Пептидное соединение и способ его получения, композиция для скринингового использования и способ отбора пептидного соединения

Изобретение относится к новому циклическому пептидному соединению с превосходной проницаемостью клеточных мембран, способу его получения, композиции для скринингового использования и способу отбора циклического пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом. В соответствии с настоящим изобретением предоставлено пептидное соединение формулы (1) или его соль, где в формуле (1) символы имеют значения, как определено в формуле изобретения настоящей заявки. 7 н. и 19 з.п. ф-лы, 53 табл.

 

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Область изобретения

[0001] Настоящее изобретение относится к пептидному соединению, способу его получения и композиции для скринингового использования. Настоящее изобретение также относится к способу отбора пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом.

2. Описание связанной области

[0002] Пептиды, содержащие циклическую структуру или не природную аминокислоту, привлекают внимание в качестве новых отправных точек в поиске лекарственных средств, поскольку эти пептиды проявляют превосходную проницаемость мембрань, способность связывания мишени и стабильность in vivo. Например, в JP2012-058092A и литературе [Translational synthesis of special cyclic peptides and development for drug discovery, Biochemistry том 82, № 6, стр. 505-514, 2010] раскрыт способ получения циклического пептидного соединения, включая способ замыкания кольца простого тиоэфира или способ замыкания кольца триазола, и способ поиска лекарственного средства с использованием циклического пептидного соединения.

[0003] Способ поиска лекарственного средства основан на определении структуры пептида посредством образования комплекса, в котором связывают транслируемый пептид и ген, из которого пептид получают, и декодирования гена пептидного комплекса, связанного с целевым веществом. В качестве способ образования комплекса в WO2000/032823A раскрыт способ получения комплекса дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)-пептида, включающий стадию сшивки пептидного акцептора с молекулой рибонуклеиновой кислоты (РНК); стадию трансляции РНК для получения пептидного продукта; и стадию обратной транскрипции РНК для получения комплекса ДНК/пептид. Кроме того, в JP2010-284172A раскрыт способ получения комплекса РНК-пептид, включающий стадию предоставления молекулы РНК; и стадию химической сшивки пептидного акцептора с 3’-концом молекулы РНК для того, чтобы формировать ковалентную связь между ними.

[0004] С другой стороны, несколько способов известно в качестве способов синтеза циклического соединения. Например, в US2015/0056137A раскрыт способ образования кольца тиазолина, который включает восстановление дисульфида и гидролиз амидной связи.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить новое пептидное соединение, проявляющее превосходную проницаемость клеточных мембран, способ его получения и композицию для скринингового использования. Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ отбора пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом.

[0008] В результате экстенсивных исследований для достижения вышеуказанных целей авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение, представленное общей формулой (1), описанной в настоящем описании, или его соль обладает превосходной проницаемостью клеточных мембран. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение, представленное общей формулой (1), или его соль представляет собой соединение, которое можно использовать в качестве библиотеки циклических пептидов. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что циклический пептид можно получать посредством реакции аминокислоты, имеющей цианогруппу, с аминокислотой, представленной общей формулой (2) (аминокислотой, имеющей реакционноспособную группу, например, цистеин), в бесклеточной системе трансляции. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что способ получения циклического пептида посредством реакции аминокислоты, имеющей цианогруппу, с аминокислотой, представленной общей формулой (2), можно использовать для конструирования библиотеки циклических пептидов. Настоящее изобретение выполнено на основе этих находок.

То есть, в соответствии с настоящим изобретением, предоставлены следующие изобретения.

[0009] <1> Пептидное соединение, представленное формулой (1), или его соль:

в формуле

X представляет S, NH или O;

A представляет одинарную связь, линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, или двухвалентную группу, представленную с помощью *-CR⁰=C(B)-, вместе с атомом углерода, с которым связан B, где R⁰ представляет атом водорода или заместитель, и * представляет положение, которое связывают с X;

B представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, при условии, что A и B одновременно не представляют собой одинарную связь;

Z представляет гидроксильную группу или аминогруппу;

фрагменты p из R могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель в случае, когда углерод, с которым G связывают вместе с A, не образует двухвалентную группу, представленную с помощью *-CR⁰=C(B)-;

фрагменты t¹ из W^1' могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, -CH₂(C₆H₅NH)-, -CH₂(C₆H₅O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

фрагменты t² из W² могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, -CO-, -COO-, -NHCO-, -NHCONH-, -CONHCO-, -(CH₂CH₂O)-, -(CH₂CH₂CH₂O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группа, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

J представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

каждый фрагмент n из Xaa независимо представляет любой аминокислотный остаток или любой остаток аналога аминокислоты;

каждый фрагмент m из Xbb независимо представляет любой аминокислотный остаток или любой остаток аналога аминокислоты;

p представляет целое от 0 до 4;

t¹ представляет целое от 0 до 6;

t² представляет целое от 0 до 6;

m представляет целое от 0 до 20; и

n представляет целое от 1 до 20.

[0010] <2> Пептидное соединение или его соль в соответствии с <1>, где пептидное соединение, представленное формулой (1), представляет собой пептидное соединение, представленное формулой (1A):

в формуле

A¹ представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, или двухвалентную группу, представленную с помощью *-CH=C(N)-, вместе с атомом углерода, с которым связывают N, где * представляет положение, которое связывают с S;

фрагменты p¹ из R¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

фрагменты t¹¹ из W¹¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, -CH₂(C₆H₅NH)-, -CH₂(C₆H₅O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

фрагменты t²¹ из W²¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, -CO-, -COO-, -NHCO-, -NHCONH-, -CONHCO-, -(CH₂CH₂O)-, -(CH₂CH₂CH₂O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

G¹ представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель в случае, когда углерод, с которым G¹ связывают вместе с A¹, не образует двухвалентную группу, представленную с помощью *-CH=C(N)-;

J¹ представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

p¹ представляет целое от 0 до 4;

t¹¹ представляет целое от 0 до 6;

t²¹ представляет целое от 0 до 6; и

Z, Xaa, Xbb, m и n имеют то же значение, что и определение в <1>.

[0011] <3> Пептидное соединение или его соль в соответствии с <1>, где пептидное соединение, представленное формулой (1), представляет собой пептидное соединение, представленное формулой (1B):

в формуле

A² представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, или двухвалентную группу, представленную с помощью *-CH=C(N)-, вместе с атомом углерода, с которым связывают N, где * представляет положение, которое связывают с S;

G² представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель в случае, когда углерод, с которым G² связывают вместе с A², не образует двухвалентную группу, представленную с помощью *-CH=C(N)-;

фрагменты p² из R² могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

J² представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

p² представляет целое от 0 до 4;

q² представляет целое от 0 до 6, при условии что p² и q² одновременно не представляют собой 0; и

Z, Xaa, Xbb, m и n имеют то же значение, что и определение в <1>.

[0012] <4> Пептидное соединение или его соль в соответствии с любым одним из <1>-<3>, в котором R, R¹ или R² представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензооксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензоимидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, бензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, изобензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изохинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хиназолиленовой группы, которая может иметь заместитель, циннолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изоксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, фураниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирроленовой группы, которая может иметь заместитель, фениленовой группы, которая может иметь заместитель, и нафтиленовой группы, которая может иметь заместитель.

<5> Пептидное соединение или его соль в соответствии с любым одним из <1>-<4>, где R, R¹ или R² представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, и фениленовой группы, которая может иметь заместитель.

<6> Пептидное соединение или его соль в соответствии с любым одним из <1>-<5>, где общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих циклическую часть пептидного соединения, составляет от 3 до 20.

<7> Пептидное соединение или его соль в соответствии с любым одним из <1>-<6>, где общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих пептидное соединение, составляет от 3 до 20.

[0013] <8> Композиция для скринингового использования, которая содержит:

пептидное соединение или его соль в соответствии с любым одним из <1>-<7>.

<9> Способ отбора пептидного соединения или его соли, которое связывается с целевым веществом, который включает:

приведение целевого вещества в контакт с библиотекой пептидов, содержащей пептидное соединение или его соль в соответствии с любым одним из <1>-<7>, чтобы отбирать пептидное соединение или его соль, которое связывается с целевым веществом.

<10> Способ получения пептидного соединения или его соли, который включает;

стадию получения пептидной цепи, содержащей аминокислотный остаток или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи в пептидной цепи или на C-конце и имеющий структуру формулы (2) на N-конце; и

стадию проведения реакции цианогруппы со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать циклическую часть, имеющую связь, представленную формулой (3):

в формуле

X представляет S, NH или O;

A представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель;

B представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель;

G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

* представляет место связывания с пептидной цепью; и

A и B одновременно не представляют собой одинарную связь;

в формуле,

X, A, G и B имеют то же значение, что и определение в формуле (2).

<11> Способ отбора пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом, который включает:

стадию получения пептидного соединения, имеющего циклическую часть, с помощью способа в соответствии с <10>; и

стадию приведения целевого вещества в контакт с библиотекой пептидов, содержащей пептидное соединение или его соль, чтобы отбирать пептидное соединение или его соль, которое связывается с целевым веществом.

<12> Способ отбора в соответствии с <11>, который включает следующие стадии:

(i) стадию получения библиотеки нуклеиновых кислот, осуществления трансляции посредством бесклеточной системы трансляции, содержащей элонгирующую тРНК, ацилированную с не природной аминокислотой, и получения библиотеки, содержащей пептидное соединение, где не природную аминокислоту случайно встраивают в пептидную последовательность;

(ii) стадию приведения библиотеки пептидов в контакт с целевым веществом; и

(iii) стадию отбора пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом,

на стадии (i) каждое пептидное соединение, образующее библиотеку, является транслируемым с последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей каждое пептидное соединение, образующее библиотеку, и последовательность нуклеиновой кислоты и пептид в качестве ее продукта трансляции связывают для того, чтобы конструировать библиотеку дисплея in vitro, и

стадия (iii) включает определение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептидное соединение, которое связывается с целевым веществом, определение пептидной последовательности по последовательности нуклеиновой кислоты и отбор пептидного соединение.

[0014] <13> Способ в соответствии с любым одним из <10>-<12>, в котором аминокислотный остаток и/или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи, представляет собой структуру, представленную формулой (4):

в формуле

фрагменты m¹ из Q¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и представляют по меньшей мере одну из гетероариленовой группы, которая может иметь заместитель, ариленовой группы, имеющей от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовой группы, имеющей от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

T¹ представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

n¹ представляет целое от 0 до 6 и m¹ представляет целое от 1 до 4; и

* представляет положение связывания с аминокислотным остатком и/или остатком аналога аминокислоты, образующим пептидную цепь.

<14> Способ в соответствии с любым одним из <10>-<12>, в котором аминокислотный остаток и/или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи, представляет собой структуру, представленную формулой (5):

в формуле

фрагменты l² из Q² могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, -CH₂(C₆H₅NH)-, -CH₂(C₆H₅O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

фрагменты n² из Q³ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, -CO-, -COO-, -NHCO-, -NHCONH-, -CONHCO-, -(CH₂CH₂O)-, -(CH₂CH₂CH₂O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

фрагменты m² из Q⁴ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и представляют по меньшей мере одну из гетероариленовой группы, которая может иметь заместитель, ариленовой группы, имеющей от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовой группы, имеющей от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

T² представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

l² представляет целое от 0 до 6;

n² представляет целое от 0 до 6;

m² представляет целое от 1 до 4; и

* представляет положение связывания с аминокислотным остатком и/или остатком аналога аминокислоты, образующим пептидную цепь.

[0015] <15> Способ в соответствии с <13> или <14>, в котором Q¹ или Q⁴ представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензооксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензоимидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, бензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, изобензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изохинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хиназолиленовой группы, которая может иметь заместитель, циннолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изоксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, фураниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирроленовой группы, которая может иметь заместитель, фениленовой группы, которая может иметь заместитель, и нафтиленовой группы, которая может иметь заместитель.

<16> Способ в соответствии с любым одним из <13>-<15>, где Q¹ или Q⁴ представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, и фениленовой группы, которая может иметь заместитель.

[0016] <17> Способ в соответствии с любым одним из <10>-<16>, где формула (2) представляет собой структуру, представленную формулой (2A):

в формуле

A¹ представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель; и

G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель.

<18> Способ в соответствии с любым одним из <10>-<17>, в котором формула (2) представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из следующих формул.

<19> Способ в соответствии с любым одним из <10>-<18>, в котором растворитель реакции на стадии проведения реакции цианогруппы со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать связь, представленную формулой (3), представляет собой воду.

<20> Способ в соответствии с любым одним из <10>-<19>, в котором pH реакционного раствора на стадии проведения реакции цианогруппы со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать связь, представленную формулой (3), составляет от 6,0 до 8,5.

<21> Способ в соответствии с любым одним из <10>-<20>, в котором общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих циклическую часть пептидного соединения, имеющего циклическую часть, составляет от 3 до 20.

<22> Способ в соответствии с любым одним из <10>-<21>, в котором общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих пептидное соединение, имеющее циклическую часть, составляет от 3 до 20.

<23> Способ в соответствии с любым одним из <10>-<22>, в котором аминокислотные остатки или остатки аналогов аминокислот, имеющих гетероариленовую группу, имеющую цианогруппу, ариленовую группу, имеющую цианогруппу, или алкиленовую группу, имеющую цианогруппу в боковой цепи, встраивают в пептидную цепь с использованием кодонов, которые становятся пустыми кодонами посредством исключения природных аминокислот из кодонов, отведенных при трансляции природных аминокислот, терминирующих кодонов или кодонов из четырех оснований.

[0017] <24> Композиция для скринингового использования, которая содержит пептидное соединение, имеющее циклическую часть, или его соль, где циклическая часть имеет структуру, представленную формулой (6):

в формуле

X представляет S, NH или O;

A представляет одинарную связь, линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, или двухвалентную группу, представленную с помощью *-CR⁰=C(B)-, вместе с атомом углерода, с которым связан B, где R⁰ представляет атом водорода или заместитель и * представляет положение, которое связывают с X;

B представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, при условии, что A и B одновременно не представляют собой одинарную связь;

фрагменты p из R могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель в случае, когда углерод, с которым G связывают, вместе с A не образует двухвалентную группу, представленную с помощью *-CR⁰=C(B)-; и

p представляет целое от 0 до 4.

[0018] Пептидное соединение по настоящему изобретению проявляет превосходную проницаемость клеточных мембран. В соответствии со способом получения пептидного соединения по настоящему изобретению, можно получать циклическое пептидное соединение, имеющее превосходную проницаемость клеточных мембран. Пептидное соединение и композицию для скринингового использования по настоящему изобретению можно использовать в способе выбора циклического пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0019] Далее в настоящем описании, настоящее изобретение описано подробно.

В настоящем изобретении% представляет собой% по массе, если не указано иное.

В настоящем изобретении каждый термин имеет следующее значение, если не указано иное.

В настоящем изобретении «до» используют в значении, включающем числовые значения, описанные до и после «до» в качестве значения нижнего предела и значения верхнего предела, соответственно.

[0020] Атом галогена относится к атому фтора, атому хлора, атому брома или атому йода.

C₁-₆ алкил относится к линейной или разветвленной C₁-₆ алкильной группе, такой как метильная группа, этильная группа, пропильная группа, изопропильная группа, н-бутильная группа, втор-бутильная группа, изобутильная группа, трет-бутильная группа, пентильная группа, изопентильная группа, 2-метилбутильная группа, 2-пентильная группа, 3-пентильная группа или гексильная группа.

C₃-₈ циклоалкильная группа относится к C₃-₈ циклоалкильной группе, такой как циклопропильная группа, циклобутильная группа, циклопентильная группа, циклогексильная группа или циклогептильная группа.

C₁-₆ алкокси C₁-₆ алкильная группа относится к C₁-₆ алкилокси C₁-₆ алкильной группе, такой как метоксиметильная группа или 1-этоксиэтильная группа.

C₆-₂₀ арил C₁-₆ алкильная группа относится к C₆-₂₀ арил C₁-₆ алкильной группе (аралкильной группе, в которой алкильный фрагмент представляет собой C₁-₆ алкил), такой как бензильная группа, дифенилметильная группа, тритильная группа, фенэтильная группа, 2-фенилпропильная группа, 3-фенилпропильная группа или нафтилметильная группа.

[0021] C₁-₆ алкоксильная группа относится к линейной, циклической или разветвленной C₁-₆ алкилоксигруппе, такой как метоксигруппа, этоксигруппа, пропоксигруппа, изопропоксигруппа, циклопропоксигруппа, бутоксигруппа, изобутоксигруппа, втор-бутоксигруппа, трет-бутоксигруппа, циклобутокси, пентилоксигруппа или гексилоксигруппа.

C₆-₂₀ арилоксигруппа относится к C₆-₂₀ арилоксигруппе, такой как феноксигруппа или нафтилоксигруппа.

[0022] C₁-₆ алкилтиогруппа относится к линейной или разветвленной C₁-₆ алкилтиогруппе, такой как метилтиогруппа, этилтиогруппа, пропилтиогруппа, изопропилтиогруппа, бутилтио, втор-бутилтиогруппа, изобутилтиогруппа, трет-бутилтиогруппа, пентилтиогруппа, изопентилтиогруппа, 2-метилбутилтиогруппа, 2-пентилтиогруппа, 3-пентилтиогруппа или гексилтиогруппа.

C₆-₂₀ арилтиогруппа относится к C₆-₂₀ арилтиогруппе, такой как фенилтиогруппа или 2-нафтилтиогруппа.

[0023] C₁-₆ алкиламиногруппа относится к линейной или разветвленной C₁-₆ алкиламиногруппе, такой как метиламиногруппа, этиламиногруппа, пропиламиногруппа, изопропиламиногруппа, бутиламиногруппа, втор-бутиламиногруппа, трет-бутиламиногруппа, пентиламиногруппа или гексиламиногруппа.

C₆-₂₀ ариламиногруппа относится к C₆-₂₀ ариламиногруппе, такой как фениламиногруппа, п-толиламиногруппа или 2-нафтиламиногруппа.

[0024] C₂-₆ алкенильная группа относится к линейной или разветвленной C₂-₆ алкенильной группе, такой как винильная группа, аллильная группа, пропенильная, изопропенильная группа, бутенильная группа, изобутенильная группа, 1,3-бутадиенильная группа, пентенильная группа или гексенильная группа.

C₃-₈ циклоалкенильная группа относится к C₃-₈ циклоалкенильной группе, такой как циклопропенильная группа, циклобутенильная группа, циклопентенильная группа или циклогексенильная группа.

C₂-₆ алкинильная группа относится к линейной или разветвленной C₂-₆ алкинильной группе, такой как этинильная группа, пропинильная группа, бутинильная группа, пентинильная группа или гексинильная группа.

[0025] C₁-₆ алкилкарбонильная группа относится к C₁-₆ алкилкарбонильной группе, такой как ацетильная группа, пропионильная группа, бутирильная группа, изобутирильная группа или пивалоильная группа.

C₁-₃₀ алкилкарбонильная группа относится к C₁-₃₀ алкилкарбонильной группе, такой как ацетильная группа, пропионильная группа, бутирильная группа, изобутирильная группа, пивалоильная группа или пальмитоильная группа.

C₆-₂₀ арилкарбонильная группа относится к арилкарбонильной группе, имеющей от 6 до 20 атомов углерода, такой как бензоильная группа.

Гетероциклическая карбонильная группа относится к гетероциклической карбонильной группе, такой как никотиноиловой группе, теноиловой группе, пирролидинокарбонильной группе или фуроиловой группе.

[0026] C₁-₆ алкилсульфонильная группа относится к C₁-₆ алкилсульфонильной группе, такой как метилсульфонильная группа, этилсульфонильная группа или пропилсульфонильная группа.

C₆-₂₀ арилсульфонильная группа относится к C₆-₂₀ арилсульфонильной группе, такой как бензолсульфонильная группа, п-толуолсульфонильная группа или нафталинсульфонильная группа.

The C₁-₆ алкилсульфинильная группа относится к C₁-₆ алкилсульфинильной группе, такой как метилсульфинильная группа, этилсульфинильная группа или пропилсульфинильная группа.

C₆-₂₀ арилсульфинильная группа относится к C₆-₂₀ арилсульфинильной группе, такой как бензолсульфинильная группа, п-толуолсульфинильная группа или нафталинсульфинильная группа.

[0027] C₆-₂₀ арильная группа относится к арильной группе, имеющей от 6 до 20 атомов углерода, такой как фенильная группа или нафтильная группа.

[0028] Моноциклическая азотсодержащая гетероциклическая группа относится к моноциклической азотсодержащей гетероциклической группе, содержащей гетероатомы, образующие кольцо, такой как азиридиниловая группа, азетидиниловая группа, пирролидиниловая группа, пирролиниловая группа, пирролиловая группа, пиперидиловая группа, тетрагидропиридиловая группа, дигидропиридиловая группа, пиридиловая группа, гомопиперидиниловая группа, октагидроазоциниловая группа, имидазолидиниловая группа, имидазолиниловая группа, имидазолиловая группа, пиразолидиниловая группа, пиразолиниловая группа, пиразолиловая группа, пиперазиниловая группа, диазепаниловая группа, пиразиниловая группа, пиридазиниловая группа, пиримидиниловая группа, гомопиперазиниловая группа, триазолиловая группа или тетразолиловая группа, и также содержащей моноциклический азотсодержащий гетероарил.

Моноциклическая кислородсодержащая гетероциклическая группа относится к моноциклической кислородсодержащей гетероциклической группе, содержащей только атом кислорода в качестве гетероатома, образующего кольцо, такой как оксетаниловая группа, тетрагидрофураниловая группа, фураниловая группа, тетрагидропираниловая группа, пираниловая группа, 1,3-диоксаниловая группа или 1,4-диоксаниловая группа.

[0029] Моноциклическая серосодержащая гетероциклическая группа относится к тиенилу, тетрагидротиопиранилу, 1,1-диоксидотетрагидротиопиранилу или тому подобному.

Моноциклическая азот/кислородсодержащая гетероциклическая группа относится к моноциклической азот/кислородсодержащей гетероциклической группе, содержащей только атом азота и атом кислорода в качестве гетероатомов, образующих кольцо, такой как оксазолиловая группа, изоксазолиловая группа, оксадиазолиловая группа, морфолиниловая группа или оксазепаниловая группа.

Моноциклическая азот/серосодержащая гетероциклическая группа относится к моноциклической азот/серосодержащей гетероциклической группе, содержащей только атом азота и атом серы в качетсве гетероатомов, образующих кольцо, такой как тиазолиловая группа, изотиазолиловая группа, тиадиазолиловая группа, тиоморфолиниловая группа, 1-оксидотиоморфолиниловая группа или 1,1-диоксидотиоморфолиниловая группа.

Моноциклическая гетероциклическая группа относится к моноциклической азотсодержащей гетероциклической группе, моноциклической кислородсодержащей гетероциклической группе, моноциклической серосодержащей гетероциклической группе, моноциклической азот/кислородсодержащей гетероциклической группе или моноциклической азот/серосодержащей гетероциклической группе.

[0030] Бициклическая азотсодержащая гетероциклическая группа относится к бициклической азотсодержащей гетероциклической группе, содержащей только атом азота в качестве гетероатома, образующего кольцо, такой как индолиниловая группа, индолиловая группа, изоиндолиниловая группа, изоиндолиловая группа, бензимидазолиловая группа, индазолиловая группа, бензотриазолиловая группа, пиразолопиридиниловая группа, хинолиловая группа, тетрагидрохинолиниловая группа, тетрагидроизохинолинил, изохинолиниловая группа, хинолидиниловая группа, циннолиниловая группа, фталазиниловая группа, хиназолиниловая группа, дигидрохиноксалиниловая группа, хиноксалиниловая группа, нафтиридиниловая группа, пуриниловая группа, птеридиниловая группа или хинуклидиниловая группа.

Бициклическая кислородсодержащая гетероциклическая группа относится к бициклической кислородсодержащей гетероциклической группе, содержащей только атом кислорода в качестве гетероатома, образующего кольцо, такой как 2,3-дигидробензофураниловая группа, бензофураниловая группа, изобензофураниловая группа, хроманиловая группа, хромениловая группа, изохроманиловая группа, 1,3-бензодиоксолиловая группа, 1,3-бензодиоксанилая группа или 1,4-бензодиоксанилая группа.

[0031] Бициклическая серосодержащая гетероциклическая группа относится к бициклической серосодержащей гетероциклической группе, содержащей только атом серы в качестве гетероатома, образующего кольцо, такой как 2,3-дигидробензотиениловая группа или бензотиениловя группа.

Бициклическая азот/кислородсодержащая гетероциклическая группа относится к бициклической азот/кислородсодержащей гетероциклической группе, содержащей только атом азота и атом кислорода в качестве гетероатомов, образующих кольцо, такой как бензоксазолиловая группа, бензоизоксазолиловая группа, бензооксадиазолиловая группа, бензоморфолиниловая группа, дигидропиранопиридиловая группа, диоксолопиридиловая группа, фуропиридиниловая группа, дигидродиоксинопиридиловая группа или дигидропиридооксазиниловая группа.

[0032] Бициклическая азот/серосодержащая гетероциклическая группа относится к бициклической азот/серосодержащей гетероциклической группе, содержащей атом азота и атом серы в качестве гетероатомов, образующих кольцо, такой как бензотиазолиловая группа, бензоизотиазолиловая группа или бензотиадиазолиловая группа.

Бициклическая гетероциклическая группа относится к бициклической азотсодержащей гетероциклической группе, бициклической кислородсодержащей гетероциклической группе, бициклической серосодержащей гетероциклической группе, бициклической азот/кислородсодержащей группе или бициклической азот/серосодержащей гетероциклической группе.

[0033] Спирогетероциклическая группа относится к спирогетероциклической группе, содержащей один или несколько атомов азота, атомов кислорода или атомов серы в качестве гетероатомов, образующих кольцо, такой как 2,6-диазаспиро[3.3]гептильная группа, 2,7-диазаспиро[3.5]нонильная группа, 2-окса-6-азаспиро[3.3]гептильная группа, 1,4-диоксаспиро[4.5]децильная группа, 1-окса-8-азаспиро[4.5]децильная группа или 1-тиа-8-азаспиро[4.5]децильная группа.

Гетероциклическая группа с мостиком относится к гетероциклической группе с мостиком, которая содержит один или несколько атомов азота в качестве гетероатомов, образующих кольцо, такой как 3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октильная группа, 8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октильная группа или хинуклидинильная группа, и дополнительно может содержать один или несколько атомов кислорода или атомов серы.

[0034] Гетероциклическая группа относится к моноциклической гетероциклической группе, бициклической гетероциклической группе, спирогетероциклической группе или гетероциклической группе с мостиком.

[0035] Алкиленовая группа, имеющая от 1 до 6 углеродов, относится к линейной или циклической C₁-₆ алкиленовой группе, такой как метиленовая группа, этиленовая группа, пропиленовая группа, изопропиленовая группа, н-бутиленовая группа, н-пентиленовая группа, н-гексиленовая группа или циклогексиленовая группа.

Ариленовая группа, имеющая от 6 до 10 атомов углерода, относится к ариленовой группе, имеющей от 6 до 20 атомов углерода, такой как фениленовая группа или нафтиленовая группа.

Здесь число атомов углерода в алкиленовой группе, имеющей от 1 до 6 атомов углерода, и ариленовой группе, имеющей от 6 до 10 атомов углерода, не включает число атомов углерода в заместителе. Гетероариленовая группа относится к двухвалентной гетероциклической группе.

[0036] Пептидное соединение является общим термином для соединений, образуемых посредством амидной связи или сложноэфирной связи аминокислот или аналогов аминокислот. Кроме того, пептидное соединение, имеющее циклическую часть (также обозначаемую как циклическое пептидное соединение), является общим термином для соединений, где пептидные соединения замыкают в цикл через ковалентные связи в одной и той же молекуле. Соединения, получаемые посредством дополнительных химических модификаций указанных выше соединений, также включены в пептидное соединение в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения. Пептидное соединение в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения может иметь линейную часть.

[0037] Аминокислоту и аналог аминокислоты, которые образуют пептидное соединение, можно обозначать как аминокислотные остатки и остатки аналогов аминокислот, соответственно. Аминокислотный остаток и остаток аналога аминокислоты относятся к одновалентной или двухвалентной группе, получаемой из аминокислоты и остатка аналога аминокислоты.

[0038] Аминокислоты в настоящем изобретении представляют собой α, β и γ-аминокислоты и не ограничены природными аминокислотами (природные аминокислоты относятся к аминокислотам 20 типов, содержащимся в белках. В частности, природные аминокислоты относятся к Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, His, Glu, Asp, Gln, Asn, Cys, Met, Lys, Arg и Pro) и могут иметь место не природные аминокислоты. Не природные аминокислоты относятся к аминокислотам, отличным от указанных выше природных аминокислот. Природные аминокислоты, присутствующие в природе, которые отличны от 20 аминокислот, содержащихся в белках, представляют собой не природные аминокислоты. В случае α-аминокислоты, она может представлять собой L-аминокислоту или D-аминокислоту или может представлять собой α,α-диалкиловую аминокислоту. Боковую цепь аминокислоты можно замещать группой, выбранной, например, из C₁-₆ алкильной группы, которая может иметь заместитель, C₃-₈ циклоалкильной группы, которая может иметь заместитель, C₂-₆ алкенильной группы, которая может иметь заместитель, C₂-₆ алкинильной группы, которая может иметь заместитель, C₆-₂₀ арильной группы, которая может иметь заместитель, гетероциклической группы, которая может иметь заместитель, и C₆-₂₀ арил C₁-₆ алкильной группы, которая может иметь заместитель, в дополнение к атому водорода.

[0039] Аналоги аминокислот предпочтительно представляют собой α-гидроксикарбоновую кислоту и α-меркаптокарбоновую кислоту. Боковые цепи α-гидроксикарбоновой кислоты и α-меркаптокарбоновой кислоты могут иметь различные заместители, отличные от атомов водорода, как в аминокислотах (могут иметь свободные заместители). Стерические структуры α-гидроксикарбоновой кислоты и α-меркаптокарбоновой кислоты могут соответствовать L-форме или D-форме аминокислоты, и боковые цепи α-гидроксикарбоновой кислоты и α-меркаптокарбоновой кислоты можно замещать группой, выбранной, например, из C₁-₆ алкильной группы, которая может иметь заместитель, C₃-₈ циклоалкильной группы, которая может иметь заместитель, C₂-₆ алкенильной группы, которая может иметь заместитель, C₂-₆ алкинильной группы, которая может иметь заместитель, C₆-₂₀ арильной группы, которая может иметь заместитель, гетероциклической группы, которая может иметь заместитель, и C₆-₂₀ арил C₁-₆ алкильной группы, которая может иметь заместитель. Число заместителей не ограничено одним, и боковые цепи α-гидроксикарбоновой кислоты и α-меркаптокарбоновой кислоты могут иметь два или больше заместителей. Например, боковые цепи α-гидроксикарбоновой кислоты и α-меркаптокарбоновой кислоты могут иметь атом S и дополнительно могут иметь функциональную группу, такую как аминогруппа или атом галогена.

[0040] <Пептидное соединение в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения или его соль >

Пептидное соединение в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения или его соль представляет собой пептидное соединение, представленное формулой (1), или его соль. Пептидное соединение в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения или его соль обладает превосходной проницаемостью клеточных мембран и, предпочтительно также, метаболической стабильностью.

[0041] X представляет S, NH или O. X предпочтительно представляет S.

[0042] A представляет одинарную связь, линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, или двухвалентную группу, представленную с помощью *-CR⁰=C(B)-, вместе с атомом углерода, с которым связан B, где R⁰ представляет атом водорода или заместитель и * представляет положение, которое связывают с X.

A предпочтительно представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, или двухвалентную группу, представленную с помощью *-CR⁰=C(B)-, вместе с атомом углерода, с которым связан B, где R⁰ представляет атом водорода или заместитель.

A более предпочтительно представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель.

A еще более предпочтительно представляет этиленовую группу или метиленовую группу, которая может иметь заместитель.

A особенно предпочтительно представляет метиленовую группу.

R⁰ предпочтительно представляет атом водорода.

[0043] B представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, при условии, что A и B одновременно не представляют собой одинарную связь.

B предпочтительно представляет одинарную связь.

[0044] В определениях A и B примеры заместителя в «линейной алкиленовой группе, имеющей 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель» включают C₁-₆ алкильную группу, C₃-₈ циклоалкильную группу, C₂-₆ алкенильную группу, C₂-₆ алкинильную группу, C₆-₂₀ арильную группу, гетероциклическую группу и C₆-₂₀ арил C₁-₆ алкильную группу.

Примеры заместителя в определении R⁰ включают C₁-₆ алкильную группу, C₃-₈ циклоалкильную группу, C₂-₆ алкенильную группу, C₂-₆ алкинильную группу, C₆-₂₀ арильную группу, гетероциклическую группу, и C₆-₂₀ арил C₁-₆ алкильную группу.

[0045] G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель в случае, когда углерод, с которым G связывают вместе с A, не образует двухвалентную группу, представленную с помощью *-CR⁰=C(B)-.

G предпочтительно представляет собой метильную группу, этильную группу или атом водорода и более предпочтительно атом водорода.

Z представляет гидроксильную группу или аминогруппу. Z предпочтительно представляет аминогруппу.

[0046] R представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель.

Ариленовая группа, имеющая от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель, который представляет собой R, предпочтительно представляет собой фениленовую группу, которая может иметь заместитель, или нафтиленовую группу, которая может иметь заместитель, и более предпочтительно фениленовую группу, которая может иметь заместитель.

Предпочтительный пример R может представлять собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензооксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензоимидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, бензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, изобензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изохинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хиназолиленовой группы, которая может иметь заместитель, циннолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изоксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, фураниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирроленовой группы, которая может иметь заместитель, фениленовой группы, которая может иметь заместитель, и нафтиленовой группы, которая может иметь заместитель.

[0047] Более предпочтительный пример R может представлять собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, и фениленовой группы, которая может иметь заместитель.

[0048] W¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, -CH₂(C₆H₅NH)-, -CH₂(C₆H₅O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель. Предпочтительно, каждый W¹ представляет одинарную связь, CH₂(C₆H₅NH)- или -CH₂(C₆H₅O)-.

W² могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, -CO-, -COO-, -NHCO-, -NHCONH-, -CONHCO-, -(CH₂CH₂O)-, -(CH₂CH₂CH₂O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель. Предпочтительно, каждый W² представляет одинарную связь, -NHCO-, -(CH₂CH₂O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, или гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель.

В качестве заместителя в определениях R, W¹ и W² и заместителя в структуре, приведенной в качестве предпочтительного примера R и более предпочтительного примера R, можно отметить заместители, описанные в группе заместителя A₁.

[0049] Группа заместителя A₁:

атом галогена,

цианогруппа,

нитрогруппа,

формильная группа,

карбоксильная группа,

сульфогруппа,

гидроксильная группа,

аминогруппа,

меркаптогруппа,

C₁-₆ алкильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₃-₈ циклоалкильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₁-₆ алкокси C₁-₆ алкильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₆-₂₀ арил C₁-₆ алкильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₁-₆ алкоксильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₆-₂₀ арилоксигруппа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₁-₆ алкиламиногруппа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₆-₂₀ ариламиногруппа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₁-₆ алкилтиогруппа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₆-₂₀ арилтиогруппа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₂-₆ алкенильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₃-₈ циклоалкенильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₂-₆ алкинильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₆-₂₀ арильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

гетероциклическая группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₁-₃₀ алкилкарбонильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₆-₂₀ арилкарбонильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₁-₆ алкилсульфонильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₆-₂₀ арилсульфонильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂,

C₁-₆ алкилсульфинильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂, и

C₆-₂₀ арилсульфинильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₂.

[0050] Группа заместителя A₂:

атом галогена,

гидроксильная группа,

цианогруппа,

C₁-₆ алкильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₃,

C₃-₈ циклоалкильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₃,

C₁-₆ алкоксильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₃,

C₁-₆ алкокси C₁-₆ алкильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₃,

C₁-₆ алкилкарбонильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₃,

C₁-₆ алкилсульфонильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₃,

гетероциклическая группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₃,

NR¹²R¹³ (каждый R¹² и R¹³ независимо представляет атом водорода или C₁-₆ алкильную группу) и

гетероциклическая карбонильная группа, которая может иметь один или несколько заместителей, выбранных из группы заместителя A₃.

[0051] Группа заместителя A₃:

атом галогена,

гидроксильная группа,

цианогруппа,

C₁-₆ алкильная группа и

C₁-₆ алкоксильная группа.

[0052] J представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель, и предпочтительно представляет собой метильную группу или атом водорода и более предпочтительно атом водорода.

[0053] Каждый фрагмент n из Xaa независимо представляет любой аминокислотный остаток или любой остаток аналога аминокислоты.

каждый фрагмент m из Xbb независимо представляет любой аминокислотный остаток или любой остаток аналога аминокислоты.

[0054] p представляет целое от 0 до 4, предпочтительно 0 до 2 и более предпочтительно 0 до 1.

t¹ представляет целое от 0 до 6 и предпочтительно целое от 0 до 2.

t² представляет целое от 0 до 6 и предпочтительно целое от 0 до 2.

[0055] m представляет целое от 0 до 20. m предпочтительно представляет целое от 0 до 10 и более предпочтительно 0 до 5.

n представляет целое от 1 до 20. n предпочтительно представляет целое от 1 до 18 и более предпочтительно от 3 до 13.

Общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих циклическую часть пептидного соединения, предпочтительно составляет от 3 до 20 и более предпочтительно от 5 до 15.

Общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих пептидное соединение, предпочтительно составляет от 3 до 20 и более предпочтительно от 5 до 20.

[0056] Предпочтительно пептидное соединение, представленное формулой (1), представляет собой пептидное соединение, представленное формулой (1A).

[0057] A¹ представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, или двухвалентную группу, представленную с помощью *-CH=C(N)-, вместе с атомом углерода, с которым связывают N, где * представляет положение, которое связывают с S.

A¹ предпочтительно представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель.

A¹ более предпочтительно представляет этиленовую группу или метиленовую группу, которая может иметь заместитель.

A¹ еще более предпочтительно представляет метиленовую группу.

Заместители в определении A¹ являются теми же, как описано выше для определения A в формуле (1).

G¹ представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель в случае, когда углерод, с которым G¹ связывают вместе с A¹, не образует двухвалентную группу, представленную с помощью *-CH=C(N)-. G¹ предпочтительно представляет этильную группу, метильную группу или атом водорода и более предпочтительно атом водорода.

[0058] R¹ представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель.

R¹ предпочтительно представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или фениленовую группу, которая может иметь заместитель.

Предпочтительные примеры R¹ и более предпочтительные примеры R¹ являются такими же, как предпочтительные примеры R и более предпочтительные примеры R.

Заместители в определении R¹ являются такими же, как описано выше для определения R в формуле (1).

[0059] W¹¹ представляет одинарную связь, -CH₂(C₆H₅NH)-, -CH₂(C₆H₅O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель. Предпочтительно, W¹¹ представляет одинарную связь, -CH₂(C₆H₅NH)- или -CH₂(C₆H₅O)-.

W²¹ представляет одинарную связь, -CO-, -COO-, -NHCO-, -NHCONH-, -CONHCO-, -(CH₂CH₂O)-, -(CH₂CH₂CH₂O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкилен, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, который может иметь заместитель. Предпочтительно, W²¹ представляет одинарную связь, -NHCO-, -(CH₂CH₂O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, или гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель.

[0060] J¹ представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель, и предпочтительно представляет собой метильную группу или атом водорода.

[0061] p¹ представляет целое от 0 до 4 и предпочтительно 0 или 1.

t¹¹ представляет целое от 0 до 6 и предпочтительно целое от 0 до 2.

t²¹ представляет целое от 0 до 6 и предпочтительно целое от 0 до 2.

Z, Xaa, Xbb, m и n имеют те же значения как определение в (1).

[0062] Предпочтительно, пептидное соединение, представленное формулой (1), представляет собой пептидное соединение, представленное формулой (1B).

[0063] A² представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, или двухвалентную группу, представленную с помощью *-CH=C(N)-, вместе с атомом углерода, с которым связывают N, где * представляет положение, которое связывают с S.

A² предпочтительно представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель.

A² более предпочтительно представляет этиленовую группу или метиленовую группу, которая может иметь заместитель.

A² еще более предпочтительно представляет метиленовую группу.

Заместители в определении A² являются такими же, как описано выше для определения A в формуле (1).

[0064] G² представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель в случае, когда углерод, с которым G² связывают, вместе с A², не образует двухвалентную группу, представленную с помощью *-CH=C(N)-. G² предпочтительно представляет этильную группу, метильную группу или атом водорода.

[0065] R² представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель.

R² предпочтительно представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или фениленовую группу, которая может иметь заместитель.

Предпочтительные примеры R² и более предпочтительные примеры R² являются такими же, как предпочтительные примеры R и более предпочтительные примеры R.

Заместители в определении R² являются такими же, как как описано выше дляопределения R в формуле (1).

[0066] J² представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель, и предпочтительно представляет собой метильную группу или атом водорода.

[0067] p² представляет целое от 0 до 4, предпочтительно целое от 0 до 2 и более предпочтительно 0 или 1.

q² представляет целое от 0 до 6, предпочтительно целое от 0 до 4, более предпочтительно целое от 0 до 2 и особенно предпочтительно 0 или 1.

Однако, p² и q² одновременно не представляют собой 0.

Z, Xaa, Xbb, m и n имеют те же значения, как определение в формуле (1).

[0068] Примеры пептидного соединения или его соли включают соли в основных группах, таких как аминогруппы, кислые группы, такие как карбоксильные группы, и гидроксильные группы, которые общеизвестны в данной области.

Кроме того, в случае простого упоминания о пептидном соединении в настоящем описании, пептидное соединение также включает его соль.

[0069] Примеры солей в основных группах включают соли с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, азотная кислота и серная кислота; соли с органическими карбоновыми кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, щавелевая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, винная кислота, аспарагиновая кислота, трихлоруксусная кислота и трифторуксусная кислота; и соли с сульфоновыми кислотами, такими как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, мезитиленсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.

[0070] Примеры солей в кислотных группах включают, например, соли с щелочными металлами, такими как натрий и калий; соли с металлами II группы, такими как кальций и магний; соли аммония; и соли с азотсодержащими органическими основаниями, такими как триметиламин, триэтиламин, трибутиламин, пиридин, N,N-диметиланилин, N-метилпиперидин, N-метилморфолин, диэтиламин, дициклогексиламин, прокаин, дибензиламин, N-бензил-β-фенэтиламин, 1-эфенамин и N,N'-дибензилэтилендиамин.

[0071] В случае, когда изомеры (например, оптический изомер и геометрический изомер) присутствуют в пептидном соединении или его соли, настоящее изобретение включает изомеры, а также сольваты, гидраты и кристаллы различных форм.

[0072] <Композиция для скринингового использования>

В соответствии с настоящим изобретением, предусмотрена композиция для скринингового использования, содержащая описанное выше пептидное соединение в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения или его соль.

В соответствии с настоящим изобретением, дополнительно предусмотрена композиция для скринингового использования, содержащая пептидное соединение, имеющее циклическую часть, или его соль, где циклическая часть имеет структуру, представленную формулой (6).

в формуле

X представляет S, NH или O;

A представляет одинарную связь, линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, или двухвалентную группу, представленную с помощью *-CR⁰=C(B)-, вместе с атомом углерода, с которым связан B, где R⁰ представляет атом водорода или заместитель и * представляет положение, которое связывают с X;

B представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, при условии, что A и B одновременно не представляют собой одинарную связь;

фрагменты p из R могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель в случае, когда углерод, с которым G связывают, вместе с A, не образует двухвалентную группу, представленную с помощью *-CR⁰=C(B)-; и

p представляет целое от 0 до 4;

[0073] Значения и предпочтительные диапазоны символов в формуле (6) являются такими же, как те, что описаны выше для формулы (1).

Целевое вещество для скрининга и его скринин описаны далее в настоящем описании.

[0074] <Способ получения пептидного соединения>

Способ получения пептидного соединения в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения конкретно не ограничен, и пептидное соединение в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения можно получать с помощью способа с использованием бесклеточной системы трансляции или можно получать посредством химического синтеза пептида.

[0075] Например, пептидное соединение, имеющее циклическую часть, можно получать из ациклического пептидноно соединения, содержащего природные аминокислоты и не природные аминокислоты, таким образом, что получают пептидную цепь (пептид в виде цепи), имеющую аминокислотный остаток или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи в пептидной цепи или на C-конце и имеющий структуру формулы (2) на N-конце, и проводят реакцию цианогруппы со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать циклическую часть, имеющую связь, представленную формулой (3).

[0076] Пептидное соединение в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения также можно получать посредством химического синтеза. Синтез пептидного соединения может представлять собой твердофазный синтез или жидкофазный синтез, но предпочтительно представляет собой твердофазный синтез. Твердофазный синтез пептидных соединений известен специалистам в данной области, и его примеры включают способ синтеза с флуоренилметоксикарбонильной группой (группой Fmoc), в котором группу Fmoc используют для защиты аминогруппы, и способ синтеза с трет-бутилоксикарбонильной группой (группой Boc), в котором группу Boc используют для защиты аминогруппы. Химический синтез пептидных соединений в целом можно осуществлять посредством автоматического пептидного синтезатора.

[0077]

В формуле (2) X представляет S, NH или O. X предпочтительно представляет S.

A представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель.

A предпочтительно представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель.

A более предпочтительно представляет этиленовую группу или метиленовую группу, которая может иметь заместитель.

A еще более предпочтительно представляет метиленовую группу.

[0078] B представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель. Однако, A и B одновременно не представляют собой одинарную связь.

B предпочтительно представляет одинарную связь.

G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель.

G предпочтительно представляет атом водорода.

* представляет сайт связывания с пептидной цепью.

[0079]

В формуле X, A, G и B представляют собой то, что определено в формуле (3).

[0080] В определениях для A и B примеры заместителя в «линейной алкиленовой группе, имеющей 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель» включает C₁-₆ алкильную группу, C₃-₈ циклоалкильную группу, C₂-₆ алкенильную группу, C₂-₆ алкинильную группу, C₆-₂₀ арильную группу, гетероциклическую группу и C₆-₂₀ арил C₁-₆ алкильную группу.

[0081] Аминокислотный остаток или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи, предпочтительно представляет собой структуру, представленную формулой (4).

В формуле (4) фрагменты m¹ из Q¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет по меньшей мере одну из гетероариленовой группы, которая может иметь заместитель, ариленовой группы, имеющей от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовой группы, имеющей от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель.

Q¹ предпочтительно представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель.

Q¹ более предпочтительно представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или фениленовую группу, которая может иметь заместитель.

[0082] T¹ представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель, и предпочтительно представляет собой метильную группу или атом водорода.

[0083] n¹ представляет целое от 0 до 6, предпочтительно целое от 0 до 3, более предпочтительно 1 или 2 и еще более предпочтительно 1.

m¹ представляет целое от 1 до 4; предпочтительно 1 или 2 и более предпочтительно 1.

* представляет положение связывания с аминокислотным остатком и/или остатком аналога аминокислоты, образующим пептидную цепь.

[0084] Аминокислотный остаток или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи, предпочтительно представляет собой структуру, представленную формулой (5).

[0085] В формуле (5), Q² представляет одинарную связь, -CH₂(C₆H₅NH)-, -CH₂(C₆H₅O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель. Q² предпочтительно представляет одинарную связь, -CH₂(C₆H₅NH)-, -CH₂(C₆H₅O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, или гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель.

[0086] Q³ представляет одинарную связь, -CO-, -COO-, -NHCO-, -NHCONH-, -CONHCO-, -(CH₂CH₂O)-, -(CH₂CH₂CH₂O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкилен, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, который может иметь заместитель. Q³ предпочтительно представляет одинарную связь, -NHCO-, -(CH₂CH₂O)-, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, или гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель.

[0087] Q⁴ представляет по меньшей мере одну из гетероариленовой группы, которая может иметь заместитель, ариленовой группы, имеющей от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовой группы, имеющей от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель. Q⁴ предпочтительно представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель.

[0088] T² представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель, и предпочтительно представляет собой метильную группу или атом водорода.

[0089] l² представляет целое от 0 до 6 и предпочтительно целое от 0 до 2;

n² представляет целое от 0 до 6 и предпочтительно целое от 0 до 2.

m² представляет целое от 1 до 4 и предпочтительно 1 или 2.

* представляет положение связывания с аминокислотным остатком и/или остатком аналога аминокислоты, образующим пептидную цепь.

[0090] Предпочтительный пример Q¹ и Q⁴ может представлять собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензооксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензоимидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, бензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, изобензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изохинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хиназолиленовой группы, которая может иметь заместитель, циннолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изоксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, фураниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирроленовой группы, которая может иметь заместитель, фениленовой группы, которая может иметь заместитель, и нафтиленовой группы, которая может иметь заместитель.

[0091] Более предпочтительный пример Q¹ и Q⁴ может представлять собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, и фениленовой группы, которая может иметь заместитель.

[0092] Структура, представленная формулой (2), предпочтительно представляет собой структуру, представленную формулой (2A).

В формуле (2A) A¹ представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель. A¹ предпочтительно представляет этиленовую группу или метиленовую группу, которая может иметь заместитель. A¹ более предпочтительно представляет метиленовую группу.

G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель. G предпочтительно представляет этильную группу, метильную группу, или атом водорода.

[0093] Формула (2) более предпочтительно представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из следующих формул.

[0094] Предпочтительно, растворитель реакции на стадии проведения реакции цианогруппы со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать связь, представленную формулой (3), представляет собой воду или органический растворитель. В случае, когда синтез посредством бесклеточной системы трансляции используют в качестве способа получения ациклических пептидов и циклических пептидов, вода является предпочтительной в качестве растворителя реакции.

Вода может представлять собой чистую дистиллированную воду, водный раствор буфера и соли (такой как NaCl) или дистиллированную воду или водный раствор, дополнительно содержащий органический растворитель и/или поверхностно-активное средство. Таким образом, в случае синтеза посредством бесклеточной системы трансляции, предпочтительно использовать воду в качестве растворителя реакции. Примеры буфера включают подходящие буферы, имеющие буферную емкость, такие как буфер HEPES (2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновая кислота) и фосфатный буфер. Органический растворитель предпочтительно представляет собой органический растворитель, который можно смешивать с водой или буфером, и его примеры включают метанол, диметилсульфоксид и полиэтиленгликоль. Примеры поверхностно-активного средства включают Triton X (торговое название), Brij (торговое название) и Tween (торговое название). Предпочтительный диспазон содержания органического растворителя составляет 20% или меньше, более предпочтительный диапазон составляет 15% или меньше и еще более предпочтительный диапазон составляет 10% или меньше. В случае, когда содержится органический растворитель, содержание органического растворителя составляет более чем 0%.

В случае, когда химический синтез используют в качестве способа получения ациклических пептидов и циклических пептидов, органический растворитель является предпочтительным в качестве растворителя реакции. Примеры органического растворителя включают диметилацетамид, N-метил-2-пирролидон, N,N-диметилформамид, метанол, этанол, изопропанол, тетрагидрофуран, диоксан и ацетонитрил. В этом случае, органический растворитель можно использовать в смеси с водой. В случае использования органического растворителя в смеси с водой, содержание органического растворителя предпочтительно составляет 20% или больше, более предпочтительно 20% или больше и 70% или меньше, и еще более предпочтительно 30% или больше и 60% или меньше.

[0095] Предпочтительно, pH на стадии проведения реакции цианогруппы со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать связь, представленную формулой (3), составляет от 6,0 до 8,5. Циклический пептид можно получать с хорошим выходом посредством корректировки pH в указанном выше диапазоне.

[0096] Стадия получения пептидной цепи, имеющей аминокислотный остаток и/или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи в пептидной цепи или на C-конце, и имеющей структуру формулы (2) на N-конце, предпочтительно представляет собой стадию синтеза незащищенного ациклического пептида. Посредством синтеза незащищенного ациклического пептида, очистку целевого циклического пептида можно упрощать на последующей стадии (стадии синтеза циклического пептида). Кроме того, в случае использования синтезируемого пептида в качестве библиотеки пептидов, его можно оценивать как он есть, без стадии снятия защитных групп после синтеза. Аминокислотный остаток и/или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи, предпочтительно представляет собой аминокислотный остаток и/или остаток аналога аминокислоты, имеющий гетероариленовую группу, имеющую цианогруппу, ариленовую группу, имеющую цианогруппу, или алкиленовую группу, имеющую цианогруппу, в боковой цепи.

[0097] Стадия проведения реакции цианогруппы со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать связь, представленную формулой (3), предпочтительно представляет собой стадию, осуществляемую без катализатора. Предпочтительно с точки зрения простоты вышеуказанную стадию можно осуществлять без катализатора.

[0098] Общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих циклическую часть пептидного соединения, имеющего циклическую часть, предпочтительно составляет от 3 до 20 и более предпочтительно от 5 до 15, с точки зрения достижения как способности связывания с мишенью (фармакологическая активность), так и мембранной проницаемости.

Предпочтительно, общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих пептидное соединение, имеющее циклическую часть, составляет от 3 до 20 и более предпочтительно от 5 до 20.

[0099] В случае, когда пептид синтезируют в бесклеточной системе трансляции, аминокислотный остаток или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи, можно встраивать с использованием терминирующих кодонов, кодонов из четырех оснований или кодонов, которые становятся пустыми кодонами посредством исключения природных аминокислот из кодонов, отведенных для трансляции природных аминокислот. Предпочтительно аминокислотный остаток или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи, встраивают с использованием терминирующих кодонов и кодонов из четырех оснований.

[0100] <Способ отбора пептидного соединения>

В соответствии с настоящим изобретением предусмотрен способ отбора пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом, включающий приведение целевого вещества в контакт с библиотекой пептидов, содержащей пептидное соединение в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения или его соль, и отбор пептидного соединения или его соли, которая связывается с целевым веществом.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, предусмотрен способ отбора пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом, включающий стадию получения пептидного соединения, дополнительно имеющего циклическую часть, с помощью указанного выше способа по настоящему изобретению; и стадию приведения целевого вещества в контакт с библиотекой пептидов, содержащей пептидное соединение или его соль, чтобы отбирать пептидное соединение или его соль, которое связывается с целевым веществом.

[0101] Библиотека пептидов представляет собой совокупность, состоящую из пептидов многих типов. Отбор представляет собой действие выбора пептида, содержащего желаемую функцию, из совокупности, и его можно обозначать как скрининг.

[0102] Библиотекой пептидов может быть та, которая содержит ациклическое пептидное соединение, состоящее из природных аминокислот, или так, которая содержит циклическое пептидное соединение, состоящее из природных аминокислот, в отношении пептидного соединения в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения.

В отношении пептидного соединения в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, предпочтительным является то, которое содержит ациклическое пептидное соединение, состоящее из природных аминокислот, или циклическое пептидное соединение, состоящее из природных аминокислот.

[0103] Способ отбора пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом, в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает следующие стадии.

(i) стадию получения библиотеки нуклеиновых кислот, осуществления трансляции посредством бесклеточной системы трансляции, содержащей элонгирующую тРНК, ацилированную с не природной аминокислотой, и получения библиотеки, содержащей пептид, где не природную аминокислоту случайно встраивают в пептидную последовательность;

(ii) стадию приведения библиотеки пептидов в контакт с целевым веществом; и

(iii) стадию отбора пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом.

[0104] Стадию (i) можно осуществлять таким образом, что каждый пептид, образующий библиотеку, транслируют с последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, и последовательность нуклеиновой кислоты и пептид в качестве продукта его трансляции связывают для того, чтобы конструировать библиотеку дисплея in vitro.

В последовательности нуклеиновой кислоты область, кодирующая пептид, может содержать случайную последовательность, состоящую из множества повторяющихся различных триплетов; по меньшей мере часть триплетов в случайной последовательности представляет собой последовательность, соответствующую кодону, точно определяющему не природную аминокислоту; и не природную аминокислоту можно встраивать в пептидную последовательность посредством спаривания антикодона элонгирующей тРНК, ацилированной с не природной аминокислотой, и кодона, точно определяющего не природную аминокислоту.

Стадия (iii) может включать определение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, который связывается с целевым веществом, определение пептидной последовательности по последовательности нуклеиновой кислоты и отбор пептидного соединения.

[0105] «Нуклеиновая кислота» в настоящем изобретении также может включать дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), рибонуклеиновую кислоту (РНК) или нуклеотидное производное, имеющие искусственные основания. Нуклеиновая кислота также может включать пептидо-нуклеиновую кислоту (PNA). Нуклеиновая кислота в настоящем изобретении может представлять собой любую из этих нуклеиновых кислот или их гибрид до тех пор, пока получаемая нуклеиновая кислота сохраняет генетическую информацию, представляющую интерес. То есть, нуклеотид гибрида ДНК-РНК или химерную нуклеиновую кислоту, в которой различные нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК, связывают вместе для создания одной нити, также включают в нуклеиновую кислоту в настоящем изобретении.

В настоящем изобретении, библиотеку нуклеиновых кислот (такую как библиотеку дисплея), содержащую эти нуклеиновые кислоты в качестве матрицы, можно использовать подходящим образом.

[0106] В дисплее in vitro пептид, синтезируемый с использованием бесклеточной системы трансляции (также обозначаемой как система трансляции in vitro) отображают в связи с генетической информацией. В качестве этого способа известен рибосомный дисплей, мРНК дисплей, ДНК дисплей или тому подобное. Каждый способ дисплея имеет механизм связывания генетической информации, записанной в мРНК или ДНК, с пептидом, кодируемым генетической информацией, и тем самым присвоения их в качестве комплекса [генетическая информация]-[продукт трансляции]. В рибосомном дисплее формируют комплекс мРНК-рибосома-пептид. В мРНК дисплее формируют комплекс мРНК-пептид. В ДНК дисплее формируют комплекс ДНК-пептид. Любую библиотеку дисплея in vitro можно использовать в настоящем изобретении.

[0107] Возможно обогащать связанные с мишенью пептиды посредством приведения библиотеки в контакт с желаемыми иммобилизованными мишенями и вымывания молекул, которые не связываются с мишенями (способ пэннинга). Информацию о гене, ассоциированную с пептидом, отобранным через такой процесс, можно анализировать для того, чтобы определять последовательность белка, связанного с мишенью. Например, о способе с использованием неспецифической конъюгации антибиотика пуромицина, который является аналогом аминоацил-тРНК, с белком в ходе его рибосомной элонгации трансляцией мРНК сообщалось в качестве мРНК дисплея (Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 12297-302. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Roberts R W, Szostak J W.) или вируса in vitro (FEBS Lett. 1997; 414: 405-8. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H.).

[0108] Спейсеры, такие как пуромицин, конъюгируют с 3'-концевой последовательностью библиотеки мРНК, получаемой посредством транскрипции с библиотеки ДНК, содержащей промотор, такой как T7 промотор. мРНК транслируют в белки в бесклеточной системе трансляции так, что пуромицин ошибочно встраивают в место аминокислоты в каждый белок с помощью рибосомы, чтобы связывать мРНК с белком, кодируемым ей, что ведет к библиотеке, в которой мРНК ассоциированы с их продуктами. Этот процесс, который не включает трансформацию E. coli или тому подобное, достигает высокой эффективности и позволяет конструировать крупномасштабную библиотеку дисплея (от 10⁹ до 10¹⁴ типов элементов). кДНК синтезируют из мРНК, служащей в качестве метки, содержащей информацию о гене, в молекуле, обогащенной и отобранной посредством пэннинга, и затем амплифицируют с помощью ПЦР. Продукты амплификации ПЦР можно секвенировать для того, чтобы определять последовательность белка, связанного с мРНК. Участки, кодирующие переменные аминокислотные остатки в библиотеке ДНК, используемые в качестве матрицы для библиотеки, можно получать посредством синтеза с использованием смеси оснований. Нить из смесей (N) 4 оснований A, T, G и C синтезируют с кратностью 3, или N для первой и второй букв в каждом кодоне, и синтезируют смеси 2 оснований (W, M, K, S и т. п.) для третьей буквы. В другом способе в качестве третьего основания можно задавать один тип в случае, когда встраивают 16 или меньше типов аминокислот. Также получают единицы кодонов, соответствующие 3 буквам для каждого кодона, и смесь этих единиц кодонов в определенном соотношении можно использовать в синтеи для того, чтобы свободно корректировать частоту возникновения каждого аминокислотного остатка.

[0109] В дополнение к мРНК дисплею, кДНК дисплей, который представляет собой библиотеку, состоящую из пептид-кодирующей кДНК, связанной с комплексами пептид-пуромицин (Nucleic Acids Res. 2009; 37 (16): e108. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Yamaguchi J, Naimuddin M, Biyani M, Sasaki T, Machida M, Kubo T, Funatsu T, Husimi Y, Nemoto N.); рибосомный дисплей, в котором используют относительную стабильность комплексов рибосома-продукт трансляции в ходе трансляции мРНК (Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91: 9022-6. An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Mattheakis L C, Bhatt R R, Dower W J.); ковалентный дисплей, в котором используют формирование ковалентной связи между эндонуклеазой бактериофага P2A и ДНК (Nucleic Acids Res. 2005; 33: e10. Covalent antibody display-an in vitro antibody-DNA library selection system. Reiersen H, Lobersli I, Loset G A, Hvattum E, Simonsen B, Stacy J E, McGregor D, Fitzgerald K, Welschof M, Brekke O H, Marvik O J.); и CIS дисплей, в котором используют связывание белка инициатора микробной плазмидной репликации RepA с сайтом начала репликации ori (Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 2806-10. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Odegrip R, Coomber D, Eldridge B, Hederer R, Kuhlman P A, Ullman C, FitzGerald K, McGregor D.) известны в качестве библиотек дисплея с использованием бесклеточной системы трансляции. Кроме того, известна компартментализация in vitro (Nat Biotechnol. 1998; 16: 652-6. Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Tawfik D S, Griffiths A D.), при которой систему транскрипции-трансляции инкапсулируют в эмульсии «вода-в-масле» или липосоме на молекулу ДНК, образующую библиотеку ДНК, и подвергают реакции трансляции. Описанный выше способ можно осуществлять надлежащим образом с использованием любых из этих известных в данной области способов.

[0110] В настоящем изобретении, эти библиотеки нуклеиновых кислот можно транслировать с использованием бесклеточной системы трансляции, описанной далее. В случае использования бесклеточной системы трансляции, кодирующую спейсер последовательность предпочтительно включают ниже по направлению считывания от целевой нуклеиновой кислоты. Примеры последовательности спейсера включают, но не ограничиваясь этим, последовательности, содержащие глицин или серин. Кроме того, линкер, образуемый с помощью РНК, ДНК, полимеров гексаэтиленгликоля (spc18) (например, пять полимеров), или тому подобное, предпочтительно включают между соединением, таким как пуромицин или его производное, которое встраивают в пептид в ходе рибосомной трансляции, и библиотекой нуклеиновых кислот.

[0111] Бесклеточная система трансляции

Систему получения белка, такую как бесклеточная система трансляции, предпочтительно используют в способе получения пептидного соединения в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения. Бесклеточная система трансляции относится к комбинации рибосомы, извлекаемой из клеток, а также группы белковых факторов, участвующих в трансляции, тРНК, аминокислот, источников энергии (таких как аденозинтрифосфаты (ATP) и системы их регенерации, и может транслировать мРНК в белки. Бесклеточная система трансляции по настоящему изобретению дополнительно может содержать фактор инициации, фактор элонгации, фактор диссоциации, аминоацил-тРНК-синтетазу (ARS), метионил-тРНК трансформилазу и т. п. Эти факторы можно получать посредством очистки из экстрактов различных клеток. Примеры клеток для использования в очистке факторов могут включать прокариотические клетки и эукариотические клетки. Примеры прокариотических клеток могут включать клетки E. coli, экстремальные термофильные клетки и клетки Bacillus subtilis. В качестве эукариотических клеток известны те, которые получают из клеток дрожжей, зародышей пшеницы, ретикулоцитов кролика, клеток растения, клеток насекомого или клеток животного.

[0112] Бесклеточную систему трансляции можно получать посредством разрушения клеточного материала и добавления тРНК, аминокислот, ATP и т. п. к экстракту, полученному посредством центрифугирования, диализа или тому подобного. Используемый материал может представлять собой, например, E. coli (Methods Enzymol. 1983; 101: 674-90. Prokaryotic coupled transcription-translation. Chen H Z, Zubay G.), дрожжи (J. Biol. Chem. 1979 254: 3965-3969. The preparation and characterization of a cell-free system from Saccharomyces cerevisiae that translates natural messenger ribonucleic acid. E Gasior, F Herrera, I Sadnik, C S McLaughlin, and K Moldave), зародыши пшеницы (Methods Enzymol. 1983; 96: 38-50. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Erickson A H, Blobel G.), ретикулоциты кролика (Methods Enzymol. 1983; 96: 50-74. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Jackson R J, Hunt T.), клетки Hela (Methods Enzymol. 1996; 275: 35-57. Assays for poliovirus polymerase, 3D(Pol), and authentic RNA replication in HeLa S10 extracts. Barton D J, Morasco B J, Flanegan J B.) или клетки насекомого (Comp Biochem Physiol B. 1989; 93: 803-6. Cell-free translation in lysates from Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) cells. Swerdel M R, Fallon A M.). Трансляцию можно сопрягать с транскрипцией с ДНК посредством добавления РНК полимеразы, такой как РНК полимераза T7. Между тем, PUREfrex (зарегистрированный товарный знак) представляет собой восстановленную бесклеточную систему трансляции, содержащую экстрагированные и очищенные белковые факторы, необходимые для трансляции в E. coli, ферменты регенерации энергии и рибосомы, смешанные с тРНК, аминокислоты, ATP, гуанозинтрифосфаты (GTP) и т. п. Поскольку PUREfrex имеет низкое содержание примесей и, кроме того, представляет собой восстановленную систему, можно легко конструировать систему, свободную от белковых факторов и аминокислот, подлежащих исключению ((i) Nat Biotechnol. 2001; 19: 751-5. Cell-free translation reconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.; и (ii) Methods Mol Biol. 2010; 607: 11-21. PURE technology. Shimizu Y, Ueda T.). В настоящем изобретении описанный выше способ можно осуществлять посредством надлежащего использования этих способов, известных в данной области.

[0113] Различные факторы, такие как рибосомы и тРНК, содержащиеся в бесклеточной системе трансляции, можно очищать от клеток E. coli или клеток дрожжей с помощью способа, хорошо известного специалистам в данной области. Можно использовать встречаемые в природе тРНК или аминоацил-тРНК-синтетазу или искусственные тРНК, или можно использовать искусственную аминоацил-тРНК-синтетазу, распознающую не природные аминокислоты. Использование искусственных тРНК или искусственной аминоацил-тРНК-синтетазы позволяет добиваться синтеза пептида, в котором не природные аминокислоты встраивают сайт-специфическим образом.

[0114] Трансляционное встраивание не природных аминокислот в пептиды требует аминоацилирования тРНК, которая обладает ортогональностью и эффективно встраивается в рибосому ((i) Biochemistry. 2003; 42: 9598-608. Adaptation of an orthogonal archaeal leucyl-tRNA and synthetase pair for four-base, amber, and opal suppression. Anderson J C, Schultz P G.; (ii) Chem Biol. 2003; 10:1077-84. Using a solid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the genetic code. Murakami H, Kourouklis D, Suga H.; and (iii) JP4917044B). Следующие пять способов можно использовать в качестве способа аминоацилирования тРНК.

[0115] (1) Внутриклеточное аминоацилирование тРНК обеспечивают с использованием аминоацил-тРНК-синтетазы для каждой аминокислоты, которая связывается с тРНК. Один способ основан на том факте, что предварительно определяемая аминоацил-тРНК-синтетаза принимает не природную аминокислоту, такую как N-Me His. То есть, в этом способе получают и используют мутантную аминоацил-тРНК-синтетазу, которая принимает не природную аминокислоту ((i) Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 9715-20. An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its application in a wheat germ cell-free system. Kiga D, Sakamoto K, Kodama K, Kigawa T, Matsuda T, Yabuki T, Shirouzu M, Harada Y, Nakayama H, Takio K, Hasegawa Y, Endo Y, Hirao I, Yokoyama S.; (ii) Science. 2003; 301: 964-7. An expanded eukaryotic genetic code. Chin J W, Cropp T A, Anderson J C, Mukherji M, Zhang Z, Schultz P G. Chin, J W.; and (iii) Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103: 4356-61. Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnatural amino acids. Hartman M C, Josephson K, Szostak J W.).

[0116] (2) Также можно использовать способ аминоацилирования тРНК и последующей химической модификации аминокислот in vitro (J Am Chem Soc. 2008; 130: 6131-6. Ribosomal synthesis of N-methyl peptides. Subtelny A O, Hartman M C, Szostak J W.).

[0117] (3) тРНК с отсутствующими CA в 3'-концевой последовательности CCA можно лигировать с аминоацилированным pdCpA (динуклеотидом, состоящим из дезоксицитидина и аденозина), полученным отдельно посредством РНК лигазы для получения аминоацил-тРНК (Biochemistry. 1984; 23: 1468-73. T4 RNA ligase mediated preparation of novel “chemically misacylated” tRNAPheS. Heckler T G, Chang L H, Zama Y, Naka T, Chorghade M S, Hecht S M.).

[0118] (4) Аминоацилирование можно осуществлять с помощью рибозима, называемого флексизим, который делает возможным связывание активных сложных эфиров различных не природных аминокислот с тРНК (J Am Chem Soc. 2002; 124: 6834-5. Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme. Murakami H, Bonzagni N J, Suga H.). Также можно использовать способ ультразвукового смешивания тРНК и активных сложных эфиров аминокислот в катионной мицелле (Chem Commun (Camb). 2005; (34): 4321-3. Simple and quick chemical aminoacylation of tRNA in cationic micellar solution under ultrasonic agitation. Hashimoto N, Ninomiya K, Endo T, Sisido M.).

(5) Аминоацилирования можно достичь посредством добавления, к тРНК, активного сложного эфира аминокислоты, связанного с PNA, комплементарной 3'-концевой области тРНК (J Am Chem Soc. 2004; 126: 15984-9. In situ chemical aminoacylation with amino acid thioesters linked to a peptide nucleic acid. Ninomiya K, Minohata T, Nishimura M, Sisido M.).

[0119] Несмотря на то, что сообщалось о многих способах с использованием терминирующих кодонов в качестве кодонов для встраивания не природных аминокислот, систему синтеза, из которой исключают природные аминокислоты и ARS, можно сконструировать с использованием PUREfrex (зарегистрированный товарный знак). Следовательно, не природные аминокислоты можно встраивать вместо исключенных природных аминокислот для кодонов, кодирующих аминокислоты, то есть не природные аминокислоты можно встраивать с использованием кодонов, которые становятся пустыми кодонами посредством исключения природных аминокислот из кодонов, отведенных для трансляции природных аминокислот (J Am Chem Soc. 2005; 127: 11727-35. Ribosomal synthesis of unnatural peptides. Josephson K, Hartman M C, Szostak J W.). Кроме того, не природные аминокислоты можно добавлять без исключения природных аминокислот посредством нарушения вырожденности кодонов и расширения кодонов с помощью кодонов из четырех оснований (Kwon I, et al., Breaking the degeneracy of the genetic code. J Am Chem Soc. 2003, 125, 7512-3.; и T, Hohsaka et al. J Am Chem Soc. 1996, 118, 9778.). То есть, в качестве аминокислотного остатка или остатка аналога аминокислоты, имеющего в его боковой цепи гетероариленовую группу, имеющую цианогруппу, ариленовую группу, имеющую цианогруппу, или алкиленовую группу, имеющую цианогруппу, можно использовать любой из кодонов, которые становятся пустыми кодонами посредством исключения природных аминокислот из кодонов, отведенных для трансляции природных аминокислот, терминирующих кодонов или кодонов из четырех оснований.

[0120] При встречаемой в природе трансляции, каждый один из 20 типов протеиногенных аминокислот и терминация трансляции (стоп) отведены каждому из 64 типов кодонов в соответствии с таблицей универсального генетического кода, представленной далее.

[0121] [Таблица 1]

[0122] В настоящем изобретении, в дополнение к кодонам, используемым в реакции элонгации пептидной цепи, инициирующий кодон также можно переписывать. Инициирующий кодон представляет собой кодон, который обозначает начало трансляции, и он кодирует инициирующую аминокислоту, образующую N-конец пептида, в мРНК. Инициация трансляции мРНК требует специальной тРНК, называемой инициирующей тРНК. Для того чтобы инициировать трансляцию, аминоацилированная инициирующая тРНК связывается с малой субъединицей рибосомы вместе с фактором инициации (IF), и малая субъединица рибосомы связывается с инициирующим кодоном на мРНК. Инициирующая тРНК имеет антикодон, соответствующий инициирующему кодону, и распознает инициирующий кодон. В таблице универсального кода AUG, который представляет собой кодон для метионина, в целом используют в качестве инициирующего кодона, так что инициирующая тРНК имеет антикодон, соответствующий метионину, и инициирующая тРНК обязательно несет метионин (формилметионин в прокариотической клетке).

[0123] Использование инициирующего сквозного прочтения (просканивания инициирующего кодона) устраняет необходимость получения множества типов инициирующих трансляцию аминоацил-тРНК для способа для синтеза пептидных соединений или библиотек пептидных соединений, имеющих разнообразные концы, посредством N-концевого встраивания аминокислоты, аналога аминокислоты или N-концевого аналога карбоновой кислоты, отличных от метионина. Инициирующее сквозное прочтение обозначает феномен, при котором транслируемый продукт генерируют из аминокислоты, кодируемой 2-м или последующим кодоном в бесклеточной системе трансляции, не содержащей инициирующей трансляцию метионил-тРНК, или при инициации трансляции с инициирующей трансляцию тРНК с не природной аминокислотой, имеющей низкую эффективность трансляции, хотя обычно трансляцию белка или пептида инициируют от метионина в качестве начальной аминокислоты посредством трансляции, кодируемой с помощью кодона AUG.

[0124] Способ с использованием инициирующего сквозного прочтения может включать предоставление возможности кодирования любой природной аминокислоты, отличной от метионина, с помощью 2-го кодона после инициирующего кодона в последовательности пептид-кодирующей мРНК и осуществление трансляции в системе трансляции, не содержащей ни метионин ни инициирующую трансляцию метионин-тРНК, чтобы получать пептид или библиотеку пептидов, имеющих любую природную аминокислоту, отличную от метионина, на N-конце. В соответствии с другим сообщением, известен способ, который включает удаление N-концевого метионина пептида под действием ферментов, например, пептиддеформилазы и метионинаминопептидазы (Meinnel, T., et al., Biochimie (1993) 75, 1061-1075, Methionine as translation start signal: A review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli).

[0125] Альтернативные аминокислоты также можно транслировать в качестве N-конца с использованием аминоацилированной тРНК желаемой аминокислоты вместо таковой для метионина. Известно, что N-концевое встраивание не природной аминокислоты имеет более высокую аминокислотную толерантность, чем таковая в ходе элонгации, и использует аминокислоту или аналог аминокислоты, значительно структурно отличные от природной аминокислоты (J Am Chem Soc. 2009 Apr 15; 131(14): 5040-1. Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides. Goto Y, Suga H.).

[0126] (Замыкание кольца пептида)

В настоящем изобретении пептид можно замыкать в кольцо с использованием внутримолекулярной специфической реакции трансляционно синтезируемого ациклического пептида.

Замыкание пептида в кольцо осуществляют с помощью следующих стадий (i) и (ii).

(i) стадия синтеза, посредством трансляционного синтеза, ациклического пептидного соединения, имеющего, в его молекуле, пару функциональных групп, то есть функциональную группу 1 и функциональную группу 2, которые способны вступать в реакцию формирования связи; и

(ii) стадия замыкания в кольцо ациклического пептидного соединения через реакцию формирования связи между функциональной группой 1 и функциональной группой 2.

[0127] Термин «пара функциональных групп, способная вступать в реакцию формирования связи» обозначает пару функциональных групп, способных вступать в реакцию формирования связи между ними, то есть между функциональной группой 1 и функциональной группой 2 и в результате реакции превращать ациклическое пептидное соединение в циклическое пептидное соединение.

В настоящем изобретении комбинацию цианогруппы и структуры формулы (2) используют в качестве указанной выше пары функциональных групп.

То есть, в настоящем изобретении циклическое пептидное соединение можно получать таким образом, что получают пептидную цепь, имеющую аминокислотный остаток или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи в пептидной цепи или на C-конце, и имеющую структуру формулы (2) на N-конце, в соответствии с чем цианогруппа вступает в реакцию со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать связь, представленную формулой (3), описанной в настоящем описании.

[0128] Поскольку кольцо формируют посредством формирования связи между указанной выше парой функциональных групп, присутствующих в ациклическом пептидном соединении, элементы (обычно, аминокислоты), образующие ациклическое пептидное соединение, должны быть одним звеном, и такая пара функциональных групп должна присутствовать на звеньях различных составляющих элементов. Такой составляющий элемент обозначают как соединение аминокислот, и звено составляющего элемента обозначают как звено соединения аминокислот. То есть ациклическое пептидное соединение представляет собой соединение, имеющее пару функциональных групп на другом звене соединения аминокислот. В ациклическом пептидном соединении предпочтительно от 1 до 18 звеньев соединения аминокислот, более предпочтительно от 1 до 15 звеньев соединения аминокислот и еще более предпочтительно от 3 до 13 звеньев соединения аминокислот присутствует между звеном соединения аминокислот, имеющим одну функциональную группу, и звеном соединения аминокислот, имеющим другую функциональную группу.

[0129] Примеры аминокислот, имеющих функциональную группу 2, включают цистеин, серин и треонин в качестве природных аминокислот. В качестве не природных аминокислот также возможно использовать не природные аминокислоты, имеющие группу -SH (например, пеницилламин, гомоцистеин и меркаптонорвалин), не природные аминокислоты, имеющие группу -NH₂ (например, α,β-диаминопропановая кислота и α,γ-диаминомасляная кислота), или не природные аминокислоты, имеющие группу OH (например, гомосерин).

Аминокислота, имеющая функциональную группу 2, предпочтительно представляет собой цистеин, α-метилцистеин, пеницилламин или гомоцистеин. Аминокислоту, имеющую функциональную группу 2, встраивают в реакции элонгации пептидной цепи в восстановленной системе трансляции, содержащей по меньшей мере эту аминокислоту и соответствующую тРНК.

[0130] Циклическое пептидное соединение синтезируют посредством замыкания кольца ациклического пептидного соединения, синтезируемого как описано выше. Условия реакции формирования связи функциональной группы 1 и функциональной группы 2 задают в соответствии с типом функциональной группы.

[0131] Замыкание кольца ациклического пептидного соединения можно осуществлять посредством выделения ациклического пептидного соединения и последующего экспонирования выделенного ациклического пептидного соединения для подходящих условий реакции. Альтернативно, замыкание кольца ациклического пептидного соединения можно осуществлять посредством корректировки бесклеточной системы трансляции для подходящих условий реакции без выделения ациклического пептидного соединения. Кроме того, в зависимости от типа пары функциональных групп, замыкание кольца можно осуществлять в условиях бесклеточной системы трансляции для синтеза ациклического пептидного соединения. В этом случае циклическое пептидное соединение можно получать без какой-либо особой корректировки условий реакции.

[0132] Предпочтительные условия реакции для замыкания кольца ациклического пептидного соединения раскрыты в настоящем описании ранее.

[0133] (Матричная нуклеиновая кислота, кодирующая пептид)

В настоящем изобретении библиотеку пептидов, имеющих случайную аминокислотную последовательность, можно синтезировать посредством осуществления трансляционного синтеза с матричной нуклеиновой кислоты (мРНК или ДНК, соответствующей ей), имеющей случайную последовательность в области, кодирующей пептид, в бесклеточной системе трансляции. Кроме того, посредством комбинирования системы трансляции с технологией дисплея in vitro, скрининг можно осуществлять в состоянии, когда пептиды, образующие библиотеку, ассоциированы с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими пептиды. В этом случае, пептидные аптамеры выбирают из библиотеки дисплея, в которой генетическая информация представлена в виде пептида, который является продуктом ее трансляции. Как результат, каждую случайную пептидную молекулу в библиотеке прикрепляют к метке, которую можно амплифицировать и считывать посредством приемов молекулярной биологии.

[0134] В настоящем изобретении можно разрабатывать последовательность РНК или ДНК, которая представляет собой матрицу, соответствующую аминокислотной последовательности пептида, чтобы кодировать случайную библиотеку пептидов. В частности, область, кодирующая пептид в последовательности оснований, включает случайную последовательность, состоящую из множества повторяющихся различных триплетов, и по меньшей мере часть триплетов в случайной последовательности представляет собой последовательность, соответствующую кодону, точно определяющему не природную аминокислоту.

Кроме того, в области, кодирующей пептид, по меньшей мере часть кодонов из четырех оснований (квартет) в случайной последовательности может представлять собой последовательность, соответствующую кодону, точно определяющему не природную аминокислоту.

[0135] В настоящем изобретении можно разрабатывать последовательность РНК или ДНК для того, чтобы кодировать циклический пептид. В частности, область, кодирующая пептид, в последовательности оснований включает, по порядку, последовательности оснований, соответствующие следующим (a)-(c), в направлении 5'→3' последовательности мРНК:

(a) кодон, точно определяющий аминокислоту, имеющую функциональную группу 1;

(b) случайная последовательность, состоящая из множества повторяющихся различных триплетов; и

(c) кодон, точно определяющий аминокислоту, имеющую функциональную группу 2.

[0136] Случайную последовательность мРНК разрабатывают так, что не природные аминокислоты встречаются с определенной вероятностью в трансляционном продукте, случайной аминокислотной последовательности. То есть в случае, когда по меньшей мере часть триплетов в случайной последовательности (b) представляет собой кодон, точно определяющий не природную аминокислоту, не природную аминокислоту встраивают в часть аминокислотной последовательности случайного пептида, который представляет собой продукт трансляции. Встраивания не природной аминокислоты достигают посредством образования пары антикодона тРНК для реакции элонгации, связанного с не природной аминокислотой, и кодона, точно определяющего не природную аминокислоту в реакции элонгации пептидной цепи на рибосоме. Кроме того, реакция формирования связи между функциональной группой 1 и функциональной группой 2, которые представляют собой пару функциональных групп, способных вступать в реакцию формирования связи, замыкает кольцо пептида, который представляет собой продукт трансляции. Как указано выше, тРНК, используемая для встраивания не природной аминокислоты, предпочтительно представляет собой искусственную тРНК, получаемую посредством реакции транскрипции in vitro.

[0137] В настоящем изобретении молекулу ДНК или РНК, соответствующую последовательности оснований, которая служит в качестве трансляционной матрицы, добавляют в бесклеточную систему трансляции, состоящую из компонентов, оптимизированных в соответствии с предполагаемым использованием. Подобно экспрессирующей белок системе с использованием живых клеток, последовательность нуклеиновой кислоты может содержать область, кодирующую желаемую аминокислотную последовательность и, кроме того, последовательность оснований, благоприятную для трансляции, в зависимости от системы трансляции, подлежащей использованию. Например, в системе с использованием рибосомы, получаемой из E. coli, эффективность реакции трансляции возрастает в случае, когда последовательность содержит, выше по направлению считывания от инициирующего кодона, последовательность Шайна-Дальгарно (SD), ε-последовательность или тому подобное.

[0138] Инициирующий кодон помещают на N-конце области, кодирующей пептид. Инициирующий кодон обычно представляет собой последовательность триплета AUG.

[0139] На C-концевой стороне последовательности, последовательность для связывания молекула нуклеиновой кислоты с пептидом, который является продуктом ее трансляции, включают для дисплея in vitro. Например, в случае использования способа мРНК дисплея с использованием пуромицинового линкера, формируют библиотеку комплексов мРНК-пептид посредством добавления, в систему трансляции, библиотеки мРНК, связанных предварительно с пуромициновым линкером. Линкер обычно вставляют между стороной 3'-конца мРНК и пуромицином для того, чтобы эффективно встраивать пуромицин в A-сайт рибосомы. Пуромицин выполняет функцию субстрата (аналога аминоацил-тРНК) реакции транспептидации на рибосоме и он соединяет мРНК и пептид посредством связывания с C-концом пептида при элонгации. Способ мРНК дисплея представляет собой технологию интегрирования генотипа и фенотипа друг с другом посредством связывания мРНК и пептида через подходящий линкер в системе трансляции in vitro. До тех пор, пока достигают цель, пуромицин можно заменять на линкер, содержащий другое вещество, имеющее схожую функцию, которое входит в спектр узнавания специалистами в данной области.

[0140] Случайная последовательность состоит из повтора кодона, состоящего из триплета любой последовательности для не природной аминокислоты, такой как аминокислота, имеющая цианогруппу в боковой цепи. Кроме того, кодоны из четырех оснований (квартет) можно включать в случайную последовательность, а не природные аминокислоты, такие как аминокислоты, имеющие цианогруппу в боковой цепи, можно обозначать как кодоны из четырех оснований.

[0141] Триплеты, которые образуют случайную последовательность, представлены с помощью кодона N¹N²N³ для того, чтобы иллюстрировать возможные последовательности. Каждый N¹ и N² независимо может представлять собой любой один из A, U, C или G. Кроме того, N³ также может представлять собой любой один из A, U, C или G. Альтернативно, N³ может представлять собой любой один, выбранный из любых трех из четырех оснований из A, U, C и G. Альтернативно, N³ может представлять собой любой один, выбранный из любых двух из четырех оснований A, U, C и G. Альтернативно, N³ можно определять как один из A, U, C или G.

[0142] Например, триплет в последовательности мРНК, образующий случайную последовательность, может представлять собой кодон NNU или кодон NNK, в котором N представляет собой рибонуклеотид любого из A, U, C или G и K представляет собой рибонуклеотид из C или G.

[0143] (Отбор in vitro)

В настоящем изобретении, библиотека пептидов, конструируемая в бесклеточной системе трансляции, совместима с технологией дисплея in vitro, включая мРНК дисплей, с тем, чтобы возможно было создавать пептидные молекулы, которые связываются с мишенью из библиотеки пептидов с большим разнообразием, имеющей 10⁹ или больше пептидов.

[0144] Технологию дисплея in vitro используют в качестве инструмента эволюционной молекулярной инженерии. В этой эволюционной молекулярной инженерии, с целью создания белков или пептидов, обладающих желаемой функцией или свойством, гены, имеющие эту возможность, получают в большом масштабе, и из них выбирают клон, обладающих желаемым фенотипом. В основном, сначала получают популяцию ДНК (библиотеку ДНК). Затем получают популяцию РНК (библиотеку РНК) в виде транскрипта in vitro, после чего следует получение популяции пептидов (библиотеки пептидов) в виде продукта трансляции in vitro. Из этой библиотеки пептидов отбирают пептиды, имеющие желаемую функцию или свойство, с использованием определенной системы скрининга. Например, в случае, когда желательно получать пептидную молекулу, которая связывается с конкретным белком, популяцию пептидов можно выливать на колонку, на которой иммобилизуют целевой белок, и можно извлекать смесь пептидных молекул, связанных с колонкой. В этот момент каждую пептидную молекулу прикрепляют к молекуле нуклеиновой кислоты, которая представляет собой матрицу пептидной молекулы, как метку, с помощью технологии дисплея in vitro. В случае библиотеки мРНК дисплея, каждую пептидную молекулу прикрепляют к мРНК. Следовательно, популяцию комплексов пептид-мРНК, извлеченных таким образом, превращают обратно в ДНК с использованием обратной транскриптазы, после чего следует амплификация с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) для получения направленной библиотеки, содержащей много клонов, имеющих желаемый фенотип. Затем тот же эксперимент по отбору осуществляют снова. Альтернативно, также возможно осуществлять обратную транскрипцию перед отбором для того, чтобы менять часть нуклеиновой кислоты на двойную цепь (гибрид ДНК/РНК) и тем самым избегать возможного извлечения РНК аптамера. Посредством повторения этой операции, клоны с желаемым фенотипом обогащают в популяции со сменой поколений.

[0145] В случае, когда идентифицируют пептидный аптамер, ген пептидного аптамера, который связывается с целевым веществом, можно клонировать посредством повторения стадии смешивания библиотеки дисплея in vitro и целевого вещества; отбора присвоенной молекулы (активной частицы), представляющей пептид, который связан с целевым веществом; и получения библиотеки нуклеиновых кислот с использованием ПЦР из части нуклеиновой кислоты из присвоенной молекулы, отобранной таким образом.

[0146] Примеры целевого вещества в целом включают белки, нуклеиновые кислоты, липиды, в том числе комплексы липидов, сахара, в том числе цепи сахаров, и другие биомолекулы и кроме того включают металлы и пигменты.

Целевое вещество предпочтительно представляет собой молекулу in vivo для лечения заболевания, в частности, молекулу, которая не имеет пространства, которое может быть занято стандартным низкомолекулярным соединением, имеющим молекулярную массу меньше чем 500, или внутриклеточный белок, доступ к которому нельзя осуществлять с помощью высокомолекулярного соединения, такого как антитело, нуклеиновая кислота, внутриклеточная область мембранного белка, трансмембранный домен мембранного белка или тому подобное.

[0147] Примеры целевых веществ включают связанные с G-белком рецепторы (GPCR), ядерные рецепторы, протеинкиназы, протеазы, эстеразы, ионные каналы, метаболические ферменты, белки без структуры, РНК, ДНК, жирные кислоты, фосфолипиды и стерины.

[0148] Конкретные примеры целевых веществ включают факторы транскрипции, такие как c-Myc, STAT, AP1, CREB и SREBP; связанные с G-белком рецепторы (GPCR), такие как GPR143, GRM1, ADORA1, мускариновый рецептор ацетилхолина, рецептор каннабиоидрв, рецептор GLP-1 и рецептор PTH; цитокины, такие как TNF, TNFR, IL-6 и IL-6R и их рецепторы; ионотропные рецепторы, такие как рецептор P2X и никотиновый рецептор ацетилхолина; рецепторы тирозинкиназного типа, такие как EGFR и PDGFR; цитоплазматические белки, такие как p53, XIAP, Mcl-1, Bcl-2, MDM2, MLL, BRD4, USP7 и YAP; микроРНК, такие как miR-21 и miR206; и ДНК, такую как cfDNA и митохондриальная ДНК.

Кроме того, металл, такой как золото, серебро, медь, платина, или палладий, или соль этого металла может представлять собой целевое вещество, или пигмент, такой как оксид титана, сульфат бария, технический углерод, диоксид кремния, оксид железа, азокраситель, фталоцианин или антрахинон, может представлять собой целевое вещество.

[0149] Для того чтобы отбирать активную частицу, необходимо приводить комплекс [генетическая информация]-[пептид] в контакт с целевым веществом и отделять и извлекать комплекс, который представляет пептид, связанный с целевым веществом, из множества других комплексов, не связанных с целевым веществом, с помощью подходящего способа. Многие приемы известны в качестве такого способа извлечения.

[0150] Например, удобно подвергать целевое вещество модификации, которую можно извлекать посредством связывания с твердой фазой. Например, целевое вещество можно модифицировать биотином и извлекать с использованием специфического связывания с иммобилизованным связывающим биотин белком. Примеры такого специфического связывания, которое можно использовать в настоящем описании, включают, но не ограничиваясь этим, комбинацию связывающего мальтозу белка/мальтозы, комбинацию полигистидинового пептида/иона металла (никель, кобальт или тому подобное), комбинацию глутатион-S-трансферазы/глутатиона и комбинацию антитела/антигена (эпитопа), в дополнение к комбинации связывающего биотин белка (авидин, стрептавидин или тому подобное)/биотина.

[0151] Настоящее изобретение включает создание пептида, который связывается с целевым веществом, посредством повторения отбора in vitro, имеющего следующие стадии: приведение библиотеки пептидов в контакт с целевым веществом, отбор активной частицы, представляющей пептид, который связан с целевым веществом, амплификация последовательности нуклеиновой кислоты активной частицы, отобранной таким образом, и отбор активной частицы из библиотеки пептидов, синтезированных снова в бесклеточной системе трансляции, с использованием амплифицированной последовательности нуклеиновой кислоты в качестве матрицы.

[0152] Создание пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом, включает извлечение активных частиц, представляющих пептиды, которые связаны с целевым веществом, анализ последовательности нуклеиновой кислоты извлеченной активной частицы, определение пептидной последовательности по последовательности нуклеиновой кислоты, отбор подходящих пептидов на основе получаемой пептидной последовательности и получение аминокислотной последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты для пептидов, которые связываются с целевым веществом. Кроме того, на основе информации о последовательности, полученной таким образом, пептиды можно синтезировать, очищать и выделялть с использованием любого способа. Посредством оценки связывания получаемых пептидов с целевым белком и подтверждения ингибирующей активности получаемых пептидов в отношении целевого белка, можно получать пептиды с высокой активностью.

Примеры

[0153] Настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры, но настоящее изобретение не ограничено этим.

Если не указано иное, очистку посредством колоночной хроматографии осуществляли с использованием автоматического аппарата очистки ISOLERA (доступен в Biotage AB) или жидкостного хроматографа среднего давления YFLC W-prep 2XY (доступен в Yamazen Corporation).

Если не указано иное, картридж SNAP KP-Sil (доступен в Biotage AB) или высокую флэш-колонку W001, W002, W003, W004 или W005 (доступны в Yamazen Corporation) использовали в качестве носителя для колоночной хроматографии на силикагеле.

Картридж SNAP KP-NH (доступен в Biotage AB) использовали в качестве NH диоксида кремния.

[0154] Соотношение смешивания в элюенте представляет собой объемное соотношение.

Например, «хлороформ/метанол=90/10→50/50» обозначает, что элюент «хлороформ/метанол=90/10» заменяют на элюент «хлороформ/метанол=50/50».

[0155] Масс-спектры (MS) измеряли с использованием способа ионизации, который одновременно осуществляет ACQUITY SQD LC/MS System (доступна в Waters Corporation, ионизация: ионизация электрораспылением (ESI)) или LCMS-2010 EV (доступно в Shimadzu Corporation, ионизация: ESI и химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI)).

Если не указано иное, MS в таблице обозначает MS (ESI m/z): (M+H).

[0156] Использовали микроволновой реактор InitiatorTM (доступен в Biotage AB). Использовали проточный реактор гидрогенизации H-Cube (доступен в ThalesNano, Inc.).

[0157] Спектры ядерного магнитного резонанса (NMR) измеряли с использованием Bruker AV300 (доступен в Bruker Corporation) с тетраметилсиланом в качестве внутреннего стандарта, где все значения δ представлены в м. д.

[0158] Время удержания (RT) измеряли с использованием SQD (доступно в Waters Corporation), и оно приведено в минутах (мин).

Колонка: Waters BEHC 18 1,7 мкм, 2,1×30 мм

Растворитель: жидкость A: 0,1% муравьиная кислота-вода

жидкость B: 0,1% муравьиная кислота-ацетонитрил

Цикл градиента: 0,00 мин (жидкость A/жидкость B=95/5), 2,00 мин (жидкость A/жидкость B=5/95), 3,00 мин (жидкость A/жидкость B=5/95)

Скорость потока: 0,5 мл/мин

Температура колонки: комнатная температура

Длина волны обнаружения: 254 нм

[0159] Использовали масс-спектр времяпролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI-TOF MS) UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF MS (производства Bruker Daltonics, Inc.). Использовали матрицу α-циано-4-гидроксикоричную кислоту.

[0160] Синтез 4-бром-2-цианотиазола

[0161] 430 мкл N-метилморфолина (NMM) и гидрохлорид гидроксиламина (200 мг) добавляли в метаноловый (MeOH) раствор (5 мл) 4-бром-1,3-тиазол-2-карбальдегида (500 мг), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении, добавляли дистиллированную воду и этилацетат и осуществляли операцию экстрагирования. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. 10 мл дихлорметана и 430 мг 1,1'-карбонилдиимидазола (CDI) добавляли в получаемый остаток, который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель отгоняли и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→10/90) для того, чтобы получать 450 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

MS(ESI m/z): 190,9(M+H)

RT (мин): 1,06

[0162] Синтез 4-бром-2-цианофурана

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез 4-бром-2-цианотиазола.

MS(ESI m/z): 172,0(M+H)

RT (мин): 1,18

[0163] Синтез 3-бром-4-нитробензонитрила

вариант ctxB

(1) Синтез 3-бром-4-нитробензамида

4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (DMT-MM) (3,95 г) и метаноловый раствор аммиака (7 моль/л, 8 мл) добавляли в ацетонитриловый раствор (20 мл) 3-бром-4-нитробензойной кислоты (2,35 г), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 часа. Насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия добавляли в реакционный раствор, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 2,26 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 246,9(M+H)

RT (мин): 0,96

[0164] (2) Синтез 3-бром-4-нитробензонитрила

10 мл тетрагидрофурана (THF) и 4 мл триэтиламина (TEA) добавляли в 2,0 г 3-бром-4-нитробензамида. На ледяной бане туда по каплям добавляли 1,8 мл трифторуксусного ангидрида (TFAA), после чего следовало перемешивание в течение 2 часов. Затем отгоняли растворитель, в получаемый остаток добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→15/85) для того, чтобы получать 1,45 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 228,1(M+H)

RT (мин): 1,31

[0165] Синтез 6-бромбензо[b]тиофен-2-карбонитрила

Начиная с 6-бромбензо[b]тиофен-2-карбоновой кислоты, процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез 3-бром-4-нитробензонитрила.

¹H-NMR(CDCl₃)δ: 8,03(1H, s), 7,86(1H, s), 7,75(1H, d, J=8,6Hz), 7,59(1H, dd, J=8,6, 2,0Hz).

MS(ESI m/z): 239,0(M+H)

RT (мин): 1,69

[0166] Синтез 6-бромбензофуран-2-карбонитрила

[0167] (1) Синтез 2-(5-бром-2-формилфенокси)ацетонитрила

N,N-диметилформамид (DMF) (5 мл), карбонат калия (1,2 г) и бромацетонитрил (460 мкл) добавляли в 4-бром-2-гидроксибензальдегид (1,1 г), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов. Дистиллированную воду и этилацетат добавляли в реакционный раствор, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→10/90→30/70) для того, чтобы получать 1,1 г указанного в заголовке соединения в виде масла бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 241,0(M+H)

RT (мин): 1,25

[0168] (2) Синтез 6-бромбензофуран-2-карбонитрила

DMF (10 мл) и карбонат калия (0,95 г) добавляли в 2-(5-бром-2-формилфенокси)ацетонитрил (1,1 г), который затем перемешивали при 100°C в течение 1 часа. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→10/90) для того, чтобы получать 1,1 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества бледно-желтого цвета.

¹H-NMR(CDCl₃)δ: 7,76(1H, s), 7,59-7,47(2H, m), 7,44(1H, s).

MS(ESI m/z): 223,0(M+H)

RT (мин): 1,64

[0169] Синтез 4-бром-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-3-карбонитрила

3,4-дигидропиран (0,98 мл) и трифторуксусную кислоту (47 мкл) добавляли в раствор 4-бром-1H-пиразол-3-карбонитрила (1,06 г) в THF (14 мл), который затем перемешивали при 60°C в течение 18 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и получаемый остаток растворяли в дихлорметане. Органический слой промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→13/87→25/75) для того, чтобы получать 1,30 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 256,8(M+H)

RT (мин): 1,44

[0170] Синтез трет-бутил (R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-йодпропаноата

Йод (7,29 г) добавляли в дихлорметановый раствор (50 мл) трифенилфосфина (PPh₃) (7,35 г) и имидазола (1,96 г) на ледяной бане, и затем температуру раствора поднимали до комнатной температуры, после чего следовало перемешивание в течение 1 часа. Затем дихлорметановый раствор (10 мл) трет-бутил (трет-бутоксикарбонил)-L-серината (Boc-Ser-OtBu) (5,0 г) добавляли туда по каплям на ледяной бане. Boc представляет трет-бутоксикарбонильную группу и tBu представляет т-бутил. После завершения добавления по каплям, температуру раствор поднимали до комнатной температуры, после чего следовало перемешивание в течение 16 часов. Нерастворимые вещества отфильтровали, растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→5/95) для того, чтобы получать 5,35 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 372,1(M+H)

RT (мин): 1,83

[0171] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата

[0172] DMF (2 мл) и йод (25 мг) добавляли в порошок цинка (116 мг), который затем перемешивали в течение 5 минут в атмосфере азота. После этого туда добавляли трет-бутил (R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-йодпропаноат (226 мг) и йод (25 мг), после чего следовало дополнительное перемешивание при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 30 минут. 6-бромхинолин-2-карбонитрил (185 мг), трис(дибензилиденацетон)дипалладий (0) (также обозначаемый как Pd₂(dba)₃) (13 мг), и 2-дициклогексилфосфино-2’,6’-диметоксибифенил (Sphos) (12 мг) добавляли в раствор, который затем перемешивали в течение 4 часов в атмосфере азота при 60°C. Нерастворимые вещества удаляли посредством фильтрования через целит, отгоняли растворительфильтрата и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→15/85) для того, чтобы получать 90 мг указанного в заголовке соединения в виде масла бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 398,2(M+H)

RT (мин): 1,72

[0173] Синтез соединений, представленных в таблице 2 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата.

[0174] [Таблица 2-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноат	398,2	1,72
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-цианохинолин-2-ил)пропаноат	398,1	1,70
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-3-ил)пропаноат	348,0	1,55
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианопиримидин-5-ил)пропаноат	349,0	1,57
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-цианопиразин-2-ил)пропаноат	349,0	1,58
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-цианопиридазин-3-ил)пропаноат	349,0	1,48
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-цианопиридин-2-ил)пропаноат	348,0	1,56

[Таблица 2-2]

	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианотиазол-4-ил)пропаноат	354,0	1,64
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропаноат	353,2	1,75
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-циано-5-метилпиридин-3-ил)пропаноат	362,1	1,62
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-циано-5-метоксипиридин-3-ил)пропаноат	378,1	1,58
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-циано-5-фторпиридин-3-ил)пропаноат	366,4	1,70
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианопиридин-2-ил)пропаноат	348,1	1,57
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-2-ил)пропаноат	348,1	1,60
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианопиридин-3-ил)пропаноат	348,1	1,57
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноат	354,1	1,60

[Таблица 2-3]

	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-цианофуран-3-ил)пропаноат	337,1	1,67
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианотиофен-3-ил)пропаноат	353,1	1,69
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензо[b]тиофен-6-ил)пропаноат	403,0	1,89
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензофуран-6-ил)пропаноат	387,1	1,86
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1H-индол-5-ил)пропаноат	386,1	1,71
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-циано-2-нитрофенил))пропаноат	392,0	1,72
	трет-бутил (S)-3-(5-амино-2-метоксифенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноат	367,1	1,13
	трет-бутил (S)-3-(4-амино-3-нитрофенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноат	382,0	1,64
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-гидрокси-4-нитрофенил)пропаноат	383,1	1,74

[0175] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензо[d]тиазол-6-ил)пропаноата

[0176] (1) Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-нитрофенил)пропаноата

(S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-нитрофенил)пропановую кислоту (Boc-Phe(pNO₂)-OH) (318 мг) растворяли в толуоле (10 мл), который затем нагревали до 80°C. В раствор добавляли по каплям N,N-диметилформамид-ди-трет-бутилацеталь (1,0 мл). После завершения добавления по каплям, реакционный раствор перемешивали при 80°C в течение 1 часа. Исчезновение сырья подтверждали посредством жидкостной хроматографии масс-спектрометрии (LC-MS), после чего следовало охлаждение до комнатной температуры. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→15/85) для того, чтобы получать 349 мг указанного в заголовке соединения в виде прозрачной жидкости.

MS(ESI m/z): 367,9(M+H)

RT (мин): 1,75

[0177] (2) Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-аминофенил)пропаноата

1,0 г восстановленного железа и хлорид аммония (300 мг) растворяли в этаноле (EtOH) (15 мл) и дистиллированной воде (15 мл), которые затем нагревали при 80°C в течение 20 минут. В раствор добавляли этаноловый раствор (5 мл) трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-нитрофенил)пропаноата (349 мг), после чего следовало перемешивание при 80°C в течение 1,5 часа. Нерастворимые вещества удаляли посредством фильтрования через целит, и фильтрат отгоняли при пониженном давлении. Дистиллированную воду и этилацетат добавляли в получаемый остаток, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния, и растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 327 мг указанного в заголовке соединения в виде масла коричневого цвета.

MS(ESI m/z): 337,0(M+H)

RT (мин): 1,20

[0178] (3) Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-амино-3-бромфенил)пропаноата

173 мг N-бромсукцинимида (NBS) добавляли в DMF раствор (10 мл) трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-аминофенил)пропаноата (300 мг), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→15/85→20/80) для того, чтобы получать 280 мг указанного в заголовке соединения в виде прозрачной жидкости.

MS(ESI m/z): 416,9(M+H)

RT (мин): 1,72

[0179] (4) Синтез трет-бутил (S,E)-3-(3-бром-4-((4-хлор-5H-1,2,3-дитиазол-5-илиден)амино)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата

170 мг соли Аппеля (хлорид 4,5-дихлор-1,2,3-дитиазолия) добавляли в дихлорметановый раствор (10 мл) трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-амино-3-бромфенил)пропаноата (280 мг), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 часа. В раствор добавляли 110 мкл пиридина (Py), после чего следовало дополнительное перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→10/90→15/85) для того, чтобы получать 280 мг указанного в заголовке соединения в виде масла желтого цвета.

MS(ESI m/z): 551,7(M+H)

RT (мин): 2,09

[0180] (5) Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензо[d]тиазол-6-ил)пропаноата

110 мг йодида меди (I) добавляли в пиридиновый раствор (5 мл) трет-бутил (S,E)-3-(3-бром-4-((4-хлор-5H-1,2,3-дитиазол-5-илиден)амино)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата (280 мг), после чего следовало микроволновое облучение (InitiatorTM, 100°C, 1,0 часа, 2,45 ГГц, от 0 до 240 Вт). В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→15/85) для того, чтобы получать 159 мг указанного в заголовке соединения в виде масла бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 403,9(M+H)

RT (мин): 1,82

[0181] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-6-метоксибензо[d]тиазол-5-ил)пропаноата

[0182] (1) Синтез трет-бутил (S)-3-(5-амино-4-бром-2-метоксифенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-амино-3-бромфенил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 446,0(M+H)

RT (мин): 1,73

[0183] (2) Синтез трет-бутил (S,Z)-3-(4-бром-5-((4-хлор-5H-1,2,3-дитиазол-5-илиден)амино)-2-метоксифенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S,E)-3-(3-бром-4-((4-хлор-5H-1,2,3-дитиазол-5-илиден)амино)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата).

MS(ESI m/z): 581,8(M+H)

RT (мин): 2,13

[0184] (3) Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-6-метоксибензо[d]тиазол-5-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензо[d]тиазол-6-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 434,0(M+H)

RT (мин): 1,84

[0185] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-индол-5-ил)пропаноата

5 мл DMF, 180 мг карбоната калия и 50 мкл метилметансульфоната (MeOMs) добавляли в 179 мг трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1H-индол-5-ил)пропаноата, который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→20/80) для того, чтобы получать 163 мг указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 400,1(M+H)

RT (мин): 1,85

[0186] Синтез смеси трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-6-ил)пропаноата и трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-5-ил)пропаноата

[0187] (1) Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3,4-диаминофенил)пропаноата

10 мл этанола и 10 мл дистиллированной воды добавляли к 110 мг восстановленного железа и 210 мг хлорида аммония, которые затем нагревали с обратным холодильником в течение 20 минут. После этого, туда добавляли этаноловый раствор (5 мл) трет-бутил (S)-3-(4-амино-3-нитрофенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата (150 мг), после чего следовало нагревание с обратным холодильником в течение 2 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через целит, а получаемый фильтрат отгоняли при пониженном давлении. Дистиллированную воду и этилацетат добавляли в получаемый остаток, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния, растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→30/70→60/40) для того, чтобы получать 81,2 мг указанного в заголовке соединения в виде масла коричневого цвета.

MS(ESI m/z): 352,1(M+H)

RT (мин): 1,10

[0188] (2) Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1H-бензо[d]имидазол-6-ил)пропаноата

5 мл пиридина и 58 мг соли Аппеля добавляли в 81 мг трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3,4-диаминофенил)пропаноата, который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего следовало микроволновое облучение (InitiatorTM, 150°C, 30 минут, 2,45 ГГц, от 0 до 240 Вт). Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→30/70→60/40) для того, чтобы получать 25,2 мг указанного в заголовке соединения в виде масла коричневого цвета.

MS(ESI m/z): 387,1(M+H)

RT (мин): 1,51

[0189] (3) Синтез смесь трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-6-ил)пропаноата и трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-5-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-индол-5-ил)пропаноата.

Ее продолжали до следующей стадии со смесью региоизомеров.

MS(ESI m/z): 401,1(M+H)

RT (мин): 1,62

[0190] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензо[d]оксазол-6-ил)пропаноата

[0191] (1) Синтез трет-бутил (S)-3-(4-амино-3-гидроксифенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3,4-диаминофенил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 353,3(M+H)

RT (мин): 1,11

[0192] (2) Синтез трет-бутил (S,Z)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-((4-хлор-5H-1,2,3-дитиазол-5-илиден)амино)-3-гидроксифенил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S,E)-3-(3-бром-4-((4-хлор-5H-1,2,3-дитиазол-5-илиден)амино)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата.

MS(ESI m/z): 488,3(M+H)

RT (мин): 1,97

[0193] (3) Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензо[d]оксазол-6-ил)пропаноата

4 мл толуола и 0,5 мл пиридина добавляли в 51 мг трет-бутил (S,Z)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-((4-хлор-5H-1,2,3-дитиазол-5-илиден)амино)-3-гидроксифенил)пропаноата, после чего следовало микроволновое облучение (InitiatorTM, 150°C, 30 минут, 2,45 ГГц, от 0 до 240 Вт). Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→5/95→10/90) для того, чтобы получать 22,2 мг указанного в заголовке соединения в виде масла желтого цвета.

MS(ESI m/z): 388,1(M+H)

RT (мин): 1,18

[0194] Синтез смеси трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-2-ил)пропаноата и трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-2-ил)пропаноата

[0195] (1) Синтез трет-бутил N⁴-(2-амино-5-цианофенил)-N²-(трет-бутоксикарбонил)-L-аспарагината

5 мл DMF и 120 мкл N-метилморфолина добавляли в 300 мг (S)-4-(трет-бутокси)-3-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-оксобутановой кислоты. На ледяной бане туда добавляли 135 мкл изобутилхлорформиата, после чего следовало перемешивание в течение 30 минут. После этого, туда добавляли 138 мг 3,4-диаминобензонитрила, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 18 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→50/50) для того, чтобы получать 321 мг указанного в заголовке соединения в виде масла коричневого цвета.

MS(ESI m/z): 405,1(M+H)

RT (мин): 1,39

[0196] (2) Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-циано-1H-бензо[d]имидазол-2-ил)пропаноата

5 мл уксусной кислоты (AcOH) добавляли в 321 мг трет-бутил N⁴-(2-амино-5-цианофенил)-N²-(трет-бутоксикарбонил)-L-аспарагината, который затем перемешивали при 60°C в течение 24 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→35/65) для того, чтобы получать 321 мг указанного в заголовке соединения в виде масла красного цвета.

MS(ESI m/z): 387,1(M+H)

RT (мин): 1,36

[0197] (3) Синтез смеси трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-2-ил)пропаноата и трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-2-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-индол-5-ил)пропаноата. Указанное в заголовке соединение получали в виде масла коричневого цвета.

Ее продолжали до следующей стадии со смесью региоизомеров.

MS(ESI m/z): 401,1(M+H)

RT (мин): 1,49

[0198] Синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата

5 мл трифторуксусной кислоты (TFA) добавляли в дихлорметановый раствор (1 мл) трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата (90 мг), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Растворитель отгоняли и туда добавляли 5 мл DMF, 2 мл N,N-диизопропилэтиламина (DIEA) и 80 мкл ди-трет-бутилдикарбоната (Boc₂O), после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 2 часов. После подтверждения исчезновения сырья туда добавляли 30 мкл бромацетонитрила, после чего следовало дополнительное перемешивание при комнатной температуре в течение 5 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→20/80→40/60) для того, чтобы получать 20,4 мг указанного в заголовке соединения в виде аморфного вещества белого цвета.

¹H-NMR(CDCl₃)δ: 8,29(1H, d, J=8,6Hz), 8,15(1H, d, J=8,6Hz), 7,77-7,63(3H, m), 5,04-4,93(1H, m), 4,89-4,64(3H, m), 3,47-3,21(2H, m), 1,41(9H, s).

MS(ESI m/z): 381,1(M+H)

RT (мин): 1,41

[0199] Синтез соединений, представленных в таблице 3 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата.

[0200] [Таблица 3-1]

R	Соединение	Наблюдаем. MS	RT/мин	1H-NMR
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензо[d]тиазол-6-ил)пропаноат	387,2	1,55
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноат	381,1	1,41
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-цианохинолин-2-ил)пропаноат	381,1	1,43

[Таблица 3-2]

	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-3-ил)пропаноат	331,0	1,24
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианопиримидин-5-ил)пропаноат	332,0	1,27
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-цианопиразин-2-ил)пропаноат	332,0	1,27
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-цианопиридазин-3-ил)пропаноат	332,0	1,18

[Таблица 3-3]

	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-цианопиридин-2-ил)пропаноат	331,0	1,26
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианотиазол-4-ил)пропаноат	336,9	1,33
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропаноат	336,0	1,40
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-циано-5-метилпиридин-3-ил)пропаноат	345,1	1,32

[Таблица 3-4]

	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-циано-5-метоксипиридин-3-ил)пропаноат	361,1	1,31
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-циано-5-фторпиридин-3-ил)пропаноат	349,0	1,37
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианопиридин-2-ил)пропаноат	331,0	1,27
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-2-ил)пропаноат	331,1	1,30

[Таблица 3-5]

	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианопиридин-3-ил)пропаноат	331,1	1,22
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноат	337,0	1,26
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-цианофуран-3-ил)пропаноат	320,0	1,37
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианотиофен-3-ил)пропаноат	336,0	1,39

[Таблица 3-6]

	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-6-метоксибензо[d]тиазол-5-ил)пропаноат	416,9	1,55
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензо[d]оксазол-6-ил)пропаноат	371,1	1,51

[Таблица 3-7]

	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-6-ил)пропаноат или Цианометил(S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-5-ил)пропаноат	384,1	1,33
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензо[b]тиофен-6-ил)пропаноат	386,0	1,57

[Таблица 3-8]

	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензофуран-6-ил)пропаноат	370,0	1,55
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-индол-5-ил)пропаноат	383,1	1,55

[Таблица 3-9]

	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(6-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-2-ил)пропаноат или Цианометил(S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-2-ил)пропаноат	384,1	1,25
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-циано-2-нитрофенил)пропаноат	375,0	1,43

[0201] Синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианофенил)пропаноата

0,9 мл N,N’-диизопропилэтиламина и 0,18 мл бромацетонитрила добавляли в DMF раствор (10 мл) Boc-4-циано-L-фенилаланина (Boc-Phe(4-CN)-OH) (0,5 г), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→40/60) для того, чтобы получать 599 мг твердое вещество белого цвета.

¹H-NMR(CDCl₃)δ: 7,63(2H, d, J=7,9Hz), 7,30(2H, d, J=7,9Hz), 4,99-4,89(1H, m), 4,89-4,61(3H, m), 3,24(1H, dd, J=13,9, 5,9Hz), 3,13-3,08(1H, m), 1,42(9H, s).

MS(ESI m/z): 330,0(M+H)

RT (мин): 1,39

[0202] Синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-цианопропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианофенил)пропаноата.

[0203] [Таблица 4]

R	Соединение	Наблюдаем. MS	RT/мин	1H-NMR
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианофенил)пропаноат	330. 0	1. 39
	Цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-цианопропаноат		2. 04

[0204] Синтез трет-бутил (трет-бутоксикарбонил)-L-аспарагината

815 мкл триэтиламина и 1,34 мл ди-трет-бутилдикарбоната (Boc₂O) добавляли в этилацетатный раствор (20 мл) сложного L-аспарагин-т-бутилового эфира (1,0 г), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 1,41 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 289,0

RT (мин): 1,10

[0205] Синтез трет-бутил (S)-4-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-тиоксобутаноата

1,03 г реактива Лоусона (2,4-бис(4-метоксифенил)-1,3-дитиа-2,4-дифосфетан 2,4-дисульфид) добавляли в THF раствор (20 мл) трет-бутил (трет-бутоксикарбонил)-L-аспарагината (1,41 г), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→30/70→40/60) для того, чтобы получать 1,39 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 305,0

RT (мин): 1,31

[0206] Синтез этил (S)-2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-карбоксилата

1,1 мл пиридина и 635 мкл этилбромпирувата добавляли в этаноловый раствор (20 мл) трет-бутил (S)-4-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-тиоксобутаноата (1,39 г), который затем нагревали с обратным холодильником в течение 3,5 часа. Туда добавляли еще 310 мкл бромпировиноградной кислоты, после чего следовало нагревание с обратным холодильником в течение 2 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и в остаток добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→20/80) для того, чтобы получать указанное в заголовке соединение (680 мг) в виде масла коричневого цвета.

MS(ESI m/z): 401,0

RT (мин): 1,62

[0207] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата

6,5 мл 25% водный аммиак добавляли в метаноловый раствор (5 мл) этил (S)-2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-карбоксилата (680 мг), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=30/70→40/60→80/20) для того, чтобы получать 473 мг указанного в заголовке соединения в виде прозрачного масла.

MS(ESI m/z): 372,0

RT (мин): 1,30

[0208] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноата

240 мкл триэтиламина добавляли в дихлорметановый раствор (5 мл) трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата (312 мг). 130 мкл трифторуксусного ангидрида добавляли туда по каплям на ледяной бане, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 14 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→10/90→20/80) для того, чтобы получать 193 мг указанного в заголовке соединения в виде прозрачного масла.

MS(ESI m/z): 354,0

RT (мин): 1,58

[0209] Синтез 4-бром-1-метил-1H-пиррол-2-карбонитрила

1,02 г NBS добавляли в DMF раствор (5 мл) 1-метил-1H-пиррол-2-карбонитрила (605 мг), который затем перемешивали в течение 5 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→5/95) для того, чтобы получать 405 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 186,0(M+H)

RT (мин): 1,26

[0210] Синтез метил (4-бромбензоил)-L-серината

20 мл дихлорметана и 1,51 мл триэтиламина добавляли в 0,84 г гидрохлорида метил-L-серинат. 1,19 г 4-бромбензоилхлорида добавляли туда по каплям на ледяной бане. После завершения добавления по каплям, реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и дистиллированную воду и этилацетат добавляли в остаток, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=50/50→100/0) для того, чтобы получать 1,49 г указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 303,8(M+H)

RT (мин): 0,98

[0211] Синтез метил 2-(4-бромфенил)оксазол-4-карбоксилата

15 мл THF и 1,41 г реактива Берджесса (метил N-(триэтиламмонийсульфонил)карбамат) добавляли в метил (4-бромбензоил)-L-серинат, который затем перемешивали при 80°C в течение 2 часов. После этого, растворитель отгоняли при пониженном давлении и дистиллированную воду и этилацетат добавляли в остаток, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и туда добавляли 15 мл дихлорметана, 1,51 мл бромтрихлорметана и 2,29 мл диазабициклоундецена, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и этилацетат добавляли в остаток, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→10/90→30/70) для того, чтобы получать 775 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 283,8(M+H)

RT (мин): 1,45

[0212] Синтез этил 1-(4-нитрофенил)-1H-имидазол-4-карбоксилата

1,3 г 1-фтор-4-нитробензола и 1,5 г карбоната калия добавляли в раствор 1,2 г этил 1H-имидазол-4-карбоксилата в 15 мл ацетонитрила, который затем перемешивали при 60°C в течение 17 часов. Дистиллированную воду и этилацетат добавляли в остаток, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, туда добавляли5 мл этилацетат и 30 мл гексана и отфильтровывали твердое вещество. Получаемое твердое вещество промывали гексаном для того, чтобы получать 977 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 262,9(M+H)

RT (мин): 1,10

[0213] Синтез этил 1-(4-аминофенил)-1H-имидазол-4-карбоксилата

18 мл этанола и 2 мл дистиллированной воды добавляли в 1,05 г восстановленного железа и 200 мг хлорида аммония, которые затем нагревали с обратным холодильником в течение 20 минут. После этого туда добавляли 970 мг этил 1-(4-нитрофенил)-1H-имидазол-4-карбоксилата, после чего следовало нагревание с обратным холодильником в течение 1 часа. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через целит, и получаемый фильтрат отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/метанол=100/0→95/5) для того, чтобы получать 819 мг указанного в заголовке соединения в виде масла желтого цвета.

MS(ESI m/z): 232,0(M+H)

RT (мин): 0,72

[0214] Синтез этил 1-(4-бромфенил)-1H-имидазол-4-карбоксилата

10 мл ацетонитрила и бромид меди 875 мг добавляли в 819 мг этил 1-(4-аминофенил)-1H-имидазол-4-карбоксилата. В раствор добавляли по каплям 1,1 мл т-бутилнитрита при комнатной температуре, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 4 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, туда добавляли 5 мл этилацетата и 30 мл гексана и отфильтровывали твердое вещество. Получаемое твердое вещество промывали гексаном для того, чтобы получать 746 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

MS(ESI m/z): 296,8(M+H)

RT (мин): 1,29

[0215] Синтез этил 6-бромимидазо[1,2-a]пиримидин-2-карбоксилата

30 мл этанола и 2,9 мл этил 3-бромпирувата добавляли в 2,0 г 2-амино-5-бромпиримидина, который затем нагревали с обратным холодильником в течение 6 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→15/85→30/70) для того, чтобы получать 804 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

MS(ESI m/z): 271,9(M+H)

RT (мин): 1,06

[0216] Синтез этил 6-бромимидазо[1,2-a]пиразин-2-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-бромимидазо[1,2-a]пиримидин-2-карбоксилата.

MS(ESI m/z): 271,9(M+H)

RT (мин): 0,92

[0217] Синтез этил 6-бромимидазо[1,2-b]пиридазин-2-карбоксилата.

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-бромимидазо[1,2-a]пиримидин-2-карбоксилата.

MS(ESI m/z): 271,9(M+H)

RT (мин): 1,09

[0218] Синтез 5-бром-1-метил-1H-индазол-3-карбонитрила

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-индол-5-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 237,9(M+H)

RT (мин): 1,48

[0219] Синтез 4-бром-1-метил-1H-пиразол-3-карбонитрила

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-циано-1-метил-1H-индол-5-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 187,0(M+H)

RT (мин): 1,10

[0220] Синтез этил 6-(3-бромфенил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-2-карбоксилата

495 мг (3-бромфенил)бороновой кислоты, 20 мл THF и 5,9 мл водного раствора карбоната натрия (1,0 моль/л) добавляли в 600 мг этил 6-бромпиразоло[1,5-a]пиримидин-2-карбоксилата, после чего следовало азотное замещение. 81,4 мг тетракис(трифенилфосфин)палладия (0) добавляли в раствор, который затем перемешивали при 80°C в течение 9 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и в остаток добавляли этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=10/90→30/70) для того, чтобы получать 622 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

MS(ESI m/z): 347,8(M+H)

RT (мин): 1,57

[0221] Синтез 6-(3-бромфенил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-2-карбоксамида

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 318,9(M+H)

RT (мин): 1,17

[0222] Синтез 6-(3-бромфенил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-2-карбонитрила

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 300,0(M+H)

RT (мин): 1,55

[0223] Синтез соединений, представленных в таблице 5 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропаноата, используя трет-бутил (R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-йодпропаноат в качестве сырья.

[0224] [Таблица 5-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианопиридин-3-ил)пропаноат	348,1	1,47
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-цианопиридин-2-ил)пропаноат	348,1	1,54
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-циано-2-фторфенил)пропаноат	365,0	1,73
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-циано-3-фторфенил)пропаноат	365,0	1,90
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-циано-3,5-дифторфенил)пропаноат	419,0	1,96
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-циано-1-метил-1H-индазол-5-ил)пропаноат	401,0	1,75
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-циано-1-метил-1H-пиразол-4-ил)пропаноат	351,2	1,58

[Таблица 5-2]

	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(7-цианобензо[c][1,2,5]тиадиазол-4-ил)пропаноат	405,0	1,71
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-(2-цианопиразоло[1,5-a]пиримидин-6-ил)фенил)пропаноат	464,2	1,80
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-циано-1-метил-1H-пиррол-3-ил)пропаноат	350,1	1,64
	метил (S)-2-(4-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)фенил)оксазол-4-карбоксилат	447,2	1,62
	этил (S)-1-(4-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)фенил)-1H-имидазол-4-карбоксилат	460,1	1,60
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиримидин-6-ил)пропаноат	435,0	1,51
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиразин-6-ил)пропаноат	435,0	1,43
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианоимидазо[1,2-b]пиридазин-6-ил)пропаноат	435,0	1,52
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиридин-6-ил)пропаноат	434,0	1,37

[0225] Синтез соединений, представленных в таблице 6 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата.

[0226] [Таблица 6-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин	1H-NMR
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианопиридин-3-ил)пропаноат	331,1	1,15
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-цианопиридин-2-ил)пропаноат	331,0	1,24
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-циано-2-фторфенил)пропаноат	348,0	1,42

[Таблица 6-2]

	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-циано-3-фторфенил)пропаноат	348,0	1,59
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-циано-3,5-дифторфенил)пропаноат	366,9	1,66
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-циано-1-метил-1H-индазол-5-ил)пропаноат	384,1	1,49
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-циано-1-метил-1H-пиразол-4-ил)пропаноат	334,1	1,27

[Таблица 6-3]

	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(7-цианобензо[c][1,2,5]тиадиазол-4-ил)пропаноат	388,0	1,42
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-(2-цианопиразоло[1,5-a]пиримидин-6-ил)фенил)пропаноат	447,1	1,54
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-цианоизоксазол-5-ил)пропаноат	321,1	1,21
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(5-циано-1-метил-1H-пиррол-3-ил)пропаноат	333,1	1,36

[0227] Синтез этил 6-(2-бромацетил)пиколината

3,1 мл бромводорода (30% раствор в уксусной кислоте) добавляли в 990 мг этил 6-ацетилпиколината. Затем, 300 мкл брома добавляли туда по каплям, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 9 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→20/80) для того, чтобы получать 1,49 г указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 273,8(M+H)

RT (мин): 1,29

[0228] Синтез метил 2-(2-бромацетил)тиазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-(2-бромацетил)пиколината.

MS(ESI m/z): 265,8(M+H)

RT (мин): 1,08

[0229] Синтез этил 2-(2-бромацетил)никотината

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-(2-бромацетил)пиколината.

MS(ESI m/z): 273,9(M+H)

RT (мин): 1,24

[0230] Синтез метил 6-ацетилникотината

20 мл толуола добавляли в 1,5 г метил 6-хлорникотината, после чего следовало азотное замещение. 3,65 мл трибутил (1-этоксивинил)олова и 308 мг дихлорбис(трифенилфосфин)палладия (II) добавляли в раствор, который затем перемешивали при 105°C в течение 5 часов и 40 минут в атмосфере азота. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и туда добавляли 10 мл метанола и 5 мл концентрированной соляной кислоты, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 16 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и 5 мл дистиллированной воды добавляли в остаток, после чего следовала нейтрализующая обработка насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия. Туда добавляли этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→40/60) для того, чтобы получать 927 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 180,0(M+H)

RT (мин): 0,97

[0231] Синтез метил 6-(2-бромацетил)никотината

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-(2-бромацетил)пиколината.

MS(ESI m/z): 259,0(M+H)

RT (мин): 1,26

[0232] Синтез этил 6-ацетилпиразоло[1,5-a]пиримидин-2-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез метил 6-ацетилникотината.

MS(ESI m/z): 234,0(M+H)

RT (мин): 0,95

[0233] Синтез этил 6-(2-бромацетил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-2-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-(2-бромацетил)пиколината.

MS(ESI m/z): 313,9(M+H)

RT (мин): 1,13

[0234] Синтез 3-бром-2,2-диметоксипропановой кислоты

10 мл триметилортоформиата и 400 мкл серной кислоты добавляли в 5,0 г 3-бромпировиноградной кислоты, которую затем перемешивали при комнатной температуре в течение 9 часов. 100 мл дихлорметана добавляли в реакционный раствор, который затем промывали с использованием 100 мл 10% водного раствора соляной кислоты. В водный слой добавляли этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 3,43 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 3,62(2H, s), 3,38(6H, s).

[0235] Синтез метил O-бензил-N-(3-бром-2,2-диметоксипропаноил)-L-серината

50 мл дихлорметана, 17 мл диизопропилэтиламина, 7,35 г HATU (1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиния 3-оксид гексафторфосфата), и 4,35 г O-метил O-бензил-L-серината гидрохлорида добавляли в 3,43 г 3-бром-2,2-диметоксипропановой кислоты, которую затем перемешивали при комнатной температуре в течение 7 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и в остаток добавляли водный раствор соляной кислоты (1 моль/л) и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали водным раствором соляной кислоты (1 моль/л), насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→40/60) для того, чтобы получать 5,77 г указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 405,9(M+H)

RT (мин): 1,46

[0236] Синтез метил (3-бром-2,2-диметоксипропаноил)-L-серината

30 мл метанола добавляли в 5,77 г метил O-бензил-N-(3-бром-2,2-диметоксипропаноил)-L-серината и реакцию осуществляли с помощью проточного реактора гидрогенизации (H-Cube, доступен в ThalesNano, Inc.) (10% гидроксид палладия/углерод, 40 бар, 60°C, 2,0 мл/мл). После завершения реакции растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 4,41 г указанного в заголовке соединения в виде масла желтого цвета.

MS(ESI m/z): 315,9(M+H)

RT (мин): 0,75

[0237] Синтез метил 2-(2-бром-1,1-диметоксиэтил)оксазол-4-карбоксилата

50 мл дихлорметана добавляли в 4,41 г метил (3-бром-2,2-диметоксипропаноил)-L-серината, который затем охлаждали до -78°C. 2,05 мл трифторид (диэтиламино)серы добавляли по каплям в раствор, который затем перемешивали при -78°C в течение 1 часа. После этого туда добавляли 3,75 г карбоната калия, после чего следовало перемешивание при -78°C в течение 1 часа и при комнатной температуре в течение 2 часов. После отфильтровывания нерастворимых веществ, фильтрат отгоняли при пониженном давлении и туда добавляли 50 мл дихлорметана и 4,2 мл диазабициклоундецена. На ледяной бане туда по каплям добавляли 3,72 мл бромтрихлорметана, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 4 часов и 30 минут. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и дистиллированную воду и этилацетат добавляли в остаток, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали водным раствором соляной кислоты (1 моль/л), насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=12/88→100/0) для того, чтобы получать 2,57 г указанного в заголовке соединения в виде масла желтого цвета.

MS(ESI m/z): 295,9(M+H)

RT (мин): 1,05

[0238] Синтез метил 2-(2-бромацетил)оксазол-4-карбоксилата

15 мл муравьиной кислоты добавляли в 2,57 г метил 2-(2-бром-1,1-диметоксиэтил)оксазол-4-карбоксилата и перемешивали при 60°C в течение 3 часов и 30 минут. Насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия добавляли в реакционный раствор, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→20/80→40/60) для того, чтобы получать 1,46 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 249,9(M+H)

RT (мин): 0,93

[0239] Синтез метил N-(2-(бензилокси)пропаноил)-O-(трет-бутил)-L-аллотреонината

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез метил O-бензил-N-(3-бром-2,2-диметоксипропаноил)-L-серината.

MS(ESI m/z): 352,2(M+H)

RT (мин): 1,66

[0240] Синтез метил (2-(бензилокси)пропаноил)-L-аллотреонината

10 мл TFA добавляли в 3,91 г метил N-(2-(бензилокси)пропаноил)-O-(трет-бутил)-L-аллотреонината, который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и в остаток добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=50/50→100/0) для того, чтобы получать 2,30 г указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 296,1(M+H)

RT (мин): 1,06

[0241] Синтез метил (2S)-2-(2-(бензилокси)пропанамид)-3-оксобутаноата

15 мл дихлорметана добавляли в 2,30 г метил (2-(бензилокси)пропаноил)-L-аллотреонината. На ледяной бане туда добавляли 4,29 г периодинана Десса-Мартина, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа. Нерастворимые вещества отфильтровали, растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→20/80→40/60) для того, чтобы получать 2,18 г указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 294,1(M+H)

RT (мин): 1,26

[0242] Синтез метил 2-(1-(бензилокси)этил)-5-метилоксазол-4-карбоксилата (DL01721-040)

20 мл дихлорметана и 4,14 мл триэтиламина добавляли в 2,18 г метил (2S)-2-(2-(бензилокси)пропанамид)-3-оксобутаноата. На ледяной бане туда добавляли 3,9 г трифенилфосфина и 3,77 г йода, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 3 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и в остаток добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой, водным раствором тиосульфата натрия (10%) и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→10/90→20/80) для того, чтобы получать 1,55 г указанного в заголовке соединения в виде масла желтого цвета.

MS(ESI m/z): 276,1(M+H)

RT (мин): 1,42

[0243] Синтез 2-(1-(бензилокси)этил)-5-метилоксазол-4-карбоксамида

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата

MS(ESI m/z): 261,1(M+H)

RT (мин): 1,21

[0244] Синтез 2-(1-(бензилокси)этил)-5-метилоксазол-4-карботиоамида

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-4-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-тиоксобутаноата.

MS(ESI m/z): 277,1(M+H)

RT (мин): 1,49

[0245] Синтез этил 2-(2-(1-(бензилокси)этил)-5-метилоксазол-4-ил)тиазол-4-карбоксилата

10 мл этанола и 335 мкл этилбромпирувата добавляли в 2-(1-(бензилокси)этил)-5-метилоксазол-4-карботиоамид, который затем нагревали с обратным холодильником в течение 2 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→15/85) для того, чтобы получать 650 мг указанного в заголовке соединения в виде масла коричневого цвета.

MS(ESI m/z): 373,1(M+H)

RT (мин): 1,79

[0246] Синтез этил 2-(2-(1-гидроксиэтил)-5-метилоксазол-4-ил)тиазол-4-карбоксилат

5 мл дихлорметана добавляли в 650 мг этил 2-(2-(1-(бензилокси)этил)-5-метилоксазол-4-ил)тиазол-4-карбоксилата. Туда по каплям добавляли 1,65 мл дихлорметанового раствора трибромида бора (1 моль/л) при -78°C, после чего следовало перемешивание при -78°C в течение 1 часа. После этого туда по каплям добавляли еще 1,65 мл дихлорметанового раствора трибромида бора (1 моль/л) при -78°C, после чего следовало перемешивание при -78°C в течение 1 часа. На ледяной бане туда добавляли дистиллированную воду, после чего следовало экстрагирование дихлорметаном. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→25/75→50/50) для того, чтобы получать 372 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 283,0(M+H)

RT (мин): 1,09

[0247] Синтез этил 2-(2-ацетил-5-метилоксазол-4-ил)тиазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез метил (2S)-2-(2-(бензилокси)пропанамидо)-3-оксобутаноата.

MS(ESI m/z): 281,0(M+H)

RT (мин): 1,32

[0248] Синтез этил 2-(2-(2-бромацетил)-5-метилоксазол-4-ил)тиазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-(2-бромацетил)пиколината.

MS(ESI m/z): 360,9(M+H)

RT (мин): 1,50

[0249] Синтез метил 2-(1-гидроксиэтил)-5-метилоксазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 2-(2-(1-гидроксиэтил)-5-метилоксазол-4-ил)тиазол-4-карбоксилата.

MS(ESI m/z): 186,1(M+H)

RT (мин): 0,69

[0250] Синтез метил 2-ацетил-5-метилоксазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез метил (2S)-2-(2-(бензилокси)пропанамидо)-3-оксобутаноата.

MS(ESI m/z): 184,1(M+H)

RT (мин): 0,81

[0251] Синтез метил 2-(2-бромацетил)-5-метилоксазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-(2-бромацетил)пиколината.

MS(ESI m/z): 263,0(M+H)

RT (мин): 1,08

[0252] Синтез 6-хлорпиридин-3-карботиоамида

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-4-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-тиоксобутаноата.

MS(ESI m/z): 173,0(M+H)

RT (мин): 0,85

[0253] Синтез этил 2-(6-хлорпиридин-3-ил)тиазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 2-(2-(1-(бензилокси)этил)-5-метилоксазол-4-ил)тиазол-4-карбоксилата.

MS(ESI m/z): 269,0(M+H)

RT (мин): 1,31

[0254] Синтез этил 2-(6-ацетилпиридин-3-ил)тиазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез метил 6-ацетилникотината.

MS(ESI m/z): 277,0(M+H)

RT (мин): 1,23

[0255] Синтез этил 2-(6-(2-бромацетил)пиридин-3-ил)тиазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-(2-бромацетил)пиколината.

MS(ESI m/z): 356,9(M+H)

RT (мин): 1,45

[0256] Синтез 6-хлорпиридин-2-карботиоамида

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-4-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-тиоксобутаноата.

MS(ESI m/z): 173,0(M+H)

RT (мин): 1,08

[0257] Синтез этил 2-(6-хлорпиридин-2-ил)тиазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 2-(2-(1-(бензилокси)этил)-5-метилоксазол-4-ил)тиазол-4-карбоксилата.

MS(ESI m/z): 269,0(M+H)

RT (мин): 1,51

[0258] Синтез этил 2-(6-ацетилпиридин-2-ил)тиазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез метил 6-ацетилникотината.

MS(ESI m/z): 277,0(M+H)

RT (мин): 1,41

[0259] Синтез этил 2-(6-(2-бромацетил)пиридин-2-ил)тиазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-(2-бромацетил)пиколината.

MS(ESI m/z): 356,9(M+H)

RT (мин): 1,54

[0260] Синтез метил (S)-2'-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)-[2,4'-битиазол]-4-карбоксилата

10 мл этанола и 342 мг метил 2-(2-бромацетил)тиазол-4-карбоксилата добавляли в 395 мг трет-бутил (S)-4-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-тиоксобутаноата, который затем нагревали с обратным холодильником в течение 1 часа. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и туда добавляли 10 мл диметилформамида, 1 мл диизопропилэтиламина и 360 мкл Boc₂O, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 5 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→20/80→40/60) для того, чтобы получать 489 мг указанного в заголовке соединения в виде масла бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 470,0(M+H)

RT (мин): 1,66

[0261] Синтез соединений, представленных в таблице 7 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез метил (S)-2'-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)-[2,4'-битиазол]-4-карбоксилата.

[0262] [Таблица 7-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	метил (S)-6-(2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-ил)никотинат	464,0	1,79
	этил (S)-6-(2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-ил)пиколинат	478,1	1,81
	метил (S)-2-(2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-ил)оксазол-4-карбоксилат	454,1	1,55
	метил (S)-2-(2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-ил)-5-метилоксазол-4-карбоксилат	468,1	1,62
	этил (S)-6-(2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-2-карбоксилат	518,1	1,74

[Таблица 7-2]

	этил (S)-2-(2-(2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-ил)-5-метилоксазол-4-ил)тиазол-4-карбоксилат	565,0	1,89
	этил (S)-2-(6-(2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-ил)пиридин-3-ил)тиазол-4-карбоксилат	561,1	1,89
	этил (S)-2-(6-(2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-ил)пиридин-2-ил)тиазол-4-карбоксилат	561,1	2,01

[0263] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамотиоилтиазол-2-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-4-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-тиоксобутаноата.

MS(ESI m/z): 388,0(M+H)

RT (мин): 1,52

[0264] Синтез соединений, представленных в таблице 8 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез метил (S)-2'-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)-[2,4'-битиазол]-4-карбоксилата, используя трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамотиоилтиазол-2-ил)пропаноат в качестве сырья.

[0265] [Таблица 8]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	этил (S)-2''-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)-[2,4':2',4''-тертиазол]-4-карбоксилат	553,9	1,84
	этил (S)-6-(2'-(3-трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)-[2,4'-битиазол]-4-ил)пиколинат	561,0	1,95
	этил (S)-2-(2'-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)-[2,4'-битиазол]-4-ил)никотинат	561,0	1,84

[0266] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоил-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 455,9(M+H)

RT (мин): 1,46

[0267] Синтез соединений, представленных в таблице 9 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата.

[0268] [Таблица 9-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-карбамоилоксазол-2-ил)фенил)пропаноат	432,9	1,48
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-карбамоил-1H-имидазол-1-ил)фенил)пропаноат	431,0	1,36
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-карбамоилимидазо[1,2-a]пиримидин-6-ил)пропаноат	406,1	1,14
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-карбамоилимидазо[1,2-a]пиразин-6-ил)пропаноат	406,1	1,19
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-карбамоилимидазо[1,2-b]пиридазин-6-ил)пропаноат	406,1	1,24
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-карбамоилимидазо[1,2-a]пиридин-6-ил)пропаноат	405,1	1,17

[Таблица 9-2]

	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(5-карбамоилпиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	449,1	1,38
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(6-карбамоилпиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	449,1	1,51
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-карбамоилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	439,1	1,33
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-карбамоил-5-метилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	453,1	1,43
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-карбамоилпиразоло[1,5-a]пиримидин-6-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	489,0	1,40
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-(4-карбамоилтиазол-2-ил)-5-метилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	536,1	1,55
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(5-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	532,1	1,58

[Таблица 9-3]

	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(6-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	5 3 2. 1	1,67
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоил-[2,4':2'4''-тертиазол]-2''-ил)пропаноат	5 3 8. 2	1,59
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(6-карбамоилпиридин-2-ил)-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноат	5 3 2. 0	1,65
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(3-карбамоилпиридин-2-ил)-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноат	5 3 2. 0	1,38

[0269] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-цианопиразоло[1,5-a]пиримидин-6-ил)тиазол-2-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 471,1(M+H)

RT (мин): 1,74

[0270] Синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-цианопиразоло[1,5-a]пиримидин-6-ил)тиазол-2-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 454,2(M+H)

RT (мин): 1,44

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 9,21(1H, s), 9,05(1H, s), 7,63(1H, s), 7,16(1H, s), 5,59(1H, d, J=8,6Hz), 4,97-4,68(3H, m), 3,78-3,57(2H, m), 1,46(9H, s).

[0271] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамотиоил[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-4-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-тиоксобутаноата.

MS(ESI m/z): 471,1(M+H)

RT (мин): 1,68

[0272] Синтез метил (S)-2'''-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)-[2,4':2',4'':2'',4'''-кватертиазол]-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез метил (S)-2'-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)-[2,4'-битиазол]-4-карбоксилата.

MS(ESI m/z): 636,7(M+H)

RT (мин): 1,99

[0273] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-карбамотиоилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-4-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-тиоксобутаноата.

MS(ESI m/z): 455,0(M+H)

RT (мин): 1,52

[0274] Синтез этил (S)-2-(2-(2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-ил)оксазол-4-ил)тиазол-4-карбоксилата

10 мл этанола и 25 мкл этилбромпирувата добавляли в 76 мг трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-карбамотиоилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноата, который затем перемешивали в течение 4 часов при нагреве с обратным холодильником. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, туда добавляли 10 мл THF, 40 мкл Boc₂O и 1 мл диизопропилэтиламина, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 18 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→20/80→40/60) для того, чтобы получать 43,8 мг указанного в заголовке соединения в виде масла бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 551,0(M+H)

RT (мин): 1,75

[0275] Синтез метил (S)-2-(2-(2-(2-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)тиазол-4-ил)оксазол-4-ил)тиазол-4-ил)оксазол-4-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез метил (S)-2'-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)-[2,4'-битиазол]-4-карбоксилата.

MS(ESI m/z): 604,0(M+H)

RT (мин): 1,69

[0276] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-(4-карбамоилтиазол-2-ил)оксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 522,1(M+H)

RT (мин): 1,47

[0277] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоил[2,4':2',4'':2'',4'''-кватертиазол]-2'''-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 621,9(M+H)

RT (мин): 1,76

[0278] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-(4-(4-карбамоилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)оксазол-2-ил)тиазол-2-ил) пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 589,0(M+H)

RT (мин): 1,49

[0279] Синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоил-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 438,0(M+H)

RT (мин): 1,21

[0280] Синтез соединений, представленных в таблице 10 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата.

[0281] [Таблица 10-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-карбамоилоксазол-2-ил)фенил)пропаноат	415,0	1,21
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-карбамоил-1H-имидазол-1-ил)фенил)пропаноат	414,3	1,08
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-карбамоилимидазо[1,2-a]пиримидин-6-ил)пропаноат	389,9	0,88
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-карбамоилимидазо[1,2-a]пиразин-6-ил)пропаноат	389,9	0,94
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-карбамоилимидазо[1,2-b]пиридазин-6-ил)пропаноат	389,9	0,98
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-карбамоилимидазо[1,2-a]пиридин-6-ил)пропаноат	388,1	0,89

[Таблица 10-2]

	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(5-карбамоилпиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	432,0	1,10
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(6-карбамоилпиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	432,0	1,22
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-карбамоилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	422,3	1,04
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-карбамоил-5-метилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	436,0	1,15
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-(4-карбамоилтиазол-2-ил)-5-метилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	519,0	1,27
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(5-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	515,0	1,29
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(6-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	515,0	1,38

[Таблица 10-3]

	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоил-[2,4':2',4''-тертиазол]-2''-ил)пропаноат	521,9	1,31
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-(4-карбамоилтиазол-2-ил)оксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	505,0	1,20
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(6-карбамоилпиридин-2-ил)-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноат	515,9	1,36
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(3-карбамоилпиридин-2-ил)-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноат	515,9	1,11
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоил-[2,4':2':4'':2'',4'''-кватертиазол]-2'''-ил)пропаноат	604,9	1,45
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-(4-(4-карбамоилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)оксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	572,9	1,23

[0282] Синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-циано-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 420,0(M+H)

RT (мин): 1,51

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,01(1H, s), 7,99(1H, s), 5,59-5,48(1H, m), 4,93-4,75(3H, m), 3,72-3,55(2H, m), 1,45(9H, s).

[0283] Синтез соединений, представленных в таблице 11 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноата.

[0284] [Таблица 11-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин	1H-NMR
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-цианооксазол-2-ил)фенил)пропаноат	397,9	1,50
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-циано-1H-имидазол-1-ил)фенил)пропаноат	396,0	1,32
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиримидин-6-ил)пропаноат	371,9	1,09

[Таблица 11-2]

	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиразин-6-ил)пропаноат	371,9	1,18
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианоимидазо[1,2-b]пиридазин-6-ил)пропаноат	371,9	1,23
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиридин-6-ил)пропаноат	370,1	1,20
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(5-цианопиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	414,0	1,45

[Таблица 11-3]

	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(6-цианопиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	414,0	1,49
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-цианооксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	404,0	1,32
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-циано-5-метилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	418,0	1,38

[Таблица 11-4]

	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-(4-цианотиазол-2-ил)-5-метилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	501,0	1,58
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(5-(4-цианотиазол-2-ил)пиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	497,3	1,53
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(6-(4-цианотиазол-2-ил)пиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	497,0	1,69

[Таблица 11-5]

	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-циано-[2,4':2',4''-тертиазол]-2''-ил)пропаноат	503,9	1,60
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-(4-цианотиазол-2-ил)оксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	487,0	1,45
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(6-цианопиридин-2-ил)-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноат	497,9	1,63

[Таблица 11-6]

	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(3-цианопиридин-2-ил)-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноат	497,9	1,52
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-циано-[2,4':2',4'':2'',4'''-кватертиазол]-2'''-ил)пропаноат	586,9	1,76
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-(4-(4-цианооксазол-2-ил)тиазол-2-ил)оксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	554,2	1,48

[0285] Синтез трет-бутил (S)-3-(4-(2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата.

5 мл DMF, 97,3 мг (((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)глицина, 100 мкл диизопропилэтиламина и 170 мг HATU (1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний 3-оксид гексафторфосфат) добавляли в 100 мг трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-аминофенил)пропаноата, который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→30/70→60/40) для того, чтобы получать 183 мг указанного в заголовке соединения в виде масла бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 616,0(M+H)

RT (мин): 1,91

[0286] Синтез соединений, представленных в таблице 12 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-3-(4-(2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)фенил)-2-(трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата.

[0287] [Таблица 12]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	трет-бутил (S)-3-(4-(2-(2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)ацетамидо)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноат	673,1	1,76
	трет-бутил (S)-3-(4-(1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6,9-триоксо-2-окса-4,7,10-триазидодекан-12-амидо)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноат	730,2	1,69

[0288] Синтез трет-бутил (S)-3-(4-(2-аминоацетамидо)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата

6 мл дихлорметана и 1,2 мл пиперидина добавляли в 183 мг трет-бутил (S)-3-(4-(2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата, который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и 30 минут. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (NH силикагель, метанол/этилацетат/гексан/= 0/50/50→0/100/0→20/80/0) для того, чтобы получать 117 мг указанного в заголовке соединения в виде масла бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 394,0(M+H)

RT (мин): 1,08

[0289] Синтез соединений, представленных в таблице 13 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-3-(4-(2-аминоацетамидо)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата.

[0290] [Таблица 13]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	трет-бутил (S)-3-(4-(2-(2-аминоацетамидо)ацетамидо)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноат	451,0	1,11
	трет-бутил (S)-3-(4-(2-(2-(2-аминоацетамидо)ацетамидо)ацетамидо)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноат	508,0	1,08

[0291] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)фенил)пропаноата

5 мл DMF, 300 мкл диизопропилэтиламина, 50 мг 5-цианотиофен-2-карбоновой кислоты и 170 мг HATU (1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний 3-оксид гексафторфосфат) добавляли в 117 мг трет-бутил (S)-3-(4-(2-аминоацетамидо)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноата, который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→30/70→60/40) для того, чтобы получать 120 мг указанного в заголовке соединения в виде масла бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 529,2(M+H)

RT (мин): 1,58

[0292] Синтез соединений, представленных в таблице 14 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)фенил)пропаноата.

[0293] [Таблица 14]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)ацетамидо)фенил)пропаноат	586,1	1,47
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)ацетамидо)ацетамидо)фенил)пропаноат	643,1	1,40

[0294] Синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)фенил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 512,2(M+H)

RT (мин): 1,34

¹H-NMR (DMSO-D₆) δ: 10,10(1H, s), 9,39-9,29(1H, m), 8,02(1H, d, J=4,0Hz), 7,93(1H, d, J=4,0Hz), 7,54-7,44(3H, m), 7,18(2H, d, J=8,6Hz), 5,00(2H, s), 4,27-4,15(1H, m), 4,15-4,02(2H, m), 3,02-2,78(2H, m), 1,33(9H, s).

[0295] Синтез соединений, представленных в таблице 15 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)фенил)пропаноата.

[0296] [Таблица 15]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин	1H-NMR
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)ацетамидо)фенил)пропаноат	569,9	1,23
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)ацетамидо)ацетамидо)фенил)пропаноат	626,0	1,27

[0297] Синтез 5-циано-N-(2-(2-(2-гидроксиэтокси)этокси)этил)тиофен-2-карбоксамида

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)фенил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 285,0(M+H)

RT (мин): 0,78

[0298] Синтез 5-циано-N-(2-(2-(2-(2-гидроксиэтокси)этокси)этокси)этил)тиофен-2-карбоксамида

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)фенил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 329,0(M+H)

RT (мин): 0,82

[0299] Синтез 5-циано-N-(12-гидроксидодецил)тиофен-2-карбоксамида

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)фенил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 337,1(M+H)

RT (мин): 1,54

[0300] Синтез 12-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)додецил 4-метилбензолсульфоната

380 мкл триэтиламина добавляли в раствор 5-циано-N-(12-гидроксидодецил)тиофен-2-карбоксамида (230 мг) в хлороформе (10 мл). На ледяной бане туда добавляли 195 мг пара-толуолсульфонилхлорида, после чего следовало перемешивание в течение 2 часов на ледяной бане. Туда дополнительно добавляли 380 мкл триэтиламина и 195 мг пара-толуолсульфонилхлорида, после чего следовало перемешивание в течение 3 часов на ледяной бане. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=5/95→15/85→30/70) для того, чтобы получать 267 мг указанного в заголовке соединения в виде масла желтого цвета.

MS(ESI m/z): 491,2(M+H)

RT (мин): 2,01

[0301] Синтез 2-(2-(2-(2-гидроксиэтокси)этокси)этокси)этил 4-метилбензолсульфоната

5 мл THF и водного раствора (5 мл) 1,92 г гидроксида натрия добавляли в 11 г 2,2'-((оксибис (этан-2,1-диил))бис(окси))бис(этан-1-ола). На ледяной бане туда по каплям добавляли THF раствор (10 мл) пара-толуолсульфонилхлорида (4,32 г). После завершения добавления по каплям, реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=50/50→100/0) для того, чтобы получать 1,30 г указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 349,0(M+H)

RT (мин): 1,08

[0302] Синтез 5-(2-(2-(2-(2-гидроксиэтокси)этокси)этокси)этокси)пиколинонитрила

10 мл ацетонитрила, 371 мг карбоната цезия и 82 мг 5-гидроксипиколинонитрила добавляли в 231 мг 2-(2-(2-(2-гидроксиэтокси)этокси)этокси)этил 4-метилбензолсульфоната, который затем перемешивали при 60°C в течение 5 часов и при 90°C в течение 3 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (NH силикагель, этилацетат/гексан=60/40→100/0) для того, чтобы получать 116 мг указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 297,1(M+H)

RT (мин): 0,80

[0303] Синтез N-(2-(2-(2-бромэтокси)этокси)этил)-5-цианотиофен-2-карбоксамида

312 мг трифенилфосфина и 396 мг тетрабромида углерода добавляли в дихлорметановый раствор (10 мл) 5-циано-N-(2-(2-(2-гидроксиэтокси)этокси)этил)тиофен-2-карбоксамида (233 мг) на ледяной бане. За этим следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 24 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=35/65→70/30) для того, чтобы получать 141 мг указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 348,9(M+H)

RT (мин): 1,14

[0304] Синтез соединений, представленных в таблице 16 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез N-(2-(2-(2-бромэтокси)этокси)этил)-5-цианотиофен-2-карбоксамида.

[0305] [Таблица 16]

Структура	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	N-(2-(2-(2-(2-бромэтокси)этокси)этокси)этил)-5-цианотиофен-2-карбоксамид	392,9	1,17
	5-(2-(2-(2-(2-бромэтокси)этокси)этокси)этокси)пиколинонитрил	360,0	1,19

[0306] Синтез трет-бутил (трет-бутоксикарбонил)-L-тирозината

50 мл дихлорметана, 6,2 мл триэтиламина и 6,1 мл Boc₂O добавляли в 5,19 г трет-бутил L-тирозината, который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и 30 минут. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и в остаток добавляли водный раствор соляной кислоты (1 моль/л) и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали водным раствором соляной кислоты (1 моль/л), насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→30/70) для того, чтобы получать 6,52 г указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 338,1(M+H)

RT (мин): 1,51

[0307] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)этокси)этокси)этокси)фенил)пропаноата

10 мг DMF, 151 мг карбоната калия и 141 мг N-(2-(2-(2-бромэтокси)этокси)этил)-5-цианотиофен-2-карбоксамида добавляли в 123 мг трет-бутил (трет-бутоксикарбонил)-L-тирозината, который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. В реакционный раствор добавляли дистиллированную воду и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали дистиллированной водой и насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=30/70→60/40) для того, чтобы получать 178 мг указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 604,1(M+H)

RT (мин): 1,72

[0308] Синтез соединений, представленных в таблице 17 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)этокси)этокси)этокси)фенил)пропаноата.

[0309] [Таблица 17]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-((1-(5-цианотиофен-2-ил)-1-оксо-5,8,11-триокса-2-азатридекан-13-ил)окси)фенил)пропаноат	648,1	1,72
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(2-(2-((6-цианопиридин-3-ил)окси)этокси)этокси)этокси)этокси)фенил)пропаноат	616,2	1,76
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-((12-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)додецил)окси)фенил)пропаноат	656,3	2,31

[0310] Синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)этокси)этокси)этокси)фенил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 587,0(M+H)

RT (мин): 1,47

¹H-NMR: (CDCl₃) δ: 7,46-7,42(2H, m), 7,06(2H, d, J=8,6Hz), 6,82(2H, d, J=8,6Hz), 4,98-4,54(4H, m), 4,13-4,08(2H, m), 3,89-3,84(2H, m), 3,76-3,61(9H, m), 3,06(2H, d, J=5,9Hz), 1,43(9H, s).

[0311] Синтез соединений, представленных в таблице 18 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)этокси) этокси)этокси)фенил)пропаноата.

[0312] [Таблица 18-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин	1H-NMR
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-((1-(5-цианотиофен-2-ил)-1-оксо-5,8,11-триокса-2-азатридекан-13-ил)окси)фенил)пропаноат	631,1	1,48

[Таблица 18-2]

	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(2-(2-((6-цианопиридин-3-ил)окси)этокси)этокси)этокси)этокси)фенил)пропаноат	599,1	1,51
	цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-((12-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)додецил)окси)фенил)пропаноат	639,2	2,09

[0313] Синтез трет-бутил (R)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-йодпропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-йодпропаноата. В настоящем описании, Fmoc представляет 9-флуоренилметилоксикарбонильную группу.

MS(ESI m/z): 494,0(M+H)

RT (мин): 2,02

[0314] Синтез аллил 2-(6-йодпиридин-2-ил)тиазол-4-карбоксилата

(1) Синтез аллил (R)-2-(6-йодпиридин-2-ил)-4,5-дигидротиазол-4-карбоксилата

Йодид натрия (12,3 г), триметилсилилхлорид (TMSCl) (3,5 мл и пропионитрил (30 мл) добавляли в 2-циано-6-бромпиридин (5,0 г), который затем перемешивали при 90°C в течение 2 часов. Водный раствор гидроксида натрия и этилацетат добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять операцию экстрагирования. Органический слой промывали водным раствором тиосульфата натрия и сушили над безводным сульфатом магния, а растворитель концентрировали при пониженном давлении. 3,63 г L-цистеина, метанол (20 мл) и дистиллированную воду (10 мл) добавляли в получаемый остаток, который затем перемешивали при 80°C в течение 3,5 часа. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, смешанный растворитель метанол/этилацетат добавляли в получаемый остаток и отфильтровывали твердое вещество. THF (100 мл) и оксалилхлорид (2,4 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, которое затем перемешивали в течение 45 минут. После этого, аллиловый спирт (3,4 мл) добавляли в реакционный раствор, который затем перемешивали в течение 4 часов. Насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и этилацетат добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять операцию экстрагирования. Органический слой сушили над безводным сульфатом магния и растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 3,2 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

MS(ESI m/z): 335,8(M+H)

RT (мин): 1,56

[0315] (2) Синтез аллил 2-(6-йодпиридин-2-ил)тиазол-4-карбоксилата

Бромтрихлорметан (5 мл) и диазабициклоундецен (DBU) (0,3 мл) добавляли в аллил (R)-2-(6-йодпиридин-2-ил)-4,5-дигидротиазол-4-карбоксилат (0,5 г), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Водный раствор лимонной кислоты и этилацетат добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять операцию экстрагирования. Органический слой сушили над безводным сульфатом магния и отгоняли растворитель при пониженном давлении для того, чтобы получать 0,31 г указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 372,4(M+H)

RT (мин): 1,67

[0316] Синтез трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропаноата

Йод (46 мг) добавляли в раствор порошка цинка (2,4 г) в DMF (2,6 мл), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут в атмосфере азота. Раствор трет-бутил (R)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-йодпропаноата (600 мг) в DMF (1,4 мл) и йод (46 мг) добавляли при комнатной температуре в реакционную смесь, которую затем перемешивали в течение 2 часов и 40 минут. 4-бром-2-цианотиофен (298 мг), 2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропил-1,1'-бифенил (29 мг) и трис(дибензилиденацетон)дипалладий (28 мг) добавляли при комнатной температуре в реакционную смесь, которую затем перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов в атмосфере азота и фильтровали через целит. Этилацетат добавляли в фильтрат, который затем промывали водным раствором тиосульфата натрия. Органический слой сушили над безводным сульфатом магния и концентрировали при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (н-гексан:этилацетат=90:10→30:70) для того, чтобы получать трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропаноат (127 мг).

MS(ESI m/z): 475,1(M+H)

RT (мин): 1,95

[0317] Синтез соединений, представленных в таблице 19 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропаноата.

[0318] [Таблица 19-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропаноат	475,1	1,95
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-цианопиридин-2-ил)пропаноат	470,1	1,85
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноат	520,1	1,98
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианопиридин-2-ил)пропаноат	470,1	1,85
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-циано-5-метоксипиридин-3-ил)пропаноат	500,1	1,85
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианопиримидин-5-ил)пропаноат	471,1	1,85

[Таблица 19-2]

	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианопиразин-2-ил)пропаноат	471,1	1,85
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиразин-2-ил)пропаноат	471,1	1,84
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-циано-1H-индол-5-ил)пропаноат	508,0	1,90
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-цианохинолин-7-ил)пропаноат	520,0	1,88
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианобензо[b]тиофен-6-ил)пропаноат	525,9	2,06
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианотиофен-3-ил)пропаноат	475,1	1,95
	трет-бутил (S)-2-((((9h-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-2-ил)пропаноат	475,1	1,95
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-2-ил)пропаноат	470,2	1,87

[Таблица 19-3]

	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-цианопиридин-3-ил)пропаноат	470,3	1,78
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианопиридин-3-ил)пропаноат	470,1	1,82
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианопиридин-3-ил)пропаноат	470,1	1,78
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианопиридин-4-ил)пропаноат	470,1	1,83
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-3-ил)пропаноат	470,1	1,83
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-циано-5-метилпиридин-3-ил)пропаноат	484,1	1,88
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-цианопиридин-2-ил)пропаноат	470,1	1,86
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиридазин-3-ил)пропаноат	471,2	1,75

[Таблица 19-4]

	трет-бутил (2S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-циано-1-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)пропаноат	543,3	1,99
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианобензо[b]тиофен-4-ил)пропаноат	525,2	2,08
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианотиазол-4-ил)пропаноат	476,9	1,88
	аллил (S)-2-(6-(2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)пиридин-2-ил)тиазол-4-карбоксилат	612,0	1,99

[0319] Синтез (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропановой кислоты

TFA (1,0 мл)) добавляли в трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропаноат (127 мг), после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 30 минут, и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (н-гексан:этилацетат=70: 30→0: 100) для того, чтобы получать 63 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

¹H-NMR (MeOD) δ: 7,78(2H, d, J=7,3Hz), 7,59(2H, d, J=7,3Hz), 7,53-7,24(6H, m), 4,53-4,43(1H, m), 4,36-4,11(3H, m), 3,25-2,93(2H, m).

MS(ESI m/z): 419,0(М+Н)

RT (мин): 1,55

[0320] Синтез соединений, представленных в таблице 20 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропановой кислоты.

[0321] [Таблица 20-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин	1H-NMR
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-цианопиридин-2-ил)пропановая кислота	414,1	1,44
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропановая кислота	464,1	1,56

[Таблица 20-2]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианопиридин-2-ил)пропановая кислота	414,1	1,43
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-циано-5-метоксипиридин-3-ил)пропановая кислота	444,1	1,46
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианопиримидин-5-ил)пропановая кислота	415,1	1,46

[Таблица 20-3]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианопиразин-2-ил)пропановая кислота	415,0	1,45
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиразин-2-ил)пропановая кислота	415,0	1,42
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-циано-1H-индол-5-ил)пропановая кислота	452,3	1,56

[Таблица 20-4]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-цианохинолин-7-ил)пропановая кислота	464,3	1,54
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианобензо[b]тиофен-6-ил)пропановая кислота	469,0	1,64
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианотиофен-3-ил)пропановая кислота	418,9	1,54
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-2-ил)пропановая кислота	418,9	1,54

[Таблица 20-5]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-2-ил)пропановая кислота	414,1	1,46
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-цианопиридин-3-ил)пропановая кислота	414,1	1,38
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианопиридин-3-ил)пропановая кислота	414,0	1,42

[Таблица 20-6]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианопиридин-3-ил)пропановая кислота	414,1	1,39
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианопиридин-4-ил)пропановая кислота	414,0	1,43
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-3-ил)пропановая кислота	414,0	1,43

[Таблица 20-7]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-циано-5-метилпиридин-3-ил)пропановая кислота	428,1	1,49
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-цианопиридин-2-ил)пропановая кислота	414,0	1,43
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиридазин-3-ил)пропановая кислота	415,1	1,37

[Таблица 20-8]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-циано-1H-пиразол-4-ил)пропановая кислота	403,1	1,31
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианобензо[b]тиофен-4-ил)пропановая кислота	469,1	1,70
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианотиазол-4-ил)пропановая кислота	420,8	1,48
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-(4-((аллилокси)карбонил)тиазол-2-ил)пиридин-2-ил)пропановая кислота	556,0	1,66

[0322] Синтез (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропановой кислоты

10 мл TFA добавляли в дихлорметановый раствор (2 мл) трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноата (193 мг), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и туда добавляли 10 мл DMF, 0,48 мл N,N-диизопропилэтиламина и 204 мг 9-флуоренилметил N-сукцинимидилкарбоната (Fmoc-OSu), после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 15 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=30/70→100/0) для того, чтобы получать 121 мг указанного в заголовке соединения в виде аморфного вещества бледно-желтого цвета.

¹H-NMR(CDCl₃) δ:7,78(2H, d, J=7,3Hz), 7,68-7,63(1H, m), 7,60-7,49(2H, m), 7,45-7,28(4H, m), 5,34-5,24(1H, m), 4,80-4,67(1H, m), 4,55-4,35(2H, m), 4,18(1H, t, J=6,9Hz), 3,42-3,21(2H, m).

MS(ESI m/z): 454,9(М+Н)

RT (мин): 1,62

[0323] Синтез трет-бутил (((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)-L-гомосерината

Триэтиламин (2,80 мл) добавляли в THF раствор (30 мл) (S)-3-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-4-(трет-бутокси)-4-оксобутановой кислоты (5,02 г). THF раствор (10 мл) этилхлорформиата (1,43 мл) добавляли туда по каплям на ледяной бане, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 35 минут. Нерастворимые вещества отфильтровали и добавляли 1,36 г борогидрида натрия понемногу в фильтрат, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа. 5 мл дистиллированной воды добавляли в реакционный раствор, в который затем добавляли водный раствор соляной кислоты (1 моль/л) и этилацетат, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 1,62 г указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 398,0(M+H)

RT (мин): 1,61

[0324] Синтез трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-4-йодбутаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (R)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-йодпропаноата.

MS(ESI m/z): 507,8(M+H)

RT (мин): 1,99

[0325] Синтез (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-циано-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропановой кислоты

2-хлоракрилонитрил (0,11 мл) добавляли при комнатной температуре в смешанный растворитель вода/ацетонитрил (= 5/2, 7 мл) для (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-азидопропановой кислоты (230 мг), после чего следовало перемешивание при 80°C в течение 21 часа. Этилацетат и насыщенный солевой раствор добавляли в реакционный раствор, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой сушили над безводным сульфатом магния и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Смешанный растворитель гексан/ацетон (15:1) добавляли в получаемый остаток и осуществляли перекристаллизацию при 50°C для того, чтобы получать указанное в заголовке соединение (145 мг) в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 403,9(M+H)

RT (мин): 1,41

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,87-7,78(2H, m), 7,65-7,55(2H, m), 7,49-7,41(3H, m), 7,40-7,31(2H, m), 5,44-5,38(1H, m), 5,03-4,62(3H, m), 4,56-4,50(1H, m), 4,23-4,19(2H, m).

[0326] Синтез трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-нитрофенил)пропаноата

4,5 мл трет-бутил 2,2,2-трихлорацетимидата добавляли при комнатной температуре в THF раствор (100 мл) (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-нитрофенил)пропановой кислоты (2,5 г), которую затем перемешивали при 70°C в течение 24 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→10/90→20/80) для того, чтобы получать указанное в заголовке соединение (3,65 г) в виде масла желтого цвета.

MS(ESI m/z): 489,1(M+H)

RT (мин): 1,96

[0327] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пент-4-еноата

Трет-бутил 2,2,2-трихлорацетимидат (4,6 г) добавляли по каплям в этилацетатный раствор (5,0 мл) (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пент-4-еновой кислоты (1,5 г), которую затем перемешивали при комнатной температуре в течение 22 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→30/70) для того, чтобы получать указанное в заголовке соединение (1,66 г) в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 270,1(M+H)

RT (мин): 1,59

[0328] Синтез этил (S)-5-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)изоксазол-3-карбоксилата

Триэтиламин (640 мкл) добавляли при 90°C в DMF раствор (21 мл) трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пент-4-еноата (1660 мг) и этил 2-хлор-2-(гидроксиимино)ацетата (2,8 г), после чего следовало перемешивание в течение 15 минут. Триэтиламин (640 мкл) добавляли при 90°C в реакционный раствор, который затем перемешивали в течение 15 минут. Туда добавляли триэтиламин (1278 мкл) при 90°C, после чего следовало перемешивание в течение 30 минут. В реакционный раствор добавляли этилацетат и насыщенный солевой раствор, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→25/75) для того, чтобы получать 818 мг указанного в заголовке соединения в виде масла желтого цвета.

MS(ESI m/z): (M+H) 385,0(М+Н)

RT (мин): 1,36

[0329] Синтез 5-бром-1-метил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-6-карбонитрила

Карбонат цезия (919 мг) и метилметансульфоната (115 мкл) добавляли в THF/ацетонитриловый раствор (= 2/1, 6 мл) 5-бром-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-6-карбонитрила (250 мг), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Этилацетат и водный раствор хлорида аммония добавляли в реакционный раствор, после чего следовало экстрагирование с этилацетатом. Органический слой сушили над сульфатом магния. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→50/50) для того, чтобы получать 151 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 235,6(M+H)

RT (мин): 1,58

[0330] Синтез этил 6-(3-бромфенил)имидазо[1,2-a]пиримидин-2-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-(3-бромфенил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-2-карбоксилата.

MS(ESI m/z): 347,0(M+H)

RT (мин): 1,45

[0331] Синтез соединений, представленных в таблице 21 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-(3-бромфенил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-2-карбоксилата.

[0332] [Таблица 21]

Структура	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	этил 6-(3-бромфенил)имидазо[1,2-a]пиразин-2-карбоксилат	347,0	1,45
	этил 6-(3-бромфенил)имидазо[1,2-b]пиридазин-2-карбоксилат	347,0	1,54

[0333] Синтез 1-(4-бромфенил)-1H-имидазол-4-карбоксамида

Метаноловый раствор аммиака (7 моль/л, 10 мл) добавляли в этил 1-(4-бромфенил)-1H-имидазол-4-карбоксилат (746 мг), после чего следовало микроволновое облучение (InitiatorTM, 110°C, 1,0 часа, 2,45 ГГц, от 0 до 240 Вт). Реакционный раствор дополнительно облучали микроволнами (InitiatorTM, 120°C, 4,0 часа, 2,45 ГГц, от 0 до 240 Вт). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 660 мг указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 268,0(M+H)

RT (мин): 0,98

[0334] Синтез 6-(3-бромфенил)имидазо[1,2-a]пиримидин-2-карбоксамида

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 318,9(M+H)

RT (мин): 1,00

[0335] Синтез соединений, представленных в таблице 22 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата.

[0336] [Таблица 22]

Структура	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	6-(3-бромфенил)имидазо[1,2-a]пиразин-2-карбоксамид	318,9	1,19
	6-(3-бромфенил)имидазо[1,2-b]пиридазин-2-карбоксамид	318,9	1,17
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-карбамоилизоксазол-5-ил)пропаноат	356,1	1,31

[0337] Синтез 6-(3-бромфенил)имидазо[1,2-a]пиримидин-2-карбонитрила

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 300,0(M+H)

RT (мин): 1,24

[0338] Синтез соединений, представленных в таблице 23 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноата.

[0339] [Таблица 23]

Структура	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	6-(3-бромфенил)имидазо[1,2-a]пиразин-2-карбонитрил	300,0	1,48
	6-(3-бромфенил)имидазо[1,2-b]пиридазин-2-карбонитрил	300,0	1,49
	1-(4-бромфенил)-1H-имидазол-4-карбонитрил	249,9	1,25
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-цианоизоксазол-5-ил)пропаноат	338,1	1,65

[0340] Синтез соединений, представленных в таблице 24 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропаноата.

[0341] [Таблица 24-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиримидин-6-ил)фенил)пропаноат	586,2	1,80
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиразин-6-ил)фенил)пропаноат	586,2	1,90
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-(2-цианоимидазо[1,2-b]пиридазин-6-ил)фенил)пропаноат	586,2	1,93
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-аминопиридин-2-ил)пропаноат	460,7	1,32
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-4-(5-цианотиофен-3-ил)бутаноат	489,1	1,94
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-циано-1-метил-1H-индазол-5-ил)пропаноат	522,9	1,97

[Таблица 24-2]

	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-циано-1-метил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)пропаноат	522,8	1,90
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-цианотиофен-2-ил)пропаноат	475,0	1,90
	трет-бутил 2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-(4-циано-1H-имидазол-1-ил)фенил)пропаноат	535,1	1,85
	трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-цианопиридин-4-ил)пропаноат	470,0	1,74

[0342] Синтез трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-аминофенил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3,4-диаминофенил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 459,1(M+H)

RT (мин): 1,55

[0343] Синтез трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-((аллилокси)карбонил)амино)фенил)пропаноата

Диизопропилэтиламин (3 мл) и аллил хлорформиат (722 мкл) добавляли в дихлорметановый раствор (50 мл) трет-бутил (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-аминофенил)пропаноата (2,83 г), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→20/80) для того, чтобы получать 2,52 г указанного в заголовке соединения в виде масла желтого цвета.

MS(ESI m/z): 543,1(M+H)

RT (мин): 1,93

[0344] Синтез соединений, представленных в таблице 25 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропановой кислоты.

[0345] [Таблица 25-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин	1H-NMR
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиримидин-6-ил)фенил)пропановая кислота	530,1	1,41

[Таблица 25-2]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиразин-6-ил)фенил)пропановая кислотая	530,1	1,51
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-(2-цианоимидазо[1,2-b]пиридазин-6-ил)фенил)пропановая кислота	530,1	1,53

[Таблица 25-3]

(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-(((аллилокси)карбонил)амино)фенил)пропановая кислота

487,0

1,56

[Таблица 25-4]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-4-(5-цианотиофен-3-ил)бутановая кислота	433,0	1,53
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-циано-1-метил-1H-индазол-5-ил)пропановая кислота	466,8	1,56

[Таблица 25-5]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-циано-1-метил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)пропановая кислота	466,8	1,53
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-цианотиофен-2-ил)пропановая кислота	418,1	1,47

[Таблица 25-6]

	(S)-2-((((9H-флуорен)ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-(4-циано-1H-имидазол-1-ил)фенил)пропановая кислота	479,1	1,43
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-цианопиридин-4-ил)пропановая кислота	414,0	1,35

[0346] Синтез этил (S)-5-(2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)имидазо[1,2-a]пиридин-2-карбоксилата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез этил 6-бромимидазо[1,2-a]пиримидин-2-карбоксилата.

MS(ESI m/z): 556,4(M+H)

RT (мин): 1,70

[0347] Синтез этил (S)-5-(3-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-оксопропил)имидазо[1,2-a]пиридин-2-карбоксилата

DMF (10 мл) и пиперидин (635 мкл) добавляли в этил (S)-5-(2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)имидазо[1,2-a]пиридин-2-карбоксилат (357 мг), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После подтверждения исчезновения сырья, туда добавляли диизопропилэтиламин (4 мл) и Boc₂O (3 мл), после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 3 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, этилацетат/гексан=0/100→50/50→100/0) для того, чтобы получать указанное в заголовке соединение (176 мг) в виде масла коричневого цвета.

MS(ESI m/z): 434,4(M+H)

RT (мин): 1,41

[0348] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-карбамоилимидазо[1,2-a]пиридин-5-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-карбамоилтиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 405,9(M+H)

RT (мин): 1,19

[0349] Синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-циано-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноата

Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноата.

MS(ESI m/z): 437,9(M+H)

RT (мин): 1,74

[0350] Синтез соединений, представленных в таблице 26 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-циано-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноата.

[0351] [Таблица 26]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-(4-цианооксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	421,0	1,60
	трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиридин-5-ил)пропаноат	387,0	1,52

[0352] Синтез (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-((1-(5-цианотиофен-2-ил)-1-оксо-5, 8,11-триокса-2-азатридекан-13-ил)окси)фенил)пропановой кислоты

Трифторуксусную кислоту (25 мл) добавляли в дихлорметановый раствор (5 мл) трет-бутил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-((1-(5-цианотиофен-2-ил)-1-оксо-5,8,11-триокса-2-азатридекан-13-ил)окси)фенил)пропаноата (891 мг), который затем перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и в остаток добавляли дихлорметан (10 мл), диизопропилэтиламин (3 мл) и N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонилокси]сукцинимид (464 мг), после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, метанол/этилацетат=0/100→30/70) для того, чтобы получать 921 мг указанного в заголовке соединения в виде масла бледно-желтого цвета.

MS(ESI m/z): 714,4(M+H)

RT (мин): 1,53

[0353] Синтез (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-(2-(2-(2-(2-((6-цианопиридин-3-ил)окси)этокси)этокси)этокси)этокси)фенил)пропановой кислоты

Синтез соединений, представленных в следующей таблице, осуществляли аналогичным образом, как синтез (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-((1-(5-цианотиофен-2-ил)-1-оксо-5,8,11-триокса-2-азатридекан-13-ил)окси)фенил)пропановой кислоты.

MS(ESI m/z): 682,2(M+H)

RT (мин): 1,58

[0354] Синтез соединений, представленных в таблице 27 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-((1-(5-цианотиофен-2-ил)-1-оксо-5,8,11-триокса-2-азатридекан-13-ил)окси)фенил)пропановой кислоты.

[0355] [Таблица 27-1]

R	Название соединения	Наблюдаем. MS	RT/мин	1H-NMR
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-циано-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропановой кислоты	503,2	1,52

[Таблица 27-2]

(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-(4-цианооксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропановая кислота

487,2

1,46

[Таблица 27-3]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиридин-5-ил)пропановая кислота	453,3	1,37
	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-((12-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)додецил)окси)фенил)пропановая кислота	722,2	2,13

[Таблица 27-4]

[Таблица 27-5]

	(S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(3-цианоизоксазол-5-ил)пропановая кислота	404,0	1,51

[0356] Синтез pdCpA аминокислоты-1

13,7 мкл DMF раствора (1,0 OD/мкл) pdCpA (производства Gene Act, Inc.) (динуклеотида, состоящего из дезоксицитидина и аденозина) добавляли в цианометил (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(2-цианобензо[d]тиазол-6-ил)пропаноат (1,15 мг), после чего следовало встряхивание с использованием вихревого смешивателя в течение 1 часа. OD обозначает оптическую плотность. После завершения реакции, реакционный раствор разводили 0,38% водным раствором муравьиной кислоты/раствором ацетонитрила (1/1) и очищали посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (Agilent 1260 Infinity Binary LC System, колонка: Agilent ZORBAX SB-C18 (9,4×50 мм), температура колонки: 40°C, условия градиента: H₂O (0,1% TFA)/ацетонитрил (0,1% TFA) = 90/10→0/100, скорость потока: 4,0 мл/мин, длина волны обнаружения: 254 нм). Растворитель из получаемого раствора целевого продукта отгоняли при пониженном давлении и в получаемый остаток добавляли 100 мкл TFA. После встряхивания при комнатной температуре в течение 1 часа, растворитель отгоняли при пониженном давлении для получения pdCpA аминокислоты-1. Идентификацию осуществляли посредством MALDI-TOF MS (производства Bruker Daltonics, Inc., ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF MS, матрица: α-циано-4-гидроксикоричная кислота).

MS(MALDI-TOF, m/z): 864,5(M-H)

[0357] Синтез pdCpA аминокислот со 2 до 29, представленных в таблице 28 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез pdCpA аминокислоты-1.

[0358] [Таблица 28-1]

№	R	Соединение	Наблюдаем. MS
pdCpA аминокислота-1		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианобензо[d]тиазол-6-ил)пропаноат	864,5
pdCpA аминокислота-2		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианохинолин-6-ил)пропаноат	858,5
pdCpA аминокислота-3		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(6-цианохинолин-2-ил)пропаноат	858,4

[Таблица 28-2]

pdCpA аминокислота-4		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(6-цианопиридин-3-ил)пропаноат	808,3
pdCpA аминокислота-5		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианопиримидин-5-ил)пропаноат	809,3
pdCpA аминокислота-6		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(5-цианопиразин-2-ил)пропаноат	809,2
pdCpA аминокислота-7		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(6-цианопиридазин-3-ил)пропаноат	809,2

[Таблица 28-3]

pdCpA аминокислота-8		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(5-цианопиридин-2-ил)пропаноат	808,2
pdCpA аминокислота-9		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианотиазол-4-ил)пропаноат	814,2
pdCpA аминокислота-10		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропаноат	813,2
pdCpA аминокислота-11		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(6-циано-5-метилпиридин-3-ил)пропаноат	822,1

[Таблица 28-4]

pdCpA аминокислота-12		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(6-циано-5-метоксипиридин-3-ил)пропаноат	838,2
pdCpA аминокислота-13		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(6-циано-5-фторпиридин-3-ил)пропаноат	826,1
pdCpA аминокислота-14		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-цианопиридин-2-ил)пропаноат	808,2
pdCpA аминокислота-15		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(6-цианопиридин-2-ил)пропаноат	808,1

[Таблица 28-5]

pdCpA аминокислота-16		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианопиридин-3-ил)пропаноат	808,3
pdCpA аминокислота-17		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-цианотиазол-2-ил)пропаноат	814,3
pdCpA аминокислота-18		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(5-цианофуран-3-ил)пропаноат	797,3
pdCpA аминокислота-19		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианотиофен-3-ил)пропаноат	813,1

[Таблица 28-6]

pdCpA аминокислота-20		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-циано-6-метоксибензо[d]тиазол-5-ил)пропаноат	8 9 4. 2
pdCpA аминокислота-21		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианобензо[d]оксазол-6-ил)пропаноат	8 4 8. 3

[Таблица 28-7]

pdCpA аминокислота-22		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-6-ил)пропаноат или (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-5-ил)пропаноат	861,1
pdCpA аминокислота-23		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианобензо[b]тиофен-6-ил)пропаноат	863,1
pdCpA аминокислота-24		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианобензофуран-6-ил)пропаноат	847,1

[Таблица 28-8]

pdCpA аминокислота-25		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-циано-1-метил-1H-индол-5-ил)пропаноат	860,2
pdCpA аминокислота-26		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(6-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-2-ил)пропаноат или (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(5-циано-1-метил-1H-бензо[d]имидазол-2-ил)пропаноат	861,2

[Таблица 28-9]

pdCpA аминокислота-27		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(5-циано-2-нитрофенил)пропаноат	852,1
pdCpA аминокислота-28		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-цианофенил)пропаноат	807,2
pdCpA аминокислота-29		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-цианопропаноат	731,2

[0359] Синтез pdCpA аминокислот, представленных в таблице 29 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез pdCpA аминокислоты-1.

[0360] [Таблица 29-1]

№	R	Соединение	Наблюдаем. MS
pdCpA аминокислота-30		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-цианопиридин-3-ил)пропаноат	808,2
pdCpA аминокислота-31		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(3-цианопиридин-2-ил)пропаноат	808,2

[Таблица 29-2]

pdCpA аминокислота-32		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(5-циано-2-фторфенил)пропаноат	825,1
pdCpA аминокислота-33		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-циано-3-фторфенил)пропаноат	825,3
pdCpA аминокислота-34		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-циано-3,5-дифторфенил)пропаноат	843,3

[Таблица 29-3]

pdCpA аминокислота-35		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(3-циано-1-метил-1H-индазол-5-ил)пропаноат	861,3
pdCpA аминокислота-36		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(3-циано-1-метил-1H-пиразол-4-ил)пропаноат	811,4
pdCpA аминокислота-37		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(7-цианобензо[c][1,2,5]тиадиазол-4-ил)пропаноат	865,2

[Таблица 29-4]

pdCpA аминокислота-38		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(3-(2-цианопиразоло[1,5-a]пиримидин-6-ил)фенил)пропаноат	924,2
pdCpA аминокислота-39		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(3-цианоизоксазол-5-ил)пропаноат	798,2
pdCpA аминокислота-40		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(5-циано-1-метил-1H-пиррол-3-ил)пропаноат	810,3

[Таблица 29-5]

pdCpA аминокислота-41		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(4-цианооксазол-2-ил)фенил)пропаноат	874,1
pdCpA аминокислота-42		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(4-циано-1H-индазол-1-ил)фенил)пропаноат	873,1
pdCpA аминокислота-43		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиримидин-6-ил)пропаноат	848,3

[Таблица 29-6]

pdCpA аминокислота-44		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиразин-6-ил)пропаноат	848,4
pdCpA аминокислота-45		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианоимидазо[1,2-b]пиридазин-6-ил)пропаноаталее, вленных елевого вляли влениить оти а типов	848,3
pdCpA аминокислота-46		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(2-цианоимидазо[1,2-a]пиридин-6-ил)пропаноат	847,3

[Таблица 29-7]

pdCpA аминокислота-47		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(5-цианопиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	891,1
pdCpA аминокислота-4 8		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(6-цианопиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	891,2
pdCpA аминокислота-49		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-циано-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноат	897,3

[Таблица 29-8]

pdCpA аминокислота-50		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(4-цианооксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	881,2
pdCpA аминокислота-51		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(4-циано-5-метилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	895,2
pdCpA аминокислота-52		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(2-цианопиразоло[1,5-a]пиримидин-6-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	931,2

[Таблица 29-9]

pdCpA аминокислота-53		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(4-(4-цианотиазол-2-ил)-5-метилоксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	978,2
pdCpA аминокислота-54		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(5-(4-цианотиазол-2-ил)пиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	974,1
pdCpA аминокислота-55		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(6-(4-цианотиазол-2-ил)пиридин-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	974,2

[Таблица 29-10]

pdCpA аминокислота-56		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-циано-[2,4':2',4''-тертиазол]-2''-ил)пропаноат	980,3
pdCpA аминокислота-57		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(4-(4-цианотиазол-2-ил)оксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	964,1
pdCpA аминокислота-58		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(6-цианопиридин-2-ил)-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноат	974,4

[Таблица 29-11]

pdCpA аминокислота-59		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(3-цианопиридин-2-ил)-[2,4'-битиазол]-2'-ил)пропаноат	974,4
pdCpA аминокислота-60		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-циано-[2,4':2',4'':2'',4'''-кватертиазол]-2'''-ил)пропаноат	1063,1
pdCpA аминокислота-61		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(4-(4-(4-цианооксазол-2-ил)тиазол-2-ил)оксазол-2-ил)тиазол-2-ил)пропаноат	1031,1

[Таблица 29-12]

pdCpA аминокислота-62		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(2-(5-cyaтиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)фенил)пропаноат	989,4
pdCpA аминокислота-63		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)ацетамидо)фенил)пропаноат	1046,5
pdCpA аминокислота-64		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(2-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)ацетамидо)ацетамидо)ацетамидо)фенил)пропаноат	1103,5

[Таблица 29-13]

pdCpA аминокислота-65		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(2-(2-(2-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)этокси)этокси)этокси)фенил)пропаноат	1064,2
pdCpA аминокислота-66		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-((1-(5-цианотиофен-2-ил)-1-оксо-5,8,11-триокса-2-азатридекан-13-ил)окси)фенил)пропаноат	1108,2

[Таблица 29-14]

pdCpA аминокислота-67		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-(2-(2-(2-(2-((6-цианопиридин-3-ил)окси)этокси)этокси)этокси)этокси)фенил)пропаноат	1076,3
pdCpA аминокислота-68		(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1(2H)-ил)-2-((фосфонокси)метил)тетрагидрофуран-3-ил)окси)(гидрокси)фосфорил)окси)метил)-5-(6-амино-9H-пурин-9-ил)-4-гидрокситетрагидрофуран-3-ил (2S)-2-амино-3-(4-((12-(5-цианотиофен-2-карбоксамидо)додецил)окси)фенил)пропаноат	1116,3

[0361] Вся вода, используемая в последующих экспериментах с использованием ДНК и РНК, представляет собой Nuclease-free Water производства QIAGEN GmbH.

[0362] Синтез мРНК

Все от мРНК-1 до мРНК-13, используемых для бесклеточного трансляционного синтеза, синтезировали в соответствии со следующим способом.

Двухцепочечную ДНК, имеющую промотор T7 и последовательность оснований, с которыми рибосома связывается выше по направлению считывания от открытой рамки считывания, амплифицировали с помощью ПЦР для того, чтобы конструировать ген матричной ДНК из мРНК (матричная ДНК с 1 до 13, приведенная в таблице далее). Сконструированный таким образом ген матричной ДНК очищали с использованием QIAquick PCR Purification Kit (производства QIAGEN GmbH).

[0363] Затем мРНК синтезировали посредством реакции транскрипции. Получали раствор, имеющий следующую композицию раствора 1, и проводили реакцию при 37°C в течение 6 часов. Туда добавляли 100 мкл 5 M ацетата аммония, после чего следовало мягкое смешивание и пребывание на льду в течение 20 минут. После центрифугирования смеси на 13200 об./мин и при 4°C в течение 20 минут, удаляли супернатант и растворяли преципитат в 200 мкл 1×TE буфера (10 ммоль/л Tris-HCl (pH 8,0), 1 ммоль/л EDTA (pH 8,0)). Здесь Tris представляет трисгидроксиметиламинометан, а EDTA представляет этилендиаминтетрауксусную кислоту. Туда добавляли равный объем фенола/хлороформа=1/1 (насыщенного 1×TE), после чего следовало перемешивание и центрифугирование. Верхний слой извлекали и туда добавляли равный объем хлороформа, после чего следовало перемешивание и центрифугирование. Верхний слой извлекали и туда добавляли 20 мкл ацетата калия 3 моль/л pH 4,5 и 600 мкл этанола, после чего следовало мягкое смешивание и пребывание при -80°C в течение 30 минут. После центрифугирования на 13200 об./мин и при 4°C в течение 30 минут, удаляли супернатант, туда добавляли 200 мкл 70% холодного этанола, который хранили при -30°C, после чего следовало центрифугирование на 13200 об./мин и при 4°C в течение 5 с. Супернатант удаляли, после чего следовала сушка при пониженном давлении. Концентрацию мРНК определяли с использованием спектрофотометра и мРНК растворяли в воде до концентрации 16 мкмоль/л.

[0364] Композиция раствора 1

10× буфер (400 ммоль/л Tris-HCl (pH 8,0), 500 ммоль/л NaCl, 80 ммоль/л MgCl₂, 50 ммоль/л дитиотреитола (DTT): 10 мкл

25 ммоль/л NTP (смесь нуклеозидтрифосфатов): 16 мкл

100 ммоль/л спермидина: 2 мкл

0,1% бычий сывороточный альбумин (BSA): 1 мкл

Ингибитор рибонуклеаз (40 Ед/мкл, производства Takara Bio Inc.): 1 мкл

Неорганическая пирофосфатаза (0,5 Ед/мкл, производства Sigma-Aldrich LLC): 1 мкл

РНК полимераза Thermo T7 (50 Ед/мкл; производства Toyobo Co., Ltd.): 4 мкл

Ген матричной ДНК для мРНК (100 нг/мкл): 20 мкл

Вода: 45 мкл

[0365] «Список последовательностей»

[Таблица 30]

[0366] Все последовательности с матричной ДНК-1 до матричной ДНК-13 приведены в SEQ ID №№ с 1 до 13 в «списке последовательностей», соответственно.

мРНК, синтезируемую из матричной ДНК-1, определяли как мРНК-1, и далее, с мРНК-2 до 13 определяли аналогичным образом.

[0367] Синтез амбер-супрессорной тРНК (-CA)

Ген тРНК (-CA) конструировали с помощью ПЦР амплификации тРНК, в которой динуклеотид CA на 3’-конце удален, с помощью полученного из Mycoplasma capricolum варианта триптофановой тРНК, описанного в WO 07/055429A, и очищали с использованием MinElute PCR Purification Kit (производства QIAGEN GmbH).

Затем тРНК (-CA) синтезировали посредством реакции транскрипции. Получали раствор, имеющий следующую композицию раствора 2, и проводили реакцию при 37°C в течение 12 часов. тРНК (-CA) очищали с помощью RNeasy MinElute Cleanup Kit (производства QIAGEN GmbH) и растворяли в воде до концентрации 200 мкмоль/л.

[0368] Композиция раствора 2

10× буфер для транскрипции (400 ммоль/л Tris-HCl (pH 8,0), 200 ммоль/л MgCl₂, 50 ммоль/л DTT): 10 мкл

25 ммоль/л NTP: 16 мкл

100 ммоль/л GMP: 20 мкл

100 ммоль/л спермидина: 2 мкл

0,1% BSA: 1 мкл

Ингибитор рибонуклеаз (40 Ед/мкл, производства Takara Bio Inc.): 1 мкл

Неорганическая пирофосфатаза (0,5 Ед/мкл, производства Sigma-Aldrich LLC): 1 мкл

РНК полимераза T7 (50 Ед/мкл; производства New England Biolabs, Inc.): 8 мкл

Ген тРНК (-CA) (100 нг/мкл): 41 мкл

[0369] Синтез аминоацил-тРНК-1 (последовательность оснований РНК части представлена в SEQ ID № 14 «списка последовательностей»)

[0370] Раствор, имеющий следующую композицию раствора 3, получали в 1,5 мл пробирке для образцов и оставляли стоять при 4°C в течение 2 часов. После этого 26,7 мкл 0,6 моль/л водного раствора ацетата калия (pH 4,5) и 160 мкл этанола добавляли в реакционный раствор, который затем оставляли стоять при -80°C в течение 30 минут. За этим следовало центрифугирование (4°C, 13200 об./мин) в течение 30 минут для того, чтобы удалять супернатант. Туда аккуратно добавляли 200 мкл 70% водного раствора этанола, после чего следовало центрифугирование (4°C, 13200 об./мин) в течение 1 минуты. Супернатант снова удаляли, после чего следовала сушка при пониженном давлении для получения аминоацил-тРНК-1. Получаемую аминоацил-тРНК растворяли в 1 ммоль/л водном растворе ацетата калия непосредственно перед его добавлением в смесь для трансляции.

[0371] Композиция раствора 3

Вода: 14 мкл

5× буфер для легирования (275 ммоль/л HEPES-Na pH 7,5, 75 ммоль/л MgCl₂, 16,5 ммоль/л DTT, 5 ммоль/л АТФ): 5,34 мкл

0,1% BSA: 0,54 мкл

DMSO раствор pdCpA аминокислоты-1 (0,73 ммоль/л): 2,66 мкл

Водный раствор амбер-супрессорной тРНК (-CA) (200 мкмоль/л): 3,34 мкл

Раствор РНК лигазы T4 (производства Takara Bio Inc., 40 U/мкл): 0,80 мкл

Здесь HEPES обозначает 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновую кислоту, а DMSO обозначает диметилсульфоксид.

[0372] Синтез аминоацил-тРНК с 2 до 68, представленных в таблицах 31 и 32 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез аминоацил-тРНК-1.

[0373] [Таблица 31-1]

Аминоацил-тРНК №	R
Аминоацил-тРНК-1
Аминоацил-тРНК-2
Аминоацил-тРНК-3
Аминоацил-тРНК-4
Аминоацил-тРНК-5
Аминоацил-тРНК-6
Аминоацил-тРНК-7
Аминоацил-тРНК-8
Аминоацил-тРНК-9
Аминоацил-тРНК-10
Аминоацил-тРНК-11
Аминоацил-тРНК-12

[Таблица 31-2]

Аминоацил-тРНК-13
Аминоацил-тРНК-14
Аминоацил-тРНК-15
Аминоацил-тРНК-16
Аминоацил-тРНК-17
Аминоацил-тРНК-18
Аминоацил-тРНК-19
Аминоацил-тРНК-20
Аминоацил-тРНК-21
Аминоацил-тРНК-22
Аминоацил-тРНК-23
Аминоацил-тРНК-24
Аминоацил-тРНК-25

[Таблица 31-3]

Аминоацил-тРНК-26
Аминоацил-тРНК-27
Аминоацил-тРНК-28
Аминоацил-тРНК-29

[0374] [Таблица 32-1]

Аминоацил-тРНК Nо.	R
Аминоацил-тРНК-30
Аминоацил-тРНК-31
Аминоацил-тРНК-32
Аминоацил-тРНК-33
Аминоацил-тРНК-34
Аминоацил-тРНК-35
Аминоацил-тРНК-36
Аминоацил-тРНК-37
Аминоацил-тРНК-38

[Таблица 32-2]

Аминоацил-тРНК-39
Аминоацил-тРНК-40
Аминоацил-тРНК-41
Аминоацил-тРНК-42
Аминоацил-тРНК-43
Аминоацил-тРНК-44
Аминоацил-тРНК-45
Аминоацил-тРНК-46
Аминоацил-тРНК-47
Аминоацил-тРНК-48
Аминоацил-тРНК-49
Аминоацил-тРНК-50
Аминоацил-тРНК-51

[Таблица 32-3]

Аминоацил-тРНК-52
Аминоацил-тРНК-53
Аминоацил-тРНК-54
Аминоацил-тРНК-55
Аминоацил-тРНК-56
Аминоацил-тРНК-57
Аминоацил-тРНК-58
Аминоацил-тРНК-59
Аминоацил-тРНК-60
Аминоацил-тРНК-61
Аминоацил-тРНК-62
Аминоацил-тРНК-63
Аминоацил-тРНК-64

[Таблица 32-4]

Аминоацил-тРНК-65
Аминоацил-тРНК-66
Аминоацил-тРНК-67
Аминоацил-тРНК-68

[0375] Бесклеточный трансляционный синтез линейного пептида со встроенными не природными аминокислотами и синтез циклического пептида, представленного формулой (1)

В качестве MALDI-TOF MS в этом разделе использовали ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF MS (производства Bruker Daltonics, Inc.). В качестве матрицы использовали α-циано-4-гидроксикоричную кислоту.

[0376] Синтез циклического пептида 1-1

[0377] Раствор, имеющий следующую композицию раствора 4, получали в 1,5 мл пробирке для образцов и инкубировали при 37°C в течение 1,5 часа. 31 мкл буфера для промывания (композиция: 20 ммоль/л фосфатного буфера (pH 7,5), 500 ммоль/л NaCl, 5 мМ имидазола) и 10 мкл раствора магнитных бус (производства MBL Life Science, Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarose) добавляли в реакционный раствор, который затем встряхивали с использованием вихревого смешивателя в течение 30 минут при комнатной температуре. За этим следовало центрифугирование для того, чтобы удалять раствор супернатанта. Операцию промывания получаемых магнитных бус (добавление 200 мкл буфера для промывания → встряхивание с использованием вихревого смешивателя → центрифугирование → удаление супернатанта) повторяли три раза. 10 мкл 2% водного раствора муравьиной кислоты добавляли в получаемых магнитные бусы, которые затем встряхивали с использованием вихревого смешивателя в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого, магнитные бусы осаждали посредством центрифугирования, и супернатант извлекали для того, чтобы получать циклический пептид 1-1. Идентификацию получаемого пептида осуществляли посредством MALDI-TOF MS.

MS(MALDI-TOF, m/z): 2382,0(M+H)

[0378] Композиция раствора 4

Вода: 2 мкл

Водный раствор мРНК-1 (0,02 OD/мкл): 1 мкл

Водный раствор аминоацил-тРНК-1 (0,2 OD/мкл): 1 мкл

Водный раствор аминокислот (смесь 19 аминокислот3, отличных от Met, 0,3 ммоль/л каждая): 1,5 мкл

PUREfrex (зарегистрированный товарный знак) спец. вер. 2 (PFC-Z1802, производства GeneFrontier Corporation)

Раствор I: 4 мкл

Раствор II: 0,5 мкл

Раствор III: 1 мкл

[0379] Синтез циклических пептидов 1 с 2 до 27, представленных в таблице 33 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинации мРНК и аминоацил-тРНК, представленных в таблице 33.

[0380] [Таблица 33-1]

№ циклического пептида	№ мРНК	№ аминоацил-тРНК	№ линкера	Наблюдаем. MS
1-1	мРНК-1	1		2382,0
1-2		2		2376,0
1-3		3		2376,2
1-4		4		2326,1
1-5		5		2327,0
1-6	6		2327,0

[Таблица 33-2]

1-7		7		2327,1
1-8		8		2326,1
1-9		9		2332,0
1-10		10		2331,1
1-11		11		2340,1
1-12		12		2356,0
1-13		13		2344,0
1-14		14		2326,2
1-15		15		2326,0
1-16		16		2326,0
1-17		17		2332,0
1-18	18		2315,1

[Таблица 33-3]

1-19		19		2330,9
1-20		20		2412,2
1-21		21		2366,0
1-22		22		2379,4
1-23		23		2381,3
1-24		24		2365,3
1-25		25		2378,4
1-26		26		2379,0
1-27	27		2370,0

[0381] Синтез циклических пептидов, представленных в таблице 34 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинации мРНК и аминоацил-тРНК, представленных в таблице 34.

[0382] [Таблица 34-1]

№ циклического пептида	№ мРНК	№ аминоацил-тРНК	№ линкера	Наблюдаем. MS
A-1	мРНК-1	30		2326,3
A-2		31		2326,3
A-3		32		2343,0
A-4		33		2343,1
A-5	34		2361,0

[Таблица 34-2]

A-6		35		2379,1
A-7		36		2329,1
A-8		37		2383,2
A-9		38		2442,3
A-10		39		2316,2
A-11		40		2328,0
A-12		41		2391,8
A-13		42		2390,9
A-14		43		2366,1
A-15	44		2366,1

[Таблица 34-3]

A-16		45		2366,2
A-17		46		2365,1
A-18		47		2409,0
A-19		48		2409,2
A-20		49		2414,8
A-21		50		2399,1
A-22		51		2413,2
A-23	52		2449,2

[Таблица 34-4]

A-24		53		2496,2
A-25		54		2491,9
A-26		55		2492,1
A-27		56		2497,9
A-27	57		2482,2

[Таблица 34-5]

A-28		58		2492,1
A-29		59		2492,1
A-30		60		2581,1
A-31		61		2549,3
A-32		62		2507,1
A-33		63		2564,2
A-34		64		2621,2
A-35	65		2582,1

[Таблица 34-6]

A-36		66		2626,1
A-37		67		2594,1
A-38	68		2634,4

[0383] Синтез циклического пептида 1-28

[0384] Раствор, имеющий вышеуказанную композицию раствора 4, получали в 1,5 мл пробирке для образцов и инкубировали при 37°C в течение 30 минут. 70 мкл 0,1 моль/л фосфатного буфера (pH 6,4) добавляли в реакционный раствор, который затем инкубировали при 37°C в течение 4 часов. 20 мкл 0,1 моль/л водного раствора гидроксида натрия и 10 мкл раствора магнитных бус (производства MBL Life Science, Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarose) добавляли в реакционный раствор, который затем встряхивали с использованием вихревого смешивателя в течение 30 минут при комнатной температуре. За этим следовало центрифугирование для того, чтобы удалять раствор супернатанта. Операцию промывания получаемых магнитных бус (добавление 200 мкл буфера для промывания → встряхивание с использованием вихревого смешивателя → центрифугирование → удаление супернатанта) повторяли три раза. 10 мкл 2% водного раствора муравьиной кислоты добавляли в получаемые магнитные бусы, которые затем встряхивали с использованием вихревого смешивателя в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого магнитные бусы осаждали посредством центрифугирования и извлекали супернатант для того, чтобы получать циклический пептид 1-28. Идентификацию получаемого пептида осуществляли посредством MALDI-TOF MS.

MS(MALDI-TOF, m/z): 2325,1(M+H)

[0385] Синтез циклического пептида 1-29

Аминоацил-тРНК-28 в синтезе циклического пептида 1-28 меняли на аминоацил-тРНК-29, а время инкубации после добавления буфера составляло 24 часа, чтобы тем самым получать циклический пептид 1-29, представленный в таблице 35.

[0386] [Таблица 35]

№ циклического пептида	№ мРНК	№ аминоацил-тРНК	№ линкера	Наблюдаем. MS
1-28	мРНК-1	28		2325,1
1-29	29		2249,1

[0387] Синтез циклических пептидов 1 с 30 до 38

Синтез циклических пептидов 1 с 30 до 38, представленных в таблице 36 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинации мРНК и аминоацил-тРНК, представленных в таблице 36.

[0388] [Таблица 36-1]

№ циклического пептида	№ мРНК	№ аминоацил-тРНК	№ линкера	Наблюдаем. MS
1-30	мРНК-2	1		2357,0
1-31		2		2351,0
1-32		4		2301,0
1-33		5		2301,9
1-34		6		2301,9
1-35		7		2301,9
1-36	8		2301,0

[Таблица 36-2]

1-37		9		2306,9
1-38	10		2305,9

[0389] Синтез циклических пептидов 1 с 39 до 47

Синтез циклических пептидов 1 с 39 до 47, представленных в таблице 37 далее, осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинации мРНК и аминоацил-тРНК, представленных в таблице 37.

[0390] [Таблица 37-1]

№ циклического пептида	№ мРНК	№ аминоацил-тРНК	№ линкера	Наблюдаем. MS
1~39	мРНК-3	1		2399,0
1-40		2		2392,0
1-41		4		2342,0
1-42		5		2342,9
1-43		6		2342,9
1-44	7		2342,9

[Таблица 37-2]

1-45		8		2342,0
1-46		9		2347,9
1-47	10		2346,9

[0391] Синтез циклического пептида 1-48

Синтез циклического пептида 1-48 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинацию мРНК-4 и аминоацил-тРНК-10.

MS(MALDI-TOF, m/z): 2159,9(M+H)

[0392] Синтез циклического пептида 1-49

Синтез циклического пептида 1-49 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинацию мРНК-5 и аминоацил-тРНК-10.

MS(MALDI-TOF, m/z): 2217,6(M+H)

[0393] Синтез циклического пептида 1-50

Синтез циклического пептида 1-50 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинацию мРНК-6 и аминоацил-тРНК-10.

MS(MALDI-TOF, m/z): 2088,9(M+H)

[0394] Синтез циклического пептида 1-51

Синтез циклического пептида 1-51 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинацию мРНК-7 и аминоацил-тРНК-10.

MS(MALDI-TOF, m/z): 2001,8(M+H)

[0395] Синтез циклического пептида 1-52

Синтез циклического пептида 1-52 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинацию мРНК-8 и аминоацил-тРНК-10.

MS(MALDI-TOF, m/z): 1845,7(M+H)

[0396] Синтез циклического пептида 1-53

Синтез циклического пептида 1-53 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинацию мРНК-9 и аминоацил-тРНК-10.

MS(MALDI-TOF, m/z): 1748,7(M+H)

[0397] Синтез циклического пептида 1-54

Синтез циклического пептида 1-54 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинацию мРНК-10 и аминоацил-тРНК-10.

MS(MALDI-TOF, m/z): 3001,3(M+H)

[0398] Синтез циклического пептида 1-55

Синтез циклического пептида 1-55 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинацию мРНК-11 и аминоацил-тРНК-10.

MS(MALDI-TOF, m/z): 3614,6(M+H)

[0399] Синтез циклического пептида 1-56

Синтез циклического пептида 1-56 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинацию мРНК-12 и аминоацил-тРНК-10.

MS(MALDI-TOF, m/z): 2327,0(M+H)

[0400] Синтез циклического пептида 1-57

Синтез циклического пептида 1-57 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида 1-1, используя комбинацию мРНК-13 и аминоацил-тРНК-10.

MS(MALDI-TOF, m/z): 2090,9(M+H)

[0401] Общий способ твердофазного синтеза пептидов с помощью автоматизированного пептидного синтезатора.

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием автоматизированного пептидного синтезатора (SyroI, производства Biotage AB). Rink Amide-ChemMatrix (зарегистрированный товарный знак, производства Biotage AB), N-метил-2-пирролидоновый (NMP) раствор Fmoc аминокислот (0,5 моль/л), NMP раствор сложного этилового эфира цианогидроксииминоуксусной кислоты (1,0 моль/л) и диизопропилэтиламина (0,1 моль/л), NMP раствор диизопропилкарбодиимида (1,0 моль/л), NMP раствор пиперидина (20% об./об.) и NMP раствор уксусного ангидрида (20% об./об.) подавали в синтезатор и осуществляли синтез в соответствии с руководством. Элонгацию пептидной цепи осуществляли посредством повторения цикла снятия защитных групп Fmoc (20 минут), промывания с использованием NMP, конденсации Fmoc аминокислот (1 час) и промывания с использованием NMP в одном цикле. HPLC, используемая в этом разделе, представляла собой 1260 Infinity Binary LC System (производства Agilent Technologies, Inc.) или LC System (производства Waters Corporation).

Колонка: Waters X Select CSH130 C18 (10×250 мм) или Waters X Select CSH130 C18 (19×250 мм)

Температура колонки: 40°C

Скорость потока: 4,0 мл/мин (производства Agilent Technologies, Inc.), 20 мл/мин (производства Waters Corporation)

Длина волны обнаружения: 220 нм, 254 нм

[0402] Синтез циклического пептида 2-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 40 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(2-цианобензо[b]тиофен-4-ил)пропановая кислота, N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-N-ω-(2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил)-L-аргинин (Fmoc-Arg(Pbf)-OH), N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-1-(т-бутоксикарбонил)-L-триптофан (Fmoc-Trp(Boc)-OH), N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-β-циклогексил-D-аланин (Fmoc-D-Cha-OH), N-(9-флуоренилметоксикарбонил)-L-пролин (Fmoc-Pro-OH) и N-α-(т-бутоксикарбонил)-S-тритил-L-цистеин ​​(Boc-Cys(Trt)-OH). После завершения элонгации, смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:триизопропилсилан:воду (= 95:2,5:2,5, 2,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа смолу отфильтровывали и н-гексан:простой метил-т-бутилов* эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. HEPES буфер (pH 7,3, 2,5 мл) и метанол (0,5 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, после чего следовала реакция в течение 2 часов. Пептид адсорбировали на носителе с использованием Sep-pak C18 (доступно в Waters Corporation), после чего следовало промывание водой и элюирование ацетонитрилом и метанолом для того, чтобы удалять соли. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем нейтрализовали посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1,0 моль/л, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 0,91 мг циклического пептида 2-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 923,9(M+H)

RT (мин): 1,19

[0403] Соединения, представленные в таблице 38 далее, получали аналогично синтезу циклического пептида 2-1.

[0404] [Таблица 38-1]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
2-2		924,2	1,18
2-3		918,9	1,15
2-4		919,2	1,12
2-5		869,4	1,11
2-6		869,1	1,12

[Таблица 38-2]

2-7		869,2	1,10
2-8		869,2	1,12
2-9		869,4	1,14
2-10		869,2	1,12
2-11		869,1	1,09
2-12		883,2	1,12
2-13		870,2.	1,09
2-14		870,2	1,10
2-15		870,1	1,08
2-16		874,3	1,19

[Таблица 38-3]

2-17		874,4	1,19
2-18		875,1	1,12
2-19		875,1	1,11
2-20		858,1	1,02
2-21		897,2	1,22
2-22		899,3	0,96
2-23		870,2	1,08
2-24		874,4	1,14

[0405] Синтез циклического пептида 3-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 100 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-3-ил)пропановая кислота, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-D-Cha-OH, Fmoc-Pro-OH и Boc-Cys(Trt)-OH. После завершения элонгации, смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:триизопропилсилан:воду (= 95:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Фосфатный буфер (pH 6,4, 5,0 мл) и ацетонитрил (1,0 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, после чего следовала реакция в течение 2 часов. Пептид адсорбировали на носителе с использованием Sep-pak C18 (доступно в Waters Corporation), после чего следовало промывание водой и элюирование ацетонитрилом и метанолом для того, чтобы удалять соли. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем нейтрализовали посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1 моль/л, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 0,93 мг циклического пептида 3-1 в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 869,2(M+H)

RT (мин): 1,09

[0406] Соединения, представленные в таблице 39 далее, получали аналогично синтезу циклического пептида 3-1.

[0407] [Таблица 39]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	/ мин
3-2		907,2	1,13
3-3		869,4	1,16
3-4		868,2	1,19
3-5		791,8	1,04

[0408] Синтез циклического пептида 4-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 100 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-2-ил)пропановая кислота, N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-D-фенилаланин (Fmoc-D-Phe-OH), N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)глицин (Fmoc-Gly-OH), Fmoc-Gly-OH, N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-O-(т-бутил)-D-тирозин (Fmoc-D-Tyr (tBu)-OH) и Boc-Cys(Trt)-OH. После завершения элонгации, смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:триизопропилсилан:воду (= 95:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали, и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Буфер HEPES (pH 7,3, 5,0 мл), ацетонитрил (1,0 мл) и водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (0,5 моль/л, 0,1 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, которое затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и оставляли стоять в течение 13 часов. Раствор концентрировали при пониженном давлении, и получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем нейтрализовали посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1,0 M, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 2,61 мг циклического пептида 4-1 в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 701,0(M+H)

RT (мин): 0,97

[0409] Циклические пептиды 4 с 2 до 7 и циклические пептиды 4-8 и 4-9, представленные в таблицах 40, 41 и 42 далее, получали аналогично синтезу циклического пептида 4-1.

[0410] [Таблица 40]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
4-2		720. 9	0. 98
4-3		705. 9	0. 96

[0411] [Таблица 41]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
4-4		809,0	1,17
4-5		804,2	1,15

[0412] [Таблица 42]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
4-6		844,0	1,02
4-7		839,1	1,00

[0413] Циклический пептид 4-8

MS(ESI m/z): 1135,2

RT (мин): 1,15

[0414] Циклический пептид 4-9

MS(ESI m/z): 1151,2

RT (мин): 1,12

[0415] Синтез циклического пептида 5-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 50 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-3-циано-L-фенилаланин (Fmoc-Phe(3-CN)-OH), сложный γ-т-бутиловый эфир N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-D-глутаминовой кислоты (Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH), N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-D-триптофан (Fmoc-D-Trp-OH), N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-L-лейцин (Fmoc-Leu-OH), N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-D-валин (Fmoc-D-Val-OH) и Boc-Cys(Trt)-OH. После завершения элонгации, смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:триизопропилсилан:воду (= 95:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Фосфатный буфер (pH 6,4, 2,5 мл), метанол (1,0 мл) и водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (0,5 моль/л, 0,025 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, которое затем перемешивали при комнатной температуре в течение 42 часов. Пептид адсорбировали на носителе с использованием Sep-pak C18 (доступно в Waters Corporation), после чего следовало промывание водой и элюирование с использованием ацетонитрила и метанола для того, чтобы удалять соли. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем нейтрализовали посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1,0 M, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 0,67 мг циклического пептида 5-1 в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 802,9(M+H)

RT (мин): 1,21

[0416] Синтез циклического пептида 6-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 50 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-(4-((аллилокси)карбонил)тиазол-2-ил)пиридин-2-ил)пропановая кислота, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-D-Cha-OH и Fmoc-Pro-OH. После элонгации пептида, туда добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (0) (Pd(PPh₃)₄) (29 мг) и хлороформ:уксусную кислоту:N-метилморфолин (= 37:2:1, 1,5 мл), после чего следовала реакция в течение 1 часа для того, чтобы удалять аллильную группу. Туда добавляли NMP раствор пиперидина (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 20 минут для того, чтобы удалять группу Fmoc и затем туда добавляли O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (19 мг), диизопропилэтиламин (17 мкл) и 1-метил-2-пирролидон (1,5 мл), после чего следовала реакция в течение 2 часов, ведущая к замыканию кольца в пептиде. Смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:триизопропилсилан:воду (= 92,5:2,5:2,5, 2,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа смолу отфильтровывали и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) для того, чтобы получать 0,91 мг циклического пептида 6-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 867,0(М+Н)

RT (мин): 1,11

[0417] Синтез циклического пептида a-1-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 104 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,48 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропановая кислота, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-D-Cha-OH, Fmoc-Pro-OH и N-(((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)-S-((4-метоксифенил)дифенилметил)-L-цистеин. После завершения элонгации пептида, туда добавляли NMP раствор пиперидина (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 20 минут для того, чтобы удалять группу Fmoc. Смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:3,6-диокса-1,8-октандитиол:триизопропилсилан:воду (= 92,5:2,5:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа смолу отфильтровывали и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Фосфатный буфер (pH 7,0, 5,0 мл), метанол (5,0 мл) и трис(2-карбоксиэтил)фосфин (0,5 моль/л, 0,1 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, которое затем перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем нейтрализовали посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1 моль/л, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 2,63 мг циклического пептида a-1-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 888,2(M+H)

RT (мин): 1,12

[0418] Циклические пептиды a-1 с 2 до 18, представленные в таблице 43 далее, получали аналогично синтезу циклического пептида a-1-1.

[0419] [Таблица 43-1]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
a-1-2		859,3	1,11
a-1-3		922	1,15
a-1-4		922	1,22
a-1-5		934,1	1,03

[Таблица 43-2]

a-1-6		859,2	1,13
a-1-7		869,2	1,12
a-1-8		1137,3	1,30
a-1-9		1169,2	1,27
a-1-10		940,3(M-H)	1,15
a-1-11		956,2(M-H)	1,15

[Таблица 43-3]

a-1-12		906,2 (M-H)	1,11
a-1-13		872,1 (M-H)	1,15
a-1-14		985,2	1,16
a-1-15		985,4	1,13
a-1-16		985,3	1,11
a-1-17		1177,3	1,69
a-1-18		888,2	1,10

[0420] Циклический пептид a-1-19

Синтез циклического пептида a-1-19 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида a-1-1.

MS(ESI m/z): 854,1(M+H)

RT (мин): 1,14

[0421] Синтез циклического пептида a-2-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 104 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,54 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(4-((аллилокси)карбонил)амино)фенил)пропановая кислота, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-D-Cha-OH, Fmoc-Pro-OH и Boc-Cys(Trt)-OH. После элонгации пептида, туда добавляли Pd(PPh₃)₄ (58 мг) и хлороформ:уксусную кислоту:N-метилморфолин (= 37:2:1, 2,0 мл), после чего следовало перемешивание в течение 1 часа для того, чтобы удалять группу Alloc. Конденсацию осуществляли в порядке Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH и Fmoc-Phe(3-CN)-OH. Туда добавляли NMP раствор пиперидина (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 20 минут для того, чтобы снимать защитную группу Fmoc, и туда добавляли NMP раствор уксусного ангидрида (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 10 минут, ведущая к ацетилированию N-концевой аминогруппы. Смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:триизопропилсилан:воду (= 95:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа смолу отфильтровывали и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Фосфатный буфер (pH 7,0, 5 мл), метанол (5 мл) и водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (0,5 моль/л, 0,1 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, после чего следовала реакция в течение 30 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем нейтрализовали посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1,0 моль/л, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 7,96 мг циклического пептида a-2-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 1184,2(M-H)

RT (мин): 1,11

[0422] Циклический пептид a-2-2

Синтез циклического пептида a-2-2 осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида a-2-1.

MS(ESI m/z): 1107,3(M+H)

RT (мин): 1,17

[0423] Циклический пептид a-3-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 104 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,54 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке Fmoc-Phe(3-CN)-OH, N-(9-флуоренилметоксикарбонил)-L-лейцин (Fmoc-Leu-OH), N-(9-флуоренилметоксикарбонил)-L-аланин (Fmoc-Ala-OH), N-(9-флуоренилметоксикарбонил)-L-фенилаланин (Fmoc-Phe-OH), Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH и Boc-Cys(Trt)-OH. Смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:3,6-диокса-1,8-октандитиол:триизопропилсилан:воду (= 92,5:2,5:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали, и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Фосфатный буфер (pH 7,0, 14 мл), метанол (15 мл), ацетонитрил (4 мл) и водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (0,5 моль/л, 0,1 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, после чего следовала реакция в течение 38 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем нейтрализовали посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1,0 моль/л, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 8,05 мг циклического пептида a-3-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 1664,6(M+H)

RT (мин): 1,53

[0424] Циклический пептид a-3-2

Циклический пептид a-3-2 получали аналогично синтезу циклического пептида a-3-1.

MS(ESI m/z): 1129,5(M+H)

RT (мин): 1,21

[0425] Циклический пептид a-4-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 104 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,54 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке Fmoc-Phe(3-CN)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH и N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-N-ε-аллилоксикарбонил-L-лизин. Туда добавляли NMP раствор пиперидина (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 20 минут для того, чтобы снимать защитную группу Fmoc, и туда добавляли NMP раствор уксусного ангидрида (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 10 минут, ведущая к ацетилированию N-концевой аминогруппы. Туда добавляли Pd(PPh₃)₄ (58 мг) и хлороформ:уксусную кислоту:N-метилморфолин (= 37:2:1, 2,0 мл), после чего следовало перемешивание в течение 1 часа для того, чтобы удалять группу Alloc. После конденсации Boc-Cys(Trt)-OH, смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:3,6-диокса-1,8-октандитиол:триизопропилсилан:воду (= 92,5:2,5:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Фосфатный буфер (pH 7,0, 5 мл), метанол (5 мл) и водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (0,5 моль/л, 0,1 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, после чего следовала реакция в течение 30 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем нейтрализовали посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1,0 моль/л, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 0,24 мг циклического пептида a-4-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 1011,5(M-H)

RT (мин): 0,98

[0426] Циклический пептид 7-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 100 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-S-тритил-L-цистеин ​​(Fmoc-Cys(Trt)-OH), Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-D-Cha-OH, Fmoc-Pro-OH и Fmoc-Ala-OH. После элонгации пептида, осуществляли снятие защитной группы Fmoc, и хлоруксусную кислоту конденсировали аналогично конденсации аминокислот. Смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:триизопропилсилан:воду (= 95:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали, и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. HEPES буфер (pH 7,3, 5,0 мл) и ацетонитрил (1,0 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 4 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор TFA:0,1% ацетонитриловый раствор TFA) для того, чтобы получать 1,4 мг циклического пептида 7-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 824,4(M+H)

RT (мин): 1,09

[0427] Циклические пептиды, представленные в таблице 44 далее, получали аналогично синтезу циклического пептида 7-1.

[0428]

[Таблица 44-1]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
7-2		656,1	0,79
7-3		795,0	0,87
7-4		759,2	1,12
7-5		1085,2	1,10

[Таблица 44-2]

7-6

1101,5

1,08

[0429] Циклический пептид 8-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 100 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке сложный γ-аллиловый эфир N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-L-глутаминовой кислоты (Fmoc-Glu(OAl)-OH), Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-D-Cha-OH, Fmoc-Pro-OH и Fmoc-Ala-OH. После элонгации пептида, туда добавляли (Pd(PPh₃)₄ (58 мг) и хлороформ:уксусную кислоту:N-метилморфолин (= 37:2:1, 2,0 мл), после чего следовало перемешивание в течение 1 часа для того, чтобы удалять аллильную группу боковой цепи. Туда добавляли NMP раствор пиперидина (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 20 минут для того, чтобы удалять группу Fmoc. Туда добавляли O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N’,N’-тетраметилуроний гексафторфосфат (57 мг), диизопропилэтиламин (52 мкл) и NMP (3,0 мл), после чего следовала реакция при комнатной температуре в течение 2 часов, ведущая к замыканию кольца в пептиде. Смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:триизопропилсилан:воду (= 95:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли при комнатной температуре в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали, и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор TFA/0,1% ацетонитриловый раствор TFA) для того, чтобы получать 7,1 мг циклического пептида 8-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 792,4(M+H)

RT (мин): 1,02

[0430] Циклические пептиды, представленные в таблице 45 далее, получали аналогично синтезу циклического пептида 8-1.

[0431] [Таблица 45]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
8-2		624,3	0,76
8-3		727,1	1,11

[0432] Циклический пептид 9-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 100 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Элонгацию пептидной цепи осуществляли в порядке Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-D-Cha-OH, Fmoc-Pro-OH и Fmoc-Cys(Trt)-OH. Затем туда добавляли NMP раствор пиперидина (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 20 минут для того, чтобы снимать защитную группу Fmoc, и туда добавляли NMP раствор уксусного ангидрида (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 10 минут, ведущая к ацетилированию N-концевой аминогруппы. Смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:3,6-диокса-1,8-октандитиол:триизопропилсилан:воду (= 92,5:2,5:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали, и простой метил-т-бутиловый эфир (12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. После добавления ацетонитрила (20 мл) и воды (20 мл), понемногу добавляли раствор гидрокарбоната триэтиламмония (1,0 моль/л, pH 8,5) для того, чтобы корректировать pH реакционного раствора до 8,0. Впоследствии ацетонитриловый раствор йода (0,1 моль/л) добавляли при комнатной температуре до исчезновения цвета йода, что, таким образом, вело к формированию дисульфидной связи. Через 30 минут добавляли аскорбат натрия до исчезновения цвета йода и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор TFA/0,1% ацетонитриловый раствор TFA) для того, чтобы получать 7,0 мг циклического пептида 9-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 856,4(M+H)

RT (мин): 1,15

[0433] Циклические пептиды, представленные в таблице 46 далее, получали аналогично синтезу циклического пептида 9-1.

[0434] [Таблица 46]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
9-2		791,2	1,18
9-3		825,9	0,91
9-4		1117,2	1,08

[0435] Циклический пептид 10-1

Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 80 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Элонгацию пептида осуществляли в порядке N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-L-пропаргилглицин (Fmoc-Pra-OH), Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-D-Cha-OH, Fmoc-Pro-OH и Fmoc-Ala-OH. Затем туда добавляли NMP раствор пиперидина (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 20 минут для того, чтобы снимать защитную N-концевую группу Fmoc. Азидоуксусную кислоту конденсировали аналогично конденсации аминокислот. Туда добавляли йодид меди (7,6 мг), диизопропилэтиламин (34,4 мкл), трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амин (6,4 мг) и NMP (2,0 мл), после чего следовало перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа, ведущее к замыканию кольца в пептиде. Смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:триизопропилсилан:воду (= 95:2,5:2,5, 2,4 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали, и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор TFA/0,1% ацетонитриловый раствор TFA) для того, чтобы получать 1,26 мг циклического пептида 10-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 859,0(M+H)

RT (мин): 1,05

[0436] Циклические пептиды, представленные в таблице 47 далее, получали аналогично синтезу циклического пептида 10-1.

[0437] [Таблица 47]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
10-2		691,0	0,78
10-3		794,0	1,10
10-4		829,1	0,88

[0438] Оценка мембраной проницаемости синтезируемого циклического пептида способом PAMPA

Для того чтобы сравнивать и исследовать мембранную проницаемость синтезируемого циклического пептида, осуществляли параллельный анализ проницаемости искусственных мембран (PAMPA).

Искусственную фосфолипидную мембрану получали посредством добавления 5 мкл раствора органического растворителя фосфолипида, состоящего из L-α-фосфатидилхолина (Avanti Polar Lipids, Inc., кат. 840051P, 1,67%), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серина (Avanti Polar Lipids, Inc., кат. 840035P, 0,33%) и реактива н-додекана особой марки (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 047-21612)/1-октанола особой марки (Kanto Chemical Co., Inc., кат. 31013-08) = 10:1 в фильтровальный планшет (Merck Millipore Corporation, кат. MAIPN4550).

[0439] Способ измерения A

475 мкл 50 ммоль/л калий-фосфатного буфера (KPB, pH 7,4 или pH 6,5) добавляли в 25 мкл DMSO раствора, содержащего соединение в концентрации 20 мкмоль/л, с тем, чтобы соединение разводить до конечной концентрации 1 мкмоль/л. 300 мкл раствора соединения добавляли в нижнюю сторону (донорную сторону) PAMPA 96-луночного планшета (фильтровальный планшет (Merck Millipore Corporation, кат. MAIPN4550)) со встроенной искусственной фосфолипидной мембраной, расположенной между. 200 мкл 5% DMSO KPB (pH 7,4) добавляли в верхнюю сторону (акцепторную сторону) со встроенной искусственной фосфолипидной мембраной. Тест на проницаемость через искусственную фосфолипидную мембрану осуществляли при 25°C в течение 4 часов. Концентрацию соединения в растворе в донорном планшете и акцепторном планшете измеряли посредством LC/MS/MS, и скорость мембранной проницаемости (P_e) соединения вычисляли по следующей формуле, полагая, что C₀ представляет собой начальную концентрацию соединения в донорном растворе, t представляет собой время теста, A представляет собой площадь мембранного фильтра=0,3 см², V_D представляет собой количество донорного раствора=300 мкл, V_A представляет собой количество акцепторного раствора=200 мкл и C_D(t) представляет собой концентрацию соединения в донорном растворе в момент времени t, C_A(t) представляет собой концентрацию соединения в акцепторном растворе в момент времени t и C_equilibrium = [C_D(t)*V_D+C_A(t)*V_A]/(V_D+V_A).

[0440] Способ измерения B

475 мкл 50 ммоль/л калий-фосфатного буфера (KPB, pH 7,4 или pH 6,5) добавляли в 25 мкл DMSO раствора, содержащего соединение в концентрации 20 мкмоль/л, с тем, чтобы соединение разводить до конечной концентрации 10 мкмоль/л. 300 мкл каждого раствора соединения добавляли в нижнюю сторону (донорную сторону) искусственной фосфолипидной мембраны PAMPA 96-луночного планшета (фильтровальный планшет (Merck Millipore Corporation, кат. MAIPN4550)). 200 мкл 5% DMSO KPB (pH 7,4) добавляли в верхнюю сторону (акцепторную сторону) со встроенной искусственной фосфолипидной мембраной. Тест на проницаемость через искусственную фосфолипидную мембрану осуществляли при 25°C в течение 4 часов. Концентрацию соединения в растворе в донорном планшете и акцепторном планшете измеряли посредством LC/MS/MS и вычисляли скорость мембранной проницаемости (P_e) соединения по следующей формуле, полагая, что C₀ представляет собой начальную концентрацию соединения в донорном растворе, t представляет собой время теста, A представляет собой площадь мембранного фильтра=0,3 см², V_D представляет собой количество донорного раствора=300 мкл, V_A представляет собой количество акцепторного раствора=200 мкл и C_D(t) представляет собой концентрацию соединения в донорном растворе в момент времени t, C_A(t) представляет собой концентрацию соединения в акцепторном растворе в момент времени t и C_equilibrium = [C_D(t)*V_D+C_A(t)*V_A]/(V_D+V_A).

[0441]

[0442] Мембранная проницаемость (Pe(10-⁶см/с)), которую получали с помощью этого способа, описана в следующей таблице.

Стандарты оценки представляют собой следующее.

+++ 0,5 < P_e (10-⁶ см/с)

++ 0,2 < P_e (10-⁶ см/с)≤0,5

+ 0,01 < P_e (10-⁶ см/с)≤0,2

- 0,01≤P_e (10-⁶ см/с)

[0443] [Таблица 48-1]

№ примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
1-1	2-1	+++	A
1-2	2-2	+++	A
1-3	2-4	+++	A
1-4	2-5	++	A
1-5	2-6	++	A
1-6	2-7	+++	A
1-7	2-10	+++	A
1-8	2-11	+++	A
1-9	2-16	+++	A
1-10	2-17	+++	A
1-11	2-19	+++	A
1-12	2-21	+++	A
1-13	2-22	++	A
1-14	3-1	+++	A
1-15	3-2	+++	A
1-16	3-4	+++	A
1-17	3-5	++	A
1-18	6-1	+++	A
№ сравнительного примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
1-1	7-1	+	A
1-2	8-1	+	A
1-3	9-1	+	A
1-4	10-1	+	A

№ примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
2-1	4-2	+++	A
2-2	4-3	+++	A
№ сравнительного примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
2-1	7-2	+	A
2-2	8-2	+	A
2-3	9-2	+	A

[Таблица 48-2]

№ примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
3-1	4-4	++	A
3-2	5-1	+++	A
№ сравнительного примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
3-1	7-4	+	A
3-2	8-3	-	A
3-3	9-2	+	A
3-4	10-3	-	A

№ примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
4-1	4-6	+	A
№ сравнительного примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
4-1	7-3	-	A
4-2	9-3	Ниже предела количественного определения	A
4-3	10-4	-	A

№ примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
5-1	4-9	+	A
№ сравнительного примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
5-1	7-6	Ниже предела количественного определения	A
№ примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
6-1	4-8	++	A
№ сравнительного примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
6-1	7-5	Ниже предела количественного определения	A
6-2	9-4	Ниже предела количественного определения	A

[Таблица 48-3]

№ примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
7-1	a-1-1	+++	A
7-2	a-1-2	++	A
7-3	a-1-3	+++	A
7-4	a-1-4	+++	A
7-5	a-1-5	++	B
7-6	a-1-6	+++	A
7-7	a-1-8	+++	A
7-8	a-1-9	+++	A
7-9	a-1-10	+++	A
7-10	a-1-11	+++	A
7-11	a-1-12	+++	A
7-12	a-1-14	+++	B
7-13	a-1-15	++	B
7-14	a-1-16	++	B
7-15	a-1-19	+++	A
№ примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
8-1	a-3-1	+++	B
8-2	a-3-2	++	A
№ примера	№ циклического пептида	Pe(10-6 см/с)	Способ измерения
9-1	a-4-1	+	B

[0444] Аминокислотные последовательности, образующие циклические пептиды, идентичны, за исключением замыкающей кольцо части, и циклические пептиды синтезировали с использованием способа получения циклических пептидов по настоящему изобретению, способа замыкания кольца простого тиоэфира и способа замыкания кольца триазола, а также способа замыкания кольца дисульфида. Индивидуальные пептиды оценивали и сравнивали по проницаемости клеточных мембран способом PAMPA.

Как результат, обнаружено, что циклический пептид, синтезируемый в соответствии с настоящим изобретением, обладает превосходящей проницаемостью клеточных мембран по сравнению с циклическими пептидами, синтезируемыми с помощью других способов получения.

[0445] Тест на метаболическую стабильность циклического пептида в микросоме печени человека

Эксперимент с использованием микросом печени человека (HLM) осуществляли для того, чтобы сравнивать и исследовать метаболическую стабильность синтезируемых циклических пептидов.

Соединение с конечной концентрацией 1 мкмоль/л инкубировали в полученных микросомах печени человека (BD № кат. 452117) в конечной концентрации 0,5 мг белка/мл с использованием 100 ммоль/л фосфатного буфера (pH 7,4) при 37°C в течение 20 минут в присутствии восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) и уридин 5’-дифосфат-α-D-глюкуроновой кислоты (UDPGA). Осуществляли обработку по депротеинизации ацетонитрилом, количество остающегося неизмененного вещества количественно определяли с использованием LC/MS/MS и вычисляли остаточный уровень (%) через 20 минут. Остаточный уровень HLM (%), получаемый с помощью этого способа, описан в следующей таблице.

Стандарты оценки представляют собой следующее.

+++ 60% < остаточный уровень HLM (%)

++ 40% < остаточный уровень HLM (%)≤60%

+ остаточный уровень HLM (%)≤40%

[0446] [Таблица 49]

№ примера	№ циклического пептида	Остаточный уровень HLM
7-1	2-1	+++
7-2	2-5	++
7-3	2-6	+++
7-4	2-7	+++
7-5	2-8	+++
7-6	2-9	+++
7-7	2-10	+++
7-8	2-11	+++
7-9	2-13	+++
7-10	2-14	+++
7-11	2-15	++
7-12	2-16	++
7-13	2-18	++
7-14	2-19	+++
7-15	2-20	++
7-16	2-21	+++
7-17	2-22	+++
7-18	3-2	+++
7-19	3-3	+++
7-20	3-4	+++
7-21	6-1	+++

№ сравнительного примера	№ циклического пептида	Остаточный уровень HLM
7-1	7-1	+
7-2	9-1	+

[0447] Аминокислотные последовательности, образующие циклические пептиды, идентичны, за исключением замыкающей кольцо части, и циклические пептиды синтезировали с использованием способа получения циклических пептидов по настоящему изобретению и способа замыкания кольца простого тиоэфира. Индивидуальные пептиды оценивали и сравнивали по метаболической стабильности с помощью теста на метаболическую стабильность в микросомах печени человека.

Как результат, обнаружено, что циклический пептид, синтезируемый в соответствии с настоящим изобретением, обладает превосходящей метаболической стабильностью по сравнению с циклическими пептидами, синтезируемыми другими способами получения.

[0448] <кДНК дисплей>

Получения библиотеки ДНК, используемой для библиотеки дисплея

Используя синтетическую олиго ДНК (SEQ ID № 15) и синтетическую олиго ДНК (SEQ ID № 16), реакцию элонгации осуществляли с использованием KOD-plus- (производства Toyobo Co., Ltd.). После денатурации при 94°C в течение 3 минут, цикл из 1 минуты при 55°C и 2 минут при 72°C повторяли пять раз. Впоследствии ПЦР осуществляли с использованием KOD-plus- (производства Toyobo Co., Ltd.), используя этот продукт реакции достраивания в качестве матрицы и синтетическую олиго ДНК (SEQ ID № 16) и синтетическую олиго ДНК (SEQ ID № 17). После денатурации при 94°C в течение 2 минут, цикл из 1 минуты при 94°C, 1 минуты при 50°C и 1 минуты при 68°C повторяли пять раз для того, чтобы конструировать библиотеку ДНК (SEQ ID № 18).

Точка, обозначаемая с помощью N в последовательности, обозначает, что A, T, G и C встречаются случайно, а точка, обозначаемая с помощью K, обозначает, что T и G встречаются случайно.

[0449] SEQ ID № 15

AAGAAGGAGATATACATATGTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGGGCGGTTCTGGCGGTAGC

[0450] SEQ ID № 16

ATACTCAAGCTTATTTATTTACCCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTACCGCCAGAACCGCC

[0451] SEQ ID № 17

GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG

[0452] SEQ ID № 18

GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGGGCGGTTCTGGCGGTAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGGGTAAATAAATAAGCTTGAGTAT

[0453] Получение комплекса мРНК-пуромициновый линкер

мРНК (SEQ ID № 19) получали с использованием РНК полимеразы Thermo T7 (производства Toyobo Co., Ltd.) с библиотекой ДНК (SEQ ID № 18), полученной с помощью ПЦР, в качестве матрицы, и очищенной посредством преципитации этанолом. 5 мкмоль/л следующего пуромицинового линкера A (производства Tsukuba Oligo Service Co., Ltd.) и TBS (25 ммоль/л Tris, 500 ммоль/л NaCl, pH 7,5) добавляли в 2,8 мкмоль/л мРНК, после чего следовала реакция в течение 1 минуты при 90°C и температуру реакционного раствора снижали до 25°C со скоростью 0,5°C/минута. Впоследствии, за УФ облучением на 365 нм в течение 30 минут следовала очистка преципитацией этанолом для того, чтобы получать комплекс мРНК-пуромициновый линкер.

[0454] Точка, обозначаемая с помощью N в последовательности, обозначает, что A, U, G и C встречаются случайно, а точка, обозначаемая с помощью K, обозначает, что U и G встречаются случайно.

[0455] SEQ ID № 19

GGGAGACCACAACGGUUUCCCUCUAGAAAUAAUUUUGUUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKUAGGGCGGUUCUGGCGGUAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGGGUAAAUAAAUAAGCUUGAGUAU

[0456]

Выше приведен пуромициновый линкер A (производства Tsukuba Oligo Service Co., Ltd.).

[0457]

Выше представлен (Sp18).

[0458] Получение целевого белка

Получали конструкцию плазмиды, где ген, содержащий часть из аминокислот 1-172 из MCL-1, вводили в плазмиду pET28a, а метку His6, MBP, последовательность распознавания протеазы HRV3C и метку 3×FLAG прикрепляли к ее N-концевой стороне. Эту плазмиду трансформировали в штамм E. coli BL21 (DE3) RIPL, который затем культивировали при 30°C. В случае, когда the O.D. достигала 0,8, IPTG 0,5 мкмоль/л добавляли для того, чтобы индуцировать крупномасштабную экспрессию, после чего следовало культивирование при 16°C в течение ночи. Извлекаемые бактериальные клетки суспендировали в лизирующем буфере B (25 ммоль/л Tris (pH 7,5), 300 ммоль/л NaCl) и затем разрушали посредством обработки звуком. За этим следовало центрифугирование на 15000 об./мин в течение 15 минут. Супернатант после центрифугирования очищали с использованием смолы Ni-NTA (производства QIAGEN GmbH). Образец, адсорбированный на смоле Ni-NTA, промывали лизирующим буфером B, содержащим 20 ммоль/л имидазола, и затем элюировали лизирующим буфером B, содержащим 200 ммоль/л имидазола. Протеазу PreScission (производства GE lifesciences, Inc.) добавляли в образец для отщепления частей метки His6 и MBP, сразу после чего следовала замена на диализный буфер (25 ммоль/л Tris (pH 7,5), 150 ммоль/л NaCl) в течение ночи посредством диализа. После подтверждения отщепления метки, образец добавляли на амилозную смолу (доступна в New England BioLabs, Inc.), проводили замещение с использованием диализного буфера и фракционировали проточную фракцию. Полученный образец концентрировали с помощью Amicon Ultra (производства Millipore Corporation) и затем очищали с помощью HiLoad Superdex75 (производства GE lifesciences, Inc.). Получаемый образец концентрировали с помощью Amicon Ultra и затем хранили при -80°C.

[0459] Получение бус с иммобилизованным белком

100 мкл ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads (производства Sigma-Aldrich LLC) промывали в TBS (20 ммоль/л Tris, 150 ммоль/л NaCl, pH 7,4). Туда добавляли 33 мкг целевого белка, после чего следовало смешивание переворачиванием в течение 10 минут для того, чтобы связывать белок с бусами. Бусы извлекали и промывали в TBS для того, чтобы получать бусы с целевым иммобилизованным белком.

[0460] Синтез амбер-супрессорной тРНК (-CA)

Амбер-супрессорную тРНК синтезировали аналогичным образом, как описано выше.

[0461] Синтез аминоацил-тРНК-15 (таблица 31)

Аминоацил-тРНК-15 получали аналогичным образом, как описано выше.

[0462] Раствор для трансляции, используемый для пэннинга

Следующее добавляли в 10 мкл реакционного раствора с использованием PUREfrex (зарегистрированный товарный знак) спец. вер. 2 (производства GeneFrontier Corporation, PFC-Z1802).

Комплекс мРНК-пуромициновый линкер: конечная концентрация 0,6 мкмоль/л

Водный раствор аминоацил-тРНК-15 (0,2 OD/мкл): 1 мкл

Водный раствор аминокислот (смесь 19 аминокислот, отличных от Met, 0,3 ммоль/л каждая): 1,5 мкл

[0463] Трансляция для осуществления 1 раунда пэннинга, обратная транскрипция, пэннинг и ПЦР

Получали указанный выше раствор для трансляции, и проводили реакцию при 37°C в течение 30 минут. 2 мкл раствора EDTA 60 ммоль/л добавляли в 4 мкл этого раствора для трансляции, который затем оставляли при комнатной температуре на несколько минут. Впоследствии ReverTra Ace (производства Toyobo Co., Ltd.), 5× RT буфер (производства Toyobo Co., Ltd.) и 1 ммоль/л dNTP добавляли в в этот раствор, который затем инкубировали при 30°C в течение 10 минут и 42°C в течение 30 минут для того, чтобы осуществлять обратную транскрипцию для того, чтобы получать 10 мкл раствора комплекса пептид-мРНК.

[0464] 10 мкл бус с целевым иммобилизованным белком и TBS добавляли в вышеуказанный раствор, после чего следовало смешивание переворачиванием в течение 45 минут при комнатной температуре. Удаляли супернатант, после чего следовало промывание четыре раза в TBS+0,05% tween-20, один раз в TBS и один раз чистой водой.

[0465] 1 мкл вышеуказанных бус добавляли в раствор для ПЦР, содержащий 1 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 20), 1 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 21) и KOD-plus- (производства Toyobo Co., Ltd.), после чего следовала ПЦР амплификация кДНК, и ДНК очищали с помощью QIAquick PCR Purification Kit (производства QIAGEN GmbH). ПЦР осуществляли снова, используя очищенную ДНК в качестве матрицы с 0,3 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 22), 0,3 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 23) и KOD-plus- (производства Toyobo Co., Ltd.), и ДНК очищали с помощью QIAquick PCR Purification Kit (производства QIAGEN GmbH).

[0466] SEQ ID № 20

GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC

[0467] SEQ ID № 21

ATACTCAAGCTTATTTATTTACCCCCCGCCGCCCCCCGTCC

[0468] SEQ ID № 22

GAAATTAATACGACTCACTA

[0469] SEQ ID № 23

ATACTCAAGCTTATTTATTT

[0470] Транскрипция для 2 раунда пэннинга, получение комплекса мРНК-пуромициновый линкер, трансляция, обратная транскрипция, пэннинг и ПЦР

мРНК синтезировали из кДНК, амплифицированной в 1 раунде, используя РНК полимеразу Thermo T7 (производства Toyobo Co., Ltd.), и проводили очистку преципитацией этанолом. Затем пуромициновый линкер A (структура представлена в абзаце [0456]) добавляли в мРНК, после чего следовала реакция в течение 1 минуты при 90°C, и температуру реакционного раствора снижали до 25°C со скоростью 0,5°C/минута. Впоследствии, за УФ облучением на 365 нм в течение 30 минут следовала очистка преципитацией этанолом для того, чтобы получать комплекс мРНК-пуромициновый линкер. Указанные выше 4 мкл раствора для трансляции, содержащего 0,6 мкмоль/л комплекса мРНК-пуромициновый линкер, получали и инкубировали при 37°C в течение 30 минут, и туда добавляли 2 мкл раствора EDTA 60 ммоль/л, после чего оставляли на несколько минут при комнатной температуре. Впоследствии ReverTra Ace (производства Toyobo Co., Ltd.), 5× RT буфер (производства Toyobo Co., Ltd.) и 1 ммоль/л dNTP добавляли в этот раствор, который затем инкубировали при 30°C в течение 10 минут и 42°C в течение 30 минут для того, чтобы осуществлять обратную транскрипцию для того, чтобы получать 10 мкл раствора комплекса пептид-мРНК.

[0471] 10 мкл бус с целевым иммобилизованным белком и TBS добавляли в вышеуказанный раствор, после чего следовало смешивание переворачиванием в течение 45 минут при комнатной температуре. Супернатант удаляли, после чего следовало промывание четыре раза в TBS+0,05% tween-20, один раз в TBS и один раз в чистой воде.

[0472] 1 мкл вышеуказанных бус добавляли в раствор для ПЦР, содержащий 1 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 20), 1 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 21) и KOD-plus- (производства Toyobo Co., Ltd.), после чего следовала ПЦР амплификация кДНК, и ДНК очищали с помощью QIAquick PCR Purification Kit (производства QIAGEN GmbH). ПЦР осуществляли снова, используя очищенную ДНК в качестве матрицы с 0,3 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 22), 0,3 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 23) и KOD-plus- (производства Toyobo Co., Ltd.) и ДНК очищали с помощью QIAquick PCR Purification Kit (производства QIAGEN GmbH).

Ту же операцию, как в раунде 2, повторяли в раунде 3 для того, чтобы проводить обогащение по кДНК, демонстрирующей специфическое связывание целевого белка. Анализ последовательности обогащенного пула ДНК осуществляли для того, чтобы идентифицировать обогащенную пептидную последовательность.

[0473] Синтез химически синтезируемого циклического пептида a-5-1 обогащенной пептидной последовательности

[0474] Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 100 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-2-ил)пропановая кислота, N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-O-(т-бутил)-L-тирозин (Fmoc-Tyr(tBu)-OH), Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-S-тритил-L-цистеин (Fmoc-Cys(Trt)-OH), Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-O-т-бутил-L-серин (Fmoc-Ser(OtBu)-OH), Fmoc-Arg(Pbf)-OH и Fmoc-Cys(Trt)-OH. После завершения элонгации пептида, туда добавляли NMP раствор пиперидина (20% об./об.), после чего следовала реакция в течение 20 минут для того, чтобы снимать защитную группу Fmoc. Смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:3,6-диокса-1,8-октандитиол:триизопропилсилан:воду (= 92,5:2,5:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Фосфатный буфер (pH 7,0, 2,5 мл), метанол (2,5 мл) и водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (0,5 моль/л, 0,025 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, которое затем перемешивали при 45°C в течение 40 минут. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем нейтрализовали посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1,0 M, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 21,7 мг циклического пептида a-5-1 в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 1957,6(M+H)

RT (мин): 1,40

[0475] Синтез циклического пептида a-5-2

[0476] Процедуру осуществляли аналогичным образом, как синтез циклического пептида a-5-1.

MS(ESI m/z): 1979,4(M+H)

RT (мин): 1,67

[0477] Синтез циклического пептида a-5-3

[0478] Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 100 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,5 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(6-цианопиридин-2-ил)пропановая кислота, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-N5-тритил-L-глутамин (Fmoc-L-Gln(Trt)-OH), Fmoc-Pro-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Phe-OH и Fmoc-Cys(Trt)-OH. После завершения элонгации пептида, смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:3,6-диокса-1,8-октандитиол:триизопропилсилан:воду (= 92,5:2,5:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали, и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Фосфатный буфер (pH 7,0, 2,5 мл), метанол (2,5 мл) и водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (0,5 моль/л, 0,025 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, которое затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем нейтрализовали посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1,0 M, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 13,4 мг циклического пептида a-5-3 в виде бесцветного масла.

MS(ESI m/z): 1821,3(M+H)

RT (мин): 1,56

[0479] Соединения, представленные в таблице 50 далее, получали аналогично синтезу циклического пептида a-5-3.

[0480] [Таблица 50-1]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
a-5-4		1848,5	1,44
a-5-5		1906,4 (M-H)	1,43
a-5-6		1936,3	1,65

[Таблица 50-2]

a-5-7		1791,3	1,69
a-5-8		1822,2	1,57

[0481] Получение целевого белка

Получали конструкцию плазмиды, где ген, содержащий часть из аминокислот 1-172 из MCL-1, вводили в плазмиду pET28a, а метку His6, MBP и последовательность распознавания протеазы TEV прикрепляли к ее N-концевой стороне. Эту плазмиду трансформировали в штамм E. coli BL21 (DE3) RIPL, который затем культивировали при 30°C. В случае, когда O.D. достигала 0,8, IPTG 0,5 мкмоль/л добавляли для того, чтобы индуцировать крупномасштабную экспрессию, после чего следовало культивирование при 16°C в течение ночи. Извлекаемые бактериальные клетки суспендировали в лизирующем буфере A (25 ммоль/л Tris (pH 7,5), 150 ммоль/л NaCl), и затем разрушали обработкой звуком. За этим следовало центрифугирование на 15000 об./мин в течение 15 минут. Супернатант после центрифугирования очищали с использованием смолы Ni-NTA (производства QIAGEN GmbH). Образец, адсорбированный на смоле Ni-NTA, промывали лизирующим буфером A, содержащим 15 ммоль/л имидазола и затем элюировали лизирующим буфером A, содержащим 200 ммоль/л имидазола. Образец хранили при -80°C после замены с использованием лизирующего буфера посредством диализа.

[0482] Оценка связывания синтетического пептида с целевым белком с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Эксперимент SPR для анализа взаимодействия синтетического пептида с Mcl-1 осуществляли при 25°C с использованием Biacore T200 (производства GE Healthcare Inc.). Синтетический пептид добавляли к иммобилизованному белку и оценивали взаимодействие между ними.

Буфер, получаемый посредством добавления диметилформамида (DMF) или диметилсульфоксида (DMSO) до конечной концентрации 1% об. В HBS-EP+ (производства GE Healthcare Inc.), использовали в качестве подвижного буфера. Mcl-1 иммобилизовали на Biacore Sensor Chip Series S Sensor Chip CM5 (производства GE Healthcare Inc.) с использованием Amine Coupling Kit (производства GE Healthcare Inc.). Для того чтобы измерять константу диссоциации (KD), каждый синтетический пептид добавляли в нескольких концентрациях, чтобы получать сенсограмму связывания с иммобилизованным Mcl-1.

[0483] Анализ получаемой сенсограммы осуществляли с использованием программного обеспечения для оценки T200 (производства GE Healthcare Inc.). Осуществляли коррекцию растворителя по DMF или DMSO и затем KD определяли с помощью анализа равновесного значения, используя сенсограмму, получаемую посредством вычитания сенсограммы из проточной кюветы, в которой Mcl-1 не иммобилизуют. Результаты, получаемые посредством анализа, как описано выше, приведены в следующей таблице.

То, что имеет KD меньше 50 мкмоль/л, обозначают как A, и то, что имеет KD 50 мкмоль/л или больше, обозначают как B.

[0484] [Таблица 51]

№ соединения	Результат оценки связывания
Циклический пептид a-5-1	B
Циклический пептид a-5-2	B
Циклический пептид a-5-3	B
Циклический пептид a-5-4	A
Циклический пептид a-5-5	A
Циклический пептид a-5-6	B
Циклический пептид a-5-7	B
Циклический пептид a-5-8	B

[0485] мРНК дисплей

Получение библиотеки ДНК, используемой для библиотеки дисплея

Библиотеку ДНК получали аналогичным образом, как описано выше.

[0486] Получение комплекса мРНК-пуромициновый линкер

мРНК (SEQ ID № 19) получали с использованием РНК полимеразы Thermo T7 (производства Toyobo Co., Ltd.) и библиотеки ДНК (SEQ ID № 18), полученной с помощью ПЦР, в качестве матрицы и очищали преципитацией этанолом. 5 мкмоль/л следующего пуромицинового линкера B (производства Tsukuba Oligo Service Co., Ltd.) (структура представлена в следующем абзаце [0487]) и TBS (25 ммоль/л Tris, 500 ммоль/л NaCl, pH 7,5) добавляли в 2,8 мкмоль/л мРНК, после чего следовала реакция в течение 5 минут при 90°C и температуру реакционного раствора снижали до 25°C. Впоследствии, за УФ облучением на 365 нм в течение 2 минут следовала очистка преципитацией этанолом для того, чтобы получать комплекс мРНК-пуромициновый линкер.

[0487]

Выше приведен пуромицин B (производства Tsukuba Oligo Service Co., Ltd.)

(Sp18): Спейсер 18

[0488] Получение целевого белка

Целевой белок получали аналогичным образом, как описано выше.

[0489] Получение бус с иммобилизованным белком

Бусы с иммобилизованным белком получали аналогичным образом, как описано выше.

[0490] Синтез амбер-супрессорной тРНК (-CA)

Амбер-супрессорную тРНК синтезировали аналогичным образом, как описано выше.

[0491] Синтез аминоацил-тРНК-10 (таблица 31)

Аминоацил-тРНК-10 получали аналогичным образом, как описано выше.

[0492] Раствор для трансляции, используемый для пэннинга

Следующее добавляли в 10 мкл реакционного раствора с использованием PUREfrex (зарегистрированный товарный знак) спец. вер. 2 (производства GeneFrontier Corporation, PFC-Z1802).

Комплекс мРНК-пуромициновый линкер: конечная концентрация 0,6 мкмоль/л

Водный раствор аминоацил-тРНК-10 (0,2 OD/мкл): 1 мкл

Водный раствор аминокислот (смесь 19 аминокислот, отличных от Met, 0,3 ммоль/л каждая): 1,5 мкл

[0493] Трансляция для осуществления 1 раунда пэннинга, пэннинг, обратная транскрипция и ПЦР

Указанный выше раствор для трансляции получали и проводили реакцию при 37°C в течение 30 минут. 10 мкл бус с целевым иммобилизованным белком и TBS (20 ммоль/л Tris, 150 ммоль/л NaCl, pH 7,4) добавляли в 4 мкл этого раствора для трансляции, после чего следовало смешивание переворачиванием при комнатной температуре в течение 45 минут. Супернатант удаляли, после чего следовало промывание четыре раза в TBS+0,05% tween-20, один раз в TBS и один раз чистой водой. Впоследствии ReverTra Ace (производства Toyobo Co., Ltd.), 5× RT буфер (производства Toyobo Co., Ltd.) и 1 ммоль/л dNTP добавляли в в раствор бус, который затем инкубировали при 30°C в течение 10 минут и 42°C в течение 30 минут для того, чтобы осуществлять обратную транскрипцию для того, чтобы получать 12 мкл раствора комплекса пептид-мРНК.

[0494] 1 мкл вышеуказанных бус добавляли в раствор для ПЦР, содержащий 1 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 20), 1 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 24) и KOD-Multi&Epi- (производства Toyobo Co., Ltd.), после чего следовала ПЦР амплификация кДНК, и ДНК очищали с помощью QIAquick PCR Purification Kit (производства QIAGEN GmbH).

[0495] SEQ ID № 24

ATACTCAAGCTTATTTATTTACCCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTACCGCCAGAACCGCCCTA

[0496] Транскрипция для 2 раунда пэннинга, получение комплекса мРНК-пуромициновый линкер, трансляция, пэннинг, обратная транскрипция и ПЦР

мРНК синтезировали из кДНК, амплифицированной в раунде 1, используя РНК полимеразу Thermo T7 (производства Toyobo Co., Ltd.), и очищали с помощью RNeady MinElute Cleanup Kit (производства QIAGEN GmbH). Затем пуромициновый линкер B (структура представлена в абзаце [0487]) добавляли в мРНК, после чего следовала реакция в течение 5 минут при 90°C, и температуру реакционного раствора снижали до 25°C. Впоследствии, за УФ облучением на 365 нм в течение 2 минут следовала очистка преципитацией этанолом для того, чтобы получать комплекс мРНК-пуромициновый линкер. Указанные выше 4 мкл раствора для трансляции, содержащего 0,6 мкмоль/л комплекса мРНК-пуромициновый линкер, получали и инкубировали при 37°C в течение 30 минут. 10 мкл ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads (производства Sigma-Aldrich LLC) и TBS добавляли в этот раствор, который затем смешивали посредством переворачивания в течение 10 минут при комнатной температуре, и супернатант повторно извлекали три раза. 10 мкл бус с целевым иммобилизованным белком и TBS добавляли в супернатант, после чего следовало смешивание переворачиванием при комнатной температуре в течение 45 минут. Супернатант удаляли, после чего следовало промывание четыре раза в TBS+0,05% tween-20, один раз в TBS и один раз чистой водой. Впоследствии ReverTra Ace (производства Toyobo Co., Ltd.), 5× RT буфер (производства Toyobo Co., Ltd.) и 1 ммоль/л dNTP добавляли в раствор бус, который затем инкубировали при 30°C в течение 10 минут и 42°C в течение 30 минут для того, чтобы осуществлять обратную транскрипцию для того, чтобы получать 12 мкл раствора комплекса пептид-мРНК.

[0497] 1 мкл вышеуказанных бус добавляли в раствор для ПЦР, содержащий 1 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 20), 1 мкмоль/л праймера (SEQ ID № 24) и KOD-Multi&Epi- (производства Toyobo Co., Ltd.), после чего следовала ПЦР амплификация кДНК, и ДНК очищали с помощью QIAquick PCR Purification Kit (производства QIAGEN GmbH).

Ту же операцию, как в 2 раунде, повторяли в 3 раунде и 4 раунде для того, чтобы обогащать кДНК, демонстрирующую специфическое связывание целевого белка. Анализ последовательности обогащенного пула ДНК осуществляли для того, чтобы идентифицировать обогащенную пептидную последовательность.

[0498] Химический синтез обогащенной пептидной последовательности

Синтез циклического пептида a-6-1

[0499] Твердофазный синтез пептидов осуществляли с использованием 104 мг Rink Amide-ChemMatrix (0,48 ммоль/г) в качестве исходного материала. Конденсацию осуществляли в порядке 2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропановая кислота, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-O-(т-бутил)-L-треонин (Fmoc-Thr(tBu)-OH), Fmoc-Pro-OH, сложный β-т-бутиловый эфир N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-L-аспарагиновой кислоты (Fmoc-Asp(OtBu)-OH), Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, сложный γ-т-бутиловый эфир N-α-(9-флуоренилметоксикарбонил)-L-глутаминовой кислоты (Fmoc-Glu(tBu)-OH) и Boc-Cys(Trt)-OH. Смолу промывали дихлорметаном и затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. TFA:3,6-диокса-1,8-октандитиол:триизопропилсилан:воду (= 92,5:2,5:2,5:2,5, 3,0 мл) добавляли в реакционный раствор для того, чтобы осуществлять отщепление и снятие защитных групп пептида. Через 2 часа, смолу отфильтровывали, и н-гексан:простой метил-т-бутиловый эфир (= 1:1, 12 мл) добавляли в фильтрат для того, чтобы получать твердое вещество. После центрифугирования для осаждения твердого вещества, удаляли супернатант. После промывания твердого вещества простым метил-т-бутиловым эфиром, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Фосфатный буфер (pH 7,0, 5 мл), метанол (5 мл) и водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (0,5 моль/л, 0,1 мл) добавляли в получаемое твердое вещество, после чего следовала реакция в течение 48 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и получаемый остаток очищали посредством HPLC (0,1% водный раствор муравьиной кислоты/0,1% ацетонитриловый раствор муравьиной кислоты) и затем корректировали до нейтрального pH посредством добавления раствора гидрокарбоната триэтиламмония (1,0 моль/л, pH 8,5). Растворитель отгоняли при пониженном давлении для того, чтобы получать 7,6 мг циклического пептида a-6-1 в виде твердого вещества белого цвета.

MS(ESI m/z): 1993,3(M+H)

RT (мин): 1,10

[0500] Циклические пептиды, представленные в таблице 52 далее, получали аналогично синтезу циклического пептида a-6-1.

[0501] [Таблица 52-1]

№ циклического пептида	Структура	Наблюдаем. MS	RT/мин
a-6-2		1795,3 (M-H)	0,82
a-6-3		1778,4	0,88
a-6-4		1627,8	0,74
a-6-5		1711,4	0,79
a-6-6		1644,7 (M-H)	0,89

[Таблица 52-2]

a-6-7

1736,3 (M-H)

1,02

[0502] Идентификация места замыкания кольца в a-6-7

[0503] Поскольку a-6-7 содержит 2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-(5-цианотиофен-3-ил)пропановую кислоту, которая является местом замыкания кольца, в двух точках, расщепление трипсином осуществляли для того, чтобы определять его структуру. Раствор трипсина (0,01 мг) (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в гидрокарбонате триэтиламмония (50 ммоль/л, pH 8,5, 95 мкл) добавляли в DMSO раствор (20 мМ, 5 мкл) a-6-7, после чего оставляли стоять при 37°C в течение 2 часов. Реакционный раствор анализировали посредством LC/MS, и наблюдали MS двух типов 1015,1 и 736,1, которые подтверждали, что местом замыкания кольца была аминокислота в 5-м остатке с N-конца.

[0504] Получение целевого белка

Целевой белок получали аналогичным образом как описано выше.

[0505] Оценка связывания синтетического пептида с целевым белком с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Связывание синтетического пептида с целевым белком оценивали аналогичным образом, как описано выше. Полученная KD представлена в следующей таблице.

То, что имеет KD меньше 50 мкмоль/л, обозначают как A, и то, что имеет KD 50 мкмоль/л или больше, обозначают как B.

[0506] [Таблица 53]

№ соединения	Результат оценки связывания
a-6-1	A
a-6-2	B
a-6-3	B
a-6-4	A
a-6-5	A
a-6-6	A
a-6-7	A

[0507] Циклический пептид, получаемый с помощью способа получения и способа отбора в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения используют в качестве активного ингредиента в фармацевтических средствах, сельскохозяйственных химических средства, реактивах для биохимических лабораторий, добавках для клеточных культур, косметике и функциональных продуктах питания, а также можно использовать в качестве адсорбента/разделяющего средства, используемого в фильтрах и колоночной хроматографии. Циклический пептид, получаемый с помощью способа получения и способа отбора в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения также можно использовать в качестве катализатора для содействия реакции синтеза, дисперсанта для мелкодисперсных твердых пигментов и наночастиц и гелеобразующего средства для водного раствора.

[Список последовательностей]

Международная заявка № 17F02646 согласно Patent Cooperation Treaty - PEPTIDE COMPOUND AND METHOD FOR PRODUCING, JP18011143 20180320----03370483151800582611 Normal 20180320163216201803071101443430_P1AP101__17_326.app

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> FUJIFILM Corporation

<120> ПЕПТИДНОЕ СОЕДИНЕНИЕ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СКРИНИНГОВОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ И СПОСОБ ОТБОРА ПЕПТИДНОГО СОЕДИНЕНИЯ

<130>Ѓ@17F02646

<160> 24

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 169

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 1

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcaaacagaa accgcggagc aaaaactaga 120

gcgactacaa agacgatgac gacaaataag cttgagtatt ctatagtgt 169

<210> 2

<211> 169

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 2

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcaaatgcaa accgcggagc aaaaactaga 120

gcgactacaa agacgatgac gacaaataag cttgagtatt ctatagtgt 169

<210> 3

<211> 169

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 3

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcaaacagaa accgcggtgc aaaaactaga 120

gcgactacaa agacgatgac gacaaataag cttgagtatt ctatagtgt 169

<210> 4

<211> 169

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 4

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcgcgcaggc gccgcggagc gcgaactaga 120

gcgactacaa agacgatgac gacaaataag cttgagtatt ctatagtgt 169

<210> 5

<211> 166

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 5

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcaaacagaa accgcggagc aaatagagcg 120

actacaaaga cgatgacgac aaataagctt gagtattcta tagtgt 166

<210> 6

<211> 163

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 6

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcaaacagaa accgcggagc tagagcgact 120

acaaagacga tgacgacaaa taagcttgag tattctatag tgt 163

<210> 7

<211> 160

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 7

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcaaacagaa accgcggtag agcgactaca 120

aagacgatga cgacaaataa gcttgagtat tctatagtgt 160

<210> 8

<211> 157

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 8

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcaaacagaa accgtagagc gactacaaag 120

acgatgacga caaataagct tgagtattct atagtgt 157

<210> 9

<211> 154

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 9

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcaaacagaa atagagcgac tacaaagacg 120

atgacgacaa ataagcttga gtattctata gtgt 154

<210> 10

<211> 184

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 10

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcaaacagaa accgcggagc aaaaacccgt 120

tttggtgcca ttagagcgac tacaaagacg atgacgacaa ataagcttga gtattctata 180

gtgt 184

<210> 11

<211> 199

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 11

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcaaacagaa accgcggagc aaaaaccaga 120

aacggaacag cccgttttgg tgccattaga gcgactacaa agacgatgac gacaaataag 180

cttgagtatt ctatagtgt 199

<210> 12

<211> 169

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 12

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gccagaaact ggtgttcttt gcggaataga 120

gcgactacaa agacgatgac gacaaataag cttgagtatt ctatagtgt 169

<210> 13

<211> 169

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 13

cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg 60

tttaacttta agaaggagat atacatatgt gcgcgatcat tggcctgtgc gtgggctaga 120

gcgactacaa agacgatgac gacaaataag cttgagtatt ctatagtgt 169

<210> 14

<211> 75

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ген тРНК

<400> 14

gggagaguag uucaauggua gaacgucggu cucuaaaacc gagcguugag gguucgauuc 60

cuuucucucc cacca 75

<210> 15

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид

<400> 15

aagaaggaga tatacatatg tgcnnknnkn nknnknnknn knnknnknnk nnknnknnkn 60

nktagggcgg ttctggcggt agc 83

<210> 16

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид

<400> 16

atactcaagc ttatttattt accccccgcc gccccccgtc ctgctaccgc cagaaccgcc 60

<210> 17

<211> 88

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид

<400> 17

gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60

ttaactttaa gaaggagata tacatatg 88

<210> 18

<211> 193

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: ДНК, полученная с помощью ПЦР

<400> 18

gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60

ttaactttaa gaaggagata tacatatgtg cnnknnknnk nnknnknnkn nknnknnknn 120

knnknnknnk tagggcggtt ctggcggtag caggacgggg ggcggcgggg ggtaaataaa 180

taagcttgag tat 193

<210> 19

<211> 171

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: мРНК, полученная с помощью РНК-полимеразы

<400> 19

gggagaccac aacgguuucc cucuagaaau aauuuuguuu aacuuuaaga aggagauaua 60

cauaugugcn nknnknnknn knnknnknnk nnknnknnkn nknnknnkua gggcgguucu 120

ggcgguagca ggacgggggg cggcgggggg uaaauaaaua agcuugagua u 171

<210> 20

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид

<400> 20

gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctc 45

<210> 21

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид

<400> 21

atactcaagc ttatttattt accccccgcc gccccccgtc c 41

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид

<400> 22

gaaattaata cgactcacta 20

<210> 23

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид

<400> 23

atactcaagc ttatttattt 20

<210> 24

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид

<400> 24

atactcaagc ttatttattt accccccgcc gccccccgtc ctgctaccgc cagaaccgcc 60

cta 63

<---

1. Пептидное соединение, представленное формулой (1), или его соль:

в формуле X представляет S;

A представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, представляющий собой С1-6 алкильную группу;

B представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, представляющий собой С1-6 алкильную группу, при условии, что A и B одновременно не представляют собой одинарную связь;

Z представляет гидроксильную группу или аминогруппу;

фрагменты p из R могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель, выбранный из атома галогена, нитро, С1-6 алкильной группы и С1-6 алкоксигруппы;

G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода;

фрагменты t¹ из W¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, –CH₂(C₆H₅NH)–, –CH₂(C₆H₅O)–, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

фрагменты t² из W² могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, –CO–, –COO–, –NHCO–, –NHCONH–, –CONHCO–, –(CH₂CH₂O)–, –(CH₂CH₂CH₂O)–, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

J представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода;

каждый фрагмент n из Xaa независимо представляет любой аминокислотный остаток или любой остаток аналога аминокислоты;

каждый фрагмент m из Xbb независимо представляет любой аминокислотный остаток или любой остаток аналога аминокислоты;

p представляет целое от 0 до 4;

t¹ представляет целое от 0 до 6;

t² представляет целое от 0 до 6;

m представляет целое от 0 до 20; и

n представляет целое от 1 до 20.

2. Пептидное соединение, представленное формулой (1A), или его соль:

в формуле A¹ представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, представляющий собой С1-6 алкильную группу;

фрагменты p¹ из R¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель, выбранный из атома галогена, нитро, С1-6 алкильной группы и С1-6 алкоксигруппы;

фрагменты t¹¹ из W¹¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга, и каждый представляет одинарную связь, –CH₂(C₆H₅NH)–, –CH₂(C₆H₅O)–, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

фрагменты t²¹ из W²¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, –CO–, –COO–, –NHCO–, –NHCONH–, –CONHCO–, –(CH₂CH₂O)–, –(CH₂CH₂CH₂O)–, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

G¹ представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода;

J¹ представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода;

p¹ представляет целое от 0 до 4;

t¹¹ представляет целое от 0 до 6;

t²¹ представляет целое от 0 до 6; и

Z, Xaa, Xbb, m и n имеют то же значение, что и определение в п. 1.

3. Пептидное соединение, представленное формулой (1B), или его соль:

в формуле A² представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, представляющий собой С1-6 алкильную группу;

G² представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода;

J² представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода;

фрагменты p² из R² могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, или ариленовую группу, имеющую от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель, выбранный из атома галогена, нитро, С1-6 алкильной группы и С1-6 алкоксигруппы;

p² представляет целое от 0 до 4;

q² представляет целое от 0 до 6, при условии что p² и q² одновременно не представляют собой 0; и

Z, Xaa, Xbb, m и n имеют то же значение, что и определение в п. 1.

4. Пептидное соединение или его соль по любому из пп. 1-3, в котором R, R¹ или R² представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензооксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензоимидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, бензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, изобензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изохинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хиназолиленовой группы, которая может иметь заместитель, циннолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изоксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, фураниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирроленовой группы, которая может иметь заместитель, фениленовой группы, которая может иметь заместитель, и нафтиленовой группы, которая может иметь заместитель, где заместитель выбран из атома галогена, нитро, С1-6 алкильной группы и С1-6 алкоксигруппы.

5. Пептидное соединение или его соль по любому из пп. 1-4, где R, R¹ или R² представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, и фениленовой группы, которая может иметь заместитель, где заместитель выбран из атома галогена, нитро, С1-6 алкильной группы и С1-6 алкоксигруппы.

6. Пептидное соединение или его соль по любому из пп. 1-5, в котором общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих циклическую часть пептидного соединения, составляет от 3 до 20.

7. Пептидное соединение или его соль по любому из пп. 1-6, в котором общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих пептидное соединение, составляет от 3 до 20.

8. Пептидное соединение или его соль по любому из пп. 1-7, где Xaa представляет собой остаток α-аминокислоты.

9. Пептидное соединение или его соль по любому из пп. 1-8, где Xaa представляет собой остаток природной аминокислоты.

10. Пептидное соединение или его соль по любому из пп. 1-9, где р, р¹ или р² равны 1.

11. Композиция для скринингового использования, которая содержит

пептидное соединение или его соль по любому из пп. 1-10.

12. Способ отбора пептидного соединения или его соли, которые связываются с целевым веществом, который включает

приведение целевого вещества в контакт с библиотекой пептидов, содержащей пептидное соединение или его соль по любому из пп. 1-10, чтобы отбирать пептидное соединение или его соль, которое связывается с целевым веществом.

13. Способ получения пептидного соединения или его соли по любому из пп. 1-10, который включает:

стадию получения пептидной цепи, имеющей аминокислотный остаток или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи в пептидной цепи или на C–конце, и имеющей структуру формулы (2) на N–конце; и

стадию проведения реакции цианогруппы со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать циклическую часть, имеющую связь, представленную формулой (3):

в формуле X представляет S;

A представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, представляющий собой С1-6 алкильную группу;

B представляет одинарную связь или линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, представляющий собой С1-6 алкильную группу;

G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода;

* представляет место связывания с пептидной цепью; и

A и B одновременно не представляют собой одинарную связь;

в формуле X, A, G и B имеют то же значение, что и определение в формуле (2).

14. Способ отбора пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом, который включает:

стадию получения пептидного соединения, имеющего циклическую часть, с помощью способа по п. 13; и

стадию приведения целевого вещества в контакт с библиотекой пептидов, содержащей пептидное соединение или его соль, чтобы отбирать пептидное соединение или его соль, которое связывается с целевым веществом.

15. Способ отбора по п. 14, который включает следующие стадии:

(i) стадию получения библиотеки нуклеиновых кислот, выполнения трансляции посредством бесклеточной системы трансляции, содержащей элонгирующую тРНК, ацилированную с не природной аминокислотой, и получения библиотеки, содержащей пептидное соединение, где не природную аминокислоту случайно встраивают в пептидную последовательность;

(ii) стадию приведения библиотеки пептидов в контакт с целевым веществом; и

(iii) стадию отбора пептидного соединения, которое связывается с целевым веществом,

на стадии (i) каждое пептидное соединение, образующее библиотеку, транслируют с последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей каждое пептидное соединение, образующее библиотеку, и последовательность нуклеиновой кислоты и пептид в качестве продукта ее трансляции связывают для того, чтобы конструировать библиотеку дисплея in vitro, и

стадия (iii) включает определение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептидное соединение, которое связывается с целевым веществом, определение пептидной последовательности по последовательности нуклеиновой кислоты и отбор пептидного соединения.

16. Способ по любому из пп. 13-15, в котором аминокислотный остаток и/или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи, представляет собой структуру, представленную формулой (4)

в формуле фрагменты m¹ из Q¹ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и представляют по меньшей мере одно из гетероариленовой группы, которая может иметь заместитель, ариленовой группы, имеющей от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовой группы, имеющей от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

T¹ представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель, представляющий собой С1-6 алкильную группу;

n¹ представляет целое от 0 до 6, и m¹ представляет целое от 1 до 4; и

* представляет положение связывания с аминокислотным остатком и/или остатком аналога аминокислоты, образующим пептидную цепь.

17. Способ по любому из пп. 13-15, в котором аминокислотный остаток и/или остаток аналога аминокислоты, имеющий цианогруппу в боковой цепи, представляет собой структуру, представленную формулой (5)

в формуле фрагменты l² из Q² могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, –CH₂(C₆H₅NH)–, –CH₂(C₆H₅O)–, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

фрагменты n² из Q³ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и каждый представляет одинарную связь, –CO–, –COO–, –NHCO–, –NHCONH–, –CONHCO–, –(CH₂CH₂O)–, –(CH₂CH₂CH₂O)–, аминокислотный остаток, который может иметь заместитель, гетероариленовую группу, которая может иметь заместитель, ариленовую группу, имеющую от 6 до 20 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовую группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

фрагменты m² из Q⁴ могут представлять собой одно и то же или отличное друг от друга и представлять по меньшей мере одно из гетероариленовой группы, которая может иметь заместитель, ариленовой группы, имеющей от 6 до 10 атомов углерода, которая может иметь заместитель, или алкиленовой группы, имеющей от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

T² представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель;

l² представляет целое от 0 до 6;

n² представляет целое от 0 до 6;

m² представляет целое от 1 до 4; и

* представляет положение связывания с аминокислотным остатком и/или остатком аналога аминокислоты, образующим пептидную цепь.

18. Способ по п. 16 или 17, в котором Q¹ или Q⁴ представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензооксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензоимидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, бензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, изобензофураниленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изохинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хиназолиленовой группы, которая может иметь заместитель, циннолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, бензотиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиадиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолиленовой группы, которая может иметь заместитель, изоксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазотиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразолопиримидиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, фураниленовой группы, которая может иметь заместитель, пирроленовой группы, которая может иметь заместитель, фениленовой группы, которая может иметь заместитель, и нафтиленовой группы, которая может иметь заместитель.

19. Способ по любому из пп. 16-18, в котором Q¹ или Q⁴ представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из бензотиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, индолиленовой группы, которая может иметь заместитель, хинолиленовой группы, которая может иметь заместитель, индазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, пирролопиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, имидазопиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиридазиниленовой группы, которая может иметь заместитель, пиразиниленовой группы, которая может иметь заместитель, тиазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, оксазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, триазолиленовой группы, которая может иметь заместитель, тиофениленовой группы, которая может иметь заместитель, и фениленовой группы, которая может иметь заместитель.

20. Способ по любому из пп. 13-19, где формула (2) представляет собой структуру, представленную формулой (2A)

в формуле A¹ представляет линейную алкиленовую группу, имеющую 1 или 2 атома углерода, которая может иметь заместитель, представляющий собой С1-6 алкильную группу; и

G представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, которая может иметь заместитель, представляющий собой С1-6 алкильную группу.

21. Способ по любому из пп. 13-20, где формула (2) представляет собой по меньшей мере одну структуру, выбранную из следующих формул:

22. Способ по любому из пп. 13-21, в котором растворитель реакции на стадии проведения реакции цианогруппы со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать связь, представленную формулой (3), представляет собой воду.

23. Способ по любому из пп. 13-22, в котором pH реакционного раствора на стадии проведения реакции цианогруппы со структурой формулы (2) для того, чтобы формировать связь, представленную формулой (3), составляет от 6,0 до 8,5.

24. Способ по любому из пп. 13-22, в котором общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих циклическую часть пептидного соединения, имеющего циклическую часть, составляет от 3 до 20.

25. Способ по любому из пп. 13-24, в котором общее число аминокислотных остатков и остатков аналогов аминокислот, образующих пептидное соединение, имеющее циклическую часть, составляет от 3 до 20.

26. Способ по любому из пп. 13-25, в котором аминокислотные остатки или остатки аналогов аминокислот, имеющие гетероариленовую группу, имеющую цианогруппу, ариленовую группу, имеющую цианогруппу, или алкиленовую группу, имеющую цианогруппу, в боковой цепи встраивают в пептидную цепь с использованием кодонов, которые делают пустыми кодонами посредством исключения природных аминокислот из кодонов, отведенных для трансляции природных аминокислот, терминирующих кодонов или кодонов из четырех оснований.