Использование аллельных вариантов генов pks15 и pe_pgrs54 в качестве маркера повышенной вирулентности mycobacterium tuberculosis в отношении людей с пониженным иммунитетом

Изобретение относится к области биотехнологии. В ходе работы было проведено полногеномное секвенирование ДНК изолятов М. tuberculosis из коллекции, анализ in silico полиморфизмов генов вирулентности, выявление корреляции между мутациями в генах вирулентности и иммунодефицитом пациента, в ходе которого были обнаружены мутации в генах pks15 и ре_pgrs54, являющиеся маркерными для изолятов, поражающих людей с иммунодефицитами различного генеза, а также разработаны праймеры для их детекции. Предлагаемый метод позволяет определить высокую патогенность микобактерий для людей со сниженным иммунитетом в режиме ПЦР, и, с минимальными адаптациями, ПЦР в реальном времени, мультилокусной ПЦР с последующим секвенированием, в том числе в системе MiSeq («Illumina», США) и GS Junior («Roche», Швейцария). 2 ил., 2 табл., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, фтизиатрии и медицинской микробиологии и может быть использовано для идентификации штаммов Mycobacterium, преимущественно поражающих людей с пониженным иммунитетом при работе с пациентами. Уровень техники

В последние годы в иммунном статусе населения произошли глобальные изменения, вызванные распространением сопровождающихся угнетением иммунитета заболеваний (ВИЧ, гепатит, сахарный диабет), увеличением стрессовой нагрузки и ухудшением экологической обстановки, а также старением населения и распространением вредных привычек [Boule LA, Kovacs EJ. 2017. Alcohol, aging, and innate immunity. J Leukoc Biol 102(1):41-55.]. В этих условиях туберкулез приобретает все большее распространение. По данным ВОЗ, носителями Mycobacterium tuberculosis являются более трети население Земли [WHO Global Tuberculosis Report 2018].

Вероятность манифестации заболевания зависит от ряда факторов, главными из которых являются иммунный статус хозяина и вирулентность возбудителя, являющаяся различной у разных линий [Coscolla М, Gagneux S. 2014. Consequences of genomic diversity in Mycobacterium tuberculosis. Semin Immunol 26:441-444.]. Определенную роль играет также их взаимное сочетание. Клинические проявления и эпидемиология ТБ определяются балансом между иммунной системой хозяина, системами вирулентности патогена и его адаптации. [Cobat A. et al. Host genomics and control of tuberculosis infection. Public Health Genomics. 2013; 16(1-2): 44-9]. Под вирулентностью подразумевают способность микроорганизма заражать организм-хозяина, преодолевая его защитные системы.

Вирулентность определяется целым рядом генов и может варьировать у различных линий М. tuberculosis. В их число входят гены, детерминирующие биосинтез миколовых кислот, трансляционные регуляторы WhiB, серин-треониновые протеинкиназы, гены, кодирующие системы секреции VII типа, гены систем токсин-антитоксин и т.д. Их продукты задействованы на различных стадиях инфекционного процесса и позволяют осуществлять колонизацию слизистой хозяина, внедряться в клетки, избегать ответа иммунной системы, переживать неблагоприятные условия и т.д. [Prozorov АА, Fedorova IA, Bekker OB, Danilenko VN. 2014 The virulence factors of Mycobacterium tuberculosis: genetic control, new conceptions. Genetika. 50 (8): 885-908; Forrellad MA, Klepp LI, A, Sabio у Garcia J, Morbidoni HR, de la Paz Santangelo M, Cataldi AA, Bigi F. 2013.Virulence factors of the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence 4(1):3-66. doi: 10.4161/viru.22329]. Одной из причин вариативности вирулентности является ряд мутаций в генах, кодирующих факторы вирулентности, поскольку мутации в данных генах могут приводить к изменению свойств белка, и, как следствие, к изменению профиля вирулентности. Таким образом, генетические вариации как патогена, так и хозяина, состояние иммунной системы хозяина, а также сочетание этих факторов могут оказывать влияние на предрасположенность и течение заболевания [Даниленко В.Н. Разработка технологической платформы для создания инновационных противотуберкулезных препаратов, активных в отношении штаммов с множественной лекарственной устойчивостью. Вестник РАН, 2019].

Этот факт позволяет сделать предположение о существовании линий, адаптированных к людям с пониженным иммунитетом [Mikheecheva NE, Zaychikova MV, Melerzanov AV, Danilenko VN. A nonsynonymous SNP catalog of Mycobacterium tuberculosis virulence genes and its use for detecting new potentially virulent sublineages. 2017.Genome Biol Evol9(4): 887-899. doi: 10.1093/gbe/evx053.].

В связи с этим важным является поиск новых мутаций в генах, задействованных в патогенезе - маркеров вирулентности и адаптации патогена к организму с определенным иммунным статусом.

При проведении подобных исследований была обнаружена связь между мутациями в гене pks15 (rv2947c) и усилением фенотипа патогенности, вирулентности и лекарственной устойчивости М. tuberculosis. [Constant Р, Perez Е, Malaga W, MA, Saurel O, M, et al. Role of the pks15/1 gene in the biosynthesis of phenolglycolipids in the Mycobacterium tuberculosis complex: Evidence that all strains synthesize glycosylated p-hydroxybenzoic methyl esters and that strains devoid of phenolglycolipids harbor a frameshift. J Biol Chem. 2002.]. Инсерция 7 нуклеотидов приводит к активации слитого белка Pks 15/1, ответственного за синтез фенольного гликолипида, ответственного за модуляцию иммунного ответа хозяина. Данная мутация ранее была обнаружена у высоковирулентных штаммов в Азии [Pang JM, Layre Е, Sweet L, Sherrid A, Moody DB, Ojha A, et al. The polyketide pksl contributes to biofilm formation in Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol. 2012; Zenteno-Cuevas R, Hernandez-Morales RJ, LM, R, Santiago- Garcia J. A rapid PCR assay to characterize the intact pks15/1 gene, a virulence marker in Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Methods. 2016. Vol. 121:33-35].

Еще одним семейством белков, вовлеченных в модуляцию иммунного ответа хозяина и выживание клеток патогена в макрофагах, являются белки Рре. Они участвуют в защите от окислительного стресса в лизосоме, индукции апоптоза, модулируют активность цитокинов [Li Y, Miltner Е, Wu М, Petrofsky М, Bermudez LE. А Mycobacterium avium РРЕ gene is associated with the ability of the bacterium to grow in macrophages and virulence in mice. Cell Microbiol. 2005; 7:539-48; Basu S, Pathak SK, Banerjee A, Pathak S, Bhattacharyya A, Yang Z, et al. Execution of macrophage apoptosis by PE_PGRS33 of Mycobacterium tuberculosis is mediated by Toll-like receptor 2-dependent release of tumor necrosis factor-alpha. J Biol Chem. 2007; 282:1039-50.]

Однако связь между штаммами с мутациями в указанных генах и иммунным статусом пациентов до настоящего времени не была известна. В данном изобретении осуществлен поиск подобной корреляции. Обнаруженные мутации могут быть использованы в будущем для создания диагностических наборов, предназначенных для определения потенциально более вирулентных линий М. tuberculosis, что является принципиально новым подходом в связи с отсутствием в настоящее время диагностикумов, дающих возможность детектировать высоковирулентные линии.

Раскрытие изобретения

Использованные подходы

Создание охарактеризованной коллекции геномов

В последние годы для эпидемиологических исследований, а также с целью изучения природы и механизмов формирования множественной и широкой лекарственной устойчивости широко используются подходы, основанные на биоинформатическом анализе однонуклеотидных полиморфизмов в секвенированных и охарактеризованных геномах М. tuberculosis различных линий и суб линий. Идентифицированы десятки тысяч полиморфизмов, чаще всего эволюционно ассоциированных с различными линиями и сублиниями [Coll F. et al. A robust SNP barcode for typing Mycobacterium tuberculosis complex strains. Nat Commun. 2014. 1; 5:4812; Merker M. et al. Evolutionary history and global spread of the Mycobacterium tuberculosis Beijing lineage. Nat Genet. 2015; 47(3):242-249]. Тем не менее, в подавляющем большинстве случаев данные исследования проводятся в отрыве от исследований состояния здоровья пациентов, и, несмотря на наличие в базах данных значительного числа секвенированных геномов, сопутствующие к ним данные часто отсутствуют, что делает бесполезным попытки анализа генома в привязке к клинической картине и характеру вызываемого процесса.

Принципиально новым элементом, предлагаемым авторами данного изобретения, является использование созданной в лаборатории коллекции геномов М. tuberculosis, охарактеризованных по источнику выделения (анамнезу пациентов). Коллекция включает 100 образцов, выделенных у пациентов с различным иммунным статусом и относящихся к распространенной в России эволюционно молодой линии Beijing-B0. Данные геномы были секвенированы и подвергнуты анализу однонуклеотидных замены в генах вирулентности. В ходе работы предполагается обнаружить связь мутаций в генах pks15 и рре24 вирулентностью возбудителя туберкулеза, а также иммунным статусом пациентов.

Секвенирование осуществлялось на платформе HiSeq2500 в режиме Rapid Run. еквенированные геномы были депонированы в международную базу данных GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA509547).

Поиск мутаций в генах pks15 и PE_PGRS54

Полученные прочтения выравнивали при помощи программы BWA-MEM [Li Н. and Durbin R. (2010) Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, Epub.] на референсный геном M. tuberculosis H37Rv (NC_000962.3). Для сбора метрики сборки использовали утилиту Picard, команда CollectWgsMetrics. Среднее покрытие составило 137,4.

Для выявления однонуклеотидных замен создвали multiple pileup (.mpileup файл) при помощи SAMtools [Li Н. Bioinformatics. 2011 Nov 1; 27(21):2987-93. Epub 2011 Sep 8.] команды mpileup с опциями (-В -f), затем определяли варианты программой VarScan 2.3.9 с опциями (--min-avgqual 30--min-var-freq 0.80 --p-value 0.01 --output-vcf 1). Всего было получено 3405 вариантных позиций, прошедших фильтр. Для дальнейшего анализа отбирали однонуклеотидные замены, не присутствующие во всех геномах (убирали замены, характерные для линии Beijing B0/W- 148). Для аннотации использовали скрипт vcf_annotate.pl, ранее разработанный сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН.

Поиск корреляции обнаруженных мутаций с иммунокомпрометирующим состоянием пациента-источника.

Для поиска молодых эпидемиологически опасных филогенетических сублиний в составе филогенетической линии Beijing-B0 древо было разделено на 7 гомогенных групп.

Для каждой группы было проведено исследование на предмет сопряженности/корреляции/ассоциации с иммунокомпрометирующим состоянием пациента-источника - как фактором риска и таргетным для создания диагностикума для детекции эпидемиологически-опасных линий в России. На Рисунке 1 представлено древо решений для поиска мутаций, ассоциированных с ИД пациента-источника и лекарственной устойчивостью.

Другим подходом для поиска мутаций в генах, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, являлся целевой поиск мутации/ий, непосредственно связанных с эпидемиологически опасными штаммами, ассоциированными с ИД пациента-источника. Для этого нами было применен схожий алгоритм поиска. На Рисунке 2 представлено древо решений для поиска мутаций, ассоциированных с ИД пациента-источника и лекарственной устойчивостью.

Разработка олигонуклеотидов для идентификации маркерных мутаций

Для идентификации данных мутаций in vitro был выбран стандартный метод ПЦР с последующим секвенированием ампликонов. Были разработаны олигонуклеотиды-праймеры к участкам генов, содержащим маркерные мутации, отвечающие основным требованиям (универсальность и высокая специфичность). Для выбора праймеров учтены требования к длине фрагмента ДНК в случае применения различных методик секвенирования.

Последовательности олигонуклеотидов представлены в приложении 1.

Осуществление изобретения

При выборе для генотипирования режима ПЦР амплификацию ДНК проводят с использованием набора High Fidelity PCR Enzyme Mix («Fermentas») на приборе «Терцик» («ДНК-технология»). Состав смеси для ПЦР (на 100 мкл): 10 мкл 10×ПЦР буфера (10Х High Fidelity PCR Buffer with 15 mM MgCl2), 10 мкл смеси 2 mM ΣdNTPs (либо 2 мкл 10 mM ΣdNTPs), 5 мкл DMSO, 0.3 мкг геномной ДНК и 1 мкл (1.25 u) фермента High Fidelity PCR Enzyme Mix-Параметры ПЦР реакции: 98°С в течение 30 сек. (лизис клеток и денатурация геномной ДНК); затем 30 циклов амплификации - 98°С - 10 сек (денатурация), 60°С в течение 10 сек. (отжиг олигонуклеотидов), 72°С - 30 сек. (достройка (элонгация) цепи); финальная элонгация фрагментов при 72°С - 10 мин., хранение при 40°С.

Амплифицированные фрагменты были выделены из агарозного геля с использованием набора JenGet Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, США).. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят аккуратно под масло 1/5 объема раствора 6Х DNA Loading Dye («Fermentas»), перемешивают и 10 мкл полученного образца вносят в лунки агарозного геля.. В качестве контроля размера полученного фрагмента используют ДНК маркер GeneRuler™ 50+п.н. («Fermentas»).

Оценка результатов

Пример 1

Формирование коллекции геномной ДНК M.tuberculosis, выделенных у пациентов с известным анамнезом.

Для анализа была сформирована коллекция геномной ДНК М. tuberculosis, выделенных у пациентов с известным анамнезом. В результате проведения полногеномного секвенирования 100 образцов ДНК, клинических изолятов М. tuberculosis на двух дорожках, были получены следующие результаты: Средний G/C состав равен ~65%, что соответствует среднему G/C составу М. tuberculosis - 65,6 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=H37Rv).

Расчет G/C состава проводился с использованием программы FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/proiects/fastqc/). Среднее покрытие на геном составило - Х193,5. Секвенированные геномы были депонированы в международную базу данных NCBI (BioProject: PRJNA509547).

Пример 2

Обнаружение у пациентов кластеров генов, ассоциированных с пониженным иммунитетом.

После разделения изолятов на 7 кластеров, было показано, что один из кластеров (№4), состоящий из 12-ти изолятов, имеет высокую ассоциацию с иммунокомпрометирующим состоянием пациента-источника=0,91 (Рисунок 1). Другие группы изолятов показали либо малую численность (кластер №1-2 изолята), либо низкую ассоциацию с ИД (кластеры 2, 3, 5, 6, 7).

В Таблице 1 приведена информация об ассоциации кластеров с иммунокомпрометацией.

Для данного кластера характерно наличие несинонимичной мутации в гене ре_pgrs54 - G>R (глицин>аргинин) в кодоне 1744.

Кроме того, при проведении анализа нами было обнаружено, что наиболее характерными для ИД пациентов является наличие мутации (инсерции) в гене поликетид синтазы pks15 (rv2947c), приводящая к активации слитого белка Pks15/1, ответственного за синтез иммуномодулирующих пептидов. Данная инсерция известна и описана как значимое полиморфное изменение гена, приводящее к усилению фенотипа патогенности и вирулентности, но ее связь с ИД пациентов показана впервые.

Пример 3

Идентификация маркерного полиморфизма методом ПЦР с последующим секвенированием.

Для проведения ПЦР были использованы олигонуклеотиды, представленные в Таблице 2.

В ходе секвенирования полученных фрагментов установлено, что из 100 изолятов 12 имеют несинонимичную мутацию в гене ре_pgrs54 в ко доне 1744. Указанные 12 изолятов выделены у пациентов с иммунодефицитом. У 16 пациентов детектирована инсерция GCCGCGGC. Из этого числа у семи изолятов присутствуют обе данные мутации, у 5-ти - только мутация в гене ре_pgrs54, у девяти - только инсерция в гене pks15.

Способ идентификации в составе линии Beijing-B0 Mycobacterium tuberculosis у пациентов с пониженным иммунитетом аллельных вариантов генов pks15 и ре_pgrs54, ранее не детектируемых и связанных с повышенной вирулетностью, характеризующийся тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора олигонуклеотидов

для pks15(rv2947c)

для pe_pgrs54 (rv3508)

причем ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера, затем выделяют целевые фрагменты из ПЦР-смеси или агарозного геля и секвенируют их с целью обнаружения соответствующих полиморфизмов; штамм высокопатогенен для пациентов с иммунодефицитом в случае обнаружения хотя бы одной из мутаций или их комплекса: G-C в кодоне 1744 гена ре_pgrs54 и инсерции GCCGCGGC в гене pks15.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области ветеринарии и пчеловодства, в частности к выявлению средств, обладающих вирусоцидным действием на вирус мешотчатого расплода пчел, и может использоваться в научно-исследовательских лабораториях, а также в производственных ветеринарных лабораториях.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для разработки новых диагностических препаратов позволяющих идентифицировать холерные штаммы O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor.

Изобретение относится к области микробиологии, а именно вирусологии. Раскрыт способ идентификации вирусов рода Arenavirus семейства Arenaviridae с помощью реакции гашения негативных колоний, включающий подготовку трехсуточного монослоя клеток Vero В в пластиковых флаконах; подготовку разведений исследуемых и контрольных проб аренавирусов; внесение в каждый из флаконов по 0,5 мл соответствующего разведения, удаление из флаконов инокулята после 60 мин инкубирования; подготовку первичного агарового покрытия, содержащего по 0,1% по объему антителсодержащего субстрата, и внесение его по 8 мл в каждый флакон; приготовление 0,1% раствора нейтрального красного и окрашивание монослоя клеток через 96 ч после нанесения первичного агарового покрытия; учет количества и определение размеров негативных колоний, образуемых исследуемыми аренавирусами через 24 ч после нанесения 0,1% раствора нейтрального красного; расчет показателей относительного размера негативных колоний и идентификацию вируса по снижению размера негативных колоний не менее чем в 2 раза при взаимодействии гомологичной пары «вирус-антитело».
Изобретение относится к области медицины, микробиологии, биологии. Предложен способ оценки специфической активности бактериофагов в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток, предусматривающий осуществление в течение 1 часа совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл.

Изобретение относится к биохимии. Описано моноклональное антитело или его фрагмент, которое связывается с белком P респираторно-синцитиального вируса человека (RSV), отличающееся тем, что данное моноклональное антитело или его фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №:1 или SEQ ID №: 5 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №: 2 или SEQ ID №: 6.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан выделенный вирус, который является членом пестивирусов, для диагностики и лечения заболевания, вызванного пестивирусом, отличающийся тем, что а) вирус является возбудителем врожденного тремора группы А-II у свиней, а б) вирус имеет вирусный геном, содержащий ген, кодирующий оболочечный белок Erns, ген, кодирующий оболочечный белок E2, и ген, кодирующий оболочечный белок E1, при этом нуклеотидная последовательность гена Erns имеет уровень идентичности, составляющий по меньшей мере 80% по отношению к нуклеотидной последовательности, как показано в SEQ ID NO:1, и/или нуклеотидная последовательность гена E2 имеет уровень идентичности, составляющий по меньшей мере 80% по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и/или нуклеотидная последовательность гена Е1 имеет уровень идентичности, составляющий по меньшей мере 80% по отношению к нуклеотидной последовательности, как показано в SEQ ID NO:5.

Изобретение относится к биотехнологии и определению респираторных заболеваний с помощью молекулярных маркеров в качестве средства прогнозирования развития случаев респираторных инфекций.

Группа изобретений относится к ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов. Раскрыт способ обнаружения бактерий, включающий обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению; добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий; фильтрацию полученной реакционной смеси; обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате; обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате; обработку полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения, и вывод результатов обнаружения пользователю.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки (БГЛ), вариант природного штамма Carvallo, адаптированный к морским свинкам и вызывающий у них зависимую от вводимой дозы вируса гибель.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования безрецидивной и общей выживаемости у ВПЧ 16-позитивных больных раком шейки матки.
Наверх