Кислотная композиция, содержащая фикоцианин

Группа изобретений относится к пищевой промышленности. Жидкая кислотная пищевая композиция содержит по меньшей мере один фикоцианин, экстрагированный из водоросли (или микроводоросли) порядка Cyanidiales, устойчивый к кислому рН, с содержанием от 2,5 до 2500 мг/л, и по меньшей мере одну неорганическую или органическую кислоту, выбранную из угольной, фосфорной, соляной, серной, перхлорной, сульфоновой, азотной, лимонной, молочной, яблочной, винной и янтарной кислот. Композиция имеет рН 4 или меньше. Фикоцианин представляет собой фикобилипротеин, апобелок которого содержит белок с SEQ ID NO: 1 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 83%-ную идентичность SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 82%-ную идентичность SEQ ID NO: 2. Газированный или негазированный напиток содержит указанную жидкую кислотную композицию. Твердая кислотная пищевая композиция содержит по меньшей мере один фикоцианин, экстрагированный из водоросли (или микроводоросли) порядка Cyanidiales, устойчивый к кислому рН, с содержанием от 0,01 до 10 мг/г, и по меньшей мере одну неорганическую или органическую кислоту, выбранную из угольной, фосфорной, соляной, серной, перхлорной, сульфоновой, азотной, лимонной, молочной, яблочной, винной и янтарной кислот. Композиция имеет рН 4 или меньше. Группа изобретений обеспечивает продукт, который имеет более стабильное окрашивание при кислом рН с течением времени. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 6 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается кислотной композиции, в частности кислотной пищевой композиции, содержащей по меньшей мере один стабильный при кислом рН фикоцианин.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фикоцианины представляют собой пищевые красители, которые придают синий цвет продуктам, в которые их добавляют. Фикоцианин, экстрагированный из спирулины, является сегодня единственным природным синим пигментом, одобренным US-FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США) (FR Doc No: 2013-19550). Он продается в жидком виде или в виде порошка для применения в качестве синего пигмента в пищевых продуктах.

Данный фикоцианин, имеющий происхождение из спирулины, имеет, однако, недостаток в том, что он является нестабильным при кислом рН - ниже 5 - приводящем к потере окрашивания и к выпадению в осадок, что ограничивает его применение. В лучшем случае потеря стабильности происходит при рН около 4 (сравни технические спецификации имеющего происхождение из спирулины фикоцианина Linablue®; http://www.dlt-spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.html).

Следовательно, имеется много кислотных пищевых композиций, а именно газированных или негазированных напитков, для которых фикоцианин, имеющий происхождение из спирулины, не может использоваться в качестве пищевого красителя или в отношении его антиоксидантных свойств.

Существует потребность в идентификации новых фикоцианинов, стабильных при кислом рН, в частности стабильных при кислом рН ниже 4. рН - устойчивость или стабильность измеряется здесь как меньше, чем 10%-ная потеря окрашивания после минимальной экспозиции 10 минут при кислом рН. рН-стабильность может быть измерена другими способами, такими как физическая характеристика фикоцианинов в кислотных композициях как функция времени.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение касается кислотной композиции, в частности кислотной пищевой композиции, которая может содержать по меньшей мере один устойчивый к кислому рН фикоцианин. Преимущественно указанный фикоцианин может представлять собой фикобилипротеин, апобелок которого может содержать по меньшей мере белок с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или его варианты.

Согласно данному изобретению фикоцианин может, в частности, представлять собой фикоцианин, экстрагированный из Galdieriaceae, более конкретно, экстрагированный из Galdieria.

Кислотная композиция согласно данному изобретению, в частности кислотная пищевая композиция, может быть либо твердой, либо пастообразной, либо жидкой, в частности, возможно, газированным напитком.

Под кислотной композицией, в частности кислотной пищевой композицией, согласно изобретению подразумевают композицию, имеющую рН 4 или меньше, чем 4, преимущественно имеющую рН от 2 до 4, более предпочтительно от 2,5 до 3,5.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фикоцианины и аллофикоцианины представляют собой фикобилипротеины, содержащие альфа- и бета-субъединицы, состоящие из апобелка, ковалентно связанного с хромофором. Разные фикоцианины различаются по существу по последовательности их апобелков альфа- и бета-субъединиц.

Согласно конкретному воплощению изобретения кислотная композиция, в частности кислотная пищевая композиция, содержит устойчивый к кислому рН фикоцианин, апобелок α-субъединицы которого содержит SEQ ID NO: 1 (номер доступа YP_009051179.1), и апобелок β-субъединицы которого содержит SEQ ID NO: 2 (номер доступа YP_009051180.1), или их варианты.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения кислотная композиция, в частности кислотная пищевая композиция, содержит устойчивый к кислому рН фикоцианин, апобелок α-субъединицы которого состоит из SEQ ID NO: 1 (номер доступа YP_009051179.1) и апобелок β-субъединицы которого состоит из SEQ ID NO: 2 (номер доступа YP_009051180.1) или их вариантов.

Согласно другому воплощению изобретения кислотная композиция, в частности кислотная пищевая композиция, может дополнительно содержать аллофикоцианин в комбинации с фикоцианином.

Преимущественно апобелок альфа-субъединицы указанного аллофикоцианина содержит SEQ ID NO: 3 (номер доступа YP_009051103.1), и апобелок β-субъединицы содержит SEQ ID NO: 4 (YP 009051104.1) или их варианты.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения апобелок альфа-субъединицы указанного аллофикоцианина состоит из SEQ ID NO: 3 (номер доступа YP_009051103.1) и апобелок β-субъединицы состоит из SEQ ID NO: 4 (YP_009051104.1) или их вариантов.

Аминокислотный состав белка может придавать указанному белку разные свойства согласно указанному аминокислотному составу. Среди прочего, характеристики белка зависят от его аминокислотного состава и его изоэлектрической точки (pI). Изоэлектрическая точка представляет собой рН раствора, при котором белок не несет нетто заряд или, другими словами, рН, при котором молекула является электрически нейтральной, и белки имеют тенденцию притягиваться друг к другу, агрегировать и выпадать в осадок. При рН выше их изоэлектрической точки белки имеют тенденцию быть отрицательно заряженными и отталкиваться друг от друга.

Сравнительный анализ изоэлектрических точек разных белков с использованием расчетной методики, описанной Patrickios and Yamasaki (Polypeptide Amino Acid Composition and Isoelectric Point. II. Comparison between Experiment and Theory. Analytical Biochemistry. 231, 1, 1995: 82-91.1995), демонстрирует определенную корреляцию между теоретическими расчетами и устойчивостью к кислому рН, наблюдаемой экспериментально.

Исследования, проведенные заявителем, показывают то, что устойчивость фикоцианина к кислому рН может быть связана с аминокислотной последовательностью α-субъединицы указанного фикоцианина. Кроме того, отмечается то, что в пределах аминокислотной последовательности α-субъединицы фикоцианина идентичность первых 26 аминокислот, по-видимому, является особенно важной. Это особенно верно для фикоцианина, полученного посредством культивирования штаммов микроводорослей родов Cyanidioschyzon, Cyanidium или Galdieria, более конкретно - штаммов Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium и Cyanidioschyzon merolae.

Таким образом, преимущественно композиция согласно данному изобретению может содержать по меньшей мере один фикоцианин, у которого по меньшей мере один апобелок, в частности апобелок α-субъединицы, может иметь низкую изоэлектрическую точку, обеспечивающую лучшую стабильность при кислом рН.

Под низкой изоэлектрической точкой подразумевается изоэлектрическая точка 3 или меньше, предпочтительно 2,5 или меньше, более предпочтительно 2,2 или меньше.

Таким образом, более преимущественно композиция согласно изобретению может содержать по меньшей мере один фикоцианин, по меньшей мере один апобелок которого, в частности апобелок α-субъединицы, может иметь изоэлектрическую точку 3 или меньше, предпочтительно 2,5 или меньше, более предпочтительно 2,2 или меньше.

Таким образом, согласно конкретному воплощению изобретения кислотная композиция, в частности кислотная пищевая композиция, может содержать по меньшей мере один фикоцианин, апобелок α-субъединицы которого, может иметь низкую изоэлектрическую точку, более конкретно, по меньшей мере один фикоцианин, апобелок α-субъединицы которого, может содержать SEQ ID NO: 1 или вариант.

Таким образом, согласно другому конкретному воплощению изобретения кислотная композиция, в частности кислотная пищевая композиция, содержит по меньшей мере один фикоцианин, апобелок α-субъединицы которого имеет низкую изоэлектрическую точку, более конкретно, по меньшей мере один фикоцианин, апобелок α-субъединицы которого состоит из SEQ ID NO: 1 или вариант.

Согласно изобретению под вариантом подразумевается последовательность белка, соответствующая эталонной последовательности, в данном случае - белку, представленному последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ NO: 4, модифицированной посредством одной или более чем одной замены, вставки или делеции одной или более чем одной аминокислоты эталонной последовательности, и которая имеет такие же функциональные свойства, что и указанная эталонная последовательность.

Преимущественно варианты согласно изобретению имеют по меньшей мере 83%-ную идентичность последовательности с α-субъединицами фикоцианина, и по меньшей мере 82%-ную с β-субъединицами фикоцианина.

Предпочтительно варианты согласно изобретению имеют по меньшей мере 90%-ную идентичность с α (SEQ ID NO: 1) и β (SEQ ID NO: 2) субъединицами.

Аналогичным образом, для аллофикоцианинов варианты преимущественно имеют по меньшей мере 89%-ную идентичность последовательности с α-субъединицами аллофикоцианина, и по меньшей мере 90%-ную с β-субъединицами аллофикоцианина.

Специалисты в данной области знают, как измерять идентичность последовательности белка с использованием обычных способов, имеющихся в их распоряжении, а именно: программы BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Аналогично, специалистам в данной области известно, как идентифицировать варианты указанных последовательностей и подтвердить то, что они сохраняют такие же структурные свойства посредством простого анализа стабильности при кислом рН, например, посредством проведения такого анализа, как анализ, представленный в Примере 3.

Специалисты в данной области знают, что полипептид может быть модифицирован заменой, вставкой и/или делецией по меньшей мере одной аминокислоты без существенной модификации его функции.

Например, замена аминокислоты в данном положении другой химически эквивалентной аминокислотой является известным примером варьирования последовательности, которое существенно не влияет на свойства белка.

Эти «консервативные» замены могут быть определены как замены в пределах следующих групп аминокислот:

- Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

- Asp, Asn, Glu, Gln

- His, Arg, Lys

- Met, Leu, Ile, Val, Cys и

- Phe, Tyr, Trp

Таким образом, варианты апобелков фикоцианинов и/или аллофикоцианинов согласно данному изобретению могут иметь отличие 1-30 аминокислот относительно соответствующей эталонной последовательности, особенно в том, что касается α- и/или β-субъединиц фикоцианина, до такой степени, при которой полученный вариант сохраняет свойства эталонного белка и процентные доли гомологий/идентичностей, заявленные выше.

Более конкретно, согласно данному изобретению:

- варианты апобелка α-субъединицы фикоцианинов, полезные в кислотных композициях согласно данному изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут иметь отличие 1-27 аминокислот относительно соответствующей эталонной последовательности, до такой степени, при которой полученный вариант сохраняет свойства эталонного белка и процентные доли идентичностей, заявленные выше;

- варианты апобелка β-субъединицы фикоцианинов, полезные в кислотных композициях согласно данному изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут иметь отличие 1-30 аминокислот относительно соответствующей эталонной последовательности, до такой степени, при которой полученный вариант сохраняет свойства эталонного белка и процентные доли идентичностей, заявленные выше;

- варианты апобелка α-субъединицы аллофикоцианинов, полезные в кислотных композициях согласно данному изобретению, образующиеся в результате замен, вставок или делеций, могут иметь отличие 1-24 аминокислот относительно соответствующей эталонной последовательности, до такой степени, при которой полученный вариант сохраняет свойства эталонного белка и процентные доли идентичностей, заявленные выше;

- варианты апобелка β-субъединицы аллофикоцианинов, полезные в кислотных композициях согласно данному изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут иметь отличие 1-20 аминокислот относительно соответствующей эталонной последовательности, до такой степени, при которой полученный вариант сохраняет свойства эталонного белка и процентные доли идентичностей, заявленные выше.

Более конкретно, согласно данному изобретению и независимо от рассматриваемой эталонной последовательности (α- и/или β-субъединица фикоцианина и/или α- и/или β-субъединица аллофикоцианина), варианты указанных субъединиц могут преимущественно иметь отличие 1-15 аминокислот, предпочтительно отличие 1-10 аминокислот, в частности, отличие 1 или 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9, или 10 аминокислот относительно соответствующей эталонной последовательности, до такой степени, при которой полученный вариант сохраняет свойства эталонного белка и процентные доли идентичностей, заявленные выше.

Согласно данному изобретению фикоцианин или его варианты, полезные в кислотных композициях, в частности в кислотных пищевых композициях, одни или в смеси с аллофикоцианином или его вариантами, могут быть получены посредством культивирования природного организма, экспрессирующего в природе интересующий фикоцианин или его вариант, или посредством культивирования организма, генетически трансформированного для экспрессии интересующего фикоцианина или его варианта, отобранного по его способности продуцировать указанный фикоцианин или его варианты.

Типичные природные организмы, экспрессирующие в природе фикоцианин, полезный в композициях согласно данному изобретению, или его интересующий вариант, включают водоросли (или микроводоросли) порядка Cyanidiales.

Порядок Cyanidiales включает семейства Cyanidiaceae и Galdieriaceae, которые сами подразделяются на роды Cyanidioschyzon, Cyanidium и Galdieria, члены которых включают, среди прочих, виды Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita and Galdieria sulphuraria. Можно сделать конкретное упоминание штамма Galdieria sulphuraria (также именуемого Cyanidium caldarium) UTEX#2919.

Таким образом, согласно одному воплощению изобретения кислотная композиция, особенно кислотная пищевая композиция, содержит устойчивый к кислому рН фикоцианин из природных организмов, таких как водоросли или микроводоросли порядка Cyanidiales, в частности из природных организмов семейств Cyanidiaceae или Galdieriaceae.

Более конкретно, согласно данному изобретению кислотная композиция, в частности кислотная пищевая композиция, содержит устойчивый к кислому рН фикоцианин из природных организмов, которые принадлежат к родам Cyanidioschyzon, Cyanidium, Galdieria, преимущественно выбранным из видов рода Cyanidium и Galdieria.

Даже более конкретно, согласно данному изобретению кислотная композиция, в частности кислотная пищевая композиция, содержит устойчивый к кислому рН фикоцианин из природных организмов, выбранных из видов Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita, Galdieria sulphuraria.

Предпочтительная форма кислотной композиции, в частности кислотной пищевой композиции согласно данному изобретению, содержит устойчивый к кислому рН фикоцианин из природных микроводорослей, таких как Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium или Cyanidioschyzon merolae. Более предпочтительно, устойчивый к кислому рН фикоцианин происходит из природной микроводоросли, выбранной из Galdieria sulphuraria и Cyanidium caldarium.

В качестве примера организма, трансформированного для экспрессии интересующего фикоцианина или его варианта, выбранного по его способности продуцировать указанный фикоцианин или его варианты, можно упомянуть микроорганизм, трансформированный таким образом, чтобы экспрессировать апобелок SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2, и/или SEQ ID NO: 3, и/или SEQ ID NO: 4, причем указанный микроорганизм также содержит биосинтетические пути, необходимые для продукции хромофора и для его связывания с апобелком. В частности, можно упомянуть дрожжи в качестве микроорганизмов, которые могут быть модифицированы для продукции фикоцианина и/или аллофикоцианина, используемых в пищевых композициях согласно изобретению.

Специалисты в данной области не будут иметь трудностей в нахождении в предшествующем уровне техники описания способов культивирования природных и/или модифицированных организмов, которые могут продуцировать фикоцианин, полезный в композициях согласно данному изобретению.

Например, культивирование Cyanidiaceae или Galdieriaceae из порядка Cyanidiales, хорошо известных специалистам в данной области, можно преимущественно проводить в миксотрофном режиме, причем свет обычно необходим для биосинтеза пигментов.

Такое промышленное культивирование преимущественно может проводиться в ферментерах большого объема (т.е. 1000-литровых, 10000-литровых, 20000-литровых, 100000-литровых). Культивирование может проводиться при условиях, известных специалистам в данной области. Оно может проводиться в периодическом режиме, режиме с подпиткой или в непрерывном режиме.

Фикоцианин, полезный в композициях согласно данному изобретению, более конкретно может быть экстрагирован из биомассы, полученной культивированием водоросли порядка Cyanidiales, как определено выше, культивированной в миксотрофном режиме со светом, имеющим длину волны от 400 нм до 550 нм, преимущественно от 420 до 500 нм, предпочтительно от 430 до 480 нм, более предпочтительно - 455 нм. Он может представлять собой «белый» свет, имеющий широкий спектр, включающий свет указанной длины волны. Он также преимущественно может представлять собой свет узкого спектра, состоящий из указанных длин волн.

Такой способ промышленного получения биомассы Cyanidiales в миксотрофном режиме и биомасса, полученная таким образом, описываются, в частности, в патентной заявке FR 15 59072, поданной 25 сентября 2015 г., содержание которой включено сюда посредством ссылки.

Целью данного изобретения является предложение композиции, в которой фикоцианин является стабильным при кислом рН. Под кислотной композицией согласно данному изобретению подразумевается любая композиция, содержащая неорганическую или органическую кислоту и фикоцианин. Указанная композиция, которая имеет кислый рН, и в которую включен устойчивый к кислому рН фикоцианин, может быть жидкой, текучей или вязкой, пастообразной или твердой.

Для водных жидких композиций рН измеряется обычным способом. Для неводных жидких композиций или для пастообразных или твердых композиций рН измеряется после растворения указанной композиции в достаточном количестве воды для растворения содержащихся в ней растворимых соединений, включающих неорганические или органические кислоты и фикоцианин.

Преимущественно композиция согласно данному изобретению представляет собой водную жидкую композицию, возможно в виде геля, или пастообразную, или твердую композицию, разработанную для растворения в водном растворе или в твердой или пастообразной композиции, содержащей воду. Согласно другому преимущественному воплощению изобретения кислотная композиция представляет собой пастообразную или твердую композицию, предназначенную для применения и/или хранения во влажной среде.

Неорганические или органические кислоты, полезные в композициях согласно данному изобретению, являются хорошо известными специалистам в данной области. Типичные неорганические кислоты включают, в частности, угольную, фосфорную, соляную, серную, перхлорную, сульфоновую и азотную кислоты. Типичные органические кислоты включают, в частности, лимонную, молочную, яблочную, винную, янтарную кислоты, преимущественно лимонную кислоту.

Под кислотной пищевой композицией согласно данному изобретению подразумевается любая композиция, разработанная для приема внутрь людьми или животными, и которая попадает в пределы предшествующего определения. Нутрицевтические кислотные композиции должны рассматриваться как попадающие в пределы определения кислотных пищевых композиций в пределах контекста данного изобретения.

Кислотные пищевые композиции согласно данному изобретению хорошо известны специалистам в данной области. Они могут содержать носитель, который может содержать структурные компоненты, ассоциированные с активными соединениями, идентифицированными по их пищевой ценности или по их полезным для здоровья свойствам, которые приносят пользу человеку или животным. Кислотная пищевая композиция согласно данному изобретению также может содержать пищевые добавки, такие как структурирующие агенты, корригенты, консерванты или любые компоненты, хорошо известные специалистам в данной области. Носитель может содержать воду и/или белки, и/или жиры, и/или волокна, и/или сахара. Компоненты носителя могут иметь только структурные свойства, но они обычно известны за их пищевую ценность.

Кислотная пищевая композиция по изобретению может быть готовой к применению или находиться в форме пищевой добавки, подлежащей добавлению в твердый, пастообразный или жидкий препарат для того, чтобы приготовить съедобную пищу.

Для пищевых композиций кислота предпочтительно будет выбрана из списка подкислителей, одобренных для пищевых продуктов, в частности, угольной, фосфорной, лимонной, яблочной, винной и молочной кислот, более конкретно - лимонной кислоты.

В том, что касается непищевых кислотных композиций по изобретению, они могут представлять собой, среди прочего, фармацевтические, ветеринарные или косметические композиции и дополнительно содержат любые добавки и/или активные агенты, известные и применяемые в таких композициях.

В твердой, жидкой или пастообразной кислотной композиции по изобретению фикоцианин может быть включен, например, в форме порошка. Указанная кислотная композиция, в частности указанная кислотная пищевая композиция, таким образом, может находиться в любой известной традиционной форме, такой как кремы, гели, пены, пасты и т.д. Типичные твердые пищевые композиции включают торты или печенье, сухие пищевые продукты для готовки, растворимые порошки, желеобразные твердые композиции (желе), пены и т.д.

Согласно данному изобретению указанная жидкая кислотная композиция может представлять собой водную композицию, в которой растворяется фикоцианин. Она может находиться в форме готовой к применению композиции или жидкого концентрата для разведения, а именно: для приема внутрь или для добавления в твердый пищевой продукт либо для его приготовления, либо для его приема внутрь, например, концентрированная жидкая композиция «покрытия», подлежащая нанесению на торт для придания ему цвета. Среди данных концентрированных композиций можно упомянуть сиропы, возможно содержащие спирт.

Жидкая кислотная композиция по изобретению может иметь варьирующую вязкость и, возможно, содержит такие добавки, как агенты, придающие вязкость, гелеобразующие агенты и другие структурирующие добавки, известные специалистам в данной области и типичные для приготовления жидких пищевых композиций.

Согласно конкретному воплощению изобретения жидкая пищевая композиция возможно может представлять собой кислотный газированный напиток. Можно конкретно упомянуть газированные воды, соки, спортивные напитки, энергетические напитки, восстановительные напитки и т.д. Составы данных напитков хорошо известны специалистам в данной области и могут, в частности, содержать сахара, неорганические соли, пищевые добавки, растворенный газ и т.д. Напиток согласно данному изобретению представляет собой традиционный кислотный напиток, в котором обычно используемый краситель был полностью или частично заменен устойчивым к кислому рН фикоцианином согласно данному изобретению.

Согласно данному изобретению содержание фикоцианина в композициях согласно данному изобретению может согласоваться с практиками специалистов в данной области.

Например, когда фикоцианин будет использоваться для окрашивания кислотной композиции, тогда содержание фикоцианина в указанной композиции может согласоваться с практикой специалистов в данной области в том, что касается окрашивания.

В жидкой кислотной композиции в пределах контекста данного изобретения содержание фикоцианина может составлять от 2,5 мг/л до 2500 мг/л, предпочтительно от 25 мг/л до 300 мг/л.

В жидкой композиции типа готового к применению напитка содержание фикоцианина обычно может составлять от 25 мг/л до 300 мг/л, предпочтительно от 50 мг/л до 100 мг/л.

В концентрированной жидкой композиции для разведения перед применением, такой как сироп, содержание фикоцианина обычно может составлять от 250 мг/л до 2500 мг/л, предпочтительно от 500 мг/л до 1000 мг/л.

В твердой композиции содержание фикоцианина обычно может составлять от 0,01 мг/г до 10 мг/г, предпочтительно от 0,1 мг/г до 5,0 мг/г, более предпочтительно - от 0,25 мг/г до 2,5 мг/г.

Одно из преимуществ данного изобретения, как можно видеть в следующих примерах, состоит в том, что окрашивание, предоставляемое устойчивыми к кислотному рН фикоцианинами, является более стабильным с течением времени.

Другие аспекты и характеристики изобретения станут очевидными из прочтения примеров и графических материалов.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 описаны аминокислотные последовательности апобелков фикоцианина и аллофикоцианина Galdieria sulphuraria:

SEQ ID NO 1: YP_009051179.1: α-субъединица фикоцианина; SEQ ID NO 2: YP_009051180.1: β-субъединица фикоцианина; SEQ ID NO 3: YP_009051103.1: α-субъединица аллофикоцианина; SEQ ID NO 4: YP_009051104.1: β-субъединица аллофикоцианина; На Фиг. 2 представлена кривая стабильности как функция рН фикоцианинов, экстрагированных из Galdieria sulphuraria (UTEX2919) и Cyanidioschyzon merolae (ACUF 199), последовательность апобелка которых состоит из SEQ ID NO: 1 или варианта, по отношению к кривой стабильности фикоцианина Linablue®, полученного из спирулины.

: фикоцианин из Galdieria sulphuraria (UTEX#2919)

: фикоцианин из Cyanidioschyzon merolae (ACUF 199)

: Lina Blue®: фикоцианин из Spirulina platensis (Arthrospira platensis) (данные, полученные с веб-сайта http://www.dlt-spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.html, демонстрирующие значения рН, при которых появляется выпадение фикоцианина в осадок).

На Фиг. 3 представлено изменение окрашивания кислотного напитка, содержащего фикоцианин, с течением времени. НО, Н2, Н4 и Н6: неделя 0, 2, 4 и 6.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: продукция и экстракция фикоцианина из Galdieria sulphuraria UTEX#2919

Материалы и методы

Штамм: Galdieria sulphuraria (также именуемая Cyanidium caldarium) UTEX#2919 Культуральная среда

Миксотрофия: 30 г/л глицерина, 8 г/л (NH₄)₂SO₄, 1 г/л KH₂PO₄, 716 мг/л MgSO₄, 44 мг/л CaCl₂, 3 мл/л маточного раствора Fe-EDTA (6,9 г/л FeSO₄ и 9,3 г/л EDTA-Na₂) и 4 мл/л раствора металлов-микроэлементов (3,09 г/л EDTA-Na₂; 0,080 г/л CuSO₄, 5H₂O; 2,860 г/л H₃BO₃; 0,040 г/л NaVO₃, 4H₂O; 1,820 г/л MnCl₂; 0,040 г/л CoCl₂,6H₂O; 0,220 г/л ZnSO₄,7H₂O; 0,017 г/л Na₂SeO₃; 0,030 г/л (NH₄)₆Mo₇O₂₄, 4H₂O).

Культуральные условия:

Культивирования проводят в реакторах с полезным объемом от 1 до 2 л с автоматическими системами, контролируемыми компьютером. рН культуры регулируют добавлением основания (14%-ный раствор аммиака (масс.NH₃/масс.) и/или кислоты (4 н. раствор серной кислоты). Останавливают температуру культуры 37°С. Культуру освещают отражателями, оснащенными системой белых LED (светодиоды) или синих LED (455 нм), способом, аналогичным способу, описанному в патенте WO 2014/174182. Отслеживание роста клеток осуществляют в разные моменты времени посредством измерения поглощения при 800 нм, а измерение сухой массы осуществляют посредством фильтрования.

Характеристики эффективности культуры в конце роста обобщают в следующей Таблице 1:

Измерения внутриклеточного содержания фикоцианина на грамм сухого вещества проводили с использованием экстракции и способа анализа, описанного Moon и коллегами [Moon et al, Korean J. Chem. Eng., 2014, 1-6], с заменой фосфатного буфера водой.

Пример 2: экстракция фикоцианинов

Штаммы Galdieria sulphuraria (UTEX#2919) и/или Cyanidioscyizon merolae (ACUF 199) культивировали при условиях примера 1.

Фикоцианин затем экстрагируют согласно модификации протокола, описанного Moon et al., 2014 (в цитируемой работе). Указанная модификация заключается в замене фосфатного буфера, используемого для солюбилизации фикоцианина, деминерализованной водой.

Таким образом, получают экстракт (также именуемый «фикоцианиновый экстракт» или «неочищенный экстракт»), который, помимо интересующего фикоцианина, содержит другие водорастворимые белки. Указанный фикоцианиновый экстракт может иметь несколько возможных характеристик, в зависимости от использованного способа экстракции и/или очистки. Например, неочищенный экстракт будет содержать большее количество водорастворимых белков, отличных от фикоцианина, чем количество, обнаруженное в очищенном экстракте. Под очищенным экстрактом подразумевают неочищенный экстракт, из которого, при сохранении фикоцианина, была удалена часть водорастворимых белков посредством ультрафильтрации, фильтрования на полых волокнах или ионообменной хроматографии - способов, известных специалистам в данной области.

Индекс чистоты традиционно выражается расчетом отношения поглощения раствора при 618 нм (специфичное поглощение фикоцианина) к поглощению при 280 нм - специфичному поглощению ароматических аминокислот, дающему представление об общем уровне белка. Чем ниже данное отношение, тем больше количество белков, отличных от фикоцианина, в растворе.

Неочищенный экстракт очищали с использованием фильтрационной системы с тангенциальным потоком KrosFlo® от Spectrum® Labs.

Таблица 2. Измерение индекса чистоты фикоцианинового экстракта до и после очистки.

Пример 3: исследование стабильности фикоцианина, экстрагированного из штаммов Galdieria sulphuraria (UTEX#2919), Cyanidioschyzon merolae (ACUF199) и Spirulina (Arthrospira) platensis, как функция рН

Штаммы Galdieria sulphuraria (UTEX#2919) и Cyanidioschyzon merolae (ACUF 199) культивировали при условиях примера 1.

Анализы проводят, принимая в качестве контроля данные имеющегося в продаже продукта LinaBlue® (http://www.dlt-spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.html) от компании DIC Lifetec Co., Ltd. (Токио, Япония), который представляет собой фикоцианин, экстрагированный из Spirulina (Arthrospira) platensis.

Данные анализы проводили с фикоцианинами, полученными в примере 2 и имеющими индекс чистоты 2,12. Измерение голубого окрашивания осуществляют измерением поглощения при 618 нм с использованием спектрофотометра Ultraspec 2100 pro (Amersham). Процент потери окрашивания рассчитывают относительно измерению поглощения образца при контрольных условиях (рН 6).

Для анализа устойчивости при кислых условиях рН постепенно понижают добавлением 5%-ного раствора лимонной кислоты (Sigma 251275) в препарат фикоцианина. Для каждого значения рН отбирают образец раствора фикоцианина, и измеряют его поглощение при 618 нм через 10 минут после снижения рН до желательного значения.

Результаты данных анализов представлены на Фиг. 2: Фикоцианин, экстрагированный из Galdieria sulphuraria (UTEX#2919) демонстрирует очень хорошую устойчивость к рН по сравнению с фикоцианином спирулины, с меньше, чем 10% потери пигментации вплоть до рН 2,75 (98,25% его окрашивания при рН 3, 92,4% при рН 2,75), причем потеря увеличивалась при рН 2,5 (79% при рН 2,5; 75% при рН 2,25; 46% при рН 2).

Фикоцианин, экстрагированный из штамма Cyanidioschyzon merolae (ACUF 199) демонстрирует хорошую устойчивость к рН по сравнению с фикоцианином спирулины, с более чем 90% его окрашивания при рН 3; 70% при рН 2,75; 40% при рН 2,5; 23% при рН 2,25; 20% при рН 2.

Фикоцианин, экстрагированный из штамма Spirulina platensis демонстрирует только 90% его окрашивания при рН 4, 80% при рН 3,8; 60% при рН 3,6; 38%) при рН 3,4. Фикоцианин, экстрагированный из Spirulina platensis, начинает выпадать в осадок при рН 3,8.

В заключение, фикоцианины Galdieria sulphuraria или Cyanidioschyzon merolae являются более устойчивыми к кислому рН, чем фикоцианин, экстрагированный из спирулины.

Пример 4 - сравнительный анализ последовательностей апобелков фикоцианина и аллофикоцианина из разных микроводорослей и измерение их изоэлектрических точек

Для того чтобы идентифицировать возможную причину увеличения устойчивости к кислому рН, проводили сравнение последовательностей α- и β-субъединиц фикоцианинов и аллофикоцианинов, продуцируемых разными микроорганизмами, в частности микроводорослями, с использованием программы BLASTP, применение которой хорошо известно специалистам в данной области, на основе опубликованных последовательностей, доступных в базах данных (см. номер доступа). Сравнение делают относительно последовательности апобелка соответствующей субъединицы штамма Galdieria sulphuraria.

В то же самое время, изоэлектрическая точка апобелков α- и β-субъединиц фикоцианинов и аллофикоцианинов, для которых было проведено сравнение последовательности, была определена расчетной методикой, описанной Patrickios and Yamasaki (1995).

Фикоцианин и аллофикоцианин, продуцированные штаммом Galdieria sulphuraria, служат в данных исследованиях в качестве контроля.

Результаты

Результаты сравнений последовательности и расчетов pI представлены в таблицах 3 и 4 ниже:

Таблица 3. Сравнение последовательностей апобелков альфа- и бета-субъединиц фикоцианина из разных организмов. Показана изоэлектрическая точка каждого белка (Patrickios and Yamasaki, 1995).

Таблица 4. Сравнение последовательностей апобелков альфа- и бета-субъединиц аллофикоцианина из разных организмов. Показана изоэлектрическая точка каждого белка (Patrickios and Yamasaki, 1995).

Сравнения последовательности и изоэлектрической точки показывают то, что наиболее устойчивые к кислому рН α-субъединицы фикоцианинов имеют изоэлектрическую точку меньше 3 и более высокий процент идентичности с последовательностью Galdieria sulphuraria.

Пример 5: стабильность в напитке с течением времени

Анализ стабильности в кислой среде с течением времени для фикоцианина, экстрагированного из штамма UTEX#2919, проводили посредством добавления данного фикоцианина в лимонадный напиток (рН 2,95; как описано в примере 6: напиток 1). После добавления 0,025% фикоцианина, последовательность апобелка которого состоит из варианта SEQ ID NO: 1, данный напиток подвергали воздействию цикла дня/ночи (16 ч/8 ч) с искусственным освещением в течение 6 недель при комнатной температуре.

С течением времени осуществляли регулярный отбор образцов для измерения поглощения при 618 нм. Аликвоту отбирают в недели 0 (Н0), 2 (Н2), 4 (Н4) и 6 (Н6), и поглощение при 618 нм измеряют с использованием спектрофотометра Ultraspec 2100 pro (Amersham) для того, чтобы определять точку 100%-ного окрашивания. Остаточное окрашивание выражают как процентную долю исходного контрольного значения.

На Фиг. 3 показаны результаты данного эксперимента. Отмечается постоянная потеря окрашивания с течением на протяжении долговременного воздействия света. Однако после 6 недель воздействия сохраняется больше, чем 60% окрашивания.

Пример 6: примеры кислотных напитков в жидком виде, содержащих фикоцианин

Напитки, содержащие фикоцианин, могут иметь следующий состав:

Напиток 1 - газированный напиток:

- газированная вода	qs (достаточное количество до) 1 л
- сахара	70 г
- лимонная кислота	1,5 г
- природный органический корригент	от 4 до 8 г
- фикоцианиновый экстракт, полученный
в примере 2	qs 100 мг фикоцианина

рН данного напитка составляет 2,95.

Напиток 2 - оздоровительный напиток для спортсменов, улучшающий общее состояние организма:

- родниковая вода	qs 1 л
- глюкоза	20 г
- фруктоза	10 г
- лимонная кислота	2,7 г
- цитрат натрия	1,87 г
- цитрат калия	0,327 г
- хлорид магния	2,5 мг
- хлорид кальция	3 мг
- природный органический корригент	4 г
- фикоцианиновый экстракт, полученный
в примере 2	qs 150 мг фикоцианина

рН данного напитка составляет 3,5

Пример 6: кислотный напиток в форме растворимого порошка, содержащий фикоцианин

- сахара	от 70 до 100 г
- лимонная кислота	от 1 до 1,5 г
- природный органический корригент	от 4 до 8 г
- фикоцианиновый экстракт, полученный
в примере 2	qs 250 мг фикоцианина

Полученный таким образом порошок (от 75 до 110 г) может быть растворен в 1 л воды с получением кислотного напитка синего цвета.

Пример 7: твердая кислотная композиция, содержащая фикоцианин:

кислотные конфеты:

- вода	qs 1 кг
- сахара	800 г
- лимонная кислота	от 1 до 2 г
- фикоцианиновый экстракт, полученный
в примере 2	qs 2500 мг фикоцианина

ССЫЛКИ

- Moon et al, Korean J. Chem. Eng., 2014, 1-6

- Patrickios et Yamasaki, Polypeptide Amino Acid Composition and Isoelectric Point. II. Comparison between Experiment and Theory. Analytical Biochemistry. 231, 1, 1995: 82-91

- FR Doc No: 2013-19550

- WO 2014/174182

- FR 15 59072, поданная 25 сентября 2015 г.

- http://www.dlt-spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.html

- http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

1. Кислотная пищевая композиция, содержащая по меньшей мере один фикоцианин, устойчивый к кислому рН, и по меньшей мере одну неорганическую или органическую кислоту, выбранную из угольной, фосфорной, соляной, серной, перхлорной, сульфоновой, азотной, лимонной, молочной, яблочной, винной и янтарной кислот, где указанная пищевая композиция является жидкой, отличающаяся тем, что:

- указанная кислотная пищевая композиция имеет рН 4 или меньше и содержание фикоцианина составляет от 2,5 мг/л до 2500 мг/л,

- указанный фикоцианин представляет собой фикобилипротеин, апобелок которого содержит белок с SEQ ID NO: 1 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 83%-ную идентичность SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 82%-ную идентичность SEQ ID NO: 2, и

- указанный фикоцианин представляет собой фикоцианин, экстрагированный из водоросли (или микроводоросли) порядка Cyanidiales.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что кислота представляет собой лимонную кислоту.

3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что апобелок α-субъединицы указанного фикоцианина содержит SEQ ID NO: 1 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 83%-ную идентичность SEQ ID NO: 1, и апобелок β- субъединицы указанного фикоцианина содержит SEQ ID NO: 2 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 82%-ную идентичность SEQ ID NO: 2.

4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанный апобелок α-субъединицы состоит из SEQ ID NO: 1 или последовательности белка, имеющей по меньшей мере 83%-ную идентичность SEQ ID NO: 1, и апобелок β-субъединицы состоит из SEQ ID NO: 2 или последовательности белка, имеющей по меньшей мере 82%-ную идентичность SEQ ID NO: 2.

5. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит аллофикоцианин в комбинации с фикоцианином, причем апобелок α-субъединицы указанного аллофикоцианина содержит SEQ ID NO: 3 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 89%-ную идентичность SEQ ID NO: 3, и апобелок β-субъединицы указанного аллофикоцианина содержит SEQ ID NO: 4 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность SEQ ID NO: 4.

6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что фикоцианин представляет собой фикоцианин, экстрагированный из водоросли (или микроводоросли) семейства Cyanidiaceae или семейства Galdieriaceae.

7. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что фикоцианин представляет собой фикоцианин, экстрагированный из водоросли (или микроводоросли) родов Cyanidioschyzon, Cyanidium или Galdieria.

8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она имеет рН примерно от 2,5 до 3,5.

9. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что апобелок α-субъединицы указанного фикоцианина имеет изоэлектрическую точку меньше 3.

10. Газированный или негазированный напиток, отличающийся тем, что содержит жидкую кислотную композицию по п. 1.

11. Кислотная пищевая композиция, содержащая по меньшей мере один фикоцианин, устойчивый к кислому рН, и по меньшей мере одну неорганическую или органическую кислоту, выбранную из угольной, фосфорной, соляной, серной, перхлорной, сульфоновой, азотной, лимонной, молочной, яблочной, винной и янтарной кислот, где указанная пищевая композиция является твердой, отличающаяся тем, что:

- указанная кислотная пищевая композиция имеет рН 4 или меньше и содержание фикоцианина составляет от 0,01 мг/г до 10 мг/г,

- указанный фикоцианин представляет собой фикобилипротеин, апобелок которого содержит белок с SEQ ID NO: 1 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 83%-ную идентичность SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 82%-ную идентичность SEQ ID NO: 2, и

- указанный фикоцианин представляет собой фикоцианин, экстрагированный из водоросли (или микроводоросли) порядка Cyanidiales.

12. Композиция по п. 11, отличающаяся тем, что кислота представляет собой лимонную кислоту.

13. Композиция по п. 11, отличающаяся тем, что содержание фикоцианина составляет от 0,25 мг/г до 2,5 мг/г.

14. Композиция по п. 11, отличающаяся тем, что апобелок α-субъединицы указанного фикоцианина содержит SEQ ID NO: 1 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 83%-ную идентичность SEQ ID NO: 1, и апобелок β- субъединицы указанного фикоцианина содержит SEQ ID NO: 2 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 82%-ную идентичность SEQ ID NO: 2.

15. Композиция по п. 13, отличающаяся тем, что указанный апобелок α-субъединицы состоит из SEQ ID NO: 1 или последовательности белка, имеющей по меньшей мере 83%-ную идентичность SEQ ID NO: 1, и апобелок β-субъединицы состоит из SEQ ID NO: 2 или последовательности белка, имеющей по меньшей мере 82%-ную идентичность SEQ ID NO: 2.

16. Композиция по п. 11, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит аллофикоцианин в комбинации с фикоцианином, причем апобелок α-субъединицы указанного аллофикоцианина содержит SEQ ID NO: 3 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 89%-ную идентичность SEQ ID NO: 3, и апобелок β-субъединицы указанного аллофикоцианина содержит SEQ ID NO: 4 или последовательность белка, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность SEQ ID NO: 4.

17. Композиция по п. 11, отличающаяся тем, что фикоцианин представляет собой фикоцианин, экстрагированный из водоросли (или микроводоросли) семейства Cyanidiaceae или семейства Galdieriaceae.

18. Композиция по п. 11, отличающаяся тем, что фикоцианин представляет собой фикоцианин, экстрагированный из водоросли (или микроводоросли) родов Cyanidioschyzon, Cyanidium или Galdieria.

19. Композиция по п. 12, отличающаяся тем, что она имеет рН примерно от 2,5 до 3,5.

20. Композиция по п. 12, отличающаяся тем, что апобелок α-субъединицы указанного фикоцианина имеет изоэлектрическую точку меньше 3.