Способ дезагрегации культуральной жидкости бифидобактерий
Владельцы патента RU 2731071:
Федеральное Бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтической промышленности. Предложен способ дезагрегации культуральной жидкости бифидобактерий в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором посредством воздействия ферромагнитных тел диаметром 0,15 мм в течение 3-5 мин. Изобретение обеспечивает увеличение концентрации микробных клеток в ростовой среде и повышение выживаемости бактерий в процессе краткосрочного промежуточного хранения культуральной жидкости. 5 табл., 1 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способа дезагрегации культуральной жидкости бифидобактерий после выращивания перед приготовлением готовой формы препарата.
Известен (1) способ обработки 18-часовых культур штаммов бифидобактерий B.bifidum 791 и B.longum 379 после последовательного трехкратного пассирования на гидролизатно-молочной среде с целью снижения вязкости в микробных культурах бифидобактерий за счет разрушения межклеточного матрикса в клеточных ассоциациях путем ферментативного гидролиза ферментами мацеробациллином Г20х или целловиридином, обладающими полисахаридгидролизующим действием. Авторами установлено, что целловиридин не оказывал действия ни на гетерополисахарид капсул, ни на декапсулированные клетки, ни на их количество в ростовой среде. В то же время обработка мацеробациллином сопровождалась снижением вязкости культуральной жидкости и увеличением числа жизнеспособных бактерий на порядок.
Основным недостатком данного способа является присутствие остаточного количества не прореагировавших ферментов в культуральной жидкости, что крайне нежелательно при приготовлении лекарственных форм биопрепаратов.
Из этого же источника (1) известен способ обработки с той же целью культур штаммов бифидобактерий B.bifidum 791 и B.longum 379 после последовательного трехкратного пассирования на гидролизатно-молочной среде ультразвуком с частотой 10 Вт/см в течение 20 мин при температуре 37°С. Такое воздействие приводило к снижению вязкости культуральной жидкости (КЖ) на 28% и увеличению числа колониеобразующих единиц (КОЕ) почти на один порядок, не оказывая на декапсулированные клетки бифидобактерий видимого эффекта.
Данный способ сложно реализовать в промышленных условиях. Кроме того, авторами не приведены данные по выживаемости бифидобактерий после ультразвукового воздействия при кратковременном хранении культуральной жидкости перед дальнейшей переработкой.
В работе (2), в которой авторы исследовали возможность получения устойчивых суспензий Bacillus thuringiensis sp.kurstaki шт. Z-52 в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором посредством воздействия на культуральную жидкость ферромагнитных тел (ФМТ) цилиндрической формы, было показано, что при диспергировании модельной культуры В. subtilis ФМТ диаметром 5 мм и длиной 10 мм выживаемость клеток остается на уровне контроля, но устойчивой суспензии не образуется. При диспергировании той же КЖ, но с добавками минерального масла, ФМТ диаметром 0,15 мм и длиной 5 мм происходит инактивация микроорганизмов, а в результате диспергирования ФМТ диаметром 0,5 мм и длиной 10 мм в течение 5 мин образование устойчивой суспензии сопровождается повышением выживаемости бацилл в 1,05-1,31 раза, что возможно только за счет дезагрегации клеток.
Этот способ обработки является наиболее близким по технической сущности к заявляемому. К сожалению, он обеспечивает недостаточную степень повышения концентрации микроорганизмов в ростовой среде. К тому же авторы не приводят данных по выживаемости микроорганизмов при краткосрочном промежуточном хранении.
Общим признаком заявляемого изобретения и прототипа является дезагрегация культуральной жидкости микроорганизмов в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором посредством воздействия ферромагнитных тел.
Технической проблемой, решаемой при создании изобретения, является разработка способа дезагрегации культуральной жидкости бифидобактерий после культивирования, позволяющего увеличить концентрацию микробных клеток в ростовой среде, а также повысить выживаемость бактерий в процессе краткосрочного промежуточного хранения культуральной жидкости перед приготовлением готовой формы препарата.
Техническим результатом настоящего изобретения является тот факт, что заявленный способ дезагрегации культуральной жидкости бифидобактерий после культивирования позволяет повысить выживаемость бактериальных клеток в ростовой среде в конце краткосрочного промежуточного хранения втрое по сравнению с прототипом, а культуральная жидкость, полученная при реализации заявленного способа, обладает в 3 раза большей концентрацией бактериальных клеток по сравнению с препаратами, приготовленными в соответствии с прототипом.
Сущность изобретения заключается в том, что дезагрегацию культуральной жидкости бифидобактерий осуществляют в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором посредством воздействия ферромагнитных тел диаметром 0,15 мм в течение 3-5 мин.
Из данных литературы (3) известно, что некоторые штаммы бифидобактерий в поздней экспоненциальной и стационарной фазах роста обладают способностью к почкованию и дихотомическому 2-4-6-8-латеральному ветвлению. Происходит мультисептация ветвящихся филаментов, блокирование отделения образовавшихся клеток, в результате чего формируются конгломераты, которые могут включать десятки микробных тел. Мицелиальные конгломераты образуются при помощи межклеточных связей преимущественно за счет слияния клеточных стенок, посредством капсулярных структур, в том числе синтезируемого клеткой органического макромолекулярного матрикса. Образование клеточных ассоциаций в культуральной жидкости сопровождается истощением питательных веществ, накоплением метаболических «ядов», увеличением активной кислотности и т.д.
Нашими собственными исследованиями установлено, что наибольшая концентрация бифидобактерий в среде культивирования в процессе дезагрегации ее в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором достигается в течение 3-5 мин ферромагнитными телами цилиндрической формы диаметром 0,15 мм.
Результаты проведенных исследований показывают, что дезагрегация в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором суспензий бифидобактерий после культивирования обеспечивает два преимущества. Первое - за счет лучшей выживаемости клеток бифидобактерий в процессе краткосрочного хранения при низкой положительной температуре повышается гибкость всей технологии приготовления сухих препаратов за счет исключения необходимости немедленного сублимационного высушивания выращенных микроорганизмов. Второе - вследствие существенного увеличения (до 20 раз) содержания в культуральной жидкости жизнеспособных клеток повышается экономическая эффективность производства бифидосодержащих пробиотических и пребиотических сухих препаратов, т.к. пропорционально увеличивается количество доз препарата, которое может быть получено из единицы веса (г, кг) высушенной биомассы требуемого штамма бифидобактерий.
Согласно изобретению, увеличение концентрации микробных клеток в ростовой среде, а также повышение выживаемости бактерий в процессе краткосрочного промежуточного хранения культуральной жидкости обеспечивается тем, что дезагрегацию осуществляют в течение 3-5 мин ферромагнитными телами диаметром 0,15 мм.
В серии экспериментов по дезагрегации межклеточного матрикса КЖ бифидобактерий использовали лабораторный электромагнитный аппарат с плоским двухсторонним индуктором, аналогичный описанному в (2). Объем рабочей камеры аппарата составлял 220 мл, а обрабатываемой суспензии - 100 мл. Загрузка ФМТ в рабочую камеру не превышала 10 г. Обработку осуществляли ФМТ цилиндрической формы диаметром 0,15 мм и длиной 4,5 мм. В первом случае обрабатывали КЖ 3-й генерации В. bifidum 791, выращенной на тиогликолевой (ТГ) среде (таблица 1), а во втором - КЖ В. adolescentis МС-42, выращенной на казеиново-дрожжевой (КД-5) среде (таблица 2).
В прототипе максимальная продолжительность воздействия на КЖ микроорганизмов составляла 5 мин, что было вызвано спецификой постановки эксперимента. Мы же не были связаны подобными ограничениями, поэтому была исследована продолжительность процесса до 10 мин (таблица 2). Было показано, что максимальная концентрация бифидобактерий в КЖ достигается к 5 минуте процесса (таблица 1). При этом содержание бифидобактерий, по сравнению с КЖ до дезагрегации, увеличивается в 20 раз.
Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что дезагрегация в электромагнитном аппарате КЖ более 5 мин не приводит к увеличению концентрации бифидобактерий. Следовательно, более продолжительная обработка КЖ не целесообразна.
Другие устройства, предназначенные для обработки жидких сред, также позволяют осуществлять разрушение агрегатов бифидобактерий в КЖ, однако повышение концентрации микробов в ростовой среде происходит в меньшей степени, чем в заявляемом способе. О чем свидетельствуют данные таблицы 3, в которой представлены результаты по дезагрегации КЖ культуры В. adolescentis МС-42, выращенной на КД-5, в лабораторном гомогенизаторе MLW при 1500 об/мин. Объем обрабатываемой суспензии 100 мл.
В данном устройстве максимальная концентрация клеток достигается к 1-2 минуте процесса, и к третьей минуте прирост клеток идет на убыль. То есть, дальнейшая обработка на таких оборотах ротора уже не приводит к увеличению количества бифидобактерий в КЖ. Поэтому увеличение времени дезагрегации для достижения желаемого результата не имеет смысла, а повышение оборотов ротора для интенсификации процесса невозможно из-за обильного пенообразования.
Из работы (4) известно, что при обработке различных материалов в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором на результат процесса помимо его продолжительности существенное влияние оказывает диаметр (d, мм) используемых ФМТ цилиндрической формы, и в меньшей степени их длина (1, мм).
Авторами были проведены исследования по влиянию диаметра ферромагнитных тел на результат процесса (таблица 4). Обработке в электромагнитном аппарате подвергали КЖ культуры В. adolescentis МС-42 третьей генерации, выращенной на ТГ среде. Объем рабочей камеры аппарата - 220 мл, а обрабатываемой суспензии - 100 мл. Загрузка ФМТ в рабочую камеру - 10 г. Продолжительность обработки - 3 мин.
Как следует из анализа данных табл. 4, ФМТ диаметром 0,15; 0,25 и 0,5 мм обеспечивают повышение количества бактерий в результате дезагрегации КЖ. ФМТ d=0,75 мм не вызывают разрушения межклеточного матрикса, поэтому концентрация клеток в ростовой среде остается без изменений (или прирост клеток равен их инактивации), а ФМТ d=1,0 мм вызывают инактивацию бифидобактерий при такой продолжительности процесса дезагрегации. Кроме того, ФМТ диаметром 0,15 обеспечивают лучшую выживаемость дезагрегированных клеток в КЖ на 8 сутки хранения при температуре (6±2)°С. Следовательно, ФМТ диаметром 0,15 мм вызывают меньшее количество сублетальных повреждений клеток при обработке в электромагнитном аппарате при указанной продолжительности процесса.
Таким образом, на основании приведенных здесь результатов исследований по дезагрегации КЖ бифидобактерий в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором установлено:
1. максимальная концентрация бифидобактерий в результате дезагрегации КЖ достигается при продолжительности процесса 3-5 мин;
2. наибольшее содержание клеток в КЖ обеспечивает, при прочих равных условиях, использование ФМТ диаметром 0,15 - 0,25 мм;
3. ФМТ диаметром 0,15 мм способствуют лучшей выживаемости дезагрегированных клеток в процессе краткосрочного хранения при низких положительных температурах.
Следует сразу отметить, что использование ФМТ меньшего диаметра, чем 0,15 мм, в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором непрерывного действия практически не осуществимо, так как нет эффективного технически реализуемого решения удержания таких ФМТ в зоне переработки рабочей камеры.
Заявляемый способ дезагрегации культуральной жидкости бифидобактерий является новым и в литературе не описан.
Концентрацию бифидобактерий определяли методом предельных разведений в жидких питательных средах. Пробу анализируемой суспензии в количестве 1 мл переносили в пробирку с 9 мл ростовой среды и перемешивали путем прокачки. Получали разведение 10'1. Далее по 1 мл каждого предыдущего разведения переносили в 9 мл среды следующего разведения, и так до 10-го. Пробирки инкубировали 3 суток при 37,5°С. Затем подсчитывали число колоний микроорганизмов. Количество жизнеспособных бактерий в пробе препарата рассчитывали, как произведение количества живых особей в последнем разведении на 10 в степени номера предпоследней пробирки, где отмечен рост микробов по формуле
где БК - биологическая концентрация клеток в материале, КОЕ/мл;
N - среднее арифметическое числа колоний в пробирках;
- степень последнего разведения.
Выживаемость микроорганизмов в процессе хранения КЖ определяли по отношению концентрации живых клеток в хранившихся материалах к таковой в свежеприготовленных.
Осуществление способа изобретения поясняется на следующем примере, подтверждающем увеличение концентрации микробных клеток в ростовой среде, а также повышение выживаемости бактерий в процессе краткосрочного промежуточного хранения культуральной жидкости перед дальнейшей переработкой при реализации способа.
Пример. В электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором обрабатывали КЖ 3-й генерации В. adolescentis МС-42 с содержанием бактерий 1,4×109 КОЕ/мл, выращенных на среде КД-5. Объем рабочей камеры аппарата - 220 мл, а обрабатываемой суспензии - 100 мл. Загрузка ФМТ в рабочую камеру - 10 г. Дезагрегацию осуществляли ФМТ d=0,15 мм и l=4,5 мм в течение 3-х, 4-х и 5 мин. Для сравнения (по прототипу) КЖ дезагрегировали ФМТ d=0,5 мм и l=6,5 мм в течение 5 мин. Результаты представлены в таблице 5.
Как следует из анализа данных, представленных в таблице 5, выживаемость В. adolescentis МС-42 в конце кратковременного хранения при низких положительных температурах КЖ в результате заявленного способа дезагрегации возросла как минимум в 3 раза. Кроме того, КЖ, полученная при реализации заявленного способа, содержит в три раза большее количество бифидобактерий по сравнению с препаратами, приготовленными в соответствии с прототипом. Указанное обеспечивается тем, что дезагрегацию осуществляли в течение 3-5 мин ферромагнитными телами диаметром 0,15 мм.
Источники информации
1. Новые подходы к конструированию препаратов-пробиотиков на основе бифидобактерий / Бандоян А.К., Амерханова A.M., Алешкин В.А. и др. // Сб. науч. тр. «Проблемы инфекционных болезней». - М., 2000. - с. 284-286.
2. Получение устойчивых суспензий Bacillus thuringiensis в электромагнитном аппарате / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, И.Ю. Давыдкин, А.А. Воробьев, А.Г. Гаврин, В.М. Блинов, С.С. Афанасьев // Журнал микробиологии. - 2001. - №4. - С. 7-10.
3. Гончарова Г.И., Лянная A.M. Культуральная, морфологическая и биохимическая характеристика Bacterium bifidum // Тр. МНИИЭМ «Кишечные и воздушно-капельные инфекции». - Т. XIII. - М., 1969. - С. 415-426.. 5-6. - С. 51-58.
4. Идентификация параметров измельчения биопрепаратов в установках на базе плоского двухстороннего индуктора / Гаврин А.Г., Давыдкин И.Ю., Давыдкин В.Ю., Давыдкин Ю.П., Синицын Л.Е. // Медицинская промышленность и биотехнология. Наука-производство-маркетинг. - 1992. - Вып. 12. - С. 15-28.
Способ дезагрегации культуральной жидкости бифидобактерий в электромагнитном аппарате с плоским двухсторонним индуктором посредством воздействия ферромагнитных тел, отличающийся тем, что дезагрегацию осуществляют в течение 3-5 мин ферромагнитными телами диаметром 0,15 мм.
