Способ получения альфа-фетопротеина, иммобилизованного на пэт-микрочастицах

Изобретение относится к области биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к реагенту на основе альфа-фетопротеина, иммобилизованного на поверхности твердых микрочастиц полиэтилентерефталата (ПЭТ-микрочастицы), а также к способу сайт-специфичной ковалентной иммобилизации альфа-фетопротеина на поверхности функционализованных ПЭТ-микрочастиц за гликозидный фрагмент белка. 2 н.п. ф-лы, 11 пр., 1 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к реагенту на основе альфа-фетопротеина, иммобилизованного на поверхности твердых микрочастиц полиэтилентерефталата, а также к способу сайт-специфичной ковалентной иммобилизации альфа-фетопротеина через гидрофильный спейсер на поверхности функционализованных ПЭТ-микрочастиц за гликозидный фрагмент белка.

Уровень техники, к которой относится изобретение

Иммобилизация протеинов, а также других биомолекул на твердых носителях является неотъемлемой составной частью многих методик в области молекулярной биологии и биотехнологии. Для иммобилизации биомолекул предложены различные методы, основанные на физической сорбции и ковалентном связывании с твердым носителем.

Авторами патента [1] предложена иммобилизация протеинов на носитель сорбционным методом. Протеин, связывающийся с функциональными биомолекулами, адсорбирован на твердый носитель, при этом не связан с ним ковалентно.

Для ковалентной иммобилизации белков на твердый полимерный носитель обычно используют реакцию между поверхностными первичными аминогруппами лизина и орнитина, входящими в полипептидную цепь белка и активными группами функционализованного полимерного носителя с образованием амидной (пептидной) связи. У носителя чаще всего используются активированные карбоксильные, иногда изоцианатные или изотиоцианатные группы [2]. Однако иммобилизация белка на носитель не сайтспецифичная.

В патенте [3] заявлена иммобилизация антител, специфичных к рицину, на полимерных микросферах MapPlex с поверхностными карбоксильными группами при помощи водорастворимого карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида. Антитела с микросферами связываются поверхностными аминогруппами, при этом иммобилизация антител на носитель не сайтспецифичная. Для увеличения специфичности ориентации молекулы белка относительно поверхности носителя предлагается в рекомбинантные антитела, при их получении геннно-инженерным методом, по С-концу полипептидной цепи белка дополнительно вводить аминокислоту лизин.

Обычно на поверхности белка находится несколько десятков химически-доступных аминогрупп, по каждой из которых может происходить иммобилизация на поверхность твердого носителя. Иммобилизация по связыванию с поверхностными аминогруппами белка происходит статистически гетерогенно. Разные молекулы белка связываются разными аминогруппами, а иногда и несколькими аминогруппами одновременно. Аминогруппы, входящие в соста лизина и орнитина, часто входят в состав эпитопов (антигенных детерминант) данного белка. При иммобилизации за аминогруппы некоторые эпитопы белка утрачивают свои антигенные свойства. Непосредственное связывание поверхностных аминогупп, входящих в состав полипептидной цепи белка, с твердой функционализованной поверхностью полимерного носителя приводит к дополнительной стерической (пространственной) недоступности некоторых антигенных детерминант белка. В результате иммобилизованные белки становятся антигенно-гетерогенными и антигенно менее валентными.

Для ковалентной иммобилизации гликозидов, полисахаридов на твердый носитель проводят их функционализацию, а затем связывают с функционализованым твердым носителем. В патенте [2] гликозиды превращали в гликозилгидразоны обработкой гидразином. В результате у гликозидов появлялась реакционноспособная аминогруппа, которую использовали для связывания с полимерным функционализованным носителем, содержащим фенилизотиоцианатные группы.

Для гликопротеинов, то есть белков, в состав которых входят гликозидные, полисахаридные, фрагменты предложены методы иммобилизации за углеводный фрагмент без затрагивания антигенных детерминант белковой части гликопротеина. Гликановую часть гликопротеина предварительно функционализуют. Окисление периодатом натрия позволяет селективно получить альдегидные группы в гликановой части без денатурации белковой части. В публикации [4] предложена сайт-специфичная иммобилизация антител за их гликановые группы на твердые функционализованные полисахаридные и силикагелевые носители для целей аффинной хроматографии.

Авторами патента [5] представлен способ сайт-специфической иммобилизации человеческого альфа1-кислого гликопротеина (1-AGP) на твердый носитель, представляющий собой функционализованный силикагель для целей хиральной аффинной хроматографии. На поверхность силикагеля с помощью эпоксисилана прививали эпоксидные группы, затем их гидролизовали до диольных групп, окисляли периодной кислотой до альдегидныъх групп, реакцией с гидразином получали гидразоны, а их в свою очередь восстанавливали боргидридом натрия до связанного с силикагелем гидразина. В итоге получали силикагель, на поверхности которого находятся активные гидразиновые группы. Человеческий альфа1-кислый гликопротеин (1-AGP) получали из объединенных сывороток, и он содержал 44% F-варианта 1-AGP, 29% S-варианта и 27% А-варианта. Углеводную часть гликопротеина окисляли периодной кислотой, и получали гликопротеин 1-AGP с альдегидными группами в гликановой части. Затем окисленный гликопротеин 1-AGP связывали с силикагелем, несущим гидразиновые группы.

Альфа-фетопротеин, иммобилизованный на твердых микрочастицах ПЭТ, предназначен для получения фрагментов ДНК, аптамеров, функциональных аналогов моноклональных антител. Альфа-фетопротеин (АФП) относится к числу мультифункциональных диагностически-значимых белков человека. Белок появляется в развивающемся эмбрионе млекопитающих и практически исчезает из крови после рождения. Во время эмбрионального развития АФП принимает участие в регуляции роста тканей, формирования и развития частей тела и систем организма, включая нервную, сердечно-сосудистую, репродуктивную и др. При различных формах канцерогенеза наблюдается гиперэкспрессия ряда факторов роста, их рецепторов и/или белков, опосредующих внутриклеточную передачу сигнала, что обычно характерно для онкофетальных белков. Установлено, что он появляется в крови взрослых особей при развитии рака печени и репродуктивных органов. [6]. Поэтому альфа-фетопротеин является важным диагностическим маркером наличия онкологических заболеваний человека.

Альфа-фетопротеин не экспрессирован на поверхности нормальных соматических клеток, но встречается на мембранах опухолевых клеток. Уровень экспрессии рецептора АФП в непролиферирующих клетках очень низок, в то время как на поверхности опухолевых клеток различного происхождения определяется от нескольких сотен до миллиона АФП-рецепторов на клетку [7]. Поэтому рецепторный, то есть находящийся на поверхности клеток, альфа-фетопротеин является маркером опухолевых клеток, а также мишенью для направленного транспорта лекарственных препаратов к опухолевым клеткам.

Альфа-фетопротеин содержит 5-6 главных эпитопов, с содержанием менее чем 10-12 аминокислот, которые выявляются моноклональными антителами [8].

Эмбриональный, фетальный, альфа-фетопротеин является гликопротеином с молекулярной массой 69 килодальтон, состит из 3-х пептидных доменов с общим содержанием 590 аминокислотных фрагментов, включает 1 гликозидный сайт с общим содержанием углеводов 3.0-5.0% [9].

При иммобилизации белка на твердом носителе должны сохраняться структурно-функциональные эпитопы (антигенной детерминанты), которые обеспечивают специфическое связывание нативного белка с соответствующими моноклональными антителами. Эти же эпитопы нужны и для специфического взаимодействия с последовательностями из ДНК-библиотеки в ходе процедур селекции аптамеров. В случае применения химически агрессивных методов иммобилизации, приводящих к частичной денатурации белка, доступными остаются только линейные, сиквенциальные, эпитопы [10].

Короткие однонитевые фрагменты нуклеиновых кислот, способные специфически распознавать белки и другие молекулярные мишени, получили название «аптамеры». Аптамеры получают экспериментальным отбором, из ДНК-библиотек по параметру специфического связывания с молекулярной мишенью. Применяется метод экспоненциального обогащения, основанный на применении различных подходов ферментативной амплификации обогащенных библиотек олигонуклеотидов [11]. Аптамеры, по характеру взаимодействия с белковой мишенью, аналогичны моноклональным антителам, хотя относятся к другому классу химических соединений. Процедура SELEX, селекции, включает специфический отбор (экстракцию) белковой мишенью однонитевых фрагментов ДНК из множества последовательностей нуклеотидов (ДНК-библиотеки). Процедура отделения белковых молекул со связавшимися с ними олигонуклеотидами эффективно выполняется, если белковые молекулы иммобилизованы на микрочастицах твердого носителя. Твердые микрочастицы со связавшимися олигонуклеотидами можно отмыть от не связавшихся олигонуклеотидов. Тип твердых микрочастиц и способ иммобилизации оказывают существенное влияние на процедуру и результаты селекции нуклеиновых кислот по связыванию с молекулярной белковой мишенью.

Аптамеры к альфа-фетопротеину, как функциональные аналоги моноклональных антител, представляют значительный практический интерес и могут использоваться как замена моноклональных антител в областях, традиционно использующих антитела. Аптамеры к альфа-фетопротеину, будучи устойчивыми к действию протеаз, могут использоваться в терапевтических целях и различных сенсорных системах и устройствах.

Для проведения успешной процедуры SELEX необходима иммобилизация альфа-фетопротеина на микрочастицы носителя, обеспечивающая максимальную доступность олигонуклеотидов к антигенным детерминантам и их максимальную сохранносить. При выполнении процедуры селекции олигонуклеотидов на антигенно гетерогенный иммобилизованный белок будет заведомо сложно получить олигонуклеотиды специфично связывающиеся с нативным белком.

Заявляемое изобретение отличается от вышеописанных аналогов тем, что для получения реагента на основе альфа-фетопротеина, иммобилизованного на твердых микрочастицах, используется сайт-специфичная ковалентная иммобилизация за гликозидный фрагмент. Связывание с носителем происходит через гидрофильный спейсер протяженностью 13 атомов. В качестве носителя используются микрочастицы полимерного материала полиэтилентерефталата (ПЭТ) с функционализованной поверхностью. Альфа-фетопротеин селективно окисляется в мягких условиях периодатом натрия с образованием альдегидных групп в гликозидной части. На поверхности ПЭТ-микрочастиц щелочным гидролизом формируются реакционно-способные карбоксильные групы. После химической активации по карбоксильным группам производится связывание со спенсером, несущим концевую аминогруппу. Полученные таким образом ПЭТ-микрочастицы через аминогруппу связываются с альдегидными группами альфа-фетопротеина.

Раскрытие изобретения

В данном изобретении реализована сайт-специфическая ковалентная иммобилизация альфа-фетопротеина на поверхности твердых полиэтилентерефталатных микрочастиц через гидрофильный спейсер. Полиэтилентерефталат представляет собой продукт линейной поликонденсации терефталевой кислоты и этиленгликоля, содержит сложноэфирные группы, которые в результате щелочного гидролиза могут быть трансформированы в реакционно-способные карбоксильные группы. Карбоксильные группы могут быть использованы для ковалентного связывания с биомолекулами, имеющими первичные аминогруппы [12].

В заявляемом изобретении предложен щелочной гидролиз поверхности ПЭТ-микрочастиц с образованием поверхностных карбоксильных групп (Схема 1). Для контроля удельной концентрации карбоксильных групп их предварительно активировали бис-(4-нитрофенил)карбонатом и обрабатывали аминосодержащим индодикарбоцианиновым красителем.

Для получения гидрофильных линкеров на поверхности ПЭТ-микрочастиц поверхностные активированные карбоксильные группы связывали с 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамином. В результате такой обработки поверхность ПЭТ-микрочастиц приобретала иммобилизованные спейсеры, содержащие первичную аминогруппу (Схема 2). Для контроля удельной концентрации аминогрупп поверхность обрабатывали активированным производным индодикарбоцианинового красителя.

Для функционализации альфа-фетопротеина проводили его селективное окисление периодатом натрия в мягких условиях с образованием альдегидных групп в гликозидной части (Фиг. 3). Контроль функциональных свойств окисленного альфа-фетопротеина проводили иммуноферментным методом, с использованием набора АФП-ИФА (Хема, www.xema-medica.com) в соответствии с инструкцией производителя. В методе ИФА моноклональные антитела, маркированые пероксидазой хрена, связываются с антигеными детерминантами окисленного альфа-фетопротеина. Для подтверждения функциональных свойств исходного альфа-фетопротеина и работоспособности набора АФП-ИФА дополнительно провели контроль концентрации альфа-фетопротеина в коммерческом препарате. Измеренная и расчетная концентрация альфа-фетопротеина в пределах погрешности совпали, что свидетельствует о достоверности данных, получаемых с помощью набора АФП-ИФА.

Связывание альфа-фетопротеина, содержащего в своей структуре альдегидные группы в гликозидной части, с ПЭТ-микрочастицами, имеющими на своей поверхности гидрофильный линкер с концевой аминогруппой, проводили по реакции Шиффа в натрий карбонатном буферном растворе при рН 9.5. Азометиновую связь, образовавшуюся в результате реакции, восстанавливали боргидридом натрия (Схема 3). Контроль функциональных свойств альфа-фетопротеина, иммобилизованного на поверхности ПЭТ-микрочастиц, проводили иммуноферментным методом анализа с использованием набора АФП-ИФА. Результаты контроля свидетельствуют о наличии функционального альфа-фетопротеина, иммобилизованного на поверхности ПЭТ-микрочастиц.

Краткое описание схем

Схема 1. Схема химической функционализации, карбоксилирования, поверхности ПЭТ-микрочастиц и связывания с аминосодержащим красителем.

Схема 2. Схема химической функционализации поверхности ПЭТ-микрочастиц, аминирования, и связывания с активированным карбоксил содержащим красителем.

Схема 3. Схема периодатного окисления альфа-фетопротеина и связывания с аминированными ПЭТ-микрочастицами.

Осуществление изобретения

Для осуществления изобретения важную роль играет подготовка коммерчески-доступного порошкообразного полиэтилентерефталата. С помощью сит высевали фракцию ПЭТ микрочастиц диаметром 40-63 мкм. Методом седиментации в воде отделяли мелкие пылевидные частицы. Микрочастицы ПЭТ промывали ацетоном с центрифугированием и высушивали в вакуум-эксикаторе. Получали мелкодисперсный полиэтилентерефталат с размером частиц 40-63 мкм, свободный от мелких пылевидных частиц.

Карбоксилированные ПЭТ-микрочастицы получали действием спиртового раствора гидроксида калия (Схема 1). При деструкции полиэтилентерефталата происходит разрыв сложноэфирных связей макромолекул с образованием на поверхности полимера карбоксильных и гидроксильных групп. Последующую активацию карбоксильных групп на поверхности ПЭТ-микрочастиц проводили в ДМСО при действии бис-(4-нитрофенил)карбоната в присутствии диизопропилэтиламина (DIPEA). Реакцию активации проводят в течение 16 ч при комнатной температуре.

Для определения концентрации 4-нитрофенилоксикарбонильных групп на поверхности ПЭТ-микрочастиц использовали флуоресцентное маркирование при помощи аминосодержащего индодикарбоцианинового красителя, флуоресцирующего в ближней ИК-области спектра. Реакцию конденсации активных 4-нитрофенилоксикарбонильных групп ПЭТ-микрочастиц и цианинового красителя осуществляли в ДМСО в присутствии DIPEA. Спектрофотометрически определяли количество красителя, связавшегося с карбоксильными группами ПЭТ-микрочастиц, путем определения концентрации раствора до и после проведения реакции. Удельная концентрация 4-нитрофенилоксикарбонильных групп составила 0.60 наномоль на 1 мг ПЭТ-микрочастиц.

Для получения гидрофильных линкеров с первичной аминогруппой на ПЭТ-микрочастицах проводили обработку поверхностных 4-нитрофенилоксикарбонильных групп раствором 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамином в ДМСО в присутствии DIPEA (Схема 2). Для контроля удельной концентрации аминогрупп использовали флуоресцентное маркирование при помощи активированного производного индодикарбоцианинового красителя. Реакцию конденсации аминогрупп ПЭТ-микрочастиц и цианинового красителя осуществляли в ДМСО в присутствии DIPEA. Спектрофотометрически определяли количество красителя, связавшегося с аминогруппами ПЭТ-микрочастиц, путем определения концентрации раствора до и после проведения реакции. Удельная концентрация 4-нитрофенилоксикарбонильных групп составила 0.51 наномоль на 1 мг ПЭТ-микрочастиц.

Для проведения иммобилизации альфа-фетопротеина на аминированную поверхность ПЭТ-микрочастиц проводили его селективное окисление при помощи периодата натрия с образованием альдегидных групп в гликозидной части (Схема 3). Контроль функциональных свойств окисленного альфа-фетопротеина проводили иммуноферментным методом с использованием набора АФП-ИФА в соответствии с инструкцией производителя. Измеренная концентрация окисленного АФП составила 450 нг/мл (450 пикомоль/мкл) и в полной мере совпала с расчетным значением (500 нг/мл).

Иммобилизацию альфа-фетопротеина, содержащего альдегидные группы в гликозидной части, на поверхность ПЭТ-микрочастиц, имеющими на своей поверхности гидрофильный линкер с концевой аминогруппой, осуществляли при помощи реакции Шиффа в натрий карбонатном буферном растворе при рН 9.5 (Схема 3). В результате проведения реакции образовывалась азометиновая связь, которую восстанавливали боргидридом натрия. Контроль функциональных свойств альфа-фетопротеина, иммобилизованного на поверхности ПЭТ-микрочастиц, проводили иммуноферментным методом анализа с использованием набора АФП-ИФА. По результатам проведенного ИФА получают ПЭТ-микрочастицы с удельной концентрацией иммобилизованного альфа-фетопротеина 100 пикомоль (100*10^-12 моль) АФП на 1 мг ПЭТ-микрочастиц.

Примеры соединений и их применение

Использовали полиэтилентерефталат порошкообразный производства Goodfellow Cambridge Ltd, Enghland марки ES306030, каталожный номер 264-007-76 (www.goodfellow.com). Материал натурального цвета с плотностью 1.39 г/см³, полидисперсный с максимальным размером микрочастиц 300 микрон.

Использован альфа-фетопротеин (LEE Biosolution (www.leebio.com) No 105-11-1, 1 мг (2.0 мг/мл, трис- буфер, солевой, рН 7.5).

Аминосодержащий индодикарбоцианиновый краситель синтезировали по схеме, представленной в публикации [12].

Активное (4-нитрофенилоксикарбонильное) производное индодикарбоцианинового красителя получали согласно методике, представленной в публикации [13].

Использовали 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамин, CAS 4246-51-9, Aldrich No 369519-100G.

Концентрацию АФП проводили методом ИФА с использованием набора АФП-ИФА (Хема, www.xema-medica.com) в соответствии с инструкцией производителя.

Пример 1. Подготовка ПЭТ-микрочастиц.

С помощью сит высевают фракцию ПЭТ-микрочастиц диаметром 40-63 мкм. Методом седиментации в воде отделяют мелкие пылевидные частицы. Микрочастицы ПЭТ промывают ацетоном с центрифугированием, а супернатант удаляют. Высушивают в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅. Получают мелкодисперсный полиэтилентерефталат с размером частиц 40-63 мкм, свободный от мелких пылевидных частиц.

Пример 2. Получение карбоксилированных ПЭТ-микрочастиц.

К навеске ПЭТ-микрочастиц (100 мг) добавляют раствор КОН в 96%-ном этиловом спирте (0.5 М, 1.5 мл) и перемешивают встряхиванием на шейкере (Вортекс) в течение 60 мин. Затем промывают водой, 0.05 М НСl, водой. Высушивают и хранят в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅.

Пример 3. Активация карбоксильных групп на поверхности ПЭТ-микрочастиц.

К карбоксилированным ПЭТ-микрочастицам (100 мг) добавляют 1.5 мл раствора бис-(4-нитрофенил)карбоната (30 нмоль/мкл) и диизопропилэтиламина (60 нмоль/мкл) в ДМСО. Смесь перемешивают встряхиванием на шейкере (Вортекс) при комнатной температуре в течение 16 ч. Осадок отделяют центрифугированием и промывают безводным ацетоном (3×1 мл) с центрифугированием. Высушивают и хранят в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅.

Пример 4. Определение концентрации 4-нитрофенилоксикарбонильных групп на поверхности ПЭТ-микрочастиц.

К навеске ПЭТ-микрочастиц с активными 4-нитрофенилоксикарбонильными группами (100 мг) добавляют 1 мл раствора аминосодержащего красителя (0.1 ммоль/мкл) и диизопропилэтиламина (0.25 ммоль/мкл) в ДМСО. Смесь перемешивают встряхиванием на шейкере (Вортекс) при комнатной температуре в течение 4 ч. Смесь центрифугируют, супернатант отделяют и осадок промывают 50%-ным ацетонитрилом в 50 мМ триэтиламмоний гидрокарбонатном буферном растворе (ТЕАН) (5×100 мкл) с перемешиванием на шейкере (Вортекс) и центрифугированием. Супернатант и промывные жидкости объединяют, и добавляют 50%-ный раствор ацетонитрила в 50 мМ ТЕАН до объема 1 мл. Спектрофотометрически определяют концентрацию красителя. Для этого 60 мкл раствора добавляют к 3 мл 50%-ного ацетонитрила в 50 мМ ТЕАН. Разбавление в 51 раз. Коэффициент молярной экстинкции аминосодержащего красителя на длине волны 647 нм равен 2.5*10⁵ л*М^-1*см^-1. Измеряют оптическую плотность раствора на длине волны 647 нм. Измеряемая оптическая плотность при длине светового пути 1 см равна 0.196, что соответствует концентрации 0.196*51*1/2.5*10⁵=3.998*10^-5 М/л=0.3998*10^-4 М/л=0.04 мМ.

При измерении исходной концентрации красителя в ДМСО отбирают пробу 30 мкл и добавляют к 3 мл 50%-ного ацетонитрила в 50 мМ ТЕАН. Разбавление 101 раз. Коэффициент молярной экстинкции аминосодержащего красителя на длине волны 647 нм равен 2.5*10⁵ л*М^-1*см^-1. Измеряемая оптическая плотность при длине светового пути 1 см, равна 0.248, что соответствует концентрации 0.248*101*1/2.5*10⁵=10*10^-5 М/л=1*10^-4 М=0.1 мМ.

Количество красителя, связавшегося с ПЭТ-микрочастицами, вычисляют по разности красителя, взятого в реакцию и не связавшегося с ПЭТ-микрочастицами в объеме 1 мл (0.1-0.04) мМ/л*10^-3 л=6*10^-8 м=60 наномоль. Удельная концентрация 4-нитрофенилоксикарбонильных групп 60/100=0.60 наномоль на 1 мг ПЭТ-микрочастиц.

Пример 5. Аминирование поверхности ПЭТ-микрочастиц.

К навеске ПЭТ-микрочастиц с поверхностными 4-нитрофенилоксикарбонильными группами (100 мг) добавляют 0.5 мл раствора 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина (1.0 ммоль/мкл) и диизопропилэтиламина (1.0 ммоль/мкл) в ДМСО. Смесь перемешивают встряхиванием на шейкере (Вортекс) при температуре +4°С в течение 4 ч. Смесь центрифугируют, супернатант отделяют и осадок промывают 50%-ным ацетонитрилом в 50 мМ триэтиламмоний гидрокарбонатном буферном растворе (ТЕАН) (5×100 мкл) с перемешиванием на шейкере (Вортекс) и центрифугированием. Высушивают и хранят в вакуум-эксикаторе над P₂O₅.

Пример 6. Определение концентрации аминогрупп на поверхности ПЭТ-микрочастиц.

К навеске ПЭТ-микрочастиц (100 мг), содержащих поверхностные аминогруппы, добавляют 1 мл раствора 4-нитрофенилоксикарбонильного производного индодикарбоцианинового красителя (0.1 ммоль/мкл) и DIPEA (0.25 ммоль/мкл) в ДМСО. Смесь перемешивают встряхиванием на шейкере (Вортекс) при комнатной температуре в течение 4 ч. Смесь центрифугируют, супернатант отделяют и осадок промывают 50%-ным ацетонитрилом в 50 мМ триэтиламмоний гидрокарбонатном буферном растворе (ТЕАН) (5×100 мкл) с перемешиванием на шейкере (Вортекс) и центрифугированием. Супернатант и промывные жидкости объединяют, и добавляют 50%-ный раствор ацетонитрила в 50 мМ ТЕАН до объема 1 мл.

Во время процедур промывки происходит гидролиз 4-нитрофенилоксикарбонильной группы красителя до карбоксильной. Выделившийся 4-нитрофенол не мешает спектрофотометрическому контролю красителя. Концентрацию красителя определяют спектрофотометрически. Для этого 60 мкл раствора добавляют к 3 мл 50%-ного ацетонитрила в 50 мМ ТЕАН. Разбавление в 51 раз. Коэффициент молярной экстинкции карбоксилсодержащего красителя на длине волны 647 нм равен 2.5*10⁵ л*М^-1*см^-1. Измеряют оптическую плотность раствора на длине волны 647 нм. Измеряемая оптическая плотность при длине светового пути 1 см равна 0.239, что соответствует концентрации 0.239*51*1/2.5* 10⁵=4.876*10^-5 М/л=0.488*10^-4 М/л=0.049 мМ.)

При измерении исходной концентрации карбоксилсодержащего красителя в ДМСО отбирают пробу 30 мкл и добавляют к 3 мл 50%-ного ацетонитрила в 50 мМ ТЕАН. Разбавление 101 раз. Коэффициент молярной экстинкции карбоксилсодержащего красителя на длине волны 647 нм равен 2.5*10⁵ л*М^-1*см^-1. Измеряемая оптическая плотность при длине светового пути 1 см, равна 0.248, что соответствует концентрации 0.248*101*1/2.5*10⁵=10*10^-5 М/л=1*10^-4 М=0.1 мМ.

Количество красителя, связавшегося со 100 мг ПЭТ-микрочастиц, вычисляют по разности красителя, взятого в реакцию и не связавшегося с ПЭТ-микрочастицами в объеме 1 мл (0.1-0.049) мМ/л*10^-3 л=5.1*10^-8 м=51 наномоль. Получают аминированные ПЭТ-микрочастицы с удельной концентрацией аминогрупп 51/100=0.51 наномоль на 1 мг (510 пикомоль на 1 мг) ПЭТ-микрочастиц.

Пример 7. Селективное окисление альфа-фетопротеина с образованием альдегидных групп в гликозидной части.

Раствор альфа-фетопротеина в трис-буферном солевом растворе (100 мкл) с концентрацией 2.0 мг/мл диализовали против 20 мМ ацетата натрия и 0.15 М хлорида натрия, рН 5.0 при 4°С в течение ночи. Получают 200 мкл раствора альфа-фетопротеина с концентрацией 1 мг/мл в 20 мМ ацетате натрия и 0.15 М хлориде натрия, рН 5.0. К 100 мкл раствора альфа-фетопротеина с концентрацией 1 мг/мл в 20 мМ ацетате натрия и 0.15 М хлориде натрия, рН 5.0 добавляют 20 мкл свежеприготовленного 0.1 М раствора NaIO₄ в воде. Смесь перемешивают 20 мин при комнатной температуре. Полученный раствор диализуют против 1 мМ ацетата натрия, рН 5.0 при 4°С в течение ночи. Получают 200 мкл раствора альфа-фетопротеина, содержащего альдегидные группы в гликозидной части, с расчетной концентрацией 0.5 мг/мл (500 мкг/мкл) в 1 мМ ацетате натрия, рН 5.0.

Пример 8. Контроль исходного альфа-фетопротеина иммуноферментным методом анализа.

Концентрацию альфа-фетопротеина в исходном стоковом трис-буферном солевом растворе с концентрацией 2.0 мг/мл (по данным производителя) определяют методом ИФА с использованием набора АФП-ИФА (Хема, www.xema-medica.com).

По рекомендации производителя набора АФП-ИФА концентрация альфа-фетопротеина в исследуемом растворе не должна превышать 500 МЕ/мл, 605 нг/мл (1 МЕ/мл=1.21 нг/мл). Из исходного стокового раствора АФП с концентрацией 2.0 мг/мл (2000 мкг/мкл) готовят исследуемый раствор АФП с расчетной концентрацией 500 нг/мл в 20 мМ трис и 0.15 М хлорида натрия, рН 7.5.

В лунки планшета вносят конъюгат пероксидазы хрена с мышиными моноклональными антителами (100 мкл), исследуемый раствор АФП (50 мкл) и калибровочные пробы (по 50 мкл). Инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Промывают лунки планшета промывочным раствором (1х входит в состав набора, 5×200 мкл). Вносят в лунки планшета раствор субстрата (тетраметилбензидин) по 100 мкл и инкубируют 20 мин в защищенном от света месте. Останавливают реакцию добавлением стоп-реагента (100 мкл, раствор серной кислоты, входит в состав набора). Проводят фотометрическое измерение оптической плотности раствора в лунке планшета при 450 нм. По калибровочным пробам строят калибровочный график. По калибровочному графику определяют концентрацию АФП в исследуемом растворе. Измеренная концентрация АФП в исследуемом растворе 495 нг/мл (расчетная концентрация 500 нг/мл).

Пример 9. Контроль окисленного альфа-фетопротеина иммуноферментным методом.

К 1 мл раствора 20 мМ трис и 0.15 М хлорида натрия, рН 7.5 добавляют 1 мкл раствора окисленного АФП с концентрацией 0.5 мг/мл (500 мкг/мкл) в 1 мМ ацетате натрия, рН 5.0. Получают раствор с расчетным содержанием 500 нг/мл окисленного АФП в 20 мМ трис и 0.15 М хлорида натрия, рН 7.5.

В лунки планшета вносят конъюгат пероксидазы хрена с мышиными моноклональными антителами (100 мкл) и исследуемый раствор окисленного АФП (50 мкл) и калибровочные пробы (по 50 мкл). Инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Лунки планшета промывают промывочным раствором (1х входит в состав набора, 5×200 мкл). Затем в лунки планшета вносят раствор субстрата (тетраметилбензидин) по 100 мкл и инкубируют 20 мин в защищенном от света месте. Останавливают реакцию добавлением стоп-реагента (100 мкл, раствор серной кислоты, входит в состав набора). Проводят фотометрическое измерение оптической плотности раствора в лунке планшета при 450 нм. По калибровочным пробам строят калибровочный график. По калибровочному графику определяют концентрацию АФП в исследуемом растворе. Измеренная концентрация окисленного АФП 450 нг/мл (450 пикомоль/мкл). Расчетная концентрация составляет 500 нг/мл.

Пример 10. Связывание окисленного альфа-фетопротеина с аминированными ПЭТ-микрочастицами.

К навеске аминированных ПЭТ-микрочастиц (20 мг, удельная концентрация аминогрупп 0.51 наномоль на 1 мг, 510 пикомоль на 1 мг ПЭТ-микрочастиц, 10.2 наномоль аминогрупп) добавляют 100 мкл 0.2 М натрий карбонатного буферного раствора рН 9.5 и 10 мкл раствора окисленного АФП в 1 мМ ацетате натрия, рН 5.0 с концентрацией 450 пикомоль/мкл (4500 пикомоль = 4.5 наномоль). Реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляют 2 мкл свежеприготовленного 0.1 М водного раствора NaBH₄ (4 мг/мл, 4 г/л, М.В. 38 г/м, 0.1 М, 1 мкл = 0.1 мкм = 100 наномоль, 2 мкл = 200 наномоль) и перемешивают 2 ч при 4°С.

Промывают ПЭТ-микрочастицы раствором 20 мМ трис и 0.15 М хлоридом натрия, рН 7.5 (5×200 мкл) с использованием центрифугирования. Получают ПЭТ-микрочастицы с иммобилизованным альфа-фетопротеином. Хранят ПЭТ-микрочастицы с иммобилизованным альфа-фетопротеином под слоем 20 мМ трис и 0.15 М хлорида натрия, рН 7.5 при температуре 5°С.

Пример 11. Контроль альфа-фетопротеина, иммобилизованного на ПЭТ-микрочастицах иммуноферментным методом анализа.

Порцию ПЭТ-микрочастиц с иммобилизованным АФП, полученную из 20 мг аминированных ПЭТ-микрочастиц, суспендируют в растворе конъюгата пероксидазы хрена с мышиными моноклональными антителами к АФП человека (100 мкл) и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Промывают ПЭТ-микрочастицы промывочным раствором (1х входит в состав набора, 5×200 мкл) с использованием центрифугирования. Добавляют раствор субстрата (тетраметилбензидин) (100 мкл) и инкубируют 20 мин в защищенном от света месте. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента (раствор серной кислоты, входит в состав набора, 100 мкл). Проводят фотометрическое измерение оптической плотности раствора в лунке планшета при 450 нм. По калибровочной кривой определяют 2000 пикомоль АФП, иммобилизованного на ПЭТ-микрочастицах. Получают ПЭТ-микрочастицы с удельной концентрацией иммобилизованного альфа-фетопротеина 100 пикомоль (100*10^-12 моль) АФП на 1 мг ПЭТ-микрочастиц.

ЛИТЕРАТУРА

1. Surface immobilization of various functional biomolecules using mussel adhesive protein, US patent, 2016017279, - 2016, POSTECH ACAD IND FOUND, Республика Корея.

2. Glycosylhydrazines, preparation, immobilization and reactions of: glycoprotein analysis and O-glycan removal, US patent, 5831077, - 1998, Maquarie University, Австрия.

3. Charged peptide appendage to facilitate oriented protein covalent immobilization, US patent, 2016305948, - 2016, The Government of the US, as represented by the secretary of the navy, США.

4. D.S. Hage. Periodate oxidation of antibodies for site-selective immobilization in immunoaffinity chromatography. Methods in Molecular Biology, Affinity Chromatography: Methods and Protocols. Edited by: P. Bailon, G.K. Ehrlich, W.-J. Fung, and W. Berthold. Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2000, V. 147: P. 69-82.

5. Immobilization method for producing active alphal-acid glycoprotein, US patent, 7575908, - 2009, Univ Nebraska, США.

6. G.J. Mizejewski. Biological role of a-fetoprotein in cancer: prospects for anticancer therapy. Expert Rev. Anticancer Ther. 2002. V. 2, №6. P. 709-735.

7. G.J. Mizejewski. Review of the putative cell-surface receptors for alpha-fetoprotein: identification of a candidate receptor protein family. Tumor Biol. 2011. V. 32. P. 241-258.

8. E.R. Karamova, A.K. Yazova, E.F. Yakimenko, A.I. Gussev, G.I. Abelev. New approaches for the detection and characterization of alpha-fetoprotein epitope variants. Tumor Biol. 2003. V. 24. P. 1-8.

9. G.J. Mizejewski. Alpha-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes, and conformational variants. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 2001. V. 226. P. 377-408.

10. S. Arif, R. Varela-Calvino, G.S. Conway, M. Peakman. 3 Beta hydroxysteroid dehydrogenase autoantibodies in patients with idiopathic premature ovarian failure target N- and C-terminal epitopes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001. V. 86. №12. P. 5892-5897.

11. C. Tuerk, L. Gold. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 1990. V. 249. P. 505 -510.

12. P.A. Мифтахов, C.A. Лапа, B.E. Шершов, O.A. Заседателева, Т.О. Гусейнов, M.A. Спицын, B.E. Кузнецова, Д.Д. Мамаев, Ю.П. Лысов, В.Е. Барский, Э.Н. Тимофеев, А.С. Заседателев, А.В. Чудинов. Получение активных карбоксильных групп на поверхности полиэтилентерефталатной пленки и количественный анализ этих групп с помощью цифровой люминесцентной микроскопии, Биофизика. 2018. Т. 63. №4. С. 661-668.

13. O.A. Zasedateleva, V.A. Vasiliskov, S.A. Surzhikov, V.Е. Kuznetsova, V.Е. Shershov, Т.О. Guseinov, I.P. Smirnov, R.A. Yurasov, М.A. Spitsyn, А.V. Chudinov. dUTPs conjugated with zwitterionic Су3 or Cy5 fluorophore analogues are effective substrates for DNA amplification and labelling by Taq polymerase. Nucleic Acids Res. 2018, 46, e73.

1. Реагент для получения фрагментов ДНК, аптамеров, функциональных аналогов моноклональных антител, включающий альфа-фетопротеин, иммобилизованный на твердых микрочастицах полиэтилентерефталата (ПЭТ-микрочастицах) через гидрофильный спейсер.

2. Способ получения реагента по п. 1, включающий проведение щелочного гидролиза поверхности ПЭТ-микрочастиц с образованием поверхностных карбоксильных групп, связывание поверхностных активированных карбоксильных групп с 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамином с образованием иммобилизованных спейсеров с первичной аминогруппой, окисление альфа-фетопротеина периодатом натрия с образованием альдегидных групп в гликозидной части, связывание альфа-фетопротеина, содержащего альдегидные группы в гликозидной части, с ПЭТ-микрочастицами, имеющими на своей поверхности спейсеры с концевой аминогруппой, по реакции Шиффа в натрий карбонатном буферном растворе при рН 9.5, при этом не менее 100 пикомоль альфа-фетопротеина иммобилизуется на 1 мг микрочастиц полиэтилентерефталата.