Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями



Владельцы патента RU 2738671:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский медицинский университет" (ФГБОУ ВО КемГМУ) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями. Способ включает культивирование определенного вида бифидобактерий, отделение микробной массы с последующей обработкой супернатанта на холоду диметилкетоном, отделением осадка, его растворением в буферном растворе и хроматографией на сефадексе Sephadex LH-20 с рехроматографией на аффинном сорбенте. Способ обеспечивает эффективность разделения, селективность очистки биологически активных веществ, продуцируемых бифидобактериями. 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и биотехнологии.

Известно, что качественные и количественные изменения микрофлоры сопутствуют многим патологическим состояниям [1]. Фундаментальные и трансляционные исследования за последние два десятилетия совершили революцию в понимании роли микрофлоры кишечника в здоровье человека. Стало очевидным, что микробы-резиденты биополостей человека включаются в патофизиологию широкого диапазона заболеваний и состояний. Из этого, естественно, следует, что терапевтическая модификация микробиоты кишечника может обеспечить изменение развития и течения многих хронических заболеваний (сахарный диабет, ожирение, атеросклероз сосудов) и предупредить развитие некоторых форм рака. От состояния микробиоты зависит продолжительность жизни, репродуктивная функция человека, особенности протекания нейрофизиологических процессов, что, в конечном итоге, определяет поведение и успешность.

Известно, что онтогенез микрофлоры заканчивается формированием относительно стабильного микробиоценоза. Однако, изменение состояния окружающей среды, культуры питания, темпа жизни, появление новых технологий в пищевой промышленности, бесконтрольный прием антибиотиков – все это изменяет нашу микрофлору, что влечет за собой снижение иммунологической реактивности макроорганизма и увеличение заболеваемости населения в целом. Так же, изменение микробиоценозов является пусковым фактором старения. Существует два принципиальных подхода для сохранения эубиоза микрофлоры – это введение пробиотиков и трансплантация фекальной микробиоты – донорских или аутоштаммов.

Предлагаемый подход в свете персонализованной медицины становится актуальным и востребованным. Возможно, человечество научится лечить еще немало заболеваний посредством управления микробиотой.

В заявляемом способе рассматривается выделение, накопление и селективная очистка веществ, продуцируемых представителями рода Bifidobacterium.

В качестве источника получения бифидобактерий, могут быть использованы штаммы, выделенные от конкретного пациента и обладающие определенными биологическими свойствами и характеристиками.

Известен способ получения плазмидной ДНК микроорганизмов А.С. SU 1124033 [2]. Способ включает в себя лизис бактериальных клеток с использованием щелочного раствора додецилсульфата натрия. Использование щелочного раствора может негативно сказываться на нативных свойствах целевого компонента, а применение додецилсульфата натрия в некоторых случаях может потребовать дополнительной стадии очистки.

В качестве прототипа принят способ получения продуктов метаболизма бифидобактерий для лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма и способ лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма RU 2 627 669. Для получения продуктов метаболизма по данному способу бифидобактерии выращивают во флаконах емкостью 400-500 см3 со средой Блаурокка в течение 3-4 суток. Определяют концентрацию микробов со стандартизацией их количества до 1×108 КОЕ/см3. Смесь бифидобактерий с продуктами их метаболизма в культуральной жидкости тщательно взбалтывают, переливают в центрифужные пробирки емкостью 50-100 см3, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. Полученный супернатант декантируют, определяют содержание сухого вещества и доводят его физиологическим раствором до концентрации 10-15 мг/см3, стерилизуют фильтрацией, разливают во флаконы и хранят в холодильнике при температуре 4-6°С.

Однако данный способ предполагает использовать суммарный супернатант, содержащий компоненты питательной среды, и метаболиты, относящиеся к различным классам соединений. Это делает затруднительным использование веществ с разной биологической активностью, содержащихся в супернатантах бифидобактерий, а также возможность стандартизации как готового продукта, так и продукта в процессе хранения.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение эффективности разделения, селективной очистки, выделения и накопления биологически активных веществ, продуцируемых представителями рода Bifidobacterium.

Предлагаемый способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями, может быть использован в фармакологических, бактериологических и биохимических исследованиях и заключается в следующем:

Вначале проводят накопление чистой культуры бифидобактерий с последующим разделением культуральной среды и бактериальной массы. Для этого выращивают культуру определенного вида бифидобактерий на жидкой Бифидум-среде (г. Оболенск). Культивирование проводят при 37 °C в течение 48 часов, что позволяет получить биомассу с содержанием бифидобактерий около 108 КОЕ/см3. Затем биомассу переносят в стерильные центрифужные пробирки и осуществляют центрифугирование при 3 000-4 000 об/мин с последующим отделением бактериальной массы.

Трехкратную обработку супернатанта проводят при пониженных температурах (+4°С) избытком диметилкетона (ацетона х.ч.). Осадок отделяют, далее растворяют в буферном растворе и хроматографируют на сефадексе (Sephadex) LH-20. Выделенная фракция олигомеров подвергается рехроматографии на аффинном сорбенте промышленного производства, например, Affi-Gel Protein A (Bio-Rad) или иные аффинные сорбенты с иммобилизоваными лектинами или гликопротеинами.

Пример 1. Выделен и идентифицирован по генетическим, морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам микроорганизм Bifidobacterium spp. штамм 74. Для накопления и выделения ДНК предварительно готовили жидкую Бифидум-среду (г. Оболенск), в которую затем помещали 1 колонию Bifidobacterium spp. Культивирование проводили при 37°C в течение 48 часов. Для определения количественного содержания бактерий в 1 см3 среды проводили титрование в стерильном физиологическом растворе от 10-1 до 10-9 КОЕ/см3 с последующим высевом по 0,1 см3 на плотную Бифидум-среду (г. Оболенск) и культивированием в анаэробных условиях. Количественные посевы показали, что содержание бифидобактерий в среде накопления составило около 108 КОЕ/ см3. Затем биомассу переносили в стерильные центрифужные пробирки и центрифугировали при 3 000-4 000 об/мин, отделяя клеточную массу. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр. Далее к охлажденному до +4°С супернатанту, добавляли трехкратный объем диметилкетона (ацетона х.ч.) и оставляли на 24 часа в темном месте при +4°С. После чего проводили трехкратно отделение осадка с последующим растворением и переосаждением из диметилкетона. Осадок растворяли в фосфатном буферном растворе с рН = 7,2. В режиме колоночной хроматографии на хроматографе низкого давления BioLogic (BioRad) осуществляли эксклюзионную хроматографию на сефадексе (Sephadex) LH-20. Выделенную фракцию олигомеров обрабатывали аффинным сорбентом Affi-Gel Protein A в режиме бэтч-метода. Супернатанты подвергали лиофилизации.

Фармакологическое исследование проводили на 100 аутбредных крысах-самках массой 250-300 г. Все манипуляции осуществлялись в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Животных содержали в стандартных климатических условиях на стандартном рационе питания. Острый формалиновый отек вызывали субплантарным введением экзометаболитов (под подошвенный апоневроз) в заднюю правую лапу мыши 0,2 см3 2% водного раствора формалина.

Все исследуемые образцы вводили принудительно через зонд в желудок. Предварительно дозу вещества разводили в 2-х см3 воды очищенной. Интактному контролю животных и контролю с моделью острого иммобилизованного стресса вводили по 2 см3 воды очищенной.

Оценка влияния исследуемого образца на развитие острого воспаления показала выраженное уменьшение флогогенного действия формалина на животных основной группы под влиянием экзометаболита штамма № 74 Bifidobacterium spp. по сравнению с контрольной группой животных, получавших диклофенак натрия. Это говорит о высокой противовоспалительной активности данного штамма (U = 2,7; p = 0,001).

Заявленный технический результат характеризуется повышением эффективности разделения, селективной очистки, выделения и накопления веществ, продуцируемых представителями рода Bifidobacterium, который достигается за счет обработки супернатанта диметилкетоном, с последующей жидкостной хроматографией и применения сефадекса LH-20 и аффинного сорбента.

Источники информации

1. Шендеров, Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 3. Пробиотики и функциональное питание / Б. А. Шендеров. – М.: Грантъ, 2001. – 288 с.

2. Пат. А.С. SU 1124033 СССР, (51) МПК. Способ получения плазмидной ДНК / Зилбере А. М., Шафранский А. Б., Хартмане Я. Я., Ансберга С. Э., Муйжниекс И. О., Камрадзе А. А.; Латвийский государственный университет им. П. Стучки. – заявка № 3555304; заявл. 16.02.1983; опубл. 15.11.1984. ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий. – [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://www.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=RUPAT&rn=283&DocNumber=1124033&TypeFile=pdf.

3. Пат. RU 2 627 669 (51) МПК А61К Способ получения продуктов метаболизма бифидобактерий для лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма и способ лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма / Никитин А.И. (RU), Низамов Р.Н. (RU), Конюхов Г.В. (RU), Василевский Н. М. (RU), Тухфатуллов М. З. (RU), Шарифуллина Д.Т. (RU), Юнусов И.Р. (RU), Гайнутдинов Т.Р. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») Заявка: 2016129773, 20.07.2016 Опубл.: 09.08.2017 Бюл. №22 Режим доступа: https://www.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet.

Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями, включающий культивирование определенного вида бифидобактерий, отделение микробной массы с последующей обработкой супернатанта на холоду диметилкетоном, отделением осадка, его растворением в буферном растворе и хроматографией на сефадексе Sephadex LH-20 с рехроматографией на аффинном сорбенте.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к способу качественного и количественного определения эфиров фталевой кислоты (фталатов) в полимерных материалах. Способ определения фталатов в полимерном материале методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием включает измельчение исследуемого полимерного материла; экстракцию из полимерного материала фталатов с помощью ацетонитрила в качестве экстрагента при температуре от 60 до 80ºС в течение промежутка времени от 90 до 150 минут; отделение экстракта, содержащего фталаты, от полимерного материала; определение содержания фталатов методом газовой хроматографии с использованием хроматографической колонки с нанесенной фазой, состоящей из 35%-фенил-65%-диметилполисилоксана.

Изобретение относится к нефтегазопромысловой геологии и может быть использовано на месторождениях и подземных хранилищах газа для оценки технического состояния газовых скважин с межколонными давлениями.

Изобретение относится к области физико-химического анализа и может применяться для выбора катализатора алкилирования изобутана бутиленами. Предложен cпособ оценки активности цеолитного катализатора алкилирования изобутана бутиленами, включающий определение его текстурных характеристик методом низкотемпературной адсорбции-десорбции азота - удельной площади поверхности, общего объема пор и объемов микро- и мезопор, расчет каталитических показателей катализатора - конверсии бутиленов (X) на основе уравнения: выхода алкилата на бутилены (Y) на основе уравнения: селективности по триметилпентанам (S) на основе уравнения: в которых Syд - удельная площадь поверхности, м2/г; Vоб - общий объем пор, м3/г, a N - отношение объемов микро- и мезопор, и выбор того образца катализатора, который отвечает расчетным показателям: X более 95 мас.

Данное изобретение относится к группе лабораторных методов, используемых при разработке новых лекарственных средств (ЛС), новых способов доставки ЛС, а также при контроле качества ЛС и их инновационных форм.

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно способу качественного и количественного определения элементарной серы в углеводородных средах. Способ определения элементарной серы в углеводородных средах с использованием жидкостного хроматографа, отличающийся тем, что в качестве неподвижной фазы используется неполярный сорбент, а в качестве подвижной фазы используется изопропиловый спирт или смесь изопропиловый спирт : вода, в которой объемное соотношение спирта и воды составляет от 99,9 % : 0,1% до 40% : 60%.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в нефтяной и газовой промышленности. Способ парофазного анализа комбинации водорастворимых летучих и малолетучих пластовых индикаторов в котором пробу пластовой воды помещают в герметичную стеклянную емкость с резиновой мембраной, выдерживают в термостате при температуре 95°С не менее 30 минут, отбирают 2 см3 паровой фазы медицинским шприцом и дозируют в испаритель газового хроматографа для анализа, при отборе паровой фазы между сменной иглой и корпусом медицинского шприца устанавливают одноразовый бумажный фильтр для удаления мелких капелек воды с растворенными в них трассерами.

Изобретение относится к транспорту углеводородных продуктов по трубопроводам и может быть использовано при эксплуатации, ремонте и реконструкции магистральных трубопроводов.
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в химико-токсикологических и контрольно-аналитических лабораториях для разделения, идентификации и анализа офлоксацина, линезолида и эфавиренза в комбинированных сочетаниях.

Изобретение относится к области аналитической химии. Способ контроля содержания противотуберкулезных препаратов (ПТП) основного ряда и их токсичных метаболитов в плазме крови заключается в подготовке плазмы крови к хроматографическому анализу путем добавления антиоксиданта, в качестве которого берут аскорбиновую кислоту, осаждении белков органическим растворителем, разбавлении пробы деионизированной водой в соотношении 1:10, проведении анализа методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии в режиме градиентного элюирования, детектировании сигналов ПТП с использованием тройного квадрупольного тандемного масс-спектрометрометра с ионизацией электрораспылением, в качестве контролируемых ПТП определяют пиразинамид, изониазид, этамбутол и рифампицин, в качестве токсичных метаболитов - пиразиноевую кислоту, 25-О-деацетилрифампицин, ацетилизониазид и изоникотиновую кислоту, измерении аналитических параметров анализируемого образца и, сравнивая их с аналитическими параметрами хроматографического анализа раствора стандартов ПТП с известными концентрациями, осуществление качественного и количественного определения ПТП и их метаболитов в плазме крови для контроля их допустимых доз.

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к газохроматографическому анализу карбоновых кислот. Способ количественного газохроматографического анализа паров пропионовой кислоты в зараженном воздухе, включающий анализ пробы воздуха, зараженного парами пропионовой кислоты, на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором, отличается тем, что в поглотительном приборе со стеклянной пористой пластиной в качестве поглотительного раствора используется смесь этилового спирта и воды в соотношении по объему 1:1.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bacillus pumilus ВКМ В-3464D, полученный методом скрининга микробиоты ротовой полости сибирского бурого медведя Ursus arctos collaris, обладает способностью синтезировать антибиотик амикумацин А широкого спектра действия.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2020-02-26 2020-12-15T11:40:33
Наверх