Моноклональные антитела человека к белку программируемой смерти 1 (pd-1) и способы лечения рака с использованием анти-pd-1-антител самостоятельно или в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами

Авторы патента:

КАРДАРЕЛЛИ Жозефин М. (US)

КОРМАН Алан Дж. (US)

ЧЭНЬ Бин (US)

ВАН Чанюй (US)

СРИНИВАСАН Мохан (US)

СЕЛБИ Марк Дж. (US)

C12Q1/68 - использующие нуклеиновые кислоты

C12Q1/02 - использующие жизнеспособные микроорганизмы

C12P21/08 - моноклональные антитела

C12N5/00 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

C12N15/09 - метод рекомбинантных ДНК

C07K16/2818 - Иммуноглобулины, например моноклональные или поликлональные антитела

C07K16/28 - против рецепторов, клеточных поверхностных антигенов или клеточных поверхностных детерминантов

C07K16/18 - против материала из животных или человека

A61K51/10 - антитела или иммуноглобулины; их фрагменты

A61K39/39558 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

A61K2039/505 - Лекарства и медикаменты для терапевтических, стоматологических или гигиенических целей (изготовление специальных лекарственных форм A61J; химические аспекты или использование материалов для дезодорации воздуха, для дезинфекции или стерилизации или для бандажей, перевязочных средств, впитывающих прокладок или хирургических приспособлений A61L; соединения как таковые C01, C07,C08,C12N; мыла C11D; микроорганизмы как таковые C12N)

Владельцы патента RU 2732924:

Е.Р. Сквибб энд Санз, Эл.Эл.Си. (US)
ОНО ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД. (JP)

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ лечения инфекционного заболевания у субъекта, способ модификации иммунной реакции на инфекционный агент у субъекта и способ активации Т-клеточных реакций на инфекционный агент у субъекта. Указанные способы осуществляются с участием антитела или его антигенсвязывающей части, содержащих: CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15-21; CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22-28; CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29-35; CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36-42; CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 43-49; и CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 50-56. Изобретение расширяет арсенал средств лечения инфекционных заболеваний. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 54 ил., 7 табл., 24 пр.

ОПИСАНИЕ

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящее изобретение является национальной фазой международной заявки РСТ/JP06/0309606, поданной 2 мая 2006, по которой испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США No. 60/679466, поданной 9 мая 2005, предварительной патентной заявки США No. 60/738434, поданной 21 ноября 2005, и предварительной патентной заявки США No. 60/748919, поданной 8 декабря 2005, каждая из которых приведена в описании в качестве ссылки в полном объеме.

Перечень последовательностей

В приложении к описанию также представлен перечень последовательностей, направленный посредством EFS 31 октября 2007 согласно 37 C.R.F. §I.52(e)(5); текстовой файл перечня последовательностей обозначен 077375, 0499SEQLISTING.txt имеет размер 48642 байта и создан 3 октября 2007. Перечень последовательностей, поданный в электронной версии, не ограничивает рамки описания и не содержит новых объектов.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение главным образом относится к иммунотерапии при лечении заболевания человека и уменьшению ее побочных эффектов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению анти-РD-1-антител и к применению комбинированной иммунотерапии, включая комбинацию анти-CTLA-4 и анти-PD1-антител, для лечения рака и/или для уменьшения частоты или тяжести побочных эффектов, связанных с лечением такими отдельно используемыми антителами.

Уровень техники

Белок программируемой смерти 1 (PD-1) является ингибиторным членом семейства рецепторов CD28, которое включает в себя также CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется активированными В-клетками, Т-клетками и миелоидными клетками (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennet et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). Первоначальные члены данного семейства, CD28 и ICOS, были обнаружены по функциональным действиям на увеличение пролиферации Т-клеток после добавления моноклональных антител (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10: 247-260). PD-1 был обнаружен скринингом на дифференциальную экспрессию в апоптотических клетках (Ishida et al. (1992) EMBO J 11: 3887-95). Другие члены данного семейства, CTLA-4 и BTLA, были обнаружены скринингом на дифференциальную экспрессию в цитотоксических Т-лимфоцитах и THl-клетках, соответственно. CD28, ICOS и CTLA-4, все, имеют неспаренный остаток цистеина, дающий возможность гомодимеризации. В противоположность этому, предполагается, что PD-1 существует в виде мономера, не имея неспаренного остатка цистеина, характерного для других членов семейства CD28.

Ген PD-1 является трансмембранным белком типа I 55 кДа, который является частью суперсемейства генов Ig (Agata et al. (1996) Int Immunol 8: 765-72). PD-1 содержит мембранопроксимальный иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) и мембранодистальный мотив переключения на основе тирозина (ITSM) (Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181: 1953-6; Vivier, E и Daeron, M (1997) Immunol Today 18: 286-91). PD-1, хотя и является структурно сходным с CTLA-4, лишен мотива MYPPPY, который является критическим для связывания В7-1 и В7-2. Были идентифицированы два лиганда для PD-1, PD-L1 и PD-L2, которые, как было показано, отрицательно регулируют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). Как PD-L1, так и PD-L2 являются гомологами В7, которые связываются с PD-1, но не связываются с другими членами семейства CD28. Один лиганд для PD-1, PD-L1, является изобилующим в различных типах рака человека (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8: 787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к уменьшению инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, уменьшению опосредованной рецептором Т-клеток пролиферации и ускользанию от иммунологического надзора раковых клеток (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81: 281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54: 307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 5094-100). Иммуносупрессия может быть обращена ингибированием локального взаимодействия PD-1 с PD-L1, и это действие является аддитивным при блокировании взаимодействия PD-1 с PD-L2 (Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170: 1257-66).

PD-1 является ингибирующим членом семейства CD28, экспрессируемым на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). PD-1-недостаточные животные развивают различные аутоиммунные фенотипы, включая аутоиммунную кардиопатию и подобный волчанке синдром с артритом и нефритом (Nishimura et al. (1999) Immunity 11: 141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291: 319-22). Кроме того, было обнаружено, что PD-1 играет роль в аутоиммунном энцефаломиелите, системной красной волчанке, болезни трансплантат против хозяина (GVHD), диабете типа I и ревматоидном артрите (Salama et al. (2003) J Exp Med 198: 71-78; Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 13: R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 13: 510). Было показано, что в линии мышиных опухолевых В-клеток ITSM PD-1 является необходимым для блокирования BCR-опосредованного вхождения Ca²⁺ и фосфорилирования тирозина, находящихся ниже по ходу процесса эффекторных молекул (Okazaki et al. (2001) PNAS 98: 13866-71).

Таким образом, желательными являются агенты, которые распознают PD-1, и способы применения таких агентов.

Описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает выделенные моноклональные антитела, в частности, моноклональные антитела человека, которые связываются с PD-1 и которые проявляют многочисленные желаемые свойства. Такие свойства включают, например, высокую аффинность связывания с PD-1 человека, но отсутствие существенной перекрестной реактивности с CD28, CTLA-4 или ICOS человека. Кроме того, было показано, что антитела настоящего изобретения модулируют иммунные реакции. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к способам модуляции иммунных реакций с использованием анти-PD-1-антител. В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования роста опухолевых клеток in vivo с использованием анти-PD-1-антител.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части, где данное антитело проявляет по меньшей мере одно из следующих свойств:

(a) связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-7 М или менее;

(b) по существу не связывается с CD28, CTLA-4 или ICOS человека;

(d) увеличивает продуцирование интерферона-гамма в анализе MLR;

(e) увеличивает секрецию интерлейкина-2 (IL-2) в анализе MLR;

(f) связывается с PD-1 человека и PD-1 собакоподобной обезьяны;

(g) ингибирует связывание PD-L1 и/или PD-L2 с PD-1;

(h) стимулирует антигенспецифические ответные реакции памяти;

(i) стимулирует ответные реакции антител;

(j) ингибирует рост опухолевых клеток in vivo.

Предпочтительно, данное антитело является антителом человека, хотя в альтернативном варианте осуществления данное антитело может быть мышиным антителом, химерным антителом или гуманизированным антителом.

В более предпочтительных вариантах осуществления данное антитело связывается с PD-1 человека с K_D 5×10^-8 М или менее, связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-8 М или менее, связывается с PD-1 человека с K_D 5×10^-9 М или менее, или связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-8 М-K_D 1×10^-10 М.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, которая содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14;

В различных вариантах осуществления ссылочное антитело содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;

или ссылочное антитело содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;

или ссылочное антитело содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;

или ссылочное антитело содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11;

или ссылочное антитело содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;

или ссылочное антитело содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;

или ссылочное антитело содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена V_H 3-33, где данное антитело специфически связывает PD-1. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена V_H 4-39, где данное антитело специфически связывает PD-1. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена V_K L6, где данное антитело специфически связывает PD-1. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее вариабельную область легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена V_K L15, где данное антитело специфически связывает PD-1.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

(a) вариабельную область тяжелой цепи гена V_H 3-33 человека; и

(b) вариабельную область легкой цепи гена V_K L6 человека;

где данное антитело специфически связывается с PD-1.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

(a) вариабельную область тяжелой цепи гена V_H 4-39 человека; и

(b) вариабельную область легкой цепи гена V_K L15 человека;

где данное антитело специфически связывается с PD-1.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело человека, или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где

(a) последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35, и их консервативных модификаций;

(b) последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, 51, 52, 53, 54, 55 и 56, и их консервативных модификаций; и

Предпочтительно, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28, и их консервативных модификаций; и последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47 и 49, и их консервативных модификаций. Предпочтительно, последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21, и их консервативных модификаций; и последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41 и 42, и их консервативных модификаций.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(a) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7;

(b) вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14;

(d) данное антитело по существу не связывается с CD28, CTLA-4 или ICOS человека.

В предпочтительном варианте осуществления данные антитела дополнительно обладают по меньшей мере одним из следующих свойств:

(a) данное антитело увеличивает пролиферацию Т-клеток в анализе MLR;

(b) данное антитело увеличивает продуцирование интерферона-гамма в анализе MLR или

Дополнительно или альтернативно, данное антитело может обладать одним или несколькими другими признаками, перечисленными выше.

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28;

(c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41 и 42;

(е) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49; и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, 51, 52, 53, 54, 55 и 56;

где данное антитело специфически связывает PD-1.

Предпочтительная комбинация содержит:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 15;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 22;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 36;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 43, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 50.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 16;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 23;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:37;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 44, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 51.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 17;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 24;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 38;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 45, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 52.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 18;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 25;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 39;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 46, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 53.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 19;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 26;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 40;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 47, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 54.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 20;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 27;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 41;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:48, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 55.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 21;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 28;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 42;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 49, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 56.

Другие предпочтительные антитела настоящего изобретения, или их антигенсвязывающие части, содержат:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14;

где данное антитело специфически связывает PD-1.

Предпочтительная комбинация содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

Антитела настоящего изобретения могут быть, например, полноразмерными антителами, например, изотипа IgG1 или IgG4. Альтернативно, данные антитела могут быть фрагментами антител, такими как Fab или F(ab')₂ фрагменты, или одноцепочечными антителами.

Настоящее изобретение обеспечивает также иммуноконъюгат, содержащий антитело настоящего изобретения или его антигенсвязывающую часть, связанные с терапевтическим агентом, таким как цитотоксин или радиоактивный изотоп. Настоящее изобретение обеспечивает также биспецифическую молекулу, содержащую антитело или его антигенсвязывающую часть настоящего изобретения, связанные со второй функциональной частью, имеющей другую специфичность связывания, чем указанное антитело или его антигенсвязывающая часть.

Обеспечены также композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающую часть, или иммуноконъюгат или биспецифическую молекулу настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие данные антитела или их антигенсвязывающие части настоящего изобретения, также включены в настоящее изобретение, а также экспрессирующие векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие экспрессирующие векторы. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает трансгенную мышь, содержащую трансгены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека, причем указанная мышь экспрессирует антитело настоящего изобретения, а также гибридомы, полученные из такой мыши, причем указанная гибридома продуцирует антитело настоящего изобретения.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ модуляции иммунной реакции у субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту антитела или его антигенсвязывающей части настоящего изобретения таким образом, что иммунная реакция у данного субъекта модулируется. Предпочтительно, антитело настоящего изобретения усиливает, стимулирует или увеличивает иммунную реакцию у данного субъекта.

В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества анти-PD-1-антитела или его антигенсвязывающей части. Антитела настоящего изобретения предпочтительны для применения в данном способе, хотя вместо них могут быть использованы другие анти-PD-1-антитела (самостоятельно или в комбинации с анти-PD-l-антителом настоящего изобретения). Например, в способе ингибирования роста опухоли может быть использовано химерное, гуманизированное или полностью анти-PD-1-антитело человека.

В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения инфекционного заболевания у субъекта, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества анти-PD-1-антитела или его антигенсвязывающей части. Антитела настоящего изобретения предпочтительны для применения в данном способе, хотя вместо них могут быть использованы другие анти-PD-1-антитела (самостоятельно или в комбинации с анти-PD-1-антителом настоящего изобретения). Например, в способе лечения инфекционного заболевания может быть использовано химерное, гуманизированное или полностью анти-PD-1-антитело человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ усиления иммунной реакции на антиген у субъекта, предусматривающий введение данному субъекту: (i) антигена и (ii) анти-PD-1-антитела или его антигенсвязывающей части таким образом, что иммунная реакция на данный антиген у субъекта усиливается. Таким антигеном может быть, например, опухолевый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген или антиген из патогена. Антитела настоящего изобретения предпочтительны для применения в данном способе, хотя вместо них могут быть использованы другие анти-PD-1-антитела (самостоятельно или в комбинации с анти-PD-1-антителом настоящего изобретения). Например, в способе усиления иммунной реакции на антиген у субъекта может быть использовано химерное, гуманизированное или полностью анти-PD-1-антитело человека.

Настоящее изобретение обеспечивает также способы получения анти-PD-1-антител «второй генерации» на основе последовательностей анти-PD-1-антител настоящего изобретения. Например, настоящее изобретение обеспечивает способ получения анти-PD-1-антитела, предусматривающий:

(а) обеспечение: (i) последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21, и/или последовательность CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28; и/или последовательность CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35; или (ii) последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41 и 42, и/или последовательность CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49, и/или последовательность CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, 51, 52, 53, 54, 55 и 56;

(b) изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка по меньшей мере в одной последовательности вариабельной области антитела, причем указанная последовательность выбрана из последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела; и

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие. Содержание всех цитируемых ссылок, вводов GenBank, патентов и опубликованных заявок на патент специально включено в данное описание посредством ссылки.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 57) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 17D8. Области CDR1 (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 22) и CDR3 (SEQ ID NO: 29) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V, D и J.

На фиг. 1В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 64) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 8) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 17D8. Области CDR1 (SEQ ID NO: 36), CDR2 (SEQ ID NO: 43) и CDR3 (SEQ ID NO: 50) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 2А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 58) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 2D3. Области CDR1 (SEQ ID NO: 16), CDR2 (SEQ ID NO: 23) и CDR3 (SEQ ID NO: 30) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 2В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 65) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 9) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 2D3. Области CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 44) и CDR3 (SEQ ID NO: 51) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 3А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 59) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 4Н1. Области CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 24) и CDR3 (SEQ ID NO: 31) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 3В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 66) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 10) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 4Н1. Области CDR1 (SEQ ID NO: 38), CDR2 (SEQ ID NO: 45) и CDR3 (SEQ ID NO: 52) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 4А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 60) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 5С4. Области CDR1 (SEQ ID NO: 18), CDR2 (SEQ ID NO: 25) и CDR3 (SEQ ID NO: 32) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 4B показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 67) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 11) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 5С4. Области CDR1 (SEQ ID NO: 39), CDR2 (SEQ ID NO: 46) и CDR3 (SEQ ID NO: 53) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 5А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 61) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 5) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 4А11. Области CDR1 (SEQ ID NO: 19), CDR2 (SEQ ID NO: 26) и CDR3 (SEQ ID NO: 33) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 5В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 68) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 12) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 4А11. Области CDR1 (SEQ ID NO: 40), CDR2 (SEQ ID NO: 47) и CDR3 (SEQ ID NO: 54) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 6А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 62) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 6) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 7D3. Области CDR1 (SEQ ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 27) и CDR3 (SEQ ID NO: 34) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 6В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 69) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 13) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 7D3. Области CDR1 (SEQ ID NO: 41), CDR2 (SEQ ID NO: 48) и CDR3 (SEQ ID NO: 55) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 7А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 63) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 5F4. Области CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 28) и CDR3 (SEQ ID NO: 35) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 7B показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 70) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 14) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 5F4. Области CDR1 (SEQ ID NO: 42), CDR2 (SEQ ID NO: 49) и CDR3 (SEQ ID NO: 56) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг. 8 показано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4 и 7D3 с аминокислотной последовательностью V_H 3-33 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 71).

На фиг. 9 показано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 17D8, 2D3 и 7D3 с аминокислотной последовательностью V_k L6 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 73).

На фиг. 10 показано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 4Н1 и 5С4 с аминокислотной последовательностью V_k L6 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 73).

На фиг. 11 показано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи 4А11 и 5F4 с аминокислотной последовательностью V_H 4-39 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 72).

На фиг. 12 показано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 4А11 и 5F4 с аминокислотной последовательностью V_k L15 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 74).

На фиг. 13А-13В показаны результаты экспериментов с проточной цитометрией, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека 5С4 и 4Н1, направленные против PD-1 человека, связываются с клеточной поверхностью клеток СНО, трансфицированных полноразмерным PD-1 человека. На фиг. 13А показан график проточной цитометрии для 5С4. На фиг. 13В показан график проточной цитометрии для 4Н1. Тонкая линия представляет связывание с клетками СНО, и жирная линия представляет связывание с CHO-hPD-1-клетками.

На фиг. 14 показывает график, демонстрирующий, что моноклональные антитела 17D8, 2D3, 4Н1, 5С34 и 4А11, направленные против PD-1 человека, специфически связываются с PD-1, но не с другими членами семейства CD28.

На фиг. 15А-15С показаны результаты экспериментов с проточной цитометрией, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека 5С4 и 4Н1, направленные против PD-1 человека, связываются с PD-1 на клеточной поверхности. На фиг. 15А показано связывание с активированными Т-клетками человека. На фиг. 15В показано связывание с Т-клетками собакоподобной обезьяны. На фиг. 15С показано связывание с трансфицированными клетками СНО, экспрессирующими PD-1.

На фиг. 16А-16С показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека против PD-1 человека стимулируют пролиферацию Т-клеток, секрецию IFN-гамма и секрецию IL-2 в анализе реакции лимфоцитов в смешенной культуре. Фиг. 16А является диаграммой в виде столбцов, показывающей зависимую от концентрации пролиферацию Т-клеток; фиг. 16В является диаграммой в виде столбцов, показывающей зависимую от концентрации секрецию IFN-гамма; фиг. 16С является диаграммой в виде столбцов, показывающей зависимую от концентрации секрецию IL-2.

На фиг. 17А-17В показаны результаты экспериментов с проточной цитометрией, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека против PD-1 человека блокируют связывание PD-L1 и PD-L2 с трансфицированными клетками СНО, экспрессирующими PD-1. Фиг. 17А является графиком, показывающим ингибирование связывания PD-L1; фиг. 17В является графиком, показывающим ингибирование связывания PD-L2.

На фиг. 18 показывает результаты экспериментов с проточной цитометрией, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека против PD-1 человека не стимулируют апоптоз Т-клеток.

На фиг. 19 показывает результаты экспериментов, демонстрирующие, что анти-PD-1-HuMab имеют зависимое от концентрации действие на секрецию IFN-гамма РВМС из CMV-положительных доноров, когда РВМС стимулировали лизатом CMV и анти-PD-1-антителом.

На фиг. 20 показывает результаты экспериментов по росту опухоли на системе мышиной модели, демонстрирующие, что лечение опухоли мыши in vivo анти-PD-1-антителами ингибирует рост опухоли.

На фиг. 21А-21D показан объем опухоли во времени у отдельных мышей, которым имплантировали опухолевые клетки ободочной кишки МС38 (PD-1^-) и в тот же день подвергали одной из следующих терапий: (A) IgG мыши (контроль), (В) анти-CTLA-4-антитело, (С) анти-PD-1-антитело и (D) анти-CTLA-4-антитело и анти-PD-1-антитело. Мышей подвергали последующей обработке антителами в дни 3, 6 и 10, как описано в примере 13, и объем опухоли подвергали мониторингу на протяжении 60 дней.

На фиг. 22 показан средний объем опухоли мышей, показанный на фиг. 21

На фиг. 23 показана медиана объема опухоли мышей, показанного на фиг. 21.

На фиг. 24А-24D показан объем опухоли во времени у отдельных мышей, которым были имплантированы опухолевые клетки МС38 ободочной кишки (PD-L1^-) и спустя одну неделю были подвергнуты одной из следующих терапий: (A) IgG мыши (контроль), (В) анти-CTLA-4-антитело, (С) анти-PD-1-антитело и (D) анти-CTLA-4-антитело и анти-PD-1-антитело. Объем опухоли в первый день обработки составлял приблизительно 315 мм³. Мышей подвергали последующей обработке антителами в дни 3, 6 и 10, как описано в примере 14.

На фиг. 25 показан средний объем опухоли мышей, показанный на фиг. 24.

На фиг. 26 показана медиана объема опухоли мышей, показанного на фиг. 24.

На фиг. 27 показан средний объем опухоли во времени у отдельных мышей, которым были имплантированы опухолевые клетки МС38 ободочной кишки (PD-L1^-) (день -7) и затем были подвергнуты в дни 0, 3, 6 и 10 после имплантации (как описано в примере 15) одной из следующих терапий: (A) IgG мыши в качестве контроля (20 мг/кг, Х₂₀) (В) анти-РD-1-антитело (10 мг/кг) и IgG мыши (10 мг/кг) (Р₁₀X₁₀), (С) анти-CTLA-4-антитело (10 мг/кг) и IgG мыши (10 мг/кг) (С₁₀Х₁₀), (D) анти-CTLA-4-антитело и анти-PD-1-антитело (10 мг/кг каждого) (C₁₀P₁₀), (Е) анти-CTLA-4-антитело и анти-PD-l-антитело (3 мг/кг каждого) (C₃P₃), и (F) анти-CTLA-4-антитело и анти-PD-1-антитело (1 мг/кг каждого) (С₁Р₁). Две группы мышей были подвергнуты обработке каждым антителом последовательно следующим образом: (G) анти-CTLA-4-антитело (10 мг/кг, день 0), анти-CTLA-4-антитело (10 мг/кг, день 3), анти-PD-1-антитело (10 мг/кг, день 6) и анти-PD-1-антитело (10 мг/кг, день 10) (С₁₀C₁₀P₁₀Р₁₀); и (Н) анти-PD-1-антитело (10 мг/кг, день 0), анти-PD-1-антитело (10 мг/кг, день 3), анти-CTLA-4-антитело (10 мг/кг, день 6) и анти-CTLA-4-антитело (10 мг/кг, день 10) (10 мг/кг, день 10) (Р₁₀Р₁₀С₁₀С₁₀).

На фиг. 28 показан средний объем опухоли мышей, показанный на фиг. 21.

На фиг. 29 показана медиана объема опухоли мышей, показанного на фиг. 27.

На фиг. 30А-30F показан объем опухоли во времени у отдельных мышей, которым были имплантированы клетки фибросаркомы SA1/N (PD-L1^-) и спустя один день были подвергнуты одной из следующих терапий: (A) PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) (контроль-носитель), (В) IgG мыши (контроль-антитело, 10 мг/кг), (С) анти-PD-1-антитело (10 мг/кг), (D) анти-CTLA-4-антитело (10 мг/кг), (Е) анти-CTLA-4-антитело (0,2 мг/кг) и (F) анти-PD-1-антитело (10 мг/кг) и анти-CTLA-4-антитело (0,2 мг/кг). Мышей подвергали последующей обработке антителами в дни 4, 7 и 11, как описано в примере 16, и объем опухоли подвергали мониторингу на протяжении 41 дня.

На фиг. 31 показан средний объем опухоли мышей, показанный на фиг. 29.

На фиг. 32 показана медиана объема опухоли мышей, показанного на фиг. 29.

На фиг. 33A-33J показан объем опухоли во времени у отдельных мышей, которым были имплантированы клетки фибросаркомы SA1/N (PD-L1^-) и затем были подвергнуты в дни 7, 10, 13 и 17 после имплантации (как описано на фиг.17) одной из следующих терапий: (A) PBS (контроль-носитель), (В) IgG мыши (контроль-антитело, 10 мг/кг), (С) анти-CTLA-4-антитело (0,25 мг/кг), (D) анти-CTLA-4-антитело (05 мг/кг), (Е) анти-CTLA-4-антитело (5 мг/кг), (F) анти-PD-1-антитело (3 мг/кг), (G) анти-PD-1-антитело (10 мг/кг), (Н) анти-PD-1-антитело (10 мг/кг) и анти-CTLA-4-антитело (0,25 мг/кг), (I) анти-PD-1-антитело (10 мг/кг) и анти-CTLA-4-антитело (0,5 мг/кг), и (F) анти-PD-1-антитело (3 мг/кг) и анти-CTLA-4-антитело (0,5 мг/кг). Объем опухоли в первый день обработки составлял приблизительно 110 мм³.

На фиг. 34 показан средний объем опухоли в мышах, показанных на фиг. 33.

На фиг. 35 показана медиана объема опухоли мышей, показанного на фиг. 33.

На фиг. 36А и 36В показан объем опухоли во времени у отдельных мышей, которым были имплантированы клетки фибросаркомы SA1/N (PD-L1^-) и затем были подвергнуты в дни 10, 13, 16 и 19 после имплантации (как описано в примере 17) одной из следующих терапий: (A) IgG мыши (контроль-антитело, 10 мг/кг) или (В) анти-PD-1-антитело (10 мг/кг) и анти-CTLA-4-антитело (1 мг/кг). Объем опухоли в первый день обработки составлял приблизительно 250 мм³.

На фиг. 37 показан средний объем опухоли в мышах, показанных на фиг. 36.

На фиг. 38 показана медиана объема опухоли мышей, показанного на фиг. 36.

На фиг. 39 показан средний процент и медиана процента ингибирования опухоли, рассчитанные из объемов опухолей, показанных на фиг. 33 и 36.

На фиг. 40А-40D показан объем опухоли у мышей BALB/c, которым были имплантированы подкожно клетки почечной аденокарциномы RENCA (PD-L1⁺) (Murphy and Hrushesky (1973) J. Nat'l. Cancer Res. 50: 1013-1025) (день -12) и затем были подвергнуты внутрибрюшинно в дни 0, 3, 6 и 9 после имплантации одной из следующих терапий: (A) IgG мыши (контроль-антитело, 20 мг/кг), (В) анти-PD-1-антитело (10 мг/кг), (С) анти-CTLA-4-антитело (10 мг/кг) и (D) анти-PD-1-антитело (10 мг/кг) в комбинации с анти-CTLA-4-антителом (10 мг/кг). Объем опухоли в первый день обработки составлял приблизительно 115 мм³.

На фиг. 41 показано, что связывание мышиного слитого белка PD-L2-Fc с мышиным PD-1 (mPD-1) блокируется анти-mPD-1-антителом 4Н2 зависимым от дозы образом. Связывание детектируют измерением флуоресценции FITC-меченым ослиным антителом против IgG крысы при помощи ELISA. Чем больше MFI (средняя интенсивность флуоресценции), тем больше связывание.

На фиг. 42 показаны кривые связывания анти-mPD-1-антител с иммобилизованным слитым белком mPD-1-Fc, полученные при помощи ELISA.

На фиг. 43 показана кривая связывания крысиного анти-mPD-1-антитела 4Н2.В3 с mPD-1-экспрессирующими СНО-клетками. Связывание детектировали ослиными антителами против крысиного IgG, FITC-конъюгированными и измеренными при помощи FACS (MFI).

На фиг. 44 показана кривая связывания слитого белка mPD-L1-hFc с mPD-1-экспрессирующими СНО-клетками в присутствии увеличивающихся концентраций анти-mPD-1-антитела 4Н2.В3. Связывание детектировали козьими антителами против IgG человека IgG, FITC-конъюгированными и измеренными при помощи FACS (MFI).

На фиг. 45 показаны кривые связывания крысиного анти-mPD-1-антитела 4Н2.В3 с mPD-1-экспрессирующими СНО-клетками в сравнении с химерным крысиным : мышиным анти-mPD-1-антителом 4Н2.

На фиг. 46 показаны кривые связывания слитого белка mPD-L1-hFc с mPD-1-экспрессирующими СНО-клетками в присутствии увеличивающихся концентраций либо крысиного анти-mPD-1-антитела 4Н2.В3, либо химерного крысиного : мышиного анти-mPD-1-антитела 4Н2.

На фиг. 47 показан средний объем опухоли не содержащих опухоли мышей, предварительно обработанных анти-PD-1-антителом и повторно имплантированных клетками фибросаркомы SA1/N (PD-L1^-). Показан также средний объем опухоли необработанных мышей (контроль, предварительно неимплантированные или необработанные), имплантированных клетками фибросаркомы SA1/N.

На фиг.48 показывает объем опухоли во времени у отдельных мышей, которые выживали без опухоли после имплантации опухолевых клеток МС38 ободочной кишки (PD-L1^-) и обработки анти-PD1-антителом или комбинацией анти-PD1-антитела с анти-CTLA-4-антителом), повторно имплантированных в 10 раз большим количеством опухолевых клеток МС38 ободочной кишки, чем при начальной обработке. Показан также средний объем опухоли необработанных мышей (контроль, предварительно неимплантированные или необработанные), имплантированных опухолевыми клетками МС38 ободочной кишки.

На фиг. 49 показан средний объем опухоли мышей, показанный на фиг. 48.

На фиг. 50 показан средний объем опухоли во времени у отдельных мышей, которым были имплантированы опухолевые клетки СТ26 ободочной кишки.

На фиг. 51А-В показаны результаты экспериментов, демонстрирующих, что моноклональные антитела человека против PD-1 человека стимулируют пролиферацию Т-клеток и секрецию IFN-гамма в культурах, содержащих регуляторные Т-клетки. Фиг. 51А является диаграммой в виде столбцов, показывающей зависимую от концентрации пролиферацию Т-клеток с использованием HuMAb 5С4; Фиг. 51В является диаграммой в виде столбцов, показывающей зависимую от концентрации секрецию IFN-гамма с использованием HuMAb 5С4.

На фиг. 52А-В показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека против PD-1 человека стимулируют пролиферацию Т-клеток и секрецию IFN-гамма в культурах, содержащих активированные Т-клетки. Фиг. 52А является диаграммой в виде столбцов, показывающей зависимую от концентрации пролиферацию Т-клеток с использованием HuMAb 5С4; Фиг. 52В является диаграммой в виде столбцов, показывающей зависимую от концентрации секрецию IFN-гамма с использованием HuMAb 5С4.

На фиг. 53 показаны результаты анализа антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC), демонстрирующие, что моноклональные анти-PD-1-антитела человека убивают активированные Т-клетки человека в ADCC зависимым от концентрации образом относительно Fc-области анти-PD-1-антитела.

На фиг. 54 показаны результаты анализа комплементзависимой цитотоксичности (CDC), демонстрирующие, что моноклональные анти-PD-1-антитела человека не убивают активированные Т-клетки человека в CDC зависимым от концентрации образом.

Наилучший способ осуществления изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в частности, моноклональным антителам человека, которые специфически связываются с PD-1. В некоторых вариантах осуществления антитела настоящего изобретения проявляют одно или несколько желаемых функциональных свойств, таких как высокая аффинность связывания с PD-1, отсутствие перекрестной реактивности с другими членами семейства CD28, способность стимулировать пролиферацию Т-клеток, секрецию IFN-гамма и/или IL-2 в реакциях смешанных лимфоцитов, способность ингибировать связывание одного или нескольких лигандов PD-1 (например, PD-L1 и/или PD-L2), способность перекрестно реагировать с PD-1 собакоподобной обезьяны, способность стимулировать антигенспецифические реакции памяти, способность стимулировать ответные реакции антител и/или способность ингибировать рост опухолевых клеток in vivo. Дополнительно или альтернативно, антитела настоящего изобретения получены из конкретных последовательностей зародышевой линии тяжелой и легкой цепи и/или содержат конкретные структурные признаки, такие как CDR-области, содержащие конкретные аминокислотные последовательности. В другом аспекте настоящее изобретение относится к комбинированному применению моноклональных антител, которые специфически связываются с PD-1, и моноклональных антител, которые специфически связываются с CTLA-4.

Настоящее изобретение обеспечивает, например, выделенные антитела, способы получения таких антител, иммуноконъюгатов и биспецифических молекул, содержащих такие антитела, и фармацевтические композиции, содержащие такие антитела, иммуноконъюгаты или биспецифические молекулы настоящего изобретения.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта с использованием анти-PD-1-антител. Как показано в данном описании, анти-PD-1-антитела способны ингибировать рост опухолевых клеток in vivo. Настоящее изобретение относится также к способам применения данных антител для модификации иммунной реакции, а также для лечения заболеваний, таких как рак или инфекционное заболевание, или для стимуляции защитной аутоиммунной реакции, или для стимуляции антигенспецифических иммунных реакций (например, совместным введением анти-PD-1-антитела с представляющим интерес антигеном).

Для более легкого понимания настоящего изобретения сначала будут определены некоторые термины. Дополнительные определения объяснены в подробном описании.

Термины "программируемая гибель 1," "программируемая гибель клеток 1," "белок PD-1," "PD-1," PD1," "PDCD1," "hPD-1" и "hPD-I" используются взаимозаменяемо и включают варианты, изоформы, видовые гомологи PD-1 человека и аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с PD-1. Полная последовательность PD-1 может быть найдена под номером доступа GenBank Accession No. U64863.

Термины "цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный антиген-4," "CTLA-4," "CTLA4," "антиген CTLA-4" и "CD152" (см., например, Murata, Am. J. Pathol. (1999) 155: 453-460) используются взаимозаменяемо и включают варианты, изоформы, видовые гомологи CTLA-4 человека и аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с CTLA-4 (см., например, Balzano (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 28-32). Полная последовательность CTLA-4 может быть найдена под номером доступа GenBank Accession No. L15006.

Термин "иммунная реакция" относится к действию, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых вышеуказанными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к селективному повреждению, деструкции или элиминации из организма человека внедряющихся патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, здоровых клеток или тканей человека.

“Путь трансдукции сигнала” относится к биохимической связи между различными молекулами трансдукции сигналов, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Как использовано в данном описании, фраза "рецептор клеточной поверхности" включает, например, молекулы и комплексы молекул, способные получать сигнал и передавать такой сигнал через плазматическую мембрану клетки. Примером «рецептора клеточной поверхности» настоящего изобретения является рецептор PD-1.

Термин "антитело", как использовано в данном описании, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. "антигенсвязывающую часть") или его отдельные цепи. Термин "антитело" относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании как V_H) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, C_H1, С_Н2 и С_H3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемую в данном описании как V_L) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, C_L. Области V_H и V_L могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), разбросанные между области, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторными клетками), и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "часть антитела"), как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, PD-1). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин "антигенсвязывающая часть" антитела включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов V_H и C_H1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов V_L и V_H в едином плече антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из домена V_H; и (vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR). Кроме того, две области Fv-фрагмента, V_L и V_H, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области V_L и V_H спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин "антигенсвязывающая часть" антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.

"Выделенное антитело", как использовано в данном описании, означает антитело, которое по существу не содержит других антител, имеющих отличающиеся антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывает PD-1, является по существу свободным от антител, которые специфически связывают антигены, отличные от PD-1). Однако выделенное антитело, которое связывает PD-1, может иметь перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы PD-1 из других видов. Кроме того, выделенное антитело может быть по существу свободным от другого клеточного материала и/или химикалиев.

Термины «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» относятся в данном описании к препарату молекул антител единого молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела проявляет единственную специфичность связывания и аффинность в отношении конкретного эпитопа.

Термин «антитело человека» включает в данном описании антитела, имеющие вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-области получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Кроме того, если данное антитело содержит константную область, то константная область также получена из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека настоящего изобретения могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro, или соматическая мутация in vivo). Однако термин «антитело человека», как использовано в данном описании, не включает антитела, в которых CDR-последовательности, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающего, такого как мышь, были привиты на каркасные последовательности человека.

Термин «моноклональное антитело человека» означает антитела, проявляющие единственную специфичность связывания, которые имеют вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-области получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В одном варианте осуществления моноклональные антитела человека получают с использованием гибридомы, которая включает в себя В-клетку, полученную из трансгенного животного (не человека), например, трансгенной мыши, имеющего геном, содержащий трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи человека, слитые с иммортализованной клеткой.

Термин «рекомбинантное антитело человека», как использовано в данном описании, включает все антитела человека, которые были получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, например, (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулина человека, или полученной из них гибридомы (описанной дополнительно ниже), (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела человека, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных, комбинаторных антител человека, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, включающим сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека в другие ДНК-последовательности. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные области, в которых каркасные и CDR-области получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека могут быть подвергнуты in vitro мутагенезу (или, когда используют животное, трансгенное в отношении последовательностей Ig, соматическому мутагенезу), и, следовательно, аминокислотные последовательности областей V_H и V_L рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, хотя и получены из последовательностей V_H и V_L зародышевой линии человека или являются родственными указанным последовательностям, могут не существовать в природе в репертуаре зародышевой линии антител человека in vivo.

Как использовано в данном описании, «изотип» относится к классу антитела (например, IgM или IgG1), который кодируется генами константной области тяжелой цепи.

Фразы «антитело, распознающие антиген» и «антитело, специфическое в отношении антигена» являются в данном описании взаимозаменяемыми с термином «антитело, которое специфически связывается с антигеном».

Термин «производные антитела человека» относится к любой модифицированной форме антитела человека, например, конъюгату антитела и другого агента или антитела.

Термин «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающего, такого как мышь, были привиты на каркасные последовательности человека. В таких каркасных последовательностях человека могут быть произведены дополнительные модификации каркасной области.

Термин «химерное антитело» относится к антителам, в которых последовательности вариабельной области получены из одного вида, и последовательности константной области получены из другого вида, таким как антитело, в котором последовательности вариабельной области получены из мышиного антитела, и последовательности константной области получены из антитела человека.

Как использовано в данном описании, фраза антитело, которое «специфически связывается с PD-1 человека» относится к антителу, которое связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-7 М или менее, более предпочтительно 5×10^-8 М или менее, более предпочтительно 1×10^-8 М или менее, более предпочтительно 5×10^-9 М или менее.

Термин “К_ассоц” или “К_а”, как использовано в данном описании, относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин "К_дис" или "К_д" относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Термин «K_D» в данном описании относится к константе диссоциации, которую получают из отношения К_д к К_а (т.е. К_д/К_а), и ее выражают в виде молярной концентрации (М). Величины K_D для антител могут быть определены с использованием способов, хорошо установленных в данной области. Предпочтительным способом определения K_D антитела является способ с использованием резонанса поверхностных плазмонов, предпочтительно с использованием биосенсорной системы, такой как система Biacore®.

Как использовано в данном описании, термин «высокая аффинность» в отношении IgG-антитела относится к антителу, имеющему K_D 10^-8 М, более предпочтительно 10^-9 или менее и, даже более предпочтительно, 10^-10 М или менее в отношении антигена-мишени. Однако «высокая аффинность» связывания может варьироваться для других изотипов антигена. Например, «высокая аффинность» связывания для изотипа IgM относится к антителу, имеющему K_D 10^-7 М или менее, более предпочтительно 10^-8 М или менее, даже более предпочтительно 10^-9 М или менее.

Термин «лечение» или «терапия» относится к введению активного агента с целью излечения, лечения, уменьшения симптомов, облегчения, изменения, вылечивания, купирования, улучшения состояния (например, заболевания), симптомов указанного состояния или воздействия на состояние (или заболевание), симптомы указанного состояния или для предупреждения или задержки проявления симптомов, осложнений, биохимических показателей заболевания или иным образом остановки или ингибирования дальнейшего развития указанного заболевания, симптомов или нарушения статистически значимым образом.

«Побочные эффекты» (АЕ) означает в данном описании любой неблагоприятный и обычно неожиданный, даже нежелательный, признак (включая аномальное лабораторное открытие), симптом или заболевание, ассоциированное с применением медицинского лечения. Например, неблагоприятное событие может быть ассоциировано с активацией иммунной системы или экспансии клеток иммунной системы (например, Т-клеток) в ответ на лечение. Медицинское лечение может иметь одно или несколько ассоциированных побочных эффектов (АЕ), и каждый АЕ может иметь один и тот же или различный уровень тяжести. Ссылка на способы, способные «изменять неблагоприятные события» означает схему лечения, которая уменьшает частоту и/или тяжесть одного или нескольких АЕ, ассоциированных с применением другой схемы лечении.

Как использовано в данном описании, «гиперпролиферативное заболевание» означает состояния, в которых рост клеток увеличивается выше нормальных уровней. Например, гиперпролиферативные заболевания или нарушения включают злокачественные заболевания (например, рак пищевода, рак ободочной кишки, билиарный рак) и незлокачественные заболевания (например, атеросклероз, доброкачественную гиперплазию, доброкачественную гиперплазию предстательной железы).

«Субтерапевтическая доза» означает дозу терапевтического соединения при введении отдельно для лечения гиперпролиферативного заболевания (например, рака). Например, субтерапевтической дозой CTLA-4-антитела является единственная доза данного антитела при менее чем приблизительно 3 мг/кг, т.е. известная доза анти-CTLA-4-антитела.

Применение альтернативы (например, «или»), как следует понимать, означает одну, обе или любую комбинацию указанных альтернатив. Неопределенные артикли «а» или "an" должны пониматься как «один или несколько» из любых указанных или перечисленных компонентов.

Как использовано в данном описании, «приблизительно» или «состоящий по существу из» означает «в пределах приемлемого диапазона ошибок» для конкретной величины, определенной специалистом в данной области, которая будет зависеть отчасти от того, как данная величина измерена или определена, т.е. от ограничений конкретной системы измерения. Например, «приблизительно» или «состоящий по существу из» может означать «в пределах 1 стандартного отклонения или более чем 1 стандартного отклонения», согласно практике в данной области. Альтернативно, «приблизительно» или «состоящий по существу из» может означать диапазон до 20%. Кроме того, в частности, в отношении биологических систем или процессов, эти термины могут означать «вплоть до значения или до 5-кратного значения величины». При использовании конкретных величин в данном описании и в формуле изобретения, если нет других указаний, значение «приблизительно» или «состоящий по существу из», как предполагается, должно быть в пределах приемлемого диапазона ошибок для этой конкретной величины.

Должно быть понятно, что в данном описании любой диапазон концентраций, диапазон процентов, диапазон отношений или диапазон целых чисел включает в себя величину любого целого числа в пределах указанного диапазона и, необязательно, его частей (например, одну десятую и одну сотую целого числа), если нет других указаний.

Как использовано в данном описании, термин «субъект» включает любого человека или любого животного, не являющегося человеком. Термин «животное-не человек» включает всех позвоночных, например, млекопитающих и не-млекопитающих, таких как приматы (не человек), овцы, собаки, лошади, коровы, куры, земноводные, рептилии и т.д. За исключением случаев, когда даются другие указания, термины «пациент» или «субъект» используются взаимозаменяемо.

Анти-PD-1-антитела

Антитела настоящего изобретения характеризуются конкретными функциональными признаками или свойствами указанных антител. Например, данные антитела связываются с PD-1 (например, связываются с PD-1 человека и могут перекрестно реагировать с PD-1 из другого вида, такого как собакоподобная обезьяна). Предпочтительно, антитело настоящего изобретения связывается с PD-1 с высокой аффинностью, например, с K_D 1×10^-7 М или менее. Анти-PD-1-антитело настоящего изобретения предпочтительно проявляют одну или несколько из следующих характеристик:

(a) связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-7 М или менее;

(b) по существу не связывается с CD28, CTLA-4 или ICOS человека;

(d) увеличивает продуцирование интерферона-гамма в анализе MLR;

(f) связывается с PD-1 человека и PD-1 собакоподобной обезьяны;

(g) ингибирует связывание PD-L1 и/или PD-L2 с PD-1;

(h) стимулирует антигенспецифические ответные реакции памяти;

(i) стимулирует ответные реакции антител;

(j) ингибирует рост опухолевых клеток in vivo.

Предпочтительно, данное антитело связывается с PD-1 человека с K_D 5×10^-8 М или менее, связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-8 М или менее, связывается с PD-1 человека с K_D 5×10^-9 М или менее, или связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-8 M-K_D 1×10^-10 М.

Антитело настоящего изобретения может проявлять любую комбинацию вышеперечисленных признаков, например, двух, трех, четырех, пяти или более вышеперечисленных признаков.

Стандартные анализы для оценки связывающей способности антител против PD-1 известны в данной области, включая, например, ELISA, Вестерн-блоттинг и RIA. Кинетика связывания (например, аффинность связывания) антител может оцениваться также стандартными анализами, известными в данной области, такими как Biacore. Подходящие анализы для оценки любой из вышеописанных характеристик описаны подробно в примерах.

Моноклональные антитела 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4

Предпочтительные антитела настоящего изобретения являются моноклональными антителами человека 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4, выделенными и структурно охарактеризованными, как описано в примерах 1 и 2. Аминокислотные последовательности V_Н 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4 показаны в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7, соответственно. Аминокислотные последовательности V_L 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4 показаны в SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14, соответственно.

При условии, что каждое из указанных антител может связываться с PD-1, последовательности V_Н и V_L могут быть «смешаны и спарены» для создания других анти-PD-1-связывающих молекул настоящего изобретения. PD-1-связывание таких «смешанных и спаренных» антител может быть испытано с использованием анализов связывания, описанных выше и в примерах (например, ELISA). Предпочтительно, при смешивании и спаривании цепей V_Н и V_L последовательность V_Н из конкретного V_H/V_L-спаривания заменяется структурно сходной последовательностью V_H. Подобным образом, последовательность V_L из конкретного V_H/V_L-спаривания заменяется структурно сходной последовательностью V_L.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14;

где данное антитело специфически связывает PD-1, предпочтительно PD-1 человека.

Предпочтительные комбинации тяжелых и легких цепей включают:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; или

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; или

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; или

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; или

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; или

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; или

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитела, которые содержат CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой и легкой цепи 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4 или их комбинации. Аминокислотные последовательности CDR1 V_H 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4 показаны в SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21, соответственно. Аминокислотные последовательности CDR2 V_Н 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4 показаны в SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28, соответственно. Аминокислотные последовательности CDR3 V_Н 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4 показаны в SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35, соответственно. Аминокислотные последовательности CDR1 Vκ 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4 показаны в SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41 и 42, соответственно. Аминокислотные последовательности CDR2 Vκ 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4 показаны в SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49, соответственно. Аминокислотные последовательности CDR3 Vκ 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4 показаны SEQ ID NO: 50, 51, 52, 53, 54, 55 и 56, соответственно. CDR-области показаны прерывистой линией с использованием системы Кабата (Kabat, Е.А., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

При условии, что каждое из указанных антител может связываться с PD-1 и что специфичность антигенсвязывания обеспечивается первично областями CDR1, CDR2 и CDR3, последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 V_Н и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 Vκ могут быть "смешаны и спарены" (т.е. CDR из разных антител могут быть смешаны и спарены, хотя каждое антитело должно содержать CDR1, CDR2 и CDR3 и V_Н CDR1, CDR2 и CDR3 Vκ) для создания других анти-PD-1-связывающих молекул настоящего изобретения. PD-1-связывание таких "смешанных и спаренных" антител может быть испытано с использованием анализов связывания, описанных выше и в примерах (например, анализ ELISA, Biacore). Предпочтительно, при смешивании и спаривании последовательностей CDR V_H, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной последовательности V_Н заменяют структурно сходной (сходными) последовательностью (последовательностями) CDR. Подобным образом, при смешивании и спаривании последовательностей CDR Vκ, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной последовательности Vκ заменяют структурно сходной (сходными) последовательностью (последовательностями) CDR. Специалисту в данной области будет очевидно, что новые последовательности V_Н и V_L могут быть созданы заменой одной или нескольких последовательностей CDR-областей V_Н и/или V_L структурно сходными последовательностями из последовательностей CDR, описанных в данном описании для моноклональных антител 17D8, 2D3, 4Н1, 5С4, 4А11, 7D3 и 5F4.

Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49; и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, 51, 52, 53, 54, 55 и 56:

где данное антитело специфически связывает PD-1, предпочтительно PD-1 человека.

В предпочтительном варианте осуществления данное антитело содержит:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 15;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 22;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 36;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 43; и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 50.

В другом предпочтительном варианте осуществления данное антитело содержит:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 16;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 23;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 37;