Микроорганизм рода escherichia, продуцирующий о-фосфосерин, и способ получения о-фосфосерина или l-цистеина с использованием этого микроорганизма

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан штамм Escherichia coli KCCM11815P, продуцирующий O-фосфосерин, способ получения О-фосфосерина с использованием этого штамма, а также способы получения цистеина и его производного с использованием О-фосфосерина. Изобретение позволяет получать О-фосфосерин с высоким выходом посредством улучшения устойчивости штамма к нему. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к микроорганизму, продуцирующему О-фосфосерин, и к способу получения О-фосфосерина, цистеина или производных цистеина с использованием этого микроорганизма.

Предшествующий уровень техники

Являясь важной аминокислотой в метаболизме серы у всех организмов, L-цистеин используется не только в in vivo синтезе белков, таких как кератин волос и так далее, глутатиона, биотина, метионина и других серусодержащих метаболитов, но также в качестве предшественника в биосинтезе коферментов.

Что касается способа получения L-цистеина с использованием микроорганизма, то известны (1) способ биологического превращения D,L-2-аминотиазолин-4-карбоновой кислоты (D,L-ATC), используя микроорганизм (Ryu ОН et al., Process Biochem., 32:201-209, 1997), и (2) способ получения L-цистеина путем прямой ферментации с использованием Escherichia coli (европейский патент №ЕР0885962В; Wada М and Takagi Н, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). Кроме того, в данной области техники известен (патент Республики Корея №10-1381048) (3) способ получения О-фосфосерина (именуемого в дальнейшем "OPS") посредством ферментирования с использованием микроорганизма с последующим превращением О-фосфосерина в L-цистеин путем взаимодействия с сульфидом в условиях катализа О-фосфосерин-сульфгидрилазой (именуемой в дальнейшем "OPSS").

В частности, для того, чтобы получать цистеин посредством указанного выше способа (3), необходимо получать его предшественник, OPS. Например, OPS может быть получен путем регулирования активностей SerA, SerC и SerB, ферментов пути биосинтеза L-серина у микроорганизмов (Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, Vol 3. 2012 October; Wendisch VF et al., CurrOpinMicrobiol. 2006 Jun, 9(3):268-74; Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov, 71(11):7139-44.).

Техническая задача

В результате интенсивных усилий по созданию продуцирующего OPS микроорганизма авторы настоящего изобретения разработали микроорганизм, способный продуцировать OPS с высоким выходом, посредством дополнительного улучшения его устойчивости к OPS, создав тем самым настоящее изобретение.

Техническое решение

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить микроорганизм, продуцирующий O-фосфосерин (OPS).

В задачу настоящего изобретения также входило предоставление способа получения OPS, включающего культивирование продуцирующего OPS микроорганизма в среде и выделение OPS из микроорганизма или среды.

В задачу настоящего изобретения также входило предоставление способа получения цистеина или его производных, включающего:

а) получение O-фосфосерина посредством культивирования продуцирующего OPS микроорганизма в среде; и

б) осуществление взаимодействия OPS, полученного на стадии (а), или содержащей его среды с сульфидом в присутствии О-фосфосерин-сульфгидрилазы (OPSS) или экспрессирующего ее микроорганизма.

Полезные эффекты изобретения

Продуцирующий OPS микроорганизм по настоящему изобретению обладает устойчивостью к OPS в высокой концентрации и способен продуцировать OPS с высокой эффективностью, вследствие чего может эффективно использоваться для синтеза L-цистеина и так далее.

Лучший вариант осуществления изобретения

Для решения вышеуказанной выше задачи в одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм, продуцирующий O-фосфосерин (OPS).

При использовании здесь термин "О-фосфосерин" (в дальнейшем "OPS") относится к соединению, представляющему собой сложный эфир серина и фосфорной кислоты, которое является компонентом различных белков. В частности, OPS как предшественник L-цистеина может быть превращен в цистеин путем взаимодействия с сульфидом в условиях катализа OPS сульфгидрилазой (OPSS) (патент республики Корея №1381048).

При использовании здесь термин "продуцирование OPS" относится к продуцированию OPS в микроорганизме, а также к продуцированию OPS, которое имеет место в пределах микроорганизма, вне микроорганизма, например к выделению его в среду.

При использовании здесь термин "продуцирующий OPS микроорганизм" относится к штамму прокариотического или эукариотического микроорганизма, способному продуцировать OPS в организме, и, более конкретно, к микроорганизму, способному аккумулировать OPS в среде или в самом микроорганизме в результате генетического манипулирования или естественной мутации. Более конкретно, в настоящем изобретении продуцирующий OPS микроорганизм в виде штамма, обладающего высокой устойчивостью к OPS, может включать Escherichia coli, депонированный с номером доступа КССМ11815Р, у которого ингибирование роста клеток является низким даже при высокой концентрации OPS, и который также имеет очень хорошую продуктивность по OPS.

Например, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, у которого дополнительно снижены способность к поступлению OPS в клетку или к деградации OPS.

Помимо информации, раскрытой выше в отношении продуцирующего OPS микроорганизма, в качестве ссылочных материалов для настоящего изобретения можно использовать информацию, раскрытую в патенте Республики Корея №1381048 или в патентной публикации US №2012-0190081.

В задачу настоящего изобретения также входило предоставление способа получения OPS, включающего культивирование продуцирующего OPS микроорганизма в среде и выделение OPS из культивируемого микроорганизма или культуральной среды.

При использовании здесь термин "культивирование" относится к выращиванию микроорганизма в соответствующим образом подобранном окружении. В настоящем изобретении процесс культивирования может быть осуществлен с использованием подходящих среды и условий культивирования, хорошо известных в данной области техники. Процесс культивирования может быть легко скорректирован для использования специалистом в данной области техники в зависимости от выбранного штамма. Более конкретно, культивирование может быть осуществлено как периодический процесс, непрерывное культивирование и периодическое культивирование с подпиткой, но без ограничения этим.

Источники углерода, содержащиеся в среде, могут включать сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масло и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло, и жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линоленовая кислота; спирты, такие как этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота, которые можно использовать по отдельности или в виде смеси, но источники углерода ими не ограничиваются. Источники азота, содержащиеся в среде, могут включать органические источники азота (например пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкость для замочки кукурузы и соевую муку) и неорганические источники азота (например мочевину, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония), которые можно использовать по отдельности или в комбинации, но источники азота ими не ограничиваются. Источники фосфора, содержащиеся в среде, могут включать дигидрофосфат калия или гидрофосфат дикалия и соответствующие содержащие натрий соли, но источники фосфора ими не ограничиваются. Кроме того, среда может включать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, а также могут быть включены аминокислоты, витамины, подходящие предшественники и так далее. Такие среды или предшественники можно добавлять в ходе процесса периодического культивирования или процесса непрерывного культивирования в культуру, но без ограничения этим.

В ходе процесса культивирования рН культуры можно регулировать путем добавления подходящим образом в культуру такого соединения, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Дополнительно, в ходе процесса культивирования для предупреждения образования пены можно добавлять пеногаситель, такой как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты. Дополнительно, для поддержания аэробного состояния культуры можно вводить в культуру кислород или кислородсодержащий газ, а для поддержания анаэробного и микроаэробного состояний культуры культивирование можно осуществлять без ввода газа, либо можно вводить азот, водород или углекислый газ. Температура культивирования обычно может составлять от 27°С до 37°С, и более конкретно от 30°С до 35°С. Культивирование можно продолжать до тех пор, пока может происходить продуцирование желаемого(ых) вещества(в), и более конкретно в течение от 10 часов до 100 часов, но без ограничения этим.

В настоящем изобретении подходящие условия для выращивания микроорганизма могут легко регулироваться для использования специалистом в данной области техники. Например, хотя условия не этим ограничиваются, можно дополнительно добавлять в среду глицин или серии. Глицин может быть представлен в форме очищенного глицина, содержащего глицин дрожжевого экстракта и триптона, а концентрация, содержащаяся в культуральной среде, может обычно составлять от 0,1 г/л до 10 г/л, более конкретно от 0,5 г/л до 3 г/л. Кроме того, серии может быть представлен в форме очищенного серина, содержащего серии дрожжевого экстракта, триптона и так далее, а концентрация, содержащаяся в культуральной среде, обычно может составлять от 0,1 г/л до 5 г/л, более конкретно 0,1 г/л до 1 г/л.

В настоящем изобретении OPS, полученный в процессе культивирования, может затем быть выделен и очищен, и целевой OPS может быть выделен из культуры с использованием подходящего способа, известного в данной области техники (например культивирование циклического типа, непрерывное культивирование или периодическое культивирование с подпиткой, и так далее), но способ этим не ограничивается. Например, можно использовать такие методы, как центрифугирование, фильтрование, анионообменная хроматография, кристаллизация, HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) и так далее, и дополнительно целевой OPS может быть выделен из среды или микроорганизма с использованием подходящих методов, известных в данной области техники.

Еще один аспект настоящего изобретения заключается в предоставлении способа получения цистеина или его производного, включающего: (а) получение OPS посредством культивирования продуцирующего OPS микроорганизма в среде; и (б) осуществление взаимодействия OPS, полученного на стадии (а), или содержащей его среды с сульфидом в присутствии OPS-сульфгидрилазы (OPSS) или экспрессирующего ее микроорганизма.

При использовании здесь термин "OPS-сульфгидрилаза (OPSS)" относится к полипептиду, который катализирует реакцию превращения OPS в цистеин путем переноса тиольной группы (-SH) на OPS. Фермент впервые был идентифицирован у Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis и Trichomonas vaginalis (MinoK and Ishikawa K, FEBSletters, 551: 133-138, 2003; Burns KE et al., J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005). Дополнительно OPSS может включать белок OPSS дикого типа, а также вариантный белок, который демонстрирует активность, эквивалентную или большую, чем биологическая активность белка OPSS дикого типа, в виде последовательности, где часть последовательности полинуклеотида, кодирующего OPSS, удалена, заменена или добавлена. Например, могут быть включены белок OPSS и его вариантный белок, раскрытые в патентах Республики Корея №1381048 и 1208267, но без ограничения этим.

Сульфид может быть использован, если этот сульфид представляет собой любой сульфид, который представлен в форме жидкости или газа из-за разницы в рН, давлении и растворимости, а также твердые вещества, обычно используемые в родственной области техники, которые могут быть превращены в форму тиольной группы (группы -SH), такой как сульфид (S^2-), тиосульфат (S₂O₃^2-) и так далее. Более конкретно, могут быть использованы Na₂S, NaSH, H₂S, (NH₄)₂S, NaSH и Na₂S₂O₃, которые предоставляют тиольную группу для OPS. Поскольку указанное выше взаимодействие представляет собой взаимодействие, при котором один цистеин или производное цистеина получают путем предоставления одной тиольной группы одной реакционноспособной группе OPS, количество сульфида, добавляемого в процессе взаимодействия, может составлять от 0,1-кратной до 3 -кратной молярной концентрации OPS, более конкретно 1-2-кратной.

Кроме того, настоящее изобретение дополнительно включает выделение цистеина или его производного, полученного посредством взаимодействия стадии (б). В частности, целевой цистеин или его производное могут быть отделены и очищены от реакционного раствора с помощью подходящих реакций, известных в данной области техники.

Дополнительно, полученный как указано выше цистеин также может быть получен в виде различных производных цистеина путем модифицирования атомов водорода или специфичных групп атомов цистеина посредством реакций химического синтеза, известных в данной области техники.

При использовании здесь термин "производное" относится к побочному продукту, получаемому в процессе получения вместе с целевым соединением, и включает соединение, сходное с целевым продуктом, предшественник целевого продукта и сходное соединение, которое получают посредством химической модификации части определенного соединения. Как правило, «производное» относится к соединению, в котором атом водорода или специфичная группа атомов в соединении заменена другим атомом или группой атомов.

При использовании здесь термин "производное цистеина" относится к соединению, в котором атом водорода или специфичная группа атомов цистеина заменена другим атомом или группой атомов, и включает его предшественника. Например, соединение может находиться в форме, в которой другой атом или группа атомов присоединена к атому азота в аминогруппе (-NH₂) или к атому серы в тиольной группе (-SH) цистеина, и примеры включают N-ацетилцистеин (NAC), S-карбоксиметилцистеин (SCMC), Boc-Cys(Me)-OH, (R)-S-(2-амино-2-карбоксиэтил)-L-гомоцистеин, (R)-2-амино-3-сульфопропионовую кислоту, D-2-амино-4-(этилтио)масляную кислоту, 3-сульфино-L-аланин, Fmoc-Cys(Boc-метил)-OH, селено-L-цистин, S-(2-тиазолил)-L-цистеин, S-(2-тиенил)-L-цистеин, S-(4-толил)-L-цистеин и так далее, но без ограничения этим. Цистеин может быть легко превращен в N-ацетилцистеин (NAC) посредством взаимодействия с ацетилирующим агентом и может быть превращен в S-карбоксиметилцистеин (SCMC) посредством взаимодействия с галогеноуксусной кислотой в основных условиях. Поскольку производное цистеина используют главным образом в качестве фармацевтического исходного сырья, его можно использовать в качестве средства против кашля, препарата, подавляющего кашель, терапевтического агента против бронхита, бронхиальной астмы или фарингита, и так далее.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению продуцирующего О-фосфосерин микроорганизма КССМ11815Р, обладающего устойчивостью к О-фосфосерину (OPS).

В отношении применения, продуцирующий О-фосфосерин микроорганизм КССМ11815Р, обладающий устойчивостью к О-фосфосерину, является таким, как описано выше.

Как описано выше, продуцирующий О-фосфосерин микроорганизм по настоящему изобретению обладает высокой устойчивостью к OPS, и ингибирование клеточного роста является низким даже при высокой концентрации OPS и, кроме того, микроорганизм имеет хорошую продуктивность по OPS.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В дальнейшем настоящее изобретение будет описано подробно посредством типичных воплощений. Однако такие типичные воплощения предлагаются только с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1: Отбор мутантного штамма методом искусственного мутирования

Для того, чтобы получить мутантный штамм микроорганизма, у которого повышена продуктивность по O-фосфосерину (OPS), использовали раскрытый ниже метод для индуцирования мутирования микроорганизма.

Более конкретно, родительский штамм Escherichia coli дикого типа W3110, высевали в жидкую среду LB и инкубировали в течение 12 часов при 37°С. Затем 1 мл указанной культуры высевали в 100 мл жидкой среды и культивировали в течение 5 часов и 30 минут при 37°С с последующим извлечением 50 мл культуральной среды. Извлеченную культуру промывали 100 мМ цитратным буфером с последующим добавлением N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (NTG) с получением конечной концентрации 200 мг/л и обрабатывали в течение 45 минут, и затем культуру промывали 100 мМ фосфатным буфером.

Затем для того, чтобы получить продуцирующий OPS штамм, к минимальной среде М9 добавляли 20 г/л КН₂РО₄ и 10 г/л глюкозы и оставляли ее затвердевать с последующим посевом штамма, обработанного NTG. В частности, показатель гибели в минимальной среде М9 составлял 97%, и после инкубирования при 37°С в течение 12 часов был получен продуцирующий OPS мутантный штамм.

Мутантный штамм, полученный указанным выше методом, был назван Escherichia coli СА07-0348 и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов с номером доступа КССМ11815Р 26 февраля 2016 года согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Состав минимальной среды М9

Na₂HPO₄ 6,78 г/л, KH₂PO₄ 3 г/л, NH₄Cl 1 г/л, NaCl 0,5 г/л, глюкоза 10 г/л и агароза 15 г/л

Пример 2: Исследование продуктивности по OPS продуцирующего OPS мутантного штамма

Для подтверждения продуктивности по OPS Escherichia coli СА07-90348, мутантного штамма, полученного в вышеприведенном Примере 1, выполняли следующие эксперименты.

Для того, чтобы усилить метаболический путь биосинтеза OPS, штамм W3110 дикого типа и штамм СА07-0348, описанный выше, трансформировали вектором pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC (патент Республики Корея №1381048) посредством традиционно используемого метода электрического импульса. Каждый из штаммов высевали на твердую среду LB и культивировали в течение ночи в инкубаторе при 33°С. Штамм, культивированный в течение ночи на твердой LB, высевали в 25 мл указанной ниже среды для титрования и снова инкубировали при 34,5°С при 200 об./мин в течение 30 часов. После инкубирования измеряли количество продуцированного OPS, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию, и концентрации OPS в культуральной среде для каждого протестированного штамма представлены в Таблице 1 ниже.

Состав среды для титрования, использованной в данном Примере 2, приведен ниже.

Среда для титрования

Глюкоза 50 г/л, дрожжевой экстракт 0,3 г/л, глицин 2,5 г/л, КН₂РО₄ 6 г/л, (NH₄)₂SO₄ 17 г/л, MgSO₄⋅7H₂O 1 г/л, FeSO₄⋅7H₂O 5 мг/л, MnSO₄⋅4H₂O 10 мг/л и CaCO₃ 30 г/л

Как можно видеть в Таблице 1 выше, штамм дикого типа W3110 совсем не продуцировал OPS, в то время как мутантный штамм по настоящему изобретению СА07-0348, как было подтверждено, продуцирует OPS в концентрации 1,23 г/л. Кроме того, в случае, когда биосинтетический путь был улучшен посредством трансформации, дикий тип совсем не продуцировал OPS, в то время как штамм СА07-0348 продуцировал OPS в концентрации 2,3 г/л, и было подтверждено, что количество OPS повышалось до трансформации.

Пример 3: Исследование устойчивости к OPS у продуцирующего OPS мутантного штамма

Для того, чтобы подтвердить устойчивость к OPS Escherichia coli СА07-0348, OPS-продуцирующего мутантного штамма, полученного в Примере 1 выше, выполняли культивирование следующим способом.

Родительский штамм Escherichia coli W3110 и вышеописанный мутантный штамм высевали в 15 мл одноразовые пробирки, содержащие 2 мл среды LB, и инкубировали при встряхивании при 37°С при 200 об./мин в течение 12 часов и в результате получали посевную культуру. После однократного промывания культивированного штамма забуференным фосфатом физиологическим раствором 100 мкл посевной культуры высевали в 50 мл одноразовые пробирки, содержащие 5 мл среды для скрининга, и инкубировали при 37°С при 200 об./мин в течение 20 часов.

Состав среды для скрининга, использованной в Примере 3, был следующим.

Среда для скрининга

Глюкоза 10 г/л, LB 100 г/л, H₃PO₄ 1 г/л, OPS 100 г/л, КОН 0,27 М и NaOH 0,27 М, рН 7,0

После инкубирования с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность (именуемую в дальнейшем "ОП"), и ОП культуральной среды для каждого протестированного штамма представлена в Таблице 2 ниже.

В результате, как показано в Таблице 2 выше, родительский штамм Escherichia coli W3110 при культивировании в среде (среда для скрининга), содержащей 100 г/л OPS, в течение 20 часов показывал результат измерения ОП 0,20, в то время как мутантный штамм Escherichia coli СА07-0348 согласно настоящему изобретению, показывал значение ОП 0,39, подтверждая тем самым, что скорость роста была примерно в два раза быстрее.

Результаты, приведенные выше, означают, что мутантный штамм Escherichia coli СА07-0348 показывал устойчивость к 100 г/л OPS, приводящую к меньшему ингибированию роста клеток. Таким образом, микроорганизм по настоящему изобретению можно эффективно применять в массовом производстве OPS.

Исходя из вышеизложенного, специалист в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение, сможет понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения технических концепций или существенных признаков настоящего изобретения. В связи с этим, иллюстративные воплощения, раскрытые в данном описании изобретения, предназначены только для иллюстративных целей и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, настоящее изобретение предназначено охватывать не только иллюстративные воплощения, но также различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в сущность и объема настоящего изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения.

1. Штамм Escherichia coli KCCM11815P, продуцирующий O-фосфосерин (OPS), обладающий устойчивостью к O-фосфосерину.

2. Способ получения O-фосфосерина, включающий:

культивирование микроорганизма по п. 1 в среде; и

выделение O-фосфосерина из микроорганизма или среды.

3. Способ получения цистеина, включающий:

а) получение O-фосфосерина посредством культивирования микроорганизма по п. 1 в среде; и

б) осуществление взаимодействия O-фосфосерина, полученного на стадии (a), или содержащей его среды с сульфидом в присутствии O-фосфосеринсульфгидрилазы (OPSS) или микроорганизма, экспрессирующего OPSS.

4. Способ по п. 3, где сульфид представляет собой по меньшей мере один сульфид, выбранный из группы, состоящей из Na₂S, NaSH, (NH₄)₂S, H₂S и Na₂S₂O₃.

5. Способ получения производного цистеина, включающий:

а) получение O-фосфосерина посредством культивирования микроорганизма по п. 1 в среде;

б) осуществление взаимодействия O-фосфосерина, полученного на стадии (a), или содержащей его среды с сульфидом в присутствии O-фосфосеринсульфгидрилазы (OPSS) или микроорганизма, экспрессирующего OPSS, с получением цистеина и

(в) превращение цистеина, полученного на стадии (б), в производное цистеина.