Электрод с поперечно-сшитым ферментом для непрерывного контроля аналита

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен электрод для электрохимического сенсора, электрохимический сенсор для измерения концентрации аналита, способ изготовления электрода и способ измерения аналита в среде. Электрод содержит проводящую поверхность и конъюгат. Конъюгат включает обеспечивающую образование и/или расходование Н₂О₂ ферментную молекулу и металлическую наночастицу, ковалентно связанные друг с другом. Причем конъюгат ковалентно связан с поверхностью электрода через ферментную молекулу, а наночастица не связана ковалентно с поверхностью электрода. Сенсор содержит указанный выше электрод. Способ изготовления электрода включает модификацию обеспечивающей образование и/или расходование H₂O₂ ферментной молекулы, функционализирующим реагентом, получение конъюгата из ферментной молекулы и металлической наночастицы и ковалентное связывание конъюгата с проводящей поверхностью электрода. Способ измерения аналита включает применение указанных выше или электрохимического сенсора. Изобретения обеспечивают эффективный ферментный электрод, процесс изготовления которого является простым и воспроизводимым. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 пр., 4 ил.

 

Настоящее изобретение относится к ферментному электроду, содержащему проводящую поверхность, с которой ковалентно связан конъюгат, включающий по меньшей мере одну ферментную молекулу. Такой электрод пригоден для непрерывного контроля аналита, в частности для непрерывного мониторирования гликемии (НМГ), т.е. мониторного наблюдения за концентрацией глюкозы, с использованием в качестве ферментной молекулы глюкозооксидазы (GOD). Кроме того, изобретение относится к содержащему такой ферментный электрод электрохимическому сенсору для измерения концентрации аналита, например глюкозы, в условиях in vivo.

Применение нежидкостных сенсоров с имплантируемыми или вводимыми в тело электродами облегчает измерение физиологически значимых аналитов, таких, например, как лактат или глюкоза, в организме пациента. Во многих случаях электроды нежидкостных сенсоров покрывают электрически проводящими слоями, с которыми связаны ферментные молекулы. Ферментные молекулы могут катализировать окислительно-восстановительную реакцию, порождая тем регистрируемый электрическими средствами сигнал. Такого рода сенсор называют ферментным нежидкостным (ENF - сокр. от англ. "enzymatic non-fluidic") сенсором.

Сенсор для измерения глюкозы может содержать, например, фермент глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4), катализирующий превращение глюкозы как определяемого аналита в глюконолактон. В отсутствие синтетического окислительно-восстановительного медиатора косубстрат кислород О₂ превращается на поверхности сенсора в перекись водорода Н₂О₂. Образовавшаяся Н₂О₂ может каталитически разлагаться до Н₂О с выработкой электрического тока, соотносящегося с концентрацией глюкозы.

Известным сенсорам часто свойственны недостатки, состоящие в том, что места образования Н₂О₂ на каталитическом участке фермента и ее разложения на поверхности электрода разнесены в пространстве. Таким образом, превращение Н₂О₂ на рабочем электроде является неэффективным, т.е. степень такого превращения недостаточна. Кроме того, длительное присутствие Н₂О₂ в ферментном слое может инактивировать ферментные молекулы.

В публикации US 6284126 В1 раскрыт сенсор, содержащий капсулированные гидрогелем ферментные молекулы, нанесенные на поверхность электрода. Однако капсулированным гидрогелем ферментам свойственен еще один недостаток, заключающийся в том, что в контакте с водными средами гель набухает. Как следствие, на протяжении всего времени набухания могут происходить изменения амперометрического измерительного сигнала, приводящие к дрейфу сенсора.

В сенсорах других типов ферментный слой дополнительно содержит синтетический окислительно-восстановительный медиатор. Во избежание дрейфа сенсора окислительно-восстановительный медиатор и фермент приходится ковалентно включать в полимерную структуру. Однако это приводит к неэффективности переноса электронов от фермента к медиатору, поскольку мобильность таких соединений ограничена ввиду их включения в полимерную структуру. Следовательно, образование перекиси водорода на ферменте конкурирует с переносом электронов к медиатору, что приводит к кислородной зависимости. Кроме того, процессы набухания полимерных структур могут создавать возмущение.

Еще один известный сенсор, описанный, например, в публикации ЕР 2348964 В1, содержит электрод, покрытый ферментным слоем, представляющим собой проводящую пасту, содержащую полимерное связующее вещество, частицы углерода, ферментные молекулы и каталитический окислительно-восстановительный медиатор, и нанесенную на поверхность электрода. Однако недостатком такого сенсора является задержка во времени, необходимая для достижения стабильного рабочего состояния, поскольку такого рода ферментный слой должен быть полностью смочен и поляризован. Кроме того, ферментный слой на основе пасты непрочен, и потому его нельзя наносить на поверхности электрода большой площади, особенно если тело сенсора имеет искривленную форму.

В публикации WO 2009/153777 раскрыт электрод, содержащий проводящую поверхность и связанный с ней матрикс, причем матрикс содержит по меньшей мере два вида соединений, а именно по меньшей мере один вид, включающий ферменты, и по меньшей мере один вид, включающий наночастицы металла, причем соединения ковалентно связаны друг с другом через первые связующие группы, а матрикс ковалентно связан с поверхностью через одну или несколько одинаковых или разных вторых связующих функциональных групп (частей молекулы). Матрикс может быть связан с поверхностью за счет образования на проводящей поверхности слоя реактивного (реакционноспособного) соединения и контактирования покрытой таким слоем проводящей поверхности с наночастицами и ферментными молекулами, и те и другие из которых содержат реактивные группы, и последующей электрополимеризации соединений в слое, вызывающей связывание реактивных групп друг с другом с образованием матрикса.

Эта раскрытая в публикации WO 2009/153777 структура электрода имеет определенные недостатки, заключающиеся в том, что ее изготовление с применением электрополимеризации является сложным, поскольку требует проведения нескольких стадий, включающих химическую модификацию металлических наночастиц. Из-за своей сложности этот процесс является труд невоспроизводимым.

Таким образом, цель настоящего изобретения заключалась в том, чтобы предложить эффективный ферментный электрод, процесс изготовления которого является простым и воспроизводимым. Эта цель достигается за счет применения композиции ферментных молекул, ковалентно связанных с наночастицами и поверхностью электрода, но при этом металлические наночастицы не связаны ковалентно с поверхностью электрода.

Первым объектом настоящего изобретения является электрод, содержащий проводящую поверхность и конъюгат, включающий по меньшей мере одну ферментную молекулу и по меньшей мере одну проводящую наночастицу, ковалентно связанные друг с другом, причем конъюгат ковалентно связан с поверхностью электрода через по меньшей мере одну ферментную молекулу, а наночастица не связана ковалентно с поверхностью электрода.

Предлагаемый в изобретении электрод покрыт конъюгатом, включающим по меньшей мере одну ферментную молекулу и по меньшей мере одну проводящую наночастицу. В предпочтительном случае такой конъюгат содержит одну ферментную молекулу и по меньшей мере одну проводящую наночастицу.

Как правило, ферментная молекула представляет собой оксидоредуктазу, т.е. ферментную молекулу, катализирующую окислительно-восстановительную реакцию. В частности, фермент катализирует окислительно-восстановительную реакцию, в ходе которой образуется и/или расходуется перекись водорода Н₂О₂. Преимущественно фермент катализирует реакцию, в ходе которой образуется Н₂О₂, например из О₂ как косубстрата. Конкретными примерами таких ферментов являются глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4), гексозооксидаза (КФ 1.1.3.5), холестериноксидаза (КФ 1.1.3.6), галактозооксидаза (КФ 1.1.3.9), алкогольоксидаза (КФ 1.1.3.13), оксидаза (S)-2 гидроксикислоты (КФ 1.1.3.15), L-глутаматоксидаза (КФ 1.4.3.11)), или L-аспартатоксидаза (КФ 1.4.3.16). В особенно предпочтительном случае ферментной молекулой является глюкозооксидаза, например глюкозооксидаза, полученная из грибов, относящихся к родам Aspergillus или Penicillum.

В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере одна ферментная молекула конъюгата ковалентно связана как с проводящей поверхностью электрода, так и с по меньшей мере одной проводящей наночастицей. Ковалентная связь с поверхностью и с наночастицей может быть реализована посредством одинаковых или разных функциональных групп. В некоторых вариантах осуществления изобретения такая связь реализована посредством одинаковых функциональных групп. Например, такая связь может быть реализована через серосодержащие функциональные группы, в частности через сульфидные или дисульфидные группы, которые могут образовывать ковалентные связи с проводящей поверхностью электрода и с наночастицей.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ферментная молекула содержит два или более аминокислотных остатка с серосодержащей боковой цепью, способной непосредственно связываться с поверхностью электрода и/или наночастицей, например цистеиновый остаток, содержащий сульфидную (SH) группу, или цистеиновый мостик, содержащий дисульфидную группу (-S-S-). В других, обычно более предпочтительных, вариантах осуществления изобретения ферментная молекула модифицирована путем включения в нее одной или нескольких серосодержащих функциональных групп, в частности сульфидных или дисульфидных групп. Такая модификация может предусматривать функционализацию первичных аминогрупп на ферментной молекуле, например амино-конца и/или аминогрупп боковой цепи аминокислотных остатков внутри ферментной молекулы, например аминогрупп боковой цепи лизиновых и/или аргининовых остатков, в частности аминокислотных групп боковой цепи лизиновых остатков. В других вариантах осуществления изобретения модификация может предусматривать функционализацию карбоксильного конца и/или карбоксильных групп боковой цепи аспартатного и/или глутаматного остатков.

Модификация ферментной молекулы может выполняться путем использования функционализирующего реагента, содержащего группу, способную модифицировать полипептид, например аминореактивную группу или карбоксиреактивную группу. Кроме того, функционализирующий реагент содержит функциональную группу, например серосодержащую функциональную группу, или группу, к которой может быть прикреплена функциональная группа, например серосодержащая функциональная группа. Предпочтительно используется реагент, содержащий аминореактивную группу, выбранную, например, из сложного эфира N-гидроксисукцинимида, изоцианата, изотиоцианата и серосодержащей функциональной группы, например сульфидной или дисульфидной группы. Функциональная группа может быть непосредственно присоединена к аминореактивной группе или может быть присоединена к аминореактивной группе посредством спейсера, который может иметь длину цепи от 1 до 5, например от 1 до 3 атомов. Особенно предпочтительным аминореактивным реагентом, содержащим серосодержащую функциональную группу, является ди-N-гидроксисукцинимидовый сложный эфир 3,3'-дитиодипропионовой кислоты (DSP), также известный как реагент Ломанта.

Введение функциональных групп может предусматривать реакцию ферментной молекулы с функционализирующим реагентом в условиях, в которых функционализируются поверхностно-экспонированные боковые цепи ферментной молекулы. Регулируя молярное отношение ферментной молекулы к функционализирующему реагенту, можно регулировать степень функционализации ферментной молекулы. Как правило, молярное отношение ферментной молекулы к функционализирующему реагенту составляет примерно 1:1 или выше, например примерно от 1:1 примерно до 1:10, примерно от 1:1 примерно до 1:2, примерно от 1:2 примерно до 1:5 или примерно от 1:5 примерно до 1:10.

Конъюгат, используемый для покрытия электрода, также содержит по меньшей мере одну проводящую наночастицу, т.е. наночастицу, имеющую проводящую поверхность или состоящую из проводящего материала. Наночастица может быть металлической наночастицей, например частицей платины, палладия, иридия, золота, серебра или любого их сплава. В частности, наночастица способна каталитически разлагать Н₂О₂, как, например, платиновая или палладиевая наночастица. Как правило, наночастицы могут иметь средний размер 100 нм или менее, например средний размер от 1 до 50 нм или от 5 до 15 нм, при измерении методом динамического рассеяния света.

Конъюгат ферментных молекул и наночастиц можно получать, обеспечивая ферментную молекулу, имеющую по меньшей мере одну функциональную группу, например серосодержащую функциональную группу, в частности сульфидную и/или дисульфидную группу, и вводя ферментную молекулу в реакцию с наночастицей в условиях, в которых между ферментной молекулой и наночастицей может образоваться ковалентная связь. Собственно наночастицы не содержат функциональных групп, способных к образованию ковалентной связи с поверхностью электрода. Соответствующие количества реагентов можно регулировать за счет того, что конъюгаты содержат ферментные молекулы и наночастицы при молярном отношении ферментных молекул к наночастицам, составляющем примерно от 1:1 примерно до 1:3, в частности примерно от 1:1 примерно до 1:2.

Конъюгат, образовавшийся в результате такой реакции, содержит по меньшей мере одну ферментную молекулу, конъюгированную с по меньшей мере одной наночастицей, причем на ферментной молекуле в конъюгате присутствует по меньшей мере одна свободная функциональная группа. Средний размер конъюгата может составлять примерно от 10 нм примерно до 300 нм, например, примерно от 50 нм примерно до 100 нм, при измерении размера методом динамического рассеяния света.

В соответствии с настоящим изобретением описанный выше конъюгат наносят на проводящую поверхность электрода, при этом свободная функциональная группа на ферментной молекуле конъюгата образует ковалентную связь с поверхностью электрода.

Проводящая поверхность электрода может быть металлической поверхностью, такой, например, как поверхность из золота, платины, палладия, иридия, серебра или их сплава. Проводящая поверхность также может быть металлооксидной поверхностью, например поверхностью из оксида индия и олова, или графитовой поверхностью. В частности, такая поверхность представляет собой золотую поверхность.

Конъюгат образует на поверхности электрода ферментный слой. Для практических применений этот ферментный слой может быть покрыт дополнительным полимерным слоем, обладающим сопротивлением диффузии измеряемого аналита и поэтому действующим в качестве диффузионного барьера. Диффузионный барьер может содержать, например, блок-сополимеры с чередующимися гидрофильными и гидрофобными блоками, как это описано в публикации ЕР 2697388 В1. Диффузионный барьер может непрерывно простираться по существу по всей площади проводящей поверхности электрода. На диффузионном барьере может быть расположена дополнительная биосовместимая мембрана в качестве спейсера, устанавливающего минимальное расстояние между ферментным слоем на электроде и клетками окружающей ткани организма. Это мероприятие выгодно тем, что создает резервуар, из которого молекулы аналита могут достигать соответствующего ферментного слоя в случае кратковременного возмущения или изменения жидкости в окрестностях ферментного слоя. Предпочтительные спейсеры, изготовленные из сополимеров (мет)акрилатов, описаны в публикации ЕР 2697388 В1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат может дополнительно содержать другие компоненты, например синтетический окислительно-восстановительный медиатор. В других, обычно более предпочтительных, вариантах осуществления изобретения конъюгат не содержит синтетического окислительно-восстановительного медиатора. Кроме того, в других, обычно предпочтительных вариантах осуществления изобретения конъюгат состоит главным образом или полностью из по меньшей мере одной ферментной молекулы и по меньшей мере одной наночастицы, в частности одной ферментной молекулы и по меньшей мере одной наночастицы, например одной или двух наночастиц.

Кроме того, настоящее изобретение относится к электрохимическому сенсору для измерения концентрации аналита, содержащему по меньшей мере один электрод, описанный выше.

Предлагаемый в изобретении сенсор пригоден для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, например в ткани, коже или физиологической (биологической) жидкости. Сенсор пригоден, в частности, для внутрикожного или подкожного измерения.

Аналитом может быть любого рода соединение, содержание которого в организме, например в ткани и/или физиологической жидкости, поддается измерению. К примерам аналитов можно отнести эндогенные аналиты, т.е. вырабатываемые в организме соединения, или экзогенные аналиты, например введенные в организм аналиты. Например, аналиты могут выбираться из сахаридов, кислот, в том числе жирных кислот и аминокислот, пептидов, белков, солей и газов. Интерес представляют глюкоза, мочевина, глицерин, лактат, пируват, кислород, диоксид углерода, катионы натрия и хлорид-ионы. Особый интерес представляют аналиты, способные окисляться или восстанавливаться с образованием Н₂О₂, такие как глюкоза, лактат, холестерин, гексоза, галактоза или спирт.

Предлагаемый в изобретении сенсор пригоден для краткосрочного или долгосрочного измерения. Такой сенсор особенно подходит для многократного, например непрерывного, контроля концентрации одного или нескольких аналитов в течение более длительного периода времени, составляющего от 3 до 12 месяцев, или в течение более короткого периода времени, составляющего от 3 до 14 суток.

Предлагаемый в изобретении сенсор представляет собой электрохимический сенсор, содержащий по меньшей мере один электрод и соответствующие электрические схемы. Такой сенсор предпочтительно представляет собой амперометрический электрохимический сенсор, содержащий по меньшей мере один рабочий (индикаторный) электрод, имеющий проводящую поверхность, с которой ковалентно связан конъюгат, описанный выше. Как правило, такой сенсор содержит по меньшей мере еще один электрод, в частности противоэлектрод и/или электрод сравнения (опорный электрод). Рабочий электрод чувствителен к измеряемому аналиту при напряжении поляризации, которое прикладывается между рабочим электродом и электродом сравнения и регулируется потенциостатом. Измерительный сигнал можно получать в виде электрического тока между противоэлектродом и рабочим электродом. В некоторых вариантах осуществления изобретения отдельный противоэлектрод отсутствует, а присутствует псевдоэлектрод сравнения, действующий также в качестве противоэлектрода. Таким образом, сенсор аналита обычно содержит набор из по меньшей мере двух, предпочтительно - из трех, электродов. В частном варианте осуществления изобретения ферментная молекула связана с проводящей поверхностью только рабочего электрода.

В еще одном частном варианте осуществления изобретения ферментной молекулой является глюкозооксидаза, например глюкозооксидаза, химически модифицированная, как описано выше, а аналитом является глюкоза. В этом варианте осуществления изобретения предложен электрохимический сенсор для измерения концентрации глюкозы. Преимущественно речь идет о сенсоре для непрерывного измерения концентрации глюкозы.

Еще одним объектом изобретения является способ изготовления описанного выше электрода, включающий:

а) получение конъюгата из по меньшей мере одной ферментной молекулы и по меньшей мере одной наночастицы в условиях, при которых ферментная молекула в конъюгате имеет свободные функциональные группы для ковалентного связывания с проводящей поверхностью электрода, а наночастица в конъюгате не имеет свободных функциональных групп для ковалентного связывания с проводящей поверхностью, и

б) ковалентное связывание указанного конъюгата с проводящей поверхностью электрода, причем связывание происходит исключительно через свободные функциональные группы на ферментной молекуле.

Еще одним объектом изобретения является способ измерения аналита, например глюкозы, в среде, например в условиях in vivo, в частности в ткани и/или в физиологической жидкости субъекта, в частности человека, включающий применение электрода или электрохимического сенсора, описанных выше. В качестве альтернативы предлагаемый в изобретении способ также включает измерение аналита в условиях in vitro, например в полученной у субъекта, в частности человека, пробе физиологической жидкости.

Далее настоящее изобретение описывается в контексте следующих чертежей и примеров.

На фиг. 1 показан рассматриваемый в качестве примера вариант выполнения предлагаемого в изобретении рабочего электрода.

На фиг. 2 показаны результаты исследования реакционных смесей глюкозооксидазы (GOD) и реагента Ломанта (DSP) при различных молярных отношениях методом электрофореза в полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях.

На фиг. 3 показано распределение по размерам для различных конъюгатов глюкозооксидазы и платиновых наночастиц, измеренное методом динамического рассеяния света.

На фиг. 4 показаны результаты трех различных измерений на рабочем электроде, с которым связан конъюгат глюкозооксидазы и платиновой наночастицы, причем на диаграмме (А) показан ток во время цикла измерения при трех напряжениях (0,20 В - 0,35 В - 0,20 В), а на диаграмме (В) показан средний ток при трех напряжениях во время цикла измерения.

На фиг. 1 показан рассматриваемый в качестве примера вариант выполнения рабочего электрода для измерения глюкозы. С поверхностью электрода, например с золотой (Аu) поверхностью электрода, ковалентно связана через серосодержащую функциональную группу ферментная молекула. Кроме того, через другую серосодержащую функциональную группу ферментная молекула ковалентно связана по меньшей мере с одной наночастицей, например платиновой (Pt) наночастицей.

Ферментной молекулой является глюкозооксидаза, модифицированная на поверхностно-экспонированной аминогруппе боковой цепи реагентом Ломанта с образованием серосодержащих функциональных групп. Глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы до глюконолактона с образованием Н₂О₂. На наночастице происходит каталитическое разложение Н₂О₂ до Н₂О, в результате чего возникает поток электронов (е^-). Таким образом вырабатывается электрический ток, сила которого соотносится с концентрацией глюкозы.

В предлагаемом в изобретении электроде используется естественно существующая медиаторная система О₂/Н₂О₂. Синтетический окислительно-восстановительный медиатор отсутствует. В присутствии каталитической наночастицы образовавшаяся Н₂О₂ эффективно разлагается до Н₂O.

Благодаря ковалентной связи каталитических наночастиц и ферментных молекул с рабочим электродом удается избежать потери молекул из ферментного слоя. Кроме того, благодаря присутствию проводящей металлической наночастицы отсутствует переходное сопротивление между ферментным слоем и электрическим проводником рабочего электрода.

Таким образом, предлагаемый в изобретении электрод и содержащий его сенсор предоставляют простую и эффективную конструкцию, которую можно легко получить путем нанесения конъюгата наночастиц и функционализированного фермента на проводящую поверхность электрода.

Пример 1: Связывание платиновых наночастиц с глюкозооксидазой

Глюкозооксидаза (GOD) из черного аспергилла (Aspergillus niger) имеет три цистеиновых остатка. Цистеиновый остаток 164 образует цистеиновый мостик с цистеиновым остатком 206, а третий цистеиновый остаток 521 не экспонирован на поверхности. Таким образом, глюкозооксидаза была биохимически модифицирована функциональным сульфидом, а именно реагентом Ломанта (ди-N-гидроксисукцинимидовый сложный эфир 3,3'-дитиодипропионовой кислоты, сокращенно - DSP) производства компании Sigma Aldrich. N-гидроксисукцинимидовая эфирная группа реагирует с поверхностно-экспонированными лизиновыми боковыми цепями глюкозооксидазы, тем самым вводя в ферментную молекулу серосодержащие группы.

Было получено несколько образцов модифицированной сульфидом глюкозооксидазы с различными молярными отношениями глюкозооксидазы к реагенту Ломанта, для чего соответствующие композиции при молярных отношениях глюкозооксидазы к DSP, составляющих 1:1, 1:10, 1:100 и 1:200, выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре. Продукты реакции проанализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях, получив показанные на фиг. 2 результаты.

Поперечную сшивку молекул глюкозооксидазы наблюдали уже при молярном отношении GOD к DSP, составлявшем 1:1. При молярном отношении 1:200 были сшиты почти все молекулы глюкозооксидазы, и образовались агрегаты с высокой молекулярной массой. Для контроля использовали глюкозооксидазу без ее модификации посредством DSP (на фиг. 2 - GOD).

Ко всем представленным на фиг. 2 образцам добавили 1 мл дисперсии платиновых наночастиц (0,5 мг/мл; размер частиц <15 нм) и выдержали в течение 12 часов, оставив на ночь при комнатной температуре, по методике из Cao et al. (Biosens. Bioelectron. 26(2010), 87-91) для получения ковалентной связи частиц с модифицированной сульфидными группами глюкозооксидазой.

На следующий день образцы измерили методом динамического рассеяния света (DLS) для определения размера поперечно-сшитых частиц. Результаты показаны на фиг. 3.

В образце A3 (молярное отношение GOD:DSP=1:100) и образце А4 (молярное отношение GOD:DSP=1:200) агрегаты обнаруживались визуально. Эти крупные частицы имеют размер, превышающий предел измерений устройства DLS, равный 10 мкм, и представлены как отсеченный пик.

Контрольный образец А5 (немодифицированная GOD) демонстрирует два дискретных пика. Образцы А1 (молярное отношение GOD:DSP=1:1) и А2 (молярное отношение GOD:DSP=1:10) имеют увеличенный размер частиц по сравнению с контрольным образцом А5, что свидетельствует о получении конъюгатов молекул GOD и наночастиц Pt.

Пример 2: Снабжение электрода покрытием

В качестве основы для рабочего электрода использовали золотую стружку QFX301 (LOT Darmstadt). Для последующего измерения использовали сенсор, выполненный по трехэлектродной схеме с рабочим электродом, электродом сравнения и противоэлектродом (золотая пленка Melinex).

На золотую стружку рабочего электрода нанесли пипеткой 80 мкл реакционной смеси образца А2 из Примера 1 и выдержали в течение 10 минут при комнатной температуре для получения ковалентной связи свободных сульфидных групп на конъюгатах с золотой поверхностью. После выдерживания несвязавшийся материал удалили несколькими окунаниями в фосфатный буферный раствор (PBS).

Пример 3: Измерение глюкозы

Сенсор по Примеру 2 испытали на потенциостате Gamry (С3 Analysentechnik ). Для этого при трех уровнях напряжения (200 мВ, 350 мВ, 200 мВ) выполнили хроноамперометрические измерения, при которых возникающий в результате ток каждый раз измеряли в течение 10 минут. Измерения проводили в фосфатном буферном растворе (PBS) в качестве контрольного измерения и в растворе глюкозы с концентрацией 26 ммоль/л (mМ). Результаты показаны на фиг. 4.

При заданном напряжении 0,20 В значительного различия между полученными в указанных растворах сигналами обнаружено не было. При напряжении 0,35 В в обоих растворах обнаруживалось увеличение тока, причем в растворе глюкозы с концентрацией 26 ммоль/л ток был значительно более высоким по сравнению с током в фосфатном буферном растворе (см. диаграмму А на фиг. 4). Этот результат демонстрирует, что снабженный покрытием рабочий электрод обладает чувствительностью к глюкозе. Средний электрический ток в течение последних пяти минут измерения при трех уровнях напряжения (0,20 В, 0,35 В, 0,20 В) цикла измерения показан на фиг. 4 на диаграмме В. Отчетливо видно значительное различие измерительных сигналов, полученных в фосфатном буферном растворе (PBS) и в растворе глюкозы с концентрацией 26 ммоль/л при напряжении 0,35 В. Заметный дрейф сенсора наблюдался только в первые минуты измерения при данном напряжении, что свидетельствует о том, что сенсор имеет малое время калибровки.

1. Электрод для электрохимического сенсора, предназначенного для измерения концентрации аналита, содержащий проводящую поверхность и конъюгат, включающий по меньшей мере одну ферментную молекулу, обеспечивающую образование и/или расходование Н₂О₂, и по меньшей мере одну металлическую наночастицу, ковалентно связанные друг с другом, причем конъюгат ковалентно связан с поверхностью электрода через по меньшей мере одну ферментную молекулу, а наночастица не связана ковалентно с поверхностью электрода.

2. Электрод по п.1, в котором ферментная молекула является глюкозооксидазой (КФ 1.1.3.4), гексозооксидазой (КФ 1.1.3.5), оксидазой (S)-2 гидроксикислоты (КФ 1.1.3.15), холестериноксидазой (КФ 1.1.3.6), галактозооксидазой (КФ 1.1.3.9), алкогольоксидазой (КФ 1.1.3.13), L-глутаматоксидазой (КФ 1.4.3.11) или L-аспартатоксидазой (КФ 1.4.3.16), преимущественно глюкозооксидазой.

3. Электрод по п.1 или 2, в котором ковалентная связь ферментной молекулы с поверхностью электрода реализована через серосодержащую функциональную группу, в частности через сульфидную или дисульфидную группу, и/или ковалентная связь ферментной молекулы с наночастицей реализована через серосодержащую функциональную группу, в частности через сульфидную или дисульфидную группу.

4. Электрод по одному из пп. 1-3, в котором ферментная молекула модифицирована с включением в нее по меньшей мере одной функциональной группы для ковалентной связи с поверхностью электрода и наночастицей, в частности, ферментная молекула модифицирована на амино-конце и/или на аминогруппе боковой цепи.

5. Электрод по п. 4, в котором ферментная молекула модифицирована путем проведения реакции фермента с функционализирующим реагентом, например, при молярном отношении фермента к функционализирующему реагенту, составляющем от 1:1 до 1:10.

6. Электрод по одному из пп. 1-5, в котором наночастицы представляют собой платиновые, палладиевые, иридиевые, золотые и/или серебряные наночастицы, преимущественно платиновые наночастицы.

7. Электрод по одному из пп. 1-6, в котором наночастицы имеют средний размер от 1 нм до 100 нм, в частности от 5 нм до 15 нм.

8. Электрод по одному из пп. 1-7, в котором конъюгат имеет средний размер от 10 нм до 300 нм.

9. Электрод по одному из пп. 1-8, в котором конъюгат не содержит окислительно-восстановительного медиатора.

10. Электрод по одному из пп. 1-9, в котором поверхность электрода представляет собой металлическую поверхность, в частности золотую поверхность.

11. Электрохимический сенсор для измерения концентрации аналита, содержащий по меньшей мере один электрод по одному из пп. 1-10.

12. Сенсор по п. 11, в котором ферментной молекулой является глюкозооксидаза, в частности функционализированная глюкозооксидаза, а аналитом является глюкоза.

13. Сенсор по п. 11 или 12, предназначенный для применения in vivo или in vitro.

14. Способ изготовления электрода по одному из пп. 1-10, включающий:

а) модификацию по меньшей мере одной ферментной молекулы, обеспечивающей образование и/или расходование H₂O₂, функционализирующим реагентом, содержащим серосодержащую функциональную группу или группу, к которой может быть прикреплена функциональная группа,

б) получение конъюгата из по меньшей мере одной ферментной молекулы и по меньшей мере одной металлической наночастицы в условиях, при которых только ферментная молекула, но не наночастица в конъюгате имеет свободные функциональные группы для ковалентного связывания с проводящей поверхностью наночастицы в конъюгате, и

в) ковалентное связывание указанного конъюгата с проводящей поверхностью электрода, причем связывание происходит исключительно через свободные функциональные группы на ферментной молекуле.

15. Способ измерения аналита в среде, в частности в ткани и/или физиологической жидкости, включающий применение электрода по одному из пп. 1-10 или электрохимического сенсора по одному из пп. 11-13.