Способ получения клеточных линий, стабильно продуцирующих человеческие моноклональные антитела класса igg

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен способ получения человеческого антитела класса IgG с аутентичными иммуноглобулиновыми последовательностями человека, продуцируемого гибридомой (триомой): мышиная миелома – человеческий лимфоцит – человеческий лимфоцит. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в получении человеческих антител класса IgG необходимой специфичности. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 4 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к гибридомной технологии, позволяющей получать немодифицированные полностью человеческие антитела класса IgG. Изобретение может быть использовано в научных организациях и фармацевтических компаниях, занимающихся разработкой препаратов на основе терапевтических антител.

Предшествующий уровень техники

Терапевтические моноклональные антитела прочно вошли в клиническую практику, объем мирового рынка препаратов на их основе увеличивается с каждым годом. Опыт использования в клинике химерных, гуманизированных и даже полностью человеческих антител показывает, что при продолжительном введении у значительного числа пациентов развивается иммунный ответ на препарат, что сильно снижает его эффективность. Дело в том, что химерные и гуманизированные антитела содержат белковые последовательности животного происхождения, что делает МкАт «видимыми» для иммунной системы. Полностью человеческие получают либо при помощи технологии фагового дисплея, либо с использованием трансгенных мышей, и в обоих случаях процесс включает в себя стадии мутагенеза для повышения аффинитета антител, так называемое созревание аффинности, что также приводит к появлению «нечеловеческих» последовательностей.

Принципиальное преимущество гибридомной технологии для получения человеческих антител состоит в том, эта технология сохраняет аутентичность последовательностей ДНК антител, полученных от нативных В-лимфоцитов, и не предполагает генетических модификаций, способных привести к появлению антигенных детерминант. Тем не менее, пока еще не зарегистрировано ни одного препарата, антитело для которого было бы получено при помощи гибридомной технологии без дополнительных генетических модификаций. Главной причиной этому является неэффективность гибридизации В-лимфоцитов человека с опухолевым партнером из-за неполного их генетического соответствия, что в итоге приводит к низкому выходу гибридомных клонов и нестабильной антителопродукции.

В 80-х годах прошлого столетия было предпринято немало попыток решить проблему при помощи различных приемов. Было замечено, что стабильность антителопродукции значительно повышается, если в качестве опухолевого партнера использовать гетерогибридому человек-мышь. Был получен целый ряд таких гетерогибридом, и во всех случаях использовали линию мышиной миеломы и опухолевую линию человека. Так были получены линии гетерогибридом SPAZ-4 (Ostberg L, Pursch Е. 1983. Human X (mouse X human) hybridomas stably producing human antibodies. Hybridoma 2:361-367.), SHM-D33 (Teng NN, Lam KS, Calvo Riera F, Kaplan HS. 1983. Construction and testing of mouse-human heteromyelomas for human monoclonal antibody production. Proc Natl Acad Sci USA 80:7308-7312), HMMA 2.5 (Posner MR, Elboim H, Santos D. 1987. The construction and use of a human-mouse myeloma analogue suitable for the routine production of hybridomas secreting human monoclonal antibodies. Hybridoma 6:611-625), K6H6/B5 (Carroll WL, Thielemans K, Dilley J, Levy R. 1986. Mouse x human heterohybridomas as fusion partners with human В cell tumors. J Immunol Methods 89:61-72.), SPYMEG (Ogura M, Morishima Y, Ohno R, Kato Y, Hirabayashi N, Nagura H, Saito H. 1985. Establishment of a novel human megakaryoblastic leukemia cell line, MEG-01, with positive Philadelphia chromosome. Blood 66:1384-1392.), B6B11 и MFP-2 (Kalantarov GF, Rudchenko SA, Lobel L, Trakht I. 2002. Development of a fusion partner cell line for efficient production of human monoclonal antibodies from peripheral blood lymphocytes. Hum Antibodies 11:85-96.). Также во всех этих случаях для эффективной гибридизации гетеромиеломы с человеческими лимфоцитами последние трансформировали вирусом Эпштейн-Барр (ВЭБ), что определяло наличие этого вируса в гибридомном продуценте. Контаминация конечного продукта этим онкогенным вирусом может привести к ятрогенному инфицированию и болезням, ассоциированным с ВЭБ, например, инфекционный мононуклеоз и лимфогранулематоз.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения гибридомных моноклональных антител соматической гибридизацией иммунных лимфобластов, получаемых из лимфоидных органов (селезенка, лимфоузлы) и миеломной клеточной линией сходного с лимфобластами генотипа. Генетическое соответствие достигается использованием линейных животных, в противном случае эффективность гибридизации и стабильность антителопродукции гибридом чрезвычайно низки (обзор Microbiol Spectr. 2015 Feb;3(l): AID-0027-2014. Use of Human Hybridoma Technology To Isolate Human Monoclonal Antibodies. Smith SA, Crowe JE Jr.). Такой способ для получения человеческих антител недоступен из-за отсутствия линейности опухолевого партнера и В-лимфоцитов, а также ограниченной доступности человеческих лимфатических органов.

Раскрытие изобретения

Технической проблемой, на решение которой направлено настоящее изобретение является разработка способа получения полностью человеческих антител с аутентичными иммуноглобулиновыми последовательностями и без каких-либо генетических модификаций.

Техническим результатом являются полученные без участия человеческих опухолевых линий и человеческих вирусов гибридомные линии, стабильно продуцирующие человеческие антитела класса IgG желаемой специфичности.

Техническая проблема решается способом получения стабильного продуцента человеческого антитела класса IgG, представляющего собой гибридому (триому): мышиная миелома - человеческий лимфоцит - человеческий лимфоцит, при этом продуцент получают соматической гибридизацией гетерогибридомы человек-мышь и лимфобластов человека, полученных из зрелых В-лимфоцитов человека, с последующим отбором и наработкой гибридомных клонов, секретирующих иммуноглобулины человека класса IgG требуемой специфичности, выделение полученных антител. В частности, гетерогибридому человек-мышь получают методом соматической гибридизации мышиной линии P3/NSI/1-Ag4-1 [NS-1] (АТСС® ТГВ-18™) и В-лимфоцитов периферической крови человека при помощи ПЭГ4000. В-лимфоциты из периферической крови человека выделяют любым известным из уровня техники способом, например при помощи коммерческого набора RosetteSep Human В cell Enrichment Cocktail (StemCell, США), затем выделенные В-лимфоциты культивируют в присутствии ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ10, митогена poke weed (Phytolacca americana). Гибриды (гетерогибридомы) отбирают на селективной среде с ГАТ (гуанин-аминоптерин-тимидин) и тестируют на присутствие в культуральной жидкости человеческих антител класса IgG. Гетерогибридомы культивируют, контролируя продукцию антител любым подходящим для этого методом, в частности методом иммуноферментного анализа. Клон гетергибридомы, дольше остальных сохранявший продукцию антител, нарабатывают в присутствии 8-азагуанина. 8-азагуанин добавляют в соответствии с рекомендациями производителя для восстановления чувствительности ГАТ (гуанин-аминоптерин-тимидин).

Для получения зрелых дендритных клеток человека из периферической крови человека выделяют моноциты любым известным из уровня техники способом, например, при помощи коммерческого набора RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (StemCell, США). Моноциты культивируют в присутствии ГМКСФ и ИЛ4, при этом моноциты превращаются в незрелые дендритные клетки. К этим клеткам добавляют антиген (иммуноген), к которому желают получить антитело, например, гликопротеин Ж вируса бешенства либо антирабическую вакцину Рабипур. Культивируют в течение времени, необходимого для созревания дендритных клеток под действием антигена, как правило в течение 1 суток. За это время незрелые дендритные клетки нагружаются антигеном и превращаются в зрелые дендритные клетки.

Для получения зрелых В-лимфоцитов человека требуются стимулированные CD4+ Т-лимфоциты. CD4+ Т-лимфоциты выделяют из периферической крови человека любым известным из уровня техники способом, например, при помощи коммерческого набора RosetteSep Human CD4+ Т cell Enrichment Cocktail (StemCell, США). Выделенные CD4+ T-лимфоциты стимулируют при помощи дендритных клеток, нагруженных антигеном. Культивируют в течение времени необходимого для стимуляции CD4+ Т-лимфоцитов дендритными клетками, как правило в течение 4 часов. В-лимфоциты выделяют из периферической крови человека любым подходящим для этого способом, например, при помощи коммерческого набора RosetteSep Human В cell Enrichment Cocktail (StemCell, США). Добавляют антиген, культивируют в течение времени необходимого для первичной стимуляции В-лимфоцитов, ориентировочно в течение 8 часов. К В-лимфоцитам добавляют стимулированные CD4+ Т-лимфоциты, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ10 и культивируют до созревания или в течение времени необходимого для полного созревания В-лимфоцитов, ориентировочно 4-5 суток). К полученным зрелым В-лимфоцитам, добавляют митоген и культивируют в течение времени необходимого для превращения зрелых В-лимфоцитов в лимфобласты (прохождения бласттрансформации, примерно 3 суток).

Для получения гибридомных клонов полученные лимфобласты подвергают соматической гибридизации с ГАТ-чувствительной гетерогибридомой при помощи ПЭГ4000. Высевают в культуральные 96-луночные планшеты в среде с ГАТ. Через 7-10 дней оценивают количество гибридомных клонов и эффективность гибридизации (отношение выросших клонов к исходному количеству В-лимфоцитов). После гибридизации производят тестирование супернатантов (культуральных жидкостей) выросших гибридомных клонов на содержание в них антител требуемой специфичности. Тестирование может быть проведено методом ИФА или другим подходящим для этого способом. Клоны с наибольшей активностью отбирают для дальнейшей работы (клонирования). Клонирование проводят с целью получения однородной популяции гибридомных клеток, то есть из единственной клетки получают клеточную линию. Клонирование проводят методом предельных разведений или другим подходящим для этого методом. Нарабатывают линии гибридомных клонов, имеющие устойчивую продукцию антител. После каждого пассажа оценивают содержание антител в культуральных жидкостях. Производят криоконсервирование клеточных гибридомных линий.

Выделение антител из культуральных жидкостей гибридом. Клеточную суспензию центрифугируют для осаждения клеток и клеточных фрагментов. Супернатант фильтруют, полученные антитела выделяют аффинной хроматографией на белок Ж-сефарозе или другим подходящим для этого способом. Раствор антител диализуют против фосфатного буфера, рН 7,2-7,5, стерилизуют фильтрованием через бактериальный фильтр с размером пор 0,22 мкм, либо добавляют консервант, либо замораживают.

Полученные антитела тестируют по следующим параметрам:

концентрация белка;

относительное содержание в образце;

связывание с антигеном, определяют соответствующие константы;

биологическая активность.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими чертежами.

На фиг. 1 представлены результаты электрофореза 12% SDS-PAGE образцов антител в восстанавливающих условиях.

Осуществление изобретения

Ниже представлено более детальное описание заявляемого способа, которое не ограничивает объем притязаний заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.

Для реализации заявляемого способа были использованы:

1. гетерогибридома (триома) человек мышь, что существенно повысило эффективность гибридизации и стабильность получаемых гибридом. Данная гетерогибридома была получена методом гибридомной технологии путем соматической гибридизации коммерчески доступной ГАТ (гуанин-аминоптерин-тимидин) чувствительной мышиной линии P3/NSI/1-Ag4-1 [NS-1] (АТСС® TIB-18™) и В-лимфоцитов периферической крови человека, предварительно стимулированных in vitro при помощи цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-6, митогена и иммуногена. Подобный метод описан в работе [Усовершенствованная технология получения моноклональных антител для определения трансфузионно опасных антигенов эритроцитов. Хлябич Г.Н., Дубинкин И.В., Донсков С.И., Суханов Ю.С., Персанова Л.В. Вестник службы крови России. 2010. №1. С. 5-9; KOHLER G; MILSTEIN С: "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of pre-defined specificity", NATURE, vol. 256, 1975, pages 495 - 7].

На селективной среде с ГАТ был отобран гибридомный клон с наибольшей продолжительностью продукции человеческого IgG1 (Hybrid Hybridomics. 2004 Dec; 23(6):362-7. Sensitive detection of human IgG in ELISA using a monoclonal anti-IgG-peroxidase conjugate. Chevrier MC, Lemieux R.). После потери антителопродукции гетерогибридому культивировали в присутствии 8-азагуанина (Sigma, США) для восстановления чувствительности к ГАТ. Через 2 месяца культивирования с 8-азагуанином чувствительность гетерогибридомы к ГАТ была полностью восстановлена. Теоретически таким способом может быть получена гетерогибридома мышиной миеломы NS1 с В-лимфоцитом любой видовой принадлежности.

2. мононуклеарные клетки периферической крови человека. Для эффективной гибридизации требуются лимфобласты, которых обычно в периферической крови практически нет. Лимфобласты, специфичные к желаемому антигену, были получены в 2 этапа: получение зрелых В-лимфоцитов и их бласттрансформация.

Зрелые В-лимфоциты получали следующим образом: из цельной крови человека выделяли субпопуляцию моноцитов при помощи коммерческого набора и получали из них незрелые дендритные клетки культивированием в присутствии гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующего фактора (ГМКСФ) и ИЛ4 (Патент WO 2011095592 А1 In vitro process for the preparation of antibodies of the igg type). После стимуляции антигеном незрелые дендритные клетки превращались в зрелые и могли участвовать в стимуляции В-лимфоцитов в качестве антиген-презентирующих клеток. Затем из цельной крови того же донора при помощи коммерческого набора получали CD4+ Т-лимфоциты, их инкубировали с зрелыми дендритными клетками для получения стимулированных Т-лимфоцитов. В-лимфоциты также выделяли из цельной крови аутологичного донора и стимулировали добавлением антигена (Патент WO 2011095592 А1). Для окончательного созревания В-лимфоциты культивировали в присутствии зрелых дендритных клеток, стимулированных CD4+ Т-лимфоцитов и цитокинов ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6 и ИЛ10 в течение 5 суток. При этом наблюдали клеточную пролиферацию и формирование клеточных синапсов.

Зрелые В-клетки непригодны для получения гибридом, поэтому их превращали в лимфобласты при помощи коммерчески доступного митогена лаконоса американского, культивируя их в его присутствии еще 3 суток. Пролиферация в присутствии митогена продолжилась, таким образом из 10 мл донорской крови и без участия онкогенных вирусов получали лимфобласты, количество которых было достаточно для получения гибридом.

Гибридизацию проводили по стандартному протоколу с использованием полиэтиленгликоля 4000. Клетки высевали на фидерный слой перитонеальных клеток мыши в полной ростовой среде DMEM с добавлением 8% телячьей фетальной сыворотки и ГАТ. Супернатанты тестировали иммуноферментным анализом, отбирали клоны, секретирующие антитела класса IgG к требуемому антигену, клонировали методом предельных разведений и нарабатывали в культуральных флаконах, контролируя антителопродукцию. Из культуральных жидкостей антитела выделяли аффинной хроматографией на белок Ж-сефарозе, определяли их концентрацию и активность в ИФА. Дополнительно определяли биологическую активность антител.

Заявленным способом можно получать антитела любой видовой принадлежности, например, лошади, собаки, кошки и других млекопитающих. (Но это только теоретически, мы не пробовали). Для этого требуется мышиная миелома и цитокины этой видовой принадлежности, если они видоспецифичны.

Для реализации заявляемого способа могут быть использованы любые миеломные линии (Усовершенствованная технология получения моноклональных антител для определения трансфузионно опасных антигенов эритроцитов. Хлябич Г.Н., Дубинкин И.В., Донсков С.И., Суханов Ю.С., Персанова Л.В. Вестник службы крови России. 2010. №1. С. 5-9).

Таким образом, использование гетерогибридомы в качестве опухолевого партнера обеспечивает стабильную антителопродукцию результирующей гибридомы. Разнесение во времени процессов созревания В-лимфоцитов in vitro и превращение их в лимфобласты позволило сначала получить полноценные зрелые В-лимфоциты, а потом превратить их в пригодные для гибридизации лимфобласты, что привело к получению множества первичных IgG-продуцирующих гибридомных клонов.

Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.

Пример 1. Получение гибридомы, стабильно продуцирующей человеческое моноклональное антитело против гликопротеина G вируса бешенства.

Процедуру in vitro стимуляции В-лимфоцитов проводили следующим образом: ранее выделенные из крови моноциты (300 тысяч клеток) размораживали, сеяли в лунки 6-луночного культурального планшета в присутствии 800 МЕ/мл ГМКСФ и 500 МЕ/мл ИЛ4, культивировали в течение 5 суток в безбелковой среде для дендритных клеток CellGro DC производства CellGenix GMP, Германия. В результате культивирования моноциты приобрели морфологию незрелых дендритных клеток. Затем добавили вакцину Рабипур до конечного разведения 1:200 и культивировали еще в течение 24 часов. К концу срока культивирования клетки приобрели морфологию зрелых дендритных клеток. Пролиферации или существенной гибели клеток при этом не наблюдали, соответственно, было получено около 300 тысяч зрелых дендритных клеток, нагруженных антигенами вируса бешенства.

Из 10 мл крови аутологичного донора выделили В-лимфоциты и из 5 мл крови CD4+ Т-лимфоциты, для выделения использовали наборы для выделения CD4+ Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов производства RosetteSep (STEMCELL TECHNOLOGIES INC, США). В результате было получено 2 млн CD4+ Т-лимфоцитов и 1,8 млн В-лимфоцитов. Выделенные В-лимфоциты культивировали в среде CellGro DC в течение 8 часов с антирабической вакциной Рабипур в конечном разведении 1:200. К CD4+ Т-лимфоцитам добавляли зрелые дендритные клетки, снятые с поверхности флакона клеточным скребком, и культивировали в среде CellGro DC в течение 4 часов. Затем стимулированные вирусными частицами В-лимфоциты переносили к стимулированным CD4+ Т-лимфоцитам и добавляли цитокины ИЛ-2 до конечной концентрации 20 ед/мл, ИЛ-4 до конечной концентрации 500 ед/мл, ИЛ-6 до конечной концентрации 1800 ед/мл, ИЛ-10 до конечной концентрации 2 ед/мл. Культивировали в течение 5 суток. За это время клетки образовали крупные клеточные синапсы, видимые невооруженным глазом, общее количество клеток возросло в десятки раз, что свидетельствует об их активной пролиферации и клональной экспансии.

Для перевода зрелых В-лимфоцитов в стадию лимфобластов по истечении 5 суток добавляли митоген Phytolacca americana и инкубировали еще 3 суток. При этом наблюдали дальнейшую пролиферацию клеток. Морфологию получившихся клеток не изучали, поскольку практически все лимфоциты и лимфобласты находились в составе плотных клеточных синапсов. Половину всех клеток заморозили, другую половину подвергли процедуре гибридизации с гетерогибридомой мышь-человек с использованием полиэтиленгликоля 4000. Гибридизованные клетки высевали на 96-луночные культуральные планшеты в полной ростовой среде DMEM в присутствии гипоксантина-аминоптерина-тимидина (ГАТ) с предварительно посеянными на них перитонеальными клетками мыши. Рост гибридомных клонов регистрировали при помощи микроскопа, всего было получена порядка 1-2 тысяч гибридомных клонов. Считается, что при успешной гибридизации лимфобластов и миеломных клеток от животных одной линии эффективность гибридизации составляет 1:10⁴ клеток, то есть один жизнеспособный гибрид получается из 10000 исходных клеток. Учитывая, что всего было выделено 1,8 млн В-лимфоцитов человека, в процессе in vitro иммунизации их количество увеличилось в 20-30 раз, и была использована половина полученных клеток, то общее количество гибридом должно составить порядка 2-3 тысяч или 20-30 клонов в лунке при посеве на один планшет. Таким образом, эффективность гибридизации оказалась сравнима с эффективностью при получении мышиных гибридом.

Пример 2. Тестирование супернатантов гибридом, продуцирующих человеческие антитела против вируса бешенства

Для отбора клонов, секретирующих антитела класса IgG против вируса бешенства, использовали следующую схему иммуноферментного анализа: в лунки планшета для ИФА иммобилизовали мышиное антитело против G1 тяжелой цепи иммуноглобулинов человека 2С11, 5 мкг/мл, затем инкубировали с гибридомными супернатантами, разведенными пополам с PBS-AT, после отмывки инкубировали с антирабической вакциной Рабипур, разведенной 1:25 в PBS-AT, затем с мышиным антителом против вируса бешенства 1С5, конъюгированным с пероксидазой. Таким образом, иммобилизованные антитела 2С11 связывают из супернатантов человеческие иммуноглобулины класса IgG1; среди них антитела, специфичные к вирусу бешенства, связывают из раствора вакцины вирусные частицы; с этими частицами в свою очередь связываются мышиные антитела 1С5, несущие на себе ферментную метку. При такой схеме сигнал появляется только в том случае, если в супернатанте содержится антитело против вирусной частицы класса IgG1. Результаты тестирования показали, что в большинстве лунок планшета находились клоны, продуцирующие антитела против вируса бешенства. (Таблица 1).

Пример 3. Наработка гибридомных клонов RabD4 и Rab5G6.

Гибридомные клоны RabD4 и Rab5G6, секретирующие антитела против вируса бешенства, культивировали более 3 месяцев, проведя не менее 10 пассажей. Антителопродукцию каждого пассажа контролировали методом ИФА с использованием серийных 2-кратных разведений супернатантов (Таблицы 2 и 3). Уровень антителопродукции практически не менялся от пассажа к пассажу для клона Rab5G6 и несколько возрастал для клона RabD4.

Всего было наработано 350 мл супернатанта клона RabD4 и 450 мл супернатанта клона Rab5G6. Антитела были выделены из супернатантов методом аффинной хроматографии на колонке с белок G - сефарозой (GE Healthcare, №17-0618-05). Выход антител из 1 мл культуральной жидкости составил 0,47 мг для клона RabD4 и 0,57 мг для клона RabG6. Анализ образцов антител проводили методом электрофореза в 12% ПААГ фиг. 1).

Пример 4. Анализ биологической активности гибридомных человеческих антител RabD4 и Rab5G6.

Наибольшую ценность имеют антитела к вирусу бешенства, обладающие вирус-нейтрализующей активностью. Нейтрализующую активность оценивали методом FAVN. Антитела инкубировали с вирусом бешенства штамма CVS11, затем добавляли к клеткам ВНК-21 С13. По включению вирусных частиц в цитоплазму клеток определяли нейтрализующую активность антител в сравнении с международным стандартом ВОЗ International Laboratory For Biological Standards, Copengagen, Denmark: Second International Standard for Rabies Immunoglobulin, и европейским стандартом European Pharmacopoeia Reference Standard Human rabies immunoglobulin BPR, Strasburg. По результатам анализа было установлено, что антитело RabD4 обладает высокой нейтрализующей активностью 305,7 МЕ/мг, тогда как антитело Rab5G6 нейтрализующей активности не проявило.

Таким образом, разработан способ получения полностью человеческих антител с аутентичными иммуноглобулиновыми последовательностями и без каких-либо генетических модификаций, т.к. не предполагает манипуляций с генетическим материалом клеток (выделение ДНК или РНК, амплификация, конструирование векторов и т.д.,), а также полученные заявляемым способом гибридомные линии, стабильно продуцируют человеческие антитела класса IgG желаемой специфичности.

1. Способ получения человеческого антитела класса IgG, с аутентичными иммуноглобулиновыми последовательностями человека, продуцируемого гибридомой (триомой): мышиная миелома - человеческий лимфоцит - человеческий лимфоцит, характеризующийся тем, что продуцент получают соматической гибридизацией гетерогибридомы человек-мышь P3/NSI/1-Ag4-1 [NS-1] (АТСС^® TIB-18^™) и лимфобластов человека, полученных из зрелых В-лимфоцитов, предварительно стимулированных in vitro митогеном, с последующим отбором и наработкой гибридомных клонов, секретирующих иммуноглобулины человека класса IgG требуемой специфичности, выделением полученных антител, при этом стимуляцию В-лимфоцитов периферической крови человека in vitro проводят путем добавления стимулированных CD4+ Т-лимфоцитов, при помощи цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10, и зрелых нагруженных антигеном дендритных клеток человека и CD4+ Т-лимфоцитов человека, затем проводят культивирование до созревания В-лимфоцитов в течение 4-5 суток, а зрелые дендритные клетки получают из моноцитов периферической крови человека при помощи ГМКСФ, ИЛ-4 и иммуногена, а превращение зрелых В-лимфоцитов в лимфобласты составляет 3 суток.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве митогена используют лектин из лаконоса американского.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве иммуногена используют белок или белковый комплекс, против которого желают получить антитело.