Микробиологический способ получения 11α-ацетоксипрогестерона

Изобретение относится к способу получения 11α-ацетоксипрогестерона. Способ включает трансформацию 11α-гидроксипрогестерона штаммом мицелиального гриба Aspergillus nidulans, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером F-1069. При этом для трансформации споровую суспензию гриба высевают в качалочные колбы с ростовой средой, выращивают до достижения количества биомассы ~1 г/100 мл по весу сухого мицелия при перемешивании. Затем в ростовую среду вносят раствор 11α-гидроксипрогестерона в диметилсульфоксиде или диметилформамиде до достижения их концентрации в среде от 2 до 6% (об.) и до концентрации субстрата в диапазоне 0,1-1,0 г/л, инкубируют на качалке при температуре 37±0,5°С в течение 4±0.5 суток в условиях ограниченной аэрации со скоростью 90-100 об/мин в течение 216 ч или в условиях интенсивной аэрации со скоростью 240-250 об/мин в течение не менее 168 ч. По окончании инкубации продукты извлекают экстракцией и очищают с получением целевого продукта 11α-ацетоксипрогестерона. Изобретение обеспечивает селективность образования целевого продукта не менее 80%. 5 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и касается нового способа применения известного штамма мицелиального гриба Aspergillus nidulans ВКПМ F-1069 для ацетилирования стероидных гидроксил-содержащих соединений, в частности, соединений ряда прегнана (производных прогестерона) и может быть использовано в промышленной биотехнологии, а также в фармацевтической промышленности для производства стероидных медицинских препаратов.

Уровень техники

Мицелиальный гриб Aspergillus nidulans является одной из наиболее известных эукариотических генетических систем и широко используется в качестве модельной системы для расшифровки биологии клеточного цикла, патогенности, лекарственной устойчивости, болезней человека, первичного и вторичного метаболизма других микроорганизмов. Несмотря на это, штаммы гриба A. nidulans как стероид-трансформирующие микроорганизмы мало изучены. Имеются сообщения, что этот вид обладает 11α-монооксигеназной активностью и способен трансформировать прогестерон с образованием преимущественно 11α-гидрокси-производного. Так, M.J. Henry и H.D. Sisler [M.J. Henry, and H.D. Sisler. Effects of sterol biosynthesis-inhibiting (SBI) fungicides on cytochrome P-450 oxygenations in fungi. Pesticide Biochemistry and Physiology, 1984, Vol. 22(3), 262-275], изучая влияние фунгицидов, ингибирующих биосинтез эргостерина в грибах, на цитохром-Р450-зависимое гидроксилирование прогестерона, сообщили, что гриб A. nidulans (Eidam) Winter (штамм 003) гидроксилирует прогестерон при начальной концентрации 100 мкг/мл с образованием смеси, содержащей 11α-гидроксипрогестерон (50%), 6β-гидроксипрогестерон (5%), 6β,11α-дигидроксипрогестерон (14%) и неконвертированный прогестерон (31%).

Также известно, что культура гриба A. nidulans (из коллекции Центра культур лаборатории микробиологической химии, National Research Centre, Каир, местная среда обитания), обладая стероид-11α-гидроксилирующей активностью, может трансформировать прогестерон не только в 11α-гидроксипрогестерон, но и в 21-гидроксипрогестерон (он же 11-дезоксикортикостерон) [А.Н. El-Refai, and K.М. Ghanem. Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338; A.H. El-Refai, and K.M. Ghanem. Microbial response to steroids. Egyptian Journal of Microbiology, 1989, Vol. 23(1), 1-11]. Авторы вносили прогестерон в ростовую среду в растворе 96% этанола с финальной концентрацией растворителя 1%. Трансформацию прогестерона проводили с нагрузкой 1 г/л при температуре 30±2°С на качалке (200 об/мин, амплитуда 7 см) в течение 48 ч. При этом авторы наблюдали образование дигидроксилированного производного - 6β,11α-дигидроксипрогестерона. Был сделан вывод, что при значениях рН среды, близких к нейтральным, 6β-гидроксилирование является вторичным процессом и 6β,11α-дигидроксипрогестерон образуется из первично образованного 11α-гидроксипрогестерона [А.Н. El-Refai, and K.М. Ghanem. Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338].

Известно, что микроорганизмы способны ацетилировать стероидные вторичные и первичные спирты. Так, известна способность некоторых видов дрожжей и дрожжеподобных организмов (Saccharomyces fragilis, S. lactis, Candida pseudotropicalis и Torulopsis sphaerica) ацетилировать вторичную 17β-гидроксильную группу тестостерона [A. , М. Tadra, and J. . Microbial transformations of steroids XXIV. Separation of androstane 17-hydroxy-epimers. Folia Microbiol. 1964, Vol. 9(6), 380-382]. При этом авторы отметили, что ацетилирование происходит только с 17β-гидроксипроизводным, тогда как соответствующий 17α-эпимер остается нетронутым. В этих условиях не происходит ацетилирования молекулы стероида с гидроксигруппой в положениях 11α, 11β, 20β и 21. Известен способ ферментативного ацетилирования стероидных 3-олов [US 3597320, 1971], в котором описана способность микромицетов родов Penicillium sp. АТСС 16501, Spicaria sp. АТСС 20152 и Spicaria sp. АТСС 20153 проводить ацетилирование вторичной гидроксильной группы при атоме С3, не затрагивая при этом вторичную 11β-гидроксильную группу. Также описана способность штамма Trichoderma glaucum ацетилировать первичную гидроксильную группу при атоме С21 в молекуле 9α-фтор-11β,21-дигидрокси-16α,17α-изопропилидендиокси-прегн-4-ен-3,20-диона и ряда других производных гидрокортизона и преднизолона [С.Е. Holmlund, L.I. Feldman, N.E. Rigler, B.E. Nielsen, and R.H. Evans Jr. Microbial esterification of steroids. J. Am. Chem. Soc., 1961, Vol. 83(11), 2586-2587]. Однако информация о способности мицелиальных грибов рода Aspergillus ацетилировать стероидные спирты в литературных источниках отсутствует.

Из уровня техники известно, что ацетилирование вторичных спиртов стероидной структуры, в частности, 11-гидроксилированных стероидов, возможно только химически с применением в качестве ацетилирующего агента ангидридов уксусной кислоты (ангидрида или хлорангидрида). Например, ацетилирование 11α-гидроксипрогестерона осуществляют химически, используя в качестве ацетилирующего агента уксусный ангидрид [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74(23), 5933-5936].

Таким образом, из уровня техники следует, что получение 11α-ацетоксипрогестерона трансформацией 11α-гидроксипрогестерона культурами мицелиальных грибов вообще, в частности, рода Aspergillus, конкретно Aspergillus nidulans, ранее не проводилось.

11α-Ацетоксипрогестерон (11α-гидроксипрегн-4-ен-3,20-диона ацетат, CAS №2268-98-6) является физиологически активным производным прогестерона (прегн-4-ен-3,20-диона, CAS №57-83-0) - нативного стероидного гормона, синтезируемого желтым телом яичника, корковым веществом (корой) надпочечников, семенными пузырьками и плацентой. Препараты на основе прогестерона и его производных применяются в качестве лекарственных средств в медицине и ветеринарии.

11α-Ацетоксипрогестерон, как и 11α-гидроксипрогестерон, являясь производным прогестерона, обладающий гестагенной активностью, может быть использован как средство, снижающее риск преждевременных родов, а также в качестве активного ингредиента в комбинации с природными или синтетическими эстрогенами как в препаратах для пероральной контрацепции, так и в препаратах для гормональной заместительной терапии женщин в постклимактерический период.

Кроме того, ацетат 11α-гидроксипрогестерона может быть использован не только в качестве прогестагенного средства, как указано выше, но и в качестве антиандрогенного агента для снижения сальных выделений у пациентов, страдающих себореей, аллопецией, вульгарными угрями и другими заболеваниями кожи, связанными с гиперандрогенизацией. Так, известны косметические композиции для ухода за волосами и кожей головы, содержащие 11α-ацетоксипрогестерон в количестве 1,4-1,8% вес. [DE 2757024, 1979]. При этом отмечено, что у этого соединения при местном применении гормональные побочные эффекты отсутствуют. Косметические композиции могут быть составлены как лосьоны для волос или масла, кремы для кожи, масла или эмульсии для нанесения на кожу, шампуни, аэрозольные аэрозоли и т.п.

11α-Ацетоксипрогестерон может быть использован как исходный продукт в синтезе других лекарственных средств для медицинского применения. При необходимости он может быть гидролизован любым удобным способом, известным из уровня техники, с образованием 11α-гидроксипрогестерона. Так, например, известен химический метод получения 11α-гидроксипрогестерона сольволизом 11α-ацетоксипрогестерона действием бис(трибутилолово)оксида [M.G. Perez, and M.S. Maier. Mild deprotection of steroid esters by bis(tributyltin)oxide. Tetrahedron Letters, 1995, Vol. 36(19), 3311-3314] или традиционным способом химического сольволиза в условиях основного катализа: в среде метанола в присутствии КОН [Т. Kubota, and F. Hayashi. Studies on A-norsteroids - VI. Directing effects of С₁₁ substituents on the addition of osmium tetroxide to steroidal Δ^1,4-3-ketones. Tetrahedron, 1967. Vol. 23, 995-1006]. Образованный 11α-гидроксипрогестерон может быть использован, например, в синтезе 11-кетопрогестерона (кетогестина, CAS №516-15-4), который далее превращают в кортизон или 11β-гидроксипрогестерон - предшественник нативного гидрокортизона - методами, известными из уровня техники. Химический метод перехода от 11α-гидроксипрогестерона к 11-кетопрогестерону с выходом более 90% и далее в 11β-гидроксипрогестерон описан в патенте [US 2015376225, 2015, примеры 1 и 7 соответственно]. Кроме того, 11α-гидроксипрогестерон может быть использован в качестве исходного соединения в синтезе перспективных аналогов нейростероидного анестетика альфаксолона [P.Y. Savechenkov, D.C. Chiara, R. Desai, A.T. Stern, X. Zhou, A.M. Ziemba, A.L. Szabo, Y. Zhang, J.B. Cohen, S.A. Forman, K.W. Miller, K.S. Bruzik. Synthesis and pharmacological evaluation of neurosteroid photoaffinity ligands. European Journal of Medicinal Chemistry, 2017, Vol. 136, 334-347].

Наиболее близким по сущности к предложенному способу получения 11α-ацетоксипрогестерона ацетилированием 11α-гидроксипрогестерона является химический метод [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74(23), 5933-5936], который заключается в получении 11α-ацетоксипрогестерона ацетилированием 11α-гидроксипрогестерона (20 мг) действием уксусного ангидрида (0,6 мл) в среде пиридина (0,6 мл). Смесь выдерживали в течение 16 ч при комнатной температуре. По окончании реакции реакционную массу разбавляли 25 мл воды, выдерживали в течение 1 ч, охлаждали для начала кристаллизации. Кристаллы отделяли фильтрацией, промывали водой и сушили. Получали 16,1 мг 11α-ацетоксипрогестерона с т. пл. 176-177°С. Таким образом, молярный выход 11α-ацетоксипрогестерона, полученного авторами высаживанием его кристаллов из реакционной массы ~20-кратным количеством воды, составлял 71,4%.

Раскрытие изобретения

Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением является разработка экологически более чистого микробиологического способа получения 11α-ацетоксипрогестерона ацетилированием 11α-гидроксипрогестерона с применением мицелиального гриба при обеспечении выхода целевого продукта не менее чем 80%.

Техническим результатом заявляемого изобретения является биокаталитическая этерификация стероидного спирта без применения химических ацетилирующих реагентов и органических оснований, применяемых традиционно в качестве катализаторов и растворителей, с практически полной конверсией исходного субстрата и селективностью образования целевого продукта не менее 85%. Экологическая значимость способа заключается в исключении указанных выше реагентов и органических растворителей, применение которых требует разработки дополнительных энергоемких методов регенерации растворителей, очистки промышленных стоков, очистки целевого продукта. Следует отметить, что модификация стероидных соединений с помощью микроорганизмов относится к области белой биотехнологии, так как позволяет не только уменьшить загрязнение окружающей среды, сберечь сырьевые и энергетические ресурсы, но и снизить стоимость конечного продукта. Это соответствует современным тенденциям в изучении биотехнологических процессов, включающим поиск новых биокатализаторов, способных выполнять реакции, наиболее важные для стероидной промышленности, с высокой степенью селективности (в том числе поиск биотехнологических методов, альтернативных химическим).

Также техническим результатом является расширение ассортимента методов ацетилирования вторичной гидроксильной группы при атоме С11 молекулы прогестерона, благодаря наличию способности штамма A. nidulans ВКПМ F-1069 по настоящему изобретению ацетилировать вторичную гидроксильную группу при атоме С11 молекулы прогестерона, как альтернативы химическому методу ацетилирования.

Поставленная техническая задача решается способом получения 11α-ацетоксипрогестерона ацетилированием 11α-гидроксипрогестерона путем микробиологической трансформации с использованием штамма дикого типа A. nidulans ВКПМ F-1069 в условиях интенсивной аэрации или в условиях ограниченной аэрации.

Использованный штамм A. nidulans депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером F-1069 (synonym FGSC A4; АТСС 3863, 12996, 26451; CBS 112.46; NRRL 194), ранее для биотрасформации стероидных соединений не применялся, его ацетилирующая способность обнаружена впервые. Этот штамм впервые применен для биотрасформации 11α-гидроксипрогестерона в 11α-ацетоксипрогестерон.

Сущность заявленного изобретения, касающегося получения 11α-ацетоксипрогестерона биотрансформацией 11α-гидроксипрогестерона, заключается в том, что с целью повышения выхода и экологичности процесса этерификацию проводят в водной среде с применением штамма мицелиального гриба дикого типа A. nidulans ВКПМ F-1069 в условиях интенсивной аэрации или в условиях ограниченной аэрации до практически полной конверсии 11α-гидроксипрогестерона.

Преимущества заявляемого способа получения 11α-ацетоксипрогестерона биотрансформацией 11α-гидроксипрогестерона перед известным из уровня техники химическим методом ацетилирования вторичной 11α-гидроксильной группы состоят в следующем:

- биотехнологическое ацетилирование 11α-гидроксипрогестерона является экологически более безопасным и экономически более эффективным процессом;

- процесс проводится без использования агрессивных химических ацетилирующих реагентов, таких как уксусный ангидрид, без использования органических оснований, например, пиридина, в качестве растворителя и одновременно катализатора ацетилирования, а также других возможных органических растворителей и катализаторов химической этерификации, известных из уровня техники, например, минеральных и органических кислот;

- биокаталитическая этерификация 11α-гидроксипрогестерона, как альтернатива химическому методу ацетилирования, является экологически более чистым и безопасным методом: в способе-прототипе для проведения реакции этерификации используется 30-кратное количество пиридина и 30-кратное количество уксусного ангидрида по объему к весу исходного соединения, а для высаживания кристаллов продукта реакции применяется 20-кратное количество воды к суммарному объему пиридина и уксусного ангидрида и промывка осадка водой; это требует разработки дополнительных методов регенерации растворителя и очистки промышленных стоков;

- биокаталитическое ацетилирование протекает регионаправленно без образования возможного побочного продукта енолацетилирования Δ⁴-3-кетогруппы молекулы 11α-гидроксипрогестерона - 3,11α-диацетоксипрегна-3,5-диен-20-она, содержание которого при использовании химического метода ацетилирования может иметь место и достигать 20-30%, что существенно осложняет очистку целевого 11α-ацетоксипрогестерона и приводит к потерям его выхода;

- биокаталитическое ацетилирование протекает с практически полной конверсией исходного субстрата и селективностью образования целевого продукта не ниже 85% в условиях интенсивной аэрации и не ниже 89% в условиях ограниченной аэрации. При этом выход выделенного кристаллического 11α-ацетоксипрогестерона составляет не менее 80% и 85% соответственно.

Для достижения указанного выше технического результата по настоящему изобретению предлагается использовать известный штамм дикого типа Aspergillus nidulans ВКПМ F-1069 в качестве биокатализатора для биотехнологического процесса ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона. Таким образом, сущность заявленного изобретения заключается также в применении известного штамма Aspergillus nidulans ВКПМ F-1069 по новому назначению, а именно для ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона.

Культурально-морфологические особенности штамма A. nidulans ВКПМ F1069.

На агаризованной среде образует круглые колонии диаметром 30-35 мм через 7 суток роста. Поверхность ровная, выпуклая, пушистая. Текстура средней плотности. Край колоний плотный, ровный. Цвет колоний в зоне спороношения зеленовато-белый. Обратная сторона палево-коричневая. Эксудат отсутствует. Характеризуется интенсивным спороношением. Цвет спор зеленый.

Основным свойством штамма по настоящему изобретению является наличие ацетилирующей активности и способности этерифицировать 11α-гидроксипрогестерон с образованием 11α-ацетоксипрогестерона с высоким выходом как в условиях интенсивной, так и в условиях ограниченной аэрации.

На фиг. 1 представлена схема получения 11α-ацетоксипрогестерона путем трансформации 11α-гидроксипрогестерона известным штаммом A. nidulans ВКПМ F-1069.

Трансформация 11α-гидроксипрогестерона протекает с образованием и 6β,11α-дигидроксипрогестерона в качестве побочного продукта. Процессы ацетилирования гидроксильной группы 11α-гидроксипрогестерона и его 6β-гидроксилирования являются конкурентными процессами трансформации, причем процесс биокаталитической этерификации имеет преимущества, так как не требует интенсивной аэрации. Этот вывод подтвержден экспериментально. При продолжительности трансформации 48 ч в условиях ограниченной аэрации в культуральной среде определено наличие только 11α-ацетоксипрогестерона и нетрансформированного исходного субстрата.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена схема трансформации 11α-гидроксипрогестерона штаммом A. nidulans ВКПМ F-1069.

На фиг. 2 представлены хроматограммы и результат масс-спектрометрического анализа 11α-ацетоксипрогестерона.

На фиг. 3-9 представлены ¹Н ЯМР-, ¹³С ЯМР-, DEPT-ЯМР-, HSQC-ЯМР- и НМВС-ЯМР- спектры 11α-ацетоксипрогестерона.

Осуществление изобретения

Штамм дикого типа Aspergillus nidulans ВКПМ F-1069 (synonym FGSC A4; АТСС 3863, 12996, 26451; CBS 112.46; NRRL 194) был получен из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ).

11α-Гидроксипрогестерон (II) (CAS №80-75-1, С₂₁Н₃₀О₃) и 11α-ацетоксипрогестерон (С₂₃Н₃₂О₄, M.w. 372.5 являются коммерчески доступными и могут быть приобретены, например, у компании Steraloids Inc. (USA) или у других производителей.

Неорганические соли были приобретены у компании Fluka (Germany). Дрожжевой экстракт и агар - у Difco Becton Dickinson and company (Sparks, USA).

Другие реагенты и растворители являются коммерчески доступными, были приобретены у российских производителей.

Для приготовления сред для культивирования и трансформации, водных растворов кислот, солей и щелочей использовали дистиллированную воду. Для промывки экстрактов в органических растворителях использовали питьевую водопроводную воду, если не оговорено особо.

Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре, то есть в диапазоне от 20 до 25°С. Для процессов, требующих более низкие температуры, чем комнатная, охлаждение обеспечивали холодной водопроводной водой (в диапазоне от 10 до 20°С) или смесью колотого льда и холодной воды (в диапазоне от 5 до 10°С).

Биотрансформацию осуществляли на качалке New Brunswick™ Innova® 44/44R в термостатированном помещении при температуре 37°С в режиме перемешивания 240-250 об/мин. для обеспечения условия интенсивной аэрации или в режиме перемешивания 60-100 об/мин. для обеспечения условия ограниченной аэрации.

Упаривание растворителей в вакууме осуществляли с использованием ротационного вакуумного испарителя Rotavapor ( Labortechnik AG) при остаточном давлении 0,35±0,05 кгс/см2 (35±5 кПа) и температуре воды в бане в диапазоне от 35-50°С в зависимости от природы упариваемого растворителя.

Высушивание кристаллов продукта до постоянного веса осуществляли при температуре 35-45°С при атмосферном давлении или с использованием вакуум-сушильного шкафа при остаточном давлении 0,35±0,05 кгс/см2 (35±5 кПа).

Для определения рН промывных вод использовали универсальную индикаторную бумагу с диапазоном значений от 0 до 12 (Лахема, Чехия).

Очистку продукта осуществляли фильтрацией через слой силикагеля на воронке Шотта №1, используя силикагель марки Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) (Merck, Germany).

Контроль за ходом элюирования осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя пластины Silica gel 60 F₂₅₄ (Merck, Germany) и хроматографические системы растворителей: дихлорметан-ацетон 9:1 (v/v) и дихлорметан-ацетон 4:1 (v/v). Пластинки просматривали в УФ-свете при длине волны 254 нм, затем опрыскивали 1% раствором ванилина в 10% водном растворе HClO₄, проявляли при температуре 100-120°С.

Структуру и чистоту продукта подтверждали, по меньшей мере, одним из следующих методов: ТСХ (пластины для ТСХ Silica gel 60 F₂₅₄ (Merck, Germany)), масс-спектрометрия, элементный анализ, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Температуру плавления продукта определяли на приборе для определения точки плавления М-565 ( Labortechnik AG).

¹Н- и ¹³C- ЯМР спектры были определены на спектрометре Bruker Avance-400 (Bruker BioSpin GmbH) с рабочей частотой 400 МГц и 100.6 МГц соответственно, используя дейтерированный хлороформ (99,8% D, Sigma-Aldrich), или дейтерированный диметилсульфоксид (99,9% D, Sigma-Aldrich) в качестве растворителя относительно тетраметилсилана (TMS NMR grade ≥99,9%, Sigma-Aldrich) в качестве внутреннего стандарта, в миллионных долях (м.д.).

Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) регистрировали на приборе Bruker Daltonics micrOTOF-Q II, используя электрораспылительную ионизацию (ESI). Измерения были получены в режиме положительных ионов со следующими параметрами: граничное напряжение капилляра 4500 В; диапазон масс от m/z 50 до 3000; внешняя калибровка (Electricpray Calibrant Solution, Fluka); давление распылителя 0,4 бар; скорость потока 3 мкл/мин; азот применяли в виде сухого газа (6 л/мин); температура интерфейса была установлена при 180°С. Образец вводили в камеру масс-спектрометра из системы HPLC Agilent 1260, снабженной колонкой Agilent Poroshell 120 ЕС-С18 (3.0×50 mm; 2,7 μm) и защитой, используя автосамплер. Образец вводили в растворе 50% ацетонитрила (квалификация LC-MS) в воде (ультрачистая вода MilliQ, Merck Millipore KGaA, Germany), и колонку элюировали смесью ацетонитрила (А) и воды (В) в градиенте концентраций со скоростью потока 400 мкл/мин в следующих параметрах градиента: 0-15% А в течение 6 мин, 15%-85% А в течение 1,5 мин, 85%-0% А в течение 0,1 мин, 0% А в течение 2,4 мин. Время удерживания было следующим: 11α-гидроксипрогестерон - 5,2 мин; 11α-ацетоксипрогестерон - 6,0 мин; 6β,11α дигидроксипрогестерон - 4,2 мин.

Образование 11α-ацетоксипрогестерона в результате трансформации 11α-гидроксипрогестерона культурой A. nidulans ВКПМ F-1069 подтверждено данными спектров ¹Н ЯМР, ¹³С ЯМР, 2DЯMP, хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения. На фиг. №№3-9 приведены спектры ЯМР и на фиг. №2 - хроматограмма и масс-спектр полученного 11α-ацетоксипрогестерона.

Для подтверждения образования 11α-ацетоксипрогестерона в процессе трансформации 11α-гидроксипрогестерона 11α-ацетоксипрогестерон был получен химическим синтезом из 11α-гидроксипрогестерона с применением известного из уровня техники метода ацетилирования. Кроме этого, полученный 11α-ацетоксипрогестерон был гидролизован известным из уровня техники методом с образованием исходного 11α-гидроксипрогестерона.

Выходы 11α-ацетоксипрогестерона, полученные биотрансформацией 11α-гидроксипрогестерона штаммом по настоящему изобретению и приведенные в примерах заявляемого изобретения, подтверждают эффективность предлагаемого способа и его пригодность для использования в промышленных процессах. Однако примеры даны лишь для иллюстрации биокаталитической способности заявляемого штамма конвертировать 11α-гидроксипрогестерон в 11α-ацетоксипрогестерон. Следует отметить, что указанная ацетилирующая способность штамма выявлена нами впервые. Выходы могут быть улучшены за счет оптимизации условий проведения биотрансформации с целью минимизации образования 6β,11α-дигидроксипрогестерона и сдвига направления модификации 11α-гидроксипрогестерона в сторону ацетилирования. Известно, что состав продуктов зависит от состава среды, рН среды, возраста культуры, от индукции исходным субстратом или продуктом [А.Н. El-Refai, and K.M. Ghanem Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338]. Поэтому для снижения активности энзима 6β-гидроксилазы и уменьшения количества образованного побочного 6β,11α-дигидроксипрогестерона необходимо оптимизировать параметры проведения процесса трансформации, например, значение рН среды, возраст культуры, способ внесения субстрата, состав среды для трансформации, температурный режим и другие, известные из уровня техники. Для примера в таблице 1 приведено влияние режима аэрации на конверсию 11α-гидроксипрогестерона заявляемым штаммом и на селективность образования 11α-ацетоксипрогестерона и 6β,11α-дигидроксипрогестерона, при прочих одинаковых условиях.

Для трансформации мы использовали среду СМ следующего состава, г/л: глюкоза - 40; MgSO₄×7H2O - 1; КН₂РО₄ - 0,74; пептон - 1; дрожжевой экстракт - 1; L-аспарагин - 0,7. Среда СМ была ранее использована А. et al [А. , М. Tadra, J. . Microbial transformations of steroids XXIV. Separation of androstane 17-hydroxy-epimers. Folia Microbiol. 1964, Vol. 9(6), 380-382] для ацетилирования тестостерона дрожжами и описана в статье А.Н. El-Refai и K.M. Ghanem [А.Н. El-Refai, and K.M. Ghanem. Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338] (среда II, pH 6,5), как наиболее благоприятная для конверсии прогестерона в 11α-гидрокси-производное культурой A. nidulans. Исходный субстрат вносили в среду для трансформации в виде раствора в биполярном апротонном растворителе, в качестве которого могут быть использованы диметилсульфоксид или диметилформамид. При этом концентрация растворителя в ферментационной среде может составлять 2-6% по объему. Трансформацию проводили при температуре 37°С, так как ранее нами было установлено, что повышение температуры трансформации прогестерона мицелиальным грибом Aspergillus niger с 28°С до 37°С на среде СМ при прочих равных условиях проведения процесса приводит к существенному подавлению 6β-гидроксилазной активности штамма [О.С. Савинова, П.Н. Сольев, Д.В. Васина, Т.В. Тяжелова, Т.В. Федорова, Т.С. Савинова. Биотрансформация прогестерона аскомицетом Aspergillus niger N402. Биохимия (Москва). 2018. Том 83(1), с. 71-77].

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Общий метод биотрансформации 11α-гидроксипрогестерона

Биотрансформация

Для получения посевного материала (споровой суспензии) штаммы выращивали при температуре 37°С в течение 7-10 суток на агаризованной среде МПА (мальт-экстракт - 3 г/л, пептон - 1 г/л, агар - 20 г/л). Споровую суспензию высевали в качалочные колбы вместимостью 750 мл, содержащие по 100 мл ростовой среды (из расчета ~1×10⁷ спор на 100 мл среды), и выращивали на качалке (240-250 об/мин) при температуре 37°С в течение 4±0,5 суток до достижения количества биомассы ~1 г/100 мл (по весу сухого мицелия). Затем в ростовую среду вносили 11α-гидроксипрогестерон в виде раствора в диметилсульфоксиде до финальной концентрации 0.5 г/л, при этом концентрация растворителя составляла 2% (об.). Трансформацию проводили при температуре 37°С в условиях интенсивной или ограниченной аэрации в течение 48 ч или 216 ч, параллельно культивируя штамм без 11α-гидроксипрогестерона в качестве контроля. Каждый эксперимент выполняли в трех повторностях.

Экстракция продуктов трансформации

Для извлечения продуктов трансформации 11α-гидроксипрогестерона использовали или метод экстракции с предварительным применением дезинтегратора-гомогенизатора для разрушения клеток микроорганизма, или метод двухэтапной экстракции - экстракции из предварительно отделенной культуральной жидкости и экстракции из мицелия мацерацией - с последующим объединением экстрактов.

Вариант 1.

По окончании инкубации ферментационную суспензию помещали в дезинтегратор-гомогенизатор типа Поттера-Эльвегейма порциями по 30-40 мл. Гомогенизацию проводили при комнатной температуре в течение 4-5 минут до полного разрушения клеток микроорганизма. Объединенный гомогенат экстрагировали дихлорметаном трижды порциями равного объема. Объединенные экстракты гомогената промывали водой, сушили Na₂SO₄, осветляли активированным углем и упаривали до прекращения погона. Содержание продуктов в остатке после упаривания оценивали с помощью количественной ТСХ. Для разрушения клеток микроорганизма может быть использован любой дезинтегратор-гомогенизатор, известный из уровня техники, пригодный для разрушения клеток мицелиальных грибов (ультразвуковой, механический и др.).

Вариант 2.

По окончании инкубации мицелий отфильтровывали, промывали дихлорметаном на фильтре. Продукты реакции из культуральной жидкости экстрагировали трижды порциями дихлорметана равного объема. Стероиды, адсорбированные на мицелии, извлекали ре-мацерацией (трижды), используя метанол и выдерживая без перемешивания в течение 4 ч. Метанол упаривали, остаток, содержащий воду, экстрагировали дихлорметаном трижды. Объединенные экстракты культуральной жидкости и мицелия промывали водой, сушили Na₂SO₄, осветляли активированным углем и упаривали до прекращения погона. Содержание продуктов в остатке после упаривания оценивали с помощью количественной ТСХ.

Извлечение 11α-ацетоксипрогестерона

Остаток после упаривания растворяли в 2-5 мл дихлорметана и фильтровали через слой силикагеля, помещенный на фильтровальную воронку Шотта №1, используя 10-кратное количество силикагеля к весу исходного субстрата (соотношение диаметра фильтра воронки к высоте слоя силикагеля 1:1.5-2). В качестве элюэнта использовали дихлорметан, для контроля элюции использовали ТСХ. По окончании элюирования 11α-ацетоксипрогестерона силикагель промывали метанолом для вымывания 6β,11α-дигидроксипрогестерона. Элюаты упаривали досуха. Кристаллизующийся остаток растирали с диэтиловым эфиром, суспензию охлаждали до температуры 5-10°С, выдерживали в течение 2 ч, осадок отфильтровывали, сушили до постоянного веса в вакуум-сушильном шкафу. Хроматографическую чистоту 11α-ацетоксипрогестерона подтверждали с помощью ТСХ, ВЭЖХ, масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии.

Пример 2. Биокаталитическое ацетилирование 11α-гидроксипрогестерона в условиях интенсивной аэрации на качалке (240-250 об/мин)

Вариант 1. Трансформация в течение 48 ч

Для экстракции продуктов трансформации использовали вариант 1 примера 1. Из 50 мг 11α-гидроксипрогестерона, загруженного на трансформацию, после извлечения получили 51 мг сухого остатка после упаривания, содержащего по данным анализа 30 мг 11α-гидроксипрогестерона (60% от загруженного), 17 мг (30,16 mol%) 11α-ацетоксипрогестерона и 2,5 мг (4,77 mol %) 6β,11α-дигидроксипрогестерона. По данным ТСХ анализа другие продукты трансформации отсутствуют.

Вариант 2. Трансформация в течение 216 ч

Для экстракции продуктов трансформации использовали вариант 2 примера 1. Из 500 мг 11α-гидроксипрогестерона, загруженного на трансформацию, получили 575 мг сухого остатка после упаривания, содержащего по данным анализа 480 мг (85,17 mol %) 11α-ацетоксипрогестерона и 75 мг (14,31 mol %) 6β,11α-дигидроксипрогестерона. По данным ТСХ анализа 11α-гидроксипрогестерон практически отсутствует. Выход кристаллического 11α-ацетоксипрогестерона составил 451 мг (80,02%, считая на загруженный 11α-гидроксипрогестерон).

Пример 3. Биокаталитическое ацетилирование 11α-гидроксипрогестерона в условиях ограниченной аэрации на качалке (90-100 об/мин)

Вариант 1. Трансформация в течение 48 ч

Для экстракции продуктов трансформации использовали вариант 1 примера 1. Из 50 мг 11α-гидроксипрогестерона, загруженного на трансформацию, после извлечения получили 50 мг сухого остатка после упаривания, содержащего по данным анализа 40 мг 11α-гидроксипрогестерона (80% от загруженного) и 10 мг (17,74 mol %) 11α-ацетоксипрогестерона. По данным ТСХ анализа 6β,11α-дигидроксипрогестерон и другие продукты трансформации отсутствуют.

Вариант 2. Трансформация в течение 216 ч

Для экстракции продуктов трансформации использовали вариант 2 примера 1. Из 500 мг 11α-гидроксипрогестерона, загруженного на трансформацию, получили 580 мг сухого остатка после упаривания, содержащего по данным анализа 506 мг (89,78 mol %) 11α-ацетоксипрогестерона и 49 мг (9,35 mol %) 6β,11α-дигидроксипрогестерона. По данным ТСХ анализа 11α-гидроксипрогестерон отсутствует. Выход кристаллического 11α-ацетоксипрогестерона составил 480 мг (85,17%, считая на загруженный 11α-гидроксипрогестерон).

ЯМР-спектры полученных образцов 11α-ацетоксипрогестерона идентичны спектрам стандартного образца и спектрам образца, полученного химическим методом ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона.

Пример 4. Получение 11α-ацетоксипрогестерона химическим методом

К раствору 34 мг 11α-гидроксипрогестерона в 0,2 мл уксусного ангидрида добавили 1 каплю 60% хлорной кислоты. Реакционную массу выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч. По окончании реакции реакционную массу добавляли по каплям в 5 мл воды, содержащей 1 мл 25% раствора аммиака (рН ~7.5). Перемешивали 30 мин., затем реакционную массу экстрагировали дихлорметаном трижды, экстракт промыли водой до нейтральной реакции, упарили досуха. Получили 39 мг остатка, из которого препаративной хроматографией извлекли 27 мг 11α-ацетоксипрогестерона с выходом 70,45%. Т. пл. 173-174°С (лит. Т. пл. 176-177°С [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74(23), 5933-5936].

Характеристика продуктов биотрансформации

11α-Гидроксипрогестерон, полученный гидролизом ацетокси-группы 11α-ацетоксипрогестерона, полученного по примеру 2 в условиях общего метода биотрансформации 11α-гидроксипрогестерона штаммом A. nidulans ВКПМ F-1069.

Т. пл. 164-166°С (лит. Т. пл. 164-165°С [K. Yildirim, and A. Kuru. Biotransformation of some steroids by Aspergillus candidus. Journal of Chemical Research, 2015. Vol. 39(9), 546-549]). M.w. 330.46.

Масс-спектр высокого разрешения C₂₁H₃₀O₃ (m/z): рассчитано для [М+Н]⁺ 331.2268, найдено 331.2264; рассчитано для [M+Na]⁺ 353.2087, найдено 353.2088. Спектр ¹Н-ЯМР идентичен спектру исходного субстрата.

11α-Ацетоксипрогестерон, полученный в условиях биотрансформации 11α-гидроксипрогестерона штаммом A. nidulans ВКПМ F-1069.

Т. пл. 172-174°С (лит. Т. пл. 176-177°С [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74(23), 5933-5936]. M.w. 372.5;

Масс-спектр высокого разрешения C₂₃H₃₂O₄ (m/z): рассчитано для [М+Н]⁺ 373.2373, найдено 373.2361; рассчитано для [M+Na]⁺ 395.2193, найдено 395.2183.

¹Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d₆): 5.67 (с, 1H СН-4), 5.14 (дт, 1Н, ³J_{11, 9}=10.6 Гц, ³J_{11, 10} 5.0 Гц, СН-11), 2,62 (дд (псевдо-т), 1H, ³J₁₇, _16α 8.9 Гц, ³J_{17, 16β} 9.1 Гц, СН-17), 2.47-2.35 (м, 2Н, СН-2β & CH-6β), 2.29-2.12 (м, 3Н, СН-6α & СН-12β & СН-2α), 2.10-1.96 (м, 1Н, СН-16β), 2.05 (с, 3Н, СН₃-21), 2.01 (с, 3Н, СН₃-23), 1.91-1.78 (м, 3Н, СН₂-1 & СН-7α), 1.72-1.60 (м, 3Н, СН-16α & СН-15α & СН-8), 1.50 (т, 1Н, ³J_{12α, 12β} 11.6 Гц, СН-12α), 1.44 (т, 1Н, ³J_{9, 8} 10.6 Гц, СН-9), 1.39-1.29 (ддд, 1Н, ³J_{14, 8} 10.7 Гц, ³J_{14, 15β} 6.4 Гц, ³J_{14, 15α} 5.6 Гц, СН-14) 1.29 (уш.с, 4Н, CH₃-19 & СН-15β), 1.17-1.00 (2×ддд, 2Н, ³J_{7α, 7β} 12.6 Гц, ³J_{7, 6α} ~ ³J_{7, 6β} 12.2 Гц, ³J_{7α, 8} 3.1 Гц, СН₂-7), 0.64 (с, 3Н, СН₃-18).

¹³С-ЯМР (300 МГц, DMSO-d₆): 208.61 (с, СО-20), 199.40 (с, СО-3), 170.14 (с, С-5), 170.10 (с, СО-22) 124.48 (с, СН-4), 70.58 (с, СНОН-11), 62.30 (с, СН-17), 55.34 (с, СН-9), 54.39 (с, СН-14), 45.02 (с, CH₂-12), 43.54 (с, С-13), 39.75 (с, С-10), 36.79 (с, СН₂-1), 34.72 (с, СН-8) 34.19 (с, СН₂-2), 33.03 (с, СН₂-6), 31.67 (с, СН₂-7), 31.37 (с, СН₃-21), 24.16 (с, СН₂-15), 22.96 (с, СН₂-16), 22.02 (с, СН₃-23), 18.20 (с, СН₃-19), 14.24 (с, СН₃-18).

Спектры идентичны спектрам стандартного образца, а также спектрам образца, полученного химическим методом ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона.

1. Способ получения 11α-ацетоксипрогестерона, включающий трансформацию 11α-гидроксипрогестерона штаммом мицелиального гриба Aspergillus nidulans, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером F-1069, при этом для трансформации споровую суспензию гриба высевают в качалочные колбы с ростовой средой, выращивают до достижения количества биомассы ~1 г/100 мл по весу сухого мицелия при перемешивании, затем в ростовую среду вносят раствор 11α-гидроксипрогестерона в диметилсульфоксиде или диметилформамиде до достижения их концентрации в среде от 2 до 6% (об.) и до концентрации субстрата в диапазоне 0,1-1,0 г/л, инкубируют на качалке при температуре 37±0,5°С в течение 4±0.5 суток в условиях ограниченной аэрации со скоростью 90-100 об/мин в течение 216 ч или в условиях интенсивной аэрации со скоростью 240-250 об/мин в течение не менее 168 ч, по окончании инкубации продукты извлекают экстракцией и очищают с получением целевого продукта 11α-ацетоксипрогестерона.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качалочные колбы с ростовой средой высевают споровую суспензию гриба из расчета ~1×10⁷ спор на 100 мл среды.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что перемешивание осуществляют со скоростью 240-250 об/мин.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что экстракцию продуктов трансформации из ферментационной суспензии проводят после предварительного разрушения клеток микроорганизма с помощью дезинтегратора-гомогенизатора.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что экстракцию продуктов трансформации из ферментационной суспензии проводят методом двухэтапной экстракции - экстракции из предварительно отделенной культуральной жидкости и экстракции из мицелия мацерацией - с последующим объединением экстрактов.

6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что очистку 11α-ацетоксипрогестерона от побочного продукта трансформации - 6β,11α-дигидроксипрогестерона - осуществляют фильтрацией через слой силикагеля в растворе дихлорметана.