Генетическая конструкция, кодирующая предшественник белка yb-1 человека, штамм escherichia coli - продуцент предшественника белка yb-1 человека, способ микробиологического синтеза этого предшественника

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена генетическая конструкция, кодирующая предшественник белка YB-1 человека, содержащий последовательность декстран-связывающего домена GBD-7 глюкансукразы штамма NRRL B512-F, последовательность температурочувствительного варианта IntMUT интеина PRP8 P. chrysogenum и последовательность зрелого белка YB-1 человека. Указанная генетическая конструкция имеет последовательность SEQ ID N1. Предложен штамм Escherichia coli ECR-proYB-1, продуцирующий предшественник белка YB-1 человека и полученный путем введения вышеуказанной генетической конструкции в клетки реципиентного штамма Escherichia coli ВКПМ В-10189. Предложен также способ микробиологического синтеза предшественника белка YB-1 человека, предусматривающий культивирование вышеуказанного штамма в подходящих условиях в присутствии индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) или лактозы. Группа изобретений обеспечивает синтез предшественника белка YB-1 человека во фракции нерастворимых белков клеток E. coli, обладающего повышенной структурной гомогенностью. 3 н.п. ф-лы, 6 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения предшественника белка YB-1 человека во фракции нерастворимых белков в клетках E. coli.

Болезнь Альцгеймера (БА) является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, которое поражает каждого четвертого человека старше 75 лет [Татарникова и др. 2015]. Актуальной проблемой остается поиск эффективных средств для лечения этого заболевания.

В качестве такого средства может выступать Y-бокс связывающий белок YB-1. Белок YB-1 представляет собой полифункциональное соединение, способное связываться со специальными сайтами на молекулах нуклеиновых кислот и белков [Скабкин и др.. 2004]. Интраназальное введение белка YB-1 предотвращает ухудшение пространственной памяти, вызванное удалением обонятельных луковиц у мышей (такие бульбоэктамированные мыши являются одной из моделей БА) [Bobkova, et al, 2015, RU 2561050]. В этой связи белок YB-1 представляет собой перспективную основу для разработок лекарственных средств для лечения БА.

Известен способ получения белка YB-1 человека в виде зрелого растворимого белка в клетках E. coli [RU 2561050]. К его недостаткам относят потенциальную гетерогенность синтезируемого белка, вызванную особенностями процесса его созревания, недостаточно высокий уровень его экспрессии, затрудненную очистку и склонность растворимого белка YB-1 к деградации под действием протеиназ клеточного лизата на первой стадии очистки.

В то же время известен способ получения целевого белка с использованием интеин-содержащего предшественника. Использование температуро-чувствительного варианта IntMUT интеина PRP8 Penicillium chrysogenum обеспечивает накопление предшественника целевого белка во фракции нерастворимых клеточных белков и его автокаталитический процессинг с образованием целевого белка [RU 2619217].

Задачей настоящего изобретения является разработка способа микробиологического синтеза предшественника белка YB-1 человека.

Задача решена путем:

- разработки генетической конструкции, имеющей последовательность SEQ ID N1 и кодирующей предшественник белка YB-1 человека, содержащий в своем составе последовательность декстран-связывающего домена GBD-7 глюкансукразы штамма NRRL B512-F, последовательность температуро-чувствительного мутантного варианта IntMUT интеина PRP8 Penicillium chrysogenum и последовательность зрелого белка YB-1 человека;

- получения штамма Escherichia coli ECR-proYB-1 - продуцента предшественника белка YB-1 человека путем введения генетической конструкции, имеющей последовательность SEQ ID N1, в клетки реципиентного штамма Escherichia coli ВКПМ В-10189;

- разработки способа микробиологического синтеза предшественника белка YB-1 человека путем культивирования штамма Escherichia coli ECR-proYB-1 в подходящих условиях в присутствии индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) или лактозы.

Для осуществления заявляемого изобретения:

- в состав предшественника белка YB-1 человека вводят последовательность самоотрезаемого температуро-чувствительного мутантного варианта IntMUT интеина PRP8 P. chrysogenum [RU 2619217], далее именуемого интеином Int4bPRO, обеспечивающего «нерастворимую экспрессию предшественников целевых белков» и их последующий автокаталитический процессинг;

- в состав предшественника белка YB-1 человека дополнительно вводят последовательность декстран-связывающего домена GBD-7 глюкансукразы штамма NRRL B512-F [Suwannarangsee et al. 2007; Пручковский с соавт. 2018], далее именуемого белком DBD, снижающего растворимость белков-предшественников, в том числе предшественника белка YB-1 человека.

Способ получения предшественника белка YB-1 человека в общем виде

С использованием методов генетической инженерии получают заявляемую генетическую конструкцию, имеющую последовательность SEQ ID N1, кодирующую предшественник белка YB-1 человека.

Конструируют заявляемый штамм Е. coli ECR-proYB-1, в клетки которого путем трансформации вводят генетическую конструкцию, кодирующую предшественник белка YB-1 человека.

Разрабатывают способ культивирования заявляемого штамма, обеспечивающий эффективный биосинтез и накопление предшественника белка YB-1 человека во фракции нерастворимых клеточных белков.

Для этого посевной материал клеток заявляемого штамма засевают и культивируют при температуре 37°С в питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, обычно используемые для выращивания клеток E. coli [Маниатис и др., 1984]. Культивирование осуществляют в колбах или в биореакторах (ферментерах). Индукцию синтеза целевого гибридного белка осуществляют путем внесения в среду культивирования индуктора. В качестве индуктора используют изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в концентрации от 0,1 до 2 мМ или лактозу в концентрации от 0,5% до 3%. Индуктор вносят на стадии роста культуры, предшествующей стационарной фазе роста. Индукцию осуществляют на протяжении не менее 1 ч. В результате клетки штамма-продуцента накапливают предшественник белка YB-1 человека в количестве до 40% от суммарного белка клеток.

Примеры

Пример 1. Получение вспомогательной плазмиды pUC18m-His10-GFP

С целью получения вспомогательной плазмиды проводят ПЦР-амплификацию гена GFP. Матрицей для амплификации служит плазмида pEGFP (Clontech). Для амплификации используют праймеры:

pGFP-dir (5'-tataccatggaaaagagatctcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatggatccggtaccgtgagcaagggcgaggag) и

pGFP-rev (5'-ggtgctcgagcggccgctttacttgtacagctcgtccatg)

Амплифицированный фрагмент ДНК очищают из геля, используя с этой целью набор Qiagen (Qiagen, cat. №28706) и после открывания концов с использованием рестриктаз NcoI и XhoI клонируют в лабораторном векторе pUC19mx, производном стандартного вектора pUC19, содержащем модифицированную последовательность полилинкера в окружении сайтов узнавания рестриктаз NcoI и XhoI.

В результате клонирования получают вспомогательную плазмиду pUC19mx-His10-GFP. В составе этой плазмиды клонированный фрагмент ДНК заключает структурный ген GFP прецизионно слитый с 5'-концевой последовательностью ДНК, кодирующей 10 остатков гистидина и находящейся в окружении сайтов узнавания рестриктаз BglII и BamHI (см. структуру праймера pGFP-dir).

Вспомогательную плазмиду pUC19mx-His10-GFP используют для клонирования других фрагментов ДНК.

Пример 2. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего белок DBD

Фрагмент ДНК, кодирующий белок DBD, амплифицируют с использованием ПЦР. Матрицей для ПЦР служит ДНК плазмиды pDBD-1 (получают от В.Г. Лунина, Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи, г. Москва). Одновременно в ходе амплификации осуществляют сайт-направленный мутагенез амплифицируемой последовательности ДНК с целью инактивации внутреннего уникального сайта узнавания рестриктазы BamHI.

С этой целью реакции амплификации осуществляют в 2 этапа.

На первом этапе получают 2 фрагмента ДНК, имеющих перекрывающиеся концы:

Фрагмент 1 получают, используя праймеры N1236 (5'-tttagatctacaaatcagtattatcaat) и N1235 (5'-gttagtatctgggtccacaatgatagcatct);

Фрагмент 2 получают, используя праймеры N1234 (5'-gacccagatactaacttgagtt) и N1237 (5'-tttctcgagttaggatcctctggcgccaga).

Амплифицированные фрагменты ДНК очищают из геля, используя набор Qiagen (Qiagen, cat. №28706).

На следующем этапе проводят ПЦР-опосредованное лигирование очищенных фрагментов ДНК. Матрицей для ПЦР служит смесь фрагментов 1 и 2. Для амплификации матрицы используют праймеры N1236 и N1237. Амплифицированный фрагмент ДНК элюируют из агарозного геля и после открывания концов с использованием рестриктаз BglII и XhoI клонируют в плазмиде pUC19mx-His10-GFP (Пример 1), расщепленной по сайтам BamHI и XhoI. В результате клонирования получают плазмиду pUC19mx-His10-DBD, заключающую в своем составе фрагмент ДНК, кодирующий белок DBD, содержащий на N-конце 10 остатков гистидина.

Плазмиду pUC19mx-His10-DBD используют для клонирования фрагмента ДНК, кодирующего интеин Int4bPRO.

Пример 3. Получение плазмиды pUC19mx-His10-DBD-Int4bPRO

Фрагмент ДНК, кодирующий мутантный вариант интеина Int4bPRO амплифицируют с использованием ПЦР. Матрицей для амплификации служит плазмида pET28b_(His)x10_IntMUT [RU 2619217]. Для амплификации используют праймеры:

pINT-dir (5'-tcatagatctgctctcgccaaggggacccgt) и

pINT-revl (5'-tttctcgagttaggatccactgttgtgcaggacaaggta)

Амплифицированный фрагмент ДНК очищают из геля и после открывания концов с использованием рестриктаз BglII и XhoI клонируют в плазмиде pUC19mx-His10-DBD (Пример 2), расщепленной по сайтам BamHI и XhoI. В результате клонирования получают плазмиду pUC19mx-His10-DBD-Int4bPRO, заключающую в своем составе фрагмент ДНК, кодирующий гибридный белок DBD-Int4bPRO, содержащий на N-конце 10 остатков гистидина.

Плазмиду pUC19mx-His10-DBD-Int4bPRO используют для клонирования фрагмента ДНК, кодирующего целевой белок YB-1 человека.

Пример 4. Конструирование плазмиды для экспрессии предшественника белка YB-1 человека

Конструирование плазмиды для экспрессии предшественника белка YB-1 человека проводят с использованием ПЦР. Реакции амплификации осуществляют в 2 этапа. На первом этапе получают 2 фрагмента ДНК, имеющих перекрывающиеся концы:

Фрагмент 1, кодирующий гибридный белок His10-DBD-Int4bPRO, амплифицируют с использованием в качестве матрицы ДНК плазмиды pUC19mx-His10-DBD-Int4bPRO. Для амплификации используют стандартный праймер "direct" для плазмид серии pUC и pINT-rev2 (5'-gttgtgcaggacaaggta), отжигающийся на 3'-конец гена Int4bPRO.

Фрагмент 2, кодирующий безметиониновый вариант белка YB-1 человека, амплифицируют, используя в качестве матрицы ДНК плазмиды pET-3-1-YB-1 (получают от Л.П. Овчинникова, Институт белка РАН, г. Пущино). Для амплификации используют праймеры pYB1-dir (5'-taccttgtcctgcacaactctagtgaagccgaaaccc), отжигающийся на 5'-конец структурного гена YB-1, и pYB1-rev (5'-ctcgagtcattactctgcaccgccttgtt), отжигающийся на 3'-конец структурного гена YB-1. Амплифицируемый фрагмент ДНК кодирует безметиониновый вариант белка YB-1 человека;

Амплифицированные фрагменты ДНК очищают из геля, используя набор Qiagen (Qiagen, cat. №28706).

На следующем этапе проводят ПЦР-опосредованное лигирование очищенных фрагментов ДНК. Матрицей для ПЦР служит смесь фрагментов 1 и 2. Для амплификации матрицы используют праймеры "direct" и pYB1-rev.

Амплифицированный фрагмент ДНК кодирующий белок His10-DBD-Int4bPRO-YB1, называемый proYB-1, элюируют из агарозного геля и после открывания концов с использованием рестриктаз NcoI и XhoI клонируют в плазмиде pET28b+ [Novagen], расщепленной по сайтам NcoI и XhoI.

В результате клонирования получают плазмиду pET28-proYB-1, в составе которой структурный ген, кодирующий предшественник белка YB-1 человека, находится под контролем мощного промотора, узнаваемого РНК-полимеразой фага Т7.

Полученную плазмиду используют для экспрессии предшественника белка YB-1 человека в клетках E. coli.

Пример 5. Получение заявляемого штамма

Заявляемый штамм получают путем трансформации реципиентного штамма E. coli BL21(DE3) (Novagen) - ВКПМ В-10189. Трансформацию осуществляют путем введения в клетки реципиентного штамма плазмиды pET28-proYB-1 с применением реактива CaCl₂ [Маниатис с соавт., 1984]. Колонии трансформированного штамма отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик канамицин. В результате трансформации получают заявляемый штамм ECR-proYB-1.

Клетки заявляемого штамма E. coli ECR-proYB-1 содержат экспрессионную плазмиду pET28-proYB-1 и в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ или лактозы осуществляют биосинтез предшественника белка YB-1 человека.

Пример 6. Биосинтез предшественника белка YB-1 человека

Биосинтез предшественника белка YB-1 человека осуществляют следующим образом. Сначала получают посевную культуру. Для этого одну колонию заявляемого штамма засевают в пробирку, содержащую 3 мл среды YTS следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 1, триптон бакто - 2, NaCl - 1, канамицин - 0,003, вода - остальное. Посевную культуру заявляемого штамма выращивают на роторной качалке со скоростью 250 об/мин в течение 18 часов при температуре 37°С.

На втором этапе посевную культуру переносят в среду для индукции. С этой целью 0,5 мл посевной культуры переносят в колбу, содержащую 50 мл среды TRB следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 2,4; триптон бакто - 1,2; одномолярный фосфатный буфер (рН7) - 10; одномолярный раствор сульфата магния - 0,2; лактоза - 0,5; глицерин - 0,5; канамицин - 0,009; вода - остальное. Культивирование в среде для индукции продолжают в течение 20 часов в тех же условиях.

В результате проведенного выращивания получают биомассу клеток заявляемого штамма. Согласно результатам анализа, выполненного методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, содержание предшественника белка YB-1 человека в полученной биомассе составляет до 40% относительно суммарного белка клеток.

В тех же условиях контрольный процесс, осуществляемый по способу, приведенному в RU 2561050, обеспечивает получение зрелого белка YB-1 человека в количестве около 15% относительно суммарного белка клеток.

Таким образом, с учетом доли целевого белка YB-1 человека составляющей 50% от молекулярного веса предшественника, заявляемое изобретение обеспечивает получение до 20% целевого белка относительно суммарного белка клеток, что сравнимо с показателем контрольного процесса по способу RU 2561050.

Вследствие того, что последовательность природного белка YB-1 человека содержит два остатка серина, следующими непосредственно за N-концевым метионином [RU 2561050], в клетках E. coli он может подвергаться удалению N-концевого метионина и ацетилированию открывающегося остатка серина [Flinta, et al, 1986], что способно приводить к образованию гетерогенной смеси белков, имеющих разное время жизни [Nguyen et al. 2018] и специфическую активность [Van Doren et al. 2008]. Поскольку клетки E.coli характеризуются нестабильным уровнем ацетилирования [Flinta et al. 1986, Schmidt et al. 2016, Willy et al. 2008], процесс биосинтеза белка YB-1 по способу RU 2561050 может приводить к получению препаратов, отличающихся уровнем ацетилирования, а следовательно, - непостоянством биологических характеристик.

В тоже время заявляемое изобретение обеспечивает получение предшественника белка YB-1 человека для его последующего прецизионного процессинга с образованием зрелого белка YB-1 in vitro, и в этой связи не подвергающегося ацетилированию и, как следствие, обладающего структурной гомогенностью и постоянными биологическими характеристиками, соответствующими требованиям, предъявляемым к белкам медицинского назначения.

Список литературы

Bobkova, N.V., Lyabin, D.N., Medvinskaya, N.I., Samokhin, A.N., Nekrasov, P.V., Nesterova, I.V., Aleksandrova, I.Y., Tatarnikova, O.G., Bobylev, A.G., Vikhlyantsev. I.M., Kukharsky, M.S., Ustyugov, A.A., Polyakov, D.N., Eliseeva, I.A., Kretov, D.A., Guryanov, S.G., and Ovchinnikov, L.P. (2015) "The Y-Box Binding Protein 1 Suppresses Alzheimer's Disease Progression in Two Animal Modes". PLoS One. 10(9):e0138867

Flinta, C., Persson, B.„Jornval, H., and von Htijnee, G. (1986) "Sequence determinants of cytosolic N-terminal protein processing" Eur. J. Biochem. 154, 193-196

Nguyen, K.T., Mun, S-H., Lee, C-S., and Hwang, C-S. (2018) "Control of protein degradation by N-terminal acetylation and the N-end rule pathway" Experimental & Molecular Medicine 50:91

Suwannarangsee, S., Moulis, C,, Potocki-Veronese, G., Monsan, P., Remaud-Simeonb, M., and Chulalaksananukul, W.(2007) "Search for a dextransucrase minimal motif involved in dextran binding" FEBS Lett.; 581(24):4675-80.

Schmidt, A., Kochanowski'K.,., Vedelaa, S., E., Volkmer, В., Callipo, L., Knoops, K., Bauer, M., Aebersold, R., and Heinemann, M. (2016) "The quantitative and condition dependent Escherichia coli proteome" Nat Biotechnol. 34(1): 104-110.

Van Doren, S.R., Wei, S., Gao, G., DaGue, B.B., Palmier, M.O., Bahudhanapati, H., and Brew, K. (2008) "Inactivation of N-TIMP-1 by N-terminal Acetylation when Expressed in Bacteria" Biopolymers. 89(11): 960-968.

Willy, V.. (2015) "Proteome-wide analysis of the amino terminal status of Escherichia coli proteins at the steady-state and upon deformylation inhibition" Proteomics 2015, 15, 2503-2518

Скабкин. M.А., Скабкина, О.В., Овчинников Л.П. (2004) «Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов» Успехи биологической химии. 44: 3-52.

Татарникова, О.Г., Орлов М.А., Бобкова, Н.В. (2015)« Бета-амилоид и тау-белок: структура, взаимодействие и прионоподобные свойства». Усп. Биол. хим. 55: 351-390.

RU 2561050. Медвинская Н.И., Овчинников Л.П., Самохин А.Н., Бобкова Н.В., Александрова И.Ю., Некрасов П.В., Гурьянов С.Г., Елисеева И.А., Нестерова И.В. "Применение белка YB-1 и его фрагментов для изготовления лекарственных средств при лечении болезни альцгеймера

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика)

<120> Генетическая конструкция, кодирующая предшественник белка YB-1 человека, штамм Escherichia coli - продуцент предшественника белка YB-1 человека,способ микробиологического синтеза этого предшественника

<160> 1

<210> 1

<211> 1956

<212> DNA

<213> Artificial sequence encoding precursor of human protein YB-1

<220>

<221> CDS

<222> (4)…(1947)

<223> Sequence encodes recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain 2917

<221> misc_feature

<222> (2)…(7)

<223> Sequence encodes site for endonuclease NcoI

<221> misc_feature

<222> (4)…(54)

<223> Sequence encodes His-tag

<221> misc_feature

<222> (55)…(459)

<223> Sequence encodes protein DBD

<221> misc_feature

<222> (460)…(504)

<223> Sequence encodes linker peptide

<221> misc_feature

<222> (505)…(975)

<223> Sequence encodes mutant intein int4bPRO

<221> misc_feature

<222> (976)…(1947)

<223> Sequence encodes mature human protein YB-1

<221> misc_feature

<222> (1948)…(1953)

<223> Sequence encodes site for endonuclease XhoI

<400> 1

ACC ATG GAA AAG AGA TCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT 48

Met Glu Lys Arg Ser His His His His His His His His His His

1 5 10 15

GGA TCT ACA AAT CAG TAT TAT CAA TTA GCA GAT GGT AAA TAT ATG TTG 96

Gly Ser Thr Asn Gln Tyr Tyr Gln Leu Ala Asp Gly Lys Tyr Met Leu

20 25 30

TTA GAT GAT AGT GGT CGT GCG AAA ACA GGG TTT GTA TTG CAA GAT GGT 144

Leu Asp Asp Ser Gly Arg Ala Lys Thr Gly Phe Val Leu Gln Asp Gly

35 40 45

GTA CTA AGA TAC TTC GAT CAA AAC GGT GAG CAA GTG AAA GAT GCT ATC 192

Val Leu Arg Tyr Phe Asp Gln Asn Gly Glu Gln Val Lys Asp Ala Ile

50 55 60

ATT GTG GAC CCA GAT ACT AAC TTG AGT TAT TAT TTC AAT GCA ACA CAA 240

Ile Val Asp Pro Asp Thr Asn Leu Ser Tyr Tyr Phe Asn Ala Thr Gln

65 70 75

GGT GTC GCT GTA AAA AAT GAT TAT TTC GAG TAT CAA GGT AAT TGG TAT 288

Gly Val Ala Val Lys Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr Gln Gly Asn Trp Tyr

80 85 90 95

TTA ACA GAT GCT AAT TAT CAA CTT ATC AAA GGT TTT AAA GCA GTT GAC 336

Leu Thr Asp Ala Asn Tyr Gln Leu Ile Lys Gly Phe Lys Ala Val Asp

100 105 110

GAC AGC TTA CAA CAT TTT GAT GAA GTC ACT GGT GTA CAA ACA AAA GAT 384

Asp Ser Leu Gln His Phe Asp Glu Val Thr Gly Val Gln Thr Lys Asp

115 120 125

AGT GCT TTA ATA AGT GCT CAG GGT AAG GTT TAC CAA TTT GAT AAT AAT 432

Ser Ala Leu Ile Ser Ala Gln Gly Lys Val Tyr Gln Phe Asp Asn Asn

130 135 140

GGA AAT GCT GTG TCA GCA AGA TCC CCG GGT TCT GGC TCC GGC TCT GGT 480

Gly Asn Ala Val Ser Ala Arg Ser Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

145 150 155

TCC GGT TCT GGC GCC AGA GGA TCT GCT CTC GCC AAG GGG ACC CGT CTC 528

Ser Gly Ser Gly Ala Arg Gly Ser Ala Leu Ala Lys Gly Thr Arg Leu

160 165 170 175

TTG CGA TAC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA GAC GTG CGC GAA GGT 576

Leu Arg Tyr Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val Glu Asp Val Arg Glu Gly

180 185 190

GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC CGT GCA TTC AAC ATA 624

Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro Arg Arg Ala Phe Asn Ile

195 200 205

GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG ATC GGC GGT GAG AAA 672

Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile Lys Ile Gly Gly Glu Lys

210 215 220

GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG GTG CTT TAT AGA GAG 720

Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile Leu Val Leu Tyr Arg Glu

225 230 235

GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG GAG ATC ACT GCT GCC 768

Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr Val Glu Ile Thr Ala Ala

240 245 250 255

GAG TTT GCC GCG CCT TCT ACC GAG GAA AGA AGC CTC TAT AGT GCC TTT 816

Glu Phe Ala Ala Pro Ser Thr Glu Glu Arg Ser Leu Tyr Ser Ala Phe

260 265 270

ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT TCG GCT CAA ACG CAC 864

Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp Asp Ser Ala Gln Thr His

275 280 285

AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC GAG AAG ACA GAG TGG 912

Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu Ser Glu Lys Thr Glu Trp

290 295 300

GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC CTG CGT CAT GAC TAC 960

Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu Tyr Leu Arg His Asp Tyr

305 310 315

CTT GTC CTG CAC AAC TCT AGT GAA GCC GAA ACC CAA CAG CCA CCG GCT 1008

Leu Val Leu His Asn Ser Ser Glu Ala Glu Thr Gln Gln Pro Pro Ala

320 325 330 335

GCA CCG CCA GCA GCA CCA GCA CTG TCT GCT GCG GAT ACC AAA CCG GGT 1056

Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Leu Ser Ala Ala Asp Thr Lys Pro Gly

340 345 350

ACG ACT GGC TCT GGT GCA GGC AGT GGT GGT CCG GGT GGC CTG ACC AGC 1104

Thr Thr Gly Ser Gly Ala Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gly Leu Thr Ser

355 360 365

GCT GCG CCT GCC GGC GGT GAC AAG AAA GTG ATT GCG ACC AAA GTT CTG 1152

Ala Ala Pro Ala Gly Gly Asp Lys Lys Val Ile Ala Thr Lys Val Leu

370 375 380

GGC ACC GTG AAG TGG TTC AAT GTG CGC AAC GGC TAT GGT TTC ATC AAC 1200

Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Val Arg Asn Gly Tyr Gly Phe Ile Asn

385 390 395

CGT AAT GAT ACC AAG GAA GAT GTG TTT GTT CAT CAG ACT GCG ATC AAA 1248

Arg Asn Asp Thr Lys Glu Asp Val Phe Val His Gln Thr Ala Ile Lys

400 405 410 415

AAG AAC AAT CCG CGC AAA TAC TTA CGT AGC GTA GGT GAT GGT GAA ACC 1296

Lys Asn Asn Pro Arg Lys Tyr Leu Arg Ser Val Gly Asp Gly Glu Thr

420 425 430

GTG GAG TTT GAC GTG GTT GAA GGC GAG AAA GGT GCG GAA GCA GCG AAT 1344

Val Glu Phe Asp Val Val Glu Gly Glu Lys Gly Ala Glu Ala Ala Asn

435 440 445

GTG ACT GGT CCT GGT GGC GTT CCG GTG CAA GGC AGC AAG TAT GCT GCC 1392

Val Thr Gly Pro Gly Gly Val Pro Val Gln Gly Ser Lys Tyr Ala Ala

450 455 460

GAT CGT AAC CAC TAC CGT CGC TAT CCA CGT CGT CGC GGT CCT CCG CGC 1440

Asp Arg Asn His Tyr Arg Arg Tyr Pro Arg Arg Arg Gly Pro Pro Arg

465 470 475

AAC TAC CAA CAG AAC TAT CAG AAT AGT GAA TCT GGT GAG AAG AAC GAA 1488

Asn Tyr Gln Gln Asn Tyr Gln Asn Ser Glu Ser Gly Glu Lys Asn Glu

480 485 490 495

GGC AGT GAG AGT GCT CCG GAA GGC CAG GCG CAG CAA CGC CGT CCG TAT 1536

Gly Ser Glu Ser Ala Pro Glu Gly Gln Ala Gln Gln Arg Arg Pro Tyr

500 505 510

CGC CGT CGC CGC TTC CCA CCG TAC TAT ATG CGT CGT CCG TAT GGT CGT 1584

Arg Arg Arg Arg Phe Pro Pro Tyr Tyr Met Arg Arg Pro Tyr Gly Arg

515 520 525

CGT CCG CAG TAT AGC AAC CCA CCG GTT CAG GGT GAA GTG ATG GAA GGT 1632

Arg Pro Gln Tyr Ser Asn Pro Pro Val Gln Gly Glu Val Met Glu Gly

530 535 540

GCG GAT AAC CAA GGT GCA GGT GAA CAA GGT CGT CCA GTT CGT CAG AAT 1680

Ala Asp Asn Gln Gly Ala Gly Glu Gln Gly Arg Pro Val Arg Gln Asn

545 550 555

ATG TAT CGT GGA TAC CGT CCG CGC TTT CGC CGT GGC CCT CCA CGC CAG 1728

Met Tyr Arg Gly Tyr Arg Pro Arg Phe Arg Arg Gly Pro Pro Arg Gln

560 565 570 575

CGT CAA CCG CGT GAA GAT GGC AAT GAG GAA GAC AAA GAG AAC CAG GGC 1776

Arg Gln Pro Arg Glu Asp Gly Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Gln Gly

580 585 590

GAT GAA ACC CAA GGT CAG CAA CCA CCG CAA CGT CGC TAT CGC CGC AAC 1824

Asp Glu Thr Gln Gly Gln Gln Pro Pro Gln Arg Arg Tyr Arg Arg Asn

595 600 605

TTC AAC TAT CGT CGC CGT CGT CCA GAG AAT CCG AAA CCT CAG GAT GGC 1872

Phe Asn Tyr Arg Arg Arg Arg Pro Glu Asn Pro Lys Pro Gln Asp Gly

610 615 620

AAA GAG ACC AAA GCA GCT GAC CCA CCA GCG GAG AAT AGC TCT GCT CCG 1920

Lys Glu Thr Lys Ala Ala Asp Pro Pro Ala Glu Asn Ser Ser Ala Pro

625 630 635

GAA GCG GAA CAA GGC GGT GCA GAG TAA TGA CTC GAG 1956

Glu Ala Glu Gln Gly Gly Ala Glu ***

640 645

<---

1. Генетическая конструкция, имеющая последовательность SEQ ID N1 и кодирующая предшественник белка YB-1 человека, содержащего в своем составе последовательность декстран-связывающего домена GBD-7 глюкансукразы штамма NRRL B512-F, последовательность температурочувствительного варианта IntMUT интеина PRP8 P. chrysogenum и последовательность зрелого белка YB-1 человека.

2. Штамм Escherichia coli ECR-proYB-1 - продуцент предшественника белка YB-1 человека, полученный путем введения генетической конструкции по п. 1 в клетки реципиентного штамма Escherichia coli ВКПМ В-10189.

3. Способ микробиологического синтеза предшественника белка YB-1 человека, путем культивирования штамма-продуцента по п. 2 в подходящих условиях в присутствии индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) или лактозы.