Анти-cd123 антитела и их конъюгаты и производные

Авторы патента:

C07K2317/24 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

C07K19/00 - Гибридные пептиды

C07K16/2866 - Иммуноглобулины, например моноклональные или поликлональные антитела

C07K16/28 - против рецепторов, клеточных поверхностных антигенов или клеточных поверхностных детерминантов

A61P35/02 - специально против лейкоза

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61K47/6801 - Лекарственные препараты, отличающиеся используемыми неактивными ингредиентами, например носителями, инертными добавками

A61K39/3955 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

A61K2039/505 - Лекарства и медикаменты для терапевтических, стоматологических или гигиенических целей (изготовление специальных лекарственных форм A61J; химические аспекты или использование материалов для дезодорации воздуха, для дезинфекции или стерилизации или для бандажей, перевязочных средств, впитывающих прокладок или хирургических приспособлений A61L; соединения как таковые C01, C07,C08,C12N; мыла C11D; микроорганизмы как таковые C12N)

Владельцы патента RU 2739612:

ИММУНОДЖЕН, ИНК. (US)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым антителам, способным связываться с антигеном CD123 (α-цепь рецептора интерлейкина 3 или IL-3Rα), и может быть использовано в медицине. Изобретение также позволяет получить иммуностимулирующие конъюгаты на основе антител к CD123 и различных противоопухолевых агентов. Помимо этого, изобретение может быть использовано для диагностики и лечения тех типов рака, в клетках которых наблюдается повышенная экспрессия антигена CD123, например острой миелоидной лейкемии, лимфобластного или лимфоцитарного лейкоза или других злокачественных В-клеточных опухолей. 10 н. и 49 з.п. ф-лы, 30 пр., 11 табл., 33 ил.

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В данной заявке заявлен приоритет даты подачи, согласно 35 USD 119 (e) предварительной заявки США №62/186161, поданной 29 июня 2015 года, предварительной заявки США №62/338203, поданной 18 мая, 2016 и предварительной заявки США №62/346730, поданной 7 июня 2016 года. Все содержимое каждой из вышеперечисленных заявок включено сюда посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение в целом относится к антителам, их антигенсвязывающим фрагментам, полипептидам и иммуноконъюгатам, которые связываются с антигеном CD123 (α-цепь рецептора интерлейкина-3 или IL-3Rα). Данное изобретение также относится к способам использования таких CD123-связывающих молекул для диагностики и лечения заболеваний, таких как злокачественные В-клеточные опухоли.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

CD123 (альфа часть рецептора интерлейкина-3, IL-3Rα) представляет собой молекулу 40 кДа, которая является частью комплекса рецептора интерлейкина-3 (IL-3R). Цитокин Интерлейкин 3 (IL-3) приводит к ранней дифференциации мультипотентных стволовых клеток в клетки эритроидных, миелоидных и лимфоидных предшественников. CD123 экспрессируется на CD34⁺-коммитированных предшественниках, но не CD34⁺/CD38^- нормальными гематопоэтическими стволовыми клетками (HSC). CD123 экспрессируется базофилами, тучными клетками, плазмоцитоидными дендритными клетками, наблюдается некоторая экспрессия моноцитами, макрофагами и эозинофилами и низкая или отсутствующая экспрессия у нейтрофилов и мегакариоцитов. Некоторые негемопоэтические ткани, такие как плацента, клетки Лейдига из яичка, некоторые элементы клеток мозга и некоторые эндотелиальные клетки, также экспрессируют CD123. Однако экспрессия там в основном цитоплазматическая.

Сообщается, что CD123 экспрессируется лейкемическими бластными клетками («лейкемические бласты») и лейкемическими стволовыми клетками (LSC) (Jordan et al., Leukemia 14: 1777-1784, 2000; Jin et al., Blood 113: 6603-6610, 2009). В человеческих популяциях нормальных предшественников CD123 экспрессируется подмножеством гемопоэтических клеток-предшественников (НРС), но не нормальными HSC. Сообщается также, что CD123 экспрессируется плазмоцитоидными дендритными клетками (pDC) и базофилами и, в меньшей степени, моноцитами и эозинофилами.

Сообщалось, что CD123 сверхэкспрессируется на злокачественных клетках в широком диапазоне гематологических злокачественных новообразований, включая острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) и миелодиспластический синдром (МДС) et al., Haematologica 86 (12): 1261-1269, 2001). Сверхэкспрессия CD123 связана с более слабым прогнозом в ОМЛ (Tettamanti et al., Br. J. Haematol. 161:389-401, 2013). Предполагается, что ОМЛ и МДС возникают и сохраняются небольшой популяцией лейкемических стволовых клеток (ЛСК), которые обычно неактивны (то есть деление клеток происходит не быстро) и, следовательно, противостоят гибели клеток (апоптозу) и обычным химиотерапевтическим агентам. ЛСК характеризуются чрезмерной экспрессией CD123, тогда как CD123 не присутствует в соответствующей нормальной популяции гемопоэтических стволовых клеток в нормальном костном мозге человека (Jin et al., Blood 113: 6603-6610,2009; Jordan et al., Leukemia 14: 1777-1784, 2000). Экспрессия CD123 также связана с несколькими другими злокачественными новообразованиями/предзлокачественными новообразованиями: клетками-предшественниками хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) (включая бластный криз ХМЛ); клетки Рид-Штернберга Ходжкина (РШ); трансформированной неходжкинской лимфомой (НХЛ); некоторыми хроническими лимфоцитарными лейкозами (ХЛЛ) (CD11c⁺); подмножеством острой Т-лимфобластной лейкемии (Т-ОЛЛ) (16%, большинство незрелых, в основном взрослых), злокачественными плазмоцитоидными дендритноклеточными опухолями (pDC) (DC2) и опухолями CD34⁺/CD38^- миелодиспластического синдрома (МДС) клеток костного мозга.

ОМЛ - это клональное заболевание, характеризующееся пролиферацией и накоплением трансформированных миелоидных клеток-предшественников в костном мозге, что в конечном итоге приводит к гемопоэтической недостаточности. Заболеваемость ОМЛ увеличивается с возрастом, а у пожилых пациентов обычно хуже, чем у молодых пациентов (Robak et al., Clin. Ther. 2: 2349-2370, 2009). К сожалению, в настоящее время большинство взрослых с ОМЛ умирают от их болезни.

Лечение ОМЛ первоначально фокусируется на индукции ремиссии (индукционная терапия). Как только ремиссия будет достигнута, лечение сдвинется для того, чтобы сосредоточиться на обеспечении такой ремиссии (терапия после ремиссии или терапия консолидации), а в некоторых случаях поддерживающей терапии. Стандартная парадигма индукции ремиссии для ОМЛ - это химиотерапия комбинацией антрациклин/цитарабин, сопровождаемая либо химиотерапией консолидации, как правило, с более высокими дозами тех же препаратов, которые использовались в течение индукционного периода, или трансплантацией стволовых клеток человека в зависимости от способности пациента переносить интенсивное лечение и вероятность лечения только химиотерапией (см. Roboz, Curr. Opin. Oncol. 24:711-719, 2012).

Средства, часто используемые в индукционной терапии, включают цитарабин и антрациклины. Цитарабин, также известный как AraC, убивает раковые клетки и другие быстро делящиеся нормальные клетки, препятствуя синтезу ДНК. Побочные эффекты, связанные с лечением AraC, включают снижение резистентности к инфекции, в результате снижения производства лейкоцитов; кровотечение, в результате сокращения производства тромбоцитов; и анемии, из-за потенциального сокращения эритроцитов. Другие побочные эффекты включают тошноту и рвоту. Антрациклины (например, даунорубицин, доксорубицин и идарубицин) обладают несколькими режимами действия, включая ингибирование синтеза ДНК и РНК, разрушение структур более высокого порядка структур ДНК и образование свободных радикалов кислорода, разрушающих клетки. Наиболее существенным побочным эффектом антрациклинов является кардиотоксичность, которая значительно ограничивает применяемую дозу на протяжении жизни и в какой-то степени их полезность.

Таким образом, к сожалению, несмотря на существенный прогресс в лечении недавно диагностированного ОМЛ, от 20 до 40% пациентов не достигают ремиссии с помощью стандартной индукционной химиотерапии, и ожидается, что у 50 до 70% пациентов, вступивших в первую полную ремиссию, случается рецидив в пределах 3 лет. Оптимальная стратегия во время рецидива или для пациентов с резистентным заболеванием остается неопределенной. Трансплантация стволовых клеток была установлена как наиболее эффективная форма антилейкемической терапии у пациентов с ОМЛ при первой или последующей ремиссии (Roboz, 2012).

Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) и другие конъюгаты агенты-лекарственные средства, связывающие клетки, становятся мощным классом противоопухолевых агентов с эффективностью против различных видов рака. Конъюгаты агенты-лекарственные средства, связывающие клетки (такие как ADC), обычно состоят из трех различных элементов: связывающего клетки агента (например, антитела); линкера; и цитотоксического фрагмента. Обычно фрагмент цитотоксического лекарственного средства ковалентно присоединен к лизиновым остаткам на антителе или к остаткам цистеина, полученным путем восстановления межцепочечных дисульфидных связей, в результате чего ADC представляют собой гетерогенные смеси, несущие различное количество лекарственных средств, прикрепленных в разных участках молекулы антитела.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение основано на удивительных выводах о том, что конъюгаты по данному изобретению являются сильнодействующими против различных CD123-экспрессирующих раковых клеток, в частности лейкемии с по меньшей мере одним отрицательным прогностическим фактором.

Один аспект изобретения предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который: (а) связывает эпитоп в пределах аминокислот от 101 до 346 человеческого CD123/IL3-Rα-антигена и (b) ингибирует IL3-зависимую пролиферацию в антиген-положительных клетках TF-1.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывают эпитоп в пределах аминокислот с 101 по 204 антигена CD123 человека. В другом варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывают эпитоп в пределах аминокислот с 205 до 346 антигена CD123 человека.

Родственный аспект изобретения обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который: (а) связывает эпитоп в пределах аминокислот от 1 до 100 антигена CD123 человека и (b) ингибирует IL3-зависимую пролиферацию в антиген-положительных клетках TF-1 с величиной IC₅₀ 0,1 нМ или менее (например, 0,08 нМ, 0,05 нМ, 0,03 нМ).

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует пролиферацию лейкемических стволовых клеток или лейкозных бластных клеток, но не гемопоэтических стволовых клеток.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с CD123 антиген-положительными клетками человека с константой диссоциации (K_d) 0,3 нМ или ниже, например, между 0,01 нМ и 0,3 нМ, между 0,01 нМ и 0,2 нМ, между 0,01 нМ и 0,19 нМ, между 0,01 нМ и 0,18 нМ, между 0,01 нМ и 0,15 нМ или между 0,01 нМ и 0,1 нМ.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с CD123 яванской макаки. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CD123 яванской макаки с K_d от 0,05 до 0,3 нМ, между 0,05 и 0,2 нМ, между 0,05 нМ и 0,19 нМ, между 0,05 нМ и 0,18 нМ, между 0,05 nM и 0,15 нМ или от 0,05 до 0,1 нМ. В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывают как CD123 человека, так и CD123 яванской макаки с по существу сходной аффинностью связывания. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CD123 человека и яванской макаки с K_d от 0,05 до 0,3 нМ, между 0,05 и 0,2 нМ или от 0,05 до 0,1 нМ. K_d может быть измерена с помощью проточной цитометрии, поверхностным плазмонным резонансом или радиоиммуноанализом.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует по меньшей мере 50% IL3-зависимой пролиферации в антиген-положительных клетках TF-1 в концентрации 0,5 нМ или ниже.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи или его фрагмент, содержащий три последовательных определяющих комплементарность областей (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где за исключением 1, 2 или 3 консервативных аминокислотных замещений, CDR1 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, 5 и 12, CDR2 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, 3, 6-10,13 и 14 и, необязательно, CDR3 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 4, 11, 15 и 70; и b) по меньшей мере один вариабельный участок легкой цепи или его фрагмент, содержащий три последовательных определяющих комплементарность областей (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где, за исключением 1, 2 или 3 консервативных аминокислотных замен, CDR1 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 16, 19, 20, 23 и 72, CDR2 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 17, 21, 24 и 71 и, необязательно, CDR3 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 18, 22 и 25.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи или его фрагмент, содержащий три последовательных определяющих комплементарность областей (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где за исключением 1, 2 или 3 консервативных аминокислотных замещений, CDR1 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, 5 и 12, CDR2 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, 3, 6-10, 13 и 14 и, необязательно, CDR3 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 4, 11 и 15; и b) по меньшей мере один вариабельный участок легкой цепи или его фрагмент, содержащий три последовательных определяющих комплементарность областей (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где, за исключением 1, 2 или 3 консервативных аминокислотных замен, CDR1 выбран из группы, состоящей ro.SEQ ID NO: 16, 19, 20 и 23, CDR2 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 17, 21 и 24 и, необязательно, CDR3 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 18, 22 и 25.

В некоторых вариантах реализации консервативные аминокислотные замены включают замещение по меньшей мере одного лизина в CDR на аргинин.

В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой гуманизированное антитело с CDR-присоединением, содержащее мышиные CDR-области, и где один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) остатков верньевой зоны области тяжелой цепи и/или легкой цепи каркасной области указанного антитела имеют мышиное происхождение.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 или 40; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах реализации Хаа, второй остаток из N-конца SEQ ID NO: 34, представляет собой Phe. В других вариантах реализации Хаа представляет собой Val.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 или 40, за исключением того, что N-концевой остаток представляет собой Ser; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59 или 60, за исключением того, что N-концевой остаток представляет собой Ser, и за исключением того, что остаток, соответствующий 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54 представляет собой Cys (т.е. Cys в позиции 442 по нумерации EC/OU); и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59 или 60, за исключением того, что остаток, соответствующий 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54 представляет собой Cys; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41, за исключением того, что N-концевой остаток представляет собой Ser.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах реализации Хаа, второй остаток из N-конца SEQ ID NO: 38, 34, 56 и 54 представляет собой Phe. B других вариантах реализации Хаа представляет собой Val.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59 или 60, за исключением того, что остаток, соответствующий 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54 представляет собой Cys; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах реализации Хаа, второй остаток из N-конца SEQ ID NO: 54 или 56, представляет собой Phe. В других вариантах реализации Хаа представляет собой Val.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или 3, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 или 10 и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19 или 20, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13 или 14, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) последовательность V_H, по меньшей мере, на 95% идентичную эталонной V_H последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (предпочтительно 26, 28, 30, 32, 34 и 38); и/или b) последовательность V_L, по меньшей мере, на 95% идентичную эталонной V_L последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (предпочтительно 27, 29, 31, 35 и 37). В некоторых вариантах реализации последовательность V_H по меньшей мере на 99% идентична одной из SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (предпочтительно 26, 28, 30, 32, 34 и 38) и/или где последовательность V_L по меньшей мере на 99% идентична одной из SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (предпочтительно 27, 29, 31, 35 и 37). В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: а) последовательность V_H, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (предпочтительно 26, 28, 30, 32, 34 и 38); и/или b) последовательность V_L, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (предпочтительно 27, 29, 31, 35 и 37). В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать V_H последовательность SEQ ID NO: 26 и V_L последовательность SEQ ID NO: 27, или V_H последовательность SEQ ID NO: 28 и V_L последовательность SEQ ID NO: 29, или V_H последовательность SEQ ID NO: 30 и V_L последовательность SEQ ID NO: 31, или V_H последовательность SEQ ID NO: 34 и V_L последовательность SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой мышиное, не относящегося к человеку млекопитающего, химерное, гуманизированное или человеческое антитело. Например, гуманизированное антитело может быть антителом с CDR-присоединением или антителом с измененной поверхностью. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах реализации его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, Fab', F(ab')₂, F_d, одноцепочечный Fv или scFv, связанный дисульфидным мостиком F_v, V-NAR-домен, IgNar, интратело, IgGΔCH₂, мини-антитело, F(ab')₃, тетратело, триатело, диатело, однодоменное антитело, DVD-Ig, Fcab, mAb₂, (scFv)₂ или scFv-Fc.

Другим аспектом изобретения является полипептид, содержащий последовательности V_H и V_L любого из антител субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент. Полипептид может быть слит с белком, который не является токсином псевдомонад.

Другим аспектом изобретения является клетка, продуцирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или полипептид по изобретению.

Другим аспектом изобретения является способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или полипептида по изобретению, включающий: (а) культивирование клеток по изобретению; и (b) выделение антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или полипептида из культивируемой клетки. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой эукариотическую клетку.

Другим аспектом изобретения является иммуноконъюгат, имеющий следующую формулу:

в которой:

СВА представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или его полипептид по изобретению, ковалентно связанный через остаток лизина с Cy^L1;

W_L представляет собой целое число от 1 до 20; а также

Cy^L1 представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -Н или (С₁-С₄)алкил; а когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н или аминозащитную группу, a Y представляет собой -ОН или -SO₃M;

W' представляет собой

представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

R^x3 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

L' представлен следующей формулой:

-NR₅-P-C(=O)-(CR_aR_b)_m-C(=O)- (В1'); или

-NR₅-P-C(=O)-(CR_aR_b)_m-S-Z^s1- (В3');

R₅ представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил;

Р представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

R_a и R_b, каждый независимо друг от друга, представляют собой -Н, (С₁-С₃)алкил или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q;

m представляет собой целое число от 1 до 6; а

Z^s1 выбирается из любой из следующих формул:

в которой:

q представляет собой целое число от 1 до 5; а

М представляет собой Н⁺ или катион.

В некоторых вариантах реализации R_a и R_b оба являются Н; и R₅ представляет собой Н или Me.

В некоторых вариантах реализации Р представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков. Например, Р может быть выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитpo-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. В некоторых вариантах реализации, P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В некоторых вариантах реализации, Q представляет собой -SO₃M.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где W_L представляет собой целое число от 1 до 10; двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -Н; и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н, a Y представляет собой -ОН или -SO₃M.

Соответствующий аспект обеспечивает иммуноконъюгат, имеющий формулу:

в которой:

СВА представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или его полипептид по изобретению, который ковалентно связан с Cy^L2 через остаток лизина;

W_L представляет собой целое число от 1 до 20; а также

Cy^L2 представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

R^x1 и R^x2 независимо представляют собой (С₁-С₆)алкил;

R^e представляет собой -Н или (С₁-С₆)алкил;

W' представляет собой

представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

Z^s1 выбирается из любой из следующих формул:

в которой:

q представляет собой целое число от 1 до 5; а

М представляет собой -Н+или катион.

В некоторых вариантах реализации R^e представляет собой Н или Me; R^x1 и R^x2 независимо -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, где R^f и R^g каждый независимо представляет собой -Н или (С₁-С₄)алкил; и р представляет собой 0, 1, 2 или 3.

В некоторых вариантах реализации R^f и R^g являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н и -Me.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

В некоторых вариантах реализации двойная линия между N и С представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой -Н. В некоторых вариантах реализации двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н, a Y представляет собой -SO₃M. B некоторых вариантах реализации М представляет собой Н⁺, Na⁺ или K⁺.

Другим связанным аспектом изобретения является иммуноконъюгат, имеющий формулу:

в которой:

СВА представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или полипептид по изобретению, который ковалентно связан с Cy^L3 через остаток Lys;

W_L представляет собой целое число от 1 до 20;

Cy^L3 представлен следующей формулой:

m' представляет собой 1 или 2;

R₁ и R₂ независимо представляют собой Н или (С₁-С₃)алкил; и

Z^s1 выбирается из любой из следующих формул:

в которой:

q представляет собой целое число от 1 до 5; а

М представляет собой Н⁺ или катион.

В некоторых вариантах реализации m' равно 1, и R₁ и R₂ оба являются Н. В некоторых других вариантах реализации m' равно 2, a R₁ и R₂ являются как Me.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где W_L представляет собой целое число от 1 до 10.

В некоторых вариантах реализации М представляет собой Н⁺, Na⁺ или K⁺. Другим аспектом изобретения является иммуноконъюгат, имеющий следующую формулу:

в которой:

СВА представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или его полипептид по изобретению, ковалентно связанный с группой J_CB';

W_S представляет собой 1, 2, 3 или 4;

J_CB' представляет собой фрагмент, образованный взаимодействием альдегидной группы, полученной в результате окисления 2-гидроксиэтиламиновый фрагмент (где 2-гидроксиэтиламиновый фрагмент может быть частью серина, треонина, гидроксилизина, 4-гидроксиорнитин или 2,4-диамино-5-гидроксивалериановой кислоты) на N-конце указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или его полипептида по изобретению, и альдегидной реакционноспособной группы на Cy^s1 и представлена следующей формулой:

где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с СВА; и s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с Cy^s1;

Cy^s1 представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -Н или (С₁-С₄)алкил; и когда он представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н или защищающий амин фрагмент, Y представляет собой -ОН или -SO₃M, а М представляет собой Н⁺ или катион;

R₅ представляет собой -Н или (C₁-С₃)алкил;

Р представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

Z_d1 отсутствует, -C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O)-;

R₉ представляет собой -Н или (C₁-С₃)алкил;

R_a и R_b для каждого случая являются независимо -Н, (C₁-С₃)алкилом или заряженным заместителем или ионизируемой группой Q;

r и r' независимо представляют собой целое число от 1 до 6;

W' представляет собой

представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

R^x3 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

L представляет собой -NR₉-(CR_aR_b)_r'' или отсутствует; и

r'' представляет собой целое число от 0 до 6.

Для простоты в каждом случае ниже, показывая Ser как N-концевой остаток, следует понимать, что другая часть 2-гидроксиэтиламина как часть серина, треонина, гидроксилизина, 4-гидроксиорнитин или 2,4-диамино-5-гидрокси валериановой кислоты, рассматривается, где это применимо, особенно в отношении Thr.

В некоторых вариантах реализации R_a и R_b оба являются Н, и R₅ и R₉ оба являются Н или Me.

В некоторых вариантах реализации Р представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков. Например, Р может быть выбран из группы, состоящей из:Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. В некоторых вариантах реализации, P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala. В некоторых вариантах реализации, Q представляет собой -SO₃M.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

Другим аспектом изобретения является иммуноконъюгат, имеющий следующую формулу:

в которой:

СВА представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или его полипептид по изобретению, ковалентно связанный с группой J_CB',

J_CB' представляет собой фрагмент, образованный взаимодействием альдегидной группы, полученной в результате окисления 2-гидроксиэтиламина, на N-конце указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или его полипептида по изобретению и альдегидной реакционноспособной группой на Cy^s2 и представлена следующей формулой:

где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с СВА; и s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с Cy^s2;

Cy^s2 представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

М представляет собой Н⁺ или катион;

R^x1 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

R^e представляет собой -Н или (С₁-С₆)алкил;

W' представляет собой

представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

R^x2 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

L₁ представлен следующей формулой:

в которой:

s3 представляет собой сайт, ковалентно связанный с группой J_CB';

s4 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -S- группой на Cy^s2;

Z_a2 отсутствует, -C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O)-;

R₉ представляет собой -Н или (C₁-С₃)алкил;

Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;

R_a1, R_a2, R_a3, R_a4, для каждого случая, независимо представляют собой Н или (C₁-С₃)алкил; а также

q1 и r1 каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10, при условии, что q1 и r1 не равны 0.

В некоторых вариантах реализации -L₁- представляет собой следующую формулу:

или ее фармацевтически приемлемую соль, где R представляет собой Н или -SO₃M.

В некоторых вариантах реализации R^e представляет собой Н или Me; и R^x1 представляет собой -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, a R^x2 представляет собой -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, где R^f и R^g каждый независимо представляют собой -Н или (C₁-С₄)алкил; и р равно 0, 1, 2 или 3. В некоторых вариантах реализации R^f и R^g являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н и -Me.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

В некоторых вариантах реализации двойная линия между N и С представляет собой двойную связь, Х отсутствует и Y представляет собой -Н.

В некоторых вариантах реализации двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, Х представляет собой -Н, а Y представляет собой -SO₃M. B некоторых вариантах реализации М представляет собой H⁺, Na⁺ или K⁺.

Другим аспектом изобретения является иммуноконъюгат, имеющий следующую формулу:

в которой:

J_CB' представляет собой фрагмент, образованный взаимодействием альдегидной группы, полученной в результате окисления 2-гидроксиэтиламина, на N-конце указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или его полипептида по изобретению и альдегидной реакционноспособной группой на Cy^s3 и представлена следующей формулой:

где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с СВА; и s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с CY^s3;

Cy^s3 представлен следующей формулой:

в которой:

m' представляет собой 1 или 2;

R₁ и R₂, каждый независимо представляют собой Н или (С₁-С₃)алкил;

L₁ представлен следующей формулой:

в которой:

s3 представляет собой сайт, ковалентно связанный с группой J_CB';

s4 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -S- группой на Cy^s3;

Z_a2 отсутствует, -C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O)-;

R₉ представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил;

Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;

R_a1, R_a2, R_a3, R_a4, для каждого случая, независимо представляют собой Н или (С₁-С₃)алкил; а также

q1 и r1 каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10, при условии, что q1 и r1 не равны 0.

В некоторых вариантах реализации m' равно 1, a R₁ и R₂ оба являются Н. В некоторых вариантах реализации m' равно 2 и R₁ и R₂ оба являются Me.

В некоторых вариантах реализации -L₁- представляет собой следующую формулу:

или ее фармацевтически приемлемую соль, где R представляет собой Н или -SO₃M и М представляет собой Н⁺ или катион.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью; где DM представлен следующей формулой:

Другим аспектом изобретения является иммуноконъюгат, имеющий следующую формулу:

в которой:

J_CB' представляет собой фрагмент, образованный взаимодействием альдегидной группы, полученной в результате окисления 2-гидроксиэтиламина, на N-конце указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или его полипептида по изобретению, и альдегидной реакционноспособной группой на Cy^s4 и представлена следующей формулой:

где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с СВА; и s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с Cy^s4;

Cy^s4 представлен следующей формулой:

L₁' представляется следующей формулой:

в которой:

s3 представляет собой сайт, ковалентно связанный с группой группы J_CB';

s4 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -NMe-группой на Cy^s4;

Z_b1 и Z_b2 оба отсутствуют, или один из Z_b1 и Z_b2 отсутствует, а другой представляет собой -СН₂-О- или -О-CH₂-;

Z_b1' и Z_b2' каждый независимо друг от друга отсутствуют, -СН₂-O-, -O-CH₂-, -NR₉-C(=O)-CH₂- или -CH₂-C(=O)-NR₉-;

R₉ представляет собой Н или (С₁-С₃)алкил;

n1 и m1 каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 6;

один из E₁ и Е₂ представляет собой -С(=O)-, а другой -NR₉-; или один из E₁ и Е₂ представляет собой -С(=O)- или -NR₉-, а другой отсутствует;

Р представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков; а также

R_b1, R_b2, R_b3, R_b4, R_b5 и R_b6, для каждого случая, каждый независимо

представляет собой Н или (С₁-С₃)алкил.

В некоторых вариантах реализации R_b1, R_b2, R_b3, R_b4, R_b5 и R_b6 являются все Н. В некоторых вариантах реализации R₉ представляет собой Н.

В некоторых вариантах реализации Z_b1' и Z_b2' оба отсутствуют; или Z_b1' представляет собой -СН₂-O-; и Z_b2' отсутствует; или Z_b1' представляет собой -СН₂-С(=O)-NR₉-; и Z_b2' представляет собой -O-СН₂- или отсутствует.

В некоторых вариантах реализации Р представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков. Например, Р может быть выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. B некоторых вариантах реализации, Р представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala и D-Ala-D-Ala.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где DM представлен следующей структурной формулой:

Другим аспектом изобретения является иммуноконъюгат, представленный следующей формулой:

в которой:

СВА представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или его полипептид по изобретению, ковалентно связанный с Су^C1через остаток цистеина;

W_C представляет собой 1 или 2;

Cy^C1 представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она является двойной связью, Х отсутствует и Y представляет собой -Н или (С₁-С₄)алкил; и когда он представляет собой одинарную связь, Х представляет собой -Н или защищающий амин фрагмент, Y представляет собой -ОН или -SO₃M, а М представляет собой H⁺ или катион;

R₅ представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил;

Р представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

R_a и R_b для каждого случая являются независимо -Н, (С₁-С₃)алкилом или заряженным заместителем или ионизируемой группой Q;

W' представляет собой -NR^e',

R^e' представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

R^x3 представляет собой (С₁-С₆)алкил; и

L_C представлен s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с СВА, a s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -С(=O)- группой на Cy^C1; в которой:

R₁₉ и R₂₀, для каждого случая, независимо представляют собой -Н или (C₁-С₃)алкил;

m'' представляет собой целое число от 1 до 10; а

R^h представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил.

В некоторых вариантах реализации R_a и R_b оба являются Н; и R₅ представляет собой Н или Me.

В некоторых вариантах реализации Р представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков. Например, Р может быть выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. B некоторых вариантах реализации, Р представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala. B некоторых вариантах реализации, Q представляет собой -SO₃M.

В некоторых вариантах реализации R₁₉ и R₂₀ оба представляют собой Н; и m'' является целым числом от 1 до 6.

В некоторых вариантах реализации -L_C- представляет собой следующую формулу:

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

Другим аспектом изобретения является иммуноконъюгат, представленный следующей формулой:

в которой:

СВА представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или его полипептид по изобретению, ковалентно связанный с Cy^C2через остаток цистеина;

W_C представляет собой 1 или 2;

Cy^C2представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

R^x1 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

R^e представляет собой -Н или (С₁-С₆)алкил;

W' представляет собой -NR^e';

R^e' представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

R^x2 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

L_C' представлен следующей формулой:

в которой:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с СВА, a s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -S- группой на Cy^C2;

Z представляет собой C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O);

Q представляет собой -Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;

R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ для каждого случая являются независимо -Н или (C₁-С₃) алкилом;

q и r, для каждого случая, независимо представляют собой целое число от 0 до 10;

m и n каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10;

R^h представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил; а также

Р' представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах реализации Р' представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков. Например, Р' может быть выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57). Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. B некоторых вариантах реализации, Р' представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В некоторых вариантах реализации в иммуноконъюгате -L_C' представляет собой следующую формулу:

В некоторых вариантах реализации R^e представляет собой Н или Me; R^x1представляет собой -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, а R^x2 представляет собой -(СН₂)_р-(CR^fR^g)-, где R^f и R^gкаждый независимо представляет собой -Н или (С₁-С₄)алкил; и р равно 0, 1, 2 или 3. В некоторых вариантах реализации R^f и R^g являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н и -Me.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

Другим аспектом изобретения является иммуноконъюгат, имеющий следующую формулу:

в которой:

СВА представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или его полипептид по изобретению, ковалентно связанный с Cy^C3через остаток цистеина;

W_C представляет собой 1 или 2;

Cy^C3представлен следующей формулой:

в которой:

m' представляет собой 1 или 2;

R₁ и R₂, каждый независимо представляют собой -Н или (С₁-С₃)алкил;

L_C' представлен следующей формулой:

в которой:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с СВА, a s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -S- группой на Cy^C3;

Z представляет собой C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O);

Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;

R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ для каждого случая являются независимо -Н или (C₁-С₃) алкилом;

q и r, для каждого случая, независимо представляют собой целое число от 0 до 10;

m и n каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10;

R^h представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил; а также

Р' представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах реализации Р' представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков. Например, Р' выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. B некоторых вариантах реализации, Р' представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В некоторых вариантах реализации -L_C' представляет собой следующую формулу:

где М представляет собой Н⁺ или катион.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где DM представляет собой фрагмент лекарственного средства, представленный следующей формулой:

Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или полипептид по изобретению или иммуноконъюгат по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Другим аспектом изобретения является способ ингибирования роста клеточной экспрессии CD123, включающий контактирование клетки с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по изобретению или полипептидом по изобретению или с иммуноконъюгатом по изобретению или фармацевтическая композиция по изобретению.

В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой клетку опухоли. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой лейкемическую клетку или клетку лимфомы.

Другим аспектом изобретения является способ лечения субъекта, имеющего опухоль, у которого клетки опухоли экспрессируют CD123, способ включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, или полипептида по изобретению, или иммуноконъюгата по изобретению, или фармацевтической композиции по изобретению.

В некоторых вариантах реализации раковое или клеточно-пролиферативное расстройство представляет собой лейкемию или лимфому. В некоторых вариантах реализации раковое или клеточно-пролиферативное расстройство выбрано из группы, состоящей из острой миелоидной лейкемии (ОМЛ); хронической миелоидной лейкемии (ХМЛ); острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), включая острый лимфобластный лейкоз В-клеточной линии (В-ОЛЛ); хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ); лейкоза ворсистых клеток (ВКЛ); миелодиспластического синдрома; основного плазмоцитоидного DC-новообразования (BPDCN) лейкемии; неходжкинских лимфом (НХЛ), включая лимфому мантийных клеток; и лейкемии Ходжкина (ЛХ). В некоторых вариантах реализации рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). В некоторых вариантах реализации рак представляет собой В-клеточный острый лимфобластный лейкоз (В-ОЛЛ).

Другим аспектом изобретения является способ лечения клеточно-пролиферативного расстройства у субъекта, где клетки клеточно-пролиферативного расстройства экспрессируют CD123, причем способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, или полипептида по изобретению, или иммуноконъюгата по изобретению, или фармацевтической композиции по изобретению, в количестве, достаточном для лечения указанного клеточно-пролиферативного расстройства.

Предполагается, что любой один вариант реализации, описанный в данном документе, в том числе описанный только в одном аспекте изобретения (но не в других или не в других повторяющийся) и описанный только в примерах, может быть объединен с любым одним или несколькими другими вариантами реализации данного изобретения, если явно не отклонено или неприменимо.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

ФИГ. 1 показывает ингибирование IL-3-зависимой пролиферации клеток TF-1 химерным СВ123-6-антителом (chCD123-6) и его huCD123-6 антителами с CDR-присоединением (huCD123-6Gv4.6 и huCD123-6Gv4.7).

ФИГ. 2А и 2В демонстрируют, что три мышиных анти-CD123 антитела (muCD123-3, -6 и -14) ингибируют IL-3-зависимую пролиферацию клеток TF-1 по меньшей мере также как и 7G3. ФИГ. 2А показывает ингибирование клеток TF-1, культивируемых в присутствии IL-3 (1 нг/мл) различными анти-CD123 антителами, включая CD123-связывающие контрольные антитела 7G3, 6Н6 и 9F5. ФИГ. 2В показывает ингибирование клеток TF-1, культивируемых в присутствии GM-CSF (2 нг/мл) с помощью тех же анти-CD123 антител.

ФИГ. 3 демонстрирует, что мышиные анти-CD123 антитела muCD123-3, -6 и -14 ингибируют IL-3 (1 нг/мл) зависимую пролиферацию клеток TF-1 дозозависимым образом и в большей степени, чем 7G3 антитела. muCD123-16 является негативным контролем анти-CD123 антителом, которое связывает CD123, но не ингибирует IL-3-зависимую пролиферацию клеток TF-1.

ФИГ. 4А и 4В демонстрируют, что мышиные антитела muCD123-3, -6 и -14 антитела имеют более высокую аффинность связывания с CD123-положительными ОМЛ-клетками, чем антитела 7G3 в CD123-экспрессирующих TF-1 (ФИГ. 4А) и HNT-34 (ФИГ. 4В) клетках.

ФИГ. 5А и 5В демонстрируют, что химерные анти-CD-123 антитела chCD123-3, -6 и -14 сохраняют высокую аффинность связывания их мышиных аналогов с использованием либо клеток HNT-34 (фиг. 5А) или CD123-положительной клеточной линии миелоидной лейкемии (ОМЛ) MOLM-13 (фиг. 5В). Химерное антитело chKTI, которое не связывает CD123, было включено как отрицательный контроль.

ФИГ. 6 демонстрирует, что химерные антитела против CD-123 chCD123-3, -6 и -14 сохраняют функциональную активность их мышиных аналогов, о чем свидетельствует их способность ингибировать IL-3-зависимую пролиферацию клеток TF-1. Нефункциональное химерное анти-CD123 антитело (chCD123-18), которое связывает CD123, но не ингибирует IL-3-зависимую пролиферацию клеток TF-1, было включено как отрицательный контроль.

ФИГ. 7А демонстрирует, что мышиные (muCD123-6), химерные (chCD123-6) и антитела с CDR-присоединением huCD123-6 (huCD123-6Gv4.7S2 и huCD123-6Gv4.7S3) имеют более высокую аффинность, чем 7G3 в CD123-экспрессирующих HNT -34 клетках. Химерное антитело chKTI, которое не связывает CD123, было включено как отрицательный контроль. ФИГ. 7В и 7С демонстрируют, что конъюгирование huCD123-6Gv4.7S3 или -Gv4.7 антитела к D1 или D2 соединениям через Lys-, Ser- или Cys-связь только умеренно влияет аффинность связывания этих ADC конъюгатов, т.е. Ser-связанное huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-sD1 (см. структуру на фиг. 17) и huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-D8, и Lys-связанное huCD123-6Gv4.7S3-sSPDB-D1 и huCD123-6Gv4.7S3-D2 на Фиг. 7В; и Cys-связанное huCD123-6Gv4.7-CysMab-D4 и huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 на фиг. 7С. На ФИГ. 7С, неконъюгированное антитело huCD123-6Gv4.7 имеет последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 54, в котором Хаа является Val. Конъюгаты с «S3-SeriMab» имеют цитотоксиновую (в данном случае соединения индолинобензодиазепина или «IGN» в данном документе далее) связь через окисленный N-концевой Ser на легкой цепи. Конъюгаты с «CysMab» имеют цитотоксиновую (в данном случае, соединения IGN) связь через модифицированый Cys в тяжелой цепи (то есть, Cys, соответствующий 5-му последнему Cys в SEQ ID NO: 54).

ФИГ. 8А демонстрирует, что химерные (chCD123-6) и антитела с CDR-присоединением (huCD123-6Gv4.7S2 и huCD123-6GS4.7S3) huCD123-6 ингибируют IL-3-зависимую пролиферацию TF-1-клеток лучше, чем антитела 7С3. Ингибирование зависит от IL-3, поскольку эти антитела не оказывают ингибирующего эффекта, когда клетки выращивают в присутствии GM-CSF (фиг. 8В).

ФИГ. 9А показывает экспрессионные конструкции внеклеточного домена IL-3Rα (CD123) и химерных рецепторных белков, содержащих домены IL-3Rα (серый) и GMRα (белый). ФИГ. 9В демонстрирует, что антитело CD123-6 связывается в первую очередь с CRM-доменом IL-3Rα (остатки 101-306). ФИГ. 9С демонстрирует, что антитело CD123-3 связывается в первую очередь с CRM-доменом IL-3Rα (остатки 101-306). ФИГ. 9D демонстрирует, что антитело CD123-14 связывается исключительно с N-концевым доменом IL-3Rα (остатки 1-100). ФИГ. 9Е демонстрирует, что антитело 7G3 связывается исключительно с N-концевым доменом IL-3Rα (остатки 1-100). ФИГ. 9F демонстрирует, что антитело 6Н6 связывается исключительно с N-концевым доменом IL-3Rα (остатки 1-100). ФИГ. 9G демонстрирует, что антитело 9F5 связывается исключительно с N-концевым доменом IL-3Rα (остатки 1-100).

ФИГ. 10 демонстрирует, что конъюгат майтансиноид DM1 антитела huCD123-6Rv1.1 с измененной поверхностью, huCD123-6Rv1.1-CX1-1-DM1, проявляет дозозависимую цитотоксичность на не зависящей от фактора роста CD123-экспрессирующей линии клеток ОМЛ OCI-AML4. Цитотоксичность является CD123-зависимой, о чем свидетельствует способность избытка неконъюгированного антитела huCD123-6 (500 нМ) блокировать цитотоксичность.

ФИГ. 11А демонстрирует in vitro цитотоксичность различных лизинсвязанных конъюгатов huCD123-6Rv1.1-IGN с измененной поверхностью на нескольких CD123-положительных злокачественных клеточных линиях различного происхождения.

ФИГ. 11В демонстрирует in vitro цитотоксичность различных конъюгатов huCD123-6-IGN связанных с лизином или цистеином на нескольких CD123-положительных клеточных линиях В-ОЛЛ. Несвязывающие конъюгаты на основе антител к KTI включают в качестве негативных контролей.

ФИГ. 11C демонстрирует, что различные соединения Lys или Cys-связанные IGN являются высокоактивными на P-gp (Р-гликопротеин) положительных линиях ОМЛ-клеток Kasumi-3 и MOLM-1. Контрольные кривые с открытыми точками данных производятся в присутствии избыточных неконъюгированных совпадающих антител huCD123.

ФИГ. 11D демонстрирует, что почти все различные конъюгаты Lys- или Cys-связанного CD123-IGN по изобретению убивают 90% ОМЛ клеток-предшественников из 9 образцов пациентов с ОМЛ в концентрациях нМ или суб-нМ.

ФИГ. 11Е демонстрирует, что Cys-связанный конъюгат huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 убивает нормальные клетки крови в концентрациях, которые являются в >100 раз выше, чем те, которые необходимы для уничтожения предшественников ОМЛ. Для сравнения, Mylotarg не проявляет такого преимущественного убийственного эффекта.

ФИГ. 12А и 12В показывают in vitro цитотоксичность различных лизинсвязанных конъюгатов huCD123-6Rv1.1-IGN на первичных клетках от пациентов с ОМЛ. Результат типичного анализа КОЕ для одного первичного образца пациента представлен на фиг. 12А. ФИГ. 12В отображает значения IC₉₀ для всех образцов пациентов ОМЛ, обработанных конъюгатами.

ФИГ. 13А-13С демонстрируют, что конъюгат IGN CysMab huCD123-6 (huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5, сплошной черный круг), по меньшей мере, так же активен, как лизиновый конъюгат (huCD123-6Gv4.6-D2, сплошной черный квадрат) того же антитела по отношению к линии клеток ОМЛ EOL-1 (фиг. 13А), линии клеток В-ОЛЛ KOPN-8 (Фиг. 13В), линии клеток ХМЛ MOLM-1 (Фиг. 13С). Пунктирные кривые, соединяющие открытые точки данных на каждой фигуре, представляют активность соответствующих конъюгатов (т.е. открытый круг для huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5 и открытый квадрат для huCD123-6Gv4.6-D2) в присутствии блокирующей концентрации (500 нМ) неконъюгированного антитела chCD123-6.

ФИГ. 14А-14С демонстрируют, что SeriMab huCD123-6 (huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8, сплошной черный круг), по меньшей мере, так же активен, как лизиновый конъюгат (huCD123-6Rv1.1-D2, сплошной нисходящий черный треугольник) одного и того же антитела в клеточных линиях ОМЛ SHI-1 (фиг. 14А) и HNT-34 (ФИГ. 14В), также как линии клеток ХМЛ MOLM-1 (Фиг. 14С). Пунктирные кривые, соединяющие открытые точки данных на каждой фигуре, представляют активность соответствующих конъюгатов (т.е. открытый круг для huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8 и открытый квадрат для huCD123-6Rv1.1-D2) в присутствии блокирующей концентрации (500 нМ) неконъюгированного антитела huCD123-6.

ФИГ. 15 показывает схематический рисунок, демонстрирующий общие этапы, которые могут быть использованы для синтеза конъюгата по изобретению, имеющего Ser-связь.

ФИГ. 16 показывает схематический рисунок, демонстрирующий общие этапы, которые могут быть использованы для синтеза конъюгата по изобретению, имеющего Ser-связь.

ФИГ. 17 показывает схематический рисунок, демонстрирующий общие этапы, которые могут быть использованы для синтеза конъюгата по изобретению, имеющего Ser-связь.

ФИГ. 18 демонстрирует, что Cys-связанный конъюгат huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 обладает более высокой активностью, чем гемтузумаб озогамицин (GO) (также известный как Mylotarg) в образцах пациентов, не выбранных из ОМЛ.

ФИГ. 19 демонстрирует, что Cys-связанный конъюгат huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 убивает нормальные клетки-предшественники в концентрациях, которые являются в >100 раз выше, чем те, которые необходимы для уничтожения предшественников ОМЛ. Для сравнения, Mylotarg и huCD123-6G4.7-CysMab-D5' (ADC ДНК-кросс-линкера D5') не проявляют такого преимущественного эффекта убийства.

ФИГ. 20 демонстрирует эффективность in vivo конъюгатов CD123-IGN в подкожной мышиной модели ОМЛ MV4-11.

ФИГ. 21 демонстрирует, что Cys-связанный конъюгат huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 очень активен на различных CD123-позитивных линиях ОМЛ-клеток с плохими прогностическими факторами.

ФИГ. 22 показывает in vivo визуализацию биолюминесценции мышей, обработанных конъюгатом huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5, по сравнению с мышами, обработанными наполнителем и контролем на 26-й день. Лечение конъюгатом значительно снижает опухолевую нагрузку у мышей.

ФИГ. 23 показывает обработку удлиненным конъюгатом huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 у 6/6 мышей по сравнению с мышами, получавшими наполнитель и контроль.

ФИГ. 24 демонстрирует, что инкубация клеток MV4-11 с конъюгатом huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 приводит к повреждению ДНК, остановке в S-фазе клеточного цикла и опосредованной апоптозом клеточной гибели.

ФИГ. 25 показывает in vivo эффективность конъюгатов CD123-IGN в генерализованной модели ОМЛ Molm-13.

ФИГ. 26 показывает in vivo эффективность конъюгатов CD123-IGN в подкожной модели EOL-1.

ФИГ. 27 показывает in vivo эффективность конъюгатов huCD123 -CysMab-D5 в различных дозах в подкожной модели EOL-1.

ФИГ. 28 показывает in vivo эффективность конъюгата huCD123-CysMab-D5 по сравнению с соответствующей свободной лекарственной формой полезной нагрузки (FGN849 или D5), голым антителом, контролем, цитарабином и азацитидином в подкожной модели EOL-1.

ФИГ. 29 показывает in vivo эффективность конъюгатов CD123-IGN в генерализованной модели ОМЛ MV4-11.

ФИГ. 30 показывает in vivo эффективность конъюгатов CD123-IGN в подкожной модели ОМЛ MV4-11.

ФИГ. 31 демонстрирует, что обработка конъюгатом huCD123-CysMab-D5 удлиненяет выживаемость у мышей по сравнению с мышами, получавшими наполнитель и контроль.

ФИГ. 32 показывает in vivo переносимость конъюгатов huCD123-CysMab-D5 и huCD123-SeriMab-sD1 у мышей.

ФИГ. 33 показывает in vivo переносимость конъюгата huCD123-лизин-связанного-D2 и huCD123-SeriMab-D2 у мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Определения

Чтобы облегчить понимание данного изобретения, ряд терминов и фраз определяется ниже.

Термины «человеческий IL-3Rα», «альфа рецептор Интерлейкина-3» или «CD123», используются в данном документе взаимозаменяемо, относятся к любому нативному (человеческому) IL-3Rα или CD123, если не указано иное. Белок CD123 представляет собой субъединицу гетеродимерного рецептора цитокинов, специфическую к интерлейкину-3 (рецептор IL-3 или IL-3R). IL-3R состоит из лиганд-специфической альфа-субъединицы и общей сигнальной трансдуцирующей бета-субъединицы (также известной как CD131), разделяемой рецепторами для интерлейкина 3 (IL3), колониестимулирующего фактора 2 (CSF2/GM-CSF) и интерлейкин 5 (IL5).Связывание CD123/IL-3Rα с IL3 зависит от бета-субъединицы. Бета-субъединица активируется связыванием лиганда и необходима для биологической активности IL3.

Все вышеуказанные термины для CD123 могут относиться к последовательности белка или нуклеиновой кислоты, как указано в данном документе. Термин «CD123/IL-3Rα» охватывает «полноразмерный» необработанный CD123/IL-3Rα, а также любую форму CD123/IL-3Rα, которая возникает в результате обработки внутри клетки. Этот термин также охватывает природные варианты белка или нуклеиновой кислоты CD123/IL-3Rα, например, сплайс варианты, аллельные варианты и изоформы. Описанные в данном документе полипептиды и полинуклеотиды CD123/IL-3Ra могут быть выделены из множества источников, таких как ткани человека или из другого источника, или получены рекомбинантными или синтетическими способами. Примеры последовательностей CD123/IL-3Rα включают (но не ограничиваются ими) номера NCBI NP_002174 и NM_002183 (последовательности белка и нуклеиновой кислоты для CD123 человека варианта 1) и NP_001254642 и NM_001267713 (последовательности белка и нуклеиновой кислоты для CD123 человека варианта 2).

Термин «антитело» означает молекулу иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинации вышеизложенного через, по меньшей мере, один сайт распознавания антигена в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Используемый в данном документе термин «антитело» охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv-фрагменты), одноцепочечные Fv (scFv) мутанты, мультиспецифические антитела такие как биспецифические антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, слитые белки, содержащие антиген-детерминирующую часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена, таким образом, что антитела проявляют желаемую биологическую активность. Антитело может быть любого из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), основанные на идентичности их константных доменов тяжелой цепи, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Различные классы иммуноглобулинов имеют разные и хорошо известные структуры субъединиц и трехмерные конфигурации. Антитела могут быть голыми или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и т.д.

В некоторых вариантах реализации антитело является неприродным антителом. В некоторых вариантах реализации антитело очищают от природных компонентов. В некоторых вариантах реализации антитело получают рекомбинантным путем. В некоторых вариантах реализации антитело получают с помощью гибридомы.

«Блокирующим» антителом или антителом «антагонистом» является такое антитело, которое ингибирует или уменьшает биологическую активность связываемого им антигена, такого как CD123/IL-3Rα. B определенном варианте реализации блокирующие антитела или антагонистические антитела практически или полностью ингибируют биологическую активность антигена. Желательно, чтобы биологическая активность снижалась на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100%.

Термин «анти-CD123 антитело», «антитело против IL-3Rα» или «антитело, которое (в частности) связывается с CD123/IL-3Rα» относится к антителу, которое способно связывать CD123/IL-3Rα с достаточной аффинностью так что антитело может использоваться в качестве диагностического и/или терапевтического средства при таргетировании CD123/IL-3Rα. Если не указано иное, степень связывания антитела против CD123/IL-3Rα с неродственным белком, не являющимся CD123/IL-3Rα, составляет около менее 10% от связывания антитела с CD123/IL-3Rα при измерении, например, радиоиммуноанализом (RIA). B некоторых вариантах реализации антитело, которое связывается с CD123/IL-3Rα, имеет константу диссоциации (K_d)≤0,5 нМ, ≤0,3 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,05 нМ или ≤0,01 нМ. В одном варианте реализации антитело против CD123/IL-3Rα не связывает с общей CD131 бета-цепью. В одном варианте реализации антитело против CD123/IL-3Rα не связывается с тем же эпитопом CD123, который связан известными и коммерчески доступными CD123-антителами, такими как 7G3 (мышиный IgG_2a), 6H6 (мышиный IgG₁) и 9F5 (мышиный IgG₁) (Sun et al., Blood 87 (1): 83-92, 1996).

Последовательности антител против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающих фрагментов по изобретению представлены в таблицах 1-6 ниже. Номенклатура для различных антител и иммуноконъюгатов по изобретению представлена отдельно ниже.

Термин «фрагмент антитела» относится к части интактного антитела и относится к антиген-детерминирующим вариабельным областям интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими. Fab, Fab', F(ab')₂ и F_v фрагменты, линейные антитела, одноцепочечные антитела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела включает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть выполнена некоторыми фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают (без ограничения): (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1 (например, антитело, расщепленное папаином, дает три фрагмента: два антигенсвязывающих Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент, который не связывает антиген); (ii) фрагмент F(ab')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области (например, антитело, расщепленное пепсином, дает два фрагмента: двухвалентный антигенсвязывающий F(ab')₂ фрагмент pFc', который не связывает антиген) и связанный с ним F(ab') одновалентный компонент; (iii) фрагмент F_d, состоящий из доменов V_H и C_H1 (т.е. той части тяжелой цепи, которая включена в Fab); (iv) фрагмент F_v, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела и связанного дисульфидным мостиком F_v; (v) фрагмент dAb (доменное антитело) или sdAb (однодоменное антитело) (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989), который состоит из домена V_H; и (vi) изолированную область определения комплементарности (CDR).

«Моноклональное антитело» относится к гомогенной популяции антител, участвующей в высокоспецифическом распознавании и связывании одной антигенной детерминанты или эпитопа. Это идет в противоположность с поликлональными антителами, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных антигенных детерминант. Термин «моноклональное антитело» включает как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, F_v), одноцепочечные (scFv) мутанты, слитые белки, содержащие антитела и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена. Кроме того, «моноклональное антитело» относится к таким антителам, полученным любым количеством способов, включая, но не ограничиваясь ими, с помощью гибридомы, выбора фагов, рекомбинантной экспрессии и трансгенных животных.

Термин «гуманизированное антитело» относится к формам нечеловеческих (например, мышиных) антител, которые представляют собой специфические цепи иммуноглобулина, химерные иммуноглобулины или их фрагменты, которые содержат минимальные нечеловеческие (например, мышиные) последовательности. Обычно гуманизированными антителами являются человеческие иммуноглобулины, в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) заменяются остатками CDR нечеловеческих видов (например, мыши, крысы, кролика, хомяка), которые имеют желаемую специфичность, сродство и функциональные возможности (Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988).

В некоторых случаях остатки F_v каркасного региона (FR) человеческого иммуноглобулина заменяются соответствующими остатками в антителе из нечеловеческих видов, которые имеют желаемую специфичность, сродство и функциональные возможности. Гуманизированное антитело может быть дополнительно модифицировано путем замещения дополнительных остатков либо в каркасной области F_v, и/или в замещенных нечеловеческих остатках для уточнения и оптимизации специфичности антител, аффинности и/или функциональных возможностей. В общем, гуманизированное антитело будет содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух или трех вариабельных доменов, содержащих все или практически все области CDR, которые соответствуют нечеловеческому иммуноглобулину, тогда как все или практически все области FR являются такими, как консенсусная последовательность иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может также содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина или домен (F_C), обычно иммуноглобулина человека. Примеры методов, используемых для создания гуманизированных антител, описаны в патентах США №№5225539 и 5639641, Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(3): 969-973, 1994; и Roguska et al., Protein Eng. 9(10): 895-904, 1996 (все включено в данном документе посредством ссылки). В некоторых вариантах реализации «гуманизированное антитело» представляет собой антитело с измененной поверхностью. В некоторых вариантах реализации «гуманизированное антитело» представляет собой антитело с CDR-присоединением.

«Вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или к вариабельной области тяжелой цепи антитела, либо отдельно, либо в комбинации. Вариабельные области тяжелой и легкой цепи состоят из четырех каркасных областей (FR), связанных тремя определяющими комплементарность областями (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости от FR и с CDR из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител. Существует как минимум два метода определения CDR: (1) подход, основанный на межвидовый вариабельности последовательностей (т.е. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al-lazikani et al., J. Molec. Biol. 273: 927-948, 1997). Кроме того, комбинации этих двух подходов иногда используются в данной области для определения CDR.

Система нумерации Kabat обычно используется для названия остатка в вариабельной области (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Нумерация аминокислот, как по Kabat, относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи для компиляции антител в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) (включенно в данном документе в качестве ссылки). Используя эту систему нумерации, фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать одну аминокислотную вставку (остаток 52а по Kabat) после остатка 52 из Н2 и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.д. в соответствии с Kabat) после остатка 82 тяжелой цепи FR. Kabat-нумерация остатков может быть определена для данного антитела путем выравнивания в областях гомологии последовательности антитела со «стандартной» нумерацией Kabat. Вместо этого Chothia ссылается на расположение структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987). Конец петли Chothia CDR-H1 при нумерации с использованием системы нумерации Kabat варьирует между Н32 и Н34 в зависимости от длины петли. Это связано с тем, что схема нумерации Kabat помещает вставки на Н35А и Н35В - если ни 35А, ни 35В не присутствует, петля заканчивается на 32; если присутствует только 35А, петля заканчивается на 33; если присутствуют оба 35А и 35В, петля заканчивается на 34. Гипервариабельные области AbM представляют собой компромисс между CDR по Kabat и структурными петлями по Chothia и используются программным обеспечением для моделирования антител AbM от Oxford Molecular.

Термин «человеческое антитело» означает антитело, продуцируемое человеком или антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую антителу, продуцируемому человеком, полученным с использованием любого метода, известного в данной области. В некоторых вариантах реализации человеческое антитело не имеет последовательности, отличной от человека. Это определение человеческого антитела включает интактные или полноразмерные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты.

Термин «химерные антитела» относится к антителам, в которых аминокислотная последовательность молекулы иммуноглобулина получена из двух или более видов. Как правило, вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей соответствует вариабельной области антител, полученных от одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика и т.д.) с желаемой специфичностью, сродством и функциональными возможностями, тогда как константные области гомологичны последовательностям в антителах, полученных из другого вида (обычно человека), чтобы избежать или уменьшить вероятность вызова иммунного ответа у этих видов (например, человека). В некоторых вариантах реализации химерные антитела могут включать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий по меньшей мере один полипептид тяжелой и/или легкой цепи человека, такой как, например, антитело, содержащее мышиную легкую цепь и полипептиды тяжелой цепи человека.

Термины «эпитоп» или «антигенная детерминанта» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к той части антигена, которая может быть распознана и специфично связана конкретным антителом. Когда антиген является полипептидом, эпитопы могут образовываться как из смежных аминокислот, так и из несмежных аминокислот, сопоставленных третичной укладкой белка. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, обычно сохраняются при денатурации белка, тогда как эпитопы, образованные путем третичной укладки, обычно теряются при денатурации белка. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3 и более обычно по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

«Аффинность связывания» обычно относится к силе суммарного количества нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антителом) и ее связывающим партнером (например, антигеном). Если не указано иное, как используется в данном документе, «аффинность связывания» относится к аффинности собственного связывания, которая отражает взаимодействие 1: 1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы Х для ее партнера Y обычно может быть представлена константой диссоциации (K_d) или полумаксимальной эффективной концентрацией (ЕС₅₀). Аффинность может быть измерена обычными методами, известными в данной области, включая описанные в данном документе. Низкоаффинные антитела обычно связывают антиген медленно и склонны легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно связывают антиген быстрее и имеют тенденцию оставаться связанными дольше. В данной области известны различные способы измерения аффинности связывания, любой из которых может быть использован для целей данного изобретения. Конкретные иллюстративные варианты реализации описаны в данном документе.

«Или лучше» при использовании в данном документе для обозначения аффинности связывания относится к более сильному связыванию между молекулой и ее связывающим партнером. «Или лучше» при использовании в данном документе относится к более сильному связыванию, представленному меньшим численным значением K_d. Например, антитело, которое имеет аффинность к антигену «0,3 нМ или лучше», сродство антитела к антигену составляет ≤0,3 нМ, например 0,29 нМ, 0,28 нМ, 0,27 нМ и т.д. или любое значение, равное или менее 0,3 нМ. В одном варианте реализации аффинность антитела, определяемая K_d, будет составлять от около 10^-3 до около 10^-12 М, между около 10^-6 до около 10^-11 М, между около 10^-6 до около 10^-10 М, от около 10^-6 до около 10^-9 М, от около 10^-6 до около 10^-8 М или от около 10^-6 до около 10^-7 М.

Под «специфическим связыванием» обычно подразумевается, что антитело связывается с эпитопом через его антигенсвязывающий домен и что связывание влечет за собой некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Согласно этому определению, антитело, как говорят, «специфически связывается» с эпитопом, когда оно связывается с этим эпитопом через его антигенсвязывающий домен более легко, чем оно связывается со случайным, неродственным эпитопом. Термин «специфичность» используется в данном документе для определения относительной аффинности, с которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, можно предположить, что антитело «А» имеет более высокую специфичность для данного эпитопа, чем антитело «В», или можно сказать, что антитело «А» связывается с эпитопом «С» с более высокой специфичностью, чем у соответствующего эпитопа «D».

В некоторых вариантах реализации антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению «специфически связывается» с антигеном CD123 тем, что он обладает более высокой связывающей специфичностью к антигену CD123 (от любых видов), чем к антигену CD123. В некоторых вариантах реализации антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению «специфически связывается» с антигеном CD123 человека тем, что он обладает более высокой связывающей специфичностью к антигену CD123 человека, чем антиген CD123 человека (например, мышь или крыса CD123).

Под «предпочтительным связыванием» подразумевается, что антитело специфически связывается с эпитопом более легко, чем оно связывается с соответствующим, аналогичным, гомологичным или аналогичным эпитопом. Таким образом, антитело, которое «предпочтительно связывается» с данным эпитопом, скорее всего связывается с этим эпитопом, чем с соответствующим эпитопом, хотя такое антитело может перекрестно реагировать с соответствующим эпитопом. Например, в некоторых вариантах реализации антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению «предпочтительно связывается» с человеческим CD123-антигеном, чем с CD123 мыши.

Говорят, что антитело «конкурентно ингибирует» связывание эталонного антитела с данным эпитопом, если оно предпочтительно связывается с этим эпитопом в той степени, в которой оно блокирует, до некоторой степени, связывание эталонного антитела с эпитопом. Конкурентоспособное ингибирование может быть определено любым способом, известным в данной области, например, конкурентным анализом ELISA-Можно сказать, что антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела с данным эпитопом по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 50%.

Фраза «практически аналогичная» или «практически такая же», как используется в данном документе, обозначает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (как правило, одна связана с антителом по изобретению, а другая связана с эталонным/сравнительным антителом) так что специалист в данной области техники рассмотрит разницу между этими двумя значениями, чтобы иметь мало или вообще не иметь биологической и/или статистической значимости в контексте биологических характеристик, измеренных указанными значениями (например, значениями K_d). Разница между указанными двумя значениями составляет менее около 50%, менее около 40%, менее около 30%, менее около 20% или менее около 10% в зависимости от значения для эталонного/сравнительного антитела.

Полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которая является «выделенной», представляет собой полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку или композицию, которая находится в форме, не обнаруженной в природе. Выделенные полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции включают те, которые были очищены до такой степени, что они больше не находятся в форме, в которой они обнаружены в природе. В некоторых вариантах реализации выделенное антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция являются выделенными практически чистыми.

Используемый в данном документе термин «практически чистый» относится к материалу, который является по меньшей мере на 50% чистым (т.е. свободным от загрязнений), по меньшей мере на 90% чистым, по меньшей мере на 95% чистым, по меньшей мере на 98% чистым или по меньшей мере на 99% чистым.

Используемый в данном документе термин «иммуноконъюгат», «конъюгат» или «ADC» относится к соединению или его производному, которое связано с агентом, связывающим клетку (т.е. с анти-CD123/IL-3Rα-антителом или его фрагментом) и определяется общей формулой: А-L-С, где С = цитотоксин, L = линкер и А = агент, связывающий клетки (АСК), такой как антитело против CD123/IL-3Rα или фрагмент антитела. Иммуноконъюгаты также могут быть определены общей формулой в обратном порядке: C-L-A.

«Линкер» представляет собой любой химический фрагмент, который способен связывать соединение, обычно лекарственное средство, такое как цитотоксический агент, описанный в данном документе (например, майтансиноид или соединения IGN (индолинобензодиазепин)) с агентом, связывающим клетку, таким как анти-CD123/IL-3Rα или его фрагмент стабильным, ковалентным образом. Линкеры могут быть подвержены или быть практически устойчивыми к вызванному кислотой расщеплению, индуцированному светом расщеплению, расщеплению, вызванному пептидазой, расщеплению, вызванному эстеразой, и расщеплению дисульфидной связи в условиях, когда соединение или антитело остаются активными. Подходящие линкеры хорошо известны в данной области и включают, например, дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотно-лабильные группы, фотолабильные группы, пептидазные лабильные группы и лабильные группы, содержащие эстеразу. Линкеры также включают заряженные линкеры и их гидрофильные формы, как описано в данном документе и известны в данной области.

Термины «повышенный» CD123/IL-3Rα, «повышенная экспрессия» CD123/IL-3Rα и «избыточная экспрессия» CD123/IL-3Rα относятся к образцу, который содержит повышенные уровни экспрессии CD123. CD123 может быть повышенным, увеличенным или сверхэкспрессированным по сравнению с контрольным значением (например, уровнем экспрессии в биологическом образце, ткани или клетке у субъекта без рака, образца или рака, которые, как известно, не экспрессируют или имеют низкий уровень CD123/IL-3Rα, нормальный образец или рак, который не имеет повышенных значений CD123/IL-3Rα). Например, образец (например, один из гематологического рака, такого как лейкемия и лимфома) с повышенной экспрессией может содержать увеличение по меньшей мере в 2-, 3-, 4-, 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30- или по меньшей мере 50 раз по сравнению с контрольными/нормальными значениями.

«Эталонный образец» может использоваться для корреляции и сравнения результатов, полученных в способах по изобретению из тестового образца. Эталонными образцами могут быть клетки (например, клеточные линии, клеточные гранулы) или ткани. Уровни CD123/IL-3Rα в «эталонном образце» могут быть абсолютным или относительным количеством, диапазоном количества, минимальным и/или максимальным количеством, средней величиной и/или медианой количества CD123/IL-3Rα. «Эталонный образец» также может служить в качестве базовой линии экспрессии CD123/IL-3Rα, с которой сравнивается тестовый образец. «Эталонный образец» может включать предыдущий образец или исходный образец от одного и того же пациента, нормальную эталон с известным уровнем экспрессии CD123/IL-3Rα или эталон из соответствующей популяции пациентов с известным уровнем CD123/IL-3Rα. Уровни CD123/IL-3Rα также могут быть выражены как значения в стандартной кривой. Стандартная кривая представляет собой количественный метод построения данных анализа для определения концентрации CD123/IL-3Rα в образце. В одном варианте реализации эталонный образец представляет собой антигенный стандарт, содержащий очищенный CD123/IL-3Rα. Способы диагностики по изобретению могут включать сравнение уровней экспрессии между CD123/IL-3Rα в тестируемом образце и «контрольного значения». В некоторых вариантах реализации эталонное значение представляет собой уровень экспрессии CD123/IL-3Rα в эталонном образце. Эталонное значение может быть заданным значением и также может быть определено из эталонных образцов (например, контроля биологических образцов или эталонных образцов), проверенных параллельно с образцами испытаний. Эталонным значением может быть одно значение, такое как медиана или среднее значение, или диапазон значений, например доверительный интервал. Эталонные значения могут быть установлены для различных подгрупп индивидуумов.

Термин «первичное антитело» в данном документе относится к антителу, которое специфически связывается с целевым белковым антигеном в образце. Первичное антитело обычно является первым антителом, используемым в анализе ELISA или процедуре IHC. B одном варианте реализации первичное антитело является единственным антителом, используемым в процедуре IHC.

Термин «вторичное антитело» в данном документе относится к антителу, которое специфически связывается с первичным антителом, тем самым образуя мостик или связь между первичным антителом и последующим реагентом, если таковые имеются. Вторичное антитело, как правило, является вторым антителом, используемым в иммуногистохимической процедуре.

«Образец» или «биологический образец» по данному изобретению имеет биологическое происхождение в конкретных вариантах реализации, из таких как эукариотические организмы. В некоторых вариантах реализации образец представляет собой человеческий образец, но также могут использоваться образцы животных. Неограничивающие источники образцов для использования в данном изобретении включают твердую ткань, аспираты для биопсии, асциты, жидкие экстракты, кровь, плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфатическую жидкость, внешние отделы кожи, респираторных, кишечных и мочеполовых трактов, слезы, слюну, молоко, опухоли, органы, клеточные культуры и/или компоненты клеточной культуры, например. «Раковый образец» представляет собой образец, который содержит раковую клетку. Этот метод может быть использован для изучения аспекта экспрессии CD123/IL-3Rα или состояния образца, включая, но не ограничиваясь ими, сравнение различных типов клеток или тканей, сравнение различных этапов развития и обнаружение или определение присутствия и/или типа заболевания или аномалии.

Используемый в данном документе термин «реагент захвата» относится к реагенту, способному связывать и захватывать молекулу-мишень в образце, так что при подходящем состоянии комплекс молекулы захвата-мишень-мишень может быть отделен от остальной части образца. В одном варианте реализации реагент захвата иммобилизуется. В одном варианте реализации реагент захвата в сэндвич-иммуноанализе представляет собой антитело или смесь различных антител против целевого антигена.

Используемый в данном документе термин «детектируемое антитело» относится к антителу, которое может быть обнаружено либо непосредственно с помощью метки, амплифицированной средствами обнаружения, либо косвенно через, например, другое антитело, которое помечено. Для прямой маркировки антитело обычно конъюгируют с фрагментом, который может быть определен некоторыми способами. В одном варианте реализации детектируемое антитело представляет собой биотинилированное антитело.

Используемый в данном документе термин «средство обнаружения» относится к фрагменту или методу, используемому для обнаружения присутствия детектируемого антитела, и включает детектирующие агенты, которые усиливают иммобилизованную метку, такую как метка, захваченная на планшете для микротитрования. В одном варианте реализации средство обнаружения представляет собой флуориметрический детектор, такой как авидин или стрептавидин.

Обычно в «сэндвич-ELISA» применяют следующие этапы: (1) микротитровальная пластина покрывается антителом захвата; (2) добавляется образец, и любой присутствующий антиген связывается с антителом захвата; (3) добавляется детектирующее антитело и связывается его с антигеном; (4) добавляется связанное с ферментом вторичное антитело и связывается с детектирующим антителом; и (5) добавляют субстрат и происходит превращение ферментом в детектируемую форму.

Слово «метка» при использовании в данном документе относится к детектируемому соединению или композиции, которое прямо или косвенно конъюгировано с антителом для того, чтобы создать «меченное» антитело. Метка может быть детектирована сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которая может быть обнаружена.

Под «коррелированием» или «корреляцией» подразумевается сравнение, в любом случае, производительности и/или результатов первого анализа с результатами и/или результатами второго анализа. Например, можно использовать результаты первого анализа при проведении второго анализа и/или использовать результаты первого анализа, чтобы определить, должен ли выполняться второй анализ и/или можно сравнить результаты первого анализа с результатами второго анализа. В одном варианте реализации повышенная экспрессия CD123/IL-3Rα коррелирует с повышенной вероятностью эффективности терапии CD123/IL-3Rα-таргетирования.

Термины «рак» и «раковые» относятся к физиологическому состоянию у млекопитающих или описывают их, в которых популяция клеток характеризуется нерегулируемым ростом клеток. «Опухоль» и «новообразование» относятся к одной или нескольким клеткам, которые являются результатом чрезмерного роста или пролиферации клеток, либо доброкачественных (неканцерогенных), либо злокачественных (канцерогенных), включая предраковые поражения.

Примеры рака включают лимфому и лейкоз. Примеры рака или опухолевых заболеваний, которые могут быть лечены и/или предотвращены способами и реагентами (например, антителом против CD123, его антигенсвязывающим фрагментом или его иммуноконъюгатом) по изобретению включают ОМЛ, ХМЛ, ОЛЛ (например, , В-ОЛЛ), ХЛЛ, миелодиспластический синдром, лейкоз бластного плазмацитоида DC (BPDCN), В-клеточные лимфомы, включая неходжкинские лимфомы (НХЛ), В-клеточную лимфобластную лейкемию/лимфому предшественников и новообразования зрелых В-клеток, такие как В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (В-ХЛЛ)/малая лимфоцитарная лимфома (МЛЛ), пролимфоцитарная лейкемия В-клеток, лимфоплазматическая лимфома, лимфома мантийных клеток (ЛМК), фолликулярная лимфома (ФЛ), включая ФЛ незначительной степени, средней степени и тяжелой степени, лимфома кожного фолликулярного центра, В-клеточная лимфома боковой зоны (тип MALT, узловой и селезеночный тип), лейкоз ворсистых клеток (ВКЛ), диффузная большая В-клеточная лимфома, лимфома Беркитта, плазмоцитома, миелома клеток плазмы, пост -трансплантационное лимфопролиферативное расстройство, макроглобулинемия Вальденстрема, анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ) и лейкемия Ходжкина (ЛХ).

Раки также охватывают раки, которые содержат клетки с повышенными уровнями экспрессии CD123/IL-3Rα. Такие раки с повышенным содержанием CD123/IL-3Rα включают, но не ограничиваются ими, ОМЛ, ХМЛ, ОЛЛ (например, В-ОЛЛ) и ХЛЛ.

Термины «раковая клетка», «опухолевая клетка» и грамматические эквиваленты относятся к общей популяции клеток, полученных из опухоли или предраковых поражений, включая как неопухолевые клетки, которые составляют основную массу популяции опухолевых клеток, и опухолегенные стволовые клетки (раковые стволовые клетки). Используемый в данном документе термин «опухолевая клетка» будет модифицироваться термином «не образующий опухоль», когда он относится исключительно к тем опухолевым клеткам, у которых нет способности обновляться и дифференцироваться, чтобы отличать эти опухолевые клетки от раковых стволовых клеток.

Термин «субъект» относится к любому животному (например, млекопитающему), включая, но не ограничиваясь ими, людей, не-человеческих приматов, грызунов и тому подобного, которые должны быть получать конкретное лечение. Как правило, термины «субъект» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо в отношении человека.

Введение «в сочетании с» одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами включает одновременное (одновременное) и последовательное введение в любом порядке.

Термин «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить эффективную биологическую активность активного ингредиента и которая не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для субъекта, которому вводили препарат. Такой состав может быть стерильным.

«Эффективное количество» антитела или иммуноконъюгата, как раскрыто в данном документе, представляет собой количество, достаточное для реализации конкретно заявленной цели. «Эффективное количество» может быть определено эмпирически и в обычном порядке в отношении заявленной цели.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела или другого лекарственного средства, эффективного для «лечения» заболевания или расстройства у субъекта или млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшить количество раковых клеток; уменьшить размер опухоли; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и в определенном варианте, останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и в определенном варианте, останавливать) метастазы опухолей; ингибировать, в некоторой степени, рост опухоли; уменьшить до некоторой степени один или несколько симптомов, связанных с раком; и/или приводит к благоприятному ответу, такому как повышенная выживаемость без прогрессирования (PFS), безрецидивная выживаемость (DFS) или общая выживаемость (OS), полный ответ (CR), частичный ответ (PR) или, в некоторых случаях (SD), снижение прогрессирующего заболевания (PD), сокращение времени до прогрессирования (ТТР) или любая их комбинация. См. определение в данном документе "лечение". В той степени, в которой препарат может предотвратить рост и/или убить существующие раковые клетки, он может быть цитостатическим и/или цитотоксическим.

«Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, но необязательно, поскольку профилактическая доза используется у субъектов до или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше терапевтически эффективного количества.

Термин «положительно реагировать» в целом относится к тому, чтобы вызвать полезное состояние у субъекта. Что касается лечения рака, этот термин относится к оказанию терапевтического воздействия на субъект. Положительные терапевтические эффекты при раке можно измерить несколькими способами (см. WAWeber, J. Nucl. Med. 50: 1S-10S (2009)). Например, ингибирование роста опухоли, экспрессия молекулярного маркера, экспрессия маркера сыворотки и методы молекулярной визуализации могут быть использованы для оценки терапевтической эффективности противоракового терапевтического средства. Что касается ингибирования роста опухоли, то согласно стандарту NCI Т/С <42% является минимальным уровнем противоопухолевой активности. АТ/С <10% считается высоким уровнем противоопухолевой активности, при Т/С (%) = средний объем опухоли обработанного/медианного объема опухоли контрольного × 100. Благоприятный ответ можно оценить, например, путем увеличения выживаемости без прогрессирования (PFS), безрецидивной выживаемости (DFS) или общей выживаемости (OS), полного ответа (CR), частичного ответа (PR) или, в некоторых случаях, стабильного заболевания (SD), снижения прогрессирующего заболевания (PD), сокращения времени до прогрессирования (ТТР) или любой их комбинации.

PFS, DFS и OS могут быть измерены стандартами, установленными Национальным институтом рака и Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для утверждения новых лекарств. См. Johnson et al., (2003) J. Clin. Oncol. 21 (7): 1404-1411.

«Выживаемость без прогрессирования» (PFS) относится ко времени от регистрации до прогрессирования заболевания или смерти. PFS обычно измеряется с использованием метода Kaplan-Meier и критериев оценки ответа в стандартах на солидные опухоли (RECIST) 1.1. Как правило, выживаемость без прогрессирования относится к ситуации, когда пациент остается живым и без рака становится хуже.

«Полный ответ» или «полная ремиссия» или «CR» указывает на исчезновение всех признаков опухоли или рака в ответ на лечение. Это не всегда означает, что рак был излечен.

«Частичный ответ» или «PR» относится к уменьшению размера или объема одной или нескольких опухолей или поражений или по степени рака в организме в ответ на лечение.

«Стабильное заболевание» относится к болезни без прогрессирования или рецидива. В стабильном заболевании нет достаточного уменьшения опухоли, чтобы подтвердить частичный ответ или достаточного увеличение опухоли, чтобы подтвердить как прогрессирующее заболевание.

«Прогрессирующая болезнь» относится к появлению еще одного нового поражения или опухолей и/или к однозначному прогрессированию существующих нецелевых поражений. Прогрессирующее заболевание также может относиться к росту опухоли более чем на 20 процентов с момента начала лечения либо из-за увеличения массы, либо при распространении опухоли.

«Безрецидивная выживаемость» (DFS) относится к продолжительности времени во время и после лечения, когда пациент остается свободным от болезни.

«Общее выживание» (OS) относится ко времени от регистрации пациентов до смерти или проверенной последней дате, когда пациент был еще жив. OS включает увеличение продолжительности жизни по сравнению с наивными или нелеченными людьми или пациентами. Общая выживаемость относится к ситуации, когда пациент остается живым в течение определенного периода времени, например, один год, пять лет и т.д., например, со времени постановки диагноза или лечения.

«Химиотерапевтическое средство» представляет собой химическое соединение, полезное при лечении рака, независимо от механизма действия. Такие термины, как «лечащий», или «лечение», или «лечить», или «облегчающий», или «облегчение», относятся к терапевтическим мерам, которые вылечивают, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают прогрессирование диагностированного патологического состояния или расстройства. Таким образом, те, кто нуждается в лечении, включают тех, у которых уже диагностированы расстройства, и могут также включать тех, у кого есть минимальное остаточное заболевание, или резистентное заболевание, или возвращенное заболевание. В некоторых вариантах реализации субъект успешно «лечится» от рака в соответствии со способами данного изобретения, если пациент демонстрирует одно или несколько из следующего: уменьшение количества или полное отсутствие раковых клеток; уменьшение размера опухоли; ингибирование или отсутствие инфильтрации раковых клеток в периферические органы, включая, например, распространение рака в мягкие ткани и кости; ингибирование или отсутствие метастазирования опухолей; ингибирование или отсутствие роста опухоли; облегчение одного или нескольких симптомов, связанных с конкретным раком; снижение заболеваемости и смертности; улучшение качества жизни; уменьшение онкогенности, опухолегенной частоты или онкогенной способности опухоли; уменьшение числа или частоты раковых стволовых клеток в опухоли; дифференцировка опухолевых клеток в неонкогенное состояние; повышенную выживаемость без прогрессирования (PFS), безрецидивную выживаемость (DFS) или общую выживаемость (OS), полный ответ (CR), частичный ответ (PR), стабильное заболевание (SD), снижение прогрессирующего заболевания (PD), сокращенное время до прогрессирования (ТТР) или любую их комбинацию.

Профилактические или превентивные меры относятся к мерам, которые предотвращают и/или замедляют развитие целевого патологического состояния или расстройства. Таким образом, те, кто нуждается в профилактических или превентивных мерах, включают тех, кто подвержен расстройству, и тех, у кого предотвращается расстройство.

Профилактические или превентивные меры относятся к терапевтическим мерам, которые предотвращают и/или замедляют развитие целевого патологического состояния или расстройства. Таким образом, те, кто нуждается в профилактических или превентивных мерах, включают тех, кто подвержен расстройству, и тех, у кого предотвращается расстройство.

Используемый в данном документе термин «поставщик медицинских услуг» относится к отдельным лицам или учреждениям, которые непосредственно взаимодействуют с живыми субъектами и оказывают им содействие, например, пациентам людям. Неограничивающие примеры поставщиков медицинских услуг включают врачей, медсестер, лаборантов, терапевтов, фармацевтов, консультантов, практиков альтернативной медицины, медицинские учреждения, кабинеты врачей, больницы, отделения скорой помощи, клиники, центры неотложной помощи, клиники/учреждения альтернативной медицины и любое другое лицо, предоставляющее общее и/или специализированное лечение, оценку, поддержание, терапию, медикаменты и/или консультации, касающиеся всех или любой части состояния здоровья пациента, включая, но не ограничиваясь, общие медицинские, специализированные медицинские, хирургические и/или любые другие виды лечения, оценки, поддержания, терапии, применения лекарств и/или консультации.

В некоторых аспектах поставщик медицинских услуг может управлять или инструктировать другого поставщика медицинских услуг для лечения терапии для лечения рака.«Назначение» терапии, как используется в данном документе, включает назначение терапии субъекту, а также доставку, применение или предоставление терапии субъекту. Поставщик медицинских услуг может осуществить или поручить другому поставщику медицинских услуг или пациенту выполнить следующие действия: получить образец, обработать образец, подать образец, получить образец, передать образец, проанализировать или измерить образец, количественно определить образец, предоставить результаты, полученные после анализа/измерения/количественного определения образца, получить результаты, полученные после

анализа/измерения/количественного определения образца, сравнить/оценить результаты, полученные после анализа/измерения/количественного определения одного или нескольких образцов, обеспечить сравнение/оценку от одного или нескольких образцы, получить сравнение/оценку из одного или нескольких образцов, назначить терапию или терапевтическое средство (например, связывающий агент CD123/IL-3Rα), начать назначение терапии, прекратить назначение терапии, продолжить назначение терапии, временно прервать назначение терапии, увеличить количество вводимого терапевтического средства, уменьшить количество вводимого терапевтического средства, продолжить введение количества терапевтического средства, увеличить частоту введения терапевтического средства, снизить частоту введения терапевтического средства, поддерживать ту же частоту дозирования терапевтического средства, заместить терапию или терапевтическое средство по меньшей мере другой терапией или терапевтическим средством, сочетать терапию или терапевтическое средство, по меньшей мере, с другой терапией или дополнительным терапевтическим средством. Эти действия могут выполняться поставщиком медицинских услуг автоматически с использованием метода, осуществимого с помощью компьютера (например, через веб-службу или автономную компьютерную систему).

«Полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотидами могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами или любым субстратом, который может быть включен в полимер ДНК или РНК-полимеразой. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если имеет место, то модификация структуры нуклеотида может быть внесена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с меченым компонентом. Другие типы модификаций включают, например, «кэпы», замещение одного или нескольких естественных нуклеотидов аналогами, межнуклеотидными модификациями, такими как, например, с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфорхотриэфиры, фосфоамидаты, кабаматы и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоатами, фосфородитиоатами и т.д.), теми, которые содержат боковые части, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, ply-L-лизин и т.д.), с интеркаляторами (например, акридином, псораленом и т.д.), содержащими хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), теми, которые содержат алкилаторы, с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида (ов).Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть заменена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами или активирована для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами или может быть конъюгирована с твердыми носителями. 5' и 3'-концы ОН могут быть фосфорилированы или замещены аминами или частями органической кепирующей группы от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть производными до стандартных защитных групп. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы Сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые обычно известны в данной области, включая, например, 2'-0-метил-, 2'-0-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидо- рибозу, карбоциклические сахарозы, альфа-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсосы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и аналогии с нулевым нуклеозидом, такие как метилрибозид. Одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связующими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают, но не ограничиваются ими, варианты, в которых фосфат заменен на P(O)S («тиоат»), P(S)S («дитиоат»), (O)NR₂ («амидат»), P(O)R, P(O)OR^*, СО или CH₂ («формацеталь»), где каждый R или R независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть одинаковыми. Предыдущее описание относится ко всем полинуклеотидам, указанным в данном документе, включая РНК и ДНК.

Термин «вектор» означает конструкцию, которая способна доставлять и экспрессировать один или несколько генов или последовательность(и), представляющую интерес в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, но не ограничиваются ими, вирусные векторы, векторы экспрессии голой ДНК или РНК, векторы плазмиды, космиды или веторы фага, векторы экспрессии ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами, векторы экспрессии ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и в него можно встроить неаминокислоты. Термины также включают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным путем или путем вмешательства; например, образованием дисульфидных связей, гликозилированием, липидацией, ацетилированием, фосфорилированием или любыми другими манипуляциями или модификациями, такими как конъюгация с меченым компонентом. Также в определение включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (включая, например, неестественные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Понятно, что, поскольку полипептиды по данному изобретению основаны на антителах, в некоторых вариантах реализации полипептиды могут встречаться как отдельные цепи или связанные цепи. В некоторых вариантах реализации полипептид, пептид или белок не встречаются в естественных условиях. В некоторых вариантах реализации полипептид, пептид или белок очищают от других природных компонентов. В некоторых вариантах реализации полипептид, пептид или белок получают рекомбинантным путем.

Термины «идентичные» или проценты «идентичности» в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или последовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, при сопоставлении и выравнивании (при необходимости, включая гэпы) для максимального соответствия, не считая каких-либо консервативных аминокислотных замен как часть идентичности последовательности. Процент идентичности может быть измерен с помощью программного обеспечения для сравнения последовательностей или алгоритмов или путем визуального контроля. В данной области известны различные алгоритмы и программное обеспечение, которые могут быть использованы для получения выравниваний аминокислотных или нуклеотидных последовательностей. Одним из таких неограничивающих примеров алгоритма выравнивания последовательностей является алгоритм, описанный в Karlin et al., Proc.Natl.Acad.Sci.87: 2264-2268, 1990, модифицировано в Karlin et al., Proc.Natl.Acad.Sci.90: 5873-5877, 1993 и включен в программы NBLAST и XBLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1991). B некоторых вариантах реализации Gapped BLAST может использоваться, как описано в Altschul et al., Nucleic Acids Res.25: 3389-3402, 1997; BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480, 1996), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) или Megalign (DNASTAR) являются дополнительными общедоступными программами, которые могут использоваться для выравнивания последовательностей. В некоторых вариантах реализации процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы GAP в программном обеспечении GCG (например, используя матрицу NWSgapdna.CMP и штраф за открытие гэпа 40, 50, 60, 70 или 90 и штраф за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6). В некоторых альтернативных вариантах реализации программа GAP в программном пакете GCG, которая включает алгоритм Needleman и Wunsch (J. Mol.Biol.(48): 444-453, 1970) может быть использована для определения процента идентичности между двумя аминокислотными последовательностями (например, с использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы РАМ250, так и штрафа за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5). Альтернативно, в некоторых вариантах реализации процент идентичности между нуклеотидными или аминокислотными последовательностями определяется с использованием алгоритма Myers и Miller (CABIOS, 4:11-17, 1989).Например, процент идентичности может быть определен с использованием программы ALIGN (версия 2.0) и с использованием РАМ 120 с таблицей остатков, штрафом за продление гэпа 12 и штрафом за гэп 4.Соответствующие параметры для максимального выравнивания с помощью конкретного программного обеспечения выравнивания могут быть определены специалистом в данной области техники. В некоторых вариантах реализации используются параметры по умолчанию для программного обеспечения выравнивания. В некоторых вариантах реализации процент идентичности «X» первой аминокислотной последовательности ко второй аминокислоте последовательности вычисляется как 100 х (Y/Z), где Y представляет собой количество аминокислотных остатков, оцененных как идентичные совпадения при выравнивании первой и второй последовательности (в соответствии с визуальным контролем или конкретной программой выравнивания последовательностей), a Z представляет собой общее количество остатков во второй последовательности. Если длина первой последовательности длиннее второй последовательности, процент идентичности первой последовательности ко второй последовательности будет больше, чем процент идентичности второй последовательности к первой последовательности.

В качестве неограничивающего примера, имеет ли какой-либо конкретный полинуклеотид определенный процент идентичности в последовательности (например, по меньшей мере на 80% идентичен, по меньшей мере на 85% идентичен, по меньшей мере на 90% идентичен, а в некоторых вариантах реализации по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны) к эталонной последовательности можно в определенных вариантах реализации определить с помощью программы Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit использует алгоритм локальной гомологии Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981, чтобы найти лучший сегмент гомологии между двумя последовательностями. При использовании программы Bestfit или любой другой программы для выравнивания последовательности для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной эталонной последовательности в соответствии с настоящим изобретением, устанавливаются параметры таким образом, что процент идентичности вычисляется по всей длине эталонной нуклеотидной последовательности и разрешены гэпы в гомологии до 5% от общего числа нуклеотидов в контрольной последовательности.

В некоторых вариантах реализации две нуклеиновые кислоты или полипептиды по данному изобретению практически идентичны, то есть они имеют по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, а в некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, как измерено с использованием алгоритма сравнения последовательностей или визуального контроля. В некоторых вариантах реализации идентичность существует поза областью последовательностей, которая составляет по меньшей мере около 10, около 20, около 40-60 остатков в длину или любое целое значение между ними или в более длинной области, чем 60-80 остатков, по меньшей мере около 90 -100, или последовательности по существу идентичны по всей длине сравниваемых последовательностей, например, к кодирующей области нуклеотидной последовательности, например.

«Консервативная замена аминокислот» представляет собой «консервативную аминокислотную замену», в которой один аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семьи аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженные полярные боковые цепи (например, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена фенилаланина на тирозин является консервативной заменой. В некоторых вариантах реализации консервативные замены в последовательностях полипептидов и антител по изобретению не отменяют связывание полипептида или антитела, содержащего аминокислотную последовательность, с антигеном(ами), то есть с CD123/IL-3Rα, с которым полипептид или антитело связывается. Способы идентификации консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, которые не исключают антигенсвязывания, хорошо известны в данной области (см., например, Brummell et al., Biochem.32:1180-1187, 1993; Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884, 1999; и Burks et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417, 1997).

Используемый в данном документе термин «Р-гликопротеин 1», также известный как «проницаемый гликопротеин», «Р-gp или Pgp», «белок 1 с множественной лекарственной устойчивостью (MDR1)», «член 1 подсемейства В АТФ-связывающей кассеты (АВСВ1), или «кластер дифференцировки 243 (CD243)», является АВС-транспортером подсемейства MDR/TAP, который транспортирует большое количество субстратов через внешне- и внутриклеточные мембраны. Это АТФ-зависимый эффлюксный насос с широкой субстратной специфичностью. Р-gp широко распространен и экспрессируется в кишечном эпителии, где он перекачивает ксенобиотики (такие как токсины или наркотики) обратно в просвет кишечника, в клетках печени, где он накачивает их в желчные протоки, в клетках проксимальной трубочки почки, где он накачивает их в мочеводные протоки и в капиллярных эндотелиальных клетках, составляющих гематоэнцефалический барьер и гематотестикулярный барьер, где он откачивает их обратно в капилляры. Некоторые раковые клетки также экспрессируют большое количество P-gp, что делает эти раковые образования устойчивыми к множественным лекарственным средствам.

Используемый в данном документе «алкил» относится к насыщенному моновалентному углеводородному радикалу с линейной или разветвленной цепью от одного до двадцати атомов углерода. Примеры алкила включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, 1-пропил, 2-пропил, 1-бутил, 2-метил-1-пропил, -СН₂СН(СН₃)₂, 2-бутил, 2-метил-2-пропил, 1-пентил, 2-пентил-3-пентил, 2-метил-2-бутил, 3-метил-2-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-1-бутил, 1-гексил), 2-гексил, 3-гексил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 3-метил-3-пентил, 2-метил-3-пентил, 2,3-диметил-2-бутил, 3,3-диметил-2-бутил, 1-гептил, 1-октил и тому подобное. Предпочтительно алкил имеет от одного до десяти атомов углерода. Более предпочтительно алкил имеет от одного до четырех атомов углерода.

Количество атомов углерода в группе может быть указано в данном документе префиксом «С_х-хх», где х и хх являются целыми числами. Например, «С_1-4алкил» представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода.

Термин «соединение» или «цитотоксическое соединение» используются взаимозаменяемо. Они предназначены для включения в состав соединений, для которых структура или формула или любое их производное раскрыты в данном изобретении, или структура или формула или любое их производное, которое включено в качестве ссылки. Этот термин также включает стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры, сольваты, метаболиты и соли (например, фармацевтически приемлемые соли) соединения всех формул, раскрытых в данном изобретении. Термин также включает любые сольваты, гидраты и полиморфы любого из вышеперечисленных. Конкретное перечисление «стереоизомеров», «геометрических изомеров», «таутомеров», «сольватов», «метаболитов», «соли», «конъюгатов», «конъюгатов соли», «сольвата», «гидрата» или «полиморфа», в некоторых аспектах изобретения, описанных в данной заявке, не следует интерпретировать как предполагаемое исключение этих форм в других аспектах изобретения, где термин «соединение» используется без перечисления этих других форм.

Термин «хиральный» относится к молекулам, которые обладают свойством неналожимости зеркальных изображений молекулы, тогда как термин «ахиральный» относится к молекулам, зеркальные изображения которых можно наложить друг на друга.

Термин «стереоизомер» относится к соединениям, которые имеют идентичное химическое строение и связи, но разные ориентации их атомов в пространстве, которые не могут быть взаимно конвертированы путем вращения вокруг одиночных связей.

«Диастереомер» относится к стереоизомеру с двумя или более центрами хиральности и молекулы которых не являются зеркальными отображениями друг друга. Диастереомеры имеют разные физические свойства, например точки плавления, точки кипения, спектральные свойства и реактивность. Смеси диастереомеров могут разделяться в аналитических процедурах высокого разрешения, таких как кристаллизация, электрофорез и хроматография.

«Энантиомеры» относятся к двум стереоизомерам соединения, которые являются неперемещаемыми зеркальными изображениями друг друга.

Стереохимические определения и условные обозначения, используемые в данном документе, обычно приведены согласно SP Parker, Ed., McGraw-Hill, Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel E. и Wilen S., Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994.Соединения по изобретению могут содержать асимметричные или хиральные центры и, следовательно, существуют в разных стереоизомерных формах. Предполагается, что все стереоизомерные формы соединений по изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, диастереомеры, энантиомеры и атропизомеры, а также их смеси, такие как рацемические смеси, являются частью данного изобретения. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, т.е. имеют возможность вращать плоскость плоско-поляризованного света. При описании оптически активного соединения префиксы D и L, или R и S, используются для обозначения абсолютной конфигурации молекулы вокруг ее хирального центра (центров).Префиксы d и I или (+) и (-) используются для обозначения знака поворота плоско-поляризованного света соединением с (-) или 1, что означает, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры эти стереоизомеры идентичны, за исключением того, что они являются зеркальными изображениями друг друга. Конкретный стереоизомер можно также назвать энантиомером, и смесь таких изомеров часто называют энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров 50:50 упоминается как рацемическая смесь или рацемат, что может образовываться там, где не было стереоизоляции или стереоспецифичности в химической реакции или химическом процессе. Термины «рацемическая смесь» и «рацемат» относятся к эквимолярной смеси двух энантиомерных частиц, лишенных оптической активности.

Термин «таутомер» или «таутомерная форма» относится к структурным изомерам с различными энергиями, которые являются взаимопревращаемыми через низкоэнергетический барьер. Например, протонные таутомеры (также известные как прототропные таутомеры) включают взаимопревращения через миграцию протона, такие как кетоэнол и имино-енаминовая изомеризация. Валентные таутомеры включают взаимопревращения путем реорганизации некоторых связанных электронов.

Термин «иминовый реакционноспособный реагент» относится к реагенту, который способен реагировать с иминовой группой. Примеры иминового реакционноспособного реагента включают, но не ограничиваются ими, сульфиты (H₂SO₃, H₂SO₂ или соль HSO₃^-, SO₃^2- или HSO₂^-, образованные с катионом), метабисульфит (H₂S₂O₅ или соль S₂O₅^2-, образованная катионом), моно-, ди-, три- и тетратиофосфаты (PO₃SH₃, PO₂S₂H₃, POS₃H₃, PS₄H₃ или соль PO₃S₃, PO₂S₂^3-, POS₃^3- или PS₄^3-, образованная катионом), тиофосфатные эфиры ((RⁱO)₂PS(ORⁱ), RⁱSH, RⁱSOH, RⁱSO₂H, RⁱSO₃H), различные амины (гидроксиламин (например, NH₂OH), гидразин (например, NH₂NH₂), NH₂ORⁱ, Rⁱ-NH-Rⁱ, NH₂-Rⁱ), NH₂-CO-NH₂, NH₂-C(=S)-NH₂, тиосульфат (H₂S₂O₃ или соль S₂O₃^2-, образованный катионом), дитионит (H₂S₂O₄ или соль S₂O₄^2-, образованная катионом), фосфородитиоат (P(=S)(OR^k)(SH)(OH) или его соль, образованная катионом), гидроксамовые кислоты (R^кC(=O)NHOH или соль, образованная с катионом), гидразид (R^KCONHNH₂), формальдегидсульфоксилат (HOCHO₂SO₂H или соль HOCH₂SO₂^-, которая образуются с катионом, таким как HOCH₂SO₂^-Na⁺), гликированный нуклеотид (такой как GDP-манноза), флударабин или их смесь, где Rⁱ и R^i' каждый независимо представляет собой линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, и является замещенным по меньшей мере одним заместителем, выбранным из -N(R^j)₂, -СО₂Н, -SO₃H и -РО₃Н; Rⁱ и R^i' могут быть дополнительно необязательно замещены заместителем для алкила, описанного в данном документе; R^j представляет собой линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода; и R^k представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, арил, гетероциклил или гетероарил (предпочтительно R^k представляет собой линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, более предпочтительно R^k метил, этил или пропил). Предпочтительно, катион представляет собой одновалентный катион, такой как Na⁺ или K⁺. Предпочтительно иминовый реакционноспособный реагент выбирают из сульфитов, гидроксиламина, мочевины и гидразина. Более предпочтительно, иминовый реакционноспособный реагент представляет собой NaHSO₃ или KHSO₃.

Используемая в данном документе фраза «фармацевтически приемлемая соль» относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям соединения по изобретению. Примеры соли включают, но не ограничиваются ими, соли сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, йодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, цитрат кислоты, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентинатин, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат «мезилат», этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, памоат (то есть 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)), соли щелочных металлов (например, натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, магния) и соли аммония. Фармацевтически приемлемая соль может содержать включение другой молекулы, такой как ацетатный ион, сукцинат-ион или другой противоион. Противоположным ионом может быть любой органический или неорганический фрагмент, который стабилизирует заряд на исходном соединении. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль может иметь более одного заряженного атома в своей структуре. Примеры, когда несколько заряженных атомов являются частью фармацевтически приемлемой соли, могут иметь несколько противоионов. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или несколько заряженных атомов и/или один или несколько противоионов.

Если соединение по изобретению является основанием, желаемая фармацевтически приемлемая соль может быть получена любым подходящим способом, доступным в данной области, например, обработкой свободного основания неорганической кислотой, такой как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, метансульфоновая кислота, фосфорная кислота и тому подобное или с органической кислотой, такой как уксусная кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, миндальная кислота, фумаровая кислота, малоновая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, гликолевая кислота, салициловая кислота, пиранозидиловой кислотой, такой как глюкуроновая кислота или галактуроновая кислота, альфа-гидроксикислота, такой как лимонная кислота или винная кислота, аминокислотой, такой как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, ароматической кислотой, такой как бензойная кислота или коричная кислота, сульфокислотой, такой как п-толуолсульфокислота или этансульфоновая кислота, или тому подобное.

Если соединение по изобретению представляет собой кислоту, желаемую фармацевтически приемлемую соль можно получить любым подходящим способом, например, обработкой свободной кислоты неорганическим или органическим основанием, таким как амин (первичный, вторичный или третичный) гидроксид щелочного металла или гидроксид щелочно-земельного металла или тому подобное. Иллюстративные примеры подходящих солей включают, но не ограничиваются ими, органические соли, полученные из аминокислот, таких как глицин и аргинин, аммиак, первичный, вторичный и третичный амины, и циклические амины, такие как пиперидин, морфолин и пиперазин, и неорганические соли, полученные из натрия, кальция, калия, магния, марганца, железа, меди, цинка, алюминия и лития.

Используемый в данном документе термин «сольват» означает соединение, которое дополнительно включает стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя, такого как вода, изопропанол, ацетон, этанол, метанол, ДМСО, этилацетат, уксусная кислота и этаноламиндихлорметан, 2-пропанол или тому подобное, связанное нековалентными межмолекулярными силами. Сольваты или гидраты соединений легко получают путем добавления по меньшей мере к одному молярному эквиваленту гидроксильного растворителя, такого как метанол, этанол, 1-пропанол, 2-пропанол или воду, чтобы получить сольватацию или гидратацию иминовой части.

«Метаболитом» или «катаболитом» является продукт, полученный посредством метаболизма или катаболизма в организме из указанного соединения, его производного или его конъюгата, или его соли. Метаболиты соединения, его производное или его конъюгат могут быть идентифицированы с использованием обычных методов, известных в данной области, и их активности, определенных с использованием тестов, таких как описанные в данном документе. Такие продукты могут быть получены, например, путем окисления, гидроксилирования, восстановления, гидролиза, амидирования, дезамидирования, этерификации, деэтерификации, ферментативного расщепления и т.п. вводимого соединения. Соответственно, изобретение включает метаболиты соединений, их производного или его конъюгата по изобретению, включая соединения, их производное или его конъюгат, полученные способом, включающим контактирование соединения, его производного или конъюгата из этого изобретения с млекопитающим в течение периода времени, достаточного для получения его метаболического продукта.

Фраза «фармацевтически приемлемый» указывает, что вещество или состав должны быть совместимы химически и/или токсикологически, с другими ингредиентами, содержащими состав, и/или с млекопитающим, подвергающимся лечению с ним.

Термин «защитная группа» или «защитный фрагмент» относится к заместителю, который обычно используется для блокирования или защиты определенной функциональности при взаимодействии других функциональных групп с соединением, его производным или его конъюгатом. Например, «аминозащитная группа» или «аминозащищающая группа» представляет собой заместитель, присоединенный к аминогруппе, которая блокирует или защищает аминогруппу в соединении. Такие группы хорошо известны в данной области (см., например, P. Wuts and Т. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 7, J. Wiley & Sons, NJ) и примерами являются карбаматы, такие как метил и этилкарбамат, FMOC, замещенные этилкарбаматы, карбаматы, расщепленные 1,6-β-элиминированием (также называемые «самонемолекулярными»), мочевины, амиды, пептиды, алкильные и арильные производные. Подходящие аминозащитные группы включают ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (CBZ) и 9-флуоренилметиленоксикарбонил (Fmoc). Общее описание защитных групп и их использование см. в P. G.M. Wuts & Т. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2007.

Термин «аминокислота» относится к природным аминокислотам или неприродной аминокислоте. В одном варианте реализации аминокислота представлена NH₂-C(R^aa'R^aa)-С(=O)ОН, где R^aa и R^aa' каждый независимо представляет собой Н, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, арил, гетероарил или гетероциклил или R33, и N-концевой атом азота может вместе образовывать гетероциклическое кольцо (например, как в про лине). Термин «аминокислотный остаток» относится к соответствующему остатку, когда один атом водорода удаляется из амино- и/или карбоксильного конца аминокислоты, такой как -NH-C(R^aa'R^aa)-C(=O)O-.

Термин «катион» относится к иону с положительным зарядом. Катион может быть моновалентным (например, Na⁺, K⁺, NH4⁺и др.), би-валентным (например, Са²⁺, Mg²⁺ и др.) или поливалентным (например, Al³⁺ и т.д.). Предпочтительно катион является одновалентным.

Термин «реакционноспособная сложноэфирная группа» относится к группе сложного эфира, которая может легко взаимодействовать с аминогруппой с образованием амидной связи. Типичные реакционноспособные сложноэфирные группы включают, но не ограничиваются ими, эфиры N-гидроксисукцинимида, эфиры N-гидроксифталимидов, эфиры N-гидроксисульфосукцинимидов, эфиры пара-нитрофенила, сложные эфиры динитрофенила, пентафторфениловые эфиры и их производные, где указанные производные облегчают образование амидной связи. В некоторых вариантах реализации реакционноспособная сложноэфирная группа представляет собой сложный эфир N-гидроксисукцинимида или эфир N-гидрокси сульфосукцинимида.

Термин «аминовая реакционноспособная группа» относится к группе, которая может взаимодействовать с аминогруппой с образованием ковалентной связи. Примеры аминовых реакционноспособных групп включают, но не ограничиваются ими, реакционноспособные сложноэфирные группы, ацилгалогениды, сульфонилгалогениды, имидоэфир или реакционноспособные тиоэфирные группы. В некоторых вариантах реализации аминовая реакционноспособная группа представляет собой реакционноспособную сложноэфирную группу. В одном варианте реализации аминовая реакционноспособная группа представляет собой N-гидроксисукцинимидный эфир или эфир N-гидроксисульфосукцинимида.

Термин «тиольная реакционноспособная группа» относится к группе, которая может реагировать с тиольной (-SH) группой с образованием ковалентной связи. Типичные тиольные реакционноспособные группы включают, но не ограничиваются ими, малеимид, галоацетил, галоацетамид, винилсульфон, винилсульфонамид или виниловый пиридин. В одном варианте реализации тиольная реакционноспособная группа представляет собой малеимид.

Следует отметить, что в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают множественное число, если из контекста явно не следует иное.

Понятно, что везде, где варианты реализации описаны в данном документе с термином «содержит», в других случаях также предусмотрены аналогичные варианты реализации, описанные в терминах «состоящих из» и/или «состоящих в основном из».

Термин «и/или», используемый в фразе, такой как «А и/или В» в данном документе, предназначен для включения как «А, так и В», «А» или «В», «А» и «В». Аналогично, термин «и/или», используемый во фразе, такой как «А, В и/или С», предназначен для охвата каждого из следующих вариантов реализации:А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (один); В (один); и С (один).

Номенклатура антител, соединений и иммуноконъюгатов

Как используется в данном документе, номенклатура, используемая для анти-CD123 антител, цитотоксических соединений и их иммуноконъюгатов, обычно принимает следующие значения.

CD123-3, -6 и -14 (или CD123 Mu-3, -6 и -14 или muCD123-3, -6 и 14) представляют собой три мышиных анти-CD123-моноклональных антитела. Последовательности CDR1-3 тяжелых и легких цепей (VH-CDR1-3 и VL-CDR1-3) приведены в таблицах 1 и 2 с соответствующими SEQ ID NO: 1-25.Последовательности вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) представлены в таблице 3А с соответствующими SEQ ID NO: 26, 28 и 30. Последовательности вариабельной области легкой цепи (LCVR) представлены в таблице 4А с соответствующими SEQ ID NO: 27, 29 и 31. Полноразмерные последовательности тяжелой цепи (НС) мышиных антител представлены в таблице 5 (SEQ ID NO: 42, 44 и 46), а полноразмерные последовательности легкой цепи (LC) мышиных антител представлены в таблице 6 (SEQ ID NO: 43, 45 и 47).

chCD123-3, -6 и -14 являются соответствующими химерными мышино-человеческими антителами, имеющими вариабельные области тяжелой и легкой цепей мыши и последовательности константной области человека. Например, химерные антитела chCD123-6 состоят из мышиных HCVR и LCVR SEQ ID NO: 28 и 29 соответственно, вместе с константами последовательности IgG1 и Карра человека для тяжелых и легких цепей, соответственно. См. Пример 3.

huCD123-3, -6 и -14 являются соответствующими гуманизированными антителами. Когда гуманизация осуществляется путем CDR-присоединения 6 соответствующих областей CDR мыши (НС и LC CDR1-3), буква «G» сразу же следует за обозначением клона, которое, в свою очередь, сопровождается номером версии, который обозначает происхождение последовательностей легкой цепи человека и тяжелой цепи. Таким образом, huCD123-6Gv4.6 относится к гуманизированному антителу CD123 на основе присоединения («G») 6 CDR областей от соответствующего антитела muCDR 123-6 к вариабельной области легкой цепи человека Gv4 и вариабельной области тяжелой цепи Gv6. По аналогии, -Gv4.7 содержит вариабельную область легкой цепи человека Gv4 и вариабельный участок тяжелой цепи Gv7; и -Gv1.1 содержит вариабельный участок легкой цепи человека Gv1 и вариабельный участок тяжелой цепи Gv1.

Три последовательности HCVR, huCD123-6Gv1, -Gv6 и -Gv7 представлены в таблице 3А (SEQ ID NO: 32 и 34, с SEQ ID NO: 34, представляющие оба -Gv6 и -Gv7, поскольку они различаются только на 2-м остатке Хаа) и их кодирующие ДНК последовательности в таблице 3В (SEQ ID NO: 62, 64 и 66). Три полноразмерные НС-последовательности, huCD123-6Gv1, -Gv6 и -Gv7 представлены в таблице 5 (SEQ ID NO: 48 и 50, с SEQ ID NO: 50, представляющие как полноразмерную -Gv6, так и -Gv7, поскольку они различаются только на 2-м остатке Хаа).

Две последовательности LCVR, huCD123-6Gv1 и -Gv4, представлены в таблице 4А (SEQ ID NO: 33 и 35, и их кодирующие ДНК последовательности в таблице 4В (SEQ ID NO: 63 и 65).Две полноразмерные LC последовательности, huCD123-6Gv1Gv6 и -Gv4 представлены в таблице 6 (SEQ ID NO: 49 и 51).

Когда гуманизация осуществляется путем изменения поверхности, последовательности тяжелой цепи с измененной поверхностью обозначаются «rh», непосредственно следуя за номером клонирования мышиного CD123-антитела, и дополнительно обозначаются одной из двух версиями последовательностей с измененной поверхностью, v1.0 или v1.1. Таким образом, huCD123-6rhv1.0 и -rhv1.1 представляют собой последовательности тяжелой цепи с измененной поверхностью с областями CDR, соответствующими антителу muCD123-6, с обозначением версии 1.0 и 1.1 соответственно. См. HCVR SEQ ID NO: 39 и 40 в Таблице 3А, и SEQ ID NO: 68 и 69 в Таблице 3В. Также см. полноразмерные НС SEQ ID NO: 59 и 60 в Таблице 5.

Аналогично, единственная версия последовательности легкой цепи с измененной поверхностью huCD123-6rlv1.0, имеет LCVR SEQ ID NO: 41 в таблице 4А и полноразмерную LC SEQ ID NO: 61 в Таблице 6.

Антитело с измененной поверхностью, имеющее huCD123-6rhv1,0 и huCD123-6rlv1,0, представляет собой huCD123-6Rv1,0; и антитело с измененной поверхностью, имеющее huCD123-6rhv1.1 и huCD123-6rlv1.0, представляет собой huCD123-6Rv1.1.

NTS2 или «S2» для краткости относится к антителу, имеющему модифицированый Ser на N-конце тяжелой цепи. Вариант S2 huCD123-6Gv6/7 имеет последовательность HCVR SEQ ID NO: 38 в таблице 3А, и полноразмерную последовательность белка НС SEQ ID NO: 53 в Таблице 5.

Аналогично, NTS3 или «S3» для краткости относится к антителу, имеющему модифицированый Ser на N-конце легкой цепи. Вариант S3 huCD123-6Gv4 имеет последовательность LCVR SEQ ID NO: 37 в таблице 3А, и полноразмерную последовательность белка LC SEQ ID NO: 58 в Таблице 6.

Антитело, содержащее модифицированый N-концевой Ser (либо S2, либо S3), может быть конъюгировано с цитотоксическим лекарственным средством/агентом либо через окисленный N-концевой Ser, либо через «обычную» связь Lys-Если соединение лекарственного средства происходит через окисленный N-концевой Ser, название конъюгата содержит обозначение «SeriMab». Если связь с лекарственным средством осуществляется через Lys, то название конъюгата не содержит SeriMab (несмотря на то, что существует обозначение S2 или S3, чтобы сигнализировать о наличии модифицированого Ser на N-конце). Конкретный тип соединения также будет проявляться на основе цитотоксиновой реакционноспособной группы. Например, huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-D8 относится к конъюгату между D8 и гуманизированным CD123-антителом huCD123-6Gv4.7S3 через окисленный N-концевой Ser на легкой цепи. Гуманизированное CD123-антитело имеет присоединенные мышиные CD123-6 CDR-области, человеческий LC Gv4 и тяжелую цепь Gv7, а N-конец легкой цепи имеет модифицированный Ser (S3). B противоположность этому, huCD123-6Gv4.7S3-sSPDB-D1 относится к конъюгату между D1 и одним и тем же гуманизированным CD123-антителом huCD123-6Gv4.7S3, посредством Lys связи через сульфированный лиганд SPDB.

В некоторых вариантах реализации, если оба N-конца как легкой цепи, так и тяжелой цепи содержат модифицированый Ser, в названии антитела могут появляться «S2S3» или «S2S3-SeriMab».

Некоторые антитела по изобретению имеют модифицированый Cys в домене СН3 тяжелой цепи в положении, соответствующем тому же положению по Kabat от 5-го до последнего Cys в SEQ ID NO: 54. Такие НС или антитела, содержащие такие НС, содержат обозначение CysMab. Таким образом, huCD123-6Gv4.6-CysMab является гуманизированным CD123-антителом, которое имеет присоединенные области CDR muCD123-6, на основе последовательностей легкой цепи Gv4 и тяжелой цепи Gv4 человека, где модифицированый Cys расположен в области НС СН3 в положении, соответствующему 5-му последнему Cys в SEQ ID NO: 54. Аналогично, его последовательность тяжелой цепи представляет собой huCD123-6Gv6-CysMab. Кроме того, huCD123-6Gv4.6S2-CysMab в остальном идентичен, но имеет модифицированный Ser на N-конце тяжелой цепи и его последовательность тяжелой цепи huCD123-6Gv6S2-CysMab.

Вышеописанное антитело с измененной поверхностью может быть дополнительно модифицировано таким образом, чтобы оно содержало N-концевой Ser либо в легкой цепи (вариант S3 с измененной поверхностью), либо в тяжелой цепи (вариант S2 антитела с измененной поверхностью), либо в обоих случаях (см. ниже). Альтернативно или дополнительно, антитело с измененной поверхностью может иметь модифицированый Cys в домене СН3 тяжелой цепи в положении, соответствующем тому же положению по Kabat от 5-го до последнего Cys SEQ ID NO: 54 (версия CysMab антитела с измененной поверхностью). Антитело с измененной поверхностью может иметь как модифицированые Cys, так и N-концевые Ser.

Однако, в конъюгатах, образованных между такими CysMab и цитотоксином, по меньшей мере теоретически, цитотоксин можно связать с CysMab либо через Cys, либо через обычный Lys. Однако, как используется в данном документе, без специфического указания, конъюгат с обозначением CysMab относится к конъюгату между CysMab и цитотоксином через Cys-соединение (не соединение Lys). Конкретный тип соединения также будет проявляться на основе цитотоксиновой реакционноспособной группы.

Другие варианты или комбинации вышеуказанной общей номенклатуры также рассматриваются и будут очевидны специалисту в данной области техники. Например, huCD123-6Rv1.1-CysMab представляет собой версию huCD123-6 (v1.1) с измененной поверхностью, которая имеет модифицированый Cys, расположенный в области НС СН3 в положении, соответствующем 5-му последнему Cys в SEQ ID NO: 54.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут быть конъюгированы с некоторыми цитотоксическими агентами либо посредством связывания с аминогруппой Lys боковой цепи, либо с тиольной группой Cys боковой цепи, либо с окисленным N-концевым Ser/Thr. Некоторые типичные (не ограничивающие) цитотоксические агенты, описанные в описании (включая примеры), перечислены ниже для иллюстрации. Следует отметить, что большинство соединений, таких как D1, D2, D4, DGN462, D3, D6 и т.д., могут быть сульфированы (не показаны тут, но см. Фиг. 17 соединение sD1, фиг. 15 соединение SDGN462 и фиг. 16 соединение sD8) в одном из мономеров индолинобензодиазепина в некоторых примерах. Для соединения D5' оба мономера индолинобензодиазепина могут быть сульфированы.

Обратите внимание, что несколько агентов незначительно отличаются друг от друга из-за различной химической структурой связи, необходимой для связывания цитотоксина с различными боковыми цепями антител (то есть, Lys-связь, Cys-связь, окисленная N-терминальная Ser-связь). Тем не менее, эти родственные цитотоксины получают разные обозначения «D».Cm. D1 и D4, а также D2, D5 и D8.

Конъюгаты антител субъекта и цитотоксические агенты обычно соответствуют номенклатуре антител и цитотоксических агентов, как описано выше.

Например, huCD123-6Gv4.6-сульфо-SPDB-D1 является конъюгатом антитела huCD123-6Gv4.6 к соединению D1 через сульфированный лиганд SPDB в одном или нескольких Lys остатках антитела. huCD123-6-СХ1-1-DМ1 представляет собой конъюгат антитела huCD123-6, конъюгированного с цитотоксическим средством DM1, через триглицильный линкер с названием «СХ1-1 линкер» в одном или нескольких остатках Lys антитела. См. Пример 9е.

Одним из примечательных исключений является конъюгат huCD123-6-SeriMab-sD1, показанный на фиг. 7В и 17, в которых короткая линкерная последовательность между huCD123-6-SeriMab и цитотоксином sD1 в явном виде не указана в названии конъюгата. Аналогично, конъюгат huCD123-6-SeriMab-sDGN462 на фиг. 15 также является исключением из общих правил выше.

2. CD 123-связывающие средства

В первом аспекте данное изобретение относится к средствам, которые специфически связывают CD123/IL-3Rα, такие как CD123/IL-3Rα человека. Эти средства обычно упоминаются в данном документе как «CD123/IL-3Rα-связывающие средства». В некоторых вариантах реализации CD123/IL-3Rα-связывающие средства представляют собой антитела или их антигенсвязывающие фрагменты (или «антитела» для простоты), их иммуноконъюгаты или их полипептиды.

Аминокислотные и нуклеотидные последовательности для человека и других видов CD123/IL-3Rα известны в данной области. Например, белковая последовательность сплайс варианта 1 белка CD123/IL-3Rα человека, отображенная в NCBI RefSeq NP_002174, приведена ниже:

Вышеприведенная последовательность демонстрирует белок цепи предшественника CD123/IL-3R альфа, который состоит из 378 аминокислот, содержащих внеклеточный домен (остатки 1-306, включая N-концевой сигнальный пептид с 18 остатками), трансмембранный 20 аминокислотный домен и короткий цитоплазматический хвост из 52 аминокислот.

Последовательность нуклеиновой кислоты сплайс варианта 1 CD123/IL-3Rα человека, отображенная в NCBI RefSeq NM_002183, приведена ниже:

Белки и последовательности нуклеиновых кислот CD123/IL-3Rα из других нечеловеческих видов могут быть легко получены из общедоступной базы данных, такой как GenBank, с использованием инструментов поиска в последовательности, известными в данной области (такими как NCBI BLASTp или BLASTn), и вышеупомянутые последовательности белка и нуклеиновой кислоты в качестве последовательностей запросов соответственно.

Такие последовательности из нечеловеческих видов могут быть выровнены с человеческими последовательностями с использованием любого из многих признанных в данной области техники средств для выравнивания последовательностей, таких как описанные тут и выше, так что любые аминокислотные остатки или нуклеотиды, «соответствующие» любым данным человеческим последовательностям или области последовательностей могут быть легко получены.

Таким образом, один аспект изобретения предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который:(а) связывает эпитоп в пределах аминокислот от 101 до 346 человеческого антигена CD123 и (b) ингибирует IL3-зависимую пролиферацию в антиген-положительных клетках TF-1.

В некоторых вариантах реализации антитело против CD123/IL-3Rα или его антигенсвязывающий фрагмент может специфически связываться с эпитопом SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах реализации эпитоп находится в области, соответствующей остаткам 101-346 человеческого CD123/IL-3Rα. B некоторых вариантах реализации эпитоп находится в области, соответствующей остаткам 101-204 SEQ ID NO: 36. B некоторых других вариантах реализации эпитоп находится в области, соответствующей остаткам 205-346 SEQ ID NO: 36. B некоторых вариантах реализации эпитоп находится в области, соответствующей остаткам 1-100 человеческого CD123/IL-3Rα.

В некоторых вариантах реализации CD123/IL-3Rα-связывающие агенты (например, антитела) ингибируют IL3-зависимую сигнализацию, такую как IL-3-зависимая пролиферация CD 123-положительных клеток TF-1. He желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, CD123/IL-3Rα-связывающие средства (например, антитела) по изобретению связываются с CD123, например, в пределах области CD123, соответствующей остаткам 101-346 (например, остатки 101-204 или 205-346) человеческого CD123/IL-3Rα и предотвращают, уменьшают, снижают или иным образом ингибируют продуктивное связывание между CD123 и лигандом IL-3 и/или продуктивное связывание между CD123 и общим CD131 с общей бета-цепью, что приводит к уменьшению или отмене IL-3-зависимой сигнализации.

В связанном аспекте изобретения предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который:(а) связывает эпитоп в пределах аминокислот от 1 до 100 антигена CD123 человека и (b) ингибирует IL3-зависимую пролиферацию в антиген-положительных клетках TF-1 с величиной IC₅₀ 0,1 нМ или менее (например, 0,08 нМ, 0,05 нМ, 0,03 нМ).

В некоторых вариантах реализации связывание CD123/IL-3Rα-связывающими агентами (например, антителами) по изобретению ингибирует (например, предпочтительно ингибирует) пролиферацию лейкозных стволовых клеток (LSC), предшественников лейкемии (LP) или лейкозных бластов, но существенно не ингибируют пролиферацию нормальных гемопоэтических стволовых клеток (HSC).

Ингибирование пролиферации клеток может быть проведено с использованием любых стандартных анализов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, проточную цитометрию. Например, обычные HSC, LSC, LP и лейкемические бласты могут быть разделены с использованием проточной цитометрии на основе разницы в экспрессии маркеров клеточной поверхности, а относительное количество выживших или оставшихся клеток после инкубации с тестирующими агентами может быть количественно измерено и сравнивается.

Ингибирование пролиферации клеток LSC, LP или лейкемических бластов, по сравнению с обычными HSC, можно также анализировать с использованием количественного определения действующего вещества in vitro на первичных раковых клетках, таких как первичные клетки ОМЛ. Например, клетки ОМЛ (или обычные образцы человеческого костного мозга, содержащие нормальные HSC) могут подвергаться воздействию различных концентраций антител против CD123 субъекта, их антигенсвязывающих фрагментов, их иммуноконъюгатов или полипептида, содержащего антитела или антигенсвязывающие фрагменты в течение 24 часов. В анализе также могут использоваться антитела без нацеливания (с изотипом) или иммуноконъюгаты (ADC). Образцы можно разделить на краткосрочный анализ жидкой культуры (STLC) для измерения цитотоксичности по отношению к LSC, LP или лейкемическим бластам; и долгосрочный анализ жидкой культуры (LTLC) для измерения влияния на LSC и нормальные HSC.STLC можно использовать для измерения колониеобразующих единиц в течение 10-14 дней в клетках, например, после нанесения покрытия в полутвердую среду MethoCult Н4230 (Stemcell technologies). Анализ LTLC может быть выполнен аналогично с добавлением факторов роста для долгосрочной культуры 5-7 недель. В обоих тестах колонии можно подсчитать, чтобы определить колониеобразующие единицы на число первоначально посаженных клеток. Колонии LTLC могут быть дополнительно проанализированы на наличие молекулярных маркеров рака (например, ОМЛ) с использованием ПЦР, или FISH, или обоих.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с CD123 антиген-положительными клетками человека с константой диссоциации (K_d) 0,3 нМ или ниже. В некоторых вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с CD123 человека с K_d между 0,05 и 0,3 нМ, или между 0,05 и 0,2 нМ, или между 0,05 и 0,1 нМ, или между 0,01 нМ и 0,3 нМ, или между 0,01 нМ и 0,2 нМ, или между 0,01 нМ и 0,1 нМ.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагменты связываются с CD123 яванской макаки. В некоторых вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с CD123 яванской макаки с K_d между 0,05 и 0,3 нМ, или между 0,05 и 0,2 нМ, между от 0,05 и 0,1 нМ.

В некоторых вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают как CD123 человека, так и CD123 яванской макаки с по существу сходной аффинностью связывания. В некоторых вариантах реализации антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связываются как с CD123 человека, так и с CD123 яванской макаки с K_d между 0,05 и 0,3 нМ, или между 0,05 и 0,2 нМ, между от 0,05 и 0,1 нМ.

В некоторых вариантах реализации значение K_d основано на анализе клеточного связывания. В некоторых вариантах реализации значение K_d измеряется с помощью проточной цитометрии.В некоторых вариантах реализации значение K_d измеряется поверхностным плазмонным резонансом (например, с использованием системы поверхностного плазмонного резонанса BIOCORE™). В некоторых вариантах реализации значение K_d измеряется с помощью радиоиммунологического анализа (РИА) В некоторых вариантах реализации значение K_d измеряется с помощью любых других известных в данной области методов.

В некоторых вариантах реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует по меньшей мере 50% 1b3-зависимой пролиферации в антиген-положительных клетках TF-1 в концентрации 0,5 нМ или ниже.

В некоторых вариантах реализации CD123/IL-3Rα-связывающие агенты представляют собой антитела CD123/IL-3Rα или их антигенсвязывающие фрагменты, которые включают вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR) и вариабельный участок легкой цепи (LCVR), каждый из которых содержит три CDR (например, CDR1-CDR3 для HCVR и CDR1-CDR3 для LCVR), где композитные CDR для HCVR и LCVR представляют собой любую из последовательностей, представленных в таблицах 1 и 2 ниже.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи или его фрагмент, содержащий три последовательных определяющих комплементарность областей (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где за исключением 1, 2 или 3 консервативных аминокислотных замещений, CDR1 выбран из группы, состоящей из :SEQ ID NO: 1, 5 и 12, CDR2 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2-3, 6-10, и 13-14 и, необязательно, CDR3 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 4, 11, 15 и 70; и b) по меньшей мере один вариабельный участок легкой цепи или его фрагмент, содержащий три последовательных определяющих комплементарность областей (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где, за исключением 1, 2 или 3 консервативных аминокислотных замен, CDR1 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 16, 19-20, 23 и 72, CDR2 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 17, 21, 24 и 71 и, необязательно, CDR3 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 18, 22 и 25.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи или его фрагмент, содержащий три последовательных определяющих комплементарность областей (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где за исключением 1, 2 или 3 консервативных аминокислотных замещений, CDR1 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, 5 и 12, CDR2 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2-3, 6-10, и 13-14 и, необязательно, CDR3 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 4,11 и 15; и b) по меньшей мере один вариабельный участок легкой цепи или его фрагмент, содержащий три последовательных определяющих комплементарность областей (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, где, за исключением 1, 2 или 3 консервативных аминокислотных замен, CDR1 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 16, 19-20 и 23, CDR2 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 17, 21 и 24 и, необязательно, CDR3 выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 18, 22 и 25.

В некоторых вариантах реализации консервативные аминокислотные замены включают замещение Lys в CDR на Arg (например, замены Lys на Arg в SEQ ID NO: 6 и 7, 8 и 9, и 19 и 20). В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой гуманизированное антитело с CDR-присоединением, содержащее мышиные CDR-области, и где один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) остатков зоны верньевой области тяжелой цепи и/или легкой цепи каркасной области антитела имеют мышечное происхождение.

В некоторых вариантах реализации антитела CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или 3, и, необязательно, CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4; и 2) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17, и, необязательно, CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 2. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах реализации антитела CD123/IL-3Ra и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, 7, 8, 9 или 10 и, необязательно, CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11; и 2) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19 или 20, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, и, необязательно, CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 6 и CDR1 вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 19. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 7 и CDR1 вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 19. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 8 и CDR1 вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 19. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9 и CDR1 вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 19. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10 и CDR1 вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 19. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 6 и CDR1 вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 20. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 7 и CDR1 вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 20. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 8 и CDR1 вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 20. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 9 и CDR1 вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 20. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10 и CDR1 вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 20. Для каждой парной комбинации вариабельной области CDR2 тяжелой цепи с вариабельной областью CDR1 легкой цепи, вариабельная область CDR1 и 3 тяжелой цепи представляют собой SEQ ID NO: 5 и 11, соответственно, и вариабельная область CDR2 и 3 легкой цепи представляют собой SEQ ID NO: 21 и 22, соответственно.

В некоторых вариантах реализации антитела CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13 или 14, и, необязательно, CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15; и 2) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, CDR2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, и, необязательно, CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25. B некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах реализации CDR2 вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах реализации последовательности CDR1 из легкой цепи и тяжелой цепи одного антитела (такие как SEQ ID NO: 5 и 19) можно комбинировать с последовательностями CDR2 из легкой цепи и тяжелой цепи другого антитела (такими как SEQ ID NO: 2 и 17) и, необязательно, может быть объединены с последовательностями CDR3 из легкой цепи и тяжелой цепи того же (например, SEQ ID N0:4 и 18, или 11 и 22) или еще одного антитела (например, SEQ ID NO: 15 и 25).Все возможные комбинации на основе SEQ ID NO: 1-25 в таблице 1, особенно те, которые относятся к одному и тому же номеру антитела (например, все шесть CDR легкой цепи и тяжелой цепи происходят из CD123-3, или из CD123-6, или из CD123-14) рассматриваются в данном документе без исчерпывающего перечисления всех конкретных комбинаций.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты сохраняют аминокислотные замены более 1, 2 или 3 последовательных остатков в любой одной или более последовательностях CDR выше. То есть в некоторых вариантах реализации антитела субъекта и их антигенсвязывающие фрагменты могут иметь консервативные аминокислотные замены на 1, 2 или 3 последовательных остатка в любом одном или более из SEQ ID NO: 1-25.

В некоторых вариантах реализации CD123/IL-3Rα-связывающие агенты представляют собой антитела CD123/IL-3Rα или их антигенсвязывающие фрагменты, которые включают вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR) и вариабельный участок легкой цепи (LCVR), где HCVR и LCVR - это любая из последовательностей, приведенных ниже в таблицах 3А и 4А. Выбранные соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие HCVR и LCVR, приведены в таблицах 3В и 4В.

* Во всех вышеприведенных последовательностях, где 2-й остаток из N-конца представляет собой X (или Хаа), например SEQ ID NO: 34 и 38, X представляет собой F для последовательностей Gv6, тогда как X представляет собой V для последовательностей Gv7.

* Жирные основания обозначают первый кодон зрелой аминокислотной последовательности вариабельной области

* Жирные основания обозначают первый кодон зрелой аминокислотной последовательности вариабельной области.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат:(а) последовательность V_H, по меньшей мере, на 95% идентичную эталонной последовательности V_H, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (или SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 и 38); и/или (b) последовательность V_L, по меньшей мере на 95% идентичную эталонной V_L последовательности, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (или SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 и 37).

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат:(а) последовательность V_H, по меньшей мере, на 96% идентичную эталонной последовательности V_H, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (или SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 и 38); и/или (b) последовательность V_L, по меньшей мере на 96% идентичную эталонной V_L последовательности, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (или SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 и 37).

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат:(а) последовательность V_H, по меньшей мере, на 97% идентичную эталонной последовательности V_H, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (или SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 и 38); и/или (b) последовательность V_L, по меньшей мере на 97% идентичную эталонной V_L последовательности, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (или SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 и 37).

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: (а) последовательность V_H, по меньшей мере, на 98% идентичную эталонной последовательности V_H, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (или SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 и 38); и/или (b) последовательность V_L, по меньшей мере на 98% идентичную эталонной V_L последовательности, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (или SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 и 37).

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123 и их антигенсвязывающие фрагменты содержат:(а) последовательность V_H, по меньшей мере, на 99% идентичную эталонной последовательности V_H, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (или SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 и 38); и/или (b) последовательность V_L, по меньшей мере на 99% идентичную эталонной V_L последовательности, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (или SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 и 37).

В некоторых вариантах реализации CD123/IL-3Rα антитело/его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий определенный процент идентичности последовательности к SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (предпочтительно SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 и 38) и/или 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (или SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 и 37) отличается от SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (или SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 и 38) и/или 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (или SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 и 37) только консервативными аминокислотными заменами, такими как 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены. В некоторых вариантах реализации консервативные аминокислотные замены представляют собой замены 1, 2 или 3 последовательных аминокислот в одной или более областях CDR тяжелых и/или легких цепей.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат:(а) последовательность V_H, идентичную эталонной последовательности V_H, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 и 40 (или SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34 и 38); и/или (b) последовательность V_L, идентичную эталонной V_L последовательности, выбранной из группы, имеющей аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 41 (или SEQ ID NO: 27, 29, 31, 35 и 37).

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: последовательность V_H, как указано в SEQ ID NO: 26 и/или последовательность V_L как указано в SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: последовательность V_H, как указано в SEQ ID NO: 28 и/или последовательность V_L как указано в SEQ ID NO: 29.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: последовательность V_H, как указано в SEQ ID NO: 30 и/или последовательность V_L как указано в SEQ ID NO: 31.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: последовательность V_H, как указано в SEQ ID NO: 34 и/или последовательность V_L как указано в SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат последовательность V_H и последовательность V_L с комбинацией SEQ ID NO выбранных из группы, состоящей из:32/33, 34/33, 38/33, 39/33, 40/33, 32/35, 34/35, 38/35, 39/35, 40/35, 32/37, 34/37, 38/37, 39/37, 40/37, 39/33, 39/35, 39/37, 39/41, 40/33, 40/35,40/37 и 40/41.

Например, в одном варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 или 40; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах реализации последовательность V_H представлена в SEQ ID NO: 39 и/или последовательность V_L представлена в SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах реализации последовательность V_H представлена в SEQ ID NO: 40 и/или последовательность V_L представлена в SEQ ID NO: 41.

В одном родственном варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35. B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 34 представляет собой Phe (F). B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 34 представляет собой Val (V).

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 или 40, за исключением того, что первый остаток заменен на Ser (S); и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41.

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 или 40; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41, за исключением того, что первый остаток заменен на Ser (S).

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59 или 60, за исключением того, что N-концевой остаток представляет собой Ser, и за исключением того, что остаток, соответствующий 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54 представляет собой Cys; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41.

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59 или 60, за исключением того, что остаток, соответствующий 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54 представляет собой Cys; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41, за исключением того, что N-концевой остаток представляет собой Ser.

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 38 представляет собой Phe (F). B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 38 представляет собой Val (V).

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37. B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 34 представляет собой Phe (F).B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 34 представляет собой Val (V).

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35. B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 56 представляет собой Phe (F).B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 56 представляет собой Val (V).

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37. B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 54 представляет собой Phe (F). B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 54 представляет собой Val (V).

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59 или 60, за исключением того, что остаток, соответствующий 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54 представляет собой Cys; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41.

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35. B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 54 представляет собой Phe (F). B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 54 представляет собой Val (V).

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35. B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 56 представляет собой Phe (F). B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 56 представляет собой Val (V).

В другом варианте реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты содержат: а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54; и b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37. B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 54 представляет собой Phe (F).B некоторых вариантах реализации Хаа в SEQ ID NO: 54 представляет собой Val (V).

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα и их антигенсвязывающие фрагменты специфически связывают CD123/IL-3Rα. B некоторых вариантах реализации антитело против CD123/IL-3Rα и его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой мышиное, химерное, гуманизированное или человеческое антитело его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывает CD123/IL-3Rα. B некоторых вариантах реализации антитело против и его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело с CDR-присоединением, или антитело с измененной поверхностью, или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα представляют собой полноразмерные антитела. Полноразмерные антитела могут содержать любое из вышеуказанных антител, определенных с помощью 1-4 CDR (например, CDR1 и CDR2 тяжелой цепи, CDR1 и CDR2 тяжелой и легкой цепей), 1-6 последовательностей CDR (например, CDR1 -CDR3 тяжелой цепи, CDR1-CDR3 тяжелой и легкой цепей) или любое из вышеуказанных антител, определенных с помощью LCVR и/или HCVR, или любое из полноразмерных антител, имеющих последовательность тяжелой цепи в таблице 5, или любое из полноразмерных антител, имеющих последовательность легкой цепи в таблице 6, или любое из полноразмерных антител, имеющих последовательность тяжелой цепи в таблице 5 и последовательность легкой цепи в таблице 6.

* Во всех вышеприведенных последовательностях, где 2-й остаток из N-конца представляет собой Х (или Хаа), например SEQ ID NO: 50, 53, 54 и 56, X представляет собой F для последовательностей Gv6, тогда как Х представляет собой V для последовательностей Gv7. B некоторых вариантах реализации Met (выделено жирным) в SEQ ID NO: 44 представляет собой Pro.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα представляют собой полноразмерные антитела, содержащие: (а) тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности для любой из полноразмерных последовательностей тяжелой цепи, указанных выше, например, любой из полноразмерных последовательностей тяжелой цепи в таблице 5; и/или (b) легкую цепь, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности для любой из полноразмерных последовательностей легкой цепи, указанных выше, такой как любая из полноразмерных последовательностей легкой цепи в таблице 6. В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα представляют собой полноразмерные антитела, содержащие комбинацию полноразмерной последовательности тяжелой цепи и полноразмерной последовательности легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42/43, 44/45, 46/47, 48/49, 50/49, 53/49, 54/49, 56/49, 59/49, 60/49, 48/51, 50/51, 53/51, 54/51, 56/51, 59/51, 60/51, 48/58, 50/58, 53/58, 54/58, 56/58, 59/58, 60/58, 59/49, 59/51, 59/58, 59/61, 60/49, 60/51, 60/58 и 60/61, или антитела с по меньшей мере приблизительно 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности для любой из их полноразмерных последовательностей тяжелой цепи и/или последовательностей легкой цепи.

В некоторых вариантах реализации антитела против CD123/IL-3Rα представляют собой полноразмерные антитела, содержащие комбинацию полноразмерной последовательности тяжелой цепи и полноразмерной последовательности легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59/61 и 60/61, или антитела с по меньшей мере приблизительно 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности для любой из их полноразмерных последовательностей тяжелой цепи и/или последовательностей легкой цепи. Такие антитела могут дополнительно содержать модифицированный Ser/Thr на N-конце легкой цепи, тяжелой цепи или обеих. Такие антитела могут дополнительно содержать модифицированый Cys в домене СН3 тяжелой цепи в положении, соответствующему от 5-го до последнего Cys SEQ ID NO: 54.

В некоторых вариантах реализации антитело против CD123/IL-3Rα представляет собой мышиное, химерное, гуманизированное или человеческое антитело, которое специфически связывает CD123/IL-3Rα. B некоторых вариантах реализации антитело против CD123/IL-3Rα, имеющее определенный процент идентичности последовательности с любым из полноразмерных SEQ ID NO, отличается от таких SEQ ID NO только консервативными аминокислотными заменами, например, 1, 2, 3, 4 или 5 последовательными консервативными аминокислотными заменами. В некоторых вариантах реализации консервативные аминокислотные замены находятся вне CDR.

В некоторых вариантах реализации его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой или содержит Fab, Fd, Fab', F(ab')₂, одноцепочечный Fv или scFv, связанный дисульфидным мостиком Fv, V-NAR-домен, IgNar, интратело, IgGΔCH 2, мини-антитело, F(ab’)₃, тетратело, триатело, диатело, однодоменное антитело, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)₂ или scFv-Fc из любого одного из вышеуказанных антител.

В связанном аспекте изобретение также обеспечивает полипептид, содержащий любое из антител или их антигенсвязывающих фрагментов, любую из последовательностей V_H и/или V_L, указанных выше, любую из HCVR и/или LCVR выше, или любую из CDR последовательности(ей) HCVR и/или LCVR, указанных выше. Полипептид может быть, например, слит с белком или доменом, не являющимся антителом. В некоторых вариантах реализации слитый белок не слит с псевдомонадным токсином.

Сродство или авидность антитела к антигену можно определить экспериментально с использованием любого подходящего метода, хорошо известного в данной области, например, проточной цитометрии, иммуно-абсорбентного анализа с ферментным связыванием (ELISA) или радиоиммуноанализа (RIA) или кинетики (например, анализа BIACORE™). Способы прямого связывания, а также форматы конкурентного связывания могут быть легко использованы. См., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," in Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); и методы, описанные в данном документе.

Измеренное сродство конкретного взаимодействия антитело-антиген может изменяться, если измерять его в разных условиях (например, концентрация соли, рН, температура). Таким образом, измерения сродства и других антигенсвязывающих параметров (например, K_D или K_d, k_нач, k_oконч) производятся со стандартизованными растворами антител и антигена и стандартизованным буфером, как известно в данной области, и такими, как буфер, описанный в данном документе.

В одном аспекте анализы связывания могут быть выполнены с использованием проточной цитометрии на клетках, экспрессирующих антиген CD123/IL-3Rα на поверхности. Например, CD123/IL-3Rα-позитивные клетки можно инкубировать с различными концентрациями антител против CD123/IL-3Rα с использованием 1×10⁵клеток на образец в 100 мкл FACS-буфера (например, среда RPMI-1640, дополненная 2% нормальной сывороткой козы). 3атем клетки можно гранулировать, промывать и инкубировать в течение 1 часа с помощью 100 мкл FITC-конъюгированного козьим антимышиным или козьим античеловеческим IgG-антителом (такое как можно получить, например, из Jackson Laboratory, 6 мкг/мл в буфере FACS). Затем клетки снова гранулируют, промывают FACS-буфером и ресуспендируют в 200 мкл PBS, содержащем 1% формальдегида. Образцы могут быть получены, например, с использованием проточного цитометра FACSCalibur с многолучевым пробоотборником HTS и проанализированы с использованием CellQuest Pro (все из BD Biosciences, Сан-Диего, США). Для каждого образца средняя интенсивность флуоресценции для FL1 (MFI) может быть экспортирована и нанесена на график против концентрации антитела в полулогарифмическом графике для создания кривой связывания. Кривая «доза-реакция» сигмоидальной формы установлена для кривых связывания, а значения ЕС₅₀ вычисляются с использованием таких программ, как GraphPad Prism v4 с параметрами по умолчанию (программное обеспечение GraphPad, Сан-Диего, Калифорния).3начения ЕС₅₀ могут использоваться в качестве меры для наблюдаемой постоянной диссоциации «K_d» или «K_D» для каждого антитела.

Моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомных методов, таких как описанные Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Используя гибридомный метод, мышь, хомяк или другое подходящее животное-хозяин, иммунизируют, чтобы вызвать продуцирование лимфоцитами антител, которые будут специфически связываться с иммунизирующим антигеном. Лимфоциты также могут быть иммунизированы in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и сливают с подходящей клеточной линией миеломы, используя, например, полиэтиленгликоль, с образованием гибридомных клеток, которые затем могут быть выбраны вне от незадействованных лимфоцитов и клеток миеломы. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, направленные специфически против выбранного антигена, как определено путем иммунопреципитации, иммуноблоттинга или путем анализа in vitro (например, радиоиммуноанализа (RIA), иммуноферментного анализа с ферментным связыванием (ELISA)), могут затем распространяться либо в культуре in vitro используя стандартные методы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) или in vivo как асцитные опухоли у животного. Моноклональные антитела затем могут быть очищены от культуральной среды или асцитной жидкости, как описано для поликлональных антител.

Альтернативно моноклональные антитела также могут быть получены с использованием способов рекомбинантной ДНК, как описано в патенте США №4816567. Полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело, выделяют из зрелых В-клеток или клеток гибридомы, с помощью таких способов как RT-PCR с использованием олигонуклеотидных праймеров, которые специфически амплифицируют гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, и их последовательность определяют с использованием обычных процедур. Выделенные полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи, затем клонируют в подходящие векторы экспрессии, которые при трансфекции в клетки-хозяева, такие как клетки Е. coli, клетки COS обезьян, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые не производят белок иммуноглобулина иным способом, моноклональные антитела генерируются клетками-хозяевами. Кроме того, рекомбинантные моноклональные антитела или их фрагменты из желаемых видов могут быть выделены из дисплейных библиотек фагов, экспрессирующих CDR желаемых видов, как описано (McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990; Clackson et al., Nature, 352: 624-628, 1991, Marks et al., J. Mol.Biol. 222:581-597, 1991).

Полинуклеотид(ы), кодирующий моноклональное антитело, можно дополнительно модифицировать различными способами, используя технологию рекомбинантной ДНК для получения альтернативных антител. В некоторых вариантах реализации константные домены легкой и тяжелой цепей, например мышиного моноклонального антитела, могут быть замещены 1) для тех областей, например, человеческого антитела с образованием химерного антитела или 2) для неиммуноглобулинового полипептида с образованием слитого антитела. В некоторых вариантах реализации константные области укорачиваются или удаляются для получения желаемого фрагмента антитела моноклонального антитела. Для оптимизации специфичности, сродства и т.д. моноклонального антитела можно использовать мутагенез вариабельной области с направленной ориентацией или высокой плотностью.

В некоторых вариантах реализации моноклональное антитело против CD123/IL-3Rα человека представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах реализации такие антитела используются терапевтически для уменьшения антигенности и ответов НАМА (человеческого антимышиного антитела) при введении человеку.

Способы модификации, гуманизации или изменения поверхности антител, отличных от человека, или антител человека, также могут быть использованы и хорошо известны в данной области. Гуманизированное, антитело с измененной поверхностью или аналогично модифицированное антитело может иметь один или несколько аминокислотных остатков из источника, который не является человеком, например, но не ограничиваясь ими, мыши, крысы, кролика, человека или другого млекопитающего. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки заменяются остатками, которые часто называются «импортными» остатками, которые обычно берутся из «импортного» вариабельного, константного или другого домена известной человеческой последовательности.

Такие импортированные последовательности могут быть использованы для снижения иммуногенности или уменьшения, улучшения или модификации связывания, сродства, скорости, скорости, авидности, специфичности, периода полувыведения или любой другой подходящей характеристики, как известно в данной области. Как правило, остатки CDR непосредственно и наиболее существенно влияют на связывание CD123/IL-3Rα. Соответственно, часть или все последовательности CDR, отличные от человека или человека, поддерживаются, в то время как нечеловеческие последовательности вариабельной и константной областей могут быть заменены человеческими или другими аминокислотами.

Антитела также могут быть гуманизированными, антителами с измененной поверхностью, искусственными или человеческими антителами, модифицированными с сохранением высокой аффинности к антигену CD123/IL-3Rα и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированные (или человеческие) или модифицированные антитела против CD123/IL-3Rα и антитела с измененной поверхностью могут быть, необязательно, получены с помощью процесса анализа родительских последовательностей и различных схематических гуманизированных и модифицированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских, модифицированных и гуманизированных последовательностей. Модели трехмерного иммуноглобулина обычно доступны и знакомы специалистам в данной области техники. Существуют компьютерные программы, которые показывают и отображают вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей кандидатов-иммуноглобулинов. Просмотр этих визуализаций позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании последовательности кандидата иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность кандидата иммуноглобулина связывать его антиген, такой как CD123/IL-3Rα. Таким образом, каркасные (FR) остатки могут быть выбраны и скомбинированы из консенсусных и импортных последовательностей таким образом, что достигается желательная характеристика антитела, такая как повышенная аффинность к целевому антигену.

Гуманизация, изменение поверхности или модификация антител по данному изобретению могут быть выполнены с использованием любого известного способа, но не ограничиваясь ими, такого как описанный в Winter (Jones et al., Nature 321: 522, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239: 1534, 1988, Sims et al., J. Immunol. 151:2296, 1993; Chothia and Lesk, J. Mol.Biol. 196:901, 1987, Carter et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 89:4285, 1992; Presia et al., J. Immunol. 151:2623, 1993; Raguska et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 91(3):969-973, 1994; патентах США №№5639641, 5723323; 5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5766886; 5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539; 4816567; PCT/:US 98/16280; US 96/18978; US 91/09630; US 91/05939; US 94/01234; GB 89/01334; GB 91/01134; GB 92/01755; WO 90/14443; WO 90/14424; WO 90/14430; EP 229246; 7557189; 7538195; и 7342110, каждый из которых включен в данное описание в качестве ссылки в полном объеме, включая ссылки приведенные тут.

В некоторых альтернативных вариантах реализации антитело к CD123/IL-3Rα является человеческим антителом. Антитела человека могут быть непосредственно получены с использованием различных методов, известных в данной области. Могут быть получены иммортализованные человеческие В-лимфоциты, иммунизированные in vitro или выделенные из иммунизированного индивидуума, которые продуцируют антитело, направленное против целевого антигена (см., например. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. стр. 77(1985), Boemer et al., 1991, J. Immunol, 147(1): 86-95 и патент США 5750373). Кроме того, человеческое антитело может быть выбрано из библиотеки фагов, где эта фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела, как описано, например, в Vaughan et al., Nat. Biotech. 14:309-314, 1996, Sheets et al., 95: 6157-6162, 1998, Hoogenboom and Winter, J. Mol.Biol. 227:381, 1991, and Marks et al., J. Mol.Biol. 222:581, 1991). Способы получения и использования фаговых библиотек антител также описаны в патентах США №№5969108, 6172197, 5885793, 6521404; 6544731; 6555313; 6582915; 6593081; 6300064; 6653068; 6706484; и 7264963; и Rothe et al., J. Mol.Bio.doi: 10.1016/j.jmb. 2007.12.018, 2007 (каждый их которых включен в данный документ в качестве ссылки во всей их полноте). Стратегии созревания аффинности и стратегии перетасовки цепи (Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783, 1992, включенные путем ссылки во всей своей полноте) известны в данной области и могут быть использованы для получения высокоаффинных человеческих антител.

Гуманизированные антитела также могут быть получены у трансгенных мышей, содержащих локусы иммуноглобулина человека, которые способны при иммунизации продуцировать полный репертуар человеческих антител в отсутствие продукции эндогенного иммуноглобулина. Этот подход описан в патентах США 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016.

В некоторых вариантах реализации предлагается фрагмент антитела, например, для увеличения проникновения в опухоли. Известны различные методы получения фрагментов антител. Традиционно эти фрагменты получают путем протеолитического расщепления интактных антител (например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117, 1993; Brennan et al., Science 229:81, 1985). B некоторых вариантах реализации фрагменты антител получают рекомбинантно. Fab, Fv и scFv фрагменты антитела могут быть экспрессированы и секретированы из Е. coli или других клеток-хозяев, что позволяет получать большие количества этих фрагментов. Такие фрагменты антител также могут быть выделены из фаговых библиотек антител. Фрагмент антитела также может быть линейным антителом, как описано, например, в патенте США 5641870 и может быть моноспецифическим или биспецифическим. Квалифицированным специалистам будут очевидны другие способы получения фрагментов антител.

Для целей данного изобретения следует иметь в виду, что модифицированные антитела могут содержать вариабельный участок любого типа, который обеспечивает ассоциацию антитела с полипептидами человеческого CD123/IL-3Rα. B этом отношении вариабельная область может содержать или быть получена из любого млекопитающего, который может быть индуцирован для формирования гуморального ответа и генерации иммуноглобулинов против желаемого антигена, ассоциированного с опухолью. Таким образом, вариабельная область модифицированных антител может быть, например, человеческого, мышиного происхождения, происходить от примата, не являющегося человеком, (например, яванских макак, макак и т.д.) или от волка. В некоторых вариантах реализации как вариабельная, так и константная области модифицированных иммуноглобулинов являются человеческими. В других вариантах реализации вариабельные области совместимых антител (обычно полученные из источника, отличного от человека) могут быть модифицированы или специально адаптированы для улучшения связывающих свойств или уменьшения иммуногенности молекулы. В этом отношении вариабельные области, полезные в данном изобретении, могут быть гуманизированы или иным образом изменены путем включения импортированных аминокислотных последовательностей.

В некоторых вариантах реализации вариабельные домены как в тяжелой, так и в легкой цепях изменяются, по меньшей мере, с частичной заменой одного или более CDR и, при необходимости, путем замены частичной каркасной области и изменения последовательности. Хотя CDR могут происходить из антитела того же класса или даже подкласса как антитела, из которого получены каркасные области, предполагается, что CDR будут получены из антитела разного класса и в некоторых вариантах реализации из антитела из другого вида. Возможно, нет необходимости заменять все CDR на полные CDR из вариабельной области донора, чтобы перенести антигенсвязывающую способность одного переменного домена в другой. Скорее, может потребоваться только перенос тех остатков, которые необходимы для поддержания активности антигенсвязывающего сайта. Учитывая объяснения, изложенные в патентах США №№5585089, 5693761 и 5693762 они могут быть в пределах компетенции специалистов в данной области, либо путем проведения обычных экспериментов, либо путем испытания и тестирования ошибок для получения функционального антитела с пониженной иммуногенностью.

Несмотря на изменения в вариабельной области, специалисты данной области техники поймут, что модифицированные антитела по данному изобретению будут содержать антитела (например, антитела с полной длиной или их иммунореактивные фрагменты), в которых по меньшей мере часть одного или нескольких доменов константных областей были удалены или, иначе говоря, изменены таким образом, чтобы обеспечить требуемые биохимические характеристики, такие как увеличение локализации опухоли или уменьшение периода полувыведения в сыворотке по сравнению с антителом примерно такой же иммуногенности, включающей нативную или неизмененную константную область. В некоторых вариантах реализации константная область модифицированных антител будет содержать константную область человека. Изменения в константной области, совместимой с данным изобретением, включают добавления, делеции или замены одной или несколько аминокислот в одном или нескольких доменах. То есть модифицированные антитела, описанные в данном документе, могут содержать изменения или модификации одного или нескольких из трех константных доменов тяжелой цепи (СН1, СН2 или СН3) и/или константного домена легкой цепи (CL). B некоторых вариантах реализации предполагаются модифицированные константные области, в которых один или несколько доменов частично или полностью удалены. В некоторых вариантах реализации модифицированные антитела будут содержать удаленные конструкции или варианты, в которых весь домен СН2 удален (конструкции АСН2). В некоторых вариантах реализации исключенный домен константной области будет заменен коротким аминокислотным спейсером (например, 10 остатков), который обеспечивает некоторую молекулярную гибкость, обычно передаваемую отсутствующей константной областью.

Следует отметить, что в некоторых вариантах реализации модифицированные антитела могут быть модифицированы так, чтобы соединять домен СН3 непосредственно в шарнирную область соответствующих модифицированных антител. В других конструкциях может быть желательно обеспечить пептидный спейсер между шарнирной областью и модифицированными доменами СН2 и/или СН3. Например, могут быть экспрессированы совместимые конструкции, в которых домен СН2 удален, а оставшийся СН3-домен (модифицированный или немодифицированный) соединен с шарнирной областью с 5-20 аминокислотным спейсером. Например, такой разделитель может быть добавлен, чтобы гарантировать, что регуляторные элементы константного домена остаются свободными и доступными или что шарнирная область остается гибкой. Однако следует отметить, что аминокислотные спейсеры могут в некоторых случаях оказаться иммуногенными и вызывать нежелательный иммунный ответ на конструкцию. Соответственно, в некоторых вариантах реализации любой спейсер, добавленный к конструкции, будет относительно неиммуногенным или даже полностью исключен, чтобы поддерживать желаемые биохимические свойства модифицированных антител.

Кроме делеции целых доменов константных областей, будет понятно, что антитела по данному изобретению могут быть получены путем частичной делеции или замещения нескольких или даже одной аминокислоты. Например, мутация одной аминокислоты в выбранных областях домена СН2 может быть достаточной для существенного снижения связывания Fc и, следовательно, увеличения локализации опухоли. Аналогичным образом может быть желательно просто удалить эту часть одного или нескольких доменов с константной областью, которые управляют эффекторной функцией (например, связывание с комплементом C1Q) для модуляции. Такие частичные делеции константных областей могут улучшить выбранные характеристики антитела (время полужизни в сыворотке крови), когда при этом другие желательные функции, связанные с доменом константной области субъекта, остаются нетронутыми. Кроме того, как указано выше, константные области раскрытых антител могут быть модифицированы, например, посредством мутации или замены одной или нескольких аминокислот, что может улучшить профиль полученной конструкции. В этом отношении может быть возможно нарушить активность, обеспечиваемую консервативным сайтом связывания (например, связывание Fc), в то же время сохраняя при этом конфигурацию и иммуногенный профиль модифицированного антитела. Некоторые варианты реализации могут включать добавление одной или нескольких аминокислот в константную область для улучшения желательных характеристик, таких как уменьшение или увеличение эффекторной функции или обеспечение большего присоединения цитотоксина или углеводов. В таких вариантах реализации может быть желательно вставить или реплицировать определенные последовательности, полученные из выбранных доменов с константной областью.

Данное изобретение также охватывает варианты и эквиваленты, которые по существу гомологичны химерным, гуманизированным и человеческим антителам или их фрагментам антител, изложенным в данном документе. Они могут содержать, например, консервативные мутации замещения, то есть замену одной или нескольких аминокислот подобными аминокислотами. Например, консервативная замена относится к замещению аминокислоты другой в том же общем классе, такой как, например, одна кислая аминокислота с другой кислой аминокислотой, одна основная аминокислота с другой основной аминокислотой или одна нейтральная аминокислота другой нейтральной аминокислотой. То, что предназначено консервативной аминокислотной заменой, хорошо известно в данной области, как определено выше.

Полипептиды по данному изобретению могут быть рекомбинантными полипептидами, природными полипептидами или синтетическими полипептидами, содержащими антитело или его фрагмент против человеческого CD123/IL-3Rα. B данной области техники будет понятно, что некоторые аминокислотные последовательности по изобретению могут быть изменены без значительного влияния на структуру или функцию белка. Таким образом, изобретение дополнительно включает вариации полипептидов, которые проявляют существенную активность или которые включают области антитела, или их фрагмента против антигена CD123, такого как CD123 человека. Такие мутанты включают делеции, вставки, инверсии, повторы и замены типов.

Полипептиды и аналоги можно дополнительно модифицировать для того, чтобы содержать дополнительные химические фрагменты, которые обычно не являются частью белка. Эти производные фрагменты могут улучшить растворимость, биологическую полужизнь или поглощение белка. Фрагменты также могут уменьшать или устранять любые желательные побочные эффекты белков и тому подобное. Обзор этих фрагментов можно найти в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

Выделенные полипептиды, описанные в данном документе, могут быть получены любым подходящим способом, известным в данной области. Такие способы варьируют от прямых синтетических способов для модификации последовательности ДНК, кодирующей изолированные полипептидные последовательности, и экспрессии этих последовательностей в подходящем трансформированном хозяине. В некоторых вариантах реализации последовательность ДНК модифицирована с использованием рекомбинантной технологии путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес белок дикого типа. Необязательно, последовательность может быть подвергнута мутагенезу с помощью сайт специфического мутагенеза с получением функциональных аналогов. См., напр., Zoeller et al., USA 81: 5662-5066, 1984, и патент США №4 588 585.

В некоторых вариантах реализации последовательность ДНК, кодирующая представляющий интерес полипептид (например, антитело, антигенсвязывающий фрагмент или полипептид по изобретению), полностью или частично конструируется химическим синтезом с использованием олигонуклеотидного синтезатора. Такие олигонуклеотиды могут быть модифицированы на основе аминокислотной последовательности желаемого полипептида и выбора тех кодонов, которые предпочтительны в клетке-хозяине, в которой будет продуцироваться представляющий интерес рекомбинантный полипептид. Стандартные методы могут применяться для синтеза выделенной полинуклеотидной последовательности, кодирующей выделенный полипептид, представляющий интерес. Например, полную последовательность аминокислот можно использовать для конструирования обратного транслируемого гена. Кроме того, может быть синтезирован олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретный выделенный полипептид. Например, несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части желаемого полипептида, могут быть синтезированы и затем лигированы. Отдельные олигонуклеотиды обычно содержат 5' или 3' выступы для комплементарной сборки.

После сборки (путем синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другого способа) полинуклеотидные последовательности, кодирующие конкретный выделенный полипептид, представляющий интерес, будут вставлены в вектор экспрессии и функционально связаны с последовательностью контроля экспрессии, подходящей для экспрессии белка в желаемом хозяине. Надлежащая сборка может быть подтверждена нуклеотидным секвенированием, картированием рестрикции и экспрессией биологически активного полипептида в подходящем хозяине. Как хорошо известно в данной области, для получения высоких уровней экспрессии трансфицированного гена в хозяине ген должен быть функционально связан с последовательностями контроля транскрипции и трансляционной экспрессии, которые являются функциональными в выбранном хозяине экспрессии.

В некоторых вариантах реализации рекомбинантные экспрессирующие векторы используются для амплификации и экспрессии ДНК, кодирующих антитела или их фрагменты, против CD123/IL-3Rα человека. Рекомбинантные векторы экспрессии представляют собой реплицируемые ДНК-конструкции, которые имеют синтетические или ДНК-фрагменты, происходящие от кДНК, кодирующие полипептидную цепь антитела против CD123/IL-3Rα или его фрагмента, функционально связанные с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами, полученными из млекопитающих, микробных, вирусных или генов насекомых. Транскрипционная единица обычно содержит сборку (1) генетического элемента или элементов, имеющих регуляторную роль в экспрессии генов, например транскрипционных промоторов или энхансеров, (2) структурную или кодирующую последовательность, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в белок, и (3) соответствующие последовательности инициации транскрипции, и трансляции, и терминации. Такие регуляторные элементы могут включать последовательность операторов для контроля транскрипции. Могут быть также дополнительно включены возможность репликации в хазяине, обычно предоставляемая ориджином репликации, и геном отбора для облегчения распознавания трансформантов. Области ДНК функционально связаны, когда они функционально связаны друг с другом. Например, ДНК для сигнального пептида (секреторного лидера) функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в качестве предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он контролирует транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы допускать трансляцию. Структурные элементы, предназначенные для использования в системах экспрессии дрожжей, включают лидерную последовательность, обеспечивающую внеклеточную секрецию трансллированного белка клеткой-хозяином. Альтернативно, когда рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать N-концевой остаток метионина. Этот остаток необязательно может быть впоследствии отщеплен от экспрессированного рекомбинантного белка с получением конечного продукта.

Выбор последовательности контроля над экспрессией и вектора экспрессии будет зависеть от выбора хозяина. Можно использовать широкий спектр комбинаций экспрессии хозяина/вектора. Полезные экспрессирующие векторы для эукариотических хозяев включают, например, векторы, содержащие последовательности контроля экспрессии из SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса. Используемые экспрессирующие векторы для бактериальных хозяев включают известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из Escherichia coli, включая pCR 1, pBR322, pMB9 и их производные, плазмиды для более широкого диапазона хозяев, такие как М13 и нитевидные одноцепочечные ДНК-фаги.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии CD123/1b-3Rα-связывающего полипептида или антитела (или белка CD123/IL-3Rα для использования в качестве антигена) включают прокариоты, дрожжи, насекомые или высшие эукариотические клетки под контролем соответствующих промоторов. Прокариоты включают грамотрицательные или грамположительные организмы, например Е. coli или bacilli. Высшие эукариотические клетки включают установленные клеточные линии млекопитающего, такие как клетки СНО. Также могут быть использованы бесклеточные системы трансляции. Соответствующие векторы клонирования и экспрессии для использования с клеточными хозяевами бактериальными, грибными, дрожжевыми и клеточными хозяевами млекопитающих описаны Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, NY, 1985), соответствующее раскрытие которого включено в данное описание посредством ссылки. Дополнительная информация о способах производства белка, включая продукцию антител, может быть найдена, например, в публикации патента США №2008/0187954, патентах США №№6413746 и 6660501 и международной патентной публикации № WO 04009823, каждая из которых включена в данном документе в качестве ссылки в полном объеме.

Для экспрессии рекомбинантного белка также выгодно использовать различные системы культивирования клеток млекопитающих или насекомых. Экспрессия рекомбинантных белков может быть осуществлена в клетках млекопитающих, поскольку такие белки обычно правильно складываются, соответствующим образом модифицируются и полностью функциональны. Примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих включают HEK-293 и HEK-293Т, линии COS-7 клеток почек обезьян, описанные Gluzman (Cell 23:175, 1981) и другие клеточные линии, включая, например, L-клетки, CI 27, 3Т3, клеточные линии яичника китайского хомячка (СНО), HeLa и BHK. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать нетранслируемые элементы, такие как ориджин репликации, подходящий промотор и энхансер, связанный с экспрессируемым геном, и другие 5' или 3' фланкирующие непереписанные последовательности и 5' или 3' нетранслируемые последовательности, такие как необходимые сайты связывания рибосомы, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга и последовательности терминации транскрипции. Бакуловирусные системы для производства гетерологичных белков в клетках насекомых рассмотрены Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

Таким образом, один аспект изобретения также обеспечивает клетку, продуцирующую любое одно из антитела субъекта или его антигенсвязывающего фрагмента, или любой один из полипептида субъекта. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой клетку HEK-293 или HEK-293Т, клетку COS-7, клетку L, клетку CI 27, клетку 3Т3, клетку яичника китайского хомячка (СНО), клетку HeLa или клетку BHK. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой клетку СНО.

Белки, полученные трансформированным хозяином, могут быть очищены в соответствии с любым подходящим способом. Такие стандартные методы включают хроматографию (например, ионообменную, аффинную и колоночную хроматографию по размеру), центрифугирование, дифференциальную растворимость или любой другой стандартный метод очистки белка. К белку могут присоединяться метки аффиности, такие как гексагистидин, домен, связывающий мальтозу, последовательность оболочки гриппа и глутатион-S-трансфераза, чтобы обеспечить легкую очистку путем прохождения через соответствующую аффинную колонку. Выделенные белки также могут быть физически охарактеризованы с использованием таких методов, как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеновская кристаллография.

Например, супернатанты из систем, которые секретируют рекомбинантный белок в культуральную среду, могут быть сначала сконцентрированы с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрации белка, например, ультрафильтрационной установки Amicon или Millipore Pellicon. После стадии концентрирования концентрат можно наносить на подходящую матрицу очистки. Альтернативно, может быть использована анионообменная смола, например матрица или субстрат, имеющие боковые группы диэтиламиноэтила (DEAE). Матрицами могут быть акриламид, агароза, декстран, целлюлоза или другие типы, обычно используемые для очистки белка. Альтернативно, можно использовать стадию обмена катионом. Подходящие катиониты включают различные нерастворимые матрицы, содержащие сульфопропильные или карбоксиметильные группы. Наконец, можно использовать один или несколько этапов высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ) с использованием гидрофобной среды ОФ-ВЭЖХ, например силикагеля, имеющего боковые метил или другие алифатические группы, для дополнительной очистки CD123/IL-3Rα - связывающего агента. Некоторые или все вышеуказанные стадии очистки в различных сочетаниях также могут быть использованы для получения гомогенного рекомбинантного белка.

Рекомбинантный белок, продуцируемый в бактериальной культуре, можно выделить, например, путем первоначальной экстракции из клеточных гранул, с последующим проведением одной или нескольких концентраций, высаливания, водного ионообмена или стадии эксклюзионной хроматографии. Для конечных этапов очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Микробные клетки, используемые для экспрессии рекомбинантного белка, могут быть разрушены любым удобным способом, включая циклы замораживания-оттаивания, ультразвуковое исследование, механическое разрушение или использование агентов, лизирующих клетки.

Методы, известные в данной области для очистки антител и других белков, также включают, например, те, которые описаны в публикациях патента США №№2008/0312425, 2008/0177048 и 2009/0187005, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки в данном документе в полном объеме.

В некоторых вариантах реализации CD123/IL-3Rα-связывающий агент по данному изобретению имеет N-концевой серин, который может быть окислен окислителем с образованием окисленного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего группу N-концевого альдегида.

Любой подходящий окислитель можно использовать на стадии (а) описанных выше способов. В некоторых вариантах реализации окислитель представляет собой периодат. Конкретнее, окислитель представляет собой периодат натрия.

Могут использоваться избыточные молярные эквиваленты окислителя относительно CDL123/IL-3Rα-связывающего агента. В некоторых вариантах реализации можно использовать примерно 2-100, 5-80, 10-50, 1-10 или 5-10 молярных эквивалентов окислителя. В некоторых вариантах реализации может быть использовано около 10 или около 50 эквивалентов окислителя. Когда используется большое количество окислителя, для предотвращения чрезмерного окисления используется короткое время реакции. Например, когда используют 50 эквивалентов окислителя, реакцию окисления проводят в течение примерно от 5 до 60 минут. Альтернативно, когда используют 10 эквивалентов окислителя, реакцию проводят в течение примерно от 30 минут до примерно 24 часов. В одном варианте реализации используют 5-10 молярных эквивалентов окислителя и реакцию окисления проводят в течение примерно от 5 до 60 минут (например, от около 10 до около 30 минут, от около 20 до около 30 минут).

В некоторых вариантах реализации реакция окисления не приводит к значительному нецелевому окислению. Например, ни одна значимая величина (например, менее 20%, менее 10%, менее 5%, менее 3%, менее 2% или менее 1%) метионина и/или гликанов не окисляется во время процесса окисления N-концевого серина для получения окисленного CDL123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего N-концевую альдегидную группу.

В некоторых вариантах реализации CDL123/IL-3Rα-связывающий агент по данному изобретению имеет рекомбинантно модифицированный остаток Cys, такой как остаток Cys, соответствующий 5-му последнему Cys в, например, SEQ ID NO: 54 или 56 (т.е., остаток Cys в позиции 442 нумерации ЕU/OU). Таким образом, термин «антитело с модифицированным цистеином», включает антитело с по меньшей мере одним Cys, который обычно не присутствует в данном остатке легкой цепи или тяжелой цепи антитела. Такой Cys, который также можно назвать «модифицированным Cys», может быть модифицирован с использованием любой традиционной технологии молекулярной биологии или рекомбинантной ДНК (например, путем замены кодирующей последовательности остатком, который не является Cys, на целевом остатке с кодирующей последовательностью для Cys). Например, если исходным остатком является Ser с кодирующей последовательностью 5'-UCU-3', кодирующая последовательность может быть мутирована (например, путем сайт-направленного мутагенеза) до 5'-UGU-3', которая кодирует Cys. B некоторых вариантах реализации Cys-модифицированное антитело по изобретению имеет модифицированный Cys в тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации модифицированный Cys находится в области СН3 тяжелой цепи или вблизи нее. В некоторых вариантах реализации модифицированный Cys соответствует 5-му последнему Cys, в, например, SEQ ID NO: 54 или 56. Модифицированную последовательность тяжелой (или легкой) цепи антитела можно вводить в подходящий рекомбинантный вектор экспрессии для получения модифицированного антитела, имеющего модифицированный остаток Cys вместо исходного остатка Ser.

3. Иммуноконъюгаты

Во втором аспекте данное изобретение также относится к иммуноконъюгатам, содержащим описанные в данном документе CDL123/IL-3Rα-связывающие агенты, ковалентно связанные с одной или несколькими молекулами цитотоксических агентов, описанных в данном документе.

В первых вариантах реализации иммуноконъюгат по данному изобретению включает CDL123/IL-3Rα-связывающие агенты (включая антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или полипептид, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), описанные в данном документе, ковалентно связанные с цитотоксическим агентом, описанным в данном документе, через ε-аминогруппу одного или нескольких остатков лизина, расположенных на CD123/IL-3Rα связывающих агентах.

В 1-м конкретном варианте реализации первого варианта реализации иммуноконъюгат по данному изобретению представлен следующей формулой:

в которой:

СВА представляет собой CD123/IL-3Rα связывающий агент (например, антитело субъекта или антигенсвязывающий фрагмент, описанный выше, или описанный выше полипептид субъекта), который ковалентно связан через остаток лизина с Cy^L1;

W_L представляет собой целое число от 1 до 20; а также

Cy^L1 представляет собой цитотоксическое соединение, представленное следующей формулой:

или

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она является двойной связью, Х отсутствует и Y представляет собой -Н или (С₁-С₄)алкил; а когда она представляет собой одинарную связь, Х представляет собой -Н или аминозащитную группу, а Y представляет собой -ОН или -SO₃M;

W' представляет собой -NR^e',

R^e' представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

R^x3 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

L' представлен следующей формулой:

-NR₅-P-C(=O)-(CR_aR_b)_m-C(=O)- (В1'); или

-NR₅-Р-С(=O)-(CR_aR_b)_m-S-Z^s1- (В2');

R₅ представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил;

Р представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

m представляет собой целое число от 1 до 6; а

Z^s1 выбирается из любой из следующих формул:

в которой:

q представляет собой целое число от 1 до 5; а

М представляет собой Н⁺ или катион.

Во втором конкретном варианте реализации для конъюгатов формулы (L1) Cy^L1 представлен формулой (L1a) или (L1a1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м конкретном варианте реализации.

В третьем конкретном варианте реализации для конъюгатов формулы (L1) Cy^L1 представлен формулой (L1b) или (L1b1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м конкретном варианте реализации. Конкретнее, R^x3 представляет собой (С₂-С₄)алкил.

В четвертом конкретном варианте реализации для конъюгатов формулы (L1) Cy^L1 представлен формулой (L1a); R_a и R_b оба представляют собой Н; R₅ представляет собой Н или Me, и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м конкретном варианте реализации.

В пятом конкретном варианте реализации Р представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков; а остальные переменные описаны выше в 1-м, 2-м или 4-м конкретном варианте реализации. В более конкретном варианте реализации Р выбран из группы, состоящей из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. Конкретнее, P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В 6-м конкретном варианте реализации Q представляет собой -SO₃M; а остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м, 2-м, 4-м или 5-м конкретном варианте реализации или в более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 7-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат первого варианта реализации представлен следующей формулой:

или

или ее фармацевтически приемлемой солью, где W_L представляет собой целое число от 1 до 10; двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y представляет собой -Н; и когда она представляет собой одинарную связь, Х представляет собой -Н, a Y представляет собой -ОН или -SO₃M. В более конкретном варианте реализации двойная линия между N и С представляет собой двойную связь, Х отсутствует и Y представляет собой -Н. В другом более конкретном варианте реализации двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, Х представляет собой -Н, а Y представляет собой -SO₃M.

В 8-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат первого варианта реализации представлен следующей формулой:

в которой:

СВА представляет собой CD123/IL-3Rα связывающий агент, описанный в первом аспекте данного изобретения (например, антитело субъекта или антигенсвязывающий фрагмент, описанный выше, или описанный выше полипептид субъекта), который ковалентно связан с Cy^L2 через остаток лизина;

W_L представляет собой целое число от 1 до 20; а также

Cy^L2 представляет собой цитотоксическое соединение, представленное следующей формулой:

или

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она является двойной связью, Х отсутствует и Y представляет собой -Н или (С₁-С₄)алкил; а когда она представляет собой одинарную связь, Х представляет собой -Н или аминозащитную группу, а Y представляет собой -ОН или -SO₃M;

R^x1 и R^x2 независимо представляют собой (С₁-С₆)алкил;

R^e представляет собой -Н или (С₁-С₆)алкил;

W' представляет собой -NR^e',

R^e' представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

Z^s1 выбирается из любой из следующих формул:

в которой:

q представляет собой целое число от 1 до 5; а

М представляет собой -Н⁺ или катион.

В 9-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (L2) Cy^L2 представлен формулой (L2a) или (L2a1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 8-м конкретном варианте реализации.

В 10-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (L2) Cy^L2 представлен формулой (L2b) или (L2b1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 8-м конкретном варианте реализации.

В 11-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (L2) R^e представляет собой Н или Me; R^x1 и R^x2 представляют собой независимо -(СН₂)_р-(CR^fR^g)-, где R^f и R^g каждый независимо представляет собой -Н или (С₁-С₄)алкил; и р представляет собой 0, 1, 2 или 3; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 8-м, 9-м или 10-м конкретном варианте реализации. Конкретнее, R^f и R^g являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н и -Me.

В 12-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат первого варианта реализации представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где W_L представляет собой целое число от 1 до 10; двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, Х отсутствует, a Y представляет собой -Н; и когда она представляет собой одинарную связь, Х представляет собой -Н, а Y представляет собой -ОН или -SO₃M. В более конкретном варианте реализации двойная линия между N и С представляет собой двойную связь. В другом более конкретном варианте реализации двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, Х представляет собой -Н, а Y представляет собой -SO₃M.

В 13-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат первого варианта реализации представлен следующей формулой:

в которой:

СВА представляет собой CD123/IL-3Rα связывающие агенты, описанные в первом аспекте данного изобретения (например, антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный выше в данном документе, или описанный выше его полипептид субъекта), который ковалентно связан с Cy^L3 через остаток лизина;

W_L представляет собой целое число от 1 до 20;

Cy^L3 представлен следующей формулой:

m' представляет собой 1 или 2;

R₁ и R₂ независимо представляют собой Н или (С₁-С₃)алкил; и

Z^s1 выбирается из любой из следующих формул:

в которой:

q представляет собой целое число от 1 до 5; а

М представляет собой Н⁺ или катион.

В 14-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (L3) m' равно 1, и R₁ и R₂ оба являются Н; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 13-м конкретном варианте реализации.

В 15-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (L3) m' равно 2, и R1 и R2 оба являются Me; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 13-м конкретном варианте реализации.

В 16-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат первого варианта реализации представлен следующей формулой:

или

или его фармацевтически приемлемой солью, где W_L представляет собой целое число от 1 до 10.

В 17-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов первого варианта реализации М представляет собой Н⁺, Na⁺ или K⁺; а остальные переменные являются такими, как описано выше, в любом одном из от 1 го до 16 го конкретного варианта реализации или любом из более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В любом из вышеуказанных от 1-го по 17-й конкретные варианты реализации антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент могут иметь один или несколько (например, по существу, все или 100%) остатков Lys в любом из шести CDR областей легкой цепи и тяжелой цепи (если они есть), замещенные Arg. Антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина (HCVR), имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 или 40; и вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина (LCVR), имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41. Антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент могут также содержать Ig HCVR, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, и Ig LCVR, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35. Антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент могут дополнительно содержать Ig HCVR, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32, 34, 38, 39 или 40; и Ig LCVR, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, 35, 37 или 41. В некоторых вариантах реализации второй остаток из N-конца SEQ ID NO: 34 представляет собой Phe, в то время как в некоторых других вариантах реализации второй остаток из N-конца SEQ ID NO: 34 представляет собой Val.

Иммуноконъюгаты, описанные в первом варианте реализации, или любых конкретных вариантах реализации, описанных в нем, могут быть получены в соответствии с любыми способами, известными в данной области, см., например, WO 2012/128868 и WO 2012/112687, которые включены сюда посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгаты по первому варианту реализации могут быть получены с помощью первого способа, включающего этапы взаимодействия СВА с цитотоксическим агентом, имеющим аминовую реакционноспособную группу.

В одном варианте реализации для первого способа, описанного выше, реакцию проводят в присутствии иминового реакционноспособного реагента, такого как NaHSO₃.

В одном варианте реализации для первого описанного выше способа цитотоксический агент, имеющий аминовый реактивный реагент, представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

L^C' представлен следующей формулой:

; или

С(=O)Е представляет собой реакционноспособную сложноэфирную группу, такую как эфир N-гидроксисукцинимида, сложный эфир N-гидроксисульфосукцинимида, сложный эфир нитрофенила (например, 2 или 4-нитрофенил), сложный эфир динитрофенила (например, 2,4-динитрофенил), сульфо-тетрафторфенил (например, 4-сульфо-2,3,5,6-тетрафторфенил) сложный эфир или пентафторфениловый эфир, предпочтительно сложный N-гидроксисукцинимид;

Z^s представлен следующей формулой:

в которой:

q представляет собой целое число от 1 до 5; а

U представляет собой -Н или SO₃M; и

остальные переменные являются такими, как описано в любом одном из от 1го до 7го и 17-м конкретных вариантов реализации или любом из более конкретных вариантов реализации, описанных в них.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгаты по первому варианту реализации могут быть получены вторым способом, включающим стадии:

(a) взаимодействие цитотоксического агента с линкерным соединением, имеющим аминовую реакционноспособную группу и тиольную реакционноспособную группу, с образованием соединения цитотоксического агента-линкера, имеющего связанную с ним аминовую реакционноспособую группу; а также

(b) взаимодействие СВА с соединением цитотоксического агента-линкера.

В одном варианте реализации для второго способа, описанного выше, реакцию на стадии (а) проводят в присутствии иминового реакционноспособного реагента.

В одном варианте реализации для второго способа, описанного выше, соединение цитотоксического агента-линкера подвергают взаимодействию с СВА без очистки. Альтернативно, соединение цитотоксического агента-линкера сначала очищают перед взаимодействием с СВА.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгаты по первому варианту реализации могут быть получены третьим способом, включающим стадии:

(a) взаимодействие СВА с линкерным соединением, имеющим аминовую реакционноспособную группу и тиольную реакционноспособную группу, с образованием модифицированного СВА, имеющего связанную с ним тиольную реакционную группу; а также

(b) взаимодействие модифицированного СВА с цитотоксическим агентом.

В одном варианте реализации для третьего способа, описанного выше, реакцию на стадии (b) проводят в присутствии иминового реакционноспособного реагента.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгаты по первому варианту реализации могут быть получены с помощью четвертого способа, включающего этапы взаимодействия СВА, цитотоксического соединения и линкерного соединения, имеющего аминовую реакционноспособную группу и тиольную реакционноспособную группу.

В одном варианте реализации для четвертого способа, реакцию проводят в присутствии иминового реакционноспособного реагента.

В некоторых вариантах реализации для второго, третьего или четвертого варианта реализации, описанного выше, линкерное соединение, имеющее аминовую реакционноспособную группу и тиольную реакционноспособную группу, представлено следующей формулой:

где X представляет собой галоген; J_D-SH, -SSR^d или -SC(=O)R^g; R^d представляет собой фенил, нитрофенил, динитрофенил, карбоксинитрофенил, пиридил или нитропиридил; R^g представляет собой алкил; и остальные переменные являются такими, как описано выше для формулы (a1) - (a10); и цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где остальные переменные являются такими, как описано в любом одном из от 8го до 12го и 17го конкретных вариантов реализации и любом из более конкретных вариантов реализации, описанных в них.

В некоторых вариантах реализации для второго, третьего или четвертого способов, описанных выше, линкерное соединение, имеющее аминовую реакционноспособную группу и тиольную реакционноспособную группу, представлено любой одной из формул (a1L) - (a10L) и цитотоксический агент представлен следующей формулой:

Где остальные переменные являются такими, как описано в любом одном из от 13го до 17го конкретных вариантов реализации и любом из более конкретных вариантов реализации, описанных в них.

Во втором варианте реализации иммуноконъюгат по данному изобретению включает окисленный СВ123/IL-3Rα-связывающий агент (включая антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или полипептид, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), описанный в первом аспекте данного изобретения, описанного в данном документе (например, окисленное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или его полипептид), ковалентно связанный с цитотоксическим агентом, описанным в данном документе, через одну или несколько альдегидных групп, расположенных на окисленном CD123-связывающем агенте. Альдегидные группы, расположенные на окисленном CD123/IL-3Rα-связывающем агенте, могут быть получены путем окисления одного или более 2-гидроксиэтиламинового фрагмента CD123/IL-3Rα-связывающего агента, где 2-гидроксиэтиламинный фрагмент является частью серина, треонина, гидроксилизина, 4-гидроксиорнитин или 2,4-диамино-5-гидроксивалериановой кислоты. В одном варианте реализации альдегидные группы могут быть получены путем окисления 2-гидроксиэтиламинового фрагмента одного или нескольких N-концевых сериновых остатков, расположенных на CD123/IL-3Rα-связывающем агенте (например, 1, 2, 3 или до 4 Ser остатков на N-концах легких цепей и/или тяжелых цепей).

В 1-м конкретном варианте реализации второго варианта реализации иммуноконъюгат по данному изобретению представлен следующей формулой:

в которой:

СВА представляет собой окисленный CD123/IL-3Rα связывающий агент, описанный в первом аспекте данного изобретения (например, антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный выше в данном документе, или его окисленный полипептид субъекта, описанный выше).

W_S представляет собой 1, 2, 3 или 4;

J_CB' представляет собой фрагмент, образованный реакцией альдегидной группы на СВА с альдегидной реакционной группой на Cy^s1 и представлен следующей формулой:

Cy^s1 представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -Н или (С₁-С₄)алкил; и когда он представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н или защищающий амин фрагмент, Y представляет собой -ОН или -SO₃M, а М представляет собой Н⁺ или катион;

R₅ представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил;

Р представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

Z_d1 отсутствует, -C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O)-;

R₉ представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил;

r и r' независимо представляют собой целое число от 1 до 6;

W' представляет собой

представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

R^x3 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

L представляет собой -NR₉-(CR_aR_b)_r'' или отсутствует; и

r'' представляет собой целое число от 0 до 6.

Во втором конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S1) представлен формулой (S1a) или (S1a1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м конкретном варианте реализации.

В третьем конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S1) представлен формулой (S1b) или (S1b1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м конкретном варианте реализации. Конкретнее, R^x3 представляет собой (С₂-С₄)алкил.

В 4-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S1) R_a и R_b оба являются Н, и R₅ и R₉ оба являются Н или Me; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м или 2-м конкретном варианте реализации.

В пятом конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S1) Р представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков; а остальные переменные являются такими, как описано выше в 1-м, 2-м или 4-м конкретном варианте реализации. В более конкретном варианте реализации Р выбран из группы, состоящей из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. Еще более конкретно, P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В пятом конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S1) Q представляет собой -SO₃M; а остальные переменные являются такими, как описано выше в 1-м, 2-м, 4-м или 5-м конкретном варианте реализации.

В 7-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат второго варианта реализации представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -Н, а когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н и Y представляет собой -ОН или -SO₃M. B более конкретном варианте реализации двойная линия между N и С представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой -Н. В другом более конкретном варианте реализации двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н, a Y представляет собой -SO₃M.

В 8-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгаты данного изобретения представлены следующей формулой:

в которой:

J_CB' представляет собой фрагмент, образованный реакцией альдегидной группы на СВА и альдегидной реакционной группой на Cy^s2 и представлен следующей формулой:

Cy^s2 представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

М представляет собой Н⁺ или катион;

R^x1 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

R^e представляет собой -Н или (С₁-С₆)алкил;

W' представляет собой -NR^e',

R^e' представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

R^x2 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

L₁ представлен следующей формулой:

в которой:

s3 представляет собой сайт, ковалентно связанный с группой J_CB';

s4 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -S- группой на Cy^s2;

Z_a2 отсутствует, C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O)-;

R₉ представляет собой -Н или (C₁-С₃)алкил;

Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;

R_a1, R_a2, R_a3, R_a4, для каждого случая, независимо представляют собой Н или (C₁-С₃)алкил; а также

q1 и r1 каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10, при условии, что q1 и r1 не равны 0.

В более конкретном варианте реализации Z_a2 отсутствует; q1 и r1 независимо друг от друга представляют собой целое число от 0 до 3, при условии, что q1 и r1 не равны 0; а остальные переменные являются такими, как описано выше, в 8-м конкретном варианте реализации. Еще более конкретно, R_a1, R_a2, R_a3, R_a4 все представляют собой -Н.

В другом более конкретном варианте реализации Z_a2 представляет собой -С(=O)-NH- или -NH₉-C(=O)-; q1 и r1 каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 6; а остальные переменные являются такими, как описано выше, в 8-м конкретном варианте реализации. Еще более конкретно, R_a1, R_a2, R_a3, R_a4 все представляют собой -Н.

В 9-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S2) Cy^s2 представлен формулой (S2a) или (S2a1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 8-м конкретном варианте реализации или любых более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 10-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S2) Cy^s2 представлен формулой (S2b) или (S2b1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 8-м конкретном варианте реализации или любых более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 11-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгата формулы (S2) -L₁ представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где R представляет собой Н или -SO₃M; а остальные переменные являются такими, как описано выше в 8-м, 9-м, или 10-м конкретном варианте реализации или в более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 12-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгата формулы (S2) R^e представляет собой Н или Me; и R^x1 представляет собой -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, a R^x2 представляет собой -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, где R^f и R^g каждый независимо представляют собой -Н или (С₁-С₄)алкил; и р равно 0, 1, 2 или 3. Конкретнее, R^f и R^g являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н и -Me.

В 13-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат второго варианта реализации представлен следующей формулой:

В 14-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат второго варианта реализации представлен следующей формулой:

в которой:

J_CB' представляет собой фрагмент, образованный реакцией альдегидной группы на СВА и альдегидной реакционной группой на Cy^s3 и представлен следующей формулой:

где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с СВА; и s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с Cy^s3;

Cy^s3 представлен следующей формулой:

в которой:

m' представляет собой 1 или 2;

R₁ и R₂, каждый независимо представляют собой Н или (С₁-С₃)алкил;

L₁ представлен следующей формулой:

в которой:

s3 представляет собой сайт, ковалентно связанный с группой J_CB';

s4 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -S- группой на Cy^s3;

Z_a2 отсутствует, C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O)-;

R₉ представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил;

Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;

R_a1, R_a2, R_a3, R_a4, для каждого случая, независимо представляют собой Н или (C₁-С₃)алкил; а также

q1 и r1 каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10, при условии, что q1 и r1 не равны 0.

В более конкретном варианте реализации Z_a2 отсутствует; q1 и r1 независимо друг от друга представляют собой целое число от 0 до 3, при условии, что q1 и r1 не равны 0; а остальные переменные являются такими, как описано выше, в 14-м конкретном варианте реализации. Еще более конкретно, R_a1, R_a2, R_a3, R_a4 все представляют собой -Н.

В другом более конкретном варианте реализации Z_a2 представляет собой -С(=O)-NH- или -NH₉-C(=O)-; q1 и r1 каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 6; а остальные переменные являются такими, как описано выше, в 14-м конкретном варианте реализации. Еще более конкретно, R_a1, R_a2, R_a3, R_a4 все представляют собой -Н.

В 15-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S3) m' равно 1, и R₁ и R₂ оба являются Н; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 14-м конкретном варианте реализации описанному в любых более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 16-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S3) m' равно 2, и R₁ и R₂ оба являются Me; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 14-м конкретном варианте реализации описанному в любых более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 17-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S3) -L₁- представлен следующей формулой:

В 18-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат второго варианта реализации представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью; где DM представлен следующей формулой:

В 19-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат второго варианта реализации представлен следующей формулой:

в которой:

J_CB' представляет собой фрагмент, образованный в результате реакции альдегидной группы на СВА и альдегидной реакционной группой на Cy^s4 и представлен следующей формулой:

Cy^s4 представлен следующей формулой:

L₁' представляется следующей формулой:

в которой:

s3 представляет собой сайт, ковалентно связанный с группой группы J_CB';

s4 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -NMe-группой на Cy^s4;

Z_b1 и Z_b2 оба отсутствуют, или один из Z_b1 и Z_b2 отсутствует, а другой представляет собой -СН₂-О- или -О-СН₂-;

и каждый независимо друг от друга отсутствуют, -СН₂-О-, -О-СН₂-, -NR₉-С(=O)-СН₂- или -CH₂-C(=O)-NR₉-;

R₉ представляет собой Н или (С₁-С₃)алкил;

n1 и m1 каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 6;

R_b, R_b2, R_b3, R_b4, R_b5 и R_b6, для каждого случая, каждый независимо представляет собой Н или (С₁-С₃)алкил.

В 20-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S4) R_b1, R_b2, R_b3, R_b4, R_b5 и R_b6 все представляют собой Н; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 19-м конкретном варианте реализации.

В 21-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S4) R₉ представляет собой Н; а остальные переменные являются такими, как описано выше в 19-м или 20-м конкретном варианте реализации.

В 22-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S4) Z_b1' и Z_b2' оба отсутствуют; или Z_b1' представляет собой -СН₂-О- и Z_b2' отсутствует; или Z_b1' представляет собой -CH₂-C(=O)-NR₉-; и Z_b2' представляет собой -О-СН₂- или отсутствует; а остальные переменные являются такими, как описано выше, в 19-м, 20-м или 21-м конкретном варианте реализации.

В 23-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (S4) Р представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков; а остальные переменные являются такими, как описано выше в 19-м, 20-м, 21-м или 22-м конкретном варианте реализации. В более конкретном варианте реализации Р выбран из группы, состоящей из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala; а остальные переменные являются такими, как описано выше, в 23-м конкретном варианте реализации. Еще более конкретно, Р представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В 24-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат второго варианта реализации представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где DM представлен следующей структурной формулой:

В 25-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов второго варианта реализации М представляет собой Н⁺, Na⁺ или K⁺; а остальные переменные являются такими, как описано выше, в любом одном из от 1 го до 24 го конкретного варианта реализации или любом из более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В любом из вышеуказанных с 1-го по 25-й конкретных вариантах реализации окисленное антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать 1, 2, 3 или до 4 N-концевых 2-гидроксиэтиламиновых фрагментов, окисленных до альдегидной группы (групп), для ковалентного связывания с цитотоксическим агентом, описанным в данном документе. N-концевая 2-гидроксиэтиламиновый фрагмент может быть частью остатка серина, треонина, гидроксилизина, 4-гидроксиорнитина или 2,4-диамино-5-гидрокси-валериановой кислоты, предпочтительно Ser или Thr. Для простоты описание ниже, включая реакцию окисления и любое последующее конъюгатирование с линкерами или цитотоксическими агентами, может относиться к Ser как к конкретному примеру таких N-концевых 2-гидроксиэтиламиновых фрагментов, но обычно следует рассматривать как относящееся ко всем N-концевым 2-гидроксиэтиламиновым фрагментам. Антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина (HCVR), имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38; и вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина (LCVR), имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, 35, 37 или 41 (предпочтительно SEQ ID NO: 35 или 37). Антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент могут также содержать Ig HCVR, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32, 34, 38, 39 или 40 (предпочтительно SEQ ID NO: 34), и Ig LCVR, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37. Антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент могут также содержать область тяжелой цепи Ig (НС), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53 или 56 и Ig LCVR, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, 35, 37 или 41 (предпочтительно SEQ ID NO: 35 или 37). Антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент могут также содержать НС область Ig, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48, 50, 53, 54, 56, 59 или 60 (предпочтительно SEQ ID NO: 53), и Ig LCVR, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37. B некоторых вариантах реализации второй остаток из N-конца SEQ ID NO: 34, 38, 50, 53, 54 или 56 представляет собой Phe, в то время как в некоторых других вариантах реализации второй остаток из N-конца SEQ ID NO: 34, 38, 50, 53, 54 или 56 представляет собой Val.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгаты второго варианта реализации могут быть получены с помощью первого способа, включающего взаимодействие окисленного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего N-концевой альдегид, описанный в первом аспекте изобретения, с цитотоксическим агентом, имеющим альдегидную реакционноспособную группу.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгаты второго варианта реализации могут быть получены вторым способом, включающим взаимодействие окисленного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего N-концевой альдегид, описанный в первом аспекте изобретения, с линкерным соединением, имеющим альдегидную реакционную группу с образованием модифицированного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего связанный с ним линкер, с последующим взаимодействием модифицированного CD123/IL-3Rα-связывающего агента с цитотоксическим агентом.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгаты второго варианта реализации могут быть получены третьим способом, включающим контактирование окисленного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего N-концевой альдегид, описанный в первом аспекте изобретения, с цитотоксическим агентом с последующим добавлением линкера, имеющего альдегидную реакционноспособную группу.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгаты по второму варианту реализации могут быть получены четветым способом, включающим стадии:

(a) окисления CD123/IL-3Rα-связывающего агента, который имеет N-концевой фрагмент 2-гидроксиэтиламин (например, Ser/Thr), с окисляющим агентом до образования окисленного СВ123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего группу N-концевую альдегидную группу; и

(b) взаимодействие окисленного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего N-концевую альдегидную группу с цитотоксическим агентом, имеющим альдегидную реакционноспособную группу.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгаты по второму варианту реализации могут быть получены пятым способом, включающим стадии:

(a) окисления CD123/IL-3Rα-связывающего агента, который имеет N-концевой фрагмент гидроксиэтиламин (например, Ser/Thr), с окисляющим агентом до образования окисленного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего группу N-концевую альдегидную группу;

(b) взаимодействие окисленного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего N-концевую альдегидную группу с линкерным соединением, имеющим альдегидную реакционную группу с образованием модифицированного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего связанный с ним линкер, с последующим взаимодействием модифицированного CD123/IL-3Rα-связывающего агента с цитотоксическим агентом.

В некоторых вариантах реализации иммуноконъюгаты по второму варианту реализации могут быть получены шестым способом, включающим стадии:

(b) контактирования окисленного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, имеющего N-концевую альдегидную группу с цитотоксическим агентом с последующим добавлением линкерного соединения, имеющего альдегидную реакционноспособную группу.

В одном варианте реализации для первого описанного выше способа цитотоксический агент, имеющий альдегидную реакционноспособную группу, представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где J_CB представлен следующей формулой:

и остальные переменные являются такими, как описано выше в любом одном из от 1го до 7го и 25-м конкретных вариантов реализации и любом из более конкретных вариантов реализации, описанных в них.

В другом варианте реализации для первого или четвертого описанного выше способа цитотоксический агент, имеющий альдегидную реакционноспособную группу, представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где J_CB является таким, как описано выше и остальные переменные являются такими, как описано в любом одном из от 19го до 25го конкретных вариантах реализации и любом из более конкретных вариантов реализации, описанных в них.

В одном варианте реализации для второго, третьего, пятого или шестого способа, описанного выше, линкерное соединение представлено следующей формулой:

где J_D-SH, -SSR^d или -SC(=O)R^g; R^d представляет собой фенил, нитрофенил, динитрофенил, карбоксинитрофенил, пиридил или нитропиридил; R^g представляет собой алкил; J_CB является таким, как описано выше; цитотоксический агент представлен следующей формулой:

и остальные переменные являются такими, как описано выше в любом одном из от 8го до 13го и 25-м конкретных вариантов реализации и любом из более конкретных вариантов реализации, описанных в них.

В другом варианте реализации для второго, третьего, пятого или шестого способа, описанного выше, линкерное соединение представлено следующей формулой (L^sa) выше; цитотоксическое соединение, представлено следующей формулой:

и остальные переменные являются такими, как описано выше в любом одном из от 14го до 18го и 25-м конкретных вариантов реализации и любом из более конкретных вариантов реализации, описанных в них.

В одном варианте реализации для первого или четвертого способов, описанных выше, цитотоксический агент подвергают взаимодействию с реагентом, реагирующим на имин, таким как NaHSO₃, с образованием модифицированного цитотоксического агента перед взаимодействием с окисленным CD123/IL-3Rα-связывающим агентом, имеющим N-концевой альдегид. В одном варианте реализации модифицированный цитотоксический агент не очищается до взаимодействия с окисленным СВА, имеющим N-концевой альдегид. Альтернативно, модифицированный цитотоксический агент очищают перед взаимодействием с окисленным СВА, имеющим N-концевой альдегид.

В другом варианте реализации для второго или пятого способа, описанного выше, цитотоксический агент подвергают взаимодействию с реагентом, реагирующим с имином, таким как NaHSO₃, с образованием модифицированного цитотоксического агента перед взаимодействием с модифицированным CD123/IL-3Rα-связывающим агентом, имеющим связанный с ним линкер. В одном варианте реализации модифицированный цитотоксический агент очищают перед взаимодействием с модифицированным CD123/IL-3Rα-связывающим агентом, имеющим связанный с ним линкер. Альтернативно, модифицированный цитотоксический агент не очищают до реакции с окисленным CD123/IL-3Rα-связывающим агентом, имеющим N-концевой альдегид.

В еще одном варианте реализации для третьего или шестого способов, описанных выше, реакцию окисленного CD123/IL-3Rα-связывающего агента, цитотоксического агента и линкерного соединения проводят в присутствии иминового реактивного реагента, такого как NaHSO₃.

Любой подходящий окислитель можно использовать на стадии (а) четвертого, пятого или шестого способов, описанных выше. В некоторых вариантах реализации окислитель представляет собой периодат. Конкретнее, окислитель представляет собой периодат натрия.

Могут использоваться избыточные молярные эквиваленты окислителя относительно CD123/IL-3Rα-связывающего агента. В некоторых вариантах реализации можно использовать примерно 2-100, 5-80, 10-50, 1-10 или 5-10 молярных эквивалентов окислителя. В некоторых вариантах реализации может быть использовано около 10 или около 50 эквивалентов окислителя. Когда используется большое количество окислителя, для предотвращения чрезмерного окисления используется короткое время реакции. Например, когда используют 50 эквивалентов окислителя, реакцию окисления проводят в течение примерно от 5 до 60 минут. Альтернативно, когда используют 10 эквивалентов окислителя, реакцию проводят в течение примерно от 30 минут до примерно 24 часов. В одном варианте реализации используют 5-10 молярных эквивалентов окислителя и реакцию окисления проводят в течение примерно от 5 до 60 минут (например, от около 10 до около 30 минут, от около 20 до около 30 минут).

В некоторых вариантах реализации катализатор присутствует в реакции по первому, второму или третьему способу, описанному выше, или в реакции стадии (b) в четвертом, пятом или шестом способах, описанных выше. Может быть использован любой подходящий катализатор в данной области. В одном варианте катализатор представляет собой анилин или замещенный анилин. Типичный анилиновый катализатор включает, но не ограничивается ими, анилин, о-фенилендиамин, м-фенилендиамин, 3,5-диаминобензойную кислоту, р-фенилендиамин, 2-метил-п-фенилендиамин, N-метил-п-фенилендиамин, о-аминофенол, м-аминофенол, п-аминофенол, п-метоксианилин, 5-метоксиантраниловую кислоту, о-аминобензоидную кислоту и 4-аминофенетиловый спирт. В одном варианте реализации катализатор представляет собой 4-аминофениловый спирт. В некоторых вариантах реализации реакцию стадии (b) проводят при рН от около 5,0 до около 6,5. В некоторых вариантах реализации реакцию стадии (b) проводят при рН около 5,0.

В некоторых вариантах реализации для реакции в первом, втором или третьем способе, описанном выше, или в реакции стадии (b) в четвертом, пятом или шестом способах, описанных выше, соединение, имеющее альдегидную реакционноспособную группу (например, цитотоксический агент или линкерное соединение, описанное в данном документе) используют в молярном избытке относительно окисленного связующего агента (например, окисленного антитела или окисленного антигенсвязывающего участка). В некоторых вариантах реализации соотношение для соединения, имеющего альдегидную реакционноспособную группу, к окисляемому агенту, который связывается с клеткой, составляет от около 10:1 до около 1,1:1, от около 5:1 до около 2:1. В одном варианте реализации соотношение составляет около 4:1.

В третьем варианте реализации иммуноконъюгаты по данному изобретению содержат CD123/IL-3Rα-связывающий агент (включая антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или полипептид, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), описанный в первом аспекте изобретения, ковалентно связан с цитотоксическим агентом, описанным в данном документе, через тиольную группу (-SH) одного или нескольких цистеиновых остатков, расположенных на CD123-связывающем агенте.

В 1-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат третьего варианта реализации представлен следующей формулой:

в которой:

СВА представляет собой CD123/IL-3Rα связывающий агент, описанный в первом аспекте данного изобретения (например, антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе выше, или описанный выше полипептид субъекта), ковалентно связан с Cy^C1 через остаток цистеина;

W_C представляет собой 1 или 2;

Cy^C1 представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -Н или (C₁-С₄)алкил; и когда он представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н или защищающий амин фрагмент, Y представляет собой -ОН или -SO₃M, а М представляет собой Н⁺ или катион;

R₅ представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил;

Р представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

W' представляет собой -NR^e',

R^e' представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

R^x3 представляет собой (С₁-С₆)алкил; и

L_C представлен следующим:

где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с СВА, a s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с-С(=O) - группой на Су^С1; в которой:

R₁₉ и R₂₀, для каждого случая, независимо представляют собой -Н или (C₁-С₃)алкил;

m'' представляет собой целое число от 1 до 10; а

R^h представляет собой -Н или (C₁-С₃)алкил.

Во втором конкретном варианте реализации для иммуноконъюгата формулы (С1) Су^С1 представлен формулой (С1а) или (C1a1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м конкретном варианте реализации.

В третьем конкретном варианте реализации для иммуноконъюгата формулы (С1) Су^С1 представлен формулой (C1b) или (C1b1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м конкретном варианте реализации.

В четвертом конкретном варианте реализации для иммуноконъюгата формулы (С1) Cy^C1 представлен формулой (С1а) или (C1a1); R_a и R_b оба представляют собой Н; R₅ представляет собой Н или Me, и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м или 2-м конкретном варианте реализации.

В пятом конкретном варианте реализации для иммуноконъюгата формулы (C1) Р представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков; а остальные переменные являются такими, как описано выше в 1-м, 2-м или 4-м конкретном варианте реализации. В более конкретном варианте реализации Р выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. B другом более конкретном варианте реализации Р представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В 6-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (C1) Q представляет собой -SO₃M; а остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м, 2-м, 4-м или 5-м конкретном варианте реализации или в более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 7-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (C1) R₁₉ и R₂₀ оба являются Н, и m'' представляет собой целое число от 1 до 6; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м, 2-м, 3-м, 4-м, 5-м или 6-м конкретном варианте реализации или в любых более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 8-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (C1) -L-L_C- представлен следующей формулой:

а остальные переменные являются такими, как описано выше, в 1-м, 2-м, 3-м, 4-м, 5-м, 6-м или 7-м конкретном варианте реализации или в более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 9-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат третьего варианта реализации представлен следующей формулой:

В 10-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат третьего варианта реализации представлен следующей формулой:

в которой:

W_C представляет собой 1 или 2;

Cy^C2 представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -Н или (C₁-C₄)алкил; и когда он представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н или защищающий амин фрагмент, Y представляет собой -ОН или -SO₃M, а М представляет собой Н⁺ или катион;

R^x1 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

R^e представляет собой -Н или (С₁-С₆)алкил;

W' представляет собой -NR^e';

R^e' представляет собой -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k;

n представляет собой целое число от 2 до 6;

R^k представляет собой -Н или -Me;

R^x2 представляет собой (С₁-С₆)алкил;

L_C' представлен следующей формулой:

в которой:

Z представляет собой C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O);

Q представляет собой -Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;

R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ для каждого случая являются независимо -Н или (С₁-С₃)алкилом;

q и r, для каждого случая, независимо представляют собой целое число от 0 до 10;

m и n каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10;

R^h представляет собой -Н или (C₁-C₃)алкил; а также

Р' представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков.

В более конкретном варианте реализации q и r каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 6, более конкретно, целое число от 1 до 3. Еще более конкретно, R₁₀, R₁₁, R₁₂ и R₁₃ все представляют собой -Н.

В другом более конкретном варианте реализации m и n каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 6, более конкретно, целое число от 1 до 3. Еще более конкретно, R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ все представляют собой -Н.

В 11-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (С2) Cy^C2 представлен формулой (С2а) или (С2а1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 10-м конкретном варианте реализации или любых более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 12-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (С2) Cy^C2 представлен формулой (C2b) или (C2b1); и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 10-м конкретном варианте реализации.

В 13-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (С2) Р представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков; а остальные переменные являются такими, как описано в 10-м, 11-м или 12-мконкретном варианте реализации или любых более конкретных вариантах реализации, описанных в нем. В более конкретном варианте реализации P выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. B другом более конкретном варианте реализации Р представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В 14-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (С2) -L_C' представлен следующей формулой:

В 15-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (С2) R^e представляет собой Н или Me; R^x1 представляет собой -(CH₂)_p-(CR^fR^g)- и R^x2 представляет собой -(CH₂)_p-(CR^fR^g)-, где R^f и R^g каждый независимо представляет собой -Н или (C₁-С₄)алкил; и p равно 0, 1, 2 или 3; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 10-м, 11-м, 12-м, 13-м или 14-м конкретном варианте реализации. Конкретнее, R^f и R^g являются одинаковыми или различными и выбраны из -Н и -Me.

В 16-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат третьего варианта реализации представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -Н, а когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н и Y представляет собой -ОН или -SO₃M. B более конкретном варианте реализации двойная линия между N и С представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой -Н. В другом конкретном варианте реализации двойная линия между N и С представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н, a Y представляет собой -SO₃M.

В 17-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат третьего варианта реализации представлен следующей формулой:

в которой:

W_C представляет собой 1 или 2;

Cy^C3 представлен следующей формулой:

в которой:

m' представляет собой 1 или 2;

R₁ и R₂, каждый независимо представляют собой -Н или (С₁-С₃)алкил;

L_C' представлен следующей формулой:

в которой:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с СВА, а s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -S- группой на Cy^C3;

Z представляет собой C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O);

Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;

R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ для каждого случая являются независимо -Н или (C₁-С₃)алкилом;

q и r, для каждого случая, независимо представляют собой целое число от 0 до 10;

m и n каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10;

R^h представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил; а также

Р' представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков.

В 18-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (С3) Р' представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков; а остальные переменные являются такими, как описано в 17-м конкретном варианте реализации или любых более конкретных вариантах реализации, описанных в нем. В более конкретном варианте реализации Р' выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala. B другом более конкретном варианте реализации Р представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В 19-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (С3) -L_C' представлен следующей формулой:

где М представляет собой Н⁺ или катион; а остальные переменные являются такими, как описано выше в 17-м, или 18-м конкретном варианте реализации или в более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 20-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (С3) m' равно 1, и R₁ и R₂ оба являются Н; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 17-м, 18-м или 19-м конкретном варианте реализации или в любых более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 21-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов формулы (С3) m' равно 2, и R₁ и R₂ оба являются Me; и остальные переменные являются такими, как описано выше, в 17-м, 18-м или 19-м конкретном варианте реализации или в любых более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В 22-м конкретном варианте реализации иммуноконъюгат третьего варианта реализации представлен следующей формулой:

В 23-м конкретном варианте реализации для иммуноконъюгатов третьего варианта реализации М представляет собой Н⁺, Na⁺ или K⁺; а остальные переменные являются такими, как описано в любом одном из от 1го до 22го конкретного варианта реализации или любом из более конкретных вариантах реализации, описанных в нем.

В любом из вышеуказанных с 1-го по 23-й конкретных вариантах реализации антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент, или полипептид, содержащий антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет Cys остаток в положении, соответствующем модифицированному Cys в домене СН3 тяжелой цепи (например, 5й до последнего остатка) SEQ ID NO: 54 или 56. Антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать участок тяжелой цепи иммуноглобулина (НС), имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54; и вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина (LCVR), имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, 35, 37 или 41 (предпочтительно SEQ ID NO: 35 или 37). Антитело субъекта или его антигенсвязывающий фрагмент могут также содержать область тяжелой цепи Ig, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56, и Ig LCVR, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, 35, 37 или 41 (предпочтительно SEQ ID NO: 35 или 37). В некоторых вариантах реализации второй остаток из N-конца SEQ ID NO: 54 и 56 представляет собой Phe, в то время как в некоторых других вариантах реализации второй остаток из N-конца SEQ ID NO: 54 и 56 представляет собой Val.

Иммуноконъюгаты третьего варианта реализации, описанного выше (например, иммуноконъюгаты любого из 1-го до 23-го конкретных вариантов реализации или любых более конкретных вариантов реализации, описанных в нем), могут быть получены путем взаимодействия СВА, имеющего один или более свободных цистеина, с цитотоксическим агентом, имеющим описанную в данном документе тиольную реакционноспособную группу.

В одном варианте реализации цитотоксический агент, имеющий тиольную реакционноспособную группу, представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где -L_C^c представлен следующей формулой:

где переменные являются такими, как описано выше в любом одном из от 1го до 9го и 23-м конкретных вариантов реализации или любом из более конкретных вариантов реализации, описанных в них.

В другом варианте реализации цитотоксический агент, имеющий тиольную реакционноспособную группу, представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где L_C^c' представлен следующей формулой:

где переменные являются такими, как описано выше в любом одном из от 10го до 16го и 23-м конкретных вариантов реализации или любом из более конкретных вариантов реализации, описанных в них.

В еще одном варианте реализации цитотоксический агент, имеющий тиольную реакционноспособную группу, представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где L_C^c' описан выше и остальные переменные являются такими, как описано в любом одном из от 17го до 23го конкретных вариантах реализации или любом из более конкретных вариантов реализации, описанных в них.

В некоторых вариантах реализации используются органические растворители в реакции СВА и цитотоксического агента для солюбилизации цитотоксического агента. Примеры органических растворителей включают, но не ограничиваются ими, диметилацетамид (DMA), пропиленгликоль и т.д. В одном варианте реализации реакцию СВА и цитотоксического агента проводят в присутствии DMA и пропиленгликоля.

4. Композиции и Способы использования

Данное изобретение включает композицию (например, фармацевтическую композицию), включающую антитела субъекта или их антигенсвязывающие фрагменты, или их иммуноконъюгаты (например, конъюгаты формул (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (С2) и (С3)), описанные в данном документе, и носитель (фармацевтически приемлемый носитель). Данное изобретение также включает композицию (например, фармацевтическую композицию), содержащую антитела субъекта или их антигенсвязывающие фрагменты, или конъюгат формул (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (С2) и (С3)) и носитель (фармацевтически приемлемый носитель) и дополнительно содержит второй терапевтический агент. Настоящие композиции используются для ингибирования аномального роста клеток или лечения пролиферативного нарушения у млекопитающего (например, человека), включая гематологический рак, лейкемию или лимфому.

В частности, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим один или несколько связывающих CD123 агентов или их иммуноконъюгатов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. Эти фармацевтические композиции находят применение в ингибировании роста опухоли и лечении рака у людей, включая гематологический рак, лейкемию или лимфому.

В некоторых вариантах реализации составы готовят для хранения и использования путем объединения очищенного антитела или его иммуно-конъюгата по данному изобретению с фармацевтически приемлемым носителем (например, носителем, наполнителем) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, нетоксичные буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например, октадецилдиметилбензиламмонийхлорид, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутил или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (например, менее примерно 10 аминокислотных остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; углеводы, такие как моносахариды, дисахариды, глюкоза, манноза или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, цинк белковые комплексы); и неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN или полиэтиленгликоль (PEG).

Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут вводиться любым количеством способов для местного или системного лечения. Введение может быть местным (таким как на слизистые оболочки, включая влагалищную и ректальную доставку), таким как трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки; легочным (например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе распылением, интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным); пероральным; или парентеральным, включая внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепным (например, интратекальным или внутрижелудочковым) введением. В некоторых конкретных вариантах реализации введение является внутривенным. Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, также могут быть использованы in vitro или in vivo.

Антитело или иммуноконъюгат по изобретению можно комбинировать в фармацевтическом комбинированном составе или в режиме дозирования в виде комбинированной терапии со вторым соединением, таким как известно, что оно эффективно для лечения интересующего заболевания или расстройства. В некоторых вариантах реализации второе соединение представляет собой противораковый агент. В некоторых вариантах реализации способы включают введение второго соединения и иммуноконъюгата по изобретению, что приводит к лучшей эффективности по сравнению с введением только иммуноконъюгата. Второе соединение можно вводить любым количеством способов, включая, например, местное, легочное, пероральное, парентеральное или внутричерепное введение. В некоторых вариантах реализации введение представляет собой пероральное введение. В некоторых вариантах реализации введение представляет собой внутривенное введение. В некоторых вариантах реализации введение представляет собой как пероральное, так и внутривенное введение.

Антитело или иммуноконъюгат можно также комбинировать в фармацевтическом комбинированном составе или в режиме дозирования в виде комбинированной терапии с анальгетиком или другими лекарственными средствами.

Антитело или иммуноконъюгат можно комбинировать в фармацевтическом комбинированном составе или в режиме дозирования в качестве комбинированной терапии со вторым соединением, обладающим противораковыми свойствами. Второе соединение фармацевтического комбинированного состава или схемы дозирования может иметь дополнительную активность к ADC комбинации, таким образом, что они не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга. Также предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие CD123-связывающий агент и второй противораковый агент.

Данное изобретение включает способ ингибирования аномального роста клеток или лечения пролиферативного нарушения у млекопитающего (например, человека), включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антител субъекта, или их антигенсвязывающих фрагментов, или иммуноконъюгатов (например, конъюгаты формул (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (С2) и (С3)), описанные в данном документе, или его композиции, отдельно или в сочетании со вторым терапевтическим агентом.

В некоторых вариантах реализации аномальный рост клеток или пролиферативное расстройство у млекопитающего является заболеванием или состоянием, связанным или характеризующимся экспрессией CD123, таким как рак, включая гематологический рак, лейкемию или лимфому. В некоторых вариантах реализации пролиферативное расстройство представляет собой рак лимфатического органа или гематологическую злокачественную опухоль.

Например, рак может быть выбран из группы, включающей острую миелоидную лейкемию (ОМЛ, в том числе ОМЛ с низким уровнем CD33, ОМЛ положительный по P-гликопротеину, рецидивирующий ОМЛ или рефрактерный ОМЛ), хроническую миелогенную лейкемию (ХМЛ), включая бластный кризис онкогена ХМЛ и Абелсона, связанный с ХМЛ (Bcr-ABL транслокация), миелодиспластический синдром (MDS), острую лимфобластную лейкемию В или острую лимфобластную лейкемиую В-клеток (В-ХЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), включая синдром Рихтера или Рихтера трансформация ХЛЛ, лейкоз волосатых клеток (ВКЛ), острый промиелоцитарный лейкоз (APL), В-клеточное хроническое лимфопролиферативное заболевание (B-CLPD), атипичная хроническая лимфоцитарная лейкемия (предпочтительно с выраженной экспрессией CD11c), бластное плазмоцитоидное дендритное клеточное новообразование (BPDCN), неходжкинские лимфомы (НХЛ), включая лейкемию лейкемии (MCL) и небольшую лимфоцитарную лимфому (SLL), лимфому Ходжкина, системный мастоцитоз и лимфому Беркитта.

В некоторых вариантах реализации В-ОЛЛ является В-ОЛЛ положительным по CD19. B некоторых других вариантах реализации В-ОЛЛ является В-ОЛЛ отрицательным по CD19.

В некоторых вариантах реализации рак имеет по меньшей мере один отрицательный прогностический фактор, например, сверхэкспрессию Р-гликопротеина, сверхэкспрессию EVI1, изменение р53, мутацию DNMT3A, внутреннюю тандемную дупликацию FLT3.

В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективное количество антител субъекта или их антигенсвязывающих фрагментов или иммуноконъюгатов (например, конъюгатов формул (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (С2) и (С3)), или их состав, один или в сочетании со вторым терапевтическим агентом, предпочтительно ингибирует пролиферацию лейкозных стволовых клеток (LSC) предшественников лейкозов (LP) и/или лейкемических бластов, над нормальными кроветворными стволовыми клетками (HSC). B некоторых вариантах реализации значение IC₅₀ или половина максимальной концентрации указанных выше агентов субъекта для ингибирования пролиферации лейкозных стволовых клеток (LSC), предшественников лейкемии (LP) и/или лейкемических бластов составляет по меньшей мере 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 100-, 150-, 300-, 500-кратное или еще ниже, чем для нормальных гемопоэтических стволовых клеток (HSC).

В некоторых вариантах реализации анти-лейкозная терапия по изобретению не только нацеливается и убивает лейкозные бласты, но предпочтительно также нацеливается и убивает лейкозных предшественников (LP) и лейкемические стволовые клетки (LSC). B некоторых вариантах реализации терапия также менее избирательна против нормальных HSC. B некоторых вариантах реализации экспрессия CD123 на LSC, LP и лейкемических бластах значительно выше (например, по меньшей мере в 20-25 раз выше в LSC, ОМЛ-предшественниках и бластах ОМЛ) по сравнению с нормальными лимфоцитами (которые могут быть близки к отрицательным). В некоторых вариантах реализации уровни экспрессии CD123 на LP и LSC, по меньшей мере, такие же, как у лейкозных бластов.

Аналогичным образом, данное изобретение обеспечивает способ индуцирования гибели клеток в отдельных популяциях клеток, включающий контактирование клеток-мишеней или тканей, содержащих клетки-мишени, с эффективным количеством антител субъекта или их антигенсвязывающих фрагментов или иммуноконъюгатов по данному изобретению. Клетки-мишени представляют собой клетки, с которыми может связываться агент, связывающий клетку конъюгатов.

При желании можно вводить другие активные агенты, такие как другие противоопухолевые агенты, вместе с конъюгатом.

Раковые терапии и их дозировки, пути введения и рекомендуемое использование известны в данной области и описаны в такой литературе, как справочник врача (PDR). PDR раскрывает дозы агентов, которые использовались для лечения различных видов рака. Режим дозирования и дозы этих вышеупомянутых химиотерапевтических лекарств, которые являются терапевтически эффективными, будут зависеть от конкретного лечения рака, степени заболевания и других факторов, известных специалисту в данной области и могут быть определены врачом. Содержание PDR полностью включено здесь в качестве ссылки. Специалист в данной области может рассмотреть PDR, используя один или несколько из следующих параметров, чтобы определить режим дозирования и дозы химиотерапевтических агентов и конъюгатов, которые могут использоваться в соответствии с идеями данного изобретения. Эти параметры включают: Подробный указатель; производитель; продукция (по названию компании или официально зарегистрированого товарного знака препарата); Индекс категории; Общий/химический индекс (немаркированные названия лекарственных препаратов); Цветные изображения лекарств; Информация о продукте, соответствующая маркировке FDA; Химическая информация; Функция/действие; Показания и противопоказания; клинические исследования, побочные эффекты, предупреждения.

Примеры использования in vitro включают обработки аутологичного костного мозга до его пересадки тому же пациенту для того, чтобы убить больные или злокачественные клетки: обработки костного мозга до его трансплантации для того, чтобы убить компетентные Т-клетки и предотвратить реакцию трансплантата против хозяина (РТПХ); обработки клеточных культур для уничтожения всех клеток, за исключением желательных вариантов, которые не экспрессируют целевой антиген; или убить варианты, которые экспрессируют нежелательный антиген.

Условия неклинического использования in vitro легко определяются специалистом в данной области.

Примерами клинического применения ex vivo являются удаление опухолевых клеток или лимфоидных клеток из костного мозга до аутологичной трансплантации при лечении рака или при лечении аутоиммунного заболевания или для удаления Т-клеток и других лимфоидных клеток из аутологичного или аллогенного костного мозга или ткани до трансплантации, чтобы предотвратить РТПХ. Обработка может быть выполнена следующим образом. Костный мозг собирают у пациента или другого индивидуума, а затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, к которой добавляют цитотоксический агент по изобретению, концентрации варьируют от около 10 мкМ до 1 пМ в течение примерно от 30 минут до около 48 часов при температуре около 37°C. Точные условия концентрации и времени инкубации, то есть дозы, легко определяются специалистом в данной области техники. После инкубации клетки костного мозга промывают средой, содержащей сыворотку, и возвращают пациенту внутривенно по известным методам. В случаях, когда пациент получает другое лечение, такое как курс абляционной химиотерапии или облучение всего тела, между временем сбора костного мозга и реинфузией обработанных клеток обработанные клетки костного мозга хранятся в замороженном виде в жидком азоте с использованием стандартного медицинского оборудования.

Для клинического применения in vivo цитотоксические соединения или конъюгаты по изобретению будут поставляться в виде раствора или лиофилизированного порошка, который тестируют на стерильность и уровни эндотоксина.

Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и наполнители хорошо известны и могут быть определены специалистами в данной области, как того требует клиническая ситуация. Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или наполнителей включают: (1) забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко, pH около 7,4, содержащий или не содержащий от 1 мг/мл до 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина, (2) 0,9% солевой раствор (0,9% мас./об. NaCl) и (3) 5% (мас./об.) декстрозы; и может также содержать антиоксидант, такой как триптамин и стабилизирующий агент, такой как Tween 20.

Способ изобретения для индуцирования гибели клеток в отдельных популяциях клеток, для ингибирования роста клеток и/или для лечения рака может быть реализован in vitro, in vivo или ex vivo.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение мышиных моноклональных антител против CD123 антигена человека и яванской макаки

Для получения мышиных анти-CD123 антител мышам BALB/c дикого типа (Charles River Laboratory, Wilmington, MA) вводили подкожно клеточную линию 300-19, стабильно экспрессирующую человеческий CD123, которая является производной от про-B-клеточной линии BALB/c (M.G. Reth et al. 1985, Nature, 317:353-355), в PBS в дозе 5×10⁶ клеток/мышь каждые 2 недели пять раз. Для получения гибридомы иммунизированным мышам проводили внутрибрюшинную инъекцию другой дозы антигена за три дня до умерщвления. Селезенку от мыши собирали в соответствии со стандартными протоколами животных и измельчали между двумя стерильными матовыми микроскопическими слайдами для получения одноклеточной суспензии в среде RPMI-1640. После того, как эритроциты лизировали с помощью лизирующего буфера ACK, клетки селезенки затем смешивали с клетками мышиной миеломы P3X63Ag8.653 (клетки Р3) (JF Kearney et al., 1979, J. Immunol, 123:1548-1550) в соотношении 1 Р3 клетка: 3 клетки селезенки. Смесь клеток селезенки и клеток Р3 промывали и обрабатывали проназой в слитых средах (0,3 М маннит/Д-сорбит, 0,1 мМ CaCl₂, 0,5 мМ MgCl₂ и 1 мг/мл BSA) при комнатной температуре в течение 3 мин. Реакцию останавливали добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS, Invitrogen); Затем клетки промывали, ресуспендировали в 2 мл среды с холодным слиянием и сливали с аппаратом для электрофузии ВТХ ЕСМ 2001 (Harvard Apparatus). Слитые клетки осторожно добавляли к среде для отбора RPMI-1640, содержащей гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT) (Sigma Aldrich), инкубировали в течение 20 мин при 37°С и затем высевали в плоские нижние 96-луночные планшеты при 200 мкл/лунку. Планшеты затем инкубировали в 5% -ном инкубаторе СО₂ при 37°С до тех пор, пока клоны гидридомы не были готовы для скрининга антител. Могут также использоваться другие методы иммунизации и получения гибридомы, в том числе описанные в J. Langone and Н. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Vol. 121, Immunochemical Techniques, Part I, Academic Press, Florida); and E. Harlow and D. Lane (Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY).

Скрининг и выбор гибридомы

Скрининг гибридомы проводили с использованием цитометрического проточного анализа связывания с клеточными линиями 300-19, стабильно экспрессирующими CD123 человека, и клетками 300-19 дикого типа. Вкратце, клетки 300-19 дикого типа сначала были помечены CELLTRACE™^, далекой красной DDAO-SE (Invitrogen) меткой, смешаны с необработанными клетками при соотношении 1:1 и инкубированы с супернатантом гибридомы в течение 2 часов на льду. Затем клетки промывали, инкубировали с меченым РЕ-мышиным IgG (Jackson Immunoresearch), промывали, фиксировали формалином и анализировали с использованием матрицы FACS (BD Bioscience). Гибридому со специфичной реакционной способностью к антигену CD 123 человека экспрессировали и супернатанты повторно скринировали с помощью цитометрического проточного анализа связывания с использованием трех независимых клеточных линий: клеточной линии 300-19, стабильно экспрессирующей CD123 человека, клеточной линии 300-19, стабильно экспрессирующей CD123 яванской макаки и клеточной линии 300-19 дикого типа. Гибридому с положительным связыванием с антигенами CD123 человека и яванской макаки, но отрицательную на клетки 300-19 дикого типа, дополнительно субклонировали путем ограниченого разведения. Для последующего анализа был выбран один субклон из каждой гибридомы, который продемонстрировал специфическое связывание с антигенами CD123 человека и яванской макаки.

В течение этого исследования было проведено в общей сложности шесть слияний. Было отобрано около 6000 гибридом, было создано 33 гибридомы, специфичные для антигенов CD123 человека и яванской макаки, и 18 гибридомов были субклонированы. Стабильные субклоны культивировали и идентифицировали изотип моноклонального антитела, используя коммерческие мышиные IgG-изотипирующие реагенты (такие как IsotStip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit от Roche Diagnostics GmbH, Германия, номер продукта 11493027001).

Очистка антител

Антитела очищали от супернатантов субклона гибридомы с использованием стандартных методов, таких как, например, хроматография на белке А или G (HiTrap Protein А или G HP, 1 мл, Amersham Biosciences). Вкратце супернатант готовят для хроматографии путем добавления 1/10 объема 1 М буфера Tris/HCl, рН 8,0. Супернатант, отрегулированный по рН, фильтровали через фильтрующую мембрану 0,22 мкм и загружали в колонку, уравновешенную связывающим буфером (PBS, рН 7,3). Колонку промывали связующим буфером до тех пор, пока не получилась стабильная базовая линия без абсорбции при 280 нм. Антитело элюировали 0,1 М раствором уксусной кислоты, содержащим 0,15 М NaCl, рН 2,8, с использованием скорости потока 0,5 мл/мин. Фракции приблизительно 0,25 мл собирали и нейтрализовали добавлением 1/10 объема 1 М Трис/HCl, рН 8,0. Пиковую фракцию (фракции) диализовали в течение ночи дважды против 1×PBS и стерилизовали фильтрованием через фильтрующую мембрану 0,2 мкм. Очищенное антитело количественно определяли путем абсорбции при А280.

Очищенные фракции белка А дополнительно шлифовали с использованием ионообменной хроматографии (IEX) с хроматографией четвертичного аммония (Q) для мышиных антител. Вкратце, образцы очистки белка А были заменены буфером на связывающий буфер (10 мМ Трис, 10 мМ хлорида натрия, рН 8,0) и фильтровали через фильтр 0,22 мкм. Полученный образец затем загружали на смолу с быстрым потоком Q (GE Lifesciences), которая была уравновешена буфером для связывания со скоростью потока 120 см/ч. Размер столбца был выбран так, чтобы иметь достаточную емкость для связывания всех MAb в образце. Колонку затем промывали связывающим буфером до тех пор, пока не была получена стабильная базовая линия без абсорбции при 280 нм. Антитело элюировали путем инициирования градиента от 10 мМ до 500 мМ хлорида натрия в 20 объемах колонки (CV). Пиковые фракции собирали на основе измерения оптической плотности при 280 нм (А280). Процентное содержание мономера оценивали с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) на TSK-геле G3000SWXL, 7,8×300 мм с защитной колонкой SWXL, 6,0×40 мм (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, РА) с использованием системы Agilent HPLC 1100 (Agilent, Санта-Клара, Калифорния). Фракции с содержанием мономеров выше 95% объединяли, буфер заменяли на PBS (рН 7,4) с использованием системы TFF и стерилизовали фильтрованием через фильтрующую мембрану 0,2 мкм. Концентрацию IgG очищенного антитела определяли с помощью А280 с использованием коэффициента экстинкции 1,47. Альтернативные методы, такие как керамический гидроксиапатит (СНТ), также использовались для шлифовки антител с хорошей селективностью. Смолу типа II СНТ с размером частиц 40 мкм (Bio-Rad Laboratories) использовали с аналогичным протоколом, описанным для хроматографии IEX. Буфер связывания для СНТ соответствовал 20 мМ фосфату натрия, рН 7,0 и антитело элюировали градиентом 20-160 мМ фосфата натрия более 20 CV.

Пример 2. Клонирование и секвенирование V_L и V_H областей антител против CD123

Клонирование областей V_L и V_H

Общая клеточная РНК была приготовлена из 5×10⁶ клеток гибридом CD123 с использованием набора RNeasy (QIAgen) в соответствии с протоколом производителя. кДНК затем синтезировали из общей РНК с использованием набора для синтеза кДНК Superscript II (Invitrogen).

Процедуры ПЦР для амплификации кДНК вариабельной области антитела, полученные из клеток гибридомы, были основаны на методах, описанных в Wang et al. ((2000) J Immunol Methods. 233:167-77) и Co et al. ((1992) J Immunol. 148:1149-54). Последовательности V_L и V_H амплифицировали как вырожденными праймерами на 5'-конце, так и специфичными праймерами с константной областью мышиного каппа или IgG₁, соответственно на 3'-конце. Очищенные ампликоны были отправлены в Beckman Coulter Genomics для секвенирования.

Поскольку вырожденные праймеры, используемые для клонирования последовательностей V_L и V_H кДНК, изменяют 5'-конец, необходимы дополнительные последовательности для проверки полных последовательностей кДНК. Предварительные последовательности были введены в поисковый запрос сайта NCBI IgBlast для идентификации мышиных последовательностей зародышевых линий, из которых были получены последовательности антител. ПЦР-праймеры затем были сконструированы таким образом, чтобы отжигать связанную с зародышевой линией лидерную последовательность мышиного антитела, чтобы эта новая реакция ПЦР приводила к полной последовательности вариабельной области кДНК, не изменяемой праймерами ПЦР.

Определение массы для подтверждения последовательности

Последовательности кДНК вариабельных областей, полученные для каждого из анти-CD123 антител, объединяли с последовательностями константной области зародышевой линии для получения последовательностей кДНК полноразмерных антител. Молекулярные массы тяжелой и легкой цепей затем вычисляли по трансляциям последовательностей кДНК и сравнивали с молекулярными массами, полученными с помощью LC/MS-анализов очищенных мышиных анти-CD123 антител. Наблюдаемые молекулярные массы для каждой из легких и тяжелых цепей соответствовали ожидаемым значениям.

Пример 3 Гуманизация антител

Экспрессия рекомбинантного антитела

Подтвержденные аминокислотные последовательности вариабельной области для мышиных CD123-антител были оптимизированы кодонами, синтезированы и клонированы внутри рамки с константными областями антител человека с помощью Blue Heron Biotechnology для создания химерных версий CD123-антител. Векторы, константные области и схемы клонирования, используемые для химерных CD123-антител, были идентичны тем, которые были использованы для гуманизированных CD123-антител, описанных ниже. Химерные антитела chCD123-6 состоят из последовательностей вариабельной области мыши SEQ ID NO: 28 и 29 соответственно, вместе с константами последовательности IgG1 и Kappa человека для тяжелых и легких цепей, соответственно. Вариабельная область легкой цепи была клонирована в EcoRI и BsiWI-сайты плазмиды pAbKZeo, а вариабельная область тяжелой цепи была клонирована в сайты HindIII и Apa1 плазмиды pAbG1Neo. Эти экспрессирующие конструкции были временно получены в обеих адгезивных клетках HEK-293Т с использованием суспензионных адаптированных клеток HEK-293Т с использованием модифицированной процедуры PEI во встряхиваемых колбах. Транзиентные PEI-трансфекции выполняли, как описано ранее (Durocher et al., Nucleic Acids Res. 30 (2): E9 (2002)), за исключением того, что клетки HEK-293Т выращивали в Freestyle 293 (Invitrogen), и объем культивирования оставался неразбавленным после добавления комплексов PEI-ДНК. Трансфекции инкубировали в течение недели, а затем очищенные супернатанты очищали стандартной хроматографией на белке А с последующими процедурами шлифующей хроматографии.

Гуманизация антител

Мышиное CD123-6-антитело гуманизировали с использованием процедур присоединения области определения комплементарности (CDR), по существу, как описано в Jones et al., Nature 321:604-608, 1986, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988, патенте США №5225539 и патенте США №5585089. CDR присоединение обычно состоит из замены каркасных областей Fv (FR) мышиного антитела на Fv каркасные области антитела человека с сохранением остатков CDR мыши, критических для специфических антигенсвязывающих свойств исходного антитела. Типичные CDR антитела CD123-6 согласно схеме нумерации Kabat и определений CDR по Kabat приведены в таблице А ниже.

Процесс CDR присоединения начинается с выбора подходящих человеческих акцепторных каркасов, обычно таких, которые получены из генов человеческого антитела, разделяющих самую высокую гомологию последовательности с исходным мышиным антителом. Были идентифицированы последовательности легкой и тяжелой цепи зародышевой линии иммуноглобулина человека с наивысшей гомологией с мышиным CD123-6-антителом с использованием интерактивного инструмента DomainGapAlign международной информационной системы ImMunoGeneTics^® (IMGT (http column double slash imgt dot cines dot fr slash), как описано в Ehrenmann et al., Nucleic Acids Res. 38:D301-307 (2010). Последовательности человеческих зародышевых линий, выбранные в качестве акцепторных каркасов для V_L и V_H- доменов CD123-6-антитела, были IGKV1-16*01 и IGHV1-46*03 соответственно.

Ниже показано выравнивание последовательности между соответствующей частью исходной последовательности muCD123-6 V_L, соответствующей последовательности зародышевой линии человека IGKV1-16*01 и соответствующими последовательностями huCD123-6VLGv1 и huCD123-6VLGv4.

Ниже показано выравнивание последовательности между соответствующей частью исходной последовательности muCD123-6 V_H, соответствующей последовательностью зародышевой линии человека IGHV1-46 * 03 и соответствующими последовательностями huCD123-6VHGv1, huCD123-6VHGv6 и huCD123-6VHGv7.

Были синтезированы, экспрессированы конструкции гуманизированной ДНК и рекомбинантные антитела, были очищены, как описано выше, для последующего анализа связывания CD123 по сравнению с исходным антителом.

Хорошо известно, что каркасные остатки также могут вносить структурный вклад в связывание антигена и могут быть повторно введены как обратные мутации, чтобы максимально сохранить антигенсвязывающую аффинность. Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992). Платформа остатков непосредственно под CDR, называемая остатками зоны верньер, может помочь сохранить конформацию петель CDR, которые обуславливают специфичность и аффинность антитела. Таким образом, были получены варианты, содержащие одну или несколько обратных мутаций остатков зоны вернье, и затем оценивали на антигенсвязывание, а также на функциональную активность ингибирования IL3. Испытанные обратные мутации остатков верньевой зоны включали 3 остатка в V_L (положение 46 в FW-L2 и положения 69, 71 в FW-L3) и 8 остатков в V_H (позиции 2, 28 в FW-H1, положение 48 в FW-H2 и положения 67, 69, 71, 73, 78 в FW-Н3). Несколько CD123-6-антител с присоединенным CDR с обратными мутациями верньевой зоны проявляли активность ингибирования IL3 на клетках TF-1, как показано в примере 4.6 или упоминалось здесь как «Gv4.6» (V_L Gv4 и V_H Gv6) и версии 4.7 или обозначенный в данном документе как «Gv4.7» (V_L Gv4 и V_H Gv7) (фиг. 1).

Специфическое использование описанных каркасных остатков антител CD123-6 с присоединенным CDR приведено в таблицах В и С ниже.

Кроме того, чтобы свести к минимуму опасения по поводу влияния конъюгированных лизинов, которые попадают в CDR, лизин 24 в мышином CD123-6-антителе CDR-L1 был заменен аргинином при CDR присоединении (см. Таблицу А выше).

Антитело CD 123-6 также гуманизировалось путем изменения поверхности вариабельного домена, согласно описанным ранее методам, Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973, 1994 и Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904, 1996. Изменение поверхности обычно включает идентификацию остатков каркасной поверхности вариабельной области как в легкой, так и в тяжелой цепях, и замену их на человеческие эквиваленты. Мышиные CDR и спрятанные остатки каркаса сохраняются в антителе с измененной поверхностью. Типичные CDR антител CD123-6 определены, как указано в таблице D.

Чтобы свести к минимуму опасения по поводу влияния конъюгирующих лизинов, которые попадают в CDR, лизин 24 мышиной CD123-6 антитела CDR-L1 был заменен аргинином. Аналогично, лизины 52 и 59 тяжелой цепи CDR-H2 мышиного CD123-6 антитела были заменены аргининами для версии 1.0 с измененной поверхностью. Определение CDR-H2 тяжелой цепи AbM использовалось для изменения поверхности, поэтому в таблице приводятся те, а также типичные последовательности CDR-H2 тяжелой цепи Kabat для мышиных и человеческих версий CD123-6 антитела.

Позиции остатков поверхности определяли как любое положение с относительной доступностью 30% или более (Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235:959-973, 1994). Затем вычисленные поверхностные остатки выравнивали с последовательностями поверхности человеческой зародышевой линии, чтобы идентифицировать наиболее гомологичную последовательность поверхности человека. Последовательность зародышевой линии человека, используемая в качестве замещающей поверхности для вариабельного домена легкой цепи CD123-6 антитела, была IGKV1-16 * 01, тогда как IGHV1-69 * 10 использовали в качестве замещающей поверхности для вариабельного домена тяжелой цепи. Специфические изменения остатков каркасной поверхности приведены ниже в таблицах Е и F.

Последовательности выравнивания ниже демонстрируют последовательности с измененной поверхностью для вариабельного домена антитела CD123-6 как легкой (V_L), так и тяжелой (V_H) цепи с их мышиными аналогами. См. SEQ ID NO: 41 для последовательности huCD123-6 V_L с измененной поверхностью и SEQ ID NO: 39 и 40 для последовательностей huCD123-6 V_H с измененной поверхностью.

Пример 4 Поиск антител против CD123, которые ингибируют IL3-опосредованную сигнализацию и пролиферацию

Способность анти-CD123 антител ингибировать опосредованную IL3 сигнализацию и пролиферацию исследовали in vitro с использованием клеточной линии эритролейкоза TF-1, которая может пролиферировать только в присутствии одного из следующих факторов роста: либо IL-3, либо GM-CSF. Клетки TF-1 культивировали в полной среде RPMI (RPMI-1640, 10% фетальной бычьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина сульфата, все реагенты были из Invitrogen), дополненной GM-CSF (2 нг/мл). Перед постановкой анализов пролиферации клетки промывали, а затем оставляли на ночь без факторов роста в течение ночи. Чтобы блокировать рецепторы Fc на поверхности клетки, культуральную среду дополнили 100 нМ антителом chKTI (несвязывающим антителом того же изотипа). Клетки TF-1 высевали 6000 клеток на лунку в полной среде RPMI либо в присутствии, либо в отсутствии 10 мкг/мл анти-CD123 антитела. К клеткам добавляли фактор роста, либо IL-3 (1 нг/мл), либо GM-CSF (2 нг/мл), чтобы инициировать клеточную пролиферацию. Клетки инкубировали при 37°С в увлажненном 5%-ном инкубаторе СО₂ в течение 3 дней. Относительное количество жизнеспособных клеток в каждой лунке определяли колориметрическим анализом WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, US). WST-8 восстанавливается дегидрогеназами в жизнеспособных клетках до оранжевого продукта формазана, который растворим в тканевой культуральной среде. Количество получаемого формазана прямо пропорционально числу жизнеспособных клеток. WST-8 добавляли в лунки при 10% от конечного объема и планшеты инкубировали при 37°С в увлажненном 5%-ном инкубаторе СО₂ в течение дополнительных 2-6 часов. Затем измеряли оптическую плотность на спектрофотометре с пластинчатым считывателем в режиме с двойной длиной волны 450 нм/650 нм, а поглощение при 650 нм (неспецифическое рассеяние света на ячейках) вычиталось из поглощения при 450 нм. Относительное количество клеток в каждой лунке рассчитывали, сначала корректируя абсорбцию фонового света, а затем деля величину каждого образца, обработанного антителом, на средние значения лунок с необработанными клетками (контроль).

Результаты типичного анализа представлены на фиг. 2А и 2В. В соответствии с ранее сообщенными данными (Sun et al. 1996) антитело 7G3, но не 6Н6 или 9F5, по существу, ингибировало зависимую от IL-3 пролиферацию. Неожиданно несколько анти-CD123 антител, полученных в этом исследовании, способны ингибировать IL-3-зависимую пролиферацию клеток TF-1 еще более значительно, чем 7G3 (фиг. 2А). Например, антитела 3, 6 и 14 уменьшали количество клеток TF-1 до менее чем 5% от количества в контроле (клетки TF-1, выращенные в отсутствие антитела), тогда как антитело 7G3 уменьшало количество клеток до 15% от контрольного. Напротив, лечение другими анти-CD123 антителами (например, антителами 2, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 18, 20, 21 и 22) оказало минимальное влияние на пролиферацию клеток или вообще никакого эффекта.

Ингибирование пролиферации клеток TF-1 антителами 3, 6, 14 и 7G3 было зависимым от IL-3, поскольку эти антитела не оказывали ингибирующего эффекта, когда клетки выращивали в присутствии другого фактора роста GM-CSF (фиг. 2В).

Затем определяли концентрации антител 3, 6, 14 (переименованных muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14, соответственно) и 7G3, которые необходимы для ингибирования IL3-зависимой пролиферации. Клетки TF-1 высевали 6000 клеток на лунку в 100 мкл культуральной среды. Антитела разводили в культуральную среду с использованием 6-кратного разведения и 50 мкл разбавленного материала добавляли на лунку. Затем к клеткам добавляли IL3 в конечной концентрации 1 нг/мл. Конечная концентрация антител обычно составляла от 6×10^-8 М до 8×10^-12 М. Клетки инкубировали при 37°С в увлажненном 5%-ном инкубаторе СО₂ в течение 3 дней. Относительное количество клеток в каждой лунке определяли с помощью анализа WST-8, как описано выше. Величина относительного числа клеток была нанесена на график относительно концентрации антител и представлена на фиг. 3. Очевидно, что muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 и 7G3 практически ингибируют IL-3-зависимую пролиферацию клеток TF-1 и дозозависимым образом, тогда как контрольное нефункциональное антитело против CD123 не имеет такого эффекта. Например, обработка 7G3 уменьшала относительное количество клеток до 18% при максимальной концентрации тестируемых антител, при этом значение IC₅₀ составляло 0,33 нМ. Обработка muCD123-3 приводила к уменьшению относительного числа клеток до 2% при максимальной концентрации тестируемых антител, при этом значение IC₅₀ составляло 0,26 нМ. Аналогично, обработка muCD123-14 или muCD123-6 приводила к уменьшению относительного числа клеток до менее 1% при максимальной концентрации тестируемых антител, при этом значения IC₅₀ составляли 0,08 нМ или 0,05 нМ соответственно. Следовательно, muCD123-3, muCD123-6 и muCD123-14 ингибируют IL-3-зависимую пролиферацию клеток TF-1 в значительно более высокой степени, чем антитело 7G3.

Пример 5 Аффинность связывания мышиных антител против CD123

Аффинность связывания тестировали с помощью проточной цитометрии с использованием очищенных антител. Гистограммы FACS, демонстрирующие связывание muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 и 7G3 с CD123-экспрессирующими клетками TF-1 и HNT-34, показаны на фиг. 4А и 4В, соответственно. Клетки TF-1 (5×10⁴ клеток на образец) инкубировали с различными концентрациями мышиных антител в 200 мкл буфера FACS (среда DMEM, дополненная 2% нормальной сывороткой козы). Затем клетки гранулировали, дважды промывали и инкубировали в течение 1 часа с 100 мкл фикоэритринового (РЕ) - конъюгированного козьего антимышиного антитела IgG (Jackson Laboratory). Затем клетки снова гранулировали, промывали FACS-буфером и ресуспендировали в 200 мкл PBS, содержащем 1% формальдегида. Образцы были получены с использованием проточного цитометра FACSCalibur с мультисветовым пробоотборником HTS или массивным проточным цитометром FACS и проанализированы с использованием CellQuest Pro (все из BD Biosciences, Сан-Диего, США). Для каждого образца рассчитывали геометрическое среднее интенсивности флуоресценции для FL2 и строили график зависимости концентрации антитела в полулогарифмическом графике. Кривая доза-реакция строилась с помощью нелинейной регрессии, а значение ЕС₅₀ каждой кривой, которое соответствует наблюдаемой константе диссоциации (K_d) каждого антитела, рассчитывали с использованием GraphPad Prism v4 (программное обеспечение GraphPad, Сан-Диего, Калифорния). Сильное связывание наблюдалось для всех тестируемых антител, а значения K_d соответствовали 0,3 нМ, 0,1 нМ, 0,3 нМ и 0,9 нМ для muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 и 7G3 антител соответственно (фиг. 4А). Таким образом, в этом эксперименте связывание мышиных CD123 антител субъекта по меньшей мере в 3-9 раз лучше, чем антитело 7G3.

Аналогичным образом, сильное связывание наблюдалось также, когда для того же описанного выше метода проточной цитометрии использовали еще одну CD123-положительную клеточную линию миелоидной лейкемии HNT-34. Значения K_d, рассчитанные, как описано выше, составляли 0,2 нМ, 0,07 нМ, 0,5 нМ и 2 нМ для muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 и 7G3 соответственно (фиг. 4В). Таким образом, в этом эксперименте связывание мышиных CD123 антител субъекта по меньшей мере в 4-28 раз лучше, чем антитело 7G3.

Эти данные демонстрируют, что muCD123-3, muCD123-6 и muCD123-14 имеют более низкое K_d (которые представляют более высокое сродство), чем антитело 7G3 к CD123-положительным ОМЛ-клеткам.

Пример 6 Аффинность связывания химерных антител против CD123

Химерные антитела chCD123-3, chCD123-6 и chCD123-14 анализировали на их аффинность связывания с клетками HNT-34 по сравнению с химерным контрольным IgG (chKTI). Анализ связывания с проточной цитометрией проводили и анализировали, как описано в примере 5, с использованием вторичных РЕ-конъюгированных с козьих античеловеческих антител. ФИГ. 5А отображает кривые доза-ответ для каждого антитела. Значение для наблюдаемой константы диссоциации (K_d) каждого антитела рассчитывали с использованием GraphPad Prism v4 (программное обеспечение GraphPad, San Diego, СА). Данные демонстрируют, что химеризация лишь умеренно влияет на аффинность связывания этих антител. Значения K_d для chCD123-3, chCD123-6 и chCD123-14 составляли 0,1 нМ, 0,04 нМ и 0,2 нМ соответственно. Эти значения были в 2,5 раза меньше, чем у их мышиных аналогов, описанных в примере 5. Как и ожидалось, антитело chKTI не связывалось с клетками при тестируемых концентрациях (фиг. 5А).

Высокая аффинность chCD123-3, chCD123-6 и chCD123-14 к клеткам ОМЛ была подтверждена с использованием другой CD123-положительной клеточной линии миелоидного лейкоза MOLM-13. Анализы связывания проточной цитометрией проводили и анализировали, как описано выше. ФИГ. 5В отображает кривые доза-ответ для каждого антитела. Значения для наблюдаемой константы диссоциации (K_d) chCD123-3, chCD123-6 и chCD123-14 составляли 0,2 нМ, 0,08 нМ и 0,2 нМ соответственно. Только предельное связывание наблюдалось для химерного изотипа контрольного IgG (антитело chKTI) при наиболее высокой концентрации (10 нМ).

Таким образом, chCD123-3, chCD123-6 и chCD123-14 сохраняют высокую аффинность их мышиных аналогов.

Функциональная активность химерных антител

chCD123-3, chCD123-6 и chCD123-14, и нефункциональное антитело против CD123, используемое в качестве отрицательного контроля, анализировали на их способность ингибировать IL3-зависимую пролиферацию клеток TF-1. Анализы проводили и анализировали, как описано в примере 4. Обработка chCD123-3, chCD123-6 и chCD123-14 приводила к уменьшению относительного числа клеток дозозависимым образом с величинами IC₅₀ 0,1 нМ, 0,03 и 0,05 нМ соответственно (фиг. 6). Контрольные нефункциональные антитела не влияли на рост клеток. Поэтому chCD123-3, chCD123-6 и chCD123-14 сохраняли функциональную активность их мышиных аналогов.

Пример 7 Аффинность связывания гуманизированных антител против CD123

Аффинность связывания типичных гуманизированных анти-CD123 антител huCD123-6Gv4.7S2 и huCD123-6Gv4.7S3 к клеткам HNT-34 сравнивали с аффинностью их мышиных и химерных аналогов, muCD123-6 и chCD123-6 соответственно. Антитело 7G3 и химерный изотип контрольного IgG (chKTI) тестировали параллельно. Анализы связывания проточной цитометрией проводили и анализировали, как описано в примере 5. ФИГ. 7А отображает кривые дозо-зависимости для каждого антитела. Эти данные демонстрируют, что гуманизация не влияла на аффинность связывания антитела, поскольку K_d для huCD123-6Gv4.7S2, huCD123-6Gv4.7S3, chCD123-6 и muCD123-6 составляет приблизительно 0,06 нМ. Наблюдаемый K_d для антитела 7G3 был значительно выше, приблизительно 2 нМ. Антитело chKTI не связывалось с клетками при тестируемых концентрациях. Следовательно, оба клона huCD123-6Gv4.7 сохраняют высокую аффинность мышиных и химерных аналогов и имеют более высокую аффинность (например, по меньшей мере примерно в 30 раз выше), чем антитело 7G3 к клеткам, экспрессирующим CD123.

Аналогично, аффинности связывания ADC-конъюгатов типичного гуманизированного антитела huCD123-6Gv4.7 анализировали с использованием клеток HNT-34 по сравнению с неконъюгированным huCD123-6Gv4.7. Анализ связывания проточной цитометрией проводили и анализировали, как описано в примере 5, с использованием вторичных РЕ-конъюгированных с козьих античеловеческих антител. ФИГ. 7В и 7С отображают кривые зависимости доза-ответ для каждого антитела и соответствующих конъюгатов. Данные демонстрируют, что конъюгация лишь умеренно влияет на аффинность связывания этих антител.

Функциональная активность гуманизированных анти-CD123 антител

Функциональную активность (способность ингибировать IL3-зависимую пролиферацию клеток TF-1) типичных гуманизированных анти-CD123 антител, huCD123-6Gv4.7S2 и huCD123-6Gv4.7S3, сравнивали с функциональностью их химерного аналога, chCD123-6.7G3 антитело тестировали параллельно. Анализы проводили и анализировали, как описано в примере 4.

Обработка huCD123-6Gv4.7S2, huCD123-6Gv4.7S3 и chCD123-6 ингибировала зависимую от IL-3 пролиферацию аналогично: пролиферация полностью ингибировалась при 1 нМ с IC₅₀ 0,02 нМ (фиг. 8А). Однако обработка 7G3 не оказала такого глубокого влияния на пролиферацию клеток: IC₅₀ антитела составляло 0,2 нМ и она не способно полностью ингибировать пролиферацию клеток, но только уменьшала число клеток до 18% при максимальной концентрации (10 нМ).

Ингибирование пролиферации клеток TF-1 huCD123-6Gv4.7S2, huCD123-6Gv4.7S3, chCD123-6 и 7G3 было зависимым от IL-3, поскольку эти антитела не оказывали ингибирующего эффекта, когда клетки выращивали в присутствии другого фактор роста GM-CSF (фиг. 8В).

Следовательно, huCD123-6Gv4.7 сохраняет функциональную активность его мышиных и химерных аналогов и значительно более активен, чем антитело 7G3 в ингибировании зависимой от IL-3 пролиферации.

Пример 8 Картирование эпитопа

Антиген CD123, α цепь рецептора IL-3 (IL-3Rα), состоит из 378 аминокислот, содержащих внеклеточный домен из 306 аминокислот, вовлеченный в связывание IL-3, трансмембранный домен из 20 аминокислот и короткий цитоплазматический хвост из 52 аминокислот. Внеклеточный домен может быть дополнительно разделен на N-концевой домен (NTD), содержащий область от треонина в положении 19 зрелого белка (например, расщепление пост-сигнального пептида) до серина в положении 100, и мотив распознавания цитокинов (CRM), состоящий из двух дискретных складчатых доменов: домена 2 (аминокислоты 101-204) и домена 3 (аминокислоты 205-306). Эпитопы для определенных анти-CD123 антител, описанных в данном документе, были картированы модифицироваными химерными белками, используя комбинации внеклеточного домена IL-3Rα и α-цепи-рецептора фактора роста гранулоцитов-макрофагов (GMRα), которая сохраняет топологию IL-3Rα и разделяет общую β-субъединицу, которая необходима для сигнализации.

Варианты клонирования и экспрессии IL-3Rα

Внеклеточный домен CD123/IL-3Rα (остатки 1-306) экспрессировали в виде белка, меченного гистидином. Белковая последовательность подвергалась оптимизации кодонов и была синтезирована с помощью Life Technologies и клонирована внутри рамки с меткой 10-гистидина в векторе экспрессии млекопитающих pABLT с использованием сайтов рестрикции EcoRI и HindIII. Внеклеточный домен контрольного белка GMRα (остаток 1-325), также содержащий N-концевой домен от серина в положении 25 в серине в положении 114 зрелого белка и CRM-домен, содержащий глицин в положении 115 до валина в положении 325, был аналогичным образом синтезирован и клонирован. Затем векторы экспрессии белка для белка химерного рецептора IL3Rα/GMRα были сконструированы с помощью рестрикционных расщеплений, заменяющими либо N-концевой домен (остатки 1-100), либо CRM-домен (остатки 101-306) молекулы IL-3Rα с соответствующими последовательностями GMRα. IL3Rα (1-100) кодирует остатки IL-1Rα 1-100, слитые с остатками GMRα 115-325, и IL3Rα (101-306) кодирует остатки GMRα 1-114, слитые с остатками IL-3Rα 101-306, как показано на фиг. 9А.

IL3-Rα, GMRα и два химерных IL-3Rα His-меченных белка, IL-3α (1-100) и IL3-Rα (101-306), экспрессировали путем транзиентной трансфекции клеток HEK 293Т и трансфицированные клетки очищали от супернатанта с использованием высококачественной хроматографии на основе Ni Sepharose (GE healthcare) по инструкции изготовителя.

Связывание антител с различными конструкциями lL3Ra

Химерные и гуманизированные анти-IL3Rα антитела тестировали в соответствии с методом иммуноферментного анализа (ELISA) для связывания с белками IL-3Rα, описанными выше. Вкратце, каждый His-меченный белок IL-3Rα, очищенный хроматографией на основе экстракта никеля Sepharose, разбавляли до 1 нг/мл в 50 мМ буфере бикарбоната натрия рН 9,6 и в каждую лунку добавляли 100 мкл. После 16-часовой инкубации при 4°С, планшеты промывали трис-буферным солевым раствором 0,1% Tween-20 (TBST), затем блокировали с 200 мкл блокирующего буфера (TBS с 1% BSA). Затем 100 мкл первичного антитела, последовательно разведенного в блокирующем буфере, двукратно добавляли к лункам ELISA и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты затем трижды промывали TBST перед добавлением 100 мкл IgG (H+L)-HRP против человека (Jackson ImmunoResearch) в каждую лунку. Планшеты снова инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем проводили три промывки TBST. Наконец, в каждую лунку добавляли 100 мкл однокомпонентного субстрата HRP для микролунок (Surmodics) и инкубировали в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл останавливающего раствора (Surmodics), и поглощение считывали при 450 нм.

Связывание CD123-антител с химерными белками IL-3Rα оценивали по сравнению с IL-3Rα дикого типа. ФИГ. 9В демонстрирует, что антитело huCD123-6 связывается как с IL-3Rα, так и с IL-3Rα (101-306) с аналогичными субнаномолярными аффинностями. Напротив, антитело huCD123-6 не связывает конструкцию GMRα, и связывание полностью исключено для конструкции химерного белка IL-3Rα (1-100). Эти результаты демонстрируют, что антитело huCD123-6 связывается в основном с CRM-доменом, возможно, только с минимальным вкладом от N-концевого домена IL-3Rα. Аналогично, антитело chCD123-3 связывается прежде всего с CRM-доменом IL-3Rα, хотя и с уменьшенной аффинностью связывания по сравнению с IL-3Rα дикого типа (фиг. 9С). Снижение аффинности связывания к химерному рецепторному белку IL-3Rα (101-306) предполагает возможное вовлечение N-концевого домена IL-3Rα в связывание с CD123-3-антителом. Однако антитело chCD123-14 не распознает химерный рецептор IL-3Rα (101-306) (фиг. 9D); скорее, он связывается как с IL-3Rα, так и с IL-3Rα (1-101) с эквивалентным сродством. Эти результаты демонстрируют, что антитело chCD123-14 связывается исключительно с N-терминальным доменом IL-3Rα. Для сравнения, антитело 7G3 вместе с двумя другими коммерчески доступными антителами, 6Н6 и 9F5, также связывается с N-терминальным доменом IL-3Rα и конструкциями IL-3Rα дикого типа, но не распознает CRM-домен IL3Rα (фиг. 9Е, 9F и 9G, соответственно). Таким образом, эти данные демонстрируют, что эпитопы антител CD123-6 и CD123-3 расположены в основном внутри CRM-домена IL-3Rα и отличаются от эпитопа антитела 7G3, который ограничен N-концевым доменом IL-3Rα. Антитело CD123-14 также связывает эпитоп, ограниченный в N-концевом домене IL-3Rα.

Пример 9 Получение лизин-связанных конъюгатов DM1 и IGN антитела huCD123-6

a. Получение huCD123Gv4,7S3-сульфо-SPDB-D1

Реакция, содержащая 2,0 мг/мл CD123-6G4,7S3 антитела и 3,5 мольных эквивалента сульфо-SPDB-D1 in situ смеси при помощи линкера в 15 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этансульфоновой кислоты) рН 8,5 буфера и 15% об./об. DMA (N,N диметилацетамид) сорастворителе была подвержена конъюгированию в течение 3-4 часов при 25°C. Смесь in situ получали путем взаимодействия 3,0 мМ сульфо-SPDB линкера с 3,9 мМ сульфированного соединения D1 в DMA в течение 5 часов при 25°С в присутствии 20 мМ N,N диизопропилэтиламина (DIPEA).

После реакции конъюгат очищали и буфер заменяли на 20 мМ гистидина, 50 мМ хлорида натрия, 8,5% мас./об. Сахарозы, 0,01% Tween-20, 50 мкМ буфера для состава бисульфита натрия с рН 6,2, используя колонки обессоливания NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Диализ проводили в том же буфере в течение 4 часов при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C с использованием кассет диализа Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10,000 MWCO).

Было обнаружено, что очищенный конъюгат имеет конечную концентрацию белка 1,2 мг/мл и в среднем 2,9 молекулы соединения D1, связанного на антитело (с помощью УФ-Вос с использованием молярных коэффициентов экстинкции ε_{330 нм}=15484 см^-1 М^-1 и ε_{280 нм}=30115 см^-1 М^-1 для соединения D1 и ε_{280 нм}=207360 см^-1 М^-1 для huCD123-6G4.7S3 антитела);); 94,3% мономера (с помощью эксклюзионной хроматографии); и <2% неконъюгированного соединения D1 (UPLC с двойной колонкой, анализ ВЭЖХ с обращенной фазой).

b. Получение huCD123-6Gv4.7S3-D2

Реакцию, содержащую 2,0 мг/мл huCD123-6Gv4.7S3 антитела и 5,0 молярных эквивалентов соединения D2 (предварительно обработанный 5-кратным избытком бисульфита натрия в 90:10 DMA: 50 мМ сукцинат с рН 5,5 в течение 4 часов при 25°С) в 15 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этансульфоновая кислота) рН 8,5 буфера и 10% об./об. DMA (N,N-диметилацетамид) сорастворителе, инкубировали в течение 4 часов при 25°С.

Было обнаружено, что очищенный конъюгат имеет конечную концентрацию белка 1,2 мг/мл и в среднем 2,9 молекулы соединения D2, связанного на антитело (с помощью УФ-Вос с использованием молярных коэффициентов экстинкции ε_{330 нм}=15484 см^-1 М^-1 и ε_{280 нм}=30115 см^-1 М^-1 для соединения D2 и ε_{280 нм}=207360 см^-1 М^-1 для huCD123-6G4.7S3 антитела);); 99,3% мономера (с помощью эксклюзионной хроматографии); и <2% неконъюгированного соединения D2 (UPLC с двойной колонкой, анализ ВЭЖХ с обращенной фазой).

с. Получение huCD123-6Gv1.1-сульфо-SPDB-DGN462

NHS-сульфо-SPDB-sDGN462 получали in situ путем инкубирования 1,5 мМ сульфо-SPDB-линкера, 1,95 мМ сульфированного DGN462 (sDGN462) в DMA, содержащего 10 мМ DIPEA (N,N-диизопропилэтиламин) в течение 20 мин, перед добавлением 0,9 мМ МРА (3-Малеимидопропионовая кислота) для гашения непрореагировавшего IGN-тиола в течение 15 мин при 25°C. Реакцию, содержащую 2,5 мг/мл huCD123-6Gv1.1 антитела и 7,5 молярных эквивалентов полученного NHS-сульфо-SPDB-DGN462 в 15 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этансульфоновой кислоты) рН 8,5 буфера и 15% об./об. DMA сорастворителе, инкубировали в течение ночи при 25°С.

После реакции конъюгат очищали в 20 мМ гистидина, 50 мМ NaCl, 8,5% сахарозы, 0,01% Tween-20, 50 мкМ буфере для состава бисульфита натрия с рН 6,2, используя колонки для обессоливания NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Диализ проводили в том же буфере в течение ночи при 4°C с использованием диализных кассет Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10,000 MWCO).

Было обнаружено, что очищенный конъюгат имеет конечную концентрацию антител 0,95 мг/мл и в среднем 2,8 DGN462 молекул, связанных на антитело (по УФ-Вос, используя молярные коэффициенты экстинкции ε_{330 нм}=15484 см^-1 М^-1 и ε_{280 нм}=30115 см^-1 М^-1 для DGN462 и ε_{280 нм}=207360 см^-1 М^-1 А для huCD123-6Gvl.l антитела); 99,5% мономера (с помощью эксклюзионной хроматографии); и 0,6% неконъюгированного DGN462 (путем осаждения ацетоном, анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой).

d. Получение huCD123-6Gv1.1-D3

Реакцию, содержащую 2,0 мг/мл huCD123-6Gv1.1 антитела и 3,5 молярных эквивалентов D3 (предварительно обработанный 5-кратным избытком бисульфита натрия в 90:10 DMA: 50 мМ сукцинат с рН 5,5 в течение 4 часов при 25°С) в 15 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этансульфоновая кислота) рН 8,5 буфера и 10% об./об. DMA (N,N-диметилацетамид) сорастворителе, инкубировали в течение 4 часов при 25°С. После реакции конъюгат очищали и буфер заменяли на 20 мМ гистидина, 50 мМ хлорида натрия, 8,5% мас./об. Сахарозы, 0,01% Tween-20, 50 мкМ буфера для состава бисульфита натрия с рН 6,2, используя колонки обессоливания NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Диализ проводили в том же буфере в течение 4 часов при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°С с использованием кассет диализа Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10,000 MWCO).

Было обнаружено, что очищенный конъюгат имеет конечную концентрацию белка 0,9 мг/мл и в среднем 3,4 D3 молекул, связанных на антитело (по УФ-Вос, используя молярные коэффициенты экстинкции ε_{330 нм}=15 484 см^-1 М^-1 и ε_{280 нм}=30 115 см^-1 М^-1 для D3 и ε_{280 нм}=207 360 см^-1 М^-1 для huCD123-6Gv1.1 антитела); 96% мономера (с помощью эксклюзионной хроматографии); и <1% неконъюгированного D3 (двойной колонкой, анализ методом ВЭЖХ с обращенной фазой).

е. Получение конъюгатов huCD123-6Rv1.1-СХ1-1-майтанзиноида

Гуманизированное анти-CD123 антитело (huCD123-6Rv1.1 с измененной поверхностью) конъюгировали с остатками лизина с полезной нагрузкой майтансиноида через триглицил, СХ1-1-линкер. Смесь, содержащую 5 мМ триглицила, СХ1-1 гетеробифункциональный линкер (несущий N-гидроксисукцинимид и малеимидные группы) и 6,5 мМ DM1 майтансиноид в N,N-диметилацетамиде (DMA), содержащий 20 мМ N,N-диизопропилэтиламина (DIPEA), инкубировали примерно 20 мин при комнатной температуре. Непрореагировавший DM1 гасили 2 мМ малеимидопропионовой кислоты (MPA) в течение примерно 20 мин при комнатной температуре перед добавлением реакционной смеси к гуманизированному анти-CD123 антителу (huCD123-6Rv1.1) при 4 мг/мл в 140 мМ буфере EPPS, рН 8, содержащего около 8% DMA, при избытке примерно 7,6 × или 15 × CX1-1-DM1 аддукта над антителом. Реакционные смеси конъюгации инкубировали в течение ночи при 25°С, после чего конъюгаты очищали и буфер заменяли на 10 мМ сукцинатного буфера, рН 5,5, содержащего 250 мМ глицина, 0,5% сахарозы, 0,01% Твин 20, используя колонки для обессоливания NAP (Illustra, Sephadex G-25, GE Healthcare). Диализ проводили в вышеописанном сукцинатном буфере в течение ночи при 4°С с использованием кассет диализа Слайд-а-Лизера (Thermo Scientific, 10000 отсечной мембраны с молекулярным весом).

Было обнаружено, что очищенные конъюгаты содержат в среднем 4,3 и 6,7 молекулы майтансиноида, соединенных на антитело (по УФ/Вос спектрометрии и ВЭЖХ с эксклюзионной хроматографией, с использованием мольных коэффициентов экстинкции ε_{252 нм}=26350 см^-1 М^-1 и ε_{280 нм}=5456 см^-1 М^-1 для DM1 и ε_{280 нм}=207076 см^-1 М^-1 для huCD123-антитела), 98%-ный мономер (с помощью эксклюзионной хроматографии) и конечная концентрация белка составляет 2,1 мг/мл и 1,2 мг/мл соответственно. Уровни неконъюгированного майтансиноида в очищенных конъюгатах оценивали по ВЭЖХ как низкое (<1%). Масс-спектрометрия дегликозилированных конъюгатов указывала на связанные виды майтансиноидов.

Пример 10. Анализы цитотоксичности in vitro

Способность конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC) из huCD123-6 убивать клетки, которые экспрессируют CD123 на их клеточной поверхности измеряли с использованием in vitro анализов цитотоксичности. Линии клеток культивировали в культуральной среде, как рекомендовано поставщиком клеток (АТСС или DSMZ). Клетки, от 2000 до 10000 в 100 мкл культуральной среды, добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов с плоским дном. Чтобы блокировать рецепторы Fc на поверхности клетки, культуральную среду дополнили 100 нМ антителом chKTI (антителом того же изотипа). Конъюгаты разводили в культуральной среде с использованием 3-кратных серий разбавления и 100 мкл добавляли на лунку. Чтобы определить вклад CD123-независимой цитотоксичности, блок CD123 (например, 100 нМ антитела chCD123-6) добавляли в некоторые лунки перед добавлением конъюгатов. Контрольные лунки, содержащие клетки и среду, но не содержащие конъюгатов, а также лунки, содержащие только среду, были включены в каждую аналитическую пластинку. Анализы выполнялись в трех экземплярах для каждой точки данных. Планшеты инкубировали при 37°С в увлажненном 6%-ном инкубаторе СО₂ в течение 4-7 дней. Затем относительное количество жизнеспособных клеток в каждой лунке определяли с использованием набора для подсчета клеток на основе WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD), как описано в примере 4. Выявленную фракцию выживших клеток в каждой лунке рассчитывали, сначала корректируя оптическую плотность среды, а затем деля каждое значение на среднее значение значений в контрольных лунках (необработанных клетках). Фракция выживших клеток была построена с учетом концентрации конъюгатов в полулогарифмических графиках.

Результаты типичного анализа цитотокичности представлены на ФИГ. 10. Линия клеток ОМЛ OCI-AML4 может размножаться без факторов роста в культуральной среде. Клетки обрабатывали конъюгатом майтанзиноид huCD123-6Rv1.1-CX1-1-DM1. Обработка приводила к дозозависимому уничтожению клеток с величиной IC₅₀ 0,07 нМ. Для оценки того, была ли гибель обусловлена экспрессией CD123, антиген блокировался избытком неконъюгированного антитела chCD123-6 (500 нМ), и эффективность клеток была проверена на клетках. Более поздняя обработка не влияла на жизнеспособность клеток при концентрациях ниже 3 нМ и имела лишь умеренное влияние на жизнеспособность клеток при 10 нМ (самая высокая концентрация была проверена). Таким образом, конъюгат huCD123-6Rv1.1-CX1-1-DM1 демонстрирует высокую CD 123-зависимую цитотоксичность на клетках OCI-AML4.

Цитотоксичность конъюгатов антитела huCD123-6, связанных с другими цитотоксическими агентами (DGN462, D3, D1 и D2) с помощью лизинов, также тестировали in vitro. В исследовании использовались пятнадцать CD123-положительных клеточных линий различного происхождения (ОМЛ, В-ОЛЛ, ХМЛ и НХЛ) (таблица ниже). Большинство клеточных линий были получены у пациентов, имеющих злокачественность, по меньшей мере с одним отрицательным прогностическим фактором (например, сверхэкспрессия Р-гликопротеина, сверхэкспрессия изменений EVI1, р53, мутация DNMT3A, внутренняя тандемная дубпликация FLT3). Конъюгаты продемонстрировали высокую активность на этих клеточных линиях с величинами IC₅₀ в диапазоне от суб-пМ до низкого nM (таблица непосредственно ниже, фиг. 11А).

Цитотоксичность in vitro различных лизиновых конъюгатов huCD123-6-IGN на CD123-положительных клеточных линиях различного происхождения

Вышеприведенные данные, по-видимому, предполагают, что клеточные линии В-ALL (KOPN8 и JM-1) очень чувствительны к соединениям IGN. Чтобы дополнительно подтвердить этот вывод, цитотоксичность конъюгатов антитела huCD123-6Gv4.7, связанных с D1 или D2, через лизины или цистеины, тестировали с использованием тех же клеточных линий B-ALL, KOPN8 и JM-1, плюс дополнительной B-ALL клеточной линии «380 клеток». Отрицательные контроли с использованием конъюгатов с антителом, которое не связывается с этими клеточным линиям В-ALL - KTI - были включены в анализы. Результаты на фиг. 11В подтвердили вышеуказанный вывод.

В приведенной выше таблице также показано, что соединения huCD123-IGN очень активны в отношении различных линий клеток ОМЛ. Типичные данные с использованием соединений Lys- и Cys-связанных IGN показаны на фиг. 11С. В соответствии с данными, показанными на фиг. 11С, дополнительные данные (показаны в таблице ниже и на фиг. 21) по цитотоксичности Cys-связанного конъюгата (huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5) демонстрируют, что конъюгат очень эффективен против различных CD123-положительных линий клеток ОМЛ, в том числе с неблагоприятными прогностическими факторами.

Интересно, что предварительные данные свидетельствуют о том, что Cys-связанный конъюгат D5, по-видимому, особенно эффективен в отношении клеток-предшественников ОМЛ даже по сравнению с мощными конъюгатами Lys-связанных D2 или Lys-связанных D1. См. фиг. 11D, в которой 9 образцов пациентов с ОМЛ использовались для проверки активности различных конъюгатов IGN по изобретению.

Дополнительные исследования цитотоксичности in vitro показывают, что Cys-связанный конъюгат D5 имеет активность в 74 раза выше, чем Mylotarg в неизбираемых образцах пациентов с ОМЛ. См. фиг. 18.

Кроме того, фиг. 11Е и FIG. 19 демонстрируют, что Cys-связанный конъюгат huCD123 D5 убивает нормальные клетки крови в концентрациях, которые являются в >100 раз выше, чем те, которые необходимы для уничтожения предшественников ОМЛ. Для сравнения, Mylotarg (гемтузумаб озогамицин) не проявляет такого преимущественного убивающего эффекта, с разницей в 10 раз в цитотоксичности между нормальными клетками-предшественниками и клетками-предшественниками ОМЛ. На ФИГ. 19, были протестированы дополнительные образцы пациентов с ОМЛ. Кроме того, был также испытан конъюгат huCD123 D5', ДНК-кросс-линкер, и он проявлял только 6-кратное различие в цитотоксичности между нормальными клетками-предшественниками и клетками-предшественниками ОМЛ (см. Фиг. 19).

Пример 11. Проницаемость лизин-связанных IGN-конъюгатов in vitro на первичных образцах пациента ОМЛ

Способность различных лизин-связаных huCD123-6-IGN конъюгатов убивать первичные ОМЛ клетки измеряли с использованием анализов колониеобразующих единиц (КОЕ). Замороженные мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и мононуклеарные клетки костного мозга (ВММС) у пациентов с ОМЛ были приобретены у Conversant Biologics Inc. (Huntsville, AL) и AllCells, LLC (Alameda, СА). Клетки размораживали, как рекомендовано поставщиками, промывали и ресуспендировали в культуральной среде RPMI (RPMI-1640, 10% фетальная бычья сыворотка, 50 нг/мл SCF и 50 нг/мл FLT3L). Чтобы блокировать рецепторы Fc на поверхности клетки, культуральную среду дополнили 100 нМ антителом chKTI (антителом того же изотипа). Клетки, 200000 в 150 мкл культуральной среды, добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов с плоским дном. Конъюгаты разводили в культуральной среде с использованием серий 10-кратного разбаведения и 50 мкл добавляли на лунку. Контрольные лунки содержали клетки и среду, но не содержали конъюгатов. Планшеты инкубировали при 37°С в увлажненном 6%-ном инкубаторе СО₂ в течение 18 часов. Затем клетки переносили в пробирки, содержащие 2,2 мл METHOCULT™ Н4534 без ЕРО (StemCell Technologies, Vancouver, ВС), смешивали и смеси переносили в 6-луночные планшеты. Планшеты инкубировали при 37°С в увлажненном 6%-ном инкубаторе СО₂ до образования колоний (обычно от 10 до 16 дней) и был произведен подсчет. Процентное ингибирование образования колоний определяли путем сравнения показателей в обработанных конъюгатом образцах с помощью необработанного контроля. Процентное ингибирование колоний было нанесено на график концентрации конъюгата и концентрация конъюгата, которая ингибирует 90% образования колонии (IC₉₀), была определена по кривым.

Результат типичного анализа КОЕ для одного первичного образца пациента представлен на фиг. 12А. Конъюгаты huCD123-6-IGN продемонстрировали дозозависимую цитотоксичность с величинами IC₉₀ 0,1 нМ, 0,01 нМ, 0,03 нМ и 0,012 нМ для huCD123-6Gv1.1-sSPDB-DGN462, huCD123-6Gv1.1-D3, huCD123-6Gv1.1-sSPDB-D1 и huCD123-6Gv1.1-D2, соответственно. ФИГ. 12В отображает значения IC₉₀ для всех образцов пациентов ОМЛ, обработанных конъюгатами. Средние значения IC₉₀ для каждого конъюгата представлены в виде сплошных линий и равны 2 нМ, 0,1 нМ, 0,03 нМ и 0,02 нМ для huCD123-6Gv1.1-sSPDB-DGN462, huCD123-6Gv1.1-D3, huCD123-6Gv1.1-sSPDB-D1 и huCD123-6Gv1.1-D2 соответственно. Таким образом, лизинсвязанные конъюгаты huCD123-6-IGN продемонстрировали высокую эффективность на образцах от пациентов с ОМЛ.

Пример 12 Получение Ser сайт-специфичных конъюгатов антитела huCD123-6

а) Конъюгация N-концевых антител - двухэтапный подход

Антитело huCD123-6Gv4.6/7S3 (имеющее huCD123-6Gv4 LCVR (SEQ ID NO: 37, включая модифицированный N-концевой Ser) и HCVR Gv6/7 (SEQ ID NO: 34)) ([1], на Схеме 1 как проиллюстрировано на фиг. 15; 3 мг/мл в PBS, рН 7,4) обрабатывали 5 мМ водным периодатом натрия (50 эквивалентов, 25°С, 30 минут). 3атем смесь помещали в буфер через колонку для обессоливания NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) в буфер для ацетата натрия, рН 5,0.

Полученный раствор обрабатывали 4-аминофенэтиловым спиртом (100 мМ в DMA [N,N-диметилацетамид]) до 10% об./об. сорастворителя. Затем вводили гетеробифункциональный линкер 1 ([3] на схеме 1, 5 эквиваленты) и реакционный сосуд герметизировали и инкубировали при 37°С в течение 24 часов.

Затем смесь подвергали буферному обмену через колонку для обессоливания NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) в HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этансульфоновую кислоту), буфер рН 8,5. 3атем раствор регулировали сорастворителем DMA (N,N-диметилацетамид) (10% об./об.) и обрабатывали сульфированным DGN462 (sDGN462) ([5], схема 1, свободный тиол, 5 эквивалентов), при 25°С в течение 6 часов.

Полученный конъюгат заменяли буфером на 250 мМ глицина, 10 мМ гистидина, 1% сахарозы, 0,01% Tween-20, 50 мкМ буфера для раствора бисульфита натрия при рН 6,2 с использованием фильтрационной колонки NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Диализ проводили в том же буфере в течение 4 часов при 25°С с использованием кассет диализа Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10,000 MWCO).

Было установлено, что очищенный конъюгат ([6], схема 1) имеет гомогенное среднее значение по двум молекулам DGN462, связанным на антитело (через масс-спектрометрию Q-ToF), >98% мономера (с помощью эксклюзионной хроматографии), <2% свободного лекарственного средства (путем осажденного ацетоном анализа ВЭЖХ с обращенной фазой) и конечной концентрации белка 0,18 мг/мл (через УФ-Вос с использованием молярных коэффициентов экстинкции ε₂₈₀=213320 М^-1 см^-1 для huCD123-6Gv4.6/7S3 антитела).

b) Конъюгация N-концевых антител - прямая IGN связь

Модифицированное N-концевое Ser-содержащее антитело huCD123-6Gv4.7S2, модифицированное с N-концевым серином в тяжелой цепи (huCD123-6Gv4.7S2, которое содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 53, в котором Хаа представляет собой Val, и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 51) ([1] на схеме 2, фиг. 16; 3 мг/мл в PBS, рН 7,4) обрабатывали 5 мМ водного периодата натрия (50 молярных эквивалентов) при 25°С в течение 30 минут. Затем смесь помещали в буфер через колонку для обессоливания NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) в буфер для ацетата натрия, рН 5,0.

Полученный раствор обрабатывали р-фенилендиамином (100 мМ в DMA [N,N-диметилацетамиде]) до 10% об./об. сорастворителя. Затем вводили сульфированный in situ - D8 (или sD8) ([3], схема 2; 5 молярных эквивалентов), и реакционный сосуд герметизировали и инкубировали при 37°С в течение 24 часов.

Затем смесь подвергали буферному обмену через колонку для обессоливания NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) в 250 мМ глицина, 10 мМ гистидина, 1%-ный буфер сахарозы при рН 6,2. Диализ проводили в том же буфере в течение 4 часов при 25°С, используя кассеты диализа Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10,000 MWCO).

Было обнаружено, что очищенный конъюгат ([4], схема 2) имеет гомогенное среднее значение двух молекул D8, связанных на антитело (через масс-спектрометрию Q-ToF), >96% мономера (через хроматографию исключения по размеру), <3% свободного лекарственного средства (через HISEP-анализ с обратной фазой ВЭЖХ) и конечную концентрацию белка 1,4 мг/мл (через УФ-Вос с использованием молярных коэффициентов экстинкции ε₂₈₀=213320 М^-1 см^-1 для huCD123-6Gv4.7S2-антитела).

Сульфонированный in situ -D8 (или sD8), описанный выше, получали в соответствии со следующей процедурой: Реагент D8 в виде лиофилизированного белого твердого вещества растворяли в DMA (N,N-диметилацетамиде) до 10-20 мМ раствора для концентрирования. Добавляли свежий бисульфит натрия (500 мМ раствор в воде, 5 молярных эквивалентов) и полученный раствор реагировал в течение 4-6 часов при 25°С до 15-часового этапа поддержания при 4°С. Добавляли еще одну аликвоту свежего бисульфита натрия (500 мМ раствора в воде, 2 молярных эквивалента) и давали возможность взаимодействовать в течение 4 часов при 25°С перед хранением при -80°С до дальнейшего использования.

с) Конъюгация N-концевых антител - двухшаговый протокол для CD123-6Gv4.7

Антитело huCD123-6Gv4.7S3 (см. Выше), модифицированное с N-концевым серином на легкой цепи (huCD123-6Gv4.7S3) ([1] на схеме 3, фиг. 17; 3 мг/мл в PBS, рН 7,4) обрабатывали 5 мМ водного периодата натрия (50 молярных эквивалентов) при 25°С в течение 30 минут. Затем смесь помещали в буфер через колонку для обессоливания NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) в буфер для ацетата натрия, рН 5,0.

Полученный раствор обрабатывали 4-аминофенэтиловым спиртом (100 мМ в DMA [N,N-диметилацетамид]) до 10% об./об. сорастворителя. Затем вводили гетероббифункциональный линкер 1 ([3], схему 3, 5 молярных эквивалентов) и реакционный сосуд герметизировали и инкубировали при 37°С в течение 24 часов.

Затем смесь помещали в буфер через колонку для обессоливания NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) в буфер HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этансульфоновой кислоты) с рН 8,5. Затем раствор регулировали сорастворителем DMA (N,N-диметилацетамид) (10% об./об.) и обрабатывали сульфированным D1 (или sD1) ([5], схемой 3, свободным тиолом, 5 молярными эквивалентами) при 25°С в течение 6 часов.

Полученный конъюгат заменяли буфером на 250 мМ глицина, 10 мМ гистидина, 1% сахарозы, 0,01% Tween-20, 50 мкМ буфера для раствора бисульфита натрия при рН 6,2 с использованием фильтрационной колонки NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Диализ проводили в том же буфере в течение 4 часов при 25°С, используя кассеты диализа Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10,000 MWCO).

Было установлено, что очищенный конъюгат ([6], схема 3) имеет в среднем 2,0 молекулы D1, связанных на антитело (через масс-спектрометрию Q-ToF), >96% мономера (с помощью хроматографии с исключением размера), <3% свободного лекарственного средства (через ацетон-осажденный анализ с обращенной фазой ВЭЖХ) и конечную концентрацию белка 0,4 мг/мл (через УФ-Вос с использованием молярных коэффициентов экстинкции ε₂₈₀=213320 М^-1 см^-1 для huCD123-6Gv4.7S3-антитела).

Пример 13 In vitro цитотоксичность сайт-специфичных конъюгатов антитела huCD123-6

Способности сайт-специфических конъюгатов huCD123-6 с различными IGN соединениями (huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5 и huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8) убивать клетки, которые экспрессируют CD123 на их клеточной поверхности было по сравнению с лизинсвязанными конъюгатами, содержащими подходящее антитело и полезную нагрузку (huCD123-6Gv4.6-D2 и huCD123-6Rv1.1-D2) с использованием анализов цитотоксичности invitro. Анализы цитотоксичности проводили и анализировали, как описано в примере 10.

Конъюгат huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5 (в котором huCD123-6Gv4.6-CysMab имеет последовательность тяжелой цепи Ig SEQ ID NO: 54 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 51) был по меньшей мере таким же активным, как лизинсвязанный конъюгат huCD123-6Gv4.6-D2 (в котором антитело huCD123-6Gv4.6 имеет последовательность тяжелой цепи Ig SEQ ID NO: 50 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 51) на многочисленных клеточных линиях. Несколько примеров анализа цитотоксичности с использованием линии EOL-1 ОМЛ, клеточной линии В-ALL KOPN-8 и клеточной линии CML MOLM-1 показаны на фиг. 13А-13С, соответственно. Оба конъюгата убивали клетки дозозависимым образом с величинами IC₅₀ приблизительно 0,002 нМ, 0,005 нМ и 0,02 нМ для клеток EOL-1, клеток KOPN-8 и MOLM-1, соответственно. Гибель была CD123-зависимой, поскольку конъюгаты были по меньшей мере в 100 раз менее токсичными для клеток, когда антиген CD123 блокировался неконъюгированным антителом chCD123-6.

Конъюгат huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8 (в котором всплывающее антитело huCD123-6Rv1.1S2 имеет последовательность тяжелой цепи Ig SEQ ID NO: 60, за исключением того, что N-концевой остаток представляет собой Ser, и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 61) поддерживали связывание мишени (CD123) и были, по меньшей мере, такими же активными, как лизинсвязанный конъюгат huCD123-6Rv1.1-D2 (в котором антитело с измененной поверхностью huCD123-6Rv1.1 имеет последовательность тяжелой цепи Ig SEQ ID NO: 60 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 61) на многочисленных клеточных линиях. Несколько примеров анализа цитотоксичности с использованием линий SHI-1 и HNT-34 линии ОМЛ, а также клеточной линии CML MOLM-1 показаны на фиг. 14А-14С, соответственно. Оба конъюгата убивали клетки дозозависимым образом с величинами IC₅₀ приблизительно 0,01 нМ, 0,002 нМ и 0,03 нМ для клеток SHI-1, клеток HNT-34 и клеток MOLM-1, соответственно. Гибель была CD123-зависимой, поскольку конъюгаты были по меньшей мере в 100 раз менее токсичными для клеток, когда антиген CD123 блокировался неконъюгированным антителом huCD123-6.

В другом эксперименте было обнаружено, что соединение DGN462, связанное с Ser с антителом huCD123, имеет 3-кратную более высокую антиген-специфическую активность, чем лизиновая версия с более высоким DAR (данные не показаны).

Пример 14 Исследования эффективности/и vivo с использованием конъюгатов CD123-IGN в подкожной модели мышей ОМЛ MVL-11

Подкожно имплантированные опухолевые клетки представляют собой удобное средство для тестирования новых потенциальных противораковых лекарств in vivo. Большое разнообразие человеческих и мышиных клеточных линий, полученных как из солидных опухолей, так и лейкемий, охватывающее широкий спектр генотипов и фенотипов опухолей, было адаптировано для роста у мышиного хозяина и, таким образом, позволяет тестировать исследуемый терапевтический агент в соответствующей модели опухоли.

Подкожная модель острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), как указано в приведенном ниже протоколе, используется для проверки эффективности конъюгатов антитела CD123 лекарственного средства субъекта (ADC) для их способности снижать нагрузку опухоли in vivo. Конкретно, каждую самку SCID-мыши инокулируют подкожно в правый бок примерно с 1×10⁷ клетками MV4-11, человеческой клеточной линией ОМЛ. На 14-й день после инокуляции мышей случайным образом делят на группы по объему опухоли и обрабатывают 400 мг/кг человеческого IgG путем внутрибрюшинной инъекции для блокирования рецепторов Fc на клетках MV4-11.ADC анти-D123 антитела субъекта или нецелевые антитела контроли (связанный с chKTI-лизин-D1, chKTI-лизин D2 и huKTI-CysMab, связанный с D2, в котором антитело huKTI имеет модифицированный Cys в положении, соответствующем 5-му по последний остаток SEQ ID NO: 54) вводят внутривенно один раз, на 15-й день после инокуляции, в дозе 1 или 3 мкг/кг. Мышей снова обрабатывают 100 мг/кг человеческим IgG на 20-й день после инокуляции. Животных контролируют ежедневно, объем опухоли измеряется два раза в неделю. Группы лечения и контрольные группы перечислены ниже с соответствующими дозами.

Используемое в исследовании антитело huCD123 представляет собой гуманизированное антитело huCD123-6Gv4.7, которое связано с соединением D1 или D2 через Lys или с помощью модифицированной Cys-связи, как описано выше. Связанные с Lys химерные конъюгаты IGN на основе антител на основе KTi и конъюгаты IGN на основе Cys на основе KTi также включены как контроль. Последнее антитело KTi CysMab имеет модифицированный Cys в домене СН3 тяжелой цепи в положении, соответствующем 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54.

Предварительные данные показывают, что Lys- и Cys-связанные IGN-соединения очень активны против опухолей в in vivo мышиной модели ксенотрансплантата MV4-11 (см. Фиг. 20).

Пример 15. Получение Cys сайт-специфичных конъюгатов антитела huCD123-6 huCD123-6Gv1.1S2-CysMab-D7

huCD123-6Gv1.1S2-CysMab представляет собой гуманизированное антитело с присоединенным CDR с LCVR-последовательностями SEQ ID NO: 33 и НС последовательностью SEQ ID NO: 48 (за исключением того, что первый остаток представляет собой Ser) и включает модифицированный Cys, соответствующий 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54 или 56.

Это антитело huCD123, несущее два неспаренных остатка цистеина в восстановленном состоянии, получали с использованием стандартных процедур. К раствору этого промежуточного соединения в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) добавляли 5 мМ N,N,N',N'-этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), рН 6,0, N,N-диметилацетамид (DMA), пропиленгликоль и 10 молярных эквивалента D7 в качестве исходного раствора в DMA с получением реакционной смеси с окончательной композицией растворителя 2% об./об. DMA и 38% об./об. пропиленгликоля в PBS 5 мМ ЭДТА рН 6,0. Реакционную смесь оставляли на 24 часа при 25°С.

Конъюгат очищали в 20 мМ гистидина, 50 мМ хлорида натрия, 8,5% сахарозы, 0,01% Tween-20, 50 мкМ буфера для бисульфита натрия с рН 6,2, используя колонки обессоливания Sephadex G25, концентрировали ультрафильтрацией через мембрану с отсечкой молекулярной массы 10 кДа, и фильтровали через 0,22 мкм шприцевой фильтр. Затем конъюгат диализовали против того же буфера, используя мембрану с отсечкой молекулярной массы 10 кДа.

Было обнаружено, что конъюгат имеет 2 моль D7/моль антитела УФ-Вио; 97,2% мономера по SEC; и 1,9% неконъюгированного D7 с помощью SEC/обращенно-фазовой ВЭЖХ.LC-MS дегликозилированного конъюгата не показана.

huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5

huCD123-6Gv4.7-CysMab представляет собой гуманизированное антитело с присоединенным CDR с LCVR-последовательностями SEQ ID NO: 34 (в которой Хаа представляет собой Val) и последовательность HCVR SEQ ID NO: 35 и включающий модифицированный Cys, соответствующий 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54 или 56.

Это антитело huCD123, несущее два неспаренных остатка цистеина в восстановленном состоянии, получали с использованием стандартных процедур. К раствору этого промежуточного соединения в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) добавляли 5 мМ N,N,N',N'-этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), рН 6,0, N,N-диметилацетамид (DMA), пропиленгликоль и 10 молярных эквивалента D5 в качестве исходного раствора в DMA с получением реакционной смеси с окончательной композицией растворителя 2% об./об. DMA и 38% об./об. пропиленгликоля в PBS 5 мМ ЭДТА рН 6,0. Реакционную смесь оставляли на 24 часа при 25°С.

Было обнаружено, что конъюгат имеет 2 моль D5/моль антитела УФ-Вио и 94,8% мономера по SEC.LC-MS дегликозилированного конъюгата не показана.

huCD123-6Gv4.7-CysMab-D4

Вышеуказанное антитело huCD123, несущее два неспаренных остатка цистеина в восстановленном состоянии, получали с использованием стандартных процедур. К раствору этого промежуточного соединения в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) добавляли 5 мМ N,N,N',N'-этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), рН 6,0, N,N-диметилацетамид (DMA), пропиленгликоль и 5 молярных эквивалента D4 в качестве исходного раствора в DMA с получением реакционной смеси с окончательной композицией растворителя 2% об./об. DMA и 38% об./об. пропиленгликоля в PBS 5 мМ ЭДТА рН 6,0. Реакционную смесь оставляли на 6 часа при 25°С.

Было обнаружено, что конъюгат имеет 1,8 моль D4/моль антитела УФ-Вио и 97,4% мономера по SEC.LC-MS дегликозилированного конъюгата не показана.

Пример 16. Синтез соединения D1

Соединение 1а:

К перемешиваемому раствору (5-амино-1,3-фенилен) диметанола (1,01 г, 6,59 ммоль) в безводном диметилформамиде (16,48 мл) и безводном тетрагидрофуране (16,48 мл) добавляли 4-метил-4-(метилдисульфанил) пентановый (1,281 г, 6,59 ммоль), гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (2,53 г, 13,19 ммоль) и 4-диметиламинопиридина (0,081 г, 0,659 ммоль). Полученную смесь перемешивали в течение 18 часов при комнатной температуре. Реакцию гасили насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагировали этилацетатом (3×50 мл). Органические экстракты промывали водой и солевым раствором, затем сушили над безводным сульфатом натрия. Раствор фильтровали и концентрировали in vacuo и полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (этилацетат/гексан) с получением соединения 1а в виде белого твердого вещества (0,70 г, выход 32%). ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d6: δ 9,90 (s, 1H), 7,43 (s, 2Н), 6,93 (s, 1H), 5,16 (t, 2Н, J=5,7 Гц), 4,44 (d, 4Н, J=5,7 Гц), 2,43 (s, 3Н), 2,41-2,38 (m, 2Н), 1,92-1,88 (m, 2Н), 1,29 (s, 6H). MS (м/з), обнаружено 330,0 (М+1)⁺.

"IGN monomer, А" означает "Мономер IGN, A"

Соединение 1b:

К охлажденному (-10°C) раствору соединения 1a (219 мг, 0,665 ммоль) в безводном дихлорметане (6,65 мл) добавляли триэтиламин (463 мкл, 3,32 ммоль) с последующим добавлением по каплям метансульфонового ангидрида (298 мг, 1,662 ммоль), Смесь перемешивали при -10°С в течение 2 часов, затем смесь гасили ледяной водой и экстрагировали холодным этилацетатом (2×30 мл). Органические экстракты промывали ледяной водой, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного димезилата. Неочищенный димезилат (227 мг, 0,467 ммоль) и IGN (или индолинобензодиазепин) мономер А (303 мг, 1,028 ммоль) растворяли в безводном DMF (3,11 мл). Добавляли карбонат калия (161 мг, 1,169 ммоль) и смесь перемешивали в течение 18 часов при комнатной температуре. Добавляли деионизированную воду и полученный осадок фильтровали и промывали водой. Твердое вещество повторно растворяли в дихлорметане и промывали водой. Органический слой сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Неочищенный остаток очищали хроматографией на силикагеле (метанол/дихлорметан) с получением соединения 1b (227 мг, выход 36%). MS (м/з), обнаружено 882,5 (М+1)⁺.

К суспензии соединения 1b (227 мг, 0,167 ммоль) в безводном 1,2-дихлорэтане (3,346 мл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (37,3 мг, 0,167 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа, после чего ее гасили насыщенным раствором хлорида аммония. Смесь экстрагировали дихлорметаном и промывали солевым раствором. Органический слой сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Неочищенный остаток очищали с помощью RP-HPLC (С18, вода/ацетонитрил). Фракции, содержащие целевой продукт, экстрагировали дихлорметаном, сушили безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали с получением соединения 1с (выход 35 мг, выход 19%). MS (м/з), обнаружено 884,3 (М+1)⁺.

Соединение 1d:

К раствору соединения 1с (18 мг, 0,017 ммоль) в ацетонитриле (921 мкл) и метаноле (658 мкл) добавляли гидрохлорид трис (2-карбоксиэтил) фосфина (17,51 мг, 0,060 ммоль) (нейтрализовали насыщенным раствором бикарбоната натрия (0,2 мл) в натрий-фосфатном буфере (132 мкл, 0,75 М, рН 6,5). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 часов, затем разбавляли дихлорметаном и деионизированной водой. Органический слой отделяли, промывали солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного тиола. MS (м/з), обнаружено 838,3 (М+1)⁺.

Неочищенный тиол (15,5 мг, 0,018 ммоль) растворяли в 2-пропаноле (1,23 мл). Добавляли деионизированную воду (617 мкл) и бисульфит натрия (5,77 мг, 0,055 ммоль) и смесь перемешивали в течение пяти часов при комнатной температуре. Реакционную смесь замораживали на бане с ацетоном/сухим льдом, лиофилизировали и очищали с помощью RP-HPLC (С18, деионизированная вода/ацетонитрил). Фракции, содержащие целевой продукт, замораживали и лиофилизировали с получением соединения (12S,12aS)-9-((3-(4-меркапто-4-метилпентанамидо)-5-(((R)-8-метокси-6-оксо-11,12,12а,13-тетрагидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)бензил)окси)-8-метокси-6-оксо-11,12,12а,13-тетрагидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-12-сульфоновой кислоты (соединение сульфировано-D1 (sD1)) (6,6 мг, выход 39%). MS (м/з), обнаружено 918,2 (М+1)^-.

Пример 17. Синтез 2,5-диоксопирролидин-1-ил 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-метокси-6-оксо-11,12,12а,13-тетрагидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)-5-((((R)-8-метокси-6-оксо-12а,13-дигидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-6-оксогексаноата, соединение D2

Этап 1: (S)-2-((бензилокси)карбонил)амино)пропановую кислоту (5 г, 22,40 ммоль) и гидрохлорида(S)-трет-бутил-2-аминопропаноат (4,48 г, 24,64 ммоль) растворяли в безводном DMF (44,8 мл). Были добавлены EDC HCl (4,72 г, 24,64 ммоль), HOBt (3,43 г, 22,40 ммоль) и DIPEA (9,75 мл, 56,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и затем промывали насыщенным хлоридом аммония, насыщенным бикарбонатом натрия, водой и солевым раствором. Органический слой сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Неочищенное масло очищали хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат) с получением соединения 2а (6,7 г, выход 85%). ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,38-7,31 (m, 5Н), 6,53-6,42 (m, 1Н), 5,42-5,33 (m, 1H), 5,14 (s, 2Н), 4,48-4,41 (m, 1Н), 4,32-4,20 (m, 1H), 1,49 (s, 9Н), 1,42 (d, 3Н, J=6,8 Гц), 1,38 (d, 3Н, J=7,2 Гц).

Этап 2: Соединение 2а (6,7 г, 19,12 ммоль) растворяли в метаноле (60,7 мл) и воде (3,03 мл). Раствор продували аргоном в течение пяти минут. Медленно добавляли палладий на угле (влажный, 10%) (1,017 г, 0,956 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи в атмосфере водорода. Раствор фильтровали через Celite, промывали метанолом и концентрировали. Его подвергали азеотропной перегонке с метанолом и ацетонитрилом, и полученное масло помещали непосредственно в высокий вакуум, получая соединение 2b (4,02 г, выход 97%), которое использовали непосредственно на следующей стадии. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,78-7,63 (m, 1H), 4,49-4,42 (m, 1H), 3,55-3,50 (m, 1Н), 1,73 (s, 2H), 1,48 (s, 9H), 1,39 (d, 3H, J=7,2 Гц), 1,36 (d, 3Н, J=6,8 Гц).

Этап 3: Соединение 2b (4,02 г, 18,59 ммоль) и монометиладипат (3,03 мл, 20,45 ммоль) растворяли в безводном DMF (62,0 мл). Были добавлены EDC HCl (3,92 г, 20,45 ммоль), HOBt (2,85 г, 18,59 ммоль) и DIPEA (6,49 мл, 37,2 ммоль). Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном/метанолом (150 мл, 5:1) и промывали насыщенным хлоридом аммония, насыщенным бикарбонатом натрия и солевым раствором. Его сушили над сульфатом натрия, фильтровали и отгоняли. Соединение подвергали азеотропной перегонке с ацетонитрилом (5х), затем прокачивали в высоком вакууме при 35°С, получая соединение 2с (6,66 г, 100% выход). Неочищенный материал был взят на следующую стадию без очистки. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 6,75 (d, 1H, J=6,8 Гц), 6,44 (d, 1H, J=6,8 Гц), 4,52-4,44 (m, 1H), 4,43-4,36 (m, 1Н), 3,65 (s, 3Н), 2,35-2,29 (m, 2Н), 2,25-2,18 (m, 2Н), 1,71-1,60 (m, 4Н), 1,45 (s, 9Н), 1,36 (t, 6Н, J=6,0 Гц).

Этап 4: Соединение 2с (5,91 г, 16,5 ммоль) перемешивали в TFA (28,6 мл, 372 ммоль) и деионизированной воде (1,5 мл) при комнатной температуре в течение трех часов. Реакционную смесь концентрировали ацетонитрилом и помещали в высокий вакуум, получая сырое соединение 2d в виде липкого твердого вещества (5,88 г, 100% выход). ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,21 (d, 1H, J=6,8 Гц), 6,81 (d, 1H, J=7,6 Гц), 4,69-4,60 (m, 1H), 4,59-4,51 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 2,40-2,33 (m, 2H), 2,31-2,24 (m, 2H), 1,72-1,63 (m, 4H), 1,51-1,45 (m, 3H), 1,42-1,37 (m, 3H).

Этап 5: Соединение 2d (5,6 г, 18,52 ммоль) растворяли в безводном дихлорметане (118 мл) и безводном метаноле (58,8 мл). Были добавлены (5-амино-1,3-фенилен) диметанол (2,70 г, 17,64 ммоль) и EEDQ (8,72 г, 35,3 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляли и добавляли этилацетат. Полученную суспензию фильтровали, промывали этилацетатом и сушили в вакууме/N₂ с получением соединения 2е (2,79 г, выход 36%). ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 9,82 (s, 1Н), 8,05, (d, 1H, J=9,2 Гц), 8,01 (d, 1H, J=7,2 Гц), 7,46 (s, 2H), 6,95 (3, 1H), 5,21-5,12 (m, 2H), 4,47-4,42 (m, 4H), 4,40-4,33 (m, 1H), 4,33-4,24 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,33-2,26 (m, 2H), 2,16-2,09 (m, 2H), 1,54-1,46 (m, 4H), 1,30 (d, 3H, J=7,2 Гц), 1,22 (d, 3H, J=4,4 Гц).

Этап 6: Соединение 2е (0,52 г, 1,189 ммоль) и тетрабромид углерода (1,183 г, 3,57 ммоль) растворяли в безводном DMF (11,89 мл). Добавляли трифенилфосфин (0,935 г, 3,57 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение четырех часов. Реакционную смесь разбавляли DCM/MeOH (10:1) и промывали водой и солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Неочищенный материал очищали хроматографией на силикагеле (DCM/MeOH) с получением соединения 2f (262 мг, выход 39%). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 10,01 (s, 1H), 8,11 (d, 1H, J=6,8 Гц), 8,03 (d, 1H, J=6,8 Гц), 7,67 (s, 2H), 7,21 (s, 1H), 4,70-4,64 (m, 4H), 4,40-4,32 (m, 1H), 4,31-4,23 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,34-2,26 (m, 2H), 2,18-2,10 (m, 2H), 1,55-1,45 (m, 4H), 1,31 (d, 3H, J=7,2 Гц), 1,21 (d, 3H, J=7,2 Гц).

Этап 7: Дибромид соединение 2f и мономер соединения IGNI-1, растворяли в DMF. Добавляли карбонат калия и перемешивали при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляли воду для осаждения продукта. Суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин и затем фильтровали и сушили в вакууме/N₂ в течение 1 часа. Неочищенный материал очищали хроматографией на силикагеле (дихлорметан/метанол) с получением соединения 2g (336 мг, выход 74%). LCMS=5,91 мин (15 минутный способ). MS (м/з):990,6 (М+1)⁺.

Этап 8: Дииминовое соединение 2g растворяли в 1,2-дихлорэтан. NaBH(ОАс)₃ добавляли к реакционной смеси и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавляли CH₂Cl₂ и гасили насыщенным раствором NH₄Cl. Слои разделяли и промывали солевым раствором, сушили над Na₂SO₄ и концентрировали. Неочищенный материал очищали через RPHPLC (колонка С18, ацетонитрил/вода) с получением соединения 2h (85,5 мг, выход 25%). LCMS=6,64 мин (15 минутный способ). MS (м/з):992,6 (М+1)⁺.

Этап 9: Метиловый эфир 2 ч растворяли в 1,2-дихлорэтане. Триметилстаннанол добавляли к реакционной смеси и нагревали при 80°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли водой. Водный слой подкисляли до рН ~ 4 1 М HCl. Смесь экстрагировали CH₂Cl₂/МеОН (10:1, 3×20 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором и сушили над Na₂SO₄ и концентрировали. Неочищенный материал пропускали через силикатную пробку с получением соединения 2i (48,8 мг, выход 80%). LCMS=5,89 мин (15 минутный способ). MS (м/з):978,6 (М+1)⁺.

Этап 10: EDC HCl добавляли к перемешиваемому раствору кислотного соединения 2i и N-гидроксисукцинамидина CH₂Cl₂ при комнатной темпераиуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавляли CH₂Cl₂ и промывали водой (1×15 мл) и солевым раствором (1×15 мл). Органический слой сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали. Неочищенный материал очищали через RPHPLC (колонка С18, ацетонитрил/вода) с получением 2,5-диоксопирролидин-1-ил 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-метокси-6-оксо-11,12,12а,13-тетрагидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)-5-((((R)-8-метокси-6-оксо-12а,13-дигидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-6-оксогексаноата, соединения D2 (8,2 мг, выход 30%). LCMS=6,64 мин (15 минутный способ). MS (м/з): 1075,4 (М+1)⁺.

Пример 18. Синтез N-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил)-11-(3-((((S)-8-метокси-6-оксо-11,12,12а,13-тетрагидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)-5-((((S)-8-метокси-6-оксо-12a,13-дигидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)фенил)-13,13-диметил-2,5,8-триокса-14,15-дитиа-11-азанонадекан-19-амида, соединение D6

Этап 1: К раствору свободного тиола DGN462 (40 мг, 0,042 ммоль) и NHS 4-(2-пиридилдитио) бутаната (35 мг, чистота 80%, 0,085 ммоль) в безводном дихлорметане (0,5 мл) добавляли безводный диизопропилэтиламин (0,015 мл, 0,085 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь гасили насыщенным хлоридом аммония и разбавляли дихлорметаном. Полученную смесь отделяли в делительной воронке. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали полупрепаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка С18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением целевого эфира NHS, соединения 6а (29,7 мг, выход 60%). LCMS=9,1 мин (15 минутный способ). MS (м/з): 1157,3 (М+1)⁺.

Этап 2: К раствору эфира NHS добавляли DIPEA (0,0022 мл, 0,013 ммоль) соединение 6а (12,3 мг, 0,011 ммоль) и гидрохлорид N-(2-аминоэтил) малеимида (2,0 мг, 0,011 ммоль) в безводном дихлорметане (0,3 мл)). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, затем ее отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали полупрепаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка С18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением желаемого малеимида, соединения D6 (10 мг, выход 80%). LCMS=8,3 мин (15 минутный способ). MS (м/з):1181,8 (М+1)⁺.

Пример 19. Синтез N1-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил)-N6-((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-метокси-6-оксо-11,12,12а,13-тетрагидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)-5-((((S)-8-метокси-6-оксо-12а,13-дигидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а)индол-9-ил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)адипамида, соединение D5

Эфир NHS, соединение 5а (8,2 мг, 7,6 мкмоль) и гидрохлорид 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (2,2 мг, 0,011 ммоль) растворяли в безводном дихлорметане (305 мкл) при комнатной температуре. Добавляли DIPEA (2,66 мкл, 0,015 ммоль) и реакцию и перемешивали в течение 3,5 часов. Реакционную смесь концентрировали и очищали RPHPLC (колонка С18, CH₃CN/H₂O, градиент, от 35 до 55%). Целевые фракции продукта замораживали и лиофилизировали с получением малеимида, соединение D5 в виде твердого белого порошка (5,3 мг, выход 58%). LCMS=5,11 мин (15 минутный способ). MS (м/з):1100,6 (М+1)⁺.

Пример 20. Синтез 1-((2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил)амино)-4-((5-((3-((((S)-8-метокси-6-оксо-11,12,12а,13-тетрагидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)-5-((((S)-8-метокси-6-оксо-12а,13-дигидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)фенил)амино)-2-метил-5-оксопентан-2-ил)дисульфанил)-1-оксобутан-2-сульфоновой кислоты, соединение D4

К суспензии свободного тиола D1 (88 мг, 0,105 ммоль) и 1-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-1-оксо-4-(пиридин-2-илдисульфанил)бутан-2-сульфоновой кислоты (сульфо-SPDB) (64,0 мг, 0,158 ммоль) в безводном дихлорметане (2,10 мл) добавляли DIPEA (55,0 мкл, 0,315 ммоль) в парах азота при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 16 часов, а затем добавляли гидрохлорид 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (55,6 мг, 0,315 ммоль), безводный дихлорметан (1,0 мл) и DIPEA (0,055 мл, 0,315 ммоль). Смесь перемешивали в течение дополнительных 5 часов при комнатной температуре, после чего реакционную смесь концентрировали под in vacuo. Полученный остаток очищали с помощью RP-HPLC (С 18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержащие желаемый продукт, замораживали и лиофилизировали с получением малеимида, D4 (20 мг, выход 16%) в виде белого твердого вещества. LCMS=4,91 мин (8 минутный способ). MS (м/з):1158,6 (М+1)⁺.

Пример 21. Синтез N-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил)-11-(3-((((S)-8-метокси-6-оксо-11,12,12а,13-тетрагидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)-5-((((S)-8-метокси-6-оксо-12а,13-дигидро-6Н-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-а]индол-9-ил)окси)метил)фенил)-2,5,8-триокса-11-азапентадекан-15-амида, соединение D7

К раствору эфира NHS добавляли 7а (5 мг, 4,82 мкмоль) и гидрохлорид 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (1,7 мг, 9,64 мкмоль) в безводном дихлорметане (200 мкл) DIPEA (1,512 мкл, 8,68 мкмоль) в парах азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов и затем концентрировали in vacuo. Полученный остаток очищали с помощью RP-HPLC (С 18, CH₃CN/H₂O. Фракции, содержащие желаемый продукт, замораживали и лиофилизировали с получением малеимида, соединения D7 (3,5 мг, выход 68%). LCMS=4,61 мин (15 минутный способ). MS (м/з):1062,8 (М+1)⁺.

Пример 22. Синтез соединения D8

Этап 1: Трет-бутилгидроксикарбамат (1,490 г, 11,19 ммоль) растворяли в безводном DMF (22,38 мл). Добавляли 2-(3-бромпропил) изоиндолин-1,3-дион (3 г, 11,19 ммоль) и карбонат калия (3,09 г, 22,38 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Его разбавляли холодной водой и экстрагировали EtOAc. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над сульфатом натрия и неочищенный остаток очищали флеш-хроматографией на силикагеле (EtOAc/Hex, градиент от 0 до 45%), получая соединение 8а в виде липкого твердого вещества (2,41 г, выход 67%). LCMS=4,99 мин (8 минутный способ). ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,86-7,83 (m, 2Н), 7,73-7,77 (m, 2Н), 7,28 (bs, 1H), 3,92 (t, 2Н, J=6,0 Гц), 3,82 (t, 2Н, 6,9 Гц), 2,05-1,98 (m, 2Н),1,47 (s, 9Н).

Этап 2: Соединение 8а (2,41 г, 7,52 ммоль) растворяли в безводном DCM (18,81 мл) и охлаждали до 0°С на ледяной бане. Добавляли свежеперемешанный раствор DCM (9,40 мл) и TFA (9,40 мл) и удаляли ледяную баню. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и разбавляли DCM и промывали насыщенным бикарбонатом натрия. Органический слой промывали солевым раствором, сушили, фильтровали и концентрировали с получением соединения 8b (1,32 г, выход 80%). Неочищенный материал использовали без дополнительной очистки. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,85-7,82 (m, 2Н), 7,72-7,69 (m, 2Н), 3,78 (t, 2Н, J=7,0 Гц), 3,72 (t, 2Н, 6,0 Гц), 1,99-1,93 (м, 2Н).

Этап 3: Соединение 8b (100 мг, 0,454 ммоль) растворяли в безводном DCM (4,5 мл) ТЭА (127 мкл, 0,908 ммоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил(2-(триметилсилил)этил)карбонате (177 мг, 0,681 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли DCM, промывали солевым раствором, сушили, фильтровали и выпаривали. Неочищенный остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле (EtOAc/Hex, градиент, от 0% до 40%) с получением соединения 8с (148 мг, выход 89%). LCMS=5,91 мин (8 минутный способ). ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 7,86-7,83 (m, 2Н), 7,73-7,69 (m, 2Н), 7,39 (bs, 1H), 4,26-4,20 (m, 2Н), 3,94 (t, 2Н, J=6,0 Гц), 3,83 (t, 2Н, 6,9 Гц), 2,06-1,98 (m, 2Н), 1,05-0,98 (m, 2Н), 0,04 (s, 9Н).

Этап 4: Соединение 8с (148 мг, 0,406 ммоль) растворяли в этаноле (2,7 мл) и перемешивали до полного растворения. Добавляли гидразин (63,7 мкл, 2,030 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до быстрого образования белого осадка в течение 1 часа. Реакционную смесь фильтровали через целит и промывали дополнительным этанолом. Фильтрат выпаривали и очищали флеш-хроматографией на силикагеле (А=МеОН, В=EtOAc-градиент, от 100% до 10%). Фракции продукта определяли по массе и выпаривали с получением соединения 8d в виде липкого твердого вещества (67,5 мг, выход 71%). ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 4,27-4,21 (m, 2Н), 3,98 (t, 2Н, J=5,9 Гц), 2,92-2,87 (m, 2Н), 1,85-1,77 (m, 2Н), 1,06-0,99 (m, 2Н), 0,04 (s, 9Н).

Этап 5: Соединение 2i (30 мг, 0,031 ммоль), описанное выше в примере 17, суспендировали в безводном DCM (613 мкл). Безводный DMF добавляли по каплям до тех пор, пока раствор не очистился. Добавляли соединение 8d (21,57 мг, 0,092 ммоль), EDC HCl (29,4 мг, 0,153 ммоль) и DMAP (0,749 мг, 6,13 мкмоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Его разбавляли DCM/MeOH 10:1 и затем промывали водой. Водный слой экстрагировали DCM/MeOH 10:1 и объединенную органическую среду сушили и концентрировали с получением соединения 8е (49 мг), которое использовали без дополнительной очистки. LCMS=5,94 мин (8 минутный способ). MS (м/з):1194,4 (М+1)⁺.

Этап 6: Соединение 8е (49 мг, 0,041 ммоль) растворяли в THF (820 мкл) и реакционную смесь охлаждали до 0°С на ледяной бане. Добавляли TBAF (205 мкл, 0,205 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 15 минут до удаления ледяной бани. Его перемешивали при комнатной температуре до завершения. Реакционную смесь охлаждали до 0°С, гасили насыщенным хлоридом аммония и экстрагировали DCM/MeOH 10:1. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над сульфатом натрия и выпаривали. Неочищенный материал очищали через RPHPLC (колонка С18, ацетонитрил/вода) с получением соединения D8 (17,6 мг, выход 54% в течение 2 стадий). LCMS=5,1 мин (8 минутный способ). MS (м/з):1050,4(М+1)⁺.

Пример 23. Синтез соединения D9

Этап 1: Соединение 9а (17 мг, 0,016 ммоль) растворяли в DCM (328 мкл). Соединение 8d (5,76 мг, 0,025 ммоль) и DIPEA (5,71 мкл, 0,033 ммоль) добавляли при комнатной температуре и реакционную смесь перемешивали до завершения. Его разбавляли 10:1 DCM:МеОН и промывали солевым раствором. Органический слой сушат и концентрируют, получая соединение 9b, которое использовали непосредственно. Этап 2: Соединение D9 получали аналогично соединению D8 в примере 23. Неочищенный материал очищали через RPHPLC (колонка С18, ацетонитрил/вода) с получением соединения D9 (5 мг, выход 31% в течение 2 стадий). LCMS=5,68 мин (8 минутный способ). MS (м/з): 1012,5 (М+1)⁺.

Пример 24. in vivo эффективность huCD123-CysMab-D5 в распространенной модели Kasumi-3-Luc-mCh-Puro

Чтобы проверить эффективность huCD123-CysMab-D5 способности уменьшать распространенную опухолевую нагрузку in vivo, модель рассеянной опухоли, экспрессирующая люциферазу, использовалась в сочетании с визуализацией живого животного, как описано в протоколе ниже.

Самкам мышей NSG (Jackson Labs) вводили внутривенно (IV) в хвостовую вену с клетками 5×10⁶ с Kasumi-3-Luc-mCh-Puro, линию клеток ОМЛ человека, модифицированную для экспрессии люциферазы и mCherry (в Molecular Imaging, Ann Arbor, МI). Экспрессия люциферазы клетками Kasumi-3 позволяет количественно определить опухолевую нагрузку с использованием живого животного, который детектирует сигнал биолюминесценции, продуцируемый люциферазой, при воздействии in vivo на инъецированный субстрат люциферазы D-люциферин. На 6-й день после инокуляции мыши были визуализированы и рандомизированы в исследовательские группы на основе биолюминесцентной визуализации (BLI). B течение 24 ч перед каждым введением конъюгата мышам вводили внутрибрюшинно (IP) 400 мг/кг нецелевого антитела chKTI, чтобы блокировать рецепторы Fc на клетках ОМЛ Kasumi-3, предотвращая неспецифический захват конъюгата. На 7-й и 41-й день после инокуляции Kasumi-3 мыши получали одиночные IV инъекции в латеральной хвостовой вене любого транспортного средства, 10 мкг/кг (по D5, 0,80 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 3 мкг/кг (по D5, 0,240 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5 или 10 мкг/кг нецелевого контрольного конъюгата KTI-CysMab-D5. B течение 5 и 10 дней после введения конъюгата мыши получали IP-инъекцию 100 мг/кг нецелевого антитела chKTI для обеспечения непрерывной блокировки Fc-рецепторов на опухолевых клетках ОМЛ.

Мышей визуализировали в дни 11, 13, 17, 20, 24, 27, 31, 38, 41, 45, 52, 59, 66, 73 и 80 после инокуляции Kasumi-3. Визуализацию in vivo биолюминесценции проводили при Molecular Imaging (Ann Arbor, MI) с использованием оптической визуализации IVIS 50 (Xenogen, Alameda, CA). Животных визуализировали три раза при 1-2% изофлурановой газовой анестезии. Каждой мыши вводили IP 150 мг/кг D-люциферина (субстрат люциферазы) и визуализировали в положении лежа, а затем на спине, через 10 минут после инъекции. Использовалась крупная и мелкая сортировка ПЗС-матрицы, и время экспозиции было отрегулировано (от 2 секунд до 2 минут), чтобы получить по меньшей мере несколько сотен показателей от опухолей, которые наблюдаются у каждой мыши на визуализации, и во избежание насыщения ПЗС чип. Изображения анализировали с использованием Matlab R2015a. Пользовательский скрипт размещал ROI с фиксированным объемом всего тела на прональных и супинальных изображениях для каждого отдельного животного и маркировался на основе идентификации животных. Общий поток (фотоны/сек) был рассчитан и экспортирован для всех ROI, чтобы облегчить анализ между группами. Прональные и супинальные ROI были суммированы вместе, чтобы оценить опухолевую нагрузку всего тела.

% Т/С рассчитывали следующим образом=[(Т, средний BLI обработанной группы)/(С, средний BLI контрольной группы)]×100%. Согласно стандартам NCI, Т/С≤42% является минимальным уровнем противоопухолевой активности, тогда как значение Т/С>42% неактивно, а значение Т/С<10% считается высокоактивным.

% Задержка опухолевой массы (% TBD) рассчитывалась следующим образом: % TBD=(ТС)/С×100%, где ТС, где Т - время (в днях) для обработанной группы, а С - время (в днях) для контрольной группы, для достижения обозначенного BLI-сигнала. Адаптируя те же показатели, что и для % ILS, мы считаем % TBD>25 минимально активным, % TBD>40 активным, а % TBD>50 - очень активным.

Мышей взвешивали два раза в неделю и контролировали клинические признаки на протяжении всего исследования. Любые мыши, достигшие критериев эвтаназии, подвергались эвтаназии. Спонтанные смерти регистрировались по мере их обнаружения. Исследование было закончено на 115-й день после инокуляции опухоли.

Предварительные эксперименты показывают, что лечение любой дозой huCD123-CysMab-D5 приводило к первоначальной регрессии опухолевой нагрузки с течением времени, достигая самого низкого уровня на 27-й день, тогда как опухолевая нагрузка постоянно возрастала в группах, обработанных наполнителем и KTI-CysMab-D5 в этот период времени. См., например, Фиг. 22. Ингибирование роста опухоли (значение Т/С), рассчитанное для этих предварительных экспериментов, показало, что 10 мкг/кг и 3 мкг/кг huCD123-CysMab-D5 являются высокоактивными на 27-й день с величинами % Т/С 0,20 и 0,25, соответственно. Была также рассчитана сумма % задержки опухолевой массы (% TBD) с использованием сигнала BLI на 45-й день обработанной носителем группы в качестве обозначенного BLI. Согласно этой метрике обе дозы huCD123-CysMab-D5 являются высокоактивными, в результате чего % TBD составляет >75% (10 мкг/кг huCD123-CysMab-D5) и >65% (3 мкг/кг huCD123-CysMab-D5), в отличие от 0% TBD, наблюдаемого с помощью 10 мкг/кг контрольного конъюгата KTI-CysMab-D5. Кроме того, лечение huCD123-CysMab-D5 при дозах 3 мкг/кг и 10 мкг/кг увеличивало выживаемость у 6/6 мышей с мутантным Р53 и множественным лекарственным сопротивлением ОМЛ по сравнению с контролем (см. Фиг. 23).

Выживание каждой из четырех исследовательских групп в конце исследования представлено на фиг. 31 и приводится в таблице ниже. Мыши, обработанные наполнителем, имели среднюю выживаемость 70 дней. Напротив, мыши, обработанные 10 мкг/кг (с помощью D5, 0,80 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, имели среднюю выживаемость 115 дней, в результате чего получали 64% ILS (высокоактивный). Аналогично, мыши, обработанные 3 мкг/кг (по D5, 0,240 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, имели среднее время выживания 105 дней, в результате чего 50% ILS (высокоактивный). Мыши, обработанные 10 мкг/кг (по D5) нецелевого контрольного конъюгата huKTI-CysMab-D5, имели среднюю выживаемость 65,5 дней, что вызывало 0% ILS (неактивное), что указывало на высокую активность, полученную с помощью huCD123-CysMab-D5, которая является CD 123-зависимой.

При N=6 средняя выживаемость (дни) является средним числом дней, когда 3-я и 4-я мыши погибают. Используя средние значения выживаемости, % ILS (Увеличение срока жизни) рассчитывается как: % ILS=(ТС)/С×100%, где Т - средняя выживаемость (в днях) обработанной группы, а С - средняя выживаемость (в днях) контрольной группы. Стандартами NCI для распространенных моделей являются: ILS≥25% минимально активна, ILS>40% активна, a ILS≥50% является очень активным.

Пример 25. Конъюгат huCD123-CysMab-D5 индуцирует повреждение ДНК, приводящее к задержке клеточного цикла в S-фазе и опосредованной апоптозом клеточной гибели клеток MV4-11

Для оценки механизма опосредованной huCD123-CysMab-D5 клеточной гибели СD123-экспрессирующие клетки MV4-11 AML обрабатывали 10 нМ huCD123-CysMab-D5 в течение одного часа с последующей дополнительной инкубацией в культуре среды без конъюгата в течение 48 часов при 37°С. В качестве контроля использовали необработанные клетки MV4-11. Клетки собирали и окрашивали различными реагентами, чтобы количественно определить количество клеток на разных стадиях клеточного цикла (пропидиум иодид), клетки с повреждением ДНК (рН2АХ), апоптоз (Annexin-V и расщепленный Caspase-3) и перфорированную плазматическую мембрану (TO-PRO-3). Как продемонстрировано на фиг. 24, инкубация клеток MV4-11 с huCD123-CysMab-D5 приводит к повреждению ДНК, остановке клеточного цикла в S-фазе и опосредованной апоптозом клеточной гибели.

Пример 26. Эффективность in vivo huCD123-CysMab-D5 в распространенной модели Molm-13

Сбор и анализ данных для всех распространенных моделей: Мышей взвешивали два раза в неделю и контролировали клинические признаки на протяжении всего исследования. Конечная точка измерений - выживание. Животные были подвергнуты эвтаназии при наличии паралича задней ноги, масса тела уменьшилась на >20% от веса предварительной обработки, появилась видимая опухоль или были видны какие-либо признаки нарушения. Спонтанные смерти регистрировались, когда они были обнаружены. Для распространенных моделей задержка роста опухоли рассчитывается как ТС, где Т - среднее время жизни (в днях) обработанной группы, а С - среднее время жизни (в днях) контрольной группы с использованием наполнителя. Процент увеличенного жизненного цикла (% ILS) для распространенных моделей рассчитывается по следующей формуле: %ILS=(Т-С)/С×100%. Противоопухолевую активность оценивали по стандартам NCI для распространенных моделей: ILS≥25% является минимальным активным, ILS>40% активен, a ILS≥50% является очень активным.

Чтобы проверить эффективность huCD123-CysMab-D5 способности уменьшать опухолевую нагрузку in vivo использовали модель рассеянной опухоли, как описано в протоколе ниже.

Самкам бестимусных голых мышей вводили внутривенно в латеральную хвостовую вену 10×10⁶ клеток Molm-13, линию клеток ОМЛ человека, в 100 мкл среды без сыворотки. На 7-й день после инокуляции мышей рандомизировали в исследуемые группы. Через 24 часа перед введением конъюгата мышам вводили внутрибрюшинно 400 мг/кг нецелевого антитела chKTI, чтобы блокировать рецепторы Fc на клетках ОМЛ Molm-13, предотвращая неспецифический захват конъюгата. На 7-й день после введения Molm-13 мышам вводили единичную внутривенную инъекцию в боковую хвостовую вену наполнитель, 0,1 мкг/кг (по D5, 0,008 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 0,3 мкг/кг (по D5 0,024 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 1 мкг/кг (по D5, 0,08 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 1 мкг/кг (по D5, 0,08 мг/huKTI) huKTI-CysMab-D5, 0,1 мкг/кг (по D2, 0,0059 мг/кг по huCD123) huCD123-лизин-связанного-D2, 0,3 мкг/кг (по D2 0,018 мг/кг по huCD123) huCD123-лизин связанного-D2, 1 мкг/кг (по D2, 0,059 мг/кг по huCD123) huCD123-лизин-связанного-D2 или 1 мкг/кг (по D2, 0,059 мг/кг с помощью chKTI) chKTI-лизин связанного-D2 контрольного конъюгата. На 4-й и 9-й дни после введения конъюгата мышам вводили внутрибрюшинные инъекции 100 мг/кг нецелевого антитела chKTI для обеспечения непрерывной блокировки рецепторов Fc на опухолевых клетках ОМЛ. Результаты суммированы в таблице ниже и на фиг. 25.

Конъюгат huCD123-CysMab-D5 был очень активен во всех трех протестированных дозах, каждая из которых опосредовала % ILS>262,5 дней. Напротив, доза 1 мкг/кг (по D5) нецелевого контрольного конъюгата huKTI-CysMab-D5 была неактивной, опосредуя 0% ILS. Это демонстрирует CD123-зависимую активность huCD123-CysMab-D5. Аналогично, huCD123-лизин-связанный-D2 был очень активен во всех трех проверенных дозах, каждая из которых опосредовала % ILS>59. Тем не менее, доза 1 мкг/кг (по D2) нецелевого контрольного конъюгата, кодирующего chKTI-лизин-D2, также неактивна, опосредовала 11% ILS, демонстрируя CD123-зависимую активность huCD123-лизин связанного-D2. Одно очевидное различие между huCD123-CysMab-D5 и huCD123-лизин связанным-D2, можно увидеть при сравнении % ILS, полученной с дозой 0,1 мкг/кг, самой низкой дозой, каждого конъюгата, нацеленного на CD 123. % ILS, полученное с помощью 0,1 мкг/кг huCD123-CysMab-D5, составляло 262,5 дней, тогда как полученная с дозой huCD 123-лизин-связанного D2 с дозой 0,1 мкг/кг составляла 59 дней, указывая на превосходство huCD123-CysMab-D5 в этой модели.

Пример 27. Эффективность in vivo huCD123-CysMab-DS в подкожных моделях EOL-1

Сбор и анализ данных для всех подкожных моделей: Мышей взвешивали два раза в неделю и контролировали клинические признаки на протяжении всего исследования. Животные были подвергнуты эвтаназии, когда присутствовал паралич задней ноги, масса тела уменьшилась на >20% от веса предварительной обработки, возникала язва опухоли или когда были видны какие-либо признаки нарушения. Объемы опухолей измерялись один-два раза в неделю в трех измерениях с помощью калипера. Объем опухоли выражали в мм³, используя формулу V=Длина×Ширина×Высота× (Tomayko and Reynolds, Cancer Chemother. Pharmacol. 24:148-54 (1989)). Активность оценивали как описано в Bissery et al., Cancer Res. 51:4845-52 (1991). Ингибирование роста опухоли (значение Т/С) также оценивали по следующей формуле: Т/С (%)=(средний объем опухоли обработанной/средний объем опухоли контрольной группы)×100%. Объем опухоли определяли одновременно для обработанных групп (Т) и групп контроля наполнителем (С), когда объем опухоли при использовании наполнителя достиг определенного размера (Bissery et al., Cancer Res. 51:4845-52 (1991). Определяли суточный средний объем опухоли каждой обработанной группы, включая мышей без опухолей (0 мм³). Согласно стандартам NCI, Т/С≤42% является минимальным уровнем противоопухолевой активности. АТ/С<10% считается высоким уровнем противоопухолевой активности.

Чтобы проверить эффективность huCD123-CysMab-D5 способности уменьшать опухолевую нагрузку in vivo, было использовано три модели исследования подкожной опухоли, как описано в приведенных ниже протоколах.

В первом исследовании самок бестимусных голых мышей каждую инокулировали с 10×10⁶ клеток EOL-1, линии клеток ОМЛ человека, в 100 мкл свободной от сыворотки среды/матригеля подкожно в правый бок. На 6-й день после инокуляции EOL-1 мыши были рандомизированы в исследуемые группы. Через 24 ч перед введением конъюгата мышам вводили внутрибрюшинно 400 мг/кг нецелевого антитела chKTI для блокирования рецепторов Fc на клетках ОМЛ EOL-1, предотвращая неспецифический захват конъюгата. На 7-й день после инокуляции после EOL-1 мышам вводили единичную внутривенную инъекцию в боковую хвостовую вену, 1 мкг/кг (по D5, 0,08 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 3 мкг/кг (по D5, 0,24 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 1 мкг/кг (по D2 0,050 мг/кг по huCD123) huCD123-лизинсвязанное D2, 3 мкг/кг (по D2, 0,151 мг/кг по huCD123) huCD123-лизин-связанное-D2, 1 мкг/кг (по D5, 0,08 мг/кг по huKTI) huKTI-CysMab-D5 контрольный конъюгат, 3 мкг/кг (по D5, 0,24 мг/кг по huKTI) контрольный конъюгат huKTI-CysMab-D5, 1 мкг/кг (по D2, 0,050 мг/кг по chKTI) chKTI-лизин-связанный-D2 или 3 мкг/кг (по D2, 0,151 мг/кг по chKTI) chKTI-лизинсвязанный-D2-конъюгат. На 4-й и 9-й дни после введения конъюгата мышам вводили внутрибрюшинную инъекцию 100 мг/кг нецелевого антитела chKTI для обеспечения непрерывной блокировки Fc-рецепторов на опухолевых клетках ОМЛ. Результаты представлены в таблице ниже и на фиг. 26.

1 мкг/кг (по D5) и дозы 3 мкг/кг huCD123-CysMab-D5 были активными и высокоактивными, соответственно, опосредуя 13% (3/6 CRs) и 2% Т/С (5/6 CRs), соответственно. Напротив, 1 мкг/кг (по D5) и дозе 3 мкг/кг бесцелевого контрольного конъюгата huKTI-CysMab-D5 были неактивными, причем % Т/С≥73, что свидетельствует о том, что активность huCD123-CysMab-D5 была CD 123-зависимой. 1 мкг/кг (по D2) и доз 3 мкг/кг huCD123-лизин-связанного-D2, были активными и высокоактивными, соответственно, опосредуя 30% (1/6 CRs) и 1% (6/6 CRs), соответственно. Напротив, дозы 1 мкг/кг (по D2) и 3 мкг/кг нецелевого контрольного конъюгата, chKTI-лизин связанного-D2, были неактивными, опосредуя 75% Т/С (0/6 CR) и 81% Т/С (0/6 CR), соответственно. Это свидетельствует о том, что активность huCD123-лизин-связанного-D2, была CD123-зависимой. Различие между двумя конъюгатами CD 123-нацеливания становится очевидным при сравнении 1 мкг/кг (по D5) huCD123-CysMab-D5 с 1 мкг/кг (по D2) huCD123-лизин-связанного-D2, в том, что первое приводит к 13% Т/С и 3/6 CR, а последний - 30% Т/С и только 1/6 CR, демонстрируя очевидное превосходство huCD123-CysMab-D5 в этой модели.

Во втором исследовании самок бестимусных голых мышей каждую инокулировали с 10×10⁶ клеток EOL-1, линии клеток ОМЛ человека, в 100 мкл свободной от сыворотки среды/матригеля подкожно в правый бок. На 6-й день после инокуляции EOL-1 мыши были рандомизированы в исследуемые группы. Через 24 ч перед введением конъюгата мышам вводили внутрибрюшинно 400 мг/кг нецелевого антитела chKTI для блокирования рецепторов Fc на клетках ОМЛ EOL-1, предотвращая неспецифический захват конъюгата. На 7-й день после инокуляции EOL-1 мышам вводили единичную внутривенную инъекцию в латеральной хвостовой вене, 0,5 мкг/кг (по D5, 0,04 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5 или 1 мкг/кг (по D5, 0,08 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5. Ha 4-й и 9-й дни после введения конъюгата мышам вводили внутрибрюшинную инъекцию 100 мг/кг нецелевого антитела chKTI для обеспечения непрерывной блокировки Fc-рецепторов на опухолевых клетках ОМЛ. Результаты представлены в таблице ниже и на фиг. 27.

Доза huCD123-CysMab-D5 составляла 0,5 мкг/кг (по D5), опосредуя 11% Т/С и 3/6 CR. Аналогично, 1 мкг/кг доза huCD123-CysMab-D5 была очень активной, опосредуя 3% Т/С и 6/6 CR.

В третьем исследовании самок бестимусных голых мышей каждую инокулировали 10×10⁶ клеток EOL-1, линии клеток ОМЛ человека, в 100 мкл свободной от сыворотки среды/матригеля подкожно в правый бок. На 6-й день после инокуляции EOL-1 мыши были рандомизированы в исследуемые группы. Через 24 ч перед введением конъюгата мышам вводили внутрибрюшинно 400 мг/кг нецелевого антитела chKTI для блокирования рецепторов Fc на клетках ОМЛ EOL-1, предотвращая неспецифический захват конъюгата. На 7-й день после инокуляции EOL-1 мышам вводили единичную внутривенную инъекцию в боковую хвостовую вену носителя 3 мкг/кг (по D5, 0,24 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 3 мкг/кг (по D5) FGN849 (свободная лекарственная форма полезной нагрузки), 0,24 мг/кг неконъюгированного (голого) huCD123 антитела или 3 мкг/кг (по D5, 0,24 мг/кг по huKTI) huKTI-CysMab-D5 контрольный конъюгат. Мышам, получавшим Цитарабин, вводили единичную внутрибрюшинную инъекцию на 7, 8, 9, 10 и 11 после EOL-1 инокуляции, а мышам, получавшим азацитидин, вводили единичную внутрибрюшинную инъекцию на 7, 10, 13, 16 и 19 после инокуляции EOL-1. На 4-й и 9-й дни после введения конъюгата мышам вводили внутрибрюшинную инъекцию 100 мг/кг нецелевого антитела chKTI для обеспечения непрерывной блокировки Fc-рецепторов на опухолевых клетках ОМЛ. Результаты представлены в таблице ниже и на фиг. 28.

Из всех испытуемых составляющих только 3 мкг/кг (по D5) доза huCD123-CysMab-D5 демонстрировала активность, опосредуя высокоактивные 1% Т/С и 8/8 CR, в отличие от 3 мкг/кг (по D5) дозы контрольного конъюгата huKTI-CysMab-D5, который опосредовал 69% Т/С и 0/8 CR. Доза 3 мкг/кг (по D5) неконъюгированного свободного лекарственного средства, FGN849, также была неактивной, с 92% Т/С и 0/8 CR. Аналогично, доза неконъюгированного («голого») huCD123 антитела до 0,24 мг/кг, согласующая дозу антитела huCD123-CysMab-D5, была неактивной, с 60% Т/С и 0/8 CR. Цитарабин, вводимый в дозе 75 мг/кг ежедневно в течение 5 дней, был неактивным, с 84% Т/С и 0/8 CR. Азацитидин, вводимый в дозе 3,75 мг/кг один раз в три дня в течение 5 доз, был неактивным, с 59% Т/С и 0/8 CR.

Пример 28. In vivo Эффективность huCD123-CysMab-D5 и huCD123-SeriMab-sD1 в распространенной модели MV4-11

Чтобы проверить эффективность huCD123-CysMab-D5 и huCD123-SeriMab-sD1 способности уменьшать опухолевую нагрузку in vivo, использовалась модель рассеянной опухоли, как описано в протоколе ниже.

Самцов мышей NOD SCID предварительно обрабатывали циклофосфамидом 150 мг/кг для частичного удаления костного мозга, чтобы улучшить приживление клеток MV4-11. Циклофосфамид (Baxter, Lot # 4Е011, Exp 05.2017) восстанавливали 0,9% NaCl и вводили внутрибрюшинно мышам на день - 3 и день - 2 до инокуляции клеток MV4-11 в день 0. После обработки циклофосфамидом, как описано выше, каждой мыши вводили внутривенно в латеральную хвостовую вену 3×10⁶ клеток MV4-11, линию клеток ОМЛ человека, в 100 мкл среды, свободной от сыворотки. На 7-й день после инокуляции MV4-11 мыши были рандомизированы в исследуемые группы. Через 24 ч перед введением конъюгата мышам вводили внутрибрюшинно 400 мг/кг нецелевого антитела chKTI для блокирования рецепторов Fc на клетках ОМЛ MV4-11, предотвращая неспецифический захват конъюгата. На 7-й день после инокуляции после MV4-11 мыши получали однократную внутривенную инъекцию в боковую хвостовую вену, 1 мкг/кг (по D5, 0,08 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 3 мкг/кг (по D5, 0,24 мг/кг huCD123) huCD123-CysMab-D5, 1 мкг/кг (по D1, 0,054 мг/кг по huCD123) huCD123-SeriMab-sD1, 3 мкг/кг (по D1, 0,163 мг/кг huCD123) huCD123-SeriMab-sD1, 1 мкг/кг (по D5, 0,08 мг/кг по huKTI) Конъюгат huKTI-CysMab-D5, 3 мкг/кг (по D5, 0,24 мг/кг по huKTI) huKTI - Контрольный конъюгат CysMab-D5, 1 мкг/кг (по D1, 0,07 мг/кг с помощью chKTI) контрольный конъюгат chKTI-SeriMab-sD1 или 3 мкг/кг (по D1, 0,21 мг/кг с помощью chKTI) chKTI-SeriMab-sD1 контрольный конъюгат. Результаты суммированы в таблице ниже и на фиг. 29.

Как дозы 1 мкг/кг, так и дозы 3 мкг/кг (по D5) huCD123-CysMab-D5 были высокоактивными, каждая из которых опосредовала % ILS≥70. Напротив, доза 1 мкг/кг (по D5) нецелевого контрольного конъюгата huKTI-CysMab-D5 была минимально активной, опосредуя 28% ILS. Доза huKTI-CysMab-D5 3 мкг/кг была неактивной, с 0% ILS, демонстрируя CD123-зависимую активность huCD123-CysMab-D5. Дозы 1 мкг/кг и 3 мкг/кг (по sD1) huCD123-SeriMab-sD1 были очень активными, каждая из которых опосредовал % ILS>101. Однако, когда исследовалась активность нецелевых контрольных конъюгатов chKTI-SeriMab-sD1, высокая степень неспецифической активности, не связанной с CD123, очевидна из дозы 3 мкг/кг (по sD1), которая опосредует 65% ILS (очень активный).Это указывает на то, что высокая активность 3 мкг/кг (по sD1) дозы CD123-нацеливания huCD123-SeriMab-sD1, скорее всего, обусловлена неспецифическими механизмами захвата лекарств, которые не связаны с нацеливанием CD123. Напротив, доза контрольного конъюгата chKTI-SeriMab-sD1 1 мкг/кг (по sD1) неактивна, при этом % ILS составляет 15, что свидетельствует о том, что неспецифическая активность дозы μKTI-SeriMab-sD1 3 мкг/кг зависит от дозы и что высокая активность дозы 1 мкг/кг (по sD1) huCD123-SeriMab-sD1 действительно зависит от CD123.

Пример 29. Эффективность in vivo huCD123-CysMab-D5 и huCD123-SeriMab-sD1 в подкожной модели MV4-11

Чтобы проверить эффективность huCD123-CysMab-D5 и huCD123-SeriMab-sD1 способности уменьшать опухолевую нагрузку in vivo, использовалась модель подкожной опухоли, как описано в протоколе ниже.

Самкам мышей СВ.17 SCID каждой инокулировали 10×10⁶ клеток MV4-11, линии клеток ОМЛ человека, в 100 мкл свободной от сыворотки среды/матригеля подкожно в правый бок. На 14-й день после инокуляции MV4-11 мыши были рандомизированы в исследуемые группы. Через 24 ч перед введением конъюгата мышам вводили внутрибрюшинно 400 мг/кг нецелевого антитела chKTI для блокирования рецепторов Fc на клетках ОМЛ MV4-11, предотвращая неспецифический захват конъюгата. На 15-й день после инокуляции MV4-11 мыши получали одну внутривенную инъекцию в боковую хвостовую вену, 0,3 мкг/кг (по D1 0,016 мг/кг по huCD123) huCD123-SeriMab-sD1, 1 мкг/кг (по D1, 0,054 мг/кг по huCD123) huCD123-SeriMab-sD1, 3 мкг/кг (по D1, 0,16 мг/кг по huCD123) huCD123-SeriMab-sD1, 0,3 мкг/кг (по D5, 0,024 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 1 мкг/кг (по D5, 0,08 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 3 мкг/кг (по D5, 0,24 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 0,3 мкг/кг (по D1, 0,021 мг/кг с помощью chKTI) контрольный конъюгат chKTI-SeriMab-sD1, 1 мкг/кг (по D1, 0,07 мг/кг по chKTI) контрольный конъюгат chKTI-SeriMab-sD1, 3 мкг/кг (по D1, 0,21 мг/кг по chKTI) контрольный конъюгат chKTI-SeriMab-sD1, 0,3 мкг/кг (по D5 0,024 мг/кг по huKTI) конъюгат huKTI-CysMab-D5, 1 мкг/кг (D5, 0,08 мг/кг с помощью huKTI). Конъюгат huKTI-CysMab-D5 или 3 мкг/кг (по D5, 0,24 мг/кг с помощью huKTI) контрольный конъюгат huKTI-CysMab-D5. Ha 20-й день после инокуляции MV4-11 мышам вводили внутрибрюшинно 100 мг/кг нецелевого антитела chKTI для обеспечения непрерывной блокировки Fc-рецепторов на опухолевых клетках ОМЛ. Результаты представлены в таблице ниже и на фиг. 30.

Дозы 1 мкг/кг и 3 мкг/кг (по sD1) huCD123-SeriMab-sD1 были очень активными, каждая из которых опосредовала % Т/С 0 и 6/6 CR. Самая низкая тестируемая доза huCD123-SeriMab-sD1, 0,3 мкг/кг (по sD1) была неактивной, с % Т/С 43 и 0/6 CR. Однако, когда исследовали активность нецелевых контрольных конъюгатов chKTI-SeriMab-sD1, высокая степень неспецифической активности, не связанной с CD 123, очевидна из дозы 3 мкг/кг (по sD1), которая опосредует 6% Т/С (высокоактивные) и 3/6 CR. Это указывает на то, что высокая активность 3 мкг/кг (по sD1) дозы CD 123-нацеливания huCD123-SeriMab-sD1, скорее всего, обусловлена неспецифическими механизмами захвата лекарств, которые не связаны с нацеливанием CD123. В противоположность этому, как 1 мкг/кг (по sD1), так и 0,3 мкг/кг дозы контрольного конъюгата chKTI-SeriMab-sD1 были неактивными, опосредуя 73% Т/С и 83% Т/С, соответственно, демонстрируя, что высокая неспецифическая активность дозы 3 мкг/кг (по sD1) chKTI-SeriMab-sD1 зависит от дозы и что высокая активность дозы 1 мкг/кг (по sD1) huCD123-SeriMab-sD1 действительно является CD123-зависимой.

Дозы 1 мкг/кг и 3 мкг/кг (по D5) huCD123-CysMab-D5 были очень активными, каждая из которых опосредовала 0% Т/С и 5/6 и 6/6 CR соответственно. Доза huCD123-CysMab-D5, 0,3 мкг/кг (по D5), самая низкая доза, была неактивной, с 69% Т/С и 0/6 CR. Напротив, все три дозы (по D5) нецелевого контрольного конъюгата huKTI-CysMab-D5 были неактивными, каждая из которых опосредовала ≥43% Т/С и 0/6 CR; демонстрируя CD123-зависимую активность huCD123-CysMab-D5.

Пример 30. In Vivo переносимость конъюгатов huCD123-IGN у мышей

Чтобы проверить переносимость huCD123-CysMab-D5 и других конъюгатов huCD123-IGN in vivo, использовали мышиную модель, как описано в протоколе ниже.

Самки мышей CD-1 получали одну внутривенную инъекцию в боковую хвостовую вену наполнителя, 150 мкг/кг (по D5, 12 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 125 мкг/кг (по D5, 10 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 100 мкг/кг (по D5, 8 мг/кг по huCD123) huCD123-CysMab-D5, 150 мкг/кг (по sD1, 14,3 мг/кг по huCD123) huCD123-SeriMab-sD1 или 125 мкг/кг (по sD1, 11,9 по huCD123) huCD123-SeriMab-sD1. Антитело huCD123 не перекрестно реагирует с CD123 мыши, что делает эту мышиную модель in vivo индикатором токсичности, не связанной с мишенью. Мышей наблюдали ежедневно в течение 33 дней, и определяли массу тела. Если животное испытало более 20% потери массы тела или стало умирающим, животное было подвергнуто эвтаназии. Помимо потери массы тела, в ходе исследования ни в одном из случаев не проводилось никаких других клинических наблюдений.

Самки мышей CD-1 получали однократную внутривенную инъекцию в боковую хвостовую вену наполнителя, 75 мкг/кг (по D2, 4,4 мг/кг по huCD123) huCD123-лизинсвязанного-D2, 100 мкг/кг (по D2, 5,9 мг/кг по huCD123) huCD123-лизинсвязанного D2 или 125 мкг/кг (по D2, 7,4 мг/кг по huCD123) huCD123-лизинсвязанного-D2. Антитело huCD123 не перекрестно реагирует с CD123 мыши, что делает эту мышиную модель in vivo индикатором токсичности, не связанной с мишенью. Мышей наблюдали ежедневно в течение 22 дней, и определяли массу тела. Если животное испытало более 20% потери массы тела или стало умирающим, животное было подвергнуто эвтаназии.

Результаты суммированы в таблицах ниже и на фиг. 32 и Фиг. 33.

huCD123-CysMab-D5 не переносится при 150 мкг/кг (по D5, 12 мг/кг по huCD123). Самый низкий уровень среднего изменения массы тела наблюдали на 12-й день с уменьшением на 11%. Одна из восьми мышей была подвергнута эвтаназии на 12-й день из-за >20% потери массы тела. huCD123-CysMab-05 плохо переносится при 125 мкг/кг (по D5, 10 мг/кг по huCD123). Самый низкий уровень среднего изменения массы тела наблюдали на 10-й день с уменьшением на 8,6%. Одна из восьми мышей была подвергнута эвтаназии на 9-й день из-за потери массы тела. huCD123-CysMab-05 переносился при 100 мкг/кг (по D5, 8 мг/кг по huCD123). Самый низкий уровень среднего изменения массы тела наблюдали на 6-й день с уменьшением на 7%. Ни одна из мышей в этой группе лечения не подвергалась эвтаназии из-за потери массы тела.

huCD123-SeriMab-sD1 не переносится при 150 мкг/кг (14,3 мг/кг по huCD 123). Самый низкий уровень среднего изменения массы тела наблюдали на 10-й день с уменьшением на 17,3%. Две из восьми мышей были подвергнуты эвтаназии на 10-й день из-за потери массы тела. huCD123-SeriMab-sD1 плохо переносится при 125 мкг/кг (на sD1, 11,9 мг/кг на huCD123). Самый низкий уровень среднего изменения массы тела наблюдали на 10-й день с уменьшением на 6,7%. Одна из восьми мышей была подвергнута эвтаназии на 12-й день из-за потери массы тела.

huCD123-лизинсвязанный D2 переносился при 75 мкг/кг (по D2, 4,4 мг/кг по huCD123). Самый низкий уровень среднего изменения массы тела наблюдали на 5-й день с уменьшением на 6%. Ни одна из мышей в этой группе лечения не подвергалась эвтаназии из-за потери массы тела. huCD123-лизинсвязанный D2 переносился при 100 мкг/кг (по D2, 5,9 мг/кг по huCD123). Самый низкий уровень среднего изменения массы тела наблюдали на 7-й день с уменьшением на 8%. Ни одна из мышей в этой группе лечения не подвергалась эвтаназии из-за потери массы тела. huCD123-лизинсвязанный D2 не переносился при 125 мкг/кг (по D2, 7,4 мг/кг по huCD123). Самый низкий уровень среднего изменения массы тела наблюдали на 9-й день (когда N=6) с уменьшением на 17%. Следующие количества мышей, из первоначальных восьми, были подвергнуты эвтаназии в указанные дни, из-за >20% потери массы тела: одна на день 8, одна на день 9, две на 10 день, одна на день 11 и одна на 13 день.

BW:Macca тела

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>ИММУНОДЖЕН, ИНК.

<120> АНТИ-CD123 АНТИТЕЛА И ИХ КОНЬЮГАТЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ

<130> 121162-02820

<150> 62/346,730

<151> 2016-06-07

<150> 62/338,203

<151> 2016-05-18

<150> 62/186,161

<151> 2015-06-29

<160> 97

<170>PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 1

Ser Tyr Val Met His

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 2

Tyr Ile Lys Pro Tyr Lys Asp Gly Thr Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 3

Tyr Ile Lys Pro Tyr Lys Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 4

Glu Gly Glu Asn Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 5

Ser Ser Ile Met His

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 6

Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 7

TyrIleArgProTyrAsnAspGlyThrArg

1 5 10

<210> 8

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 8

Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 9

Tyr Ile Arg Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 10

Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 11

Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 12

AsnTyrAlaMetSer

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 13

Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Phe Thr Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 14

Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 15

Gln Ser Glu Ala Tyr Tyr Gly Tyr Asp Lys Arg Thr

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 16

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 17

TyrThrSerThrLeuGlnPro

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 18

Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Tyr Thr

1 5

<210> 19

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 19

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 20

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 21

ArgValAsnArgLeuValAsp

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 22

Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 23

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 23

Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ser Ile His

1 5 10

<210> 24

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 24

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 25

Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 26

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 26

Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Lys Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ile Ser Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Glu Asn Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 28

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 28

Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 29

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 29

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 30

<211> 125

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 30

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Asn Ser Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Ser Glu Ala Tyr Tyr Gly Tyr Asp Lys Arg Thr Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 31

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 31

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Thr Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asn Gly Phe Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 32

<211> 82

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 32

Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn

1 5 10 15

Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr

20 25 30

Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg

35 40 45

Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp

50 55 60

Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

65 70 75 80

SerSer

<210> 33

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 34

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<220>

<221>Xaa

<222> (2)..(2)

<223> Phe или Val

<400> 34

Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 36

<211> 378

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 36

Met Val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu

1 5 10 15

Leu Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met

20 25 30

Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr

35 40 45

Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn

50 55 60

Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe

85 90 95

Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys

100 105 110

Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro

115 120 125

Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn

130 135 140

Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly

145 150 155 160

Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly

165 170 175

Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly

180 185 190

Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu

195 200 205

Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met

210 215 220

His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu

225 230 235 240

Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp

245 250 255

Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile

260 265 270

Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro

275 280 285

Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp

290 295 300

Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys

305 310 315 320

Val Phe Val Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro

325 330 335

Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln Asn Asp

340 345 350

Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu

355 360 365

Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lys Thr

370 375

<210> 37

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 37

Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 38

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<220>

<221>Xaa

<222> (2)..(2)

<223> Phe или Val

<400> 38

Ser Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 39

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Arg Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 40

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 40

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 41

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 42

<211> 445

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 42

Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Lys Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ile Ser Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Glu Asn Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

115 120 125

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

130 135 140

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

210 215 220

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

290 295 300

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

305 310 315 320

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

340 345 350

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

355 360 365

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly

385 390 395 400

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

405 410 415

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

420 425 430

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 43

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 44

<211> 445

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 44

Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

115 120 125

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

130 135 140

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Met Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

210 215 220

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

290 295 300

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

305 310 315 320

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

340 345 350

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

355 360 365

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly

385 390 395 400

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

405 410 415

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

420 425 430

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 45

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 45

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 46

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 46

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Asn Ser Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Ser Glu Ala Tyr Tyr Gly Tyr Asp Lys Arg Thr Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr

115 120 125

Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr

130 135 140

Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn

195 200 205

Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro

210 215 220

Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser

225 230 235 240

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr

245 250 255

Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr

275 280 285

Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser

290 295 300

Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln

370 375 380

Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met

385 390 395 400

Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys

405 410 415

Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu

420 425 430

Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 47

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 47

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Thr Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asn Gly Phe Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 48

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

ProGly

450

<210> 49

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 50

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<220>

<221>Xaa

<222> (2)..(2)

<223> Phe или Val

<400> 50

Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

ProGly

450

<210> 51

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 51

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 52

<211> 1713

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 52

Gly Thr Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala

1 5 10 15

Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Cys

20 25 30

Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Thr Gly

35 40 45

Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Thr Cys Thr

50 55 60

Cys Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Cys

65 70 75 80

Cys Thr Cys Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr

85 90 95

Cys Cys Thr Thr Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly

100 105 110

Thr Thr Thr Cys Ala Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys

115 120 125

Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Ala Thr Ala

130 135 140

Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Cys Ala Ala Thr Cys Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr

165 170 175

Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly

180 185 190

Cys Thr Gly Cys Thr Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Cys Ala

195 200 205

Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Cys Ala Gly Ala Ala

210 215 220

Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Ala Gly Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly

225 230 235 240

Ala Cys Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr

245 250 255

Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Ala Cys Gly Ala Ala

260 265 270

Gly Gly Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Ala Cys Ala

275 280 285

Cys Ala Gly Thr Ala Cys Thr Thr Thr Gly Ala Thr Cys Thr Cys Cys

290 295 300

Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr

305 310 315 320

Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly

325 330 335

Ala Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Thr Cys Cys Cys Gly Ala Thr Gly

340 345 350

Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Thr Cys Ala

355 360 365

Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Gly Cys

370 375 380

Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly

385 390 395 400

Cys Ala Ala Ala Cys Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys

405 410 415

Cys Ala Ala Ala Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Thr Cys Ala Cys

420 425 430

Gly Ala Ala Cys Cys Thr Ala Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ala

435 440 445

Gly Cys Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr

450 455 460

Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Ala Ala

465 470 475 480

Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Thr

485 490 495

Ala Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Thr Gly Thr Thr Ala Ala Ala Gly

500 505 510

Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Thr Cys Thr Ala Thr

515 520 525

Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Thr

530 535 540

Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Gly Thr Thr Thr Gly

545 550 555 560

Gly Ala Gly Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr Ala Thr Gly

565 570 575

Thr Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys

580 585 590

Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala

595 600 605

Ala Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Cys

610 615 620

Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr

625 630 635 640

Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Gly Cys

645 650 655

Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Gly Gly Ala

660 665 670

Gly Ala Ala Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly

675 680 685

Ala Thr Thr Cys Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Thr Thr

690 695 700

Thr Cys Thr Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly

705 710 715 720

Gly Gly Cys Gly Gly Thr Ala Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly

725 730 735

Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Gly Ala Cys Gly Thr Cys Cys

740 745 750

Ala Gly Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Thr Thr

755 760 765

Gly Ala Ala Cys Gly Thr Thr Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly

770 775 780

Cys Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Cys Gly Ala Gly Thr

785 790 795 800

Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Cys

805 810 815

Gly Gly Ala Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Cys Ala

820 825 830

Cys Gly Thr Ala Thr Cys Gly Gly Gly Thr Gly Thr Cys Gly Thr Thr

835 840 845

Thr Cys Gly Ala Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly

850 855 860

Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr

865 870 875 880

Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Cys Cys Cys Ala Cys Ala Thr Cys Cys

885 890 895

Thr Gly Gly Thr Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly

900 905 910

Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Ala Thr Cys

915 920 925

Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr Ala Ala Gly Thr

930 935 940

Thr Thr Gly Thr Cys Gly Thr Cys Thr Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala

945 950 955 960

Gly Ala Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr Ala Ala Cys Thr

965 970 975

Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr Gly Ala Cys Thr Gly

980 985 990

Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ala Gly Ala Cys

995 1000 1005

Ala Cys Ala Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys Ala

1010 1015 1020

Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly

1025 1030 1035

Thr Cys Ala Thr Thr Thr Cys Ala Ala Thr Cys Gly Cys Ala Ala

1040 1045 1050

Ala Thr Thr Thr Cys Gly Cys Thr Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr

1055 1060 1065

Thr Cys Ala Gly Ala Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly

1070 1075 1080

Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Ala Thr

1085 1090 1095

Cys Ala Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Gly

1100 1105 1110

Ala Gly Ala Cys Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Thr

1115 1120 1125

Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys Thr Cys Ala Ala Thr Cys Cys

1130 1135 1140

Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Ala Cys Ala Cys Ala Gly Thr

1145 1150 1155

Ala Cys Ala Ala Ala Thr Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly

1160 1165 1170

Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Gly Ala

1175 1180 1185

Ala Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly

1190 1195 1200

Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly

1205 1210 1215

Cys Thr Thr Cys Gly Ala Gly Thr Gly Cys Gly Ala Cys Cys Ala

1220 1225 1230

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Cys Ala Ala Ala

1235 1240 1245

Cys Ala Cys Ala Cys Gly Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly

1250 1255 1260

Gly Ala Cys Gly Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr

1265 1270 1275

Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr

1280 1285 1290

Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly

1295 1300 1305

Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly

1310 1315 1320

Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr

1325 1330 1335

Gly Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Thr

1340 1345 1350

Thr Cys Cys Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys Cys Cys Thr Cys Ala

1355 1360 1365

Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Cys Ala Thr

1370 1375 1380

Cys Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala

1385 1390 1395

Ala Ala Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr

1400 1405 1410

Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Gly

1415 1420 1425

Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala

1430 1435 1440

Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys

1445 1450 1455

Thr Gly Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Thr

1460 1465 1470

Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Thr Thr Gly Ala Gly Ala

1475 1480 1485

Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr

1490 1495 1500

Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr

1505 1510 1515

Cys Ala Ala Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly

1520 1525 1530

Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala

1535 1540 1545

Cys Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly

1550 1555 1560

Ala Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys Ala Cys Gly Cys Ala Gly Cys

1565 1570 1575

Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Thr

1580 1585 1590

Cys Cys Thr Ala Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly

1595 1600 1605

Gly Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Thr Gly Cys Cys Thr

1610 1615 1620

Gly Thr Gly Thr Ala Ala Thr Thr Thr Cys Gly Thr Cys Cys Gly

1625 1630 1635

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala

1640 1645 1650

Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Thr

1655 1660 1665

Gly Thr Gly Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala Thr Gly Ala

1670 1675 1680

Thr Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr

1685 1690 1695

Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ala Cys Cys Cys Ala Ala Ala Ala

1700 1705 1710

<210> 53

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<220>

<221>Xaa

<222> (2)..(2)

<223> Phe или Val

<400> 53

Ser Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

ProGly

450

<210> 54

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<220>

<221> Xaa

<222> (2)..(2)

<223> Phe или Val

<400> 54

Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser

435 440 445

ProGly

450

<210> 55

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 55

AlaLeuAlaLeu

<210> 56

<211> 398

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 56

ProTyrAsnAspGlyThrLysTyrAsnGluLysPheLysGlyArgAla

1 5 10 15

Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser

20 25 30

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly

35 40 45

Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

50 55 60

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

85 90 95

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

100 105 110

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

115 120 125

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

130 135 140

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

145 150 155 160

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

165 170 175

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

180 185 190

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

195 200 205

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

210 215 220

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

225 230 235 240

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

245 250 255

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

260 265 270

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

275 280 285

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

290 295 300

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

305 310 315 320

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

325 330 335

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

340 345 350

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

355 360 365

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

370 375 380

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser Pro Gly

385 390 395

<210> 57

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<220>

<221>Xaa

<222> (1)..(1)

<223> beta-Ala

<400> 57

Xaa Leu Ala Leu

<210> 58

<211> 214

<212>Белок

<213>Искусственный

<220>

<223>Синтетическийпептид

<400> 58

Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 59

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Arg Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

ProGly

450

<210> 60

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 60

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

ProGly

450

<210> 61

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 62

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 62

Ala Ala Gly Cys Thr Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ala Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Thr Thr Ala Thr

20 25 30

Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Ala Gly Cys Ala

35 40 45

Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys

50 55 60

Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr

65 70 75 80

Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys

85 90 95

Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly

100 105 110

Gly Cys Gly Cys Ala Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr

115 120 125

Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys

130 135 140

Gly Gly Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Cys Cys Ala

145 150 155 160

Gly Cys Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly

165 170 175

Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala

180 185 190

Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Cys Thr Cys Gly Ala Ala Thr

195 200 205

Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gly Ala Thr Ala Cys Ala Thr Thr Ala Ala

210 215 220

Gly Cys Cys Thr Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr

225 230 235 240

Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala

245 250 255

Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Gly Gly Thr Cys Gly Thr Gly Thr

260 265 270

Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr

275 280 285

Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Thr Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly

290 295 300

Thr Cys Thr Ala Thr Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Gly

305 310 315 320

Cys Thr Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Gly

325 330 335

Gly Ala Thr Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Ala Thr Ala Thr Thr

340 345 350

Ala Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly

355 360 365

Ala Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys

370 375 380

Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Thr Thr

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Ala Cys Thr

405 410 415

Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys

420 425 430

Gly Cys Cys Thr Cys Thr Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys

435 440 445

Cys

<210> 63

<211> 396

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 63

Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Thr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Thr Ala Thr Ala Ala Thr

20 25 30

Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Gly Cys Thr

35 40 45

Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly Thr Thr Cys

50 55 60

Ala Cys Thr Cys Ala Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr

65 70 75 80

Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr

85 90 95

Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly

100 105 110

Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Ala Cys

115 120 125

Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Gly Gly Gly Cys Ala

130 135 140

Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Thr Thr

145 150 155 160

Cys Thr Thr Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Gly Gly Thr Thr

165 170 175

Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Ala

180 185 190

Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Thr Ala Ala Ala Thr Cys Thr Cys

195 200 205

Thr Cys Ala Thr Thr Thr Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala

210 215 220

Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala

225 230 235 240

Gly Thr Gly Cys Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr Thr Thr Ala

245 250 255

Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly

260 265 270

Thr Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys

275 280 285

Ala Cys Cys Ala Thr Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys

290 295 300

Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Thr Cys Gly Cys

305 310 315 320

Ala Ala Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Thr Thr Gly

325 330 335

Cys Ala Gly Thr Ala Thr Gly Ala Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Cys

340 345 350

Cys Thr Thr Ala Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Gly Gly Gly Cys Ala

355 360 365

Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala

370 375 380

Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Gly Thr Ala Cys Gly

385 390 395

<210> 64

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 64

Ala Ala Gly Cys Thr Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Ala Thr

20 25 30

Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr Thr Gly Cys Ala

35 40 45

Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys

50 55 60

Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr

65 70 75 80

Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys

85 90 95

Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly

100 105 110

Gly Cys Gly Cys Thr Ala Gly Thr Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr

115 120 125

Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala

130 135 140

Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Ala

145 150 155 160

Gly Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala Thr Thr Gly

165 170 175

Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr

180 185 190

Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr

195 200 205

Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ala

210 215 220

Gly Cys Cys Ala Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala

245 250 255

Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys

260 265 270

Cys Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr

275 280 285

Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly

290 295 300

Cys Cys Thr Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Gly Ala Gly

305 310 315 320

Cys Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Ala

325 330 335

Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr

340 345 350

Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly

355 360 365

Ala Gly Gly Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys

370 375 380

Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr

405 410 415

Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys

420 425 430

Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys

435 440 445

Cys

<210> 65

<211> 396

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 65

Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Thr Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Ala Thr

20 25 30

Cys Cys Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala

35 40 45

Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys

50 55 60

Ala Thr Ala Gly Cys Gly Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala Gly Ala Thr

65 70 75 80

Gly Ala Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr

85 90 95

Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly

100 105 110

Thr Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys

115 120 125

Thr Ala Thr Cys Ala Cys Ala Thr Gly Thr Cys Gly Gly Gly Cys Cys

130 135 140

Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Thr Ala Ala Cys Thr

145 150 155 160

Cys Thr Thr Ala Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Thr

165 170 175

Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly

180 185 190

Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Cys

195 200 205

Thr Gly Ala Thr Ala Thr Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala

210 215 220

Thr Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Thr Thr Gly Ala Cys Gly Gly Thr

225 230 235 240

Gly Thr Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Ala Thr Thr Thr Thr

245 250 255

Cys Cys Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly

260 265 270

Ala Ala Ala Cys Gly Ala Thr Thr Ala Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys

275 280 285

Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys

290 295 300

Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys

305 310 315 320

Ala Ala Cys Ala Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Thr Gly

325 330 335

Cys Ala Gly Thr Ala Cys Gly Ala Thr Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys

340 345 350

Cys Thr Thr Ala Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala

355 360 365

Gly Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala

370 375 380

Ala Thr Thr Ala Ala Ala Cys Gly Thr Ala Cys Gly

385 390 395

<210> 66

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 66

Ala Ala Gly Cys Thr Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Ala Thr

20 25 30

Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr Thr Gly Cys Ala

35 40 45

Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys

50 55 60

Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr

65 70 75 80

Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys

85 90 95

Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly

100 105 110

Gly Cys Gly Cys Thr Ala Gly Thr Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr

115 120 125

Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala

130 135 140

Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Ala

145 150 155 160

Gly Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala Thr Thr Gly

165 170 175

Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr

180 185 190

Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr

195 200 205

Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ala

210 215 220

Gly Cys Cys Ala Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala

245 250 255

Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys

260 265 270

Cys Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr

275 280 285

Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly

290 295 300

Cys Cys Thr Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Gly Ala Gly

305 310 315 320

Cys Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Ala

325 330 335

Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr

340 345 350

Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly

355 360 365

Ala Gly Gly Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys

370 375 380

Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr

405 410 415

Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys

420 425 430

Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys

435 440 445

Cys

<210> 67

<211> 396

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 67

Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Thr

20 25 30

Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Ala

35 40 45

Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys

50 55 60

Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr

65 70 75 80

Gly Ala Cys Thr Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr

85 90 95

Thr Cys Thr Ala Thr Gly Thr Cys Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly

100 105 110

Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys

115 120 125

Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Gly Cys Gly Cys Thr

130 135 140

Thr Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala

145 150 155 160

Gly Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr Gly Gly Thr Thr

165 170 175

Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys

180 185 190

Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Thr Cys

195 200 205

Thr Gly Ala Thr Thr Thr Ala Thr Cys Gly Gly Gly Thr Thr Ala Ala

210 215 220

Cys Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Thr

225 230 235 240

Gly Thr Gly Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr

245 250 255

Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gly Gly

260 265 270

Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Thr Ala Thr Ala Gly Cys Cys Thr Gly

275 280 285

Ala Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr Gly

290 295 300

Ala Ala Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ala Ala Thr Cys Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys Thr Thr Gly

325 330 335

Cys Ala Gly Thr Ala Thr Gly Ala Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys

340 345 350

Cys Thr Thr Ala Thr Ala Cys Ala Thr Thr Cys Gly Gly Cys Cys Ala

355 360 365

Gly Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala

370 375 380

Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys Gly Thr Ala Cys Gly

385 390 395

<210> 68

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 68

Ala Ala Gly Cys Thr Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Thr Thr Ala Thr

20 25 30

Thr Cys Thr Gly Thr Thr Cys Thr Thr Gly Gly Thr Cys Gly Cys Cys

35 40 45

Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys

50 55 60

Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr

65 70 75 80

Cys Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Ala

85 90 95

Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly

100 105 110

Gly Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr

115 120 125

Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Thr Ala Gly Cys

130 135 140

Gly Gly Gly Thr Ala Thr Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys Ala Thr

145 150 155 160

Cys Thr Ala Gly Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala Thr Thr Gly

165 170 175

Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr

180 185 190

Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr

195 200 205

Gly Gly Ala Thr Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Thr Cys Ala Gly

210 215 220

Gly Cys Cys Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Thr Gly Gly Cys

225 230 235 240

Ala Cys Thr Cys Gly Ala Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Ala Ala

245 250 255

Ala Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Cys

260 265 270

Thr Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Ala Gly Ala Cys

275 280 285

Cys Gly Cys Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly

290 295 300

Cys Ala Ala Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala

305 310 315 320

Cys Ala Gly Thr Cys Thr Thr Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly

325 330 335

Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Cys Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr

340 345 350

Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly

355 360 365

Thr Gly Gly Cys Ala Ala Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Ala Thr

370 375 380

Gly Ala Thr Ala Cys Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Cys Cys Thr Cys

405 410 415

Thr Gly Thr Ala Ala Cys Ala Gly Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Cys

420 425 430

Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Thr Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys

435 440 445

Cys

<210> 69

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 69

Ala Ala Gly Cys Thr Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Thr

20 25 30

Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys

35 40 45

Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Cys Gly Thr Thr Cys

50 55 60

Ala Cys Ala Gly Thr Cys Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr

65 70 75 80

Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys

85 90 95

Gly Ala Gly Gly Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly

100 105 110

Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Ala Ala Ala Gly Ala Thr

115 120 125

Gly Thr Cys Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Thr Ala Gly Cys

130 135 140

Gly Gly Cys Thr Ala Thr Ala Cys Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Thr

145 150 155 160

Cys Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly

165 170 175

Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Cys Cys Thr

180 185 190

Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr

195 200 205

Gly Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Thr Ala Ala

210 215 220

Ala Cys Cys Thr Thr Ala Thr Ala Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys

225 230 235 240

Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Ala

245 250 255

Ala Gly Thr Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Cys

260 265 270

Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Ala Gly Ala Cys

275 280 285

Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Cys Ala Cys Thr Gly

290 295 300

Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Thr Ala Ala

305 310 315 320

Thr Ala Gly Thr Cys Thr Thr Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly

325 330 335

Gly Ala Thr Thr Cys Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Thr Ala Thr Thr

340 345 350

Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly

355 360 365

Gly Gly Gly Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys

370 375 380

Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly

405 410 415

Thr Gly Thr Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys

420 425 430

Gly Cys Thr Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys

435 440 445

Cys

<210> 70

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 70

Gln Ser Glu Ala Tyr Tyr Gly Tyr Asp Lys Arg Thr Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 71

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 71

ArgValAsnArgLeuValSer

1 5

<210> 72

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 72

ArgAlaSerGlnAspIleAsnSerTyrLeuAla

1 5 10

<210> 73

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 73

GlyPheLeuGly

<210> 74

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 74

AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerMetSerAlaSerValGly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

<210> 75

<211> 47

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 75

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Leu Glu Pro Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala

20 25 30

Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

35 40 45

<210> 76

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 76

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Arg Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn

50 55 60

<210> 77

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 77

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn

50 55 60

<210> 78

<211> 60

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 78

Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Ser Ser

1 5 10 15

Thr Ala Asn Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

20 25 30

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp

35 40 45

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

50 55 60

<210> 79

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 79

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

<210> 80

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 80

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

<210> 81

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 81

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Val Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

<210> 82

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 82

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

<210> 83

<211> 47

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 83

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala

20 25 30

Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

35 40 45

<210> 84

<211> 47

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 84

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala

20 25 30

Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

35 40 45

<210> 85

<211> 47

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 85

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala

20 25 30

Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

35 40 45

<210> 86

<211> 34

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 86

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser

20 25 30

TyrPro

<210> 87

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 87

Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn

50 55 60

<210> 88

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 88

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn

50 55 60

<210> 89

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 89

Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn

50 55 60

<210> 90

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 90

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn

50 55 60

<210> 91

<211> 61

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala

50 55 60

<210> 92

<211> 60

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 92

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser

1 5 10 15

Thr Ala Asn Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

20 25 30

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp

35 40 45

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

50 55 60

<210> 93

<211> 60

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 93

Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser

1 5 10 15

Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

20 25 30

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp

35 40 45

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

50 55 60

<210> 94

<211> 60

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 94

Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser

1 5 10 15

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

20 25 30

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp

35 40 45

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

50 55 60

<210> 95

<211> 60

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 95

Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser

1 5 10 15

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

20 25 30

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp

35 40 45

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

50 55 60

<210> 96

<211> 37

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 96

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser

1 5 10 15

Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

20 25 30

Tyr Tyr Cys Ala Arg

<210> 97

<211> 60

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид

<400> 97

Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser

1 5 10 15

Thr Ala Asn Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

20 25 30

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp

35 40 45

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

50 55 60

<---

1. Антитело к CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:

а) вариабельный участок тяжелой цепи V_H имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 или 40; и

b) вариабельный участок легкой цепи V_L имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, 37 или 41.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 или 40; и

b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34; и

b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, где Xaa, второй остаток от N-конца SEQ ID NO: 34, представляет собой Phe.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, где Xaa, второй остаток от N-конца SEQ ID NO: 34, представляет собой Val.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 или 40, за исключением того, что N-концевой остаток представляет собой Ser; и

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41, за исключением того, что N-концевой остаток представляет собой Ser.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

а) часток тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59 или 60, за исключением того, что N-концевой остаток представляет собой Ser, и за исключением того, что остаток, соответствующий 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54, представляет собой Cys; и

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59 или 60, за исключением того, что остаток, соответствующий 5-му до последнего остатка SEQ ID NO: 54, представляет собой Cys; и

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

а) вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38; и

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56; и

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

а) участок тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54; и

14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 10-13, где Xaa, второй остаток от N-конца SEQ ID NO: 38, 34, 56 и 54, представляет собой Phe.

15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 10-13, где Xaa, второй остаток от N-конца SEQ ID NO: 38, 34, 56 и 54, представляет собой Val.

16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 17, где Xaa, второй остаток от N-конца SEQ ID NO: 54 или 56, представляет собой Phe.

19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 17, где Xaa, второй остаток от N-конца SEQ ID NO: 54 или 56, представляет собой Val.

20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие V_H последовательность SEQ ID NO: 26 и V_L последовательность SEQ ID NO: 27.

21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие V_H последовательность SEQ ID NO: 28 и V_L последовательность SEQ ID NO: 29.

22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие V_H последовательность SEQ ID NO: 30 и V_L последовательность SEQ ID NO: 31.

23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие V_H последовательность SEQ ID NO: 34 и V_L последовательность SEQ ID NO: 35.

24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-23, причем указанное антитело представляет собой мышиное антитело, антитело не относящегося к человеку млекопитающего, химерное, гуманизированное или человеческое антитело.

25. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-24, включающий:

(a) культивирование клетки продуцирующей указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент; и

(b) выделение указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из указанной культивируемой клетки.

26. Способ по п. 25, в котором указанная клетка представляет собой эукариотическую клетку.

27. Иммуноконъюгат, который связывается с антигеном CD123, имеющий следующую формулу:

где:

CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-24, который ковалентно связан через остаток лизина с Cy^L1;

W_L представляет собой целое число от 1 до 20; а также

Cy^L1 представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -H или (C₁-C₄)алкил; а когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -Н или аминозащитную группу, а Y представляет собой -ОН или -SO₃М;

L’ представлен следующей формулой:

R₅ представляет собой -H или (C₁-C₃)алкил;

P представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков;

R_a и R_b, каждый независимо друг от друга, представляют собой -H, (C₁-C₃)алкил, или заряженный заместитель, или ионизируемую группу Q;

m представляет собой целое число от 1 до 6; а

Z^s1 выбирается из любой из следующих формул:

(b1); (b2); (b3);

(b4); (b5),

(b6),

(b7); (b8); (b9); и

(b10),

где:

q представляет собой целое число от 1 до 5; а

М представляет собой Н⁺, Na⁺ или K⁺.

28. Иммуноконъюгат по п. 27, в котором R_a и R_b - оба являются H; а R₅ представляет собой H или Me.

29. Иммуноконъюгат по любому из пп. 27, 28, у которого P выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala.

30. Иммуноконъюгат по п. 29, у которого P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

31. Иммуноконъюгат по любому из пп. 27-30, у которого Q представляет собой -SO₃M.

32. Иммуноконъюгат по п. 27, причем иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

;

или

;

или его фармацевтически приемлемой солью, где W_L представляет собой целое число от 1 до 10; двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -H; и когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H, а Y представляет собой -ОН или -SO₃M.

33. Иммуноконъюгат по любому из пп. 27-32, в котором двойная линия между N и C представляет собой двойную связь, X отсутствует и Y представляет собой -H.

34. Иммуноконъюгат по любому из пп. 27-32, в котором двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H и Y представляет собой -SO₃M.

35. Иммуноконъюгат, который связывается с антигеном CD123, представленный следующей формулой:

где:

CBA представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-24, который ковалентно связан с Cy^C1 через остаток цистеина;

W_С представляет собой 1 или 2;

Cy^C1 представлен следующей формулой:

;

или ее фармацевтически приемлемой солью, где:

двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -H или (C₁-C₄)алкил; и когда он представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H или защищающий амин фрагмент, Y представляет собой -OH или -SO₃M, а M представляет собой H⁺, Na⁺ или K⁺;

R₅ представляет собой -H или (C₁-C₃)алкил;

P представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков;

R_a и R_b для каждого случая являются независимо -H, (C₁-C₃)алкилом, или заряженным заместителем, или ионизируемой группой Q;

m представляет собой целое число от 1 до 6; и

L_C представлен , s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с CBA, а s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с -С(=O)- группой на Cy^C1; в которой:

R₁₉ и R₂₀ для каждого случая независимо представляют собой -H или (C₁-C₃)алкил;

m’’ представляет собой целое число от 1 до 10; а

R^h представляет собой -H или (C₁-C₃)алкил.

36. Иммуноконъюгат по п. 35, в котором R_a и R_b - оба являются H; а R₅ представляет собой H или Me.

37. Иммуноконъюгат по любому из пп. 35, 36, в котором P выбран из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met и Met-Ala.

38. Иммуноконъюгат по п. 37, в котором P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

39. Иммуноконъюгат по любому из пп. 35-38, в котором Q представляет собой -SO₃M.

40. Иммуноконъюгат по любому из пп. 35-39, в котором R₁₉ и R₂₀ - оба представляют собой Н; и m’’ является целым числом от 1 до 6.

41. Иммуноконъюгат по п. 40, в котором -L_C- представлен следующей формулой:

42. Иммуноконъюгат по п. 35, который представлен следующей формулой:

;

или ее фармацевтически приемлемой солью, где двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -H, а когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H и Y представляет собой -ОН или -SO₃M.

43. Иммуноконъюгат, который связывается с антигеном CD123, представленный следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где

W_C означает 1 или 2;

двойная линия между N и C представляет собой одинарную связь или двойную связь при условии, что, когда она является двойной связью, X отсутствует и Y представляет собой -H, а когда она представляет собой одинарную связь, X представляет собой -H и Y представляет собой -SO₃M, М представляет собой Н⁺, Na⁺ или К⁺; и где CBA представляет собой антитело к CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:

b) вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35; и

где представляет собой антитело к CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент, который ковалентно связан через тиоловую группу цистеина.

44. Иммуноконъюгат по п. 43, где Xaa, второй остаток от N-конца SEQ ID NO: 34, представляет собой Phe.

45. Иммуноконъюгат по п. 43, где Xaa, второй остаток от N-конца SEQ ID NO: 34, представляет собой Val.

46. Иммуноконъюгат по п. 43, где CBA представляет собой антитело, содержащее:

b) участок легкой цепи иммуноглобулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51.

47. Иммуноконъюгат по п. 46, где Xaa, второй остаток от N-конца SEQ ID NO: 54, представляет собой Val.

48. Фармацевтическая композиция для лечения рака, где клетки указанного рака экспрессируют CD123, содержащая эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-24 или иммуноконъюгата по любому из пп. 27-47 и фармацевтически приемлемый носитель.

49. Фармацевтическая композиция для ингибирования роста опухолевой клетки, экспрессирующей CD123, содержащая эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-24 или иммуноконъюгата по любому из пп. 27-47 и фармацевтически приемлемый носитель.

50. Способ ингибирования роста опухолевой клетки, экспрессирующей CD123, включающий контактирование клетки с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-24, или иммуноконъюгатом по любому из пп. 27-47, или фармацевтической композицией по п. 48 или 49.

51. Способ по п. 50, причем указанная опухолевая клетка представляет собой лейкемическую клетку или клетку лимфомы.

52. Способ лечения субъекта, имеющего рак, при котором клетки рака экспрессируют CD123, причем способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-24, или иммуноконъюгата по любому из пп. 27-47, или фармацевтической композиции по п. 48 или 49.

53. Способ по п. 52, в котором указанный рак представляет собой лейкоз или лимфому.

54. Способ по п. 52, в котором указанный рак выбран из группы, включающей: острую миелоидную лейкемию (ОМЛ), острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) и хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).

55. Способ по п. 54, в котором указанный рак представляет собой острую миелоидную лейкемию (ОМЛ).

56. Способ по п. 52, где указанный рак представляет собой B-клеточную острую лимфобластную лейкемию (В-ОМЛ).

57. Способ по п. 52, где указанный рак представляет собой основное плазмоцитоидное DC-новообразование (BPDCN) лейкемии.

58. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-24, или иммуноконъюгата по любому из пп. 27-47, или фармацевтической композиции по п. 48 или 49 для лечения рака, при котором клетки рака экспрессируют CD123.

59. Применение по п. 58, где указанный рак выбран из группы, состоящей из: острой миелоидной лейкемии (ОМЛ); хронической миелоидной лейкемии (ХМЛ); острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), острого лимфобластного лейкоза В-клеточной линии (B-ОЛЛ); хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ); лейкоза ворсистых клеток (ВКЛ); миелодиспластического синдрома; основного плазмоцитоидного DC-новообразования (BPDCN) лейкемии; неходжкинских лимфом (НХЛ), лимфомы мантийных клеток; и лейкемии Ходжкина (ЛХ).

Данная группа изобретений относится к иммунологии. Предложено антитело, специфично связывающееся с PD-1 и охарактеризованное аминокислотными последовательностями CDR.

Специфически очищенные антитела против пресепсина // 2739607

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены способ получения поликлональных антител против пресепсина, композиция антител для обнаружения сепсиса или способствующая обнаружению или диагностике сепсиса.

Система презентации пептидов на клеточной поверхности // 2739593

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам на основе тетраспанина, в котором внеклеточная петля заменена полностью или частично пептидными последовательностями различного состава, и может быть использовано для их получения и применения в качестве носителя.

Способы получения двуцепочечных белков в бактериях // 2739500

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен способ получения иммуномобилизующего моноклонального Т-клеточного рецептора против рака (ImmTAC).

Терапевтический биопрепарат для лечения гепатоцеллюлярной карциномы // 2739218

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к конъюгату, который специфически связывает эпитоп внеклеточного домена PLVAP, и может быть использовано в медицине.

Анти-pcsk9 антитело, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение // 2739208

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено анти-PCSK9 антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, кодирующие их нуклеиновые кислоты и экспрессионные векторы.

Анти-сеасам6 антитела и их применения // 2739163

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающие СЕАСАМ6 человека и Масаса fascicularis.

Новые медицинские агенты и их применение // 2739073

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуностимулирующим белковым конструкциям на основе CD154, и может быть использовано в медицине для лечения заболеваний, связанных с иммунитетом, аутоиммунных заболеваний, аллергий, лимфопролиферативных заболеваний и рака, инфекционных и воспалительных заболеваний.

Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула // 2738802

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Предложена антигенсвязывающая молекула, способная связывать рецепторный комплекс CD3, содержащая вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, охарактеризованные аминокислотными последовательностями определяющих комплементарность участков (CDR).

Производное фенилпропанамида, способ его получения и его фармацевтическое применение // 2738207

Изобретение относится к производному фенилпропанамида формулы (I), к способу его получения и к его применению в качестве агониста κ-опиоидного рецептора (KOR), и к его применению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики боли и связанных с болью заболеваний.

Система презентации пептидов на клеточной поверхности // 2739593