Способ получения бактериологически чистого протеинового продукта с повышенным содержанием минорных белков
Владельцы патента RU 2736645:
Общество с ограниченной ответственностью «Победа-1» (ООО «Победа-1») (RU)
Изобретение относится к молочной и биотехнологической промышленности. Способ получения белковой композиции из молозива включает обезжиривание молозива, осаждение казеиновой фракции удалением из нее микрофлоры посредством первой микрофильтрации и получением пермеата П1, который подвергают второй микрофильтрации с получением пермеата П2, обогащенного лактоферрином, и ретентата Р2, обогащенного иммуноглобулинами. Ретентат Р2 далее подвергают диафильтрации с использованием мембраны, обеспечивающей разделение ретентата Р2 на пермеат П3, содержащий лактозу и минеральные соли, и ретентат Р3, содержащий иммуноглобулины, при этом все этапы способа проводят при температуре, ниже температуры денатурации лактоферрина и иммуноглобулинов; ретентат Р3 подвергают ультрафиолетовой обработке, при этом ретентат в процессе обработки перемешивают; полученные ретентат Р3 и пермеат П2 смешивают с получением белковой композиции. Изобретение позволяет получить бактериологически чистый гипоаллергенный продукт с максимально возможным сохранением нативных свойств сырья, который может быть пригоден для профилактического диетического питания, а также для получения препаратов, обладающих иммуномодулирующим эффектом. 4 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр., 8 ил.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской, фармацевтической, пищевой промышленности, а именно к получению из молозива специализированных продуктов питания и препаратов, обогащенных иммуноглобулинами, лактоферрином с пониженным содержанием лактозы и казеина, характеризующихся антивирусной и антибактериальной активностью. Изобретение может быть использовано для профилактики, а также в комплексной терапии инфекционных заболеваний различной этиологии, снижения воспалительных и аллергических реакций, профилактики астматического статуса, укрепления иммунной системы. Особенно актуально использование гипоаллергенного белкового продукта на основе лактоферрина, обогащенного иммуноглобулинами, для профилактики и в комплексной терапии при лечении COVID-19.
Уровень техники
В последние годы наблюдается возрастающий спрос на белковые продукты из молозива. Известно, что молозиво содержит различные иммунные факторы, такие как иммуноглобулины, лактоферрин, а также богатые пролином полипептиды, которые в комплексе обладают антибактериальной, антивирусной активностью, а также способностью модулировать иммунную систему. Эффекты применения молозива, описанные в литературе, сложно отнести к отдельным его компонентам. Поэтому оптимальный состав продуктов и препаратов, полученных из молозива для использования человеком, должен быть приближен по содержанию ценных компонентов к составу необработанного молозива, т.е. содержать ценные компоненты в высокой концентрации в нативной форме. Однако в процессе переработки молозива для получения готовых продуктов, обогащенных иммуноглобулинами, лактоферрином, и содержащих минимальное количество аллергенных компонентов (казеина, альфа-лактоальбумина и бета-лактоглобулина), большая часть ценных компонентов теряет свои свойства - иммуноглобулины и лактоферрин не выдерживают высоких температур, их денатурация начинается при 70°С, а после температурной обработки в течение 4 с при 138°С иммуноглобулины полностью теряют свою активность. В результате возникает необходимость усовершенствования способов обработки молозива с сохранением его нативных свойств.
Существует два основных подхода к переработке сырого молозива в продукт. Один из подходов - пастеризация с последующей распылительной сушкой. Этот способ прост и безопасен в использовании. Однако высокие температуры при пастеризации и распылительной сушке приводят к денатурации белков. Особенно важные ингредиенты, такие как иммуноглобулины и факторы роста, частично разрушаются.
Альтернативно, молозиво может быть обработано с использованием различных процессов мембранного разделения, в т.ч., при температурах, не превышающих температуру денатурации белка. Сырое молозиво обычно обезжиривают перед отделением казеина (например, WO 97/43905). Отделение казеина проводят осаждением кислотой или мембранной фильтрацией. Полученная таким образом сыворотка может быть сконцентрирована и обессолена микрофильтрацией и/или ультрафильтрацией. Далее полученный продукт стерилизуют или подвергают лиофильной сушке. Продукт, изготовленный таким образом, содержит большую часть первоначально присутствующих белков. Однако отдельные процессы разделения или фильтрации предполагают, что такой продукт также содержит лактозу, что делает его непригодным для использования группой пользователей, имеющих ответную аллергическую реакцию на данный компонент.
Настоящее изобретение направлено на то, чтобы избежать или, по меньшей мере, уменьшить содержание лактозы в конечном белковом продукте, получаемом из молозива при обеспечении высокого содержания лактоферрина и иммуноглобулинов по сравнению с исходным составом необработанного молозива.
Из уровня техники известен способ очистки молочного сырья с целью получения лактоферрина (RU 2400106). Способ включает в себя очистку молочного сырья, сепарирование, осаждение казеина, двухступенчатую ультрафильтрацию, хроматографическое разделение белков, диализ, микрофильтрацию с селективностью пор 0,2-0,3 мкм, смешивание выделенных монофракций в соотношении, аналогичном их содержанию в свежевыдоенном коровьем молоке, лиофильную сушку. На первой ступени ультрафильтрации осуществляют выделение из сыворотки иммуноглобулиновой фракции через мембраны 100 кДа. Повторной ультрафильтрации через мембраны 30 кДа подвергают пермеат. Полученный при этом концентрат белков подвергают ионообменной хроматографии, илюируя градиентом NaCl от 0,35 до 1 М с получением лактоферриновой и лактопероксидазной фракций. Недостатком данного изобретения является относительная трудоемкость, связанная с поэтапным проведением очистки белка, необходимость отделения балластных белков.
Из уровня техники известен безлактозный молочный продукт и способ его получения из молозива (AT511308A2). Сырое молозиво обезжиривают, а продукт, содержащий высокомолекулярные ингредиенты, полученные после ультрафильтрации, подвергают стерилизации и/или стерильной фильтрации. Молочный продукт из молозива содержит не более 20% от лактозы, присутствующей в сыром молозиве. Однако в связи с наличием казеинов первой формы (α-казеина) этот продукт не является свободным от аллергенов. Кроме того, после стерилизации продукт теряет ценные белковые компоненты - минорные и сывороточные белки, которые могут присутствовать в продукте лишь в виде обрывков полипептидных цепочек.
Из уровня техники известны способ и устройство для выделения целевых компонентов из молозива с возможностью получения различных продуктов и добавок (US2003059512). Способ позволяет отделять казеин от других белков без введения каких-либо химических осаждающих агентов, которые нарушают целостность питательных веществ исходного продукта. В процессе отделения образуются две жидкие фракции, одна из которых обогащена казеином, а другая обеднена казеином и содержит иммуноглобулины, альфа-лактальбумин, бета-лактоглобулин, бычий сывороточный альбумин, лактоферрин, лактопероксидазу, иммуноглобулины, углеводы, пептиды, сиалиллактозу и лактозу, которые могут быть предназначены для дальнейшего разделения и использования. Способ включает следующие стадии: обезжиривание исходного молозива с использованием отделителя сливок; пастеризацию молозива; первый этап фильтрации молозива с поперечным потоком для удаления бактерий; второй этап фильтрации молозива с поперечным потоком для разделения его на богатую казеином ретентатную фракцию и обедненную казеином фракцию пермеата; третий этап фильтрации обедненной казеином фракции пермеата с поперечным потоком с образованием ретентатной фракции, обогащенной макромолекулами, такими как альбумин и иммуноглобулины, и фракции пермеата, обедненной такими макромолекулами; четвертый этап фильтрации фракции пермеата, обедненной макромолекулами, с поперечным потоком с образованием фракции ретентата, обогащенной β-лактоглобулином, и фракции пермеата, обедненной β-лактоглобулином; пятый этап фильтрации фракции пермеата, обедненного бета-лактоглобулином, с поперечным потоком с образованием фракции ретентата, обогащенной альфа-лактальбумином, и фракции пермеата, обедненной альфа-лактальбумином; шестой этап фильтрации фракции пермеата, обедненного α-лактальбумином, с поперечным потоком с образованием фракции ретентата, богатой сложными углеводами, и фракции пермеата, обедненной сложными углеводами; седьмой этап фильтрации фракции пермеата, обедненного сложными углеводами, с образованием богатой лактозой фракции ретентата и фракции пермеата, обедненной лактозой. Такой интегральный процесс обеспечивает максимальное использование всех полезных компонентов, содержащихся в молоке. Кроме того, достигается цель минимизации отходов, продления срока хранения молочного продукта и поддержания его естественной питательной целостности. Отделение казеина от других компонентов молока может быть осуществлено с помощью фильтрующей мембраны со средним размером пор в диапазоне от 100 кДа до 3000 кДа, предпочтительно от 100 кДа до 1000 кДа. Обедненную казеином фракцию пермеата пропускают через другой фильтрующий модуль с получением ретентатной фракции, обогащенной иммуноглобулином G (IgG) и альбумином, и фракции пермеата, которая обеднена альбумином и IgG. Отделение альбумина и IgG от других компонентов молока может быть осуществлено путем включения в фильтрующий модуль полимерной или целлюлозной фильтрующей мембраны, имеющей ретентатную молекулярную массу в диапазоне от 50000 до 300000 МВт.
Однако данный способ подразумевает использование крайне сложной технологической комбинации мембран с широким интервалом значений среднего размера пор, что в ряде случаев может не обеспечивать выделение чистых фаз с получением продукта, очищенного от нежелательных компонентов. При этом изобретение направлено на получение из сходного молозива отдельных компонентов, которые могут быть использованы при приготовлении различных конечных продуктов разного состава - качественного и количественного. Заявляемое же изобретение направлено на получение из исходного молозива в рамках одного технологического цикла одного конечного продукта с сохранением нативных свойств молозива.
Из уровня техники известен также продукт из молозива и способ его получения (WO200103515), включающий обезжиривание исходного молозива, отделение казеина и липидов и получения пермеата, богатого сывороточными белками, ультрафильтрацию и/или диафильтрацию (концентрирование) пермеата с получением изолята молозива в сыворотке. Для микрофильтрации используют керамические мембраны с диаметром пор от 0,05 до 1,4 мкм, предпочтительно 0,1 мкм. Температуру при микрофильтрации поддерживают в диапазоне от 4 до 70°С, предпочтительно, около 50°С, уровень рН - в диапазоне от 4,6 до 8,5, предпочтительно, в диапазоне от 6 до 7. Ультрафильтрацию проводят при температуре около 10°С с использованием мембран с отсечкой по молекулярной массе от 1 кДа до 1 ОД, предпочтительно около 1 ОД. Получаемый изолят молозива в сыворотке включает, по меньшей мере, 70% белков, в котором, по меньшей мере, 20% содержания белка составляют иммуноглобулины. Способ дополнительно включает сушку изолята для получения концентрата белка молозива с низким содержанием сыворотки. Порошок молозива может быть приготовлен посредством смешения пермеата, полученного после микрофильтрации (предпочтительно после концентрирования ультрафильтрацией/диафильтрацией) или его части, с ретентатом сыворотки. Затем смесь может быть сконцентрирована перед выпариванием и сушкой. В одном из вариантов осуществления изобретения молозива получают из бычьих иммунизированных или гипериммунизированных животных. Признано, что иммунизация животного, например, коровы, специфическими антигенами будет стимулировать выработку специфических антител, например, IgG и/или IgA, которые затем могут быть «собраны» из молока или молозива этого животного.
Однако в способе используются высокотемпературные процессы, при которых сывороточные белки начинают денатурировать (42°С и более), что отрицательно сказывается на количественном содержании сывороточных белков в готовом продукте. Кроме того, используемый в способе диапазон рН (от 4,6 до 8,5) также уменьшает количественное содержание в готовом продукте минорных белков, в частности, лактоферрина, по сравнению с их содержанием в исходном сырье. Уровень рН в технологическом процессе для обеспечения оптимальной концентрации лактоферрина в готовом продукте должен быть более 7,0. Таким образом, при осуществлении известного способа потери белка в готовом продукте по сравнению с исходным составом могут достигать более 40%. Кроме того, использование вакуум-выпарной сушки также ухудшает нативные свойства белка.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения белковой композиции из молозива (CA 2013941), содержащей общий белок 75-85% масс., в том числе иммуноглобулины - 50-65% и лактоферрин 3,5-6,0%, лактозу - менее 3% и зольные (минеральные вещества) - менее 1%. Данное изобретение направлено на увеличение в композиции доли общего белка, занимаемого иммуноглобулинами, реализуемое посредством обработки сыворотки молозива с помощью ультрафильтрационной мембраны, предназначенной для фракционирования иммуноглобулинов в соответствии с их молекулярной массой, при этом в процессе ультрафильтрации из сыворотки удаляются низкомолекулярные вещества, а также такие белки, как α-лактоальбумин, β-лактоглобулин. Однако данная композиция предназначена преимущественно для профилактики и лечения ротавирусной инфекции, которая подразделяется на семь серотипов. В связи с чем, для повышения эффективности композиции в отношении данной инфекции получают иммуноглобулины с высокими титрами нейтрализующих антител против всех серотипов ротавируса путем извлечения иммуноглобулинов из смеси образцов молозива, собранных у как можно большего количества коров, предпочтительно не менее 50 коров в различных регионах. Кроме того, в рассматриваемом изобретении отсутствуют данные, демонстрирующие наличие у полученной белковой композиции иной биологической активности, помимо активности в отношение ротавирусной инфекции, что не позволяет использовать её, например, для профилактики и в комплексной терапии при лечении COVID-19.
Заявляемое изобретение позволяет получать из молозива белковую композицию (продукт) более широкого спектра действия с оптимальным качественным и количественным составом компонентов, в т.ч., для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых РНК-вирусами, включая COVID-19, без необходимости сбора молозива из различных регионов.
Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением, является устранение недостатков, присущих перечисленным выше аналогам.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом изобретения является получение бактериологически чистого гипоаллергенного продукта (белковой композиции), обогащенного иммуноглобулинами A, M, G и E и лактоферрином с сохранением их нативных свойств, имеющего противомикробную активность и противовирусную активность в отношении Betacoronavirus, в т.ч. SARS-CoV-2, обусловленную стимуляцией клеток иммунной системы.
Все нативные свойства белка сохраняются за счет использования ультрафильтрации и смешивания чистых стерильных компонентов. Продукт является низколактозным, в этой связи пригоден для использования аллергиками.
По итогам проведенных исследований было показано, что белковая композиция, полученная по заявляемому способу, демонстрирует наилучший комплексный эффект в отношении подавления роста бактерий Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Porphyromonas gingivalis, Candida albicans, и вирусов, в т.ч. SARS-CoV-2, что является важным при лечении COVID-19.
Технический результат достигается при использовании способа получения белковой композиции из молозива, обогащенной иммуноглобулинами и лактоферрином, включающего обезжиривание молозива, осаждение казеиновой фракции с получением сыворотки, удалением из нее патогенной микрофлоры посредством первой микрофильтрации и получением пермеата П1, который подвергают второй микрофильтрации с получением пермеата П2, обогащенного лактоферрином, и ретентата Р2, обогащенного иммуноглобулинами, который далее подвергают диафильтрации с использованием мембраны, обеспечивающей разделение ретентата Р2 на пермеат П3, содержащий предпочтительно лактозу и минеральные соли, и ретентат Р3, содержащий предпочтительно иммуноглобулины, при этом обезжиривание молозива, осаждение казеиновой фракции, удаление из сыворотки патогенной микрофлоры, микрофильтрацию и диафильтрацию или ультрафильтрацию проводят при температуре, ниже температуры денатурации лактоферрина и иммуноглобулинов; для удаления остаточной микрофлоры ретентат Р3 подвергают ультрафиолетовой обработке, при этом ретентат в процессе обработки перемешивают; полученные ретентат Р3 и пермеат П2 смешивают с получением белковой композиции, обогащенной лактоферрином и иммуноглобулинами.
Осаждение казеиновой фракции проводят предпочтительно с использованием сычужного фермента. Первую микрофильтрацию проводят с использованием керамической мембраны 800 нм, вторую - с использованием керамической мембраны 100 нм, диафильтрацию - с использованием мембраны с отсечкой 5кДа. Обезжиривание молозива осуществляют при температуре 30-40°С. Микрофильтрацию и диафильтрацию проводят при температуре 10-12°С.
Заявляемым способом в процессе одного технологического цикла может быть получена белковая композиция следующего состава, масс.%: общий белок - не менее 4,0, в т.ч. иммуноглобулины A, М, G и E - не менее 2, и лактоферрин - не менее 0,1; а также аминокислоты - не менее 4,5 г/100г, лактозу - не более 1,0, казеин - не более 0,1, минеральные соли - не более 0,5, воду - остальное; при этом содержание иммуноглобулина G оставляет не менее 80% от общего содержания иммуноглобулинов. В конкретном варианте реализации изобретения содержание общего белка в композиции может составлять 4,0-6,0 масс.%, в т.ч. иммуноглобулинов A, М, G и E - 2,0-3,5 масс.%, лактоферрина - 0,1-0,4 масс.%, казеина - не более 0,01 масс.%, минеральных солей - 0,02-0,3%. Содержание иммуноглобулина A от общего содержания иммуноглобулинов может составлять не менее 6%, иммуноглобулина М - не менее 5%, иммуноглобулина E - не менее 1%. Белковая композиция может быть представлена в виде раствора, или концентрата, или лиофильно высушенного продукта. Из белковой композиции также может быть получено средство, обладающее антивирусной и антибактериальной активностью, содержащее упомянутую белковую композицию и совместимые с ней наполнители и/или вспомогательные вещества, включая консерванты, связующие вещества, стабилизаторы, и т.д., в качестве которых могут быть использованы любые вещества, известные из уровня техники.
Технический результат достигается при использовании заявляемой последовательности поэтапной обработки исходного молозива, в т.ч., с использованием микрофильтрации и диафильтрации, при этом в конечном продукте остается не только лактоферрин, а комбинация лактоферрина с иммуноглобулинами IgA, IgM, IgG и IgE-антителом первого иммунного ответа, с сохранением их наивных свойств.
На начальном этапе молозиво разводят водой до плотности молока для того, чтобы оно легче проходило через мембрану и для уменьшения расходов электроэнергии на насосах, удаляют жир и казеин без изменения нативных свойств оставшегося в сыворотке белка. Мембранную фильтрацию проводят в 2 стадии: сначала пермеат пропускают через мембрану 800 нм для удаления патогенной флоры, затем полученный пермеат пропускают через мембрану 100 нм для разделения состава на пермеат, содержащий предпочтительно лактоферрин, и ретентат, содержащий предпочтительно иммуноглобулины и лактозу. На следующем этапе полученный ретентат, в свою очередь, разделяют с помощью блока диафильтрации на пермеат с предпочтительным содержанием лактозы, который удаляют из данного технологического процесса, и ретентат с предпочтительным содержанием иммуноглобулинов, который обрабатывают ультрафиолетовым облучением для удаления оставшейся патогенной микрофлоры, и смешивают с пермеатом, содержащим лактоферрин. В результате данного технологического процесса из молозива отделяют казеин, лактозу (альфа-лактоальбумин, бета-лактоглобулин), минеральные соли, а лактоферрин и иммуноглобулины остаются в сыворотке с сохранением их нативных свойств.
Таким образом, мембранная фильтрация позволяет получить белковую композицию в виде бактериологически чистого концентрированного раствора с максимально возможным количественным содержанием лактоферрина и иммуноглобулинов с сохранением их нативных свойств, свободный от казеина и обеднѐнный по лактозе, т.е. продукт с антивирусным, в т.ч. SARS-CoV-2, и антимикробным действием со значительно сниженными аллергенными свойствами, не содержащего БГКП (бактерии группы кишечной палочки) на 1 сутки с минимально возможным содержанием в 1,0 г КМАФАнМ (количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов или общая бактериальная обсемененность) на 3 сутки - до 1×101.
Существенным в изобретении является последовательное использование определенных этапов микрофильтрации и диафильтрации, в которых применяется принцип механического разделения исходного жидкого продукта на фракции: все частицы в жидкости, которые больше, чем поры мембраны, удерживаются мембраной, в комбинации с обработкой УФО. Движущей силой в указанных методах разделения является перепад давления между входом исходного продукта и выходом фильтра, который может составлять от 0,3 до 8 бар.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется иллюстрациями.
На Фиг. 1 представлена схема установки, демонстрирующая процесс последовательного фракционирования белковых компонентов из молозива и получения диетического продукта (белковой композиции), где: 1 - автоцистерна; 2 - насос питательный; 3 - счетчик-расходомер; 4 - емкость для сырого молозива; 5 - емкость для нормализованной смеси; 6 - емкость с водой деминерализованной; 7 - сепаратор-сливкоотделитель; 8 - емкость для обезжиренного молозива; 9 - емкость для сырых сливок; 10 - блок микрофильтрации (800 нм); 11 - емкость для фильтрата, прошедшего через мембрану 800 нм; 12 - блок микрофильтрации (100 нм); 13 - емкость для фильтрата, прошедшего через мембрану 100 нм; 14 - блок диафильтрации; 15 - емкость для концентрата, прошедшего через мембрану с отсечкой 5 кДа; 16 - блок ультрафиолетовой обработки ретентата, 17 - емкость для приготовления готового продукта; 18 - автомат фасовки.
На фиг. 2 представлен блок ультрафиолетовой обработки ретентата, где 19 - емкость с рубашкой охлаждения, 20 - лампы УФ; 21 - мешалка с нижним приводом; 22 - привод мешалки.
На фиг. 3-8 представлены результаты исследований бактерицидного действия заявляемой белковой композиции (образец 2) и аналога (образец 1), при этом на фиг.3 представлены характеристики максимумов роста исследуемых штаммов - Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Porphyromonas gingivalis, Candida albicans, по показателю оптической плотности OD, на фиг. 4-8 - кривые роста перечисленных штаммов, соответственно, при использовании образцов 1 и 2.
Осуществление изобретения
Термин «молозиво» при описании настоящего изобретения означает любой тип натурального молозива, полученного от млекопитающих, в основном от крупного рогатого скота (включая взрослую самку крупного рогатого скота), но не ограничиваясь этим. Может быть использовано молозиво от следующих животных: козы, лошади, овцы, лоси, олени, верблюды, и др., а также смеси двух или более видов животных.
При описании изобретения использованы термины пермеат или фильтрат, которые означают часть исходного потока (раствора/сыворотки), прошедшего через мембрану, а также концентрат или ретентат - часть исходного потока, уносящего с собой микроэлементы и/или примеси, задержанные мембраной.
Фильтрующие модули с поперечным потоком и фильтрующие кассеты с поперечным потоком, используемые в технологическом процессе получения конечного продукта в соответствии с настоящим изобретением, являются коммерчески доступными.
Изобретение направлено на получение из молозива белковой композиции, обогащенной лактоферрином и иммуноглобулинами, без казеина и лактозы (или с незначительным их содержанием) без введения каких-либо химических осадителей, которые нарушают целостность питательных компонентов. Таким образом, в процессе разделения указанных компонентов в соответствии с настоящим изобретением образуются две жидкие фракции, одна из которых - обогащенная казеином, направляется на утилизацию, а другая, обогащенная лактоферрином и иммуноглобулинами, может быть использована в качестве конечного продукта в жидком, концентрированном или лиофильно высушенном виде, или в качестве добавки в составе иных продуктов или препаратов.
Ниже представлено детальное описание способа получения белковой композиции (продукта) из молозива, которое не ограничивает заявляемое решение, а на конкретном примере демонстрирует возможность его осуществления с достижением технического результата. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификациям, понятным специалисту на основе прочтения настоящего описания. Например, могут изменяться пропорции воды и молозива при его нормализации, температура сепарации, время обработки ультрафиолетом ретентата после этапа диафильтрации (5 кДа) и т.д.
Заявляемый белковый продукт может быть получен с использованием установки, схематично представленной на фиг. 1, содержащий блок ультрафиолетовой очистки, схематично изображенный на фиг. 2.
Установка для получения белковой композиции содержит соединенные в технологической последовательности блок обезжиривания молозива, блок осаждения казеиновой фракции, первый блок микрофильтрации, второй блок микрофильтрации, блок диафильтрации, блок ультрафиолетовой обработки (блок ультрафиолетовой обработки в одном из вариантов осуществления изобретения может быть совмещен с блоком диафильтрации), а также емкость для белковой композиции, которая установлена на выходе для пермеата из второго блока микрофильтрации и на выходе для ретентата блока диафильтрации или на выходе блока ультрафиолетовой обработки.
В одном из вариантов осуществления изобретения блок обезжиривания молозива включает соединенные технологическими трубопроводами следующие устройства, как показано на фиг. 1 - емкость для сырого молозива 4, выполненную с возможностью охлаждения и поддержания температуры молозива, например, 4°С; емкость для нормализованных смесей 5, выполненную с возможностью нагрева и поддержания температуры смеси при температуре, например, 35°С; емкость для деминерализованной воды 6, которая выполнена с возможностью подачи воды в емкость 5; сепаратор-сливкоотделитель 7, вход которого соединен с выходом емкости 5, при этом выходы сепаратора соединены с емкостями для обезжиренного молозива 8 и емкостью для сырых сливок 9.
Блок осаждения казеиновой фракции по существу состоит из емкости для обезжиренного молозива 8, в которой производят его смешение с закваской (сычужным ферментом), с последующим осаждением казеиновой фракции, при этом емкость выполнена с возможностью нагрева, поддержания определенной температуры смеси (например, 35°С для обеспечения процесса сквашивания), и удаления из емкости казеиновой фракции (в виде творожной фракции).
Первый блок микрофильтрации 10 представляет собой мембранный модуль, который предназначен для удаления оставшегося казеина и патогенной микрофлоры из сыворотки, и имеет вход для сыворотки, полученной после осаждения казеиновой фракции, соединенный с емкостью 8, а также выходы для концентрата (ретентата) Р1 и фильтрата (пермеата) П1, где выход для фильтрата соединен с емкостью 11, выполненной с возможностью охлаждения и поддержания температуры фильтрата, например, 10-12°С. Блок 10 выполнен на базе керамических мембран с размером пор предпочтительно 800 нм. Выбор мембран с определенным размером пор обусловлен необходимостью удаления из сыворотки жиров, казеина, лактозы, альфа-лактоальбумина, бета-лактоглобулина. Для микрофильтрации используют фильтрационное оборудование на тангенциальном принципе фильтрации, например, с трансмембранным давлением, не превышающим 4 бар. Предпочтительно, чтобы трансмембранное давление во время микрофильтрации поддерживалось в интервале значений 2,0-3,5 бар. Возможен вариант использования микрофильтрационных мембран, имеющих градиент пористости или толщины мембранного слоя.
Второй блок микрофильтрации 12, представляет собой мембранный модуль, который предназначен для разделения фильтрата из емкости 11 на ретентат Р2, содержащий предпочтительно иммуноглобулины A, М, G и E и лактозу, и пермеат П2, содержащий предпочтительно лактоферрин, где выход для пермеата П2 соединен с емкостью 13, выполненной с возможностью охлаждения и поддержания температуры пермеата, например, 10-12°С. Емкость 13 соединена с емкостью 16 для приготовления готового продукта (белковой композиции). Блок 12 включает фильтрационный модуль, выполненный преимущественно на базе керамических мембран с размером пор 100 нм, циркуляционный насос, питающий насос, КИПиА (Контрольно-измерительные приборы и автоматика), модуль АСУТП (Автоматическая система управления технологическим процессом), трубопроводы для отвода пермеата и ретентата.
Блок диафильтрации 14, представляет собой мембранный модуль, который предназначен для разделения ретентата Р2, получаемого на выходе из блока 12, на пермеат П3, содержащий предпочтительно лактозу и минеральные соли, и ретентат Р3, содержащий предпочтительно иммуноглобулины A, М, G и E, где выход для ретентата Р3 соединен с емкостью 15, выполненной с возможностью охлаждения и поддержания температуры ретентата, например, 10-12°С. Блок 14 включает фильтрационный модуль, выполненный преимущественно на базе керамических мембран с отсечкой 5 кДа, циркуляционный насос, питающий насос, КИПиА, модуль АСУТП, трубопроводы для отвода пермеата и ретентата. Емкость 15 соединена с емкостью 17 для приготовления готового продукта (белковой композиции) через блок 16 ультрафиолетовой обработки (УФО).
Блок ультрафиолетовой обработки (УФО) 16 (фиг. 2) может быть выполнен отдельно, и расположен на выходе для ретентата Р3 из блока диафильтрации, или может быть совмещен с блоком диафильтрации. В частности, емкость 15 для концентрата, прошедшего через блок диафильтрации 14, выполненная с возможностью охлаждения и поддержания температуры концентрата, например, 10-12°С, может быть дополнительно снабжена ультрафиолетовыми лампами 20, электромагнитной мешалкой 21 с нижним приводом 22 (например, 100-500 об/мин), как показано на фиг. 2. Ультрафиолетовые лампы расположены равномерно по всему объему емкости, при этом для емкости объемом 100 л предпочтительно использование пяти ультрафиолетовых ламп мощностью 45 Вт. Каждая ультрафиолетовая лампа снабжена кожухом из кварцевого стекла.
В одном из вариантов выполнения емкости 4, 11, 13, 15, 16 для охлаждения и поддержания температуры размещаемых в них продуктов могут быть снабжены рубашкой охлаждения. Установка снабжена также питательными насосами, установленными в каждом технологическом блоке.
Обработку исходного молозива с получением белкового продукта требуемого состава проводят следующим образом.
Предпочтительно сбор 100% натурального молозива проводят в течение первых 24 часов лактации, т.к. такое молозиво позволяет получить максимально обогащенный продукт лактоферрином и иммуноглобулинами. При этом молозиво может быть получено как от неиммунизированных животных, так и иммунизированных с целью увеличения абсолютного количественного содержания лактоферрина и иммуноглобулинов в конечном продукте. В своем большинстве молозиво получают от КРС, например, черно-пестрых коров беспривязного содержания. Перед началом переработки оценивают параметры полученного молозива.
На подготовительном этапе отобранное по качеству сырое молозиво очищают от механических примесей, например, с использованием тканевых фильтров с ячейками 0,5 мм, и охлаждают до 4±2°С в емкости для сырого молозива 4, далее направляют в резервуар (емкость) 5. Охлаждённое молозиво до переработки хранят при температуре 4±2°С. Для снижения вязкости в емкости 5 (емкости нормализации) молозиво смешивают с деминерализованной водой (нормализуют), которую подают в емкость 5 из емкости 6, предпочтительно в соотношении Молозиво:Вода = 1:0,1÷4,0 (разбавляют до концентрации молока). Затем нормализованную смесь в емкости 5 нагревают до температуры 34-40ºС и направляют в сепаратор-сливкоотделитель 7. В результате молозиво разделяется на две фракции: высокожирные сливки (м.д.ж. 60%) и обезжиренное молозиво. Высокожирные сливки собирают в емкость для сырых сливок 9, затем разливают в чистую тару и отправляют в низкотемпературную камеру (4±2°С) для охлаждения и хранения, а обезжиренное молозиво при температуре 34-35°С направляют на следующий этап обработки - получение сыворотки, для чего обезжиренное молозиво перекачивают в емкость 8, в которой проводят сквашивание путем внесения сычужного фермента, например, из расчета 0,5-1,5 мл на 1 кг молозива. После получения плотного сгустка отделяют сыворотку молозива, которую направляют на следующий этап обработки - мембранную очистку от патогенной микрофлоры, а творог, содержащий казеиновую фракцию, может быть использован в виде конечного продукта или направлен на дальнейшую переработку, например, для получения сыра.
Для очистки сыворотки молозива от патогенной микрофлоры используют блок микрофильтрации 10. После блока 10 получают бактериологически чистый фильтрат (пермеат), который направляют на следующий этап обработки, и концентрат (ретентат), который направляют на утилизацию. Работа блока микрофильтрации 10, как правило, основана на использовании тангенциальной фильтрации. Микрофильтрация с использованием мембран 800 нм обеспечивает удаление из сыворотки до 98,5% патогенной микрофлоры, а также остатков казеиновой пыли. При этом использование мембран 800 нм не влияет на концентрацию лактоферрина, иммуноглобулинов, лактозы и других растворимых компонентов сыворотки молозива. Пермеат (фильтрат) блока микрофильтрации с мембранами 800 нм направляют в емкость 11.
На следующем этапе проводят разделение состава, полученного на выходе из блока 10, на состав, содержащий предпочтительно лактоферрин и иммуноглобулин G, и состав, содержащий предпочтительно иммуноглобулины А и М и лактозу, для чего используют блок микрофильтрации 12, выполненный преимущественно на базе керамических мембран с размером пор 100 нм. Пермеат (фильтрат) из блока микрофильтрации 12, содержащий лактоферрин и иммуноглобулин G, направляют в емкость 13. Следует отметить, что концентрация лактоферрина и иммуноглобулина G в пермеате составляет 60-80% от содержания в нормализованном молозиве. Иммуноглобулины А, М, Е не проходят через поры мембраны 100 нм и остаются в ретентате (концентрате).
На следующем этапе из ретентата (концентрата), полученного после блока 12, удаляют лактозу, минеральные соли, и оставшиеся бактерии, для чего используют блок диафильтрации (или ультрафильтрации) 14, выполненный преимущественно на базе керамических мембран с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа. Процесс диафильтрации ведут с добавлением деминерализованной воды, которую подают в блок 14 из емкости 6, предпочтительно в соотношении Ретентат из блока 12:Вода = 1:5,0÷30,0. После прохождения через блок диафильтрации 14 пермеат (фильтрат), содержащий лактозу и минеральные соли, направляют на утилизацию, а ретентат, содержащий иммуноглобулины A, М, G и E, лактоферрин и минорные белки, направляют в емкость 15, которая в одном из вариантов осуществления изобретения дополнительно снабжена ультрафиолетовыми лампами 20, электромагнитной мешалкой 21 с нижним приводом 22, как показано на фиг. 2, для обработки ультрафиолетовым излучением в течение 1-10 часов в зависимости от микробиологического качества исходного молозива. Благодаря данной обработке достигается полная элиминации патогенной флоры.
Готовый продукт получают путем смешивания в емкости 17 пермеата, полученного на выходе из блока микрофильтрации 12 (из емкости 13) и облученного ультрафиолетом ретентата, полученного на выходе из блока диафильтрации 14 (из емкости 15). Соотношение пермеата и ретентата выдерживают в соответствии с соотношением пермеата и ретентата при работе блока микрофильтрации 12, например, при соотношении пермеата и ретентата в блоке микрофильтрации 12 1:1, для получения готового продукта необходимо смешать пермеат блока микрофильтрации 12 и облученный ультрафиолетом ретентат также в соотношении 1:1.
Готовый продукт представляет собой белковую композицию, следующего состава (на 100 мл или 100 см3): общий белок - не менее 4,0 масс.%, иммуноглобулины A, М, G и E - не менее 2,0 г/100 см3, лактоферрин - не менее 1,0 мг/см3, аминокислоты не менее 4,5 г/100г, лактоза - не более 1,5 масс.%, минеральные соли - не более 0,5 масс.%, казеин - не более 0,1 масс.%. В зависимости от состава исходного молозива, кратности разбавления молозива водой, коэффициента разбавления при диафильтрации, соотношения пермеата, прошедшего через мембрану 100 нм, и ретентата, прошедшего через мембрану с отсечкой 5 кДа, готовый продукт (белковая композиция) предпочтительно имеет следующий состав: общий белок - 4,0-6,0 масс.%, иммуноглобулины A, М, G, и E - 2,0-3,5 масс.%, лактоферрин - 1,0-4,0 г/л, лактоза - 0,1-1,0 масс.%, минеральные соли - 0,02-0,3%, казеин - не более 0,1 масс.%.
Получаемая белковая композиция представляет собой раствор, который может выступать в качестве конечного продукта (может быть расфасован в емкости объемом 50-500 мл для поставки потребителю), либо подвергнут дальнейшему концентрированию и/или лиофильной сушке. Таким образом, из белковой композиции может быть получен конечный продукт в жидкой, твердой, пастообразной или микроинкапсулированной форме, в т.ч. в липосомальной форме.
В одном из вариантов осуществления изобретения для получения конечного продукта в таблетированной форме, получаемый в емкости 17 раствор концентрируют, например, в 10 раз, после чего полученный концентрат смешивают с сахаром (глюкозой) и на этой основе формируют связывающий сироп, который затем смешивают с сухим молоком (в отдельном узле смешения или в емкости 17). Далее смесь подают на гранулятор с подпрессовыванием (на чертеже не показано) и при температурах, не превышающих 42 градуса, производят перемешивание компонентов, после чего смесь подают на устройство прессования таблетки и упаковку - в автомат фасовки 18.
Для повышения эффекта от использования композиции лиофилизат может быть размещен в капсуле, обеспечивающей ее растворение и высвобождение активных компонентов в тонком кишечнике. Кроме того, раствор, или концентрат, или лиофилизат может быть использован в качестве добавки к другим продуктам/препаратам с целью иммунной коррекции человеческого организма, получения комплексного препарата питания для улучшения антивирусной терапии человека, и т.д.
Кроме того, в одном из вариантов использования получаемый продукт может быть выполнен в форме для ректального введения, например, в виде микроклизм или свечей. Например, для получения микроклизм жидкую фазу смешивают в определенных пропорциях с мелкодисперсным гипоаллергенным диоксидом кремния с получением водорастворимого геля.
Количество смешиваемых компонентов на выходе из емкостей 13 и 15 может варьироваться в зависимости от назначения конечного продукта.
Получаемый состав с содержанием иммуноглобулинов в комбинации с лактоферрином может быть использован для создания гипоаллергенного продукта для профилактического диетического питания, а также для получения биологически активных добавок и фармацевтических композиций для использования в рамках комплексной терапии, в том числе и для борьбы с коронавирусом (Serrano G, Kochergina I, Albors A, Diaz E, Oroval M, Hueso G, et al. Liposomal Lactoferrin as Potential Preventative and Cure for COVID-19. Int J Res Health Sci. 2020; 8(1): 8-15.E-ISSN: 2321-7251). При этом следует отметить, что именно белковая композиция заявляемого состава показала свою противовирусную активность в отношении РНК-вируса, в частности, в отношении SARS-CoV-2.
Примеры конкретной реализации изобретения.
Исходное молозиво (см. Таблицу 1, представленную в Приложении) в количестве 100 л смешивали с деминерализованной водой в пропорции 1:1, нагревали до температуры 34°С и сепарировали с использованием сепаратора-сливкоотделителя «Омь». В полученное обезжиренное нормализованное молозиво вносили 68 мл сычужного фермента и выдерживали 30 мин. Образовавшийся сгусток казеина отделяли от сыворотки с использованием рукавных фильтров. Полученную сыворотку перерабатывали в блоке микрофильтрации с мембраной 800 нм. В результате было получено 150 л очищенной сыворотки (пермеат микрофильтрации), которая была направлена на переработку в блок микрофильтрации с мембраной 100 нм, на выходе из которого было получено 50 л пермеата и 100 л ретентата, т.е. соотношение пермеата и ретентата на этой стадии составило 1 к 2. Ретентат, прошедший через мембрану 100 нм, был направлен в блок диафильтрации на мембране с отсечкой по молекулярной массе 5 кДа, на которой был очищен от лактозы и минеральных солей. Коэффициент разбавления при диафильтрации (соотношение ретентата 100 нм и деминерализованной воды) был равен 30. Содержание лактозы в ретентате после диафильтрации составило менее 0,05%. Далее ретентат после диафильтрации был обработан ультрафиолетовым излучением в течение 8,5 часов в емкости с рабочим объемом 100 л, оборудованной мешалкой с нижним приводом и пятью ультрафиолетовыми лампами мощностью 45 Вт каждая. Готовый продукт получали смешиванием пермеата, полученного после микрофильтрации на мембране 100 нм, и ретентата, полученного после диафильтрации с отсечкой 5 кДа, облученного ультрафиолетом, в пропорции 1 к 2 соответственно. В результате всех технологических операций было получено 150 литров готового продукта, который имел основной состав, представленный Таблице 1 (см. Пример 1). Молекулярный вес полученной белковой композиции (измеренный с помощью метода капиллярного электрофореза) характеризовался следующим распределением, масс.%: менее 1,5 кДа - 0,001±5%; 1,5-3,5 кДа - 4,87±5%; 3,5-6,0 кДа - 0,01±5%; более 6,0 кДа - 93,94±5%. Продукт характеризовался массовой долей влаги 93,61%. Помимо основных компонентов, указанных в Примере 1, белковая композиция может содержать также другие компоненты в незначительных количествах, которые существенно не изменяют ее свойства, например, β-лактоглобулин (менее 0,01 мг/100см3), α-лактоальбумин (менее 1,5 мг/100см3), альбумин сыворотки крови (БСА) (менее 0,7 мг/100см3), цитокины (менее 0,5 мг/100см3), витамин А (менее 13,0 мкг/100 см3) и др. Фактические потери (в кг) иммуноглобулина и лактоферрина происходят на этапах сепарации с высокожирными сливками и осаждения казеина с сывороткой, которую содержит казеиновый сгусток. Эти потери составляют не более 25-30%. При этом количество готовой белковой композиции в результате переработки молозива получается примерно в 1,5 р. больше, чем было молозива за счет разбавления (нормализации) водой.
Лиофилизат, представленный в Примере 2 (см. Таблицу 1) готовили следующим образом. Три литра готового продукта замораживали в специальных поддонах лиофильной сушилки TOPT-18SC и охлаждали до температуры -40°С. После охлаждения сушили в вакууме (остаточное давление 14-18 Па) постепенно повышая температуру: при -40°С в течение 10 часов, -30°С в течение 5 часов, -10°С в течение 2 часов, +10°С в течение 3 часов и при +30°С в течение 6 часов. В результате сушки получали 212,8 г сухого продукта.
Результаты микробиологических исследований исходного молозива, полупродуктов и готовой продукции, полученных по изобретению, представлены в Таблице 2.
Таблица 2
| Наименование пробы | БГКП (1 сут.) (Бактерии группы кишечной палочки) |
КМАФАнМ (3 сут.) (количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов или общая бактериальная обсемененность) |
| КОЕ/мл | КОЕ/мл | |
| Норма БАД | 0,1 | 1*104 |
| Молозиво исходное | Обнаружено в 0,00001 мл | Более 1*106 |
| Смесь нормализованная обезжиренная | Обнаружено в 0,00001 мл | Более 1*106 |
| Сыворотка молозива | Обнаружено в 0,00001 мл | Более 1*106 |
| Фильтрат 800 нм | Обнаружено в 0,01 мл | 2*105 |
| Фильтрат 100 нм | Не обнаружено в 1 мл | Менее 1*101 |
| Ретентат 5 кДа, обработанный ультрафиолетом | Не обнаружено в 1 мл | Менее 1*101 |
| Готовый продукт (смесь фильтрата 100 нм и ретентата 5 кДа) | Не обнаружено в 1 мл | Менее 1*101 |
Таким образом, белковая композиция, полученная заявляемым способом, характеризуется отсутствием БГКП и минимальным значением концентрации КМАФАнМ.
Кроме того, было проведено исследование влияния заявляемой белковой композиции (препарат) на иммунную систему пациентов, инфицированных SARS-Cov-2 в динамике заболевания. Для исследования иммуномодулирующего действия препарата было сформировано 2 группы: основная - пациенты, инфицированные SARSCov-2, получавшие препарат в динамике заболевания (1 проба - 16 человек, вторая -15) и группа сравнения - пациенты, инфицированные SARS-Cov-2, не получавшие препарат (1 проба - 9 человек, вторая - 5).
Анализ гематологических параметров проводили с использованием автоматического анализатора ВС-5380 (Mindray). Иммунофенотипирование основных субпопуляций лимфоцитов осуществляли на цитофлюориметре FacsCanto II (BD, США) с использованием BD Multitest™ (CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC; CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC) (BD Biosciences, США) и CD3-FITC/HLA-DR-PE (IO Test, Immunotech, Франция). Для оценки внутриклеточного киллинга (бактерицидной активности лейкоцитов) и поглотительной активности нейтрофилов и моноцитов использовали методы, разработанные в лаборатории клинической иммунологии Института иммунологии Минздрава РФ (Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии. Иммунология. 2000. № 2. С. 57-59; Мазуров Д.В., Хамидуллина К.Ф., Пинегин Б.В. Оценка поглощения бактерий гранулоцитами и моноцитами периферической крови методом проточной цитометрии. Иммунология. 2000. №1. С.57-61). Для оценки НАДФ-Н2-оксидазной системы нейтрофилов использовали спонтанный и стимулированный НСТ-тест (Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические перспективы изучения фагоцитоза. Казан, мед. журнал. 1993. №3. С. 193-196). Концентрации сывороточных иммуноглобулинов IgE, IgG, IgM, IgA в сыворотке крови определяли методом иммунотурбидиметрии на анализаторе AU-680 (Beckman Coulter). Для оценки содержания циркулирующих иммунных комплексов использовали метод иммунопреципитации в 4% растворе полиэтиленгликоля 6000 с последующей фотометрией на спектрофотометре СФ-2000 (Гриневич Ю.А., Алферов А.Н. Определение иммунных комплексов в крови онкологических больных. Лаб. Дело. 1981. №8. С. 493-496). Статистическую обработку материала проводили с использованием ППП Statistica 6.0 (StatSoft Inc.).
У пациентов основной группы, принимавших препарат, во второй пробе по сравнению с первым обследованием значимо увеличивалось содержание лимфоцитов (1,92 против 1,51*109/л), моноцитов (0,453 против 0,298*109/л), эозинофилов (0,120 против 0,030*109/л). Из лимфоцитарных субпопуляций значимо увеличилось в динамике абсолютное содержание Т-лимфоцитов CD3+ (1,412 против 1,015*109/л), цитотоксических Т-лимфоцитов CD3+CD8+ (0,462 против 0,358*109/л), активированных Т-клеток CD3+HLA- DR+ (0,213 против 0,172*109/л) и Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD16+CD56+ (0,122 против 0,098*109/л). В динамике наблюдения происходило снижение содержания общих иммуноглобулинов класса IgG (10,80 против 11,10 г/л), увеличение процента НСТ-положительных нейтрофилов (9,00 против 6,50%) и поглотительной активности моноцитов (0,382 против 0,257*109/л).
В группе сравнения в динамике наблюдения (вторая-первая проба) зарегистрированы значимые различия только в относительном содержании лимфоцитов (36,60 против 29,40%) и относительном содержании эозинофилов (1,40 против 1,30%). При этом также зарегистрирована тенденция к увеличению абсолютного содержания Т-лимфоцитов CD3+.
Основная группа и группа сравнения на старте исследования отличались содержанием моноцитов (0,298 против 0,416*109/л) и их поглотительной активностью (0,257 против 0,396*109/л), оба этих показателя были ниже в основной группе.
Вторая проба в сравниваемых группах (основная и группа сравнения) отличалась содержанием цитотоксических Т-лимфоцитов CD3+CD8+ (0,462 против 0,652*109/л) и Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD16+CD56+ (0,122 против 0,221*109/л).
Таким образом, в результате исследования было показано, что заявляемый препарат влияет на лейкоциты, повышая активность NK-клеток, нейтрофилов и макрофагов, повышает выработку цитокинов и оксида азота и ограничивает рост патогенных микроорганизмов, способствует созреванию иммунных клеток, например, Т- и В-лимфоцитов. Механизм действия включает не только способность компонентов белковой композиции, в частности, лактоферрина, связывать железо, но также взаимодействовать с молекулярными и клеточными компонентами как клеток-хозяев, так и патогенов. В частности, противовирусное действие заявляемой композиции опосредовано его конкуренцией за рецепторы клеточной мембраны, которые обычно используются вирусами для проникновения в клетки. Компоненты заявляемой композиции блокируют АПФ2 и предотвращают связывание шиповидного белка S вируса с клеткой-хозяином, предотвращая слияние вируса с клеточной мембраной.
Таким образом, проведенные исследования выявили наличие иммуномодулирующего эффекта препарата, в частности, регулирующего изменение численности субпопуляций Т-лимфоцитов, участвующих в противовирусном иммунном ответе.
Кроме того, были проведены исследования антибактериального действия двух образцов продукта (Образец 1, соответствующий Примеру 3, и Образец 2, соответствующий Примеру 2). Для исследования образцы готовили растворением 7г лиофилизатов в 100 мл воды. Исследование бактерицидного действия композиции проводилось в отношении ряда патогенных бактерий и грибов рода Candida с использованием автоматизированной системы контроля роста микроорганизмов в режиме реального времени. Для данного микробиологического исследования использовали следующие клинические изоляты микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Porphyromonas gingivalis, Candida albicans. При этом результаты исследований сравнивались с лактоферрином, выделенным из коровьего молока.
Первичный посев для выделения облигатных и факультативных анаэробов осуществляли на питательную среду М144 (Himedia, In.) с добавлением крови (для культивирования грамотрицательных анаэробных и грамположительных микроаэрофильных бактерий) и М1297А (Himedia, In.) для грибов рода Candida. Посевы помещали в термостат при 37°С на 48 часов (для анаэробных культур - в анаэростат на 7 суток). После получения и идентификации чистых культур, в экспериментальной части использовали биореактор «Реверс-Спиннер RTS-1» (BioSan, Латвия). Данная система предназначена для культивирования микроорганизмов и оценки их роста в режиме реального времени. Интерпретацию результатов проводили по изменению оптической плотности OD при длине волны λ=850 нм.
Оба образца препарата представляли собой лиофильно высушенную композицию в форме хлопьев, которую разводили в 10 мл той питательной среды, которая в дальнейшем использовалась для культивирования микроорганизмов. Для каждого эксперимента отдельно, в стерильных пробирках типа Eppendorff, готовили бактериальную взвесь в общем количестве 5 мл. Для осуществления культивирования, в каждую пробирку добавляли 18 мл питательной среды и вносили заранее подготовленную бактериальную взвесь в количестве 0,5 мл, из заранее подготовленной пробирки, а затем исследуемый раствор лактоферрина - 1,5 мл. Общий объем в каждой пробирке составил - 20 мл. Густота взвеси до начала эксперимента - 102 КОЕ/мл, что примерно соответствовало оптической плотности OD до 0,2.
Исследование динамики роста микроорганизмов проводили в двух параллелях, что отражалось на графиках кривых роста бактериальных популяций каждого вида в присутствии образцов исследуемого состава. В качестве контроля оценивали рост соответствующего вида бактерий, который характеризовался наступлением логарифмической фазы роста через 2-3 часа и достигал максимума с переходом в стационарную фазу роста через 12-18 часов от начала культивирования в зависимости от вида микроорганизма. Во всех случаях показатель стационарной фазы роста был достоверно выше (от 6,0 до 7,2 OD), чем при использовании исследуемых составов. Диаграммы, характеризующие максимум роста микроорганизмов изученных видов после достижения стационарной фазы представлены на фиг. 3.
При оценке кривых роста бактериальных популяций исследуемых видов микроорганизмов получены следующие данные (фиг. 4-8).
Кривая роста штамма - клинического изолята Staphylococcus aureus (фиг. 4) отличалась короткой лаг-фазой с переходом в фазу логарифмического роста на 3-ий час культивирования, причём переход к стационарной фазе происходил одинаково для сравниваемых видов образцов (9-12 часов). Максимум роста в случае использования образца 2 составил 1,0 OD, в то время как образца 1-3,5 OD, что соответственно было в 6 и 1,7 раз меньше, чем в контроле.
Кривая роста штамма - клинического изолята Streptococcus sanguis (фиг. 5) характеризовалась более продолжительной лаг-фазой с медленным переходом в фазу логарифмического роста через 18-24 час культивирования, причём переход к стационарной фазе происходил примерно одинаково для сравниваемых видов образцов (42-45 час). Максимум роста в случае использования Образца 2 составил 2,0 OD, в то время как Образца 1-3,5 OD, что соответственно было в 4,5 и 2 раза меньше, чем в контроле.
Кривая роста штамма - клинического изолята Streptococcus salivarius (фиг. 6) также характеризовалась продолжительной лаг-фазой, но с более резким, чем у Streptococcus sanguis переходом в фазу логарифмического роста через 18-21 час культивирования, причём переход к стационарной фазе происходил примерно одинаково для сравниваемых образцов (48-51 час). Максимум роста в случае использования Образца 2 составил 2,0 OD, в то время как Образца 1-3,3 OD, что соответственно было в 3,5 и 2,1 раза меньше, чем в контроле.
Кривая роста штамма - клинического изолята Porphyromonas gingivalis (фиг. 7) характеризовалась медленным увеличением накопления биомассы в течение 27 часов, одинаково для сравниваемых образцов, а затем резким переходом в фазу логарифмического роста с двумя явными скачками - на 27-30 час и 36-42 час. Максимум роста с переходом в стационарную фазу отмечен через 48 час культивирования, причём одинаково для сравниваемых образцов. Максимум роста в случае использования Образца 2 составил 2,9 OD, в то время как Образца 1-3,3 OD, что соответственно было в 2,5 и 2,2 раза меньше, чем в контроле.
Кривая роста штамма - клинического изолята Candida albicans (фиг. 8) отличалась короткой лаг-фазой с переходом в фазу логарифмического роста на 3-ий час культивирования, причём переход к стационарной фазе происходил одинаково для сравниваемых образцов заявляемого состава (12 часов). Максимум роста в случае использования Образца 2 составил 2,5 OD, в то время как Образца 1-3,5 OD, что соответственно было в 2,4 и 1,7 раз меньше, чем в контроле.
Таким образом, заявляемая композиция вызывает существенное снижение роста бактериальных популяций и грибов рода Candida.
Следует отметить, что при проведении исследований свойств белковой композиции в группу исследуемых образцов были включены композиции, полученные способами, отличающимися от разработанного способа выполнением этапов микрофильтрации и диафильтрации, которые не обеспечивали заявляемый технический результат.
Таблица 1
| Компонент | Количественное содержание компонентов | НД на методы | ||||
| Согласно изобретению (на 100 см3) |
Исходное молозиво (на 100 см3) |
Заявляемая композиция, получаемая из исходного молозива Пример 1 (раствор на 100 см3) | Заявляемая композиция, получаемая из исходного молозива Пример 2 (лиофилизат) (масс.% в пересчете на сухую массу) |
Аналог (Биотарис*) Пример 3, лиофилизат (негативный пример) масс.% |
||
| Общий белок, масс.%, в т.ч. | не менее 4,0 | 12,8 | 4,4 | 62,8 | 66,2 | ГОСТ3648.2-99 |
| Иммуноглобулины, г/100 см3 в том числе: |
не менее 2,0 | 4,3 | 2,1 | 30,43 | 23,4 | ИФА, диск-электрофореза |
| Иммуноглобулин A | не менее 0,1 | 0,3 | 0,15 | 2,14 | - | |
| Иммуноглобулин М | не менее 0,1 | 0,3 | 0,13 | 1,8 | - | |
| Иммуноглобулин G | не менее 1,6 | 3,6 | 1,8 | 26,0 | 23,4 | |
| Иммуноглобулин E | не менее 0,02 | 0,1 | 0,02 | 0,2 | - | |
| Лактоферрин, г/100см3 | не менее 0,1 | 0,28 | 0,17 | 2,4 | - | ВЭЖХ |
| Казеин, масс.% | не более 0,1 | 4,1 | 0,01 | 0,13 | - | ВЭЖХ |
| Жиры, масс.% | не более 0,1 | 6,0 | 0,05 | 0,72 | 1,1 | ГОСТ 5867-90 |
| Лактоза, масс.% | не более 1,0 | 3,8 | 0,5 | 6,84 | 20,3 | ГОСТ 34304-2017 |
| Аминокислоты, г/100 г, в т.ч. | не менее 4,5 | Аспаргиновая кислота - 0,61 Глутаминовая кислота - 1,73 Серин - 0,61 Глицин - 0,26 Гистидин - 0,22 Аргинин - 0,33 Треонин - 0,38 Аланин - 0,23 Пролин - 1,0 Тирозин - 0,53 Валин - 0,55 Метионин - 0,24 Цистеин - 0,08 Изолейцин - 0,69 Лейцин - 0,54 Фемилаланин - 0,53 Лизин - 0,12 Триптофан - 0,55 |
Аспаргиновая кислота - 0,25 Глутаминовая кислота - 1,72 Серин - 0,24 Глицин - 0,11 Гистидин - 0,09 Аргинин - 0,14 Треонин - 0,15 Аланин - 0,09 Пролин - 0,43 Тирозин - 0,22 Валин - 0,22 Метионин - 0,10 Цистеин - 0,03 Изолейцин - 0,29 Лейцин - 0,22 Фемилаланин - 0,21 Лизин - 0,05 Триптофан - 0,23 |
Аспаргиновая кислота - 3,42 Глутаминовая кислота - 23,5 Серин - 3,2 Глицин - 1,5 Гистидин - 1,2 Аргинин - 1,9 Треонин - 2,0 Аланин - 1,2 Пролин - 5,8 Тирозин - 3,1 Валин - 3,1 Метионин - 1,3 Цистеин - 0,4 Изолейцин - 3,9 Лейцин - 3,1 Фемилаланин - 2,8 Лизин - 0,7 Триптофан - 3,2 |
31,26 | МВИ МН 1363-2000 |
| Минеральные соли (масс.%):, в т.ч. Кальций Фосфор Магний Натрий Калий Хлор |
не более 0,5 | 0,87, в т.ч.: | 0,1 | 1,36 | 3,25 | |
| Вода | остальное | остальное | остальное | - | - | |
| Кислотность | 60°Т | 16°Т (6,75-6,72 pH) | - | |||
| Микробиологические показатели: | ||||||
| КМАФнМ, КОЕ/г, | не более 1х101 | 4,3х104 | 8 | - | 1х102 | |
| БГКП (колиформы) в 1,0 г | - | обнаружено в 0,001 г | не обнаружено | не обнаружено | не обнаружено |
*Препарат Биотарис: https://russian.alibaba.com/product-detail/large-supply-of-organic-bovine-liquid-colostrum-extract-30-igg-from-leading-dealer-50045778366.html?spm=a2700.md_ru_RU.maylikehoz.1.487f38e3FgqLN1
1. Способ получения белковой композиции из молозива, обогащенной иммуноглобулинами и лактоферрином, включающий обезжиривание молозива, осаждение казеиновой фракции с получением сыворотки, удалением из нее патогенной микрофлоры посредством первой микрофильтрации и получением пермеата П1, который подвергают второй микрофильтрации с получением пермеата П2, обогащенного лактоферрином, и ретентата Р2, обогащенного иммуноглобулинами, отличающийся тем, что ретентат Р2, полученный после микрофильтрации, обогащенный иммуноглобулинами, подвергают диафильтрации с использованием мембраны, обеспечивающей разделение ретентата Р2 на пермеат П3, содержащий предпочтительно лактозу и минеральные соли, и ретентат Р3, содержащий предпочтительно иммуноглобулины, при этом обезжиривание молозива, осаждение казеиновой фракции, удаление из сыворотки патогенной микрофлоры, микрофильтрацию и диафильтрацию или ультрафильтрацию проводят при температуре, ниже температуры денатурации лактоферрина и иммуноглобулинов; для удаления остаточной микрофлоры ретентат Р3 подвергают ультрафиолетовой обработке, при этом ретентат в процессе обработки перемешивают; полученные ретентат Р3 и пермеат П2 смешивают с получением белковой композиции, обогащенной лактоферрином и иммуноглобулинами.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что осаждение казеиновой фракции проводят с использованием сычужного фермента.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что первую микрофильтрацию проводят с использованием керамической мембраны 800 нм, вторую – с использованием керамической мембраны 100 нм, диафильтрацию – с использованием мембраны с отсечкой 5кДа.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что обезжиривание молозива осуществляют при температуре 30-40°С.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что микрофильтрацию и диафильтрацию проводят при температуре 10-12°С.
