерного материала. Подложка может иметь поверхности с карбоксильными, амино-, меркапто-, альдегидными, изоцианатными, метакрилатными и др. группами. Предпочтительно подложка представляет собой подложку с альдегидными группами или аминосилановую подложку. Материалы для таких подложек широко известны из уровня техники и могут включать как коммерческие подложки, так и специально разработанные для нанесения на них антител. Основным отличием в данном случае служит то, что подложка имеет активные альдегидные группы или является аминосилановой подложкой. При этом, согласно способу диагностики, в качестве образца может быть использован назофарингеальный смыв, смыв из носовой полости, мазок из носовой полости, носоглоточная жидкость или выделенный образец антигена.

Согласно способу диагностики, анализ биологического образца на биочипе проводится в одну стадию, путём инкубации биочипа с аналитической пробой. Аналитическая проба представляет собой биологический образец (например, назофарингеальный смыв), предварительно смешанный со смесью детектирующих биотинилированных моноклональных антител. Установлено, что оптимальная рабочая концентрация детектирующих антител в аналитической пробе составляет 1 мкг/мл.

Было установлено, что в зависимости от концентрации детектирующих антител через 16 часов инкубации регистрируемый специфический сигнал флуоресценции (RFU) уже выходит на максимум и достигает предела «насыщения». Дальнейшее увеличение времени гибридизации с образцами в исследуемых диапазонах концентраций не приводит к усилению RFU, что указывает на то, что в течение 16 часов все возможные антитела связались с антигеном в образце и дальнейшего связывания не происходит.

Также было установлено, что оптимальная температура проведения анализа составляет от 37° до 47°С. Дальнейшее повышение температуры не приводит к увеличению уровня флуоресценции, и более того, при температуре свыше 52°С происходит частичное разрушение самой тест-системы в виде отслоения элементов подложки, что может приводить к полной непригодности для анализа самой тест-системы.

Согласно проведённым исследованиям, объём аналитической пробы для проведения анализа составляет от 50 до 150 мкл. Было установлено, что одно и то же количество (в пг) биологического образца, внесённого на биочип для диагностики в разных объёмах, приводит к снижению сигнала флуоресценции в объёме 150 мкл по сравнению с объёмом 100 мкл, в объёме 100 мкл по сравнению с 50 мкл. Однако, поскольку при длительной инкубации использование малого объёма аналитической пробы может приводить к плохим результатам вследствие испарения жидкости, оптимальным рабочим объёмом был выбран объём 100 мкл.

Благодаря разработанному способу диагностики возбудителей респираторных вирусных инфекций стало возможным проведение многопараметрической диагностики с выявлением 6 различных вирусов, в течение суток, при малом количестве образца, а также образца, не подвергаемого длительной и трудоёмкой обработке для выделения антигенов, а обрабатываемого только лизирующим раствором, содержащим стандартные реактивы. Данный способ позволит существенно ускорить и упростить выявление вирусных инфекций в период эпидемии или в условиях быстрого течения заболевания для более эффективного лечения.

Более подробно изобретение раскрыто ниже в примерах.

Примеры

Пример 1

Получение антител

Антитела, используемые для диагностической тест-системы, получали с помощью асцитов.

Описанные антитела получали способом, включающим следующие стадии:

- получение антитело-продуцирующих спленоцитов;

- накопление клеток мышиной миеломы;

- слияние антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками;

- отбор гибридом;

- введение гибридомы в брюшную полость праймированных пристаном мышей;

- накопление моноклональных антител в асцитах;

- очистка полученных моноклональных антител.

Более подробно процесс получения антител с помощью асцитов описан ниже на примере антитела к РСВ.

Получение МКА к белкам респираторно-синцитиального вируса

Процесс получения гибридом-продуцентов МКА к консервативным эпитопам в составе респираторно-синцитиального вируса состоял из нескольких стадий.

Стадия 1. Очистка вирусов, предназначенных для использования в качестве иммуногена.

Эталонный штамм РСВ, принадлежащий к антигенной группе Long (группа А), полученный из National Institute for Medical Research (London), культивировали в перевиваемой клеточной культуре МА-104 (эпителиальные клетки почки обезьяны) в течение 5-7 суток. В качестве поддерживающей бессывороточной среды использовали среду alpha-МЕМ («Биолот», Россия). Вируссодержащую культуральную жидкость использовали для очистки и концентрации вируса путём ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы по методу Orvell [Orvell et al., 1978]. Для этого вирусы из культуральной среды осаждали ультрацентрифугированием при 50000 g в течение 2 ч, суспендировали в малом количестве буферного раствора 10 мМ трис-ЭДТА, рН 7,2 (STE) и производили очистку через градиент 20-60% сахарозы ультрацентрифугированием при 100000 g в течение 2,5 ч с последующим осаждением вируса из зоны 36-40% сахарозы на дно при 120000 g в течение 1 ч. Осадок ресуспендировали в STE. Содержание белка в очищенном вирусном материале определяли с использованием набора “Pierce BCA Protein assay kit” (“Thermo Fisher Scientific”, США). Наличие вирусной контаминации и целостность полученных вирионов контролировали с помощью электронной микроскопии. Полученные цельновирионные вирусные суспензии хранили при -80°С.

Стадия 2. Получение антитело-продуцирующих спленоцитов в результате иммунизации мышей соответствующим антигеном под контролем образования специфических сывороточных антител в ИФА.

Мышей линии BALB/c иммунизировали очищенным антигеном, полученным на стадии 1, смешанным с неполным адъювантом Фрейнда путём внутрибрюшинного введения (иммунизации) очищенного ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы антигена РСВ в концентрации 50-100 мкг/мл (по 1 мл на мышь). Затем проводили мониторинг иммунизированных животных на образование специфических антител. Животных с достаточно высоким титром антител отбирали в качестве источника антитело-продуцирующих клеток.

Инъекции антигенов проводили двукратно с интервалом в 5 недель. Спустя 7 дней после каждой иммунизации из ретробульбарного синуса мышей брали пробы крови для определения титра сывороточных антител против гомологичного РСВ или рекомбинантного белка в ИФА. Через две недели после последней иммунизации мышей, имевших по данным ИФА антитела в титре 1:10000, бустировали антигеном, полученным на стадии 1, или рекомбинантным белком.

Стадия 3. Определение титра сывороточных антител в ИФА.

Очищенный концентрат РСВ сорбировали на твёрдой поверхности (96-луночный планшет для ИФА) в концентрации 1-5 мкг/мл. После промывания планшета в лунки с сорбированным антигеном вносили серийные двукратные разведения сыворотки от иммунизированной мыши (от 1:10 до 1:20480) и инкубировали в течение часа при температуре 37°C. Для выявления сформированного комплекса антигена с антителом добавляли антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена (HRP). После промывания в планшет добавляли субстратную смесь для фермента. В качестве субстрата на стадии детекции использовали раствор ТМБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин) в концентрации 100 мкг/мл с 0,03% Н₂О₂. Титр антител оценивали по изменению оптической плотности раствора, регистрируемой спектрофотометрически на фотометре Multiscan FC при длине волны 450 нм.

Стадия 4. Накопление клеток мышиной миеломы.

Через 3 дня после бустер-иммунизации мышь использовали в качестве донора лимфоцитов селезёнки для слияния с клетками мышиной миеломы в целях получения гибридом [Новохатский и др., 1985; Новиков и др., 1988]. Для этого проводили гибридизацию спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы в присутствии 50% ПЭГ-2000. В качестве партнёра для слияния при получении гибридом использовали культуру клеток мышиной миеломы линии Х63Аg8.653, адаптированную к росту в среде с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС), полученную из коллекции ФГБУ «РНЦРХТ». Данный штамм является устойчивым к 8-азагуанину, то есть дефектным по гену гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазы.

Выбранную клеточную линию культивировали на среде RPMI-1640 c добавлением глутамина, 2-меркаптоэтанола (МЭ), гентамицина и сыворотки КРС для обеспечения в день слияния со спленоцитами плотности популяции не менее 2×10⁷ клеток/мл. Культивирование миеломы осуществляли в пластиковых культуральных планшетах или во флаконах производства “Sarstedt” или “Nunc” (Германия, США). Клетки размножали при температуре 36-37°С и 100% влажности в атмосфере воздуха с 5-7% СО₂. Базовая культуральная среда содержала 90% RPMI-1640 и 10% сыворотки КРС («Биолот», Санкт-Петербург).

Стадия 5. Слияние антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками.

Для получения антитело-продуцирующих клеток у мышей с высокими титрами специфических антител через 3-4 дня после последней бустер-иммунизации удаляли селезёнку и вымывали из неё спленоциты бессывороточной средой (такой как RPMI-1640) или забуференным физиологическим раствором, после чего их смешивали с миеломными клетками в соотношении от 5:1 до 10:1. Затем клетки центрифугировали (10 мин, 1000 об/мин), осадок разрыхляли, после чего, перемешивая, по каплям добавляли 1 мл бессывороточной среды, содержащей 50% (масс/об) ПЭГ (молекулярный вес 1000-4000 Да). Затем медленно добавляли 10 мл бессывороточной среды, после чего смесь центрифугировали.

Осаждённые клетки суспендировали в соответствующем количестве селективной НАТ-среды. Затем клетки переносили в селективную НАТ-среду, приготовленную на основе RPMI-1640 и 20% СКРС с добавлением гипоксантина (10^–4 М), аминоптерина (4×10^–7 М) и тимидина (1,6×10^–5 М) производства “Sigma-Aldrich” (США), а также 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия (“Sigma-Aldrich”, США), 1 мг/л амфотерицина В и 50 мг/л гентамицина. Суспензию распределяли по ячейкам 96-луночных планшетов для культивирования, содержащих трёхсуточную культуру мышиных макрофагов, и инкубировали в атмосфере 5-7% СО₂ при температуре 37°С в течение 3 недель. После 10 суток культивирования НАТ-среду заменяли на более щадящую НТ-среду, а после 20 суток культуры поддерживали на среде RPMI-1640 с СКРС. Для удаления Ig, секретированных неслившимися спленоцитами мышей, культуральную жидкость из ячеек с растущими гибридами отбирали на 5-6, затем 10-12 и на 16-17 дни после слияния.

Стадия 6. Отбор гибридом.

Поскольку используемый штамм миеломы резистентен к 8-азагуанину, он является дефектным по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазе, и любые не слитые с лимфоцитами миеломные клетки, и любые гибриды миелома-миелома не способны выживать в среде НАТ. С другой стороны, гибриды антитело-образующих клеток друг с другом, а также гибридомы, образованные антитело-продуцирующими и миеломными клетками, могут выживать в этой среде, причём гибриды спленоцитов друг с другом имеют ограниченное время жизни (на протяжении 3-4 пассажей) и отмирают в ходе культивирования, тогда как гибридомы спленоцитов с миеломными клетками (СМ) способны к неограниченному размножению.

Стадия 7. Реклонирование и криоконсервирование гибридом.

Скрининг гибридом проводили методом твердофазного ИФА. Из большого числа активно размножающихся гибридом отбирали гибридомы, активно продуцирующие противовирусные антитела. Для этого в супернатантах гибридом определяли титры специфических антител к вирусу-иммуногену в ИФА. Вирусным материалом (очищенные концентраты), разведённым карбонатно-бикарбонатным буферным раствором (КББ) до концентрации 2-5 мкг/мл, сенсибилизировали планшеты в течение 18 часов при температуре 4°С. После отмывания несвязавшегося антигенного материала 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) с добавлением 0,05% Твин 20 (ФСБТ), рН 7,2 вносили культуральную жидкость в ФСБТ в разведении 1:10 (при тестировании субклонов в 2-х повторах) и инкубировали 1 час при 37°С. Связавшиеся с антигеном антитела детектировали с помощью пероксидазных конъюгатов АТ к IgG мыши (“Sigma-Aldrich”, США) в PBS-T в течение 1 часа при температуре 37°С. Пероксидазную реакцию проявляли добавлением субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) и 0,02% Н₂О₂ в ацетат-цитратном буферном растворе, рН 5,0. После остановки реакции 2N H₂SO₄ оптическую плотность измеряли на фотометре Multiscan FC при длине волны 450 нм.

Для последующего клонирования отобранных гибридом СМ использовали метод предельных разведений. Клетки гибридомы разводили из расчёта, чтобы на одну лунку планшета приходилось 1-2 клетки, и затем культивировали их, как выше описано, в ростовой среде в инкубаторе с подачей 5-7% СО₂ при температуре 36-37°С. Процедуру клонирования повторяли 3-4 раза для каждого избранного клона, продуцирующего специфические антитела. Клоны - стабильные продуценты антител - отбирали для последующего накопления культивированием в ростовой среде с целью накопления клеток в количестве, достаточном для последующего пассажа на сингенных мышах и криоконсервирования.

Стадия 8. Криоконсервирование гибридом.

Криоконсервированию подвергали культуры гибридомных клеток, находящиеся в логарифмической фазе роста, или клетки, выращенные в перитонеальной полости мышей сингенной линии (при получении асцитных жидкостей). Перед замораживанием клетки подвергали микроскопическому анализу на жизнеспособность и бактериологическому исследованию на отсутствие контаминации микрофлорой. Количество живых клеток оценивали по эксклюзии трипанового синего. После центрифугирования при 1000 об/мин концентрацию клеток доводили до 1-2 млн в мл. Для криоконсервирования клеток использовали среду, состоящую из 90% сыворотки крупного рогатого скота и 10% ДМСО (“Sigma-Aldrich”, США). Предварительно охлаждённые до температуры -80°С в парах азота криопробирки с клетками помещали в жидкий азот (для многолетнего хранения при температуре -196°С) и хранили в Криобанке гибридом ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.

Стадия 9. Накопление МКА в асцитах.

Асцитные жидкости мышей линии BALB/c, содержащие МКА, секретируемые гибридомой, получали следующим образом. Для этого мышам-реципиентам за 12-14 дней до инокуляции гибридомы вводили внутрибрюшинно 0,5 мл пристана (“Sigma-Aldrich”, США) [Hoogenraad et al., 1983]. Восстановленные гибридомы в количестве 5-10 млн инокулировали в брюшную полость праймированных пристаном мышей. Спустя 2-3 недели после образования асцита, контролируемого визуально, делали прокол брюшной стенки и собирали оттекающую жидкость. После центрифугирования асцитов надосадочная жидкость служила источником МКА, а клетки гибридом, прошедшие пассирование на мышах, криоконсервировали. Исследования выполнялись согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 266 МЗ РФ от 19.06.2003).

Аналогичным образом получали антитела к аденовирусу, вирусу гриппа А и В, вирусам парагриппа 2 и 3.

Для их получения использовали штаммы вирусов из коллекции клеточных культур, полученные из ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России (Санкт-Петербург). Для гибридизации использовали следующие штаммы вируса гриппа А и В: A/California/07/09 (H1N1pdm09); A/Texas/50/12 (H3N2); A/Vietnam/1194/04 (H5N1) вакцинный штамм NIBRG-14; A/duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2); B/Brisbane/46/15; B/Massachusetts/2/12; B/Beijing/184/93; B/Phuket/3073/13. Для получения антител к вирусу парагриппа использовали штамм II ALTB cc 2056 (вирус парагриппа типа 2); штамм III V2932 (вирус парагриппа типа 3). Для получения антител к аденовирусу использовали аденовирус тип 5 (штаммы Adenoid 75 и Tonsil 99).

Пример 2

Характеристика антител

Для создания белкового биочипа были охарактеризованы 47 моноклональных антител (МКА), полученных в ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России. Антитела характеризовали по специфичности (отсутствию перекрёстной реактивности) и чувствительности к искомому вирусу, а также по физико-химическим параметрам, таким как чистота полученного препарата антител и молекулярная масса тяжёлой и лёгкой цепей иммуноглобулинов. Специфичность и чувствительность антител оценивали методом ИФА, физико-химические параметры - методами хроматографии и электрофоретического разделения в полиакриламидном геле (ПААГ).

Полученные антитела характеризовали посредством хроматографии и гель-электрофореза. Результаты представлены на Фиг. 2 и 3.

Обозначения на Фиг. 3: 1-17 - исследуемые образцы МКА. Стрелками отмечены фрагменты, соответствующие компонентам IgG: ~25 кДа - лёгкая цепь, ~50 кДа - тяжёлая цепь, ~75 кДа - лёгкая + тяжёлая цепи. 1 - 6D11; 2 - 4H1; 3 - 3F8; 4 - 1E7; 5 - 4E2; 6 - 4D12; 7 - 5G4; 8 - 6B12; 9 - 4B7; 10 - 4A7; 11 - 2C6; 12 - 5D4; 13 - 3H8; 14 - 1H3; 15 - 4F2; 16 - 5F3; 17 - 5H8. М - маркеры молекулярного веса, Dual Xtra (cat. no. 1610377, “Bio-Rad”, США).

Основными критериями выбора антител были их специфичность и чувствительность к искомому антигену, а также возможность создания на их базе надёжной мультиплексной системы.

В результате клонирования и отбора культур гибридом было выделено 9 клонов МКА к ВГА. По данным иммуноблотинга все МКА взаимодействовали с белком, соответствующим по молекулярной массе NP ВГА. Для оценки способности полученных МКА взаимодействовать со штаммами различных субтипов ВГА был проведён микрокультуральный ИФА (мк-ИФА) с использованием монослойных культур клеток MDCK, инфицированных вирусом. Большинство МКА взаимодействовали в мк-ИФА с широким спектром ВГА как сезонных, так и потенциально пандемических субтипов. В качестве оптимальной пары для определения ВГА была выбрана пара F8-4H1b.

Все полученные МКА к ВГВ специфически взаимодействовали в непрямом варианте ИФА с очищенными концентратами современных ВГВ Ямагатской (B/Massachusetts/2/12 (В/М/2/12)) и Викторианской (B/Brisbane/46/15 (В/Br/46/15)) эволюционных линий при отсутствии перекрёстного реагирования с гетерологичными ВГА. Полученные антитела давали более высокий сигнал, чем коммерческие антитела IB12 («Биалекса», Россия) и IB64 («Биалекса», Россия) (в тех же концентрациях). В силу того, что антитела 6G4 обладали наилучшими характеристиками и проявляли высокую аффинность к более широкому диапазону штаммов вируса гриппа B, было принято решение использовать в тест-системе именно эту пару антител (6G4-6G4b).

Для антител к РСВ было получено одно МКА к ВПГ2 4А7. Определение чувствительности и специфичности очищенных МКА 4А7 проводилось в одностадийном ИФА, где сорбировался ВПГ2. После очистки МКА 4А7 сохранили свою специфичность и активность в отношении ВПГ2. К ВПГ3 было получено 3 МКА: 2C6, 5D4, 3H8. Определение чувствительности и специфичности очищенных МКА проводилось в ИФА с сорбцией ВПГ3. Очищенные МКА остались чувствительны и специфичны в отношении ВПГ3.

В целом, были получены и охарактеризованы следующие антитела (таблица 1).

Полученные антитела сравнивались с уже известными.

Таблица 1:

№	Название антитела	Тип антитела	Производитель	Иммуноген (штамм)	Аффинность к антигену	Лучшая пара антител	Нижний предел детекции
1	4A7	IgG	ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России	HPIV-2	+++	4А7-4А7b
2	3H8	IgG	ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России	HPIV-3	+++	3Н8-2С6b
3	5D4	IgG		HPIV-3	+
4	2C6	IgG	HPIV-3	+++
5	4B7	IgG	ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России	Hexon HAdV	+	6B12-4B7b
6	2С3	IgG1		Hexon HAdV	+
7	3F12	IgG		Hexon HAdV	+
8	4B7	IgG		Hexon HAdV	+++
9	4G10	IgG1		Hexon HAdV	+
10	6B12	IgG1		Hexon HAdV	+++
11	6G10	IgG1	Hexon HAdV	+
12	Cy25	IgG	Всероссийский Научный Центр Молекулярной Диагностики И Лечения	Hexon HAdV	+++
13	F8	IgG	Всероссийский Научный Центр Молекулярной Диагностики И Лечения	NP A/Texas/50/12 (H3N2)	+++	F8-4H1b	2 нг/мл
14	1,00E+07	IgG1	Всероссийский Научный Центр Молекулярной Диагностики И Лечения	NP A/Texas/50/12 (H3N2)	+
15	3F8	IgG3		NP A/Texas/50/12 (H3N2)	+
16	4H2	IgG1		NP A/Texas/50/12 (H3N2)	+
17	4,00E+02	IgG1		NP A/Texas/50/12 (H3N2)	+
18	4D12	IgG1		NP A/Texas/50/12 (H3N2)	+
19	5G4	IgG1		NP A/Texas/50/12 (H3N2)	+
20	4H1	IgG2a		NP A/Duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2)	+++
21	6D11	IgG1	NP A/Vietnam/1194/04/ (H5N1) вакцинный штамм NIBRG-14	+++
22	1F2	IgG3	ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России	NP B/Massachusetts/2/12	+	6G4-6G4b	70 нг/мл
23	02.мар	IgG2a		NP B/Beijing/184/93	+++
24	6G1	IgG2a		NP B/Brisbane/46/15	+++
25	6G2	IgG2a		NP B/Brisbane/46/15	+
26	6G4	IgG2a		NP B/Brisbane/46/15	+++
27	8A2	IgG2a		NP B/Brisbane/46/15	+++
28	8G1	IgG2a		NP B/Brisbane/46/15	+
29	9D1	IgG2a		NP B/Brisbane/46/15	+
30	9D6	IgG2a		NP B/Brisbane/46/15	+++
31	9,00E+07	IgG3		NP B/Brisbane/46/15	+
32	10A5	IgG3		NP B/Brisbane/46/15	+
33	10C5	IgG2a		NP B/Brisbane/46/15	+++
34	11D4	IgG2a		NP B/Brisbane/46/15	+
35	1,10E+02	IgG3	NP B/Brisbane/46/15	+
36	IB12	IgG2b	Биалекса	NP	+++
37	IB64	IgG1	NP	+++
38	4F2	IgG1	ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России	F protein HRSV strain Long	+++	7B12-4F2b
39	5F3	IgG1		F protein HRSV strain Long	+++
40	5H8	IgG1		F protein HRSV strain Long	+
41	1H3	IgG1		F protein HRSV strain Long	+
42	5F8	IgG2a		F protein HRSV strain Long	+
43	7B12	IgG		F protein HRSV strain Long	+
44	7H11	IgG		F protein HRSV strain Long	+++
45	9H1	IgG		F protein HRSV strain Long	+++
46	12C9	IgG		F protein HRSV strain Long	+
47	9Е12	IgG		F protein HRSV strain Long	+++
48	11G4	IgG	F protein HRSV strain Long	+++
47	10G6	IgG	ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России	F protein HRSV strain Long	+++
48	7H8	IgG	ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России	F protein HRSV strain Long	+++

Пример 3

Нанесение полученных антител на подложку

Моноклональные антитела (МКА) наносили на подложку биочипа, содержащую альдегидные группы, или на аминосилановую подложку, следующим образом. Использовали нанесение бесконтактным способом при помощи роботизированной системы sciFLEXARRAYER S3 robotic system (“SCIENION”, Германия). Антитела разбавляли в буферном растворе для печати, содержащем 20 мM Na₂HPO₄, 0,005% бромфеноловый голубой, 0,5% глицерин, до конечной концентрации 250 мкг/мл.

Для нанесения МКА на поверхность биочипа в виде круглой области (спота) диаметром 250 мкм использовали капиллярный диспенсер PDC 70 Piezo (10 капель в споте). Полученный объём антител в споте составлял 325 пиколитров.

После нанесения антител на биочип и последующего этапа их конъюгации (связывания) с активными группами подложки, заключающегося в инкубации биочипа в течение 16-20 часов во влажной камере при относительной влажности не менее 80%, проводили процесс деактивации свободных альдегидных групп биочипа. Для этого биочип обрабатывали боргидридом натрия, что приводило к восстановлению альдегидных групп и потери их способности связывать белки. Благодаря этому биочип можно было хранить без потери активности в течение 6 месяцев (при +4°C).

На Фиг. 1 представлены схемы полученной тест-системы:

A - Общий вид полученного белкового биочипа;

B - Схема субэррея;

С - Отсканированное изображение субэррея после печати на канале 635 нм (флуорофор Cy5) при следующих параметрах: мощность лазера - низкая, коэффициент усиления PMT = 10%, сканирующее разрешение - 15 мкм, скорость сканирования 35;

D - Порядок расположения антител в субэррее.

Пример 4

Оптимизация параметров проведения анализа с использованием тест-системы

Все стадии гибридизации биочипов были выполнены с применением гибридизационных камер AHC4×24 и силиконовых прокладок 3×8 (“Arrayit”, США). Данные камеры позволяют при полной загрузке проводить гибридизацию до 96 образцов одновременно (по 24 образца на биочип и по 4 биочипа на гибридизационную камеру).

Изначально поверхность биочипа блокировали 1% БСА в ФСБ (блокировку проводили непосредственно перед анализом образца). Для этого добавляли 100 мкл блокирующего раствора в лунку гибридизационной камеры и инкубировали 2 часа.

При использовании двухстадийного протокола анализа гибридизацию проводили аналогично ИФА. Образцы в известных концентрациях, полученных серией двукратных разведений в ФСБ, добавляли к лункам биочипа и инкубировали при 37°C. После промывки биочипа ФСБТ к лункам добавляли 100 мкл смеси биотинилированных антител (каждое в конечной концентрации 1 мкг/мл) и инкубировали при 37°C. Затем лунки промывали ФСБТ, инкубировали со стрептавидином-Cy5 и регистрировали связывание по определению уровня флуоресцентного сигнала.

При использовании одностадийного протокола анализа 100 мкл (общий объём) смеси образца и биотинилированных антител одновременно добавляли к лункам биочипа. Конечные концентрации биотинилированных антител составляли 1 мкг/мл, конечная концентрация образца соответствовала двухстадийному протоколу. Смесь инкубировали на биочипе.

Биочипы сканировали с использованием двухцветного сканера InnoScan 710 (“Innopsys”, Франция) при следующих параметрах:

флуорофор Cy5; мощность лазера 30%; коэффициент усиления PMT 70%; сканирующее разрешение 10 мкм.

Полученные изображения обсчитывали с помощью программы Mapix Software. Дополнительную обработку данных проводили в программе Microsoft Excel. Программу GraphPad Prism использовали для статистической оценки достоверности различий полученных сигналов.

Сравнение чувствительности биочипа при проведении одностадийного и двухстадийного анализа представлены на Фиг. 4. Точками указаны средние значения (Mean) ± стандартное отклонение (SD), пунктирной линией отмечено пороговое значение флуоресценции. В качестве аналита использовали назофарингеальные смывы, полученные от здоровых волонтёров (отрицательный диагноз подтверждён методом ОТ-ПЦР), в которые был добавлен очищенный препарат ВГА.

Для оптимизации параметров проведения диагностики, а также для исследования показателей точности при этих параметрах, были исследованы зависимости уровней флуоресценции от времени инкубации, температуры проведения анализа, объёма аналитической пробы и концентрации образца.

Полученные результаты приведены на Фиг. 5А, 5В, 5С и 5D.

Все исследования по оптимизации проводили на модельной системе с использованием образца, содержащего вирус гриппа А. Варьировали концентрацию образца, температуру проведения анализа, количество образца в ячейке, объём гибридизационной смеси, а также концентрацию антител для определения, и по уровню флуоресценции судили об эффективности влияния изменяемого параметра на точность и возможность детекции антигена в образце.

Таким образом, было выявлено, что оптимальное время гибридизации составляет от 4 до 16 часов, в частности, проведение гибридизации более 16 часов не приводит к увеличению уровня сигнала.

Также была проведена серия гибридизаций тест-системы с образцом на примере ВГА в диапазоне температур от 37° до 52°С (с шагом 5°C). В целом, в диапазоне температур 37-42°С не наблюдалось какой-либо существенной разницы в чувствительности. Однако при 52°C наблюдалось частичное изменение структуры биочипа с отслоением элементов подложки. Таким образом, наиболее оптимальной для проведения анализа была выбрана температура от 37°C до 47°C, предпочтительно 37°C.

Для выбора объёма реакционной смеси проводили гибридизацию образцов на тест-системе в объёме 50, 100 и 150 мкл. Концентрации образцов находились в диапазоне 1-8 нг/мл; согласно этому количество образца варьировало от 50 до 1200 пг на субэррей. Уровень флуоресцентного сигнала, полученный для одних и тех же концентраций образца, нанесённого в объёмах 50, 100 или 150 мкл, был примерно сопоставим. Однако, в пересчёте на количество образца, взятое на лунку, бóльшее значение флуоресценции наблюдалось для образцов, взятых в меньшем объёме.

Для изучения влияния концентрации биотинилированных (детектирующих) антител на результаты гибридизации в качестве образца использовали ВГА в трёх концентрациях: 2, 4 и 8 нг/мл. Уровни флуоресценции, полученные при выявлении одной и той же концентрации образца различными концентрациями биотинилированных антител, находились в пределах погрешности. Чем выше была концентрация образца, тем выше был флуоресцентный сигнал. В целях экономии реагентов рекомендовалась минимальная концентрация детектирующих антител 1 мкг/мл.

Пример 5

Оценка специфичности антител в тест-системе

Для исследования специфичности разрабатываемого метода в лунки биочипа - по одному в одну лунку - вносили вирусы в высоких концентрациях, позволяющих оценить случайное «залипание» проб с неспецифическими антителами. Результаты представлены на Фиг. 6. По оси абсцисс отмечены вирусы, вносимые в лунки биочипа (представлено 6 независимых лунок), цветом показаны уровни флуоресценции, соответствующие регистрируемому вирусу (расшифровка представлена справа от диаграммы). Пунктирной линией отмечен пороговый уровень флуоресценции, ниже которого все значения считаются отрицательными.

Как видно из полученных результатов, разработанная тест-система согласно изобретению обладает достаточно высокой специфичностью. Несмотря на наличие слабых сигналов, полученных от антител, неспецифически связывающихся с внесёнными вирусными мишенями, их уровень достаточно низкий и не преодолевает порогового уровня флуоресценции.

Пример 6

Использование лизирующего буферного раствора для обработки клинических образцов

Для повышения эффективности тест-системы были проведены исследования по использованию лизирующего буферного раствора для обработки клинических образцов перед нанесением в тест-систему. В качестве буферных растворов были использованы следующие буферные системы: SDS на ФСБТ, Тритон X-100 на 100 мМ Трис-HCl и Дезоксихолат натрия на ФСБ, содержащие от 0,025% до 1% ПАВ. При этом было найдено, что от концентрации ПАВ уровень флуоресценции практически не зависит.

Результаты анализа ОРВИ на примере ВГА в концентрациях 4, 8 и 16 нг/мл (по тотальному белку), с использованием и без использования лизирующего буферного раствора для пробоподготовки назофарингеальных мазков, представлены на Фиг. 7.

Для оптимизации были исследованы следующие буферные растворы для обработки клинических образцов. Были использованы буферные растворы, содержащие 200 мМ ДТТ в Трис-HCl, 50 мМ ДТТ в ФСБ, 200 мМ в ФСБТ и коммерческий буферный раствор для сравнения.

Результаты показали (Фиг. 7), что лизирующий буферный раствор 200 мМ ДТТ в Трис-HCl для обработки назофарингеального мазка приводит к наилучшему результату (самому высокому уровню флуоресценции). Результаты представлены на Фиг. 7А.

Пример 7

Применение тест-системы для анализа клинических образцов

Для апробации способа на биологических образцах было проведено исследование назофарингеальных смывов от 30 пациентов с диагнозом ОРЗ в эпидемические сезоны 2018-2019 гг. Для подтверждения клинического диагноза проводили первоначальную диагностику образцов методом ПЦР на 12 патогенов, в частности: грипп А (в том числе проводили субтипирование), грипп Б, парагрипп, аденовирус, РС-вирус, бокавирус, метапневмовирус, коронавирус, риновирус, а также бактериальные инфекции S. pneumoniae, N. meningitis и H. influenzae. Далее полученные образцы анализировали с помощью способа согласно изобретению. Способ не давал ложноположительных результатов.

Изображение тест-системы после проведения анализа представлено на Фиг. 8.

Обозначения на Фигуре: 1 - образец, содержащий ВГА (подтверждено методом ПЦР), 2 - образец, содержащий ВГА (подтверждено методом ПЦР), 3 - образец, не содержащий ВГА, ВГВ, РСВ, АдВ, ВПГ2 или ВПГ3 (согласно методу ПЦР).

1. Способ дифференциальной диагностики возбудителей респираторных вирусных инфекций, включающий:

- обработку лизирующим буферным раствором образца перед внесением в тест-систему;

- приготовление аналитической пробы — предварительное смешивание биологического образца и детектирующих моноклональных антител в конечной концентрации последних по 1 мкг/мл каждого;

- блокировку активных групп на подложке биочипа, представляющего собой белковый чип для одновременного определения в образце вируса гриппа А, вируса гриппа В Викторианской и Ямагатской линий, аденовируса, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 2 и 3 типов, содержащий моноклональные антитела к указанным вирусам, при этом белковый чип представляет собой подложку с активированными альдегидными группами или аминосилановую подложку, при этом блокировка проводится в два этапа: восстановление активных альдегидных групп раствором, представляющим собой 0,4% NaHB₄, 20% этанол в ФСБ, и связывание возможных невосстановившихся альдегидных групп 1% БСА в 20 мМ Na₂HPO₄, а блокировочный раствор для биочипа имеет рН 8,5;

- внесение и одностадийную инкубацию приготовленной аналитической пробы в биочипе;

- определение наличия вирусов в образце путём иммунофлуоресцентного анализа с установлением уровня флуоресценции, при этом время инкубации тест-системы с образцом составляет от 4 до 16 часов, температура проведения анализа составляет от 37°С до 47°С, а объём аналитической пробы составляет 50-150 мкл.

2. Способ диагностики по п. 1, отличающийся тем, что образец для анализа представляет собой назофарингеальный смыв, смыв из носовой полости, мазок из носовой полости, носоглоточную жидкость или выделенный образец антигена, при этом образец обрабатывают лизирующим буферным раствором перед внесением в тест-систему.

3. Способ диагностики по п. 1, отличающийся тем, что тест-система включает антитела для определения вируса гриппа А, вируса гриппа В Викторианской и Ямагатской линий, аденовируса, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 2 и 3 типов в концентрации 250 мкг/мл.

4. Способ диагностики по п. 1, отличающийся тем, что лизирующий буферный раствор для обработки образца представляет собой 200 мМ ДТТ в Трис-HCl, 50 мМ ДТТ в ФСБТ, 200 мМ ДТТ в ФСБТ.