Сверхпрочная ультратонкая коллагеновая мембрана и способ ее получения

Группа изобретений относится к области тканевой инженерии, в частности к коллагеновым мембранам, используемым в качестве ксеноимплантатов и раскрывает коллагеновую мембрану из биоткани кальмара и способ ее получения. Коллагеновая мембрана из биоткани кальмара вида Dosidicus Gigas семейства Ommastrephinae обладает с прочностью на разрыв 150-250 МПа, относительном удлинении при разрыве не менее 20%, толщиной от 20 до 100 мкм, с отклонением по толщине от среднего значения не более 5%, с содержанием коллагена не менее 98% в пересчете на абсолютно сухое вещество. Способ получения включает разделку туши кальмара на отдельные анатомические части механическим способом, с отделением покровной соединительной биоткани мантии, которая последовательно выдерживается в растворе нейтральной соли, в слабощелочном растворе, содержащем липолитический и протеолитический ферменты, после чего промывается водой, раствором кислоты с высокой ионной силой, затем щелочным раствором, дистиллированной водой и высушивается. Коллагеновая мембрана обладает биосовместимостью, резорбируемостью в физиологических условиях, может использоваться как ксеноимплантат, в инженерии тканей, выращивании культуры клеток и косметических манипуляциях, практически без ограничений. 1 пр.

 

Настоящее изобретение относится к коллагеновым мембранам, используемым в качестве ксеноимплантатов, матрицы в тканевой инженерии, при выращивании культуры клеток, а также основы масок для косметических манипуляций.

Традиционно коллагеновые мембраны получают из кожи и других соединительнотканных структур (например, перикарда) наземных животных, чаще всего крупного рогатого скота и свиней.

Несмотря на достаточно широкое применение этих мембран, оказалось, что они могут содержать патогенные вирусы, и в том числе смертельный для человека, вирус губчатой энцефалопатии. Кроме того, для значительных групп населения использование ксеноимплантатов от определенного вида животных не представляется возможным из-за религиозных и этических соображений.

В связи с этим все больший интерес и значимость приобретают коллагеновые мембраны, получаемые на основе соединительно-тканных структур морских гидробионтов. Более чистая в экологическом отношении среда обитания морских организмов в значительной степени гарантирует отсутствие в них патологических факторов, представляющих опасность для человека.

В качестве источника для получения коллагеновых мембран обычно используется кожа рыб.

Для получения коллагеновой мембраны из кожи рыб исходный объект подвергается специальной обработке для разрушения и удаления посторонних клеточных структур, а также липидов, глобулярных белков, нуклеиновых кислот и других неколлагеновых компонентов.

Получаемая в результате мембрана обычно представляет собой коллагеновую пленку, толщиной порядка 0,2-0,4 миллиметра, обладающую биосовместимостью и резорбируемостью в физиологических условиях - факторов, определяющих успешность их применения.

Однако, не менее важными характеристиками коллагеновой мембраны, помимо биосовместимости и резорбируемости, является ее механическая прочность и пластичность.

Механическая прочность, характеризуемая как величина предельного напряжения разрушения в условиях линейной деформации, для большинства известных коллагеновых мембран находится в интервале от 5 до 15 МРа, а пластичность, оцениваемая как относительное удлинение при разрыве, на уровне 7-9%.

Несмотря на то, что коллагеновые мембраны с такими характеристиками могут использоваться в практике, достаточно актуальной задачей является получение более прочных и одновременно пластичных коллагеновых мембран, поскольку высокие значения этих показателей позволяют расширить сферу применения и снижают риск механического разрушения мембран, особенно при хирургических вмешательствах и косметических манипуляциях.

К сожалению решить эту задачу при использовании кожи рыб до последнего времени не удавалось.

В связи с этим было предложено в качестве исходного сырья для получения коллагеновой мембраны использовать не кожу, а чешую рыб.

Известен способ получения высокопрочной коллагеновой мембраны, предложенный Tanaka, et. al. "High-strength collagen fiber membrane and manufacturing method thereof" (US Patent N 9,315,562, Apr. 19, 2016.).

Способ предполагает использование в качестве коллагенсодержащего сырья чешуи рыб в основном вида Tilapia семейства Cichlidae.

В основе способа лежит экстракция коллагена, с последующим его выделением в виде гидратированного фибриллярного геля, высушиваемого между двумя слоями влагонепроницаемого материала, при котором испарение растворителя происходит только с открытых боковых поверхностей.

Несмотря на то, что получаемая в результате коллагеновая мембрана обладает прочностью на разрыв порядка 30 МРа, сама мембрана, как и способ ее получения, имеют ряд существенных недостатков.

Прежде всего, прочность, получаемой согласно изложенному способу мембраны, не принципиально превышает прочность известных аналогов, а ее пластичность, определяемая как величина максимального удлинения при разрыве, составляет не более 8%.

Кроме того, мембрана неоднородна по толщине. При этом разница в толщине одного и того же образца может достигать 30%, считая от среднего значения этого показателя. Это приводит к непредсказуемости топологии ее разрыва, особенно при фиксации мембраны с помощью хирургических нитей. Кроме того, разнотолщинность обуславливает существенные различия в скорости рассасывания отдельных участков мембраны, что представляет определенную проблему в случае ее использования в качестве резорбируемого ксеноимплантата.

К недостатками способа можно отнести:

- необходимость деминерализации для удаления из чешуи содержащихся в ней минеральных веществ

- использование экстракционной схемы выделения коллагена из деминерализованного сырья, что значительно увеличивает длительность процесса, требует больших количеств высокоочищенных реагентов и воды, а также применения многократного центрифугирования или фильтрации;

- формирование мембраны путем сушки коллагенового геля между двумя слоями стекла или полимерного материала, что представляет собой длительную и практически не масштабируемую процедуру, и делает крайне сложным использование способа.

Целью настоящего изобретения является коллагеновая мембрана из морских гидробионтов, представляющая собой пленку практически одинаковой толщины, большей прочности и пластичности, а также способ ее получения, лишенные вышеприведенных недостатков.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве исходного сырья используется покровная биоткань мантии головоногих моллюсков, точнее кальмаров, конкретно -кальмара вида Dosidicus Gigas семейства Ommastrephinae.

Кальмар Dosidicus Gigas - это многочисленный вид десятируких кальмаров, биомасса которого, по существующим оценкам, составляет примерно 10 млн. тонн, а объем вылова только в районах Тихого океана колеблется от 300 до 700 тыс. тонн в год.

Основная масса дозидикуса перерабатывается с целью отделения мантии - наиболее ценного в пищевом отношении компонента кальмара. При этом, уже на начальных стадиях биоткани покрывающие мантию, отделяются и практически не используются.

К последним относится слой соединительной ткани, непосредственно примыкающий к мантии и представляющий собой особую биоткань, состоящую из коллагеновых волокон. Эта коллагеновая биоткань (в определенной степени функционально аналогичная фасции) достаточно легко механически отделяется, и может быть получена в виде гидратированной прочной пленки миллиметровой толщины, и площадью порядка нескольких тысяч квадратных сантиметров, в зависимости от размера особи кальмара.

Основным компонентом биоткани является коллаген, при незначительном содержании липидов, углеводов и минеральных веществ.

После очистки биоткани от неколлагеновых компонентов может быть получена тонкая прочная мембрана, геометрические размеры которой близки исходному фрагменту.

Для этого отделенная механическим способом биоткань обрабатывается в течение 3-10 часов водным раствором нейтральной соли с ионной силой 0,2-0,5 М, например, хлористого натрия.

При такой обработке биоткань практически не увеличивается в объеме, существенного изменения ее структуры не происходит, в то же время часть глобулярных белков, пептидов, нуклеиновых кислот и нуклеотидов, а также низко- и высокомолекулярных углеводов переходит в солевой раствор.

При использовании солевых растворов с концентрацией ниже 0,2 М наблюдается заметное набуханию биоткани с определенным изменением ее нативной структуры, а при концентрациях выше 0,5 М - промотируется агрегация коллагеновых фибрилл, с существенным ростом жесткости биоткани, негативно сказывающимся на полноте экстракции неколлагеновых компонентов.

Уменьшении времени обработки ниже указанного предела снижает степень извлечения неколлагеновых компонентов, а его увеличение - не сопровождается ее существенным ростом.

После обработки биоткань извлекается из солевого раствора и помещается в 5-10 кратный избыток слабощелочного водного раствора с рН 8-10, содержащий липазу и протеазу, в котором выдерживается в течение 3-4 часов при температуре 10-25 град. Цельсия, при постоянном контроле и поддержании рН на исходном уровне. В процессе обработки происходит гидролиз липидов и неколлагеновых белков, и переход продуктов гидролиза в раствор.

В качестве липазы предпочтительно использовать щелочную липазу, например LIPOPAN F, липазин, флюозим ГЗХ, а также нейтральную или щелочную протеазу, например ENZYM, ПРОК, суперлотан А.

Выбранный интервал рН близок к оптимальному с точки зрения активности ферментов. При этом снижение температуры обработки ниже 10 град.С увеличивает время гидролиза, а ее увеличение выше 25 град. С может приводить к изменению нативной структуры коллагена и частичной инактивации ферментов.

После завершения ферментативной обработки, биоткань промывается водой и обрабатывается в течение 30 мин 1 М раствором уксусной кислоты, содержащем 10% хлористого натрия, для инактивации ферментов, а затем 0,1 М раствором бикарбоната натрия для нейтрализации кислоты, и дистиллированной водой для очистки от солей и других низкомолекулярных соединений.

Полученная влажная очищенная биоткань извлекается из раствора, высушивается на воздухе или сублимацией.

По существу, она представляет собой воздушно-сухую коллагеновую пленку (мембрану), содержащую в пересчете на абсолютно-сухое вещество как минимум 98% коллагена, при практическом отсутствии липидов, а также низко- и высокомолекулярных углеводов.

Комплекс физико-механических свойств коллагеновой мембраны значительно превосходит свойства известных аналогов. Так предельное напряжение при разрыве достигает 250 МРа, при величине относительного удлинения более 20%.

Воздушно-сухая коллагеновая мембрана, имеет толщину от 20 до 100 мкм, при отклонении от среднего значения не более 5%.

Процесс получения коллагеновой мембраны, согласно предложенному способу, исключает стадии экстракции и осаждения коллагена, и характеризуется, в целом, простотой, небольшой продолжительностью, не требует использования дорогостоящих реагентов и сложного оборудования, и может быть легко масштабирован.

Ниже приведен конкретный пример, применения изобретения.

Кальмар Dosidicus Gigas разделывается на анатомические части, с отделением слоя соединительной биоткани, непосредственно примыкающего к мантии, который промывается водой.

100 г биоткани, размером около 950 кв. см, помещается в пятикратный избыток 0,5 М раствора хлористого натрия, в котором выдерживается в течение 8 часов, после чего извлекается из солевого раствора и промывается 2 литрами воды.

Промытая биоткань переносится в водный раствор бикарбоната натрия с рН 8, содержащем липазу Lipopan F и протеазу Enzym, в количествах, обеспечивающих липазную и протеазную активность в растворе на уровне 50 и 10 ME соответственно, выдерживается в нем в течение 4 часов при температуре 20°С, в режиме периодического перемешивания и рН-статирования, а затем извлекается из раствора и промывается 1 литром воды.

Промытая биоткань помещается в 1 М раствор уксусной кислот, содержащий 10% хлористого натрия, в котором выдерживается в течение 10 мин, и затем в 0,2 М раствор бикарбоната натрия для нейтрализации кислоты, и промывается дистиллированной водой до нейтрального рН среды.

Промытая биоткань высушивается на воздухе при температуре 40°С.

В результате получают коллагеновую мембрану, представляющая собой тонкий плоский полупрозрачный лист площадью 820 кв. см, толщиной 50 мкм, с разнотолщинностью в 1,5 мкм, с пределом прочности на разрыв 220 МРа, и относительном удлинении при разрыве 23%,содержащая 98% коллагена в пересчете на абсолютно сухое вещество.

Коллагеновая мембрана обладает биосовместимостью, резорбируемостью в физиологических условиях, характеризуется повышенными физико-механическими характеристиками, может использоваться как ксеноимплантат, в инженерии тканей, выращивании культуры клеток и косметических манипуляциях, практически без ограничений.

1. Коллагеновая мембрана из биоткани кальмара, с прочностью на разрыв 150-250 МПа, относительном удлинении при разрыве не менее 20%, толщиной от 20 до 100 мкм, с отклонением по толщине от среднего значения не более 5%, с содержанием коллагена не менее 98% в пересчете на абсолютно сухое вещество.

2. Коллагеновая мембрана по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве биоткани используется биоткань, покрывающая мантию кальмара.

3. Коллагеновая мембрана по п. 1, отличающаяся тем, что используется гигантский кальмар вида Dosidicus Gigas семейства Ommastrephinae.

4. Способ получения коллагеновой мембраны из кальмара по п. 1, заключающийся в том, что кальмар разделывается на отдельные анатомические части механическим способом, с отделением покровной соединительной биоткани мантии, которая последовательно выдерживается в растворе нейтральной соли, в слабощелочном растворе, содержащем липолитический и протеолитический ферменты, после чего промывается водой, раствором кислоты с высокой ионной силой, затем щелочным раствором, дистиллированной водой и высушивается.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве раствора нейтральной соли используется водный раствор хлористого натрия с ионной силой 0,2-0,5 М, а время выдерживания в нем составляет 3-10 часов.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что в качестве слабощелочного раствора используется водный раствор бикарбоната натрия с рН 8-9, содержащий липазу и протеазу, в количествах, обеспечивающих липазную и протеазную активность на уровне 50 и 10 ME соответственно.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что обработку слабощелочным раствором проводят в режиме рН-статирования в течение 3-4-часов при температуре 10-25°С.

8. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве раствора кислоты с высокой ионной силой используют 1 М раствор уксусной кислоты, содержащий 1-2 М хлористого натрия, а в качестве щелочного раствора - 0,1 М раствор бикарбоната натрия.

9. Способ по п. 4, отличающийся тем, что сушку проводят на воздухе при температуре не выше 40°С.