Пептиды, связывающие фактор роста эндотелия сосудов

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к соединениям, которые способны связывать фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), и могут быть использованы в медицине. Данные соединения представляют собой спиральные пептиды, характеризующиеся наличием в определенных положениях аминокислотной последовательности Сα-тетразамещенной аминокислоты, в частности, α-аминоизобутановой кислоты, которая способствует усилению связывания с VEGF, а также повышает устойчивость пептидов к ферментативному расщеплению. 3 табл., 28 ил.

 

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к пептидным соединениям, которые обладают способностью к связыванию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), а также к методам их получения и применения в медицине.

Предшествующий уровень техники

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является одним из основных регуляторов процесса образования сосудов (ангиогенеза). Нерегулируемая экспрессия данного белка вызывает пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток и неконтролируемый рост микрососудов в различных тканях (патологический ангиогенез). Данный феномен способствует патогенезу ряда заболеваний, таких как рост опухолей, псориаз, артрит, а также возрастной макулярной дегенерации (ВМД). В настоящее время известно несколько методов контроля активности VEGF-зависимых сигнальных путей, которые включают в себя ингибирование секреции эндогенного VEGF, нейтрализацию VEGF, использование олигонуклеотидов, антител, внеклеточных доменов рецептора (VEGFR), отвечающих за связывание лиганда, и низкомолекулярных ингибиторов взаимодействия VEGF-рецептор [1, 2].

Среди используемых в настоящее время анти-VEGF соединений, антитела (mAb) и так называемые «растворимые» рецепторы являются наиболее распространенными и действуют путем блокирования взаимодействия между рецептором и его лигандом VEGF. Бевацизумаб (Avastin^®), применяющийся также для лечения карцином, представляет собой полноразмерные антитела к VEGF и широко используется в офтальмологии при возрастной макулярной дегенерации, диабетической ретинопатии, окклюзии сетчатки и других заболеваний. Также широко применяется Ранибизумаб (Lucentis^®) - фрагмент моноклонального антитела (Fab), произведенный из того же антитела, что и Бевацизумаб. Пегаптаниб (Macugen^®) - аптамер, разработанный Eyetech Pharmaceuticals и Pfizer, также предназначен для лечения пациентов с неоваскулярной ВМД. В RU 2008144289 для связывания VEGF были использованы наноантитела [3]. Полноразмерный «растворимый» рецептор Афлиберсепт в настоящее время используется в медицине под торговым названием Eylea^®. Также было предпринято множество попыток разработать ингибиторы VEGF на основе только связывающих VEGF частей рецептора. Например, в Regeneron Pharmaceuticals была разработана VEGF-ловушка, которая представляла собой химерную молекулу, состоящую из второго и третьего доменов рецептора, и имела более высокое сродство к VEGF, по сравнению с моноклональными антителами [4]. Еще один химерный белок, способный связывать несколько разновидностей фактора роста эндотелия сосудов, был получен путем слияния внеклеточных доменов рецепторов VEGFR-1 и VEGFR-2 [5]. Несмотря на все достижения в разработке анти-VEGF соединений, разработка новых ингибиторов VEGF остается приоритетной областью исследований вследствие многочисленных недостатков используемых в настоящее время фармацевтических препаратов. Небольшая стабильность по отношению к ферментативному расщеплению, необходимость частых инъекций и риск осложнений сильно ограничивают их применение в антиангиогенной терапии.

Конструирование коротких пептидов и пептидомиметиков, которые могут связывать VEGF и одновременно более устойчивы к действию протеолитических ферментов, может быть многообещающей альтернативой полноразмерным белкам. В работе Fairbrother методом фагового дисплея был найден ряд небольших пептидов с различной способностью связывания с VEGF [6]. Среди них спиральный пептид v114 (VEPNCDIHVMWEWECFERL, Seq ID NO:1) обнаруживал наибольшую анти-VEGF активность. Еще более высокое сродство к VEGF показал пептид v114* (VEPNCDIHVⁿLWEWECFERL, Seq ID NO:2), в котором остаток метионина в положении 10 был заменен остатком норлейцина [7]. На Фиг. 1 представлены их структуры.

С целью дополнительно увеличить аффинность пептидов v114 и v114* к VEGF и определить положения в пептидной последовательности, которые имеют наиболее важное значение для VEGF-связывания, были проведены аланиновое и β-сканирование [7]. Было показано, что замещения в положениях 1-4, 6-8, 12, 14 и 17-19 не оказывают существенного влияния. Однако, попытки модификации аминокислот в некоторых из этих положений не приводили к заметному увеличению связывания VEGF, либо ухудшали его [8]. Единственное улучшение структуры пептида v114 (Seq ID NO:1) было произведено в WO 2009136352, где было показано, что замещение аминокислот в некоторых положениях приводит к усилению связывания [9]. В частности, в формуле данного изобретения такие изменения описаны как замена глутаминовой кислоты в положении 12 или 14 исходной последовательности v114 на валин и замена лейцина в положении 19 на другие гидрофобные природные или неприродные аминокислоты, а также удлинение последовательности v114. Однако, в WO 2009136352 ничего не говорилось о стабильности полученных аналогов v114 как таковых или периоде их полувыведения без дополнительных модификаций макромолекулами, в частности, антителами, которые могли обеспечить дополнительную терапевтическую функцию, например, увеличение продолжительности действия или улучшенное связывание с VEGF.

Таким образом, желательной является такая модификация последовательности пептидов v114 и v114*, которая позволит устранить их недостатки, в частности, увеличить их взаимодействие с VEGF и замедлить расщепление протеолитическими ферментами, без необходимости получения сложных конструкций с макромолекулами, такими, как, например, антитела.

Изобретение описывает анти-VEGF пептиды с улучшенной структурой, по сравнению уже использованными пептидами на основе v114* (Seq ID NO:2). Технической задачей, лежащей в основе изобретения, является увеличение VEGF-связывающей активности пептида v114*, а также увеличение его протеолитической стабильности. В данном изобретении эта проблема была решена путем введения в структуру v114* Сα-тетразамещенной аминокислоты. Было обнаружено, что введение в определенные положения пептидной последовательности v114* Сα-тетразамещенной аминокислоты, в частности, α-аминоизобутановой кислоты, которая может стабилизировать спиральную конформацию пептида, приводит к улучшенному связыванию VEGF. Кроме того, данные модификации приводят к увеличению стабильности пептида в присутствии ферментов. Далее, в данном изобретении было показано, что введение Aib-содержащей олиголизиновой последовательности на N-конце пептида v114* вместо тетрапептидного фрагмента VEPN может также увеличить стабильность пептида в витреальной жидкости и VEGF-связывание.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1: Структура пептидов v114 (А) и v114* (В).

Фиг. 2: Структура Сα-тетразамещенной аминокислоты (А) и α-аминоизобутановой кислоты (В).

Фиг. 3: Структура пептида VAibPNCDIHVⁿLWEWECFERL.

Фиг. 4: Структура пептида VAibPNCDIHVⁿLWEWECFERL.

Фиг. 5: Структура пептида VEAibNCDIHVⁿLWEWECFERL.

Фиг. 6: Структура пептида VEPNCDIHVⁿLWAibWECFERL.

Фиг. 7: Структура пептида AibKKKCDIHVⁿLWEWECFERL.

Фиг. 8: Структура пептида KAibKKCDIHVⁿLWEWECFERL.

Фиг. 9: Структура пептида KKAibKCDIHVⁿLWEWECFERL.

Фиг. 10: Структура пептида KKKKCDIHVⁿLWAibWECFERL.

Фиг. 11: Структура пептида CDIHVⁿLWEWECFERL.

Фиг. 12: Структура пептида VNCDIHVⁿLWEWECFERL.

Фиг. 13: Структура пептида VEPNCDIAibVⁿLWEWECFERL.

Фиг. 14: ВЭЖХ хроматограмма пептида v114* (Seq ID NO:2).

Фиг. 15: ВЭЖХ хроматограмма пептида sv114* (Seq ID NO:12).

Фиг. 16: ВЭЖХ хроматограмма пептида kv114* (Seq ID NO:9).

Фиг. 17: ВЭЖХ хроматограмма пептида Aib12 (Seq ID NO:7).

Фиг. 18: ВЭЖХ хроматограмма пептида Aib8 (Seq ID NO:14).

Фиг. 19: ВЭЖХ хроматограмма пептида Aib2 (Seq ID NO:5).

Фиг. 20: ВЭЖХ хроматограмма пептида VN (Seq ID NO: 13).

Фиг. 21: КД спектры пептидов v114* (Seq ID NO:2, A), sv114* (Seq ID NO:12, В), Aib2 (Seq ID NO:5, C), Aib8 (Seq ID NO:14, D), Aib12 (Seq ID NO:7, E), kv114* (Seq ID NO:9, F).

Фиг. 22: Регион fingerprint спектра NOESY пептида v114* (А) и Aib12 (В). Кросс-пики CαH(i)-HN(i+2), CαH(i)-HN(i+3) и CaH(i)-HN(i+4) выделены красным, зеленым и синим, соответственно.

Фиг. 23: Стабильность пептидов в витреальной жидкости.

Фиг. 24: Зависимость количества комплексов VEGF-пептид, выраженного в значениях нормализованной флуоресценции, от концентрации пептида: A-v114*; B-sv114*; C-kv114*; D - Aib12; E - Aib8; F - Aib2; G - VN (Seq ID NO:2, Seq ID NO: 12, Seq ID NO:9, Seq ID NO:7, Seq ID NO:14, Seq ID NO:5, Seq ID NO:13, соответственно).

Фиг. 25: Сравнение зависимостей количества комплексов VEGF-пептид от концентрации пептида в системе (концентрация VEGF - 1 нМ).

Фиг. 26: Зависимость количества комплексов VEGF-Бевацизумаб, выраженного в значениях нормализованной флуоресценции, от концентрации Бевацизумаба.

Фиг. 27: Аффинность связывания фактора роста эндотелия сосудов анти-VEGF пептидами.

Фиг. 28: Влияние совместного инкубирования VEGF с пептидами на эффективность связывания.

Описание изобретения

Определения

Название «аминокислота», если не уточнено дополнительно, относится к природным и искусственным соединениям, имеющим как минимум одну аминогруппу и как минимум одну карбоксильную группу. α-аминокислоты имеют один атом углерода между аминогруппой и карбоксильной группой. Природные аминокислоты являются аминокислотами, кодируемыми генетическим кодом, а также модифицированные впоследствии клеточными механизмами. Неприродные аминокислоты являются некодируемыми генетическим кодом.

Сα-тетразамещенные аминокислоты являются природными или неприродными аминокислотами, у которых атом углерода между аминогруппой и карбоксильной группой α-аминокислоты имеет два заместителя, отличные от водорода. Заместители у Сα могут быть одинаковыми или разными. Простейшим примером Сα-тетразамещенной аминокислоты является α-аминоизобутановая кислота (Aib) (Фиг. 2).

Природные и неприродные аминокислоты могут связываться между собой с образованием ковалентной пептидной (амидной) связи с определенным чередованием аминокислот, которое называется аминокислотной или пептидной последовательностью. Образующееся соединение, если не уточнено дополнительно, может называться пептидом или полипептидом. В целом аналогичной пептидной последовательностью в данном изобретении называется пептидная последовательность, которая отличается от исходной менее чем на 15% аминокислот. Подходящая терминология и классификация пептидов хорошо известна специалистам в данной области и будет им очевидна при описании данного изобретения. Пептиды могут быть получены с помощью методов, широко известным специалистам в этой области, например, с помощью твердофазного метода или путем синтеза в растворе [10].

«Связывание» определяется как способность описанных в данном изобретении соединений образовывать комплекс с другим соединением, в данном случае с VEGF. Пептиды в данном изобретении связывают VEGF с константой диссоциации (K_D) предпочтительно меньше, чем 4 μМ, более предпочтительно, меньше чем 1 μМ, еще более предпочтительно, меньше, чем 0.005 μМ.

Модификация пептида v114* Сα-тетразамещенной аминокислотой

Определение пространственной структуры пептида v107 (Seq ID NO:3) в комплексе с VEGF методом ЯМР показало наличие спирального фрагмента, образуемого аминокислотами 13-19 [6]. Вследстве схожести последовательностей v107 и v114 можно предположить наличие подобной структуры также и у последнего пептида. Фиксация спиральной конформации может существенно увеличить аффинность к VEGF. Как известно, присутствие в аминокислотной последовательности Сα-тетразамещенных аминокислот может как стабилизировать спиральную конформацию, так и существенно увеличить стабильность пептидов по отношению к ферментативному расщеплению [11, 12]. В данном изобретении Сα-тетразамещенная аминокислота, предпочтительно α-аминоизобутановая кислота, вводится в определенные положения аминокислотной последовательности v114* (Seq ID NO:2), которые были выявлены путем анализа структуры v114 (Seq ID NO:1) и могут быть не критичными для связывания VEGF [7]. Сα-тетразамещенная аминокислота может быть введена в положения 1-3, 12, 14 и 19, более предпочтительно, в положения 1-3 или 12.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему по крайней мере один остаток Сα-тетразамещенной аминокислоты, предпочтительно Aib, и включающему последовательность, по существу гомологичную последовательности:

X₁¹-X₂²-X₃³-X4⁴-C⁵-D⁶-I⁷-H⁸-V⁹-ⁿL^l0-W¹¹-X₅¹²-W¹³-E¹⁴-C¹⁵-F¹⁶-E^,7-R¹⁸-L^,9

где X₁ представляет V или Z, Х₂ представляет Е или Z, Х₃ представляет Р или Z, Х₄ представляет N, Х₅ представляет Е или Z, где Z - Сα-тетразамещенная аминокислота, предпочтительно Aib.

Таким образом, в одном из аспектов последовательность анти-VEGF пептида может быть отображена как AibEPNCDIHVⁿLWEWECFERL (Seq ID NO:4) (Фиг. 3).

Еще в одном из аспектов последовательность анти-VEGF пептида может быть отображена как VAibPNCDIHVⁿLWEWECFERL (Seq ID NO:5) (Фиг. 4).

Еще в одном из аспектов последовательность анти-VEGF пептида может быть отображена как VEAibNCDIHVⁿLWEWECFERL (Seq ID NO:6) (Фиг. 5).

Еще в одном аспекте последовательность анти-VEGF пептида может быть отображена как VEPNCDIHVⁿLWAibWECFERL (Seq ID NO:7) (Фиг. 6).

Анти-VEGF пептид, кроме Сα-тетразамещенной аминокислоты, может также содержать олиголизиновую последовательность, которая может улучшить связывание VEGF, как было показано ранее на примере пептидов, связывающих хемокины [13]. Предпочтительно, если олиголизиновая последовательность находится на N-конце пептида и включает в себя Сα-тетразамещенную аминокислоту, предпочтительно, Aib.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему по крайней мере один остаток Сα-тетразамещенной аминокислоты, предпочтительно Aib, и включающему последовательность, по существу гомологичную последовательности:

X₁¹-X₂²-X₃³-X4⁴-C⁵-D₆-I⁷-H⁸-V⁹-ⁿL¹⁰-W¹¹-X4¹²-W¹³-E¹⁴-C¹⁵-F^16--E¹⁷-R¹⁸-L^,9

где Х₁, Х₂, Х₃ представляет K или Z, Х₄ представляет K, Х₅ представляет Е или Z, где Z - Сα-тетразамещенная аминокислота, предпочтительно Aib.

Таким образом, в одном из аспектов последовательность анти-VEGF пептида может быть отображена как AibKKKCDIHVⁿLWEWECFERL (Seq ID NO:8) (Фиг. 7).

Еще в одном аспекте последовательность анти-VEGF пептида может быть отображена как KAibKKCDIHVⁿLWEWECFERL (Seq ID NO:9) (Фиг. 8).

Еще в одном аспекте последовательность анти-VEGF пептида может быть отображена как KKAibKCDIHVⁿLWEWECFERL (Seq ID NO:10) (Фиг. 9).

Еще в одном аспекте последовательность анти-VEGF пептида может быть отображена как KKAibKCDIHVⁿLWEWECFERL (Seq ID NO:11) (Фиг. 10).

Для сравнения были использованы аналоги v114*, не содержащие Сα-тетразамещенной аминокислоты (CDIHVⁿLWEWECFERL, Seq ID NO:12; VNCDIHVⁿL WE WECFERL, Seq ID NO: 13), а также аналог v114*, в котором гистидин в положении 8, которое находится вне спирали, заменен на Aib, что может влиять на связывание VEGF (VEPNCDIAibVⁿLWEWECFERL, Seq ID NO:14) (Фиг. 14-21).

Получение пептидов, содержащих Сα-тетразамещенную аминокислоту

Пептиды, содержащие Сα-тетразамещенную аминокислоту, могут быть получены различными методами, известными специалистам в этой области, и не требуют специального обсуждения. Одним из способов получения может быть твердофазный синтез, который представляет собой последовательное присоединение защищенных аминокислот к полипептидной цепи, закрепленной на полимерном носителе, например, Ринк-амидной смоле, с последующим отщеплением пептида от носителя и деблокированием. На следующем этапе может происходить циклизация пептида с образованием дисульфидной связи и очистка пептида с помощью ВЭЖХ. Примеры иллюстрируют один из вариантов и никак не ограничивают формулу изобретения (Фиг. 14-20).

Исследование структуры анти-VEGF пептидов методом кругового дихроизма

Для исследования структуры полученных соединений использовался метод кругового дихроизма (КД), который позволяет определить общую пространственную конформацию полипептида (спаральную, β-складчатую, неупорядоченную и т.д.). Этим методом было показано, что все пептиды имеют КД спектры типичные для спиральной конформации, независимо от того, имеется в их составе Сα-тетразамещенная аминокислота или нет (Фиг. 21). Таким образом, введение Сα-тетразамещенной аминокислоты не дестабилизирует исходную структуру пептида v114*.

Исследование структуры анти-VEGF пептидов методом ЯМР

Эффект введения аминокислоты Aib в пептидную последовательность иллюстрирует пример спектров NOESY пептидов v114* (Seq ID NO:2) и Aib12 (Seq ID NO:7) (Фиг. 22). В регионе fingerprint пептида v114*, кроме сигналов CaH(i)-HN(i+3), присутствуют как сигналы CaH(i)-HN(i+2), которые характерны для 3₁₀-спиральной структуры, так и CαH(i)-HN(i+4), типичные для a-спиральной структуры. Таким образом, пептидная спираль v114* представляет собой смесь 3₁₀/α и свидетельствует о подвижности спирали. В то же время в спектре NOESY пептида Aib12 отсутствуют кросс-пики, свидетельствующие о взаимодействии CαH(i)-HN(i+2). Таким образом, в его структуре преобладает α-спираль, что показывает его более жесткую структуру и возможное усиленное взаимодействие с VEGF Aib-содержащих пептидов.

Определение устойчивости пептидов в витреалъной жидкости

Исследование устойчивости анти-VEGF пептидов к ферментативному расщеплению исследовалась на примере витреальной жидкости. Введение Сα-тетразамещенной аминокислоты в структуру большинства пептидов существенно увеличивает их стабильность действию ферментов, по сравнению с пептидами, содержащими только природные аминокислоты (Фиг. 23, Таблица 1). При этом время жизни большинства Aib-содержащих пептидов в витреальной жидкости увеличивается в 7-10 раз, по сравнению с исходным пептидом v114* (Seq ID NO:2).

Определение VEGF-связывающей активности пептидов

Данные, полученные методом микроскопического термофореза (МСТ) показывают, что укорочение N-концевого фрагмента последовательности v114* приводит к небольшому увеличению VEGF-связывающей активности пептида, однако ее полное удаление существенно понижает способность к взаимодействию с VEGF, как это было обнаружено ранее (Таблица 2) [8].

Введение Сα-тетразамещенной аминокислоты почти во всех случаях способствует усилению взаимодействия и уменьшению K_D, однако введение Aib в положение 8 (Seq ID NO:14), где по литературным данным родственный пептиду v114* пептид v107 не имеет спиральной структуры, приводит к ухудшению VEGF-связывающей способности. По всей видимости, остаток Сα-тетразамещенной аминокислоты в данном положении частично дестабилизирует общую конформацию пептида, необходимую для взаимодействия с VEGF. Увеличение времени инкубирования пептида с VEGF перед проведением измерения методом МСТ, позволяют детектировать высокоспецифичное взаимодействие в случае пептидов Aib12 (Seq ID NO:7) и Aib2 (Seq ID NO:5). Наибольшую VEGF-связывающую способность показывает пептид Aib2, аффинность которого по отношению к фактору роста эндотелия сосудов сравнима с коммерческим препаратом на основе анти-VEGF антитела (Бевацизумаб).

Примеры

Материалы

Carbosynth (Berkshire, UK): HATU

Fluka (Buchs, Swiss): EDT

IRIS Biotech (Marktredwitz, Germany): смола Ринка, Fmoc-защищенные аминокислоты, HBTU

Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, USA): ацетонитрил, трифторуксусная кислота, бикарбонат аммония, дихлорметан, ДМФ, диэтиловый эфир, метанол, триизопропилсилан, VEGF-A.

Твердофазный синтез пептидов

Синтез проводили с помощью автоматического пептидного синтезатора. К 0.25 г Fmoc-защищенной Rink амидной смолы с емкостью 0,65 ммоль/г добавляли 2 мл ДМФ. После набухания смолы в течение 30 мин растворитель отфильтровывали и защитную группу снимали 20% пиперидином в ДМФ (2 мл в 2 цикла в течение 5 и 20 минут). Затем смолу промывали 4 раза 2 мл ДМФ и проводили ацилирование. На каждой стадии ацилирования (1 час) использовали избыток реагентов: 5 эквивалентов защищенных аминокислот, 5 эквивалентов HBTU и 7 эквивалентов DIPEA. В случае Aib ацилирование проводили 2 раза с помощью 5 эквивалентов HATU и 7 эквивалентов DIPEA. После каждого ацилирования смолу промывали 3 раза 2 мл ДМФ. Повторение циклов ацилирования и снятия Fmoc-защиты повторяли до получения желаемых пептидных последовательностей. В конце пептиды отщепляли от смолы смесью 3 мл ТРА/вода/TIS/EDT (в соотношении 94/2.5/1/2.5) и осаждали в 5 мл диэтилового эфира. Осадок центрифугировали и сушили. Полученный линейный пептид растворяли в 0.15М растворе бикарбоната аммония до получения концентрации 1 мг/мл. Раствор перемешивали в течение нескольких дней до завершения реакции образования дисульфидной связи (контроль с помощию ВЭЖХ-МС). Затем рН полученного раствора доводили до 2 с помощию 1М раствора соляной кислоты и продукт очищали методом препаративной ВЭЖХ на Shimadzu LC-8A с УФ-детектированием при 224 нм, используя колонку С18 Jupiter (Phenomenex) 21,2 × 250 мм и элюенты А: 10% ацетонитрил-вода с 0,1% TFA; элюент В: 90% ацетонитрил-вода с 0,1% TFA. Проводили элюирование с использованием градиента: 0 мин - 5% элюент В, 20 мин - 31% элюент В; 65 мин - 38% элюент В, 70 мин - 95% элюент В. Фракции с чистотой >97% собирали и лиофилизировали. Полученные пептиды анализировали с помощью ВЭЖХ-МС (Таблица 3). На Фиг. 14-20 представлены ВЭЖХ хроматограммы пептидов (Seq ID NO:2, Seq ID NO:5, Seq ID NO:7, Seq ID NO:9, Seq ID NO:12, Seq ID NO:13, Seq ID NO:14).

Определение структуры пептидов методом кругового дихроизма

Измерения кругового дихроизма (КД) проводились при 25°С с использованием КД спектрометра Jasco J-1500 (JASCO, Mary's Court Easton, MD, USA) с использованием кварцевой кюветы Hellma с оптическим путем 0.1 см в метаноле (МеОН) и фосфатном буфере (PBS) при рН 7.0. Спектры были получены в диапазоне длин волн от 180 до 260 нм и нормализованы к молярной эллиптичности на один аминокислотный остаток ([θ]×10^-3, deg⋅cm²⋅dmol^-1⋅res^-1) с использованием точной концентрации пептидов, полученной с помощью УФ поглощения при 280 нм. На Фиг. 21 представлены КД спектры пептидов (Seq ID NO:2, Seq ID NO:5, Seq ID NO:7, Seq ID NO:9, Seq ID NO:12, Seq ID NO:14).

Определение структуры пептидов методом ЯМР спектроскопии

Спектры ЯМР регистрировали на приборе DMX 600 МГц. Образцы растворяли в H₂O/D₂O в соотношении 9:1 с добавлением 0,5 мкл 3М HCl для получения 1,5 мМ раствора. Химические сдвиги (d) выражены в частях на миллион (ррт) по сравнению с эталонным сигналом растворителя (D₂O). На Фиг. 22 представлен регион fingerprint спектра NOESY пептидов v114* (Seq ID NO:2) и Aib12 (Seq ID NO:7).

Определение стабильности пептидов в витреальной жидкости

Стабильность пептидов по отношению к протеолитическому расщеплению была определена с помощью ВЭЖХ-МС метода. Пептиды растворялись в свиной витреальной жидкости и раствор термостатировался при 37°С [14]. Содержание пептида в растворе определялось через определенные промежутки времени по отношению к раствору пептида без витреальной жидкости. На Фиг. 23 представлены данные по стабильности пептидов (Seq ID NO:2, Seq ID NO:5, Seq ID NO:7, Seq ID NO:9, Seq ID NO:12, Seq ID NO:13, Seq ID NO:14).

Определение VEGF-связывающей активности пептидов

Аффинность связывания пептидов с VEGF определяли с использованием метода микроскопического термофореза (МСТ) [15]. Для исследования использовали прибор NanoTemper Monolith NT.115 Pico, флуоресцентно меченый белок VEGF-RED с исходной концентрацией 12 ммоль/л и капилляры серии Premium. Связывание метки (NHS-RED) с молекулой белка (VEGF) проводили согласно стандартному протоколу [16]. Измерения взаимодействия проводили при постоянной концентрации VEGF-RED (1 нМ), варьируя концентрацию анти-VEGF пептида в диапазоне от 50 μМ до 0,5 нМ. Настройка интенсивности инфракрасного (ИК) лазера происходила в автоматическом режиме. Взаимодействие пептид-VEGF детектировали, изучая изменение флуоресценции комплекса пептид-белок под воздействием ИК-лазера, которое пропорционально термофоретической подвижности меченного белка молекул. Для обсчета полученной кривой использовалось лицензированное программное обеспечение компании NanoTemper - МО Affinity Ananlysis. На Фиг. 24 представлены данные по зависимости количества комплексов VEGF-пептид, выраженного в значениях нормализованной флуоресценции, от концентрации пептида (Seq ID NO:2, Seq ID NO:5, Seq ID NO:7, Seq ID NO:9, Seq ID NO:12, Seq ID NO:13, Seq ID NO:14). На Фиг. 25 представлено сравнение зависимостей количества комплексов VEGF-пептид от концентрации пептида в системе. На Фиг. 26 представлена зависимость количества комплексов VEGF-Бевацизумаб, выраженного в значениях нормализованной флуоресценции, от концентрации Бевацизумаба. На Фиг. 27 представлена аффинность связывания фактора роста эндотелия сосудов анти-VEGF пептидами. На Фиг. 28 представлено влияние совместного инкубирования VEGF с пептидами на эффективность связывания.

Как показывают приведенные результаты апробации, заявленное изобретение позволяет получить VEGF-связывающие пептиды, которые просты в получении и имеют более высокую аффинность к VEGF, по сравнению с ранее описанными родственными пептидами. При этом их аффинность к VEGF может находиться в диапазоне аффинности коммерчески используемых антител. Описанные в данном изобретении соединения отличаются от родственных пептидов наличием в структуре Сα-тетразамещенной аминокислоты, что существенно уменьшает их чувствительность к ферментативному расщеплению. Таким образом, предложенные соединения могут быть использованы при получении ингибиторов VEGF с улучшенными свойствами и могут найти применение в диагностике или лечении патологического ангиогенеза.

Список литературы

[1] Glade-Bender et al. Expert Opin. Biol. Ther. 2003, 3, 263-276.

[2] Liang et al. Cur. Med. Chem. 2014, 21, 894-910.

[3] RU 2008144289.

[4] Holash et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 2002, 99, 11393-11398.

[5] Wang et al. PLoS ONE 2013, 8, e70544.

[6] Fairbrother et al. Biochemistry 1998, 37, 17754-17764 (прототип).

[7] Haase et al. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 7652-7655.

[8] Reille-Seroussi et al. Biochemistry 2015, 54, 5147-5156.

[9] WO 2009136352.

[10] Benoiton, N.L. Chemistry of peptide synthesis. CRC Press, Taylor & Francis Group, 2006).

[11] Toniolo et al. Biopolymers 2002, 60, 396-419).

[12] Jensen K. J. Peptide and protein design for biopharmaceutical applications. 2009 John Wiley & Sons, 2009).

[13] Guryanov et al. Nanomedicine, NBM 13, 2017, 2575-2585.

[14] Bhattacharya et al. J. Contr. Release 2017,251,37-48.

[15] Wienken et al. Nat. Commun. 2010, 1, 100.

[16] Jerabek-Willemsen et al. Assay Drug. Dev. Technol. 2011, 9, 342-353.

Пептид, связывающий фактор роста эндотелия сосудов, с аминокислотной последовательностью, имеющей в составе, как минимум, один остаток α-аминоизобутановой кислоты, и представляющий собой последовательность:

R₁-C⁵-D⁶-I⁷-H⁸-V⁹-ⁿL¹⁰-W¹¹-X₁¹²-W¹³-E¹⁴-C¹⁵-F¹⁶-E¹⁷-R¹⁸-L¹⁹,

где ⁿL - норлейцин;

X₁ - глутаминовая кислота или α-аминоизобутановая кислота;

R₁ представляет собой Х₂¹-Х₃²-Х₄³-N⁴,

где Х₂ - валин или α-аминоизобутановая кислота, Х₃ - глутаминовая кислота или α-аминоизобутановая кислота, Х₄ - пролин или α-аминоизобутановая кислота;

или R₁ представляет собой Х₂¹-Х₃²-Х₄³-K⁴,

где Х₂, Х₃, Х₄ - лизин или α-аминоизобутановая кислота.