Способ получения вирусбезопасного раствора иммуноглобулина g человека для внутримышечного введения

Изобретение относится к медицине и касается способа получения вирусбезопасного раствора иммуноглобулина G для внутримышечного введения, включающего выделение иммуноглобулиновой фракции II Кона (осадка В) из плазмы крови здоровых доноров методом спиртового фракционирования и дополнительную очистку от примесей и вирусов, где удаление вирусов осуществляют методом глубинной фильтрации на фильтрующем материале с анионообменным эффектом, при рН раствора от 6,0 до 7,0, а инактивацию вирусов проводят при инкубации стерильного раствора иммуноглобулина при низком рН 4,5, температуре от 36°С в течение 24-38 часов, с последующей очисткой ультрафильтрацией с одновременной корректировкой белка и рН, введением в раствор стабилизатора глицина, проведением стерилизующей фильтрации, при этом последовательность технологических стадий и оптимальные условия процесса для каждой стадии, направленной на редукцию вирусов, определяют в процессе валидационных испытаний при преднамеренном заражении исследуемого материала модельными вирусами, моделировании производственного процесса в лабораторном масштабе и определении уровня вирусной редукции в логарифмах. Изобретение обеспечивает повышение качества и безопасности выпускаемых препаратов иммуноглобулинов за счет введения в технологический процесс дополнительных стадий удаления и инактивации вирусов, эффективность которых подтверждена экспериментально. 6 пр., 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к биофармацевтической промышленности, и может быть использовано для получения вирусологически безопасных препаратов из плазмы крови, в частности иммуноглобулина G человека для внутримышечного введения.

Иммуноглобулины человека для внутримышечного введения производят двух видов: нормальные (поливалентные), которые содержат усредненный уровень различных антител, характерный для популяции доноров, и специфические или гипериммунные, в которых согласно рекомендациям ВОЗ количество отдельных видов антител должно быть в 5 и более раз выше, чем в нормальных препаратах.

Иммуноглобулин человека нормальный для внутримышечного введения применяется для профилактики гепатита А, кори, коклюша, менингококковой инфекции, полиомиелита. Иммуноглобулины человека специфические предназначены для профилактики и лечения конкретных заболеваний, например, клещевого энцефалита, гепатита В, бешенства, стафилококковой инфекции, а иммуноглобулин человека противоаллергический для лечения аллергических заболеваний. Лечебный эффект препаратов достигается благодаря их уникальному составу - концентрату антител, содержащихся в иммунологически активной фракции плазмы крови здоровых доноров, в том числе доноров, иммунизированных определенными антигенами.

Являясь уникальной биологической субстанцией, плазма крови доноров, несмотря на предпринимаемые меры безопасности, может содержать различные инфекционные агенты, наиболее опасными из которых являются вирусы. Это требует применения специальных технологических подходов для снижения риска вирусной контаминации [1]. Традиционно для выделения иммуноглобулинов используют метод спиртового фракционирования, который признан эффективным против большинства известных вирусов. Однако недостатком его является то, что в зависимости от условий проведения процесса распределение патогенов по фракциям плазмы может быть неравномерным, что, в свою очередь, не позволяет гарантировать безопасность получаемых препаратов [2].

Известен способ получения иммуноглобулина G человека из иммуноглобулиновой фракции плазмы крови человека путем растворения ее в буфере в условиях кислого рН в диапазоне от 4,6-4,95, добавления в промежуточный раствор каприлат и/или гептаноат-ионов, установления рН 4,8-4,95 для формирования осадка примесных белков, инкубации супернатанта в присутствии каприлат- и/или гептаноат-ионов при их концентрации 10-30 мМ для инактивации вирусов, проведения, как минимум, одной хроматографии при рН 5,0-5,2, а также включения в процесс по выбору дополнительных стадий инактивации/удаления вирусов, а именно, сольвент-детергентной обработки, нанофильтрации или глубинной фильтрации, причем контакт с фильтром должен проводиться при рН 3,5-4,5, предпочтительно рН 4,0±0,1 [3].

Недостатком данного способа является многостадийность технологического процесса, а также использование каприлата натрия, который может оказать негативное влияние на структуру молекулы иммуноглобулина G. Кроме того, по данным наших исследований выбранные условия противовирусной фильтрации на глубинных фильтрах, а именно, при рН 3,5-4,5, предпочтительно 4,0±0,1, не обеспечивают эффективного уровня редукции вирусов.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому, выбранным в качестве прототипа, является способ получения иммуноглобулина человека нормального для внутримышечного введения, производство которого осуществляется по ФС №42-3198-95, включает выделение фракции II Кона (осадка В) методом спиртового фракционирования, растворение ее в воде для инъекций, дополнительную очистку раствора иммуноглобулина фильтрацией и ультрафильтрацией, стерилизующую фильтрацию.

Известный способ не предусматривает использования дополнительных стадий инактивации и/или элиминации вирусов. В России данным способом выпускались иммуноглобулины человека (нормальный и специфические) до введения в действие ОФС.1.8.1.0001.15 «Лекарственные препараты из плазмы крови человека», в соответствии с которой предусматривается внедрение в технологию производства нескольких стадий вирусной инактивации и/или элиминации вирусов [4].

Техническая проблема, решаемая предлагаемым изобретением, - усовершенствование технологии производства препаратов иммуноглобулинов человека для внутримышечного введения, позволяющей получать вирусологически безопасные препараты с сохранением физико-химических свойств и специфической активности.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение качества и безопасности выпускаемых препаратов иммуноглобулинов за счет введения в технологический процесс дополнительных стадий удаления и инактивации вирусов, эффективность которых подтверждена экспериментально.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения вирусбезопасного раствора иммуноглобулина G для внутримышечного введения, включающем выделение иммуноглобулиновой фракции II Кона (осадка В) из плазмы крови здоровых доноров методом спиртового фракционирования и дополнительную очистку от примесей и вирусов, удаление вирусов осуществляют методом глубинной фильтрации на фильтрующем материале с анионообменным эффектом, способным удерживать патогенные агенты абсорбцией в сочетании с механическим захватом, при рН раствора от 6,0 до 7,0, предпочтительно 6,4-6,6, а инактивацию вирусов проводят при инкубации стерильного раствора иммуноглобулина при низком рН, а именно, не более 4,5, температуре не менее 36°С в течение 24 часов и более, с последующей очисткой ультрафильтрацией с одновременной корректировкой белка и рН, введением в раствор стабилизатора, проведением стерилизующей фильтрации, при этом последовательность технологических стадий и оптимальные условия процесса для каждой стадии, направленной на редукцию вирусов, определяют в процессе валидационных испытаний при преднамеренном заражении исследуемого материала модельными вирусами, как с липидной оболочкой, так и без липидной оболочки, моделировании производственного процесса в лабораторном масштабе и определении уровня вирусной редукции в логарифмах.

Вирусную редукцию определяют для каждой стадии процесса: на этапе выделения фракции II Кона (осадка В) методом спиртового фракционирования, глубинной фильтрации и инкубации стерильного раствора иммуноглобулина при низком значении рН.

В качестве модельных вирусов с липидной оболочкой используют вирус гепатита В человека, вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека I типа, вирус гепатита В утят, возбудителя вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.

В качестве модельных вирусов без липидной оболочки используют парвовирус В19 и полиовирус.

Сущность изобретения состоит в том, что оптимальные условия для удаления и инактивации вирусов, обеспечивающие должный уровень их редукции и, соответственно, вирусную безопасность препарата, устанавливают в процессе валидационных испытаний.

Ограничения, накладываемые стандартами Надлежащей производственной практики (GMP), не допускают намеренного внесения вирусов в зону производства. Эффективность стадий удаления и инактивации вирусов для производственных процессов проверяют путем преднамеренного заражения исследуемого материала модельными вирусами, моделирования производственного процесса в лабораторных условиях и определения уровня вирусной редукции в логарифмах (log₁₀) при разных условиях [5]. Каждую технологическую стадию моделируют отдельно, уменьшая процесс в 1000 и более раз. Выбор вирусов для проведения исследований осуществляют, исходя из возможных рисков и биологических особенностей патогенных агентов. Для исследования выбирают представителей ДНК и РНК-содержащих вирусов, как с липидной оболочкой, так и без нее. Исходная концентрация модельных вирусов должна быть максимально высокой, чтобы адекватно оценить уровень вирусной редукции, при этом объем добавляемой вирусной суспензии не должен превышать 10%, чтобы не изменить состав исходного материала.

Уровень вирусной редукции (R) определяют до и после обработки для каждой стадии процесса: выделения фракции II Кона (осадка В) методом спиртового фракционирования, глубинной фильтрации и инкубации стерильного раствора иммуноглобулина при низком значении рН.

Для расчета используют следующую формулу (1):

V₁ - объем (масса) исходного материала

T₁- концентрация вируса в исходном материале,

V₂ - объем (масса) в материале после моделирования технологической стадии,

Т₂ - концентрация вируса в материале после моделирования технологической стадии [6].

Для оптимизации параметров технологического процесса валидационные испытания проводят один раз. В дальнейшем повторные испытания могут быть выполнены при необходимости внесения изменений в технологию.

В соответствии с требованиями ВОЗ снижение титра вируса на уровне 4 log₁₀ или более, указывает на эффективность стадии инактивации/удаления для конкретного вируса, подвергающегося исследованию [7].

Способ осуществляют следующим образом.

Сырьем для получения иммуноглобулина человека нормального и специфических для внутримышечного введения является плазма крови здоровых доноров, в том числе иммунизированных против гепатита В, клещевого энцефалита, бешенства, стафилококковой инфекции и других инфекционных заболеваний. Плазму контролируют на вирусную безопасность в соответствии с ФС.3.3.2.0001.15 [8]. Показатели активности специфических антител для иммунной плазмы, предназначенной для производства специфических иммуноглобулинов, должны соответствовать регламентным.

Иммуноглобулиновую фракцию II Кона (осадок В), полученную методом спиртового фракционирования, растворяют в охлажденной до 2-8°С стерильной воде для инъекций до регламентируемых показателей концентрации белка, обычно 2,5-5,5%, устанавливают рН 6,5-7,5 и подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Раствор выстаивают от 8 часов до 30 дней при температуре 2-8°С для формирования осадка денатурированных белков, полимеров и нестабильных примесей, сформировавшийся осадок удаляют центрифугированием или фильтрацией. Далее в растворе иммуноглобулина G устанавливают рН 6,0-7,0, предпочтительно 6,4-6,6, и пропускают через фильтрующий материал с анионообменным эффектом, способный удерживать вирусы абсорбцией в сочетании с механическим захватом, например ZetaPlus® VR06 (производство компании 3М), с допустимой скоростью потока не более 0,25 мл/см²/мин при температуре (20-28)°С. Данные параметры глубинной фильтрации были выбраны в ходе валидационных испытаний на модельных вирусах в лабораторных условиях и являются оптимальными, так как снижение или увеличение рН от заданной величины уменьшает способность фильтрующего материала сорбировать вирусные частицы. Проводят стерилизующую фильтрацию. Для дополнительной инактивации вирусов в растворе иммуноглобулинов проводят инкубацию стерильного раствора иммуноглобулина при низком значении рН не более 4,5 и прогревании его при температуре не менее 36°С и времени инкубации 24 ч и более. Затем проводят разбавление раствором натрия хлорида 0,9% с последующим концентрированием препарата до первоначального объема методом ультрафильтрации, одновременно корректируя белок по показателю преломления по рефрактометру до 1,356-1,358 и рН до 6,5-7,5. После этого в емкость с раствором иммуноглобулина добавляют расчетное количество глицина для стабилизации физических свойств, устанавливают содержание белка в растворе иммуноглобулина до регламентированных параметров и передают на осветляющую и стерилизующую фильтрацию, после чего разливают препарат в ампулы или флаконы.

Для оценки уровня вирусной редукции спиртового фракционирования процесс моделировали в лабораторных условиях путем его уменьшения в 1000 раз, соблюдая критические параметры, указанные в промышленном регламенте. Иммуноглобулин G человека выделяли из пулов плазмы крови, искусственно контаминированных актуальными гемотрансмиссивными вирусами с липидной оболочкой, а именно: вирусом гепатита С (ВГС) и вирусом гепатита В (ВГВ) и без липидной оболочки: парвовирусом В19 (B19V). Оценивали концентрацию ДНК B19V, РНК ВГС, ДНК ВГВ методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в исходной плазме и по стадиям процесса и определяли уровень вирусной редукции с учетом изменения концентрации нуклеиновых кислот исследуемых вирусов и объема (веса) фракций в процессе фракционирования.

Установлено, что уровень вирусной редукции при получении фракции II Кона (осадка В) методом спиртового фракционирования составил более 5 log₁₀ для ВГВ и более 4 log₁₀ для ВГС и B19V. Таким образом, процесс спиртового фракционирования плазмы крови, выполненный в соответствии с действующим регламентом производства для производства иммуноглобулина G человека, можно признать эффективным в удалении значимых гемотрансмиссивных вирусов.

Исследования, подтверждающие эффективность удаления вирусов методом глубинной фильтрации на материале ZetaPlus® VR06, и выбор оптимальных параметров противовирусной фильтрации были выполнены с использованием вируса полиомиелита (PV, вирус без липидной оболочки) и вируса гепатита В уток (ВГВУ, модель с липидной оболочкой вируса гепатита В человека), которые добавляли в раствор иммуноглобулина перед проведением процесса. Воспроизведение процесса фильтрации в лабораторных условиях осуществляли с использованием капсюлей BioCap25 ZetaPlus® VR06 с площадью фильтрации 25 см² (производство компании 3М). Основные параметры рассчитывали, исходя из рекомендуемой производителем удельной скорости фильтрации (0,25 мл/см²/мин) и объема производственной серии иммуноглобулина G человека для внутримышечного введения. Фильтрацию вируссодержащих растворов иммуноглобулина G человека для внутримышечного введения с установленной вирусной нагрузкой, концентрацией белка не более 6% проводили при комнатной температуре (20-28°С) в диапазоне рН от 4,5 до 7,5. Отбирали образцы фильтрата для оценки вирусной нагрузки через каждые 100 мл. Определяли вирусную нагрузку в образцах до и после фильтрации и рассчитывали фактор вирусной редукции по формуле (1).

В результате проведенных испытаний были установлены оптимальные параметры фильтрации, позволяющие эффективно удалять исследуемые вирусы и обеспечивать надежный уровень вирусной редукции исследуемых вирусов, включая представителя вирусов без липидной оболочки, 4 log и более: рекомендуемая скорость потока 0,25 мл/см²/мин, рН раствора от 6,0 до 7,0, оптимально 6,4-6,6, максимальная нагрузка на фильтр не более 80 л на 1 м² фильтрующей поверхности. Воспроизводимость указанного режима была подтверждена в опытах с тремя сериями растворов иммуноглобулинов G человека для внутримышечного введения.

Исследования, подтверждающие эффективность инактивации вирусов на стадии инкубации стерильного раствора иммуноглобулина при низком значении рН путем прогрева растворов иммуноглобулинов G человека для внутримышечного введения при рН не более 4,5, температуре не менее 36°С в течение 24 часов и более, выполнены с использованием трех вирусов с липидной оболочкой: вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), ВГВУ (модель вируса гепатита В человека), возбудителя вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВВД-БС КРС, модель вируса гепатита С человека). Вируссодержащую суспензию («спайк») вносили в раствор иммуноглобулина на соответствующей стадии, определяли вирусную нагрузку, устанавливали в растворах рН в диапазоне 4,0-7,0, прогревали при температуре от 36 до 38°С в течение 1-120 часов, после инкубации определяли вирусную нагрузку в образцах. Уровень вирусной редукции определяли по формуле (1). Оптимальным считали режим инактивации (рН, время), обеспечивающий уровень вирусной редукции не менее 4 log₁₀ в двух последовательных контрольных точках процесса (время). Испытания, выполненные в модельных опытах на трех сериях растворов иммуноглобулинов G человека для внутримышечного введения, показали, снижение титра инфекционности вирусов на 4 log₁₀ и более при рН не более 4,5, температуре не менее 36°С в течение 24 часов и более, что в соответствии с требованиями ВОЗ позволяет считать данную технологическую стадию эффективной для инактивации вирусов.

Таким образом, эффективность инактивации/удаления вирусов при получении препаратов иммуноглобулина G человека для внутримышечного введения заявленным способом была подтверждена с использованием семи различных вирусов: двух вирусов без липидной оболочки (вируса полиомиелита и парвовируса В19) и пяти вирусов с липидной оболочкой: ВИЧ-1, ВГВ, ВГВУ в качестве модели вируса гепатита В человека, ВГС, ВВД-БС КРС в качестве модели вируса гепатита С. Было подтверждено, что процесс спиртового фракционирования и каждая из двух дополнительных стадий, как глубинная фильтрация на материале с анионообменным эффектом ZetaPlus VR06 при рН 6,0-7,0, так и инкубация стерильного раствора иммуноглобулина G человека при рН не более 4,5, температуре не менее 36°С в течение 24 часов и более, способны снижать на каждой стадии титр вирусов на 4 log и более.

В результате проведенных исследований был установлен суммарный уровень вирусной редукции при получении препаратов иммуноглобулина G человека для внутримышечного введения (нормального и специфических), который для вирусов без липидной оболочки составил более 8 log₁₀, для вирусов с липидной оболочкой, а именно, ВИЧ-1 более 4 log₁₀, ВГВ более 14 log₁₀, ВГС более 9 log₁₀. Данные по уровню редукции приведены в таблице 1.

На основании представленных данных продукт, полученный заявленным способом, может рассматриваться как вирусбезопасный. Преимуществом является то, что предложенный способ не предполагает использование химических реагентов, которые могут оказать негативное влияние на молекулу иммуноглобулина G человека.

Пример 1. 4,0 кг спиртовой фракции II Кона (осадок В) растворяют в охлажденной до 2-8°С воде до концентрации белка 2,5%, устанавливают рН 6,5 и подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Раствор выстаивают 8 часов при температуре 2-8°С. Образовавшийся осадок денатурированных белков, полимеров и нестабильных примесей удаляют осветляющей фильтрацией. В растворе иммуноглобулина G устанавливают рН 6,0 и пропускают через фильтрующий материал Zeta Plus® VR06, соблюдая рекомендуемую скорость потока и нагрузку на фильтрующую поверхность. Затем с помощью 0,1 н раствора соляной кислоты в растворе устанавливают рН 4,0 и прогревают его при температуре 38°С в течение 48 часов. Раствор разбавляют пятикратным объемом раствора натрия хлорида 0,9% и проводят концентрирование до первоначального объема с одновременной коррекцией белка по показателю преломления по рефрактометру 1,356-1,358 и рН до 6,5-7,5. В емкость с раствором иммуноглобулина добавляют расчетное количество глицина до конечной концентрации 0,3 М (2,25±0,05)%. Проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию через соответствующие фильтромембраны, заправленные в фильтродержатель. Фильтрат собирают в стерильную емкость. Отбирают пробу для контроля качества по показателям спецификации. Для стабилизации физических показателей стерильный раствор иммуноглобулина выдерживают в течение 1-1,5 мес. при температуре от 18 до 25°С. Раствор разливают в ампулы или флаконы.

Пример 2. 4,5 кг спиртовой фракции II Кона (осадок В) растворяют в охлажденной до 2-8°С воде до концентрации белка 5,5%, устанавливают рН 7,5 и подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Раствор выстаивают 30 дней при температуре 2-8°С. Образовавшийся в процессе отстаивания осадок денатурированных белков, полимеров и нестабильных примесей удаляют осветляющей фильтрацией. В растворе иммуноглобулина G устанавливают рН 6,5 и пропускают через фильтрующий материал Zeta Plus® VR06. Затем с помощью 0,1 н раствора соляной кислоты в растворе устанавливают рН 4,5 и прогревают его при температуре 36°С в течение 24 часов. Раствор разбавляют пятикратным объемом раствора натрия хлорида 0,9% и проводят концентрирование до первоначального объема с одновременной коррекцией рН до 7,5. Содержание белка доводят до 9,5-10,5% и вносят глицин до конечной концентрации 0,3 М (2,25±0,05)%. Проводят стерилизующую фильтрацию. Фильтрат собирают в стерильную емкость. Отбирают пробу для контроля качества по показателям спецификации. Для стабилизации физических показателей стерильный раствор иммуноглобулина выдерживают в течение 1-1,5 мес. при температуре от 18 до 25°С, а затем разливают в ампулы или флаконы.

Пример 3. Иммунную плазму, содержащую антитела к стафилококковому экзотоксину, объединяют в производственную загрузку. В производственном пуле содержание антиальфастафилолизина составляет не менее 2 МЕ/мл. Проводят выделение специфической иммуноглобулиновой фракции (осадка В) спиртовым методом при низких температурах. Полученную в процессе фракционирования спиртовую фракцию II Кона (осадок В) в количестве 4,5 кг заливают охлажденной стерильной водой для инъекций в соотношении 1:5 и перемешивают при температуре (2-4)°С до получения однородного раствора. Доводят концентрацию белка в растворе до 4,5%, устанавливают рН 7,0. Раствор иммуноглобулина фильтруют через стерилизующие фильтры и выстаивают 14 дней при температуре (2-8)°С. Образовавшийся осадок удаляют фильтрацией. Устанавливают в растворе иммуноглобулина значения рН 6,5 и пропускают через фильтрующий материал Zeta Plus® VR06. Добавляют кислоты соляной раствор 0,1 н до значения рН 4,0 и проводят стерилизующую фильтрацию. Стерильный раствор иммуноглобулина для дополнительной инактивации вирусов прогревают при 36°С в течение 48 часов. Раствор разбавляют пятикратным объемом раствора натрия хлорида 0,9% и проводят концентрирование до первоначального объема с одновременной коррекцией рН до 7,0. Корректируют содержание белка до 9,5%. Стабилизируют глицином из расчета 15-30 г глицина на 1 л раствора иммуноглобулина. Проводят стерилизующую фильтрацию. Отбирают пробу для контроля качества по показателям спецификации. Содержание анти-альфастафилолизина в готовом препарате составляет не менее 20 МЕ/мл. Разливают препарат в ампулы или флаконы.

Пример 4. Эффективность удаления вирусов при выделении иммуноглобулиновой фракции II Кона (осадка В) методом спиртового фракционирования проверяют путем преднамеренного заражения материала значимыми вирусами и моделирования производственного процесса в лабораторных условиях. В плазму для фракционирования, проверенную на отсутствие вирусных маркеров, вносят растворы стандартных образцов, аттестованных по содержанию ДНК ВГВ, РНК ВГС, ДНК B19V, до конечной концентрации вирусных нуклеиновых кислот не менее 5 log₁₀ МЕ/мл, при этом объем добавляемых вируссодержащих растворов не должен превышать 10% от общего объема плазмы. Замеряют объем полученного пула плазмы. Определяют концентрацию нуклеиновых кислот вирусов в сформированном модельном пуле методом ПЦР.

Выделяют из контаминированного вирусами модельного пула плазмы фракцию II Кона (осадок В) методом спиртового фракционирования. Определяют количество выделенного осадка В. Тестируют образец полученного осадка В, предварительно разведенного стерильным изотоническим раствором натрия хлорида до гомогенного состояния в весовом соотношении 1:4, на количественное содержание ДНК ВГВ, РНК ВГС, ДНК B19V методом ПЦР. Рассчитывают концентрацию вирусных нуклеиновых кислот в осадке В с учетом фактора разведения. Устанавливают уровень вирусной редукции в модельном процессе по формуле (1).

Уровень вирусной редукции составил (5,29±0,19) log₁₀, (4,24±0,04) log₁₀ и (4,56±0,14) log₁₀ для вирусов ВГВ, ВГС и B19V, соответственно, что позволяет считать процесс спиртового фракционирования плазмы крови эффективным в удалении вирусов.

Пример 5. Для оптимизации параметров противовирусной фильтрации проводят серию модельных опытов с вирусом гепатита В уток в качестве модели ВГВ - одного из наиболее устойчивых гемотрансмиссивных вирусов человека с липидной оболочкой и вируса полиомиелита человека (PV) в качестве модели вирусов без липидной оболочки. Испытания проводят в лабораторных условиях.

В растворы фракции II Кона (осадка В), полученные после стадий осветляющей и стерилизующей фильтрации, выдерживания в течение 14 дней и осветляющей фильтрации, с содержанием белка 4,5% вносят отдельно ВГВУ и PV до конечной концентрации вирусного генома в растворе не менее 10⁴ копий/мл. Для каждого контаминированного раствора иммуноглобулина готовят серию образцов по 500 мл каждая с рН раствора от 4,5 до 7,5. Определяют концентрацию вирусных геномов в растворах до начала фильтрации методом ПЦР. Образцы пропускают через капсюли BioCap25 ZetaPlus® VR06 с площадью фильтрации 25 см² (один образец - один фильтр) со скоростью потока 6 мл/мин (удельный поток 0,25 мл/см²/мин) при комнатной температуре, отбирая аликвоты фильтрата через каждые 100 мл. Фильтр предварительно промывают водой очищенной стерильной объемом 150 мл при скорости потока до 50 мл/мин. Подачу раствора на фильтр осуществляют перистальтическим насосом. Нулевой точкой эксперимента считают время появления фильтрата на выходе из фильтра. Определяют концентрацию ДНК ВГВУ и РНК PV в образцах фильтрата методом ПЦР. Оценивают уровень вирусной редукции в каждой тестируемой точке фильтрации по формуле (1).

Эффективным считают режим глубинной фильтрации, обеспечивающий уровень вирусной редукции не менее 4 log₁₀.

В ходе проведения экспериментов было установлено, что уровень вирусной редукции 4 log₁₀ и более обеспечивает глубинная фильтрация растворов иммуноглобулинов с рН 6,0-7,0, оптимально 6,4-6,6, при комнатной температуре со скоростью потока 0,25 мл/см²/мин и максимальной нагрузке на фильтр 40-80 л на 1 кв. м фильтрующей поверхности.

Пример 6. Эффективность вирусинактивирующей стадии инкубации стерильных растворов иммуноглобулинов при низком значении рН и определение оптимального режима инактивации осуществляют с использованием в качестве модели ВГВУ, ВВД- БС КРС и ВИЧ-1. Особенностью методологического подхода для оценки эффективности вирусной инактивации является работа с биологическими моделями живых систем в опытах in vivo и in vitro, позволяющая оценивать жизнеспособность вирусов. Для модельных опытов используют растворы фракции II Кона (осадок В) на соответствующей стадии технологического процесса. Растворы раздельно контаминируют ВГВУ, ВВД-БС КРС и ВИЧ-1, при этом объем вносимых вирусных суспензий в растворах иммуноглобулина не должен превышать 10%, а содержание вирусов в исходных растворах должно быть не менее 4 log₁₀ доз в соответствующих единицах измерения. Готовят серию контаминированных образцов иммуноглобулина с рН от 4,0 до 7,0. Определяют биоконцентрацию модельного вируса в образцах до вирусинактивирующей обработки. Инкубируют полученные растворы при температуре от 36 до 38°С в течение 1, 5, 24, 48, 120 ч. После инактивирующего воздействия определяют биоконцентрацию ВВД-БС КРС и ВИЧ-1 в условиях in vitro путем титрования экспериментальных образцов на чувствительных культурах клеток. Устанавливают отсутствие инфекционности ВГВУ путем моделирования ВГВУ-инфекции уток in vivo. Рассчитывают уровень вирусной редукции по формуле (1). Оптимальным считают режим инактивации (рН, время), обеспечивающий уровень вирусной редукции не менее 4 log₁₀ в двух последовательных контрольных точках процесса (время).

Оптимальным режимом является инкубация растворов иммуноглобулинов в течение 24-48 часов при значении рН менее 4,5 при температуре 36°С и выше, обеспечивающая уровень вирусной редукции более 4 log₁₀ для ВИЧ-1 и более 5 log₁₀ для ВГВУ и ВВД-БС КРС.

Качественные характеристики производственных серий препаратов иммуноглобулинов G человека для внутримышечного введения (нормального и специфических), полученных заявленным способом, представлены в табл.2.

Таким образом, предлагаемый способ получения раствора иммуноглобулина G человека для внутримышечного введения (нормального и специфических) обеспечивает высокий уровень очистки и вирусной безопасности и позволяет получать препараты с сохраненными физико-химическими свойствами и специфической активностью.

Литература

1. Обеспечение инфекционной безопасности препаратов из плазмы крови доноров (обзор литературы)/Н.В.Зубкова // Гематология и трансфузиология. - 2014. - №2. - С. 44-49.

2. Экспериментальное изучение удаления вирусов гепатита В, С и парвовируса В19 при фракционировании плазмы этиловым спиртом / Н.В. Зубкова [и др.] // Биопрепараты. - 2016. - Т. 16, №1 (57). - С. 43-48.

3. Пат. №2337109. МПК С07К 16/06, A61L 2/00. Препарат иммуноглобулина IgG и способ его получения [Электрон. ресурс] / А. Бухахер, Г. Иберер, Ю. Ремиш; заявл. 25.02.2005; опубл. 27.10.2008 - Электрон. Дан. - Режим доступа: // http://www.freepatent.ru/patents/2337109.

4. Лекарственные препараты из плазмы крови человека (ОФС 1.8.1.0001.15) [Электрон. ресурс] / Государственная Фармакопея РФ XIII издание. - 2015. - Т. 2. - С. 862-866. - Электрон. дан. - Режим доступа: http://www.femb.ru/feml.

5. Правила организации производства контроля качества лекарственных средств / Приказ Минпромторга России от 14.06.2013 г. №916.

6. Virus Validation Studies: the design contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses [Electronic resource] European Medicines Agency // CPMP/BWP/268/95 - Электрон. дан. - Режим доступа: // http://www.emea.europa.eu.

7. WHO Guidance document on viral inactivation and removal procedure intended to assure the viral safety of blood plasma products [Electronic resource] / WHO Technical Report, Series №924, Annex 4. - 2004. - Электрон. дан. - Режим доступа: //http://ww.who.int/bloodproducts/ publications /WHO_TRS_924_A4.pdf.

8. Плазма для фракционирования (ФС.3.3.2.0001.15) [Электрон, ресурс] / Государственная Фармакопея РФ XIII издание. - 2015. - Т. 3. - С. 1206-1212. - Электрон. дан. - Режим доступа: http://www.femb.ru/feml.

Способ получения вирусбезопасного раствора иммуноглобулина G для внутримышечного введения, включающий выделение иммуноглобулиновой фракции II Кона (осадка В) из плазмы крови здоровых доноров методом спиртового фракционирования и дополнительную очистку от примесей и вирусов, отличающийся тем, что удаление вирусов осуществляют методом глубинной фильтрации на фильтрующем материале с анионообменным эффектом, способным удерживать патогенные агенты абсорбцией в сочетании с механическим захватом, при рН раствора от 6,0 до 7,0, а инактивацию вирусов проводят при инкубации стерильного раствора иммуноглобулина при низком рН 4,5, температуре от 36°С в течение 24-38 часов, с последующей очисткой ультрафильтрацией с одновременной корректировкой белка и рН, введением в раствор стабилизатора глицина, проведением стерилизующей фильтрации, при этом последовательность технологических стадий и оптимальные условия процесса для каждой стадии, направленной на редукцию вирусов, определяют в процессе валидационных испытаний при преднамеренном заражении исследуемого материала модельными вирусами, как с липидной оболочкой, так и без липидной оболочки, актуальных с точки зрения риска контаминации основного сырья - плазмы крови доноров, моделировании производственного процесса в лабораторном масштабе и определении уровня вирусной редукции в логарифмах.