Композиция для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом

Изобретение относится к области химической энзимологии и химико-фармацевтической промышленности и предназначено для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. Композиция для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом, состоит из антиоксидантного действующего вещества и основы. В качестве действующего вещества она содержит частицы, полученные путем смешения буферных растворов антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в концентрации 2,5-10,0 мг/мл и поликатиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, перемешивания и выдерживания смеси с последующими добавлением в нее буферного раствора полианиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, перемешиванием и выдерживанием полученной смеси, добавлением в нее водного раствора глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с аминогруппами поликатиона 0,3-1,5, выдерживанием смеси, добавлением в смесь водного раствора боргидрида натрия в концентрации 1-2 мг/мл, очисткой смеси с использованием мембранной фильтрующей системы с пределом пропускания 90-130 килодальтон, лиофильной сушкой очищенной смеси и смешением лиофилизата с основой. Поликатион выбирают из группы, включающей протамин, полилизин и полиаргинин. Полианион представляет собой блок-сополимер полиглутаминовой кислоты и полиэтиленгликоля или блок-сополимер полиаспарагиновой кислоты и полиэтиленгликоля. Компоненты используются в заявленных количествах. Использование изобретения позволяет повысить эффективность лечения воспалительных заболеваний и повышает с 12 до 18 ч продолжительность выхода действующего вещества из композиции. 8 пр.

 

Изобретение относится к области химической энзимологии и химико-фармацевтической промышленности и касается композиции, которая может быть использована при лечении гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. Данная композиция в качестве действующего вещества содержит антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу (СОД), покрытую внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона.

Известна композиция с антиоксидантными свойствами, которая может быть использована для лечения различных воспалительных, в том числе гинекологических и проктологических заболеваний млекопитающих, в т.ч. человека, сопровождающихся окислительным стрессом, состоящая из фармацевтически приемлемой добавки и действующего вещества - смеси антиоксидантного фермента пероксиредоксина и активатора дигидролипоевой кислоты (патент RU 2280448 С2, А61К 31/38 (2006.01), 2002, см. описание).

Данная композиция содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как наличие в ее составе антиоксидантного фермента и использование в композиции лиофилизованной формы действующего вещества.

Известна композиция для лечения воспалительных заболеваний, пригодная для изготовления суппозиториев и состоящая из противовоспалительного действующего вещества - индометацина и основы (патент RU 2226091С1, А61К 31/38 (2006.01), 2002, см. описание).

Данная композиция содержит признак, совпадающий с существенными признаками предлагаемого технического решения, такой как наличие в ее составе противовоспалительного действующего вещества.

Наиболее близким к заявляемому является известная композиция для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом, состоящая из антиоксидантного действующего вещества 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат (ЭМОС) и основы, выбранной из группы, включающей полиэтиленоксид 1500, полиэтиленоксид 400, масло какао и гидрогенизированные жиры, при следующем соотношении компонентов на одну свечу, г:

ЭМОС	0,1-1,0
Основа	1,0-6,0

(Патент RU 2293558 С2, А61К 31/4425 (2006.01), 2005 - прототип, см. описание). Массовый состав известной композиции будет иметь следующий состав, мас. %:

ЭМОС	1,6-50
Основа	остальное

Данная композиция содержит признак, совпадающий с существенным признаком предлагаемого технического решения, такой как наличие в ее составе антиоксидантного действующего вещества.

Композиция, используемая для лечения воспалительных заболеваний, сопровождающихся (обусловленных) окислительным стрессом, должна обладать относительно высокой антиоксидантной активностью у действующего вещества и обеспечивать пролонгированный выход действующего вещества в слизистую оболочку и мягкие ткани. Однако, проведенный контрольный опыт (пример 8) показал, что антиоксидантная активность ЭМОС относительно невелика и в прототипе указано, что пролонгированный выход действующего вещества (препарата) наблюдается в течение около 12 ч.

Техническая проблема изобретения заключается в создании композиции для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, лишенной вышеуказанных недостатков.

Технический результат изобретения состоит в повышении эффективности композиции при лечении заболеваний и увеличении продолжительности выхода действующего вещества из композиции.

Предварительно были проведены эксперименты с различными композициями, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда композиция для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом, состоящая из антиоксидантного действующего вещества и основы, в качестве действующего вещества она содержит частицы, полученные путем смешения буферных растворов антиоксидантного фермента СОД в концентрации 2,5-10,0 мг/мл и поликатиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, где поликатион выбирают из группы, включающей протамин, полилизин и полиаргинин, перемешивания и выдерживания смеси с последующими добавлением в нее буферного раствора полианиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, где полианион представляет собой блок-сополимер (блок-СПЛ) полиглутаминовой кислоты (ПГ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) или блок-СПЛ полиаспарагиновой кислоты (ПА) и ПЭГ, перемешиванием и выдерживанием полученной смеси, добавлением в нее водного раствора глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с аминогруппами поликатиона 0,3-1,5, выдерживанием смеси, добавлением в смесь водного раствора боргидрида натрия в концентрации 1-2 мг/мл, очисткой смеси с использованием мембранной фильтрующей системы с пределом пропускания 90-130 килодальтон (кДа), лиофильной сушкой очищенной смеси и смешением лиофилизата с основой, при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Действующее вещество	0,01-20,00
Основа	остальное

Предлагаемая композиция является новой и не описана в патентной и научно-технической литературе. Используемые в композиции частицы также является новыми.

Известно, что СОД обладает высокой антиоксидантной активностью, однако использование нативного фермента неэффективно с связи с его быстрой инактивацией в организме. При этом введение относительно больших доз нативного белка СОД в композициях нецелесообразно ввиду нежелательного иммунного ответа организма на чужеродный белок. Поэтому из научно-технической литературы известно, что СОД вводят, например, в кальций-фосфатные биодеградируемые наночастицы, покрытые дисахаридами (патент RU 2577236 C1, А61К 33/08, 2014).

Предлагаемая композиция может быть использована при получении различных лекарственных форм, например, суппозиторий, мазей, гелей и т.д., используемых при лечении гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся (обусловленных) окислительным стрессом, например, таких как вагинит, вульвит, вульвовагинит, цервицит, геморрой, проктит, парапроктит и т.д.

Все реагенты и расходные материалы (фильтрующие мембраны), использованные при получении предлагаемой композиции, коммерчески доступны. Так, СОД коммерчески доступна (http://sodferment.ru, ООО НПП «Ферментные технологии», Россия) и является известным антиоксидантным ферментом, инактивирующим супероксидные радикалы [McCord J. М., Fridovich I. Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) // Journal of Biological chemistry. - 1969. - T. 244. - №. 22. - C. 6049-6055].

Частицы, используемые в предлагаемой композиции, получают путем смешения буферных растворов поликатиона и СОД. При этом состав буферных растворов может быть различен и их рН может варьироваться и составлять, например, 5-8.

При получении частиц концентрация СОД в использованном буферном растворе может быть различной и составлять 2,5-10,0 мг/мл. Концентрация коммерчески доступных (Sigma-Aldrich, США) вышеуказанных поликатионов в буферном растворе также может варьироваться и составлять 2,5-10,0 мг/мл. Следует отметить, что раствор поликатиона следует по каплям добавлять к раствору СОД при перемешивании. Если вышеуказанные растворы смешивать не по каплям, а, например, за один прием, то возрастает вероятность образования частиц с широким распределением по размеру, что нежелательно, поскольку это затрудняет очистку суспензии частиц. При этом количество использованных СОД и поликатиона может варьироваться, однако заряд СОД после модификации поликатионом должен быть положительным для обеспечения возможности последующего покрытия частиц слоем одного из вышеуказанных полианионов. После смешения компонентов полученную смесь необходимо выдерживать при перемешивании в течение, например, 25-40 мин для обеспечения возможности получение более однородных по размеру частиц, затем по каплям добавлять в нее водный буферный раствор блок-СПЛ. Если вышеуказанные растворы смешивать не по каплям, а, например, за один прием, то возрастает вероятность образования частиц с широким распределением по размеру, что нежелательно.

Используемые при этом блок-сополимеры ПА - ПЭГ и ПГ - ПЭГ коммерчески доступны (http://www.alamanda-polymers.com/, Alamanda Polymers, США). При проведении данной стадии синтеза концентрация блок-СПЛ в буферном растворе может варьироваться и составлять 2,5-10,0 мг/мл. При этом общее количество ранее обработанной поликатионом СОД и блок-СПЛ может варьироваться, однако после повторной модификации заряд полученных частиц должен поменять знак, т.е. стать отрицательным.

Образование на частицах СОД внутреннего слоя поликатиона в ходе вышеуказанной обработки антиоксидантного фермента буферным раствором поликатиона, а также образование дополнительного внешнего слоя из блок-СПЛ в ходе обработки модифицированной СОД буферным раствором полианиона подтверждено методом тушения флуоресценции.

После смешения вышеуказанных компонентов полученную смесь необходимо перемешивать и выдерживать в течение, например, 25-40 мин для обеспечения возможности получение более однородных по размеру частиц. При этом для обеспечения сохранности активности фермента выдерживание целесообразно проводить при пониженной относительно комнатной температуре, например, в холодильнике при 3-8°С.

После окончания данной стадии синтеза в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют свежеприготовленный водный раствор глутарового альдегида, который, как известно, выступает в качестве неизбирательного сшивающего агента химических соединений, содержащих первичные аминогруппы [Migneault I. et al. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking //Biotechniques. - 2004. - T. 37. - №. 5. - C. 790-802.]. При этом экспериментально было показано, что для увеличения суммарного выхода СОД по активности у частиц и повышения стабильности значений активности СОД у частиц в процессе их хранения в отличие от вышеописанного аналога необходимо добавлять водный раствор глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с аминогруппами поликатиона 0,3-1,5. При этом концентрация раствора глутарового альдегида может быть различной. Затем для обеспечения полноты протекания ковалентного связывания (сшивки) аминогрупп полученную смесь необходимо выдерживать, например, в течение 8-12 ч при пониженной относительно комнатной температуре, например, в холодильнике при 3-8°С. После этого для повышения стабильности полученных частиц в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют избыток свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с целью восстановления неустойчивых двойных связей между углеродом и азотом в полученных основаниях Шиффа с образованием стабильной ковалентной связи. При этом концентрация раствора боргидрида натрия может варьироваться и составлять 1-2 мг/мл.

Ковалентное связывание глутарового альдегида с частицами СОД/поликатион/полианион было подтверждено инструментальными методами.

Ввиду того, что точно описать строение полученных частиц после их обработки вначале раствором глутарового альдегида, затем раствором боргидрида натрия не представляется возможным, в предлагаемой композиции действующее вещество - полученный продукт охарактеризован способом его получения.

Перед получением композиции суспензию частиц очищают от побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов с использованием мембранной фильтрующей системы. При этом можно использовать мембранную фильтрующую систему, например, в комбинации с перистальтическим насосом, подающим полученную суспензию частиц на мембрану (фильтр) под давлением, или применять центрифугирование с использованием помещенного в пробирку центрифуги ультрафильтрационного фильтра (мембраны). В последнем случае скорость вращения ротора центрифуги может варьироваться и

составлять, например, 3000-4000 оборотов (об) /мин. В отличие от аналога при этом используют мембранную фильтрующую систему с экспериментально подобранным пределом пропускания 90-130 кДа. То есть, например, мембрана с пределом пропускания 90 кДа пропускает вещества с молекулярной массой менее 90 кДа. Следует отметить, что при получении используемых частиц описанная в аналоге ультрафильтрационная мембрана с пределом пропускания 50 кДа не позволяет провести надлежащую очистку полученных частиц в связи с забивкой пор в мембране.

При очистке частиц с использованием центрифугирования в пробирку центрифуги помещают фильтр на основе ультрафильтрационной мембраны, заполненный аликвотой вышеописанной суспензии, с последующим введением перед каждой новой стадией центрифугирования дистиллированной воды.

При использовании поточной фильтрующей системы в накопительную емкость наливают полученную суспензию частиц. Далее фильтруемая суспензия из накопительной емкости с помощью перистальтического насоса под давлением подается на фильтрационный картридж с мембраной с пределом пропускания 90-130 кДа и двигается вдоль мембраны. Часть жидкости с низкомолекулярными побочными продуктами и не вступившими в реакцию реагентами проходит сквозь поры фильтрующей системы и накапливается в емкости. Очищенные от низкомолекулярных компонентов частицы, не прошедшие сквозь мембрану, потоком жидкости рециркулируются обратно в накопительную емкость, где смешиваются с постоянно поступающей дистиллированной водой. В результате общая концентрация низкомолекулярных побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов в накопительной емкости уменьшается. На завершающем этапе очистки останавливают подачу жидкости в накопительную емкость и может быть осуществлено концентрирование очищенной суспензии (уменьшение ее объема), например, в 2-4 раза.

Вышеописанный способ дает возможность получать водную суспензию частиц СОД / поликатион / полианион с определенным методом динамического светорассеяния средним гидродинамическим диаметром 90-200 нм. При этом погрешность измерений составляет не более 4%. Размер используемых в композиции частиц можно варьировать изменением рН и ионной силы использованного буферного раствора, например, изменением в буферном растворе концентрации NaCl.

Ввиду того, что полученные частицы предстоит смешивать с фармакологически приемлемой, как правило, гидрофильной или гидрофобной твердой основой, полученную суспензию частиц подвергают лиофильной сушке, которую проводят с помощью традиционной лиофильной сушилки или вакуумной камеры. При этом перед лиофильной сушкой в суспензию частиц могут быть введены фармакологически приемлемые стабилизаторы, в качестве которых могут быть использованы, например, аминокислоты, моно- или полисахариды, полипептиды или белки. В группу аминокислот могут входить, например, аланин и глицин. В группу моно- или полисахаридов могут входить, например, глюкоза, сахароза, лактоза, трегалоза, манноза. В качестве полипептидов или белков могут быть использованы альбумины. При этом используемые стабилизаторы также будут входить в качестве компонента в основу лекарственной формы.

Анализ антиоксидантной активности проводят с использованием метода, в основе которого лежит реакция ингибирования автоокисления пирогаллола под действием СОД или ЭМОС [Marklund S., Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase // European journal of biochemistry. - 1974. - T. 47. - №. 3. - C. 469-474]. Измерения проводят в 96-луночном планшете. Предварительно лиофилизат диспергируют в буферном растворе с получением суспензии частиц с известной концентрацией, в воде растворяют ЭМОС. Для одного образца используют 8 лунок (один столбец). Последовательным разбавлением получают 8 точек объемом 20 мкл с концентрациями СОД 0,45-1000 мкг/мл или с концентрациями ЭМОС 0,02-50 мг/мл. В каждую из лунок добавляют 160 мкл 50 мМ Трис-буфера с рН 8,2 и 20 мкл раствора пирогаллола, полученного растворением навески пирогаллола в рассчитанном объеме ацетона с получением раствора с концентрацией 5 мг/мл и его разбавлением в 10 раз водой. Затем в течение 5 мин через каждые 30 сек с помощью спектрофотометра определяют изменение оптической плотности раствора от времени в результате окисления пирогаллола растворенным в воде кислородом в отсутствии и присутствии антиоксидантов и строят график зависимости скорости окисления пирогаллола от концентрации антиоксидантов в логарифмическом масштабе. С помощью программного обеспечения Origin 8.1 полученную зависимость аппроксимируют кривой «доза-ответ» и находят концентрацию, соответствующую 50%-ному ингибированию реакции (ЕС₅₀, мкг/мл). Далее рассчитывают активность СОД и ЭМОС по формуле: А=1000000/(20 * ЕС₅₀) [Ед/мг]. Выход СОД по активности у частиц определяют как отношение активности СОД у частиц к начальной активности используемого в синтезе раствора СОД и измеряют в процентах. Следует отметить, что активность зависит от концентрации раствора СОД, и снижается с ее уменьшением, а также от строения частиц и реагентов, используемых при их получении. Поэтому корректное сравнение значений активности СОД в частицах возможно проводить с учетом только вышеуказанных условий.

Определение концентрации белка в образцах проводят с помощью набора Micro ВСА™ Protein Assay Kit в соответствии с инструкцией производителя. Метод основан на колориметрическом определении комплекса бицинхониновой кислоты с ионами Cu⁺, образующегося путем восстановления ионов Cu²⁺ белками. Выход СОД по белку (ферменту) определяют как отношение конечной массы белка в суспензии частиц к начальной массе используемого белка в синтезе.

Суммарный выход СОД по активности вычисляют как произведение выхода СОД по активности и выхода СОД по белку.

Полученный лиофилизат целесообразно хранить при пониженной температуре в морозильной камере. Лиофилизат частиц может быть использован для получения средств для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, например, суппозиториев (свечей), мазей, гелей и т.д. Указанные лекарственные формы могут быть получены путем смешения действующего вещества - лиофилизата частиц с основой, выбранной из группы, включающей в себя, например, полиэтиленоксид 1500, полиэтиленоксид 400, витепсол, твердые жиры, бутирол, ланоль, масло какао, гидрогенизированные жиры или желатин-глицериновая смесь и т.д. Суппозитории из вышеуказанной композиции могут быть получены, например, традиционными методами выливания или ручного формирования. Смесь вышеуказанных веществ может дополнительно содержать также стабилизаторы, консерванты и другие лекарственные препараты и т.д. В зависимости от вида и тяжести заболевания схема лечения с использованием вышеописанных лекарственных форм может быть также различна.

Для измерения показателей антиоксидантной активности биологических жидкостей была использована модельная система гемоглобин - Н₂О₂ - люминол. В качестве субстрата окисления в данной системе выступает люминол. При взаимодействии с активными формами кислорода люминол подвергается свободнорадикальному окислению, в ходе которого испускаются кванты света, которые регистрируются с помощью хемилюминометра. Введение в модельную систему антиоксидантов приводит к торможению свободнорадикального окисления люминола.

Измерение антиокислительной активности (АОА) в модельной системе гемоглобин - Н₂О₂ - люминол проводят следующим образом.

Контрольная проба: в пробирку вносят 370 мкл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,4) и добавляют 50 мкл раствора 0,1 мМ люминола, 50 мкл раствора 5,0 мМ гемоглобина и тщательно перемешивают. Для инициирования реакции свободнорадикального окисления люминола добавляют 30 мкл раствора 0,98 мМ H₂O₂, перемешивают и точно фиксируют время внесения реактива. Пробирку помещают в хемилюминометр, с помощью которого регистрируют кинетику свободнорадикальной реакции в модельной системе.

Опытная проба: в пробирку вносят 340 мкл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,4) и добавляют последовательно 50 мкл раствора 0,1 мМ люминола, 50 мкл раствора 5,0 мМ гемоглобина и 30 мкл исследуемого материала и тщательно перемешивают. Затем вносят 30 мкл раствора 0,98 мМ H₂O₂, фиксируют время внесения, перемешивают и регистрируют кинетику свободнорадикального окисления на хемилюминометре марки "Биотокс-7" (Россия, НПО Энергия).

Измеряемыми параметрами являются величина латентного периода и интенсивность хемилюминисценции. По величине латентного периода судят о значении АОА по отношению к гидроксильному радикалу, по величине максимальной интенсивности хемилюминисценции судят о значении АОА по отношению к супероксидному радикалу.

Испытания лекарственной формы на основе предлагаемой композиции были проведены на добровольцах.

Преимущества предлагаемой композиции иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. В пластиковую пробирку объемом 15 мл помещают 1,80 мл раствора СОД с концентрацией 5,00 мг/мл в буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,57 мг/мл и 0,11 мг/ мл, соответственно, с рН 7,4 с добавлением NaCl с концентрацией 130 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 0,97 мл раствора поликатиона протамина с концентрацией 5,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 32,8 мкмолям аминогрупп протамина, и полученную смесь выдерживают в течение 30 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 1,07 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 5,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 30 мин при 4°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,90 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,4% по объему (39,6 мкмоль), что соответствует его мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 1,2, и полученную смесь выдерживают в течение 10 ч при 4°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,20 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 1,00 мг/мл. Для очистки суспензии полученных частиц используют поточную мембранную фильтрующую систему. Полученную суспензию наливают в накопительную емкость, откуда суспензия с помощью перистальтического насоса поступает на фильтрационный картридж, содержащий мембрану с пределом пропускания 90 кДа, и с большой скоростью двигается вдоль мембраны. Часть буферного раствора с низкомолекулярными побочными продуктами и не вступившими в реакцию реагентами проходит сквозь поры мембраны и накапливается в емкости. Остальная часть суспензии частиц, не прошедшая сквозь мембрану, рециркулируется обратно в накопительную емкость, где смешивается с постоянно поступающей дистиллированной водой.

В итоге получают 2,50 мл очищенной суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из протамина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 90 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 13500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 52%.

Далее проводят лиофильную сушку полученной очищенной суспензии частиц. Суспензию переносят в круглодонную колбу, содержимое колбы замораживают при -78°С, после чего колбу соединяют с лиофильной сушилкой, в ловушку сушилки заливают жидкий азот и с помощью форвакуумного насоса внутри сушилки создают вакуум. В процессе сушки колба снаружи покрывается инеем из атмосферной влаги, и сушку осуществляют до тех пор, пока иней не исчезнет. Колбу с лиофилизатом снимают с сушилки, лиофилизат переносят в пластиковую пробирку с плотно прилегающей крышкой. Пробирку с полученным лиофилизатом хранят в морозильной камере при -18°С.

После хранения лиофилизата в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 8%, а размер частиц после диспергирования лиофилизата в воде практически не изменился.

Для получения композиции 7,5 мг лиофилизата смешивают с 75,00 г желатин-глицериновой основы, состоящей из 8,50 г желатина, 47,00 г глицерина и 19,50 г воды. Получают композицию, в которой масс. % действующего вещества равен 0,01, а остальное основа, из которой формируют 20 суппозиториев массой по 3,00 г.

Больная А., 29 лет. Диагноз: острый вагинит. Больной вводили внутривагинально по 1 суппозиторию 2 раза в день в течение 10 дней. Уже на 2-й день лечения наблюдали значительное уменьшение боли, зуда и чувства жжения, также явное уменьшение отечности и гиперемии наружных половых органов и слизистой влагалища.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использована для лечения гинекологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.

Пример 2.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. В пластиковую пробирку объемом 2000 мл помещают 450,0 мл раствора СОД с концентрацией 2,50 мг/мл в буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,03 мг/мл и 0,57 мг/ мл соответственно, с рН 5 с добавлением NaCl с концентрацией 140 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 242,5 мл раствора поликатиона полилизина с концентрацией 2,50 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 4,0 ммолям аминогрупп поликатиона, и полученную смесь выдерживают в течение 25 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 267,5 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 2,50 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 25 мин при 3°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 112,5 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,1% по объему (1,2 ммоль), что соответствует мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 0,3, и полученную смесь выдерживают в течение 8 ч при 3°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 50,0 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 1,00 мг/мл. Очистку суспензии полученных частиц проводят аналогично примеру 1, однако используют мембрану с пределом пропускания 130 кДа.

В итоге получают 620,0 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из полилизина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 123 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 6500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 55%.

Далее проводят лиофильную сушку, полученной суспензии частиц аналогично примеру 1. Однако, в качестве стабилизатора в суспензию вводят 312,5 мл раствора мальтозы с концентрацией 21%.

После хранения в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 4%, а размер частиц в суспензии после диспергирования лиофилизата в воде практически не изменился.

Для получения композиции 11,3 г лиофилизата, содержащего мальтозу смешивают с 63,7 г формирующего компонента основы - масла какао. Получают композицию, содержащую 5,00 масс. % действующего вещества, а остальное основа. Суппозитории массой по 3,00 г из полученной композиции получают методом ручного формирования.

Больной М., 62 года. Диагноз: хронический геморрой, стадия обострения. Больному вводили по 1 суппозиторию в прямую кишку 2 раза в день в течение 7 дней. На 4-й день после начала лечения отмечено значительное улучшение состояния - кровотечение прекратилось, уменьшились боли и зуд в области заднего прохода. К концу курса лечения геморроидальный узел значительно уменьшился в размерах, воспаление было практически ликвидировано.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использована для лечения проктологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.

Пример 3.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. В пластиковую емкость объемом 7000 мл помещают 1800 мл раствора СОД с концентрацией 10,00 мг/мл в буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,58 мг/мл и 0,04 мг/мл соответственно, с рН 8 с добавлением NaCl с концентрацией 150 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 970 мл раствора поликатиона полиаргинина с концентрацией 10,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 65,6 ммолям аминогрупп протамина, и полученную смесь выдерживают в течение 40 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 1070 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 10,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 40 мин при 8°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 1800 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,5% по объему (98,4 ммоль), что соответствует мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 1,5, и полученную смесь выдерживают в течение 12 ч при 8°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 200 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 2,00 мг/мл. Для очистки суспензии полученных частиц от побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов в пробирки центрифуги помещают фильтр с ультрафильтрационной мембраной с пределом пропускания 100 кДа, затем фильтр вначале заполняют 5 мл полученной суспензии частиц, после чего туда добавляют 10 мл дистиллированной воды, пробирки с фильтром помещают в центрифугу и проводят центрифугирование в течение 12 мин при скорости вращения ротора центрифуги 3500 об/мин. После этого в пробирки повторно добавляют 10 мл дистиллированной воды, снова помещают в центрифугу и проводят повторное центрифугирование, затем снова добавляют 10 мл дистиллированной воды и осуществляют третье центрифугирование. Находящуюся над фильтром очищенную суспензию переносят в пластиковую пробирку и хранят при 8°С.

В итоге получают 2500 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из полиаргинина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 196 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии составляет 26200±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 47%.

Лиофильную сушку, полученной суспензии частиц аналогично примеру 1, однако не используют стабилизатор.

После хранения в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 9%, а размер частиц в суспензии после диспергирования лиофилизата практически не изменился.

Для получения композиции 15,0 г лиофилизата смешивают с 60,0 г основы, включающей в себя 15,0 г полиэтиленоксида 400 и 45,0 г полиэтиленоксида 1500. Получают композицию, в которой масс. % действующего вещества равен 20,00, а остальное основа. Из полученной композиции формируют суппозитории массой 3,0 г.

Больная Л., 41 год. Диагноз: острый вульвит. Больной вводили по 1 суппозиторию 2 раза в день в течение 10 дней. На 4-й день после начала лечения наблюдали значительное улучшение состояния - отмечено значительное уменьшение боли, зуда и чувства жжения, констатировали уменьшение отечности и гиперемии наружных половых органов и слизистой влагалища.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использована для лечения гинекологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.

Пример 4.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА - ПГ.

Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 153 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 13500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 52%. После хранения лиофилизата в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 7%, а размер частиц в суспензии после диспергирования лиофилизата в воде практически не изменился.

Из полученного лиофилизата готовят суппозитории (свечи) аналогично примеру 1.

Больная Т. 45 лет. Обратилась с жалобами на частое болезненное мочеиспускание, зуд и жжение в области гениталий, тянущие боли в промежности. Диагноз: хронический рецидивирующий цервицит, период обострения. Было назначено лечение предлагаемыми суппозиториями по 1 суппозиторию 2 раза в день в течение 7 дней. Спустя 2 дня было отмечено значительное уменьшение боли и чувства жжения. При повторном осмотре очаг воспалительного процесса значительно уменьшился. Назначено лечение в течение еще 5 дней, по истечении которых пациент полностью вылечился.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использованы для лечения гинекологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.

Пример 5.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. Опыт проводят аналогично примеру 2, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА - ПГ.

Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 118 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 7200±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 47%. После хранения лиофилизата в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 6%, а размер частиц в суспензии после диспергирования лиофилизата в воде практически не изменился.

Из полученного лиофилизата готовят суппозитории (свечи) аналогично примеру 2.

Больная К, 49 лет. Диагноз: вагинит, вызванный смешанной инфекцией. Было назначено лечение предлагаемыми суппозиториями по 1 суппозиторию 2 раза в день в течение 7 дней. При повторном осмотре воспаление отсутствовало, наблюдалось улучшение клинической картины.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использована для лечения гинекологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.

Пример 6.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. Опыт проводят аналогично примеру 3, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА - ПГ.

Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 186 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 24900±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 49%. После хранения лиофилизата в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 5%, а размер частиц в суспензии после диспергирования лиофилизата в воде практически не изменился.

Из полученного лиофилизата готовят суппозитории (свечи) аналогично примеру 3.

Больной Д., 56 лет. Диагноз: поверхностный проктит. Больному вводили по 1 суппозиторию 2 раза в день в течение 10 дней. В конце курса лечения наблюдалось купирование воспалительных процессов в тканях, уменьшение явления отека, исчезновение болевого синдрома, зуда, а также уменьшение отечности.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использована для лечения гинекологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.

Приведенные выше примеры показывают, что предлагаемая композиция может быть использована для эффективного лечения различных гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. Ниже приведены примеры, которые подтверждают достижение вышеуказанного технического результата при использовании предлагаемой композиции.

Пример 7 (контрольный, по прототипу)

Для получения суппозиторий на основе описанной в прототипе композиции предварительно готовят основу. Для этого взвешивают 20 г масла какао, помещают в емкость для плавления основы и расплавляют в течение 20 мин при 60°С. Затем расплавленную основу охлаждают до 40°С, медленно добавляют в нее 1 г мелкодисперсного порошка ЭМОС и перемешивают до однородной массы, получая композицию с 5%-ным содержанием действующего вещества. Далее для получения суппозиториев композицию разливают в гнезда металлической формы, которую затем охлаждают при 4°С. В итоге одна свеча (суппозиторий) для лечения человека имеет в своем составе 0,15 г действующего вещества (5% по массе) и 2,85 г основы. Суппозитории массой 50 мг для лечения подопытных животных получали аналогичным образом.

Для оценки выхода действующего вещества из композиции с использованием хемилюминесцентного метода проводят забор и анализ секрета слизистых оболочек влагалища до и после введения суппозиторий. Для этого одной группе здоровых людей, состоящих из трех человек, вводят интравагинально суппозитории, полученные с использованием предлагаемой композиции с 5%-ным содержанием действующего вещества, другой группе здоровых людей вводят суппозитории, полученные с использованием известной композиции по прототипу с 5%-ным содержанием действующего вещества - ЭМОС. Выделения отбирают тампоном до введения суппозиториев и через 12, 16, 18 ч после их введения. Спустя 12 ч АОА влаги по отношению к гидроксильному и супероксид радикалам после введения суппозиториев на основе ЭМОС была на 5% больше ее исходного уровня. Спустя 16 и 18 ч АОА влаги соответствовала исходным значениям АОА секрета слизистых оболочек. АОА выделений по отношению к гидроксильному и супероксид радикалам после использования суппозиториев на основе предлагаемой композиции через 12 ч была выше на 40% по сравнению с начальным уровнем, спустя 16 ч АОА превышала исходный уровень на 28%, после 18 ч использования суппозиториев АОА снизилась еще на 8%, и спустя 20 ч достигла исходных значений.

Таким образом, у суппозиториев на основе предлагаемой композиции выход действующего вещества из композиции достигал 18 ч, тогда как у известной композиции он составлял 12 ч.

Пример 8

Оценку эффективности композиции проводили на примере лечения вагинита. Опыт осуществляют на традиционной модели вагинита у крыс по методике, описанной в (патент RU 2428173 C1, А61К 9/02 (2006.01), 2010, см. описание). При этом используют 20 белых беспородных самок крыс массой 190-210 г.

Вагинит моделируют путем однократной внутривлагалищной аппликации ирританта (раздражителя), в качестве которого применяют комбинацию живичного скипидара с диметилсульфоксидом в массовом соотношении 1:1 в дозе 0,5 мл/100 г массы тела животного. Через 24 ч после введения ирританта начинают лечение животных. Суппозитории вводят во влагалище 2 раза в сутки в течение 7 дней. Животных предварительно делят на четыре экспериментальные группы: первая группа - животные без лечения, вторая группа - животные, которым вводят суппозитории, полученные с использованием описанной в прототипе композиции с 5%-ным содержанием ЭМОС, третья группа - животные, которым вводят суппозитории, полученные с использованием заявляемой композиции с 5%-ным содержанием частиц, четвертая группа - интактные (здоровые) крысы.

Регистрируют динамику воспалительного процесса на 1-е, 3-й и 7-е сутки после аппликации ирританта. Кроме того, отслеживают поведение и общее состояние животных. Учитывают степень выраженности местной гиперемии в баллах: 0 баллов - видимая слизистая влагалища и кожа вокруг влагалища без изменений; 1 балл - легкая гиперемия видимой слизистой влагалища; 2 балла - выраженная гиперемия слизистой влагалища и кожи; 3 балла - выраженная гиперемия слизистой влагалища и признаки самоповреждения кожи. Также учитывают степень обильности выделений из влагалища в баллах: 0 баллов - выделений нет; 1 балл - слабые выделения при надавливании тампоном; 2 балла - умеренные выделения, смочена кожа вокруг влагалища; 3 балла - обильные выделения, смочена кожа вокруг влагалища и подстилка. В те же сроки оценивают гематологические маркеры воспалительного процесса - содержание лейкоцитов в крови у подопытных крыс и скорость оседания эритроцитов (СОЭ).

У животных из всех экспериментальных групп через 24 ч после введения ирританта наблюдали выраженное беспокойство, выделения из влагалища и гиперемию видимой слизистой оболочки влагалища.

В первые сутки после моделирования вагинита животные из трех первых групп проявляли беспокойство, повышенную реакцию на внешние раздражители. У них наблюдали серозно-слизистые выделения из влагалища. Отклонения в поведении животных постепенно уменьшались к 3-у дню эксперимента.

На 3-й сутки, в первой контрольной группе, состоящей из не получавших лечение крыс, не отмечалось положительной динамики, наблюдали гиперемию слизистой влагалища и умеренные выделения. В группах крыс, получавших суппозитории на основе ЭМОС и суппозитории на основе предлагаемой композиции, отмечали значительное снижение лейкоцитов в крови животных по сравнению с первыми сутками с начала лечения. Однако в группе животных, получавших суппозитории на основе ЭМОС, наблюдали выраженную гиперемию влагалища, и животные проявляли беспокойство.

На 7-е сутки в группе животных, получавших суппозитории на основе предлагаемой композиции, наблюдали значимое снижение общего количества лейкоцитов в крови, которое достигло значений, соответствующих группе интактных (здоровых) крыс, что свидетельствовало об успешном излечении заболевания, а также значения СОЭ у них не отличалась от изначального показателя и гиперемию не наблюдали. В группе животных, получавших суппозитории на основе ЭМОС, наблюдали легкую гиперемию влагалища. При этом общее количество лейкоцитов в крови хоть и снизилось, но не достигло начальных показателей, соответствующих группе интактных крыс, что свидетельствовало о продолжении воспалительного процесса.

Результаты опыта показывают, что композиция, в которой в качестве действующего вещества содержатся частицы СОД, обладает большей эффективностью при лечении воспалительных заболеваний по сравнению с композицией на основе ЭМОС.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемая композиция может быть использована для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. При этом предлагаемая композиция по сравнению с прототипом действительно более эффективна при лечении воспалительных заболеваний и у нее продолжительность выхода действующего вещества из композиции повышается с 12 до 18 ч.

Композиция для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом, состоящая из антиоксидантного действующего вещества и основы, отличающаяся тем, что в качестве действующего вещества она содержит частицы, полученные путем смешения буферных растворов антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в концентрации 2,5-10,0 мг/мл и поликатиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, где поликатион выбирают из группы, включающей протамин, полилизин и полиаргинин, перемешивания и выдерживания смеси с последующими добавлением в нее буферного раствора полианиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, где полианион представляет собой блок-сополимер полиглутаминовой кислоты и полиэтиленгликоля или блок-сополимер полиаспарагиновой кислоты и полиэтиленгликоля, перемешиванием и выдерживанием полученной смеси, добавлением в нее водного раствора глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с аминогруппами поликатиона 0,3-1,5, выдерживанием смеси, добавлением в смесь водного раствора боргидрида натрия в концентрации 1-2 мг/мл, очисткой смеси с использованием мембранной фильтрующей системы с пределом пропускания 90-130 килодальтон, лиофильной сушкой очищенной смеси и смешением лиофилизата с основой, при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Действующее вещество	0,01-20,00
Основа	остальное