Штамм гриба fusarium equiseti вкпм f-1455 для получения биопрепарата, восстанавливающего почву для сельскохозяйственных растений, биопрепарат и способ его получения

Предложена группа изобретений: штамм гриба Fusarium equiseti ВКПМ F-1455 – продуцент биологически активных соединений, способ его культивирования штамма и биопрепарат на основе штамма гриба Fusarium equiseti ВКПМ F-1455. Штамм Fusarium equiseti ВКПМ F-1455, обладающий способностью продуцировать биологически активные соединения, депонирован под регистрационным номером ВКПМ F-1455 и может быть использован для получения ферментативного биопрепарата. Способ получения ферментативного препарата предусматривает выращивание штамма гриба Fusarium equiseti ВКПМ F-1455 на питательной среде, содержащей мелассу свекловичную, глюкозу, аммоний азотнокислый, фосфат калия, микроэлементы и воду при заданном содержании компонентов. Культивирование осуществляют в течение 36-48 ч при температуре 22±1 °С, рН 5,5-6,2 и до содержания редуцирующих веществ в культуральной среде 0,9-1,5 мас. % с последующим фильтрованием и сгущением нативного раствора культуральной среды с получением биопрепарата. Биопрепарат представляет собой сгущенный фильтрат нативного раствора культуральной среды и может быть использован для восстановления почв для сельскохозяйственных растений. Группа изобретений позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных растений. 3 н.п. ф-лы, 16 ил., 13 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к полученному селекционным путем штамму гриба Fusarium equiseti Д -117, являющийся продуцентом широкого спектра активных соединений, оказывающих антагонистическое действие на возбудителей корневой гнили, снижающие содержание токсических веществ: гербицидов, пестицидов и солей тяжелых металлов в почве, устраняющие токсическое действие гербицидов, пестицидов и др. химических веществ на популяцию почвенной микрофлоры и растения, повышающие рост и активность микрофлоры почвы в том числе после химической обработки почвы, повышающие образование и скорость накопления органических веществ в почве, повышающие концентрацию и активность почвенных ферментов в почве, восстанавливающие и защищающие плодородный слой почвы от разрушения. И создание на основе его метаболитов ферментного препарата «Агрофлорин».

Штамм Fusarium equiseti Д - 117 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1455 и может быть использован для создания на основе его активных метаболитов биопрепаратов для сельского хозяйства.

Изобретение позволяет получать в процессе культивирования продуцента активные соединения метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды продуцента и создавать на их основе биопрепараты проявляющие антагонистическую активность против возбудителей корневой гнили, нейтрализующие токсическое действие пестицидов, гербицидов на почвенную микрофлору и растения, уменьшающие содержание солей тяжелых металлов в почве, повышающие образование и скорость накопления органических веществ, концентраций и активность почвенных ферментов в почве и восстанавливающие плодородный слой почвы.

Актуальность проблемы

Ежегодно увеличивающийся рост использования пестицидов, минеральных удобрений и химических средств защиты растений в сельском хозяйстве в ущерб экологии и здравому смыслу ведет к антропогенным разрушительным последствиям (Добровольский Г.В. "Тихий кризис планеты", Вестник Российской академии наук, 1997, т. 67, №4, с. 313-320):

Разрушается почва и уничтожается гумусный (плодородный) слой.

В результате применения пестицидов и минеральных удобрений резко растет минерализация почв, снижается содержание углерода и питательных веществ, увеличивается подвижность почвообразующих элементов и их вымывание, что приводит к деградации и разрушению почвенного покрова и уничтожению гумусного (плодородного) слоя почвы.

Разрушается естественная биоцинозная система почв.

Использование в сельском хозяйстве химических препаратов приводит к резкому снижению численности специфической сапротрофной почвенной микрофлоры. И как следствие этого к резкому снижению в почве концентраций и активности почвенных ферментов, ухудшению условий иммобилизации различных ферментов и резкому снижению содержания в почве органических соединений, таких как углеводы, фосфорорганические и азоторганические соединения, являющиеся основными носителями молекул внеклеточных ферментов, участвующих в почвенных биохимических обменных процессах. В результате этого резко замедляются процессы разложения растительных остатков, органических удобрений, пестицидов и других химических веществ, что приводит к накоплению в почве лигнина, фенолов, других фитотоксинов и солей тяжелых металлов.

Увеличивается рост фитопатогенной флоры и накопление токсических веществ в почве и растениях.

Нарушение равновесия, гибель и угнетение активности полезной почвенной микрофлоры приводят к утомлению и истощению почв, снижению активности биохимических обменных процессов, накоплению в почве токсических веществ, что создает благоприятные условия для роста и развития корневой гнили, патогенных грибов и других фитопатогенов. В результате чего растет поражаемость сельскохозяйственных культур и посевного материала фитопатогенами, фитотоксинами и корневой гнилью, резко падает урожайность сельскохозяйственных культур и снижается рентабельность сельскохозяйственного производства.

Новизна изобретения.

В сложившихся условиях для восстановления почв, повышения качества сельхозпродукции и борьбы с фитопатогенной флорой возникает необходимость создания и использования в сельскохозяйственном производстве биопрепаратов (биологических средств защиты, биоудобрений, ферментных препаратов) не наносящих вред растениям, животным и человеку, которые позволяют создать оптимальный баланс между показателями экологичности, экономичности и энергоэффективности агропроизводства. На данном этапе их основу в основном составляют биопрепараты на основе живых бактерий или продуктов их жизнедеятельности.

Однако данная группа биопрепаратов имеет ряд значительных недостатков: они не устойчивы и очень чувствительны к изменениям температур, влажности и состоянию почв и имеют короткий период действия (срок жизни колоний микроорганизмов составляет до 2 недель). Эффективность и спектр действия биопрепаратов на основе живых микроорганизмов очень мала, так как бактерии имеют узкий набор и малые концентрации продуцируемых метаболитов, что делает их малоэффективными и экономически не выгодными. Поэтому, для повышения эффективности действия биопрепаратов целесообразно использовать готовые активные метаболиты, а не живые микроорганизмы.

Наиболее эффективными оказываются активные метаболиты грибов, так как метаболическая активность грибов, набор и концентрации синтезируемых ими метаболитов в десятки раз превышает возможности других микроорганизмов, в том числе бактерий. При этом, биологическая активность метаболитов практически не зависит от состояния почв и температуры окружающей среды. Что делает их более экономически выгодными, более эффективными и удобными для применения. Кроме того, по сравнению с бактериями, метаболиты грибов оказывают более широкий спектр биологического действия и способны подавлять рост и развитие фитопатогенной флоры, в том числе патогенных грибов. По данным ряда авторов: Зубейру (1995, 1997), Шкаликов (1995), Моисеева (1997), Хашим (2000), Дорофеев В.А (2001) была показана антагонистическая активность ряда грибов против корневой гнили.

В последние годы опубликовано большое количество исследований, доказывающих эффективность использования в качестве компонентов биопрепаратов белки и аминокислоты. Внесение аминокислот в почву рассматривается как одно из наиболее перспективных направлений оптимизации минерального питания растений и повышения их устойчивости к действию стрессовых факторов внешней среды. Кроме того, растения способны так же усваивать такие сложные органические соединения, как полипептиды, полисахариды, витамины, сахара, органические кислоты, ферменты и др. (Пильщикова Н.В. "Физиология растений с основами микробиологии" 2004).

В литературе имеются сведения об участии высокомолекулярных соединений (полипептидов, ферментов, полисахаридов) различных микроорганизмов во взаимоотношениях с растениями (Морозова 1990, Duijiff 1994, Фиофилова 1994, Nihei 1998). Из научных исследований известно, что белки, ферменты, полисахариды, фитогормоны и другие активные соединения, выделенные из микроорганизмов, в том числе из грибов положительно влияют на физиологию растений (Г.Н. Чупахина, А.Ю. Романчук. Возможный механизм стимулирования ростовых процессов янтарной кислотой. 1999, Емельянова Е.П. Влияние ауксинов на укоренение растений.)

Основываясь на научных данных и в ходе проведения научных работ, был получен селекционным путем новый штамм гриба Fusarium equiseti Д - 117. Данный селекционный штамм гриба обладает высокой ферментативной активностью и широким спектром продуцируемых активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллинов. Метаболиты нативного раствора фильтрата культуральной среды данного штамма гриба проявляют высокую биологическую активность на почвообразующие процессы, а также проявляют высокую антагонистическую активность в отношении корневой гнили и других фитопатогенных грибов, что было изучено и показано в ряде научных исследований, проведенных в ведущих научных центрах страны.

Для оценки продуктивности нового штамма, как продуцента биологически активных метаболитов нами был исследован химический состав нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцента (таблица 1). Показано, что в его состав входят белки (полипептиды, ферменты), аминокислоты, углеводы (полисахариды), жиры, большое количество органических кислот, витамины группы В, комплекс микро- и макроэлементов в виде органических соединений (таблица 2-4).

Таким образом, представленные данные лабораторных исследований нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцента подтверждают, что штамм гриба Fusarium equiseti Д-117 в процессе своего роста продуцирует большое количество активных соединений: белков (полипептидов, ферментов), углеводов (полисахаридов), аминокислот, витаминов, органических кислот и гиббереллинов, а также микро и макроэлементов.

Нами впервые было изучено и показано эффективное положительное действие метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцируемые новым селекционным штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117 по защите популяции почвенной микрофлоры и восстановлении ее активности после токсического действия гербицидов, пестицидов и др. химических веществ, по снижению содержания в почве солей тяжелых металлов, на подавление роста и развития фитопатогенной флоры, в том числе корневых гнилей. А также, было показано их действие на повышение органической составляющей почвы, активацию биохимических реакций в почве и растениях и восстановления гумусного (плодородного) слой почвы. Что было показано в ряде научных исследований, проведенных в ведущих научных центрах страны.

Из материалов научного исследования, проведенного во Всероссийском Научно-Исследовательском Институте Биологической Защиты Растений: фиг. 1.

«При исследовании образцов почв, обработанных гербицидным препаратом, наибольшее количество полезной почвенной микрофлоры было выделено в образцах почв, с применением активных метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды штамма гриба Fusarium equiseti Д-117 и составило 65,5%. В первом контрольном варианте почвенных образцов (не обработанных гербицидом препаратом) данный показатель составил 13,4%, а во втором контрольном варианте почвенных образцов (обработанных гербицидом) данный показатель составил 7,2%. В то же время максимальное количество патогенных грибов, свидетельствующих об утомленности почв (Penicillium и Aspergillus), было отмечено в варианте с применением гербицида - 84,5%. В контрольном, варианте с применением метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды количество указанных грибов было на уровне 23%».

Полученные результаты исследования состояния микрофлоры почвенных образцов, обработанные метаболитами нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцируемые штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117, достоверно указывают на восстановление (сохранение) и активацию почвенной микрофлоры после обработки гербицидом и свидетельствует об отсутствии токсического и угнетающего действия гербицида на почвенную микрофлору и биологическое состояние почвы в целом. А также, достоверно показывают угнетающее действие метаболитов, продуцируемые штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117 на рост и развитие патогенных грибов.

Из материалов научно-лабораторных исследований, проведенного в Мадридском Политехническом Университете и Центральной Испытательной лаборатории ФГБУ ГЦАС: «Так однократное внесение активных метаболитов продуцента в почвенные образцы позволило повысить концентрацию органических веществ в почве в 2,3 раза по отношению к контролю и значительно снизить концентрации солей свинца и кадмия в почве (фиг. 2 и 3).

Данные анализа почвенных образцов, полученных под действием метаболитов (ферментов) продуцируемых штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117 достоверно свидетельствуют об их существенной роли на трансформацию и снижение содержания солей тяжелых металлов в почве и повышению концентрации органического вещества в почвенных образцах.

Из материалов научно-полевых исследований, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И.В Мичурина: фиг. 4

«Так спустя 15 дней после внесения метаболитов продуцента в почву все элементы качества (Р, K, Mg, Са), отвечающие за полноценное развитие растений оказались выше, чем перед внесением. Так внесенные метаболиты способствовали увеличению содержания в листьях фосфора на 32 пункта, калия - на 192, кальция - на 84, магния - на 51. Анализ проведен на сертифицированном экспресс оборудовании «Аквадонис».

Данные анализа растительных образцов, полученные под действием метаболитов продуцента на трансформацию элементов питания в почве, свидетельствуют о существенной роли ферментов нативного фильтрата культуральной среды, продуцируемые данным штаммом гриба в активации биохимических реакций в почве и растениях и оптимизации минерального питания растений.

«Полученные в ходе научного исследования данные достоверно свидетельствуют, что внесение метаболитов продуцента в почву: повышает образование и скорость накопления (концентрации) полезных органических веществ и микроэлементов в почве и растениях. Значительно повышается концентрация и активность почвенных ферментов, увеличивается способность иммобилизовать молекулы внеклеточных ферментов, тем самым существенно увеличивается скорость течения биохимических реакций и процессов в почве и растениях и значительно повышается биодоступность и усвояемость питательных веществ растениями».

Таким образом, представленные данные проведенных научных и лабораторных исследований достоверно подтверждают заявляемые биологические эффекты и действия метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцируемые штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117, заключающиеся в том, что метаболиты нативного фильтрата культуральной среды продуцента, оказывают антагонистическое действие на возбудителей корневой гнили, снижают содержание солей тяжелых металлов в почве, устраняют токсическое действие гербицидов, пестицидов и др. химических веществ на состояние и активность почвенной микрофлоры и растения, повышают образование и скорость накопления органических веществ, повышают концентрацию и активность почвенных ферментов в почве, усиливают биохимические реакции протекающие в почве и растениях, улучшают биодоступность и усвояемость питательных веществ растениями.

Практическая ценность работы

Изобретение относится к способу и технологии культивирования продуцента активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллинов, нового селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д-117 и заключается в выращивании продуцента на жидкой питательной среде, в которой с целью повышения синтеза гиббереллинов, увеличения скорости фильтрации культуральной жидкости и снижения себестоимости среды, в качестве основного источника глюкозы используют комбинацию глюкозы и свекловичной мелассы, являющуюся одновременно стимулятором синтеза гиббереллинов, а в качестве основного источника органического азота - аммоний азотнокислый, при следующих соотношениях: меласса свекловичная 40,0-60,0 г/л, глюкоза 4,0-7,0 г/л аммоний азотнокислый 0,6-0,8 г/л; фосфат калия 3,0-6,0 г/л, микроэлементы 0,25-1,0 мг/л, балансное количество воды. При этом процесс культивирования осуществляется в течении 36-48 часов при температуре 22+1 С и до содержания редуцирующих веществ в культуральной среде 0,9-1,5%, что позволяет получить значимые концентрации активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллиновой кислоты в нативном фильтрате культуральной среды, значительно увеличить скорость фильтрации культуральной жидкости и как следствие этого, значительно снизить себестоимость производства препарата.

Известно, что вегетативный рост грибов и их продуктивность можно эффективно регулировать источниками питания. В любой питательной среде для грибов значительную роль играют источник углерода и азота, а также их концентрации. В ходе изучения вегетативных особенностей нового штамма гриба, был определен наиболее эффективный источник углерода и азота, и их оптимальные концентрации, обеспечивающие максимальный рост биомассы мицелия гриба и высокий синтеза активных метаболитов, (таблица 5 и 6).

Анализ полученных данных показал, что наиболее эффективным источником углеводов для максимального роста грибного мицелия является комбинация мелассы свекловичной и глюкозы. Оптимальными для роста мицелия гриба оказались соотношения концентраций мелассы 40,0-60,0 г/л и глюкозы - 4,0-7,0 г/л и органического азота - 0,6-0,8 г/л. При этом было отмечено, что, максимальный рост мицелия (набор биомассы мицелия) наблюдался на 2 сутки. А интенсивность лизиса мицелия наблюдалась на 4-6 сутки культивирования и находилась в прямой зависимости от времени и температуры культивирования. В других вариантах мицелий гриба находился в стадии активного роста до конца эксперимента.

Таким образом, проведенные исследования питательной потребности культуры селекционного штамма гриба позволили определить оптимальные концентрации компонентов питательной среды, определить оптимальные сроки и температуру культивации штамма, с достижением значимых концентраций активных метаболитов в нативном фильтрате культуральной среды и увеличением скорости фильтрации культуральной жидкости до 110 мл в минуту по сравнению с другими питательными средами. Что позволяет значительно снизить себестоимость производства препаратов.

Анализируя результаты научных исследований вегетативных особенностей штамм гриба Fusarium equiseti Д - 117, было отмечено, что штамм гриба Fusarium equiseti Д-117 на всех стадиях своего развития продуцировал активные метаболиты и гиббереллины, однако в фазу активного роста мицелия, гриб накапливает полипептиды в мицелии и практически не выделяет их в культуральную среду, зато выделял большое количество ферментов, углеводов (полисахаридов), витаминов и органических кислот. А в фазу активного лизиса мицелий выделял в культуральную среду большое количество полипептидов, но при этом его ферментативная активность резко снижалась. Исходя из полученных данных было определено оптимальное время культивации гриба, которое составило 36-48 часов и обеспечивало достижения максимальных концентраций и соотношение метаболитов в нативном фильтрате культуральной среды, что было подтверждено в ряде научных экспериментов, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И.В Мичурина.

В первую очередь была проведена оценка эффективности действия метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцента в зависимости от времени культивирования гриба. В результате проведенного исследования была достоверно показана прямая зависимость эффективности действия различных концентраций метаболитов в нативном фильтрате культуральной среды на растения, подвергнутые воздействию моделированных стрессоров от времени культивирования продуцента. В ходе научного эксперимента было установлено, что не все концентрации метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды продуцента в зависимости от времени культивирования продуцента были одинаково эффективны. Так изучение фотосинтетической активности и интенсивности фотосинтеза показало, что наиболее эффективны были варианты концентраций метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды при культивировании продуцента в интервале 36-48 часов (фиг. 5 и 6).

Фиг. 5 Фотосинтетическая активность листьев подвоев яблони при воздействии стрессоров.

Фиг. 6 Интенсивность фотосинтеза листьев подвоев яблони при воздействии стрессоров.

Так анализ работы фотосистемы листьев показал, что показатель Fv/Fm в вариантах культивирования продуцента в течении 48 и 36 часов (переувлажнение) в среднем за период исследований составил 0,6 и 0,63 отн. ед. соответственно, тогда как в контроле он был 0,42 отн. ед. (что соответствует состоянию близкому к гибели). Подобные показатели, но несколько ниже (0,57 и 0,52 отн. ед. соответственно) отмечены в данных вариантах при воздействии засухи.

Аналогичные результаты были получены и при анализе интенсивности фотосинтеза листьев, однако в данном случае различия с контролем были более существенны - в вариантах 48 и 36 часов искомый показатель превышал контроль более чем в 2 раза.

Устьичная проводимость листьев так же в значительной степени зависела от воздействия стрессовых факторов высокой влажности почвы и засухи. Помимо этого известно, что высокая температура листовой пластинки, также, отрицательно сказывается на всех физиологических процессах в связи с чем на были проведены замеры данного показателя.

На основании проведенных анализов выявлено положительное влияние на растения всех видов обработок. Так температура листовой пластинки обработанных растений была на 1-1,5°С ниже контрольных в варианте «переувлажнение» и на 1,7-2,2°С - в варианте «засуха» (рис. 3). Устьичная проводимость листьев обработанных растений превышала контроль в 3,2-4,7 раза в варианте «переувлажнение» ив 1,1-1,5 раз в варианте «засуха». По данным показателям, также, наиболее эффективным были концентрации метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды в вариантах культивирования продуцента в течении 48 и 36 часов (Фиг. 7).

Фиг. 7. Устьичная проводимость и температура листовой пластинки подвоев яблони при воздействии стрессоров

Значимым показателями состояния растения являются анатомические характеристики листовой пластинки.

Применение активных метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды во всех вариантах оказал положительное воздействие и на анатомическую структуру листовой пластинки в опыте с моделированием как переувлажнения, так и засухи. По результатам анализов наиболее эффективными в варианте «переувлажнение» были обработки с концентрациями метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды в вариантах культивирования продуцента в течении 48 и 36 часов (фиг. 8).

Фиг. 8. Анатомическая структура листовой пластинки подвоев яблони при воздействии стрессоров.

Так же, было отмечено увеличение площади листовой пластинки, в варианте переувлажнение при обработке растения концентрациями метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды с культивацией продуцента в течении 36 и 48 часов, величина данного показателя превысила контроль почти в 2 раза общей площади листовой поверхности, (фиг 10).

Исходя из полученных данных было показано и еще раз подтверждено, что максимальные концентрации и соотношение метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды и их положительное влияние на биохимические процессы, протекающие в растения, достигаются при культивировании продуцента в течении 36-48 часов.

Технический регламент производства.

Предлагаемый способ культивирования продуцента активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллинов, селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д-117, заключается в выращивании продуцента на жидкой питательной среде содержащей основные компоненты при следующем оптимальном соотношении: меласса свекловичная 40,0-60,0 г/л; глюкоза 4,0-7,0 г/л; аммоний азотнокислый 0,6-0,8 г/л; фосфат калия 0,3-0,5 г/л; микроэлементы 0,25-1,0 иг/л, балансовое количество воды, рН 5,5-6,2. При этом содержание активных метаболитов в нативном фильтрате культуральной жидкости составляет: массовая доля сухого остатка 1,5-1,7; массовая доля белка 2,5-3,5; массовая доля углеводов 13,0-15,0; массовая доля жиров 0,05; балансовое количество воды до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в культуральном растворе составляет соответственно 9,0-10,9 г/л и 2850-3650 мкг/мл. Фильтруемость культуральной жидкости (по количеству образующегося нативного раствора) в единицу времени составляет 95- 110 мл/мин. Оптимальное время культивации продуцента составляет 36 - 48 часов.

Возможность получения препарата указанного состава промышленным способом иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1.

Посевной мицелий для рабочего ферментационного аппарата выращивается сначала в пробирках на твердой питательной среде (сусло-агаре), затем в колбах на качалке в жидкой питательной среде и далее в инокуляторе при следующем технологическом режиме: температура 24±2 С; рН 5,5-6,2; аэрация 1 м3/м3/мин.

Для приготовления посевной культуры качалочные колбы емкостью 550 мл со 100 мл стерильной питательной среды следующего состава: меласса свеклосахарная 4,0 г.; глюкоза 0,4 г.; аммоний азотнокислый 0,3 г.; фосфат калия однозамещенный 0,2 г.; рН 6,0, засевают агаровыми блоками культуры из пробирок. Посевную культуру выращивают на качалке при температуре 24-26 С в течение 20-24 ч и используют для засева производственного посевного аппарата. Посевной материал считается готовым, когда концентрация сухих веществ мицелия в культуральной среде достигает 12-15 г/л. 5-10 объемных процентов такой среды служат посевным материалом, который с соблюдением правил асептики переносится в рабочий ферментационный аппарат.

В посевной аппарат емкостью 1500 л с 1000 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л): меласса свеклосахарная 40,0; глюкоза 4,0; аммоний азотнокислый 0,6; фосфат калия однозамещенного 3,0; микроэлементы 25,0, рН 6,0, из инокулятора вносят 5-10 объемных процентов культуральной среды, являющейся посевным материалом.

Процесс ферментации осуществляют методом глубинного культивирования при температуре 22±1 С без механического перемешивания и при аэрации 600 куб. м/ч в течение 36 часов. По окончании ферментации культуральную жидкость подают на фильтр-пресс для отделения биомассы. Следующей стадией технологического процесса является сгущение культуральной среды с помощью вакуумных фильтрующих аппаратов. Количество полученного готового ферментного препарата составляет 1000 л. При этом содержание активных метаболитов в готовом препарате составляет (масс %): массовая доля сухого остатка 1,5; массовая доля белка 2,5; массовая доля углеводов 15,0; массовая доля жиров 0,05; остальное вода до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в нативном растворе составляет соответственно 9,5 г/л и 2850 мкг/мл. Фильтруемость культуральной жидкости (по количеству образующегося нативного раствора) в единицу времени составляет 95 мл/мин. Время культивации 36 часов.

Пример 2.

Посевной мицелий для рабочего ферментационного аппарата выращивается сначала в пробирках на твердой питательной среде (сусло-агаре), затем в колбах на качалке в жидкой питательной среде и далее в инокуляторе при следующем технологическом режиме: температура 24±2 С; рН 5,5-6,2; аэрация 1 м3/м3/мин.

Для приготовления посевной культуры качалочные колбы емкостью 550 мл со 100 мл стерильной питательной среды следующего состава: мальтоза 2,6 г.; аммоний азотнокислый 0,5 г.; фосфат калия однозамещенный 0,3 г.; рН 5,8,-6,2 засевают агаровыми блоками культуры из пробирок. Посевную культуру выращивают на качалке при температуре 24-26 С в течение 20-24 ч и используют для засева производственного посевного аппарата. Далее 5-10 объемных процентов такой среды служат посевным материалом, который с соблюдением правил асептики переносится в рабочий ферментационный аппарат.

Мицелий гриба выращивали в условиях глубинного культивирования в ферментационном аппарате объемом 1500 л, с использованием 1000 л следующей питательной среды (г/л): меласса свеклосахарная 60,0; глюкоза 7,0; аммоний азотнокислый 0,5; фосфат калия однозамещенного 3,0; микроэлементы 28,0; рН 6,2. Посевной материал вносили в количестве 5 объемных процентов. Температура культивирования 22±1оС, продолжительность культивирования 48 часов. Полученный таким образом препарат имел следующий состав (масс %): массовая доля сухого остатка 1,7; массовая доля белка 3,5; массовая доля углеводов 13,0; массовая доля жиров 0,05; остальное водя до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в нативном растворе составляет соответственно 10,9 г/л и 3650 мкг/мл. Фильтруемость культуральной жидкости (по количеству образующегося нативного раствора) в единицу времени составляет 110 мл/мин.

Ферментный препарат «Агрофлорин»

Основываясь на проведенных научных работах по изучению нового селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д -117, и его активных метаболитов, оказывающих антагонистическое действие на возбудителей корневой гнили, снижающие содержание токсических веществ: гербицидов, пестицидов и солей тяжелых металлов в почве, устраняющие токсическое действие гербицидов, пестицидов и др. химических веществ на популяцию почвенной микрофлоры и растения, повышающие рост и активность микрофлоры почвы в том числе после химической обработки почвы, повышающие образование и скорость накопления органических веществ в почве, повышающих активность и скорость биохимических реакций протекающих в почве и растениях, восстанавливающие и защищающие плодородный слой почвы от разрушения был создан ферментный препарат «Агрофлорин».

Ферментный препарат «Агрофлорин» характеризуется высоким для природных соединений содержанием и уникальным соотношением биологически активных соединений: белков (полипептидов, ферментов), углеводов (полисахаридов), жиров и органических кислот (таблица 7 и 9). Ферментный препарат «Агрофлорин» содержит большое количество аминокислот, в том числе незаменимые аминокислоты (таблица 8). В состав препарата «Агрофлорин» входят витамины группы В, фолиевая и никотиновая кислоты (таблица 11). Минеральный состав ферментного препарата «Агрофлорин» представлен важными для растений макро- и микроэлементами (таблица 10).

Ферментный препарат «Агрофлорин» является катализатором биохимических реакций протекающих в почве и растениях и предназначен для защиты и восстановления активности популяции полезной почвенной микрофлоры после химической обработки почв (например, применения нематицидов, почвенных гербицидов и др.), для нейтрализации токсического действия пестицидов, гербицидов, для уменьшения концентраций токсических химических веществ и солей тяжелых металлов в почве, для восстановления плодородного (гумусного) слоя почв, для предупреждения развития корневых гнилей и других фитопатогенов, для ускорения процессов разложения растительных остатков в поверхностном слое почвы, для защиты и восстановления мульчирующего слоя почвы, для предохранения почвы от образования почвенной корки; для улучшения структуры почвы и повышения устойчивости почвы к засолению и очистки почв от солей тяжелых металлов. Для восстановления и активации обменных процессов в семенах и растениях. Для улучшения развития корневой и вегетативной частей растения.

Нами в первые была изучена и оценена перспективность и эффективность действия ферментного препарата «Агрофлорин» на основе активных метаболитов нового селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д - 117 на восстановления почвенной микрофлоры и состояния почв после обработки (гербицидом) и подавлению роста и активности патогенных грибов родов: Cephalosporium, Rizopus, Alternaria, Mucor, Penicillium и Aspergillus, поражающих большинство семян и растений сельскохозяйственных культур и подавляющих полезную почвенную микрофлору (таблица 12-13).

Анализ данных, приведенных данных в таблице 12, свидетельствует о том, что наибольшее процентное количество грибов рода Trichoderma, которые относятся к супрессивной, т.е. полезной, микрофлоре почв было отмечено в вариантах с применением ферментного препарата «Агрофлорин» на основе метаболитов нового штамма в различных концентрациях. Максимальное количество грибов рода Penicillium, которые свидетельствуют об утомленности почв, было выделено в варианте с обработкой почв гербицидом - вариант 1а. Грибы рода Aspergillus выделялись только в варианте с применением гербицида - вариант 1а. Во всех вариантах, где почва обрабатывалась гербицидом (вариант 1а, 1б и 1в), были выделены одиночные колонии грибов рода Mucor. В некоторых отмечались представители других родов, относящихся к патогенной группе: Cephalosporium, Rizopus, Alternaria. Таким образом было показано, что среди исследуемых образцов наибольшее количество супрессивной, т.е. полезной, микробиоты (грибов р. Trichoderma) выделено в вариантах с применением ферментного препарата «Агрофлорин», что свидетельствует об отсутствии токсического действия гербицида на почвенную микрофлору и биологическое состояние почвы в целом. А также, достоверно показано угнетающее действие ферментного препарата Агрофлорин на рост и развитие патогенных грибов.

Нами впервые было изучено и показано действие ферментного препарата «Агрофлорин» на восстановления и активацию почвенных процессов: повышение образования и скорость накопления (концентрацию) полезных органических веществ и микроэлементов в почве и растениях, в результате чего значительно повышается скорость и активность биохимических реакций в почве и растениях, увеличивается усвояемость растениями питательных веществ и микроэлементов.

Из материалов научно-полевых исследований, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И.В Мичурина: «Полученные в ходе научного исследования данные достоверно свидетельствуют, что внесение ферментного препарата «Агрофлорин» в почву: повышает образование и скорость накопления (концентрации) полезных органических веществ и микроэлементов в почве и растениях. Значительно повышается концентрация и активность почвенных ферментов, увеличивается способность иммобилизовать молекулы внеклеточных ферментов, тем самым существенно увеличивается скорость течения биохимических реакций и процессов в почве и растениях. Так однократное внесение ферментного препарата «Агрофлорин» в прикорневую зону растений позволило повысить содержания в листьях растений калия - на 192 пункта, а также кальция - на 84 и магния - на 51, по отношению к контрольным образцам».

Увеличение калия, являющегося важнейшим элементом, регулирующим поступление влаги в растения и ее транспирацию, позволило растениям сохранить активность физиологических процессов в условиях засухи. Данные анализа растительных образцов, полученные под действием ферментного препарата «Агрофлорин» на трансформацию элементов питания в почве, свидетельствуют о существенной роли ферментов в оптимизации минерального питания растений и увеличении биодоступности и усвояемости питательных веществ и микроэлементов растениями. На всех культурах, где препарат вносился с капельным поливом, отмечалась повышенная устойчивость к засухе, интенсивное цветение и плодоношение, увеличение размеров плодов и их вкусовых качеств.

Из материалов научно-полевых исследований, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И.В Мичурина: «Полученные в ходе научного исследования данные достоверно свидетельствуют, что внесение ферментного препарата «Агрофлорин» в прикорневую зону растений позволило значительно увеличить скорость течения биохимических процессов в растениях: развитие вторичной корневой системы превысило контроль в 2 раза, работа интенсивности фотосинтеза листьев превысила контроль более чем в 2, 5 раза, суммарный прирост, общий вес растений по отношению к контрольным образцам составил 75%, увеличение массы и количества плодов по отношению к контролю превысило 1,5 раза», (см. фиг. 10 и 11)».

На основании полученных данных проведенных полномасштабных полевых исследований эффективности действия препарата «Агрофлорин» в различных климатических зонах (Брянская обл., Псковская обл., Астраханская обл., Кабардино-Балкарская Республика, Чеченская Республика, Самарская обл., Республика Татарстан и ряд других) и на различных культурах (озимые и яровые зерновые, картофель, подсолнечник, кукуруза, рапс, горчица, хлопчатник, кормовые культуры и т.д.) было достоверно показано, положительное влияние ферментного препарата «Агрофлорин» на развитие растений, увеличение роста и развития корневой и вегетативной системы растений, увеличение и суммарный прирост зеленой части и общего веса растений, увеличения прироста по урожайности. Увеличение устойчивости растений к засухе. Восстановление биоактивности почвы после химических обработок, увеличение интенсивность вовлечения пожнивных остатков в процесс гумусообразования. (Фиг. 9, 12-15).

Фиг. 1. Влияние ферментного препарата «Агрофлорин» на урожайность

Преимущества и отличия ферментного препарата «Агрофлорин» от биопрепаратов на основе живых микроорганизмов.

• Ферментный препарат «Агрофлорин» в отличие от биопрепаратов, содержащие живые бактерии, устойчив к перепадам температур, состоянию и химическому загрязнению почв. Действие препарата продолжается 4-6 месяцев в широком диапазоне температур - +1…+50°С. Тогда, как биопрепараты не устойчивы и очень чувствительны к изменениям температур, влажности и состоянию почв. Продолжительность действия биопрепаратов короткое (срок жизни колоний микроорганизмов составляет до 2 недель).

• Действия ферментного препарата «Агрофлорин» начинается сразу при внесении в почву, тогда как, для начала действия биопрепаратов требуется определенное время и оптимальные условия среды (колонии живых микроорганизмов должны адаптироваться в новой среде, должны иметь достаточно питания для начала активной работы. Что при современном состоянии почв практически не реально).

• Эффективность и спектр действия ферментного препарата «Агрофлорин» в десятки раз превышает эффективность и спектр действия биопрепаратов. Причиной тому служат, количество, высокие концентрации и особенности ферментов, в частности их способность сохранять активность в большом диапазоне температурного режима от минусовых до +70°С. При этом каждая молекула фермента способна вступать в реакцию с более чем ста молекулами субстрата в течение одной секунды, что делает ферментный биопрепарат особенно ценными для сельскохозяйственного производства, как в условиях низких температур, так и при засухе.

• Очень низкий расход ферментного препарата на единицу площади, в отличие от биопрепаратов. Причиной тому служат, количества и очень высокие концентрации ферментов, питательных веществ и микроэлементов в ферментном препарате. 1 литр ферментного препарата обрабатывает 3 гектара почвы.

Регламент производства ферментного препарата «Агрофлорин»

Посевной мицелий селекционного штамма гриба для рабочего ферментационного аппарата выращивается сначала в пробирках на твердой питательной среде (сусло-агаре), затем в колбах на качалке в жидкой питательной среде и далее в инокуляторе при следующем технологическом режиме: температура 24±2 С; рН 6,0; аэрация 1 м3/м3/мин.

Для приготовления посевной культуры качалочные колбы емкостью 550 мл со 100 мл стерильной питательной среды следующего состава: меласса свеклосахарная 4,0 г.; глюкоза 0,4 г.; аммоний азотнокислый 0,3 г.; фосфат калия однозамещенный 0,2 г.; рН 6,0, засевают агаровыми блоками культуры из пробирок. Посевную культуру выращивают на качалке при температуре 24-26 С в течение 20-24 ч и используют для засева производственного посевного аппарата. Посевной материал считается готовым, когда концентрация сухих веществ мицелия в культуральной среде достигает 12-15 г/л. 5-10 объемных процентов такой среды служат посевным материалом, который с соблюдением правил асептики переносится в рабочий ферментационный аппарат.

В посевной аппарат емкостью 1500 л с 1000 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л): меласса свеклосахарная 40,0; глюкоза 4,0; аммоний азотнокислый 0,6; фосфат калия однозамещенного 3,0; микроэлементы 25,0; рН 6,0, из инокулятора вносят 5-10 объемных процентов культуральной среды, являющейся посевным материалом.

Процесс ферментации осуществляют методом глубинного культивирования при 22±1 С без механического перемешивания и при аэрации 600 куб. м/ч в течение 36 часов. По окончании ферментации нативный раствор культуральной жидкости подают на фильтр-пресс для отделения биомассы. Следующей стадией технологического процесса является добавление в нативный раствор фильтрата культуральной среды борной кислоты из расчета 2-4 мг/л. и сгущение нативного раствора фильтрата культуральной среды с помощью вакуумных фильтрующих аппаратов. Нативный раствор фильтрата культуральной среды характеризуют по содержанию органических кислот, сухих веществ, величине рН. Количество полученного готового ферментного препарата составляет 1000 л. При этом содержание активных метаболитов в готовом препарате составляет (масс %): массовая доля сухого остатка 1,5; массовая доля белка 2,5; массовая доля углеводов 15,0; массовая доля жиров 0,05; остальное вода до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в готовом препарате составляет соответственно 9,5 г/л и 2850 мкг/мл. Время культивации 36 часов.

1. Штамм гриба Fusarium equiseti ВКПМ F-1455 для получения биопрепарата, восстанавливающего почву для сельскохозяйственных растений.

2. Способ получения ферментного биопрепарата на основе штамма гриба Fusarium equiseti ВКПМ F-1455, включающий выращивание на жидкой питательной среде, содержащей компоненты при следующих соотношениях: меласса свекловичная - 40,0-60,0 г/л, глюкоза - 4,0-7,0 г/л, аммоний азотнокислый - 0,6-0,8 г/л, фосфат калия - 3,0-6,0 г/л, микроэлементы - 1,0 мг/л (в качестве микроэлементов используются сернокислый марганец 0,25, сернокислый цинк 0,25 и борная кислота 0,5), балансное количество воды, при этом процесс культивирования осуществляют в течение 36-48 часов при температуре 22±1 °С, рН 5,5-6,2 и до содержания редуцирующих веществ в культуральной среде 0,9-1,5 мас. % с последующим фильтрованием и сгущением нативного раствора культуральной среды.

3. Биопрепарат, представляющий собой сгущенный фильтрат нативного раствора культуральной среды, для восстановления почв для сельскохозяйственных растений.