Рекомбинантное получение стевиол-гликозидов

Изобретение относится к области области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ получения соединения стевиол–гликозида или композиции стевиол–гликозидов, соединение ребаудиозида Z2, подсластитель, содержащий вышеуказанное соединение ребаудиозид Z2, и применение подсластителя в пищевом продукте. В одном из вариантов реализации ребаудиозид Z2 имеет структуру, представленную формулой:

.

Изобретение расширяет арсенал средств стевиол–гликозидов и способов их получения для использования в пищевой промышленности. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр., 14 ил.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США 61/898,571, поданной 1 ноября 2013 года, которая настоящим полностью включена посредством отсылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[2] Бумажная копия Списка последовательностей и машиночитаемая форма последовательности, содержащая файл под названием 32559-17_ST25.txt, который имеет размер 46751 байт (согласно измерению в Microsoft WINDOWS® Explorer), представлена в настоящей заявке и включена посредством отсылки. Указанный Список последовательностей состоит из SEQ ID NO: 1-12.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[3] Настоящее описание в целом относится к биосинтезу стевиол-гликозидов. В частности, настоящее описание относится к рекомбинантному полипептиду, который катализирует продукцию стевиол-гликозидов, таких как ребаудиозид D, ребаудиозид E и новый ребаудиозид (ребаудиозид Z).

[4] Стевиол-гликозиды представляют собой природные продукты, выделенные из листьев Stevia rebaudiana, и широко применяются в качестве высокоинтенсивных, низкокалорийных подсластителей. Природные стевиол-гликозиды имеют одинаковую основную структуру (стевиол) и отличаются содержанием углеводных остатков (например, остатки глюкозы, рамнозы и ксилозы) в положениях C13 и C19. Стевиол-гликозиды с известной структурой включают стевиозид, ребаудиозид A, ребаудиозид B, ребаудиозид C, ребаудиозид D, ребаудиозид E, ребаудиозид F и дулькозид A.

[5] В пересчете на сухой вес стевиозид, ребаудиозид A, ребаудиозид C и дулькозид A составляют 9,1, 3,8, 0,6 и 0,3% от общего веса стевиол-гликозидов в листьях, соответственно, в то время как другие стевиол-глюкозиды присутствуют в намного более низком количестве. Экстракты из растения Stevia rebaudiana доступны коммерчески и обычно содержат стевиозид и ребаудиозид в качестве основных соединений. Другие стевиол-гликозиды обычно присутствуют в экстракте стевии в качестве минорных компонентов. Например, количество ребаудиозида A в коммерческих препаратах может изменяться от приблизительно 20% до более чем 90% от общего количества содержащихся стевиол-гликозидов, тогда как количество ребаудиозида B может составлять приблизительно 1-2%, количество ребаудиозида C может составлять приблизительно 7-15%, и количество ребаудиозида D может составлять приблизительно 2% от общего количества стевиол-гликозидов.

[6] Как натуральные подсластители, различные стевиол-глюкозиды имеют различные уровни сладости и послевкусие. Сладость стевиол-гликозидов значительно превышает сладость сахарозы. Например, стевиозид в 100-150 раз слаще сахарозы и имеет горькое послевкусие, тогда как ребаудиозид A и E в 250-450 раз слаще сахарозы и их послевкусие намного лучше, чем у стевиозида. Соответственно, на вкусовой профиль любого экстракта стевии существенно влияет относительное содержание стевиол-гликозидов в экстракте, на которое в свою очередь может влиять источник растения, факторы окружающей среды (такие как состав почвы и климат) и процесс экстракции. В частности, изменения условий экстракции могут привести к непостоянному содержанию стевиол-гликозидов в экстрактах стевии, в результате чего вкусовой профиль различается у разных партий продуктов экстракции. На вкусовой профиль экстрактов стевии также могут влиять содержащиеся в растении примеси (такие как пигменты, липиды, белки, фенольные соединения и сахариды), которые остаются в продукте после процесса экстракции. Такие примеси обычно имеют посторонние привкусы, нежелательные в случае применения экстракта стевии в качестве подсластителя.

[7] Большинство стевиол-гликозидов образуются в результате нескольких реакций гликозилирования стевиола, которые обычно катализируют УДФ-гликозилтрансферазы (УГТ) при использовании уридин-5’-дифосфоглюкозы (УДФ-глюкозы) в качестве донора сахарной группы. В растениях УГТ представляют крайне неоднородную группу ферментов, которые переносят остаток глюкозы от УДФ-глюкозы к стевиолу. Стевиозид является промежуточным соединением в биосинтезе ребаудиозидных соединений. Например, гликозилирование C-3’ C-13-O-глюкозы стевиозида дает ребаудиозид A; а гликозилирование C-2’ 19-O-глюкозы стевиозида дает ребаудиозид E. Дальнейшее гликозилирование ребаудиозида A (по 19-O-глюкозе) или ребаудиозида E (по C-13-O-глюкозе) дает ребаудиозид D (Фигура 1).

[8] Практический подход к улучшению вкусовых качеств экстракта стевии состоит в повышении выхода ребаудиозидных соединений в результате дальнейшего гликозилирования стевиозида. УГТ с 1,2-19-O-глюкоза гликозилирующей активностью являются важными ферментами для получения ребаудиозида D и E.

[9] Сахарозосинтазы (СС) катализируют превращение УДФ в УДФ-глюкозу в присутствии сахарозы. Таким образом, для реакции гликозилирования, использующей УДФ-глюкозу (такой как реакции, катализируемые УГТ), СС может использоваться для регенерации УДФ-глюкозы из УДФ, повышая эффективность такой реакции (Фигура 2).

[10] Таким образом, существует потребность в стевиол-гликозидах с постоянным вкусовым профилем и менее интенсивным посторонним привкусом, чем у существующих коммерческих продуктов. Как описано в настоящей заявке, в настоящем описании предложен рекомбинантный полипептид, который может применяться для получения стевиол-гликозидов (таких как ребаудиозид D и ребаудиозид E). В настоящем описании также предложен способ получения композиции стевиол-гликозида (ребаудиозида Z) с применением такого рекомбинантного полипептида.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[11] Рассматриваемая технология в общем относится к рекомбинантным полипептидам, которые обладают активностями УДФ-гликозилтрансферазы. В частности, предложены полипептиды, обладающие 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующей активностью в отношении стевиол-гликозидных соединений. В одном аспекте рассматриваемая технология относится к рекомбинантному полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO:6. В примере осуществления аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида, описанного в настоящей заявке, обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с SEQ ID NO:6.

[12] В другом аспекте рассматриваемая технология относится к выделенной нуклеиновой кислоте, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный полипептид, описанный в настоящей заявке. В другом аспекте рассматриваемая технология относится к вектору, включающему нуклеиновую кислоту, описанную в настоящей заявке, и клетке-хозяину, включающей вектор, описанный в настоящей заявке. В примере осуществления клетка-хозяин рассматриваемой технологии выбрана из группы, состоящей из клетки бактерий, дрожжей, нитчатых грибов, цианобактерий и растений.

[13] В другом аспекте рассматриваемая технология также относится к способу получения композиции стевиол-гликозида, включающему инкубирование субстрата (такого как стевиозид, ребаудиозид A, ребаудиозид E или их комбинация) с рекомбинантным полипептидом, включающим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO:6. В примере осуществления аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида, применяемого в способе, описанном в настоящей заявке, обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с SEQ ID NO:6.

[14] В другом аспекте рассматриваемая технология также относится к способу получения композиции стевиол-гликозида, включающему инкубирование субстрата (такого как стевиозид и ребаудиозид E) с рекомбинантным полипептидом, включающим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO:11. В примере осуществления аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида, применяемого в способе, описанном в настоящей заявке, обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с SEQ ID NO:11.

[15] В одном варианте осуществления способ дополнительно включает инкубирование рекомбинантной сахарозосинтазы (такой как сахарозосинтаза с аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью AtSUS1, представленной в SEQ ID NO:9) с субстратом и рекомбинантным полипептидом, описанным в настоящей заявке. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает инкубирование рекомбинантной УДФ-гликозилтрансферазы (такой как УДФ-гликозилтрансфераза с аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью UGT76G1, представленной в SEQ ID NO:11) с рекомбинантной сахарозосинтазой, субстратом и рекомбинантным полипептидом, описанным в настоящей заявке. В другом варианте осуществления способ, описанный в настоящей заявке, включает инкубирование субстрата с клеткой-хозяином, экспрессирующей рекомбинантный полипептид.

[16] Рассматриваемая технология также относится к новому стевиол-гликозиду, называемому ребаудиозид Z, который отличается временем удержания приблизительно 6,68 минут на ВЭЖХ при условиях, описанных в настоящей заявке. Рассматриваемая технология также относится к способу получения ребаудиозида Z, описанного в настоящей заявке, включающему инкубирование субстрата с рекомбинантным полипептидом, включающим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO:6. При использовании в настоящем описании, термины "ребаудиозид Z" или "Reb Z" относятся к смеси соединений, в частности смеси ребаудиозида Z1 ("Reb Z1") и ребаудиозида Z2 ("Reb Z2").

[17] В одном варианте осуществления настоящее описание также направлено на способ синтеза ребаудиозида Z из ребаудиозида E. Способ включает: получение реакционной смеси, включающей ребаудиозид E, субстрат, выбранный из группы, состоящей из сахарозы, уридиндифосфата (УДФ) и уридиндифосфат-глюкозы (УДФ-глюкозы), и HV1, и сахарозосинтазу, инкубирование реакционной смеси в течение времени, достаточного для получения ребаудиозида Z, где глюкоза ковалентно присоединяется к ребаудиозиду E с получением ребаудиозида Z, глюкоза ковалентно присоединяется к C2’-13-O-глюкозе ребаудиозида E с получением ребаудиозида Z1, и глюкоза ковалентно присоединяется к C2’-19-O-глюкозе ребаудиозида E с получением ребаудиозида Z2.

[18] В одном варианте осуществления соединение ребаудиозид Z является ребаудиозидом Z1 (Reb Z1), имеющим следующую структуру:

.

[19] В одном варианте осуществления соединение ребаудиозид Z является ребаудиозидом Z2 (Reb Z2), имеющим следующую структуру:

.

[20] Как описано в настоящей заявке, рекомбинантные полипептиды согласно настоящей технологии могут использоваться для разработки биосинтетического способа получения стевиол-гликозидов, которые обычно мало распространены в природных источниках, например, ребаудиозида D и ребаудиозида E. Таким образом, настоящая технология также обеспечивает композицию стевиол-гликозида, полученную биосинтетическим способом, описанным в настоящей заявке. Такая композиция может включать стевиол-гликозидное соединение, выбранное из группы, состоящей из ребаудиозида D, ребаудиозида E, нового ребаудиозида (указанного в настоящей заявке как "ребаудиозид Z" и "Reb Z") и их комбинаций. Кроме того, также предложен подсластитель, включающий композицию стевиол-гликозидов, описанную в настоящей заявке.

[21] В одном варианте осуществления настоящее описание направлено на подсластитель, включающий соединение, имеющее следующую химическую структуру:

.

[22] В другом варианте осуществления подсластитель включает соединение, имеющее следующую химическую структуру:

.

[23] Настоящее описание также направлено на применение подсластителей в потребительских продуктах, таких как напитки, кондитерские изделия, хлебобулочные изделия, печенье и жевательные резинки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[24] Описание будет более понятным, и особенности, аспекты и преимущества, помимо представленных выше, станут ясны при рассмотрении их подробного описания, следующего далее. Такое подробное описание ссылается на следующие чертежи, где:

[25] Фигура 1 является схемой, на которой показаны пути биосинтеза стевиол-гликозида из стевиозида. Как описано в настоящей заявке, рекомбинантный полипептид HV1 ("HV1") содержит 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующую активность, которая переносит вторую сахарную группу на C-2’ 19-O-глюкозы стевиозида с получением ребаудиозида E ("Reb E") или, аналогично, с получением ребаудиозида D ("Reb D") из ребаудиозида A ("Reb A"). На Фигуре 1 также показано, что рекомбинантный фермент UGT76G1 ("UGT76G1", отличающийся от рекомбинантного полипептида HV1) катализирует реакцию, которая переносит сахарную группу на C-3’ C-13-O-глюкозы стевиозида с получением ребаудиозида A или, аналогично, с получением ребаудиозида D из ребаудиозида E.

[26] На Фигуре 2 показана примерная схема комбинированной реакционной системы УДФ-гликозилтрансферазы ("УГТ") и сахарозосинтазы ("СС"). В Реакции 1 показана катализируемая УГТ реакция, превращающая ребаудиозид A ("Reb A") в ребаудиозид D ("Reb D"), в которой УДФ-глюкоза используется в качестве донора глюкозы и приводит к получению УДФ. В Реакции 2 показана катализируемая СС реакция, превращающая УДФ в УДФ-глюкозу, в которой сахароза используется в качестве донора глюкозы. В Реакции 2 также показано, что катализируемая СС реакция может быть объединена с реакцией, катализируемой УГТ.

[27] На Фигуре 3 показано in vitro получение ребаудиозида D ("Reb D") из ребаудиозида ("Reb A"), катализируемое рекомбинантным полипептидом HV1 (SEQ ID NO:6) и рекомбинантной AtSUS1 (SEQ ID NO:9) в комбинированной реакционной системе HV1-AtSUS1, как описано в настоящей заявке. На Фигуре 3A показаны стандарты стевиозида ("Ste"), Ребаудиозида A ("Reb A") и Ребаудиозида D ("Reb D"). Результаты на 6, 9, 12 и 24 часа показаны на Фигурах 3B-E, соответственно. Результаты реакции без рекомбинантной AtSUS1 (то есть некомбинированной реакции) на 12 и 24 часа показаны на Фигурах 3F и 3G, соответственно.

[28] На Фигуре 4 показано in vitro получение ребаудиозида E ("Reb E") из стевиозида, катализируемое рекомбинантным полипептидом HV1 (SEQ ID NO:6) и рекомбинантной AtSUS1 (SEQ ID NO:9) в комбинированной реакционной системе HV1-AtSUS1, как описано в настоящей заявке. На Фигуре 4A показаны стандарты стевиозида ("Ste"), Ребаудиозида A ("Reb A") и Ребаудиозида D ("Reb D"). Результат на 20 часов показан на Фигурах 4B, который включает соединение ребаудиозид Z ("Reb Z").

[29] На Фигуре 5 показано in vitro получение ребаудиозида D ("Reb D") из стевиозида, катализируемое комбинацией рекомбинантного полипептида HV1 (SEQ ID NO:6), рекомбинантной UGT76G1 (SEQ ID NO:11) и рекомбинантной AtSUS1 (SEQ ID NO:9). На Фигуре 5A показаны стандарты стевиозида ("Ste"), Ребаудиозида A ("Reb A") и Ребаудиозида D ("Reb D"). Результаты на 6, 9, 12 и 24 часов показаны на Фигурах 5B-E, соответственно.

[30] На Фигуре 6 показан электрофоретический анализ в ДСН-ПААГ очищенного рекомбинантного полипептида HV1.

[31] На Фигуре 7 показан электрофоретический анализ в ДСН-ПААГ очищенного рекомбинантного полипептида AtSUS1.

[32] На Фигуре 8 показано in vitro получение ребаудиозида Z ("Reb Z") из ребаудиозида E ("Reb E"), катализируемое рекомбинантным полипептидом HV1 (SEQ ID NO:6) и рекомбинантной AtSUS1 (SEQ ID NO:9) в комбинированной реакционной системе HV1-AtSUS1, как описано в настоящей заявке. На Фигуре 8A показаны стандарты ребаудиозида E ("Reb E"). Результат на 24 часа показан на Фигурах 8B, который включает соединение ребаудиозид Z ("Reb Z").

[33] На Фигуре 9 показан электрофоретический анализ в ДСН-ПААГ очищенного рекомбинантного полипептида UGT76G1.

[34] Фигура 10: Структуры Ребаудиозида Z (включая Reb Z1 и Reb Z2) и Ребаудиозида E.

[35] Фигура 11: Ключевые TOCSY и HMBC корреляции Reb Z1 и Reb Z2.

[36] Фигура 12: показано in vitro получение ребаудиозида D ("Reb D") из ребаудиозида E ("Reb E"), катализируемое рекомбинантной UGT76G1 (SEQ ID NO:11). На Фигуре 12A-12B показаны стандарты Ребаудиозида E ("Reb E"), Ребаудиозида D ("Reb D"). Показаны результаты реакции без рекомбинантной AtSUS1 (Фигура 12C) (то есть некомбинированной реакции) и с рекомбинантной AtSUS1 (Фигура 12D) (то есть комбинированной УГТ-СС реакции) на 6 часов, соответственно.

[37] Хотя в отношении настоящего описания допускаются различные модификации и альтернативные формы, определенные варианты его осуществления показаны в качестве примера на чертежах и подробно описаны ниже. Впрочем, следует понимать, что описание конкретных вариантов осуществления не должно ограничивать описание и охватывает все модификации, эквиваленты и альтернативы, включенные в сущность и объем описания, как определено прилагаемой формулой изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[38] Рассматриваемая технология обеспечивает рекомбинантный полипептид, который обладает УДФ-гликозилтрансферазной активностью, такой как 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующая активность и 1,2-13-O-глюкоза-гликозилирующая активность, для синтеза стевиол-гликозидов. Рекомбинантный полипептид рассматриваемой технологии (который в дальнейшем может также именоваться как "рекомбинантный полипептид HV1") может применяться для биосинтеза стевиол-гликозидных соединений. В настоящем описании УДФ-гликозилтрансфераза (УГТ) относится к ферменту, который переносит остаток сахара с активированной донорной молекулы (обычно УДФ-глюкозы) на акцепторную молекулу. 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующая активность относится к ферментной активности, которая переносит сахарную группу на C-2’ 19-O-глюкозной группы стевиозида, ребаудиозида A или ребаудиозида E (Фигура 1 и Фигура 10). 1,2-13-O-глюкоза-гликозилирующая активность относится к ферментной активности, которая переносит сахарную группу на C-2’ 13-O-глюкозной группы ребаудиозида E (Фигура 10).

[39] Названия УГТ ферментов, используемые в настоящем описании, соответствуют системе номенклатуры, принятой Комитетом по номенклатуре УГТ (Mackenzie et al., "The UDP glycosyltransferase gene super family: recommended nomenclature updated based on evolutionary divergence", Pharmacogenetics, 1997, vol. 7, pp. 255-269), которая классифицирует гены УГТ комбинацией номера семейства, буквы, обозначающей подсемейство, и номера индивидуального гена. Например, название "UGT76G1" соответствует ферменту УГТ, кодируемому геном, который относится к семейству УГТ номер 76 (растительного происхождения), подсемейству G и гену номер 1.

[40] В растениях существует большое семейство генов УГТ. Впрочем, биологические функции большинства этих УГТ остаются неизвестными.

Определения

[41] При использовании в настоящем описании, формы единственного числа включают формы множественного числа, если из текста прямо не следует иное.

[42] В тех случаях, когда термин "включает", "содержит" или подобный используется в описании или формуле изобретения, предполагается, что такой термин является включительным так же, как термин "включать", при интерпретации "включать" при использовании в качестве переходного слова в формуле изобретения.

[43] Слово "примерный" используется в настоящем описании как "служащий в качестве примера, образца или иллюстрации". Любой вариант осуществления, описанный в настоящей заявке как "примерный", не должен обязательно рассматриваться как предпочтительный или преимущественный в отношении других вариантов осуществления.

[44] Термин "комплементарный" должен иметь свое обычное и общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и использоваться без ограничения для описания отношения между нуклеотидными основаниями, которые способны к гибридизации друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, рассматриваемая технология также включает выделенные фрагменты нуклеиновых кислот, которые комплементарны полным последовательностям, представленным в сопровождающем Списке последовательностей, а также те, которые по существу подобны последовательностям нуклеиновых кислот.

[45] Термины "нуклеиновая кислота" и "нуклеотид" должны иметь свои соответствующие обычные и общепринятые значения, известные среднему специалисту в данной области техники, и использоваться без ограничения для обозначения дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов и их полимеров в одно- или в двухцепочечной форме. Если нет специальных ограничений, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают подобными характеристиками связывания, как и референсная нуклеиновая кислота, и метаболизируются аналогично природным нуклеотидам. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также в подразумеваемой форме охватывает соответствующие консервативно модифицированные или вырожденные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также последовательность, указанную в явной форме.

[46] Термин "выделенный" должен иметь свое обычное и общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и при использовании в отношении выделенной нуклеиновой кислоты или выделенного полипептида должен использоваться без ограничения для обозначения нуклеиновой кислоты или полипептида, которые, благодаря человеку, существуют отдельно от своего нативного окружения и поэтому не являются продуктом природы. Выделенная нуклеиновая кислота или полипептид могут существовать в очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, в таком как, например, трансгенная клетка-хозяин.

[47] Термин "инкубирование", при использовании в настоящем описании, означает процесс смешивания двух или более химических или биологических единиц (таких как химическое соединение и фермент) и обеспечения их взаимодействия при условиях, благоприятных для получения композиции стевиол-гликозидов.

[48] Термин "вырожденный вариант" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность остатков, которая отличается от референсной последовательности нуклеиновой кислоты на одну или более вырожденных замен кодонов. Вырожденные замены кодонов могут быть получены при создании последовательностей, в которых третье положение одного или более выбранных (или всех) кодонов заменено смешанным основанием и/или остатками дезоксиинозина. Последовательность нуклеиновой кислоты и все ее вырожденные варианты будут экспрессировать ту же аминокислоту или полипептид.

[49] Термины "полипептид", "белок" и "пептид" должны иметь свое обычное и общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники; эти три термина иногда используются попеременно и используются без ограничения для обозначения полимера из аминокислот или аналогов аминокислот, независимо от его размера или функции. Хотя "белок" часто используется в отношении относительно крупных полипептидов, а "пептид" часто используется в отношении малых полипептидов, применение данных терминов в уровне техники совпадает и изменяется. Термин "полипептид", при использовании в настоящем описании, относится к пептидам, полипептидам и белкам, если не отмечено иное. Термины "белок", "полипептид" и "пептид" используются в настоящем описании попеременно при обозначении продукта полинуклеотида. Таким образом, примерные полипептиды включают продукты полинуклеотидов, природные белки, гомологи, ортологи, паралоги, фрагменты и другие эквиваленты, варианты и аналоги предыдущего.

[50] Термины "полипептидный фрагмент" и "фрагмент", при использовании в отношении референсного полипептида, должны иметь свои обычные и общепринятые значения, известные среднему специалисту в данной области техники, и использоваться без ограничения для обозначения полипептида, в котором аминокислотные остатки удалены по сравнению с референсным полипептидом непосредственно, но где остальная аминокислотная последовательность обычно идентична соответствующим положениям в референсном полипептиде. Такие делеции могут происходить на N-конце или C-конце референсного полипептида или, в альтернативном варианте, на обоих концах.

[51] Термин "функциональный фрагмент" полипептида или белка относится к пептидному фрагменту, который является частью полноразмерного полипептида или белка и обладает по существу такой же биологической активностью или имеет по существу такую же функцию, что и полноразмерный полипептид или белок (например, выполняет такую же ферментативную реакцию).

[52] Термины "вариант полипептида", "модифицированная аминокислотная последовательность" или "модифицированный полипептид", которые используются попеременно, относятся к аминокислотной последовательности, которая отличается от референсного полипептида одной или более аминокислотами, например, одной или более аминокислотными заменами, делециями и/или добавлениями. В одном из аспектов вариант является "функциональным вариантом", который сохраняет некоторые или все свойства референсного полипептида.

[53] Термин "функциональный вариант" также включает консервативно замененные варианты. Термин "консервативно замененный вариант" относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от референсного пептида одной или более консервативными аминокислотными заменами и сохраняет некоторую часть или всю активность референсного пептида. "Консервативная аминокислотная замена" является заменой остатка аминокислоты функционально подобным остатком. Примеры консервативных замен включают замену одного неполярного (гидрофобного) остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другим; замену одного заряженного или полярного (гидрофильного) остатка другим, например, между аргинином и лизином, между глутамином и аспарагином, между треонином и серином; замену одного основного остатка, такого как лизин или аргинин, другим; или замену одного кислотного остатка, такого как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, другим; или замену одного ароматического остатка, такого как фенилаланин, тирозин или триптофан, другим. Такие замены, как ожидают, будут оказывать малое или не оказывать никакого воздействия на кажущуюся молекулярную массу или изоэлектрическую точку белка или полипептида. Фраза "консервативно замененный вариант" также включает пептиды, в которых остаток заменен химически дериватизированным остатком, при условии, что полученный в результате пептид сохраняет некоторую часть или всю активность референсного пептида, как описано в настоящей заявке.

[54] Термин "вариант", применительно к полипептидам рассматриваемой технологии, также включает функционально активный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% и даже на 100% идентична аминокислотной последовательности референсного полипептида.

[55] Термин "гомологичный", во всех его грамматических формах и вариантах написания, относится к зависимости между полинуклеотидами или полипептидами, которые обладают "общим эволюционным происхождением", включая полинуклеотиды или полипептиды из суперсемейств, а также гомологичные полинуклеотиды или белки из различных биологических видов (Reeck и другие, Клетка 50:667, 1987). Такие полинуклеотиды или полипептиды обладают гомологией последовательности, что отражается подобием их последовательностей, либо в процентах идентичности, либо в присутствии определенных аминокислот или мотивов в консервативных положениях. Например, два гомологичных полипептида могут иметь аминокислотные последовательности, которые являются по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% и даже на 100% идентичными.

[56] "Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей" в отношении последовательностей различных полипептидов рассматриваемой технологии определяется как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам референсного полипептида (такого как, например, SEQ ID NO:6), после выравнивания последовательностей и введения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательности.

[57] Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может быть выполнено различными способами, которые известны в уровне техники, например, при использовании общедоступных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники сумеют определить подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, требуемые для получения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Например, % идентичности аминокислотных последовательностей можно определить при использовании программы сравнения последовательностей NCBI-BLAST2. Программа сравнения последовательностей NCBI-BLAST2 может быть загружена с сайта ncbi.nlm.nih.gov. В NCBI BLAST2 используется несколько параметров поиска, где все параметры поиска установлены со значениями по умолчанию, включая, например, unmask yes, strand=all, expected occurrences 10, minimum low complexity length=15/5, multi-pass e-value=0.01, constant for multi-pass=25, dropoff for final gapped alignment=25 и scoring matrix=BLOSUM62. В случаях использования NCBI-BLAST2 для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотных последовательностей для данной аминокислотной последовательности A и данной аминокислотной последовательности B (что можно альтернативно сформулировать как данная аминокислотная последовательность A, которая имеет или включает некоторый % идентичности аминокислотной последовательности по отношению к данной аминокислотной последовательности B) вычисляют следующим образом: 100 умножить на частное X/Y, где X является количеством аминокислотных остатков, оцененных как идентичные совпадения программой выравнивания последовательностей NCBI-BLAST2 при выравнивании с помощью этой программы последовательностей A и B, и где Y является общим количеством аминокислотных остатков в B. Следует понимать, что если длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, % идентичности аминокислотных последовательностей A и B не будет равен % идентичности аминокислотных последовательностей B и A.

[58] В этом смысле методики определения "подобия" аминокислотных последовательностей известны в уровне техники. В общем, "подобие" означает точное сравнение аминокислоты с аминокислотой в двух или более полипептидах в подходящем положении, где аминокислоты идентичны или обладают подобными химическими и/или физическими свойствами, такими как заряд или гидрофобность. При этом между сравниваемыми полипептидными последовательностями может быть определен так называемый "процент подобия". Методики определения идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот также известны в уровне техники и включают определение нуклеотидной последовательности мРНК для данного гена (обычно через промежуточную кДНК) и определение аминокислотной последовательности, кодируемой в ней, и ее сравнение со второй аминокислотной последовательностью. В общем, "идентичность" относится к точному соответствию нуклеотида с нуклеотидом или аминокислоты с аминокислотой в двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностях, соответственно. Две или более полинуклеотидных последовательности можно сравнить при определении их "процента идентичности", как и в случае двух или более аминокислотных последовательностей. Программы, доступные в пакете Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (доступном от Genetics Computer Group, Madison, Wis.), например программа GAP, позволяют вычислять идентичность между двумя полинуклеотидами и идентичность и подобие между двумя полипептидными последовательностями, соответственно. Другие программы для вычисления идентичности или подобия между последовательностями известны специалистам в данной области.

[59] Положение аминокислоты, "соответствующее" референсному положению, является положением, которое выравнивается с референсной последовательностью, как идентифицируют при выравнивании аминокислотных последовательностей. Такие выравнивания могут быть выполнены вручную или при использовании известных программ выравнивания последовательностей, таких как ClustalW2, Blast 2 и т.д.

[60] Если не определено иное, процент идентичности двух полипептидных или полинуклеотидных последовательностей именуется как процент идентичных аминокислотных или нуклеотидных остатков по всей длине более короткой из двух данных последовательностей.

[61] "Кодирующая последовательность" должна иметь свое обычное и общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и использоваться без ограничения для обозначения последовательности ДНК, которая кодирует определенную аминокислотную последовательность.

[62] "Подходящие регуляторные последовательности" должны иметь свое обычное и общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и используются без ограничения для обозначения нуклеотидных последовательностей, которые расположены перед (5’ некодирующие последовательности), в или после (3’ некодирующие последовательности) кодирующей последовательности, и которые влияют на транскрипцию, процессинг РНК или стабильность, или трансляцию связанной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны и последовательности распознавания полиаденилирования.

[63] "Промотор" должен иметь свое обычное и общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и используется без ограничения для обозначения последовательности ДНК, способной регулировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК. В общем, кодирующая последовательность расположена 3’ относительно последовательности промотора. Промоторы могут быть получены полностью из нативного гена или собраны из различных элементов, полученных из различных промоторов, существующих в природе, или даже могут включать синтетические сегменты ДНК. Специалистам в данной области техники известно, что различные промоторы могут направлять экспрессию гена в различных тканях или типах клеток, или на различных стадиях развития, или в ответ на различные условия окружающей среды. Промоторы, которые вызывают экспрессию гена в большинстве типов клеток большую часть времени, обычно называются "конститутивными промоторами". Также известно, что поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей не были полностью определены, фрагменты ДНК различной длины могут обладать идентичной промоторной активностью.

[64] Термин "функционально связанный" относится к ассоциации последовательностей нуклеиновых кислот на одном фрагменте нуклеиновой кислоты, в результате чего на функцию одной из последовательностей влияет другая. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, когда он способен воздействовать на экспрессию данной кодирующей последовательности (то есть кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.

[65] Термин "экспрессия", при использовании в настоящем описании, должен иметь свое обычное и общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и используется без ограничения для обозначения транскрипции и устойчивого накопления смысловой (мРНК) или антисмысловой РНК, полученной из фрагмента нуклеиновой кислоты рассматриваемой технологии. "Оверэкспрессия" относится к синтезу продукта гена в трансгенных или рекомбинантных организмах, уровни продукции которого превышают уровни продукции в нормальных или нетрансформированных организмах.

[66] "Трансформация" должна иметь свое обычное и общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и используется без ограничения для обозначения переноса полинуклеотида в клетку-мишень. Перенесенный полинуклеотид может быть включен в геном или хромосомную ДНК клетки-мишени, что приводит к генетически стабильному наследованию, или он может реплицироваться независимо от хромосом хозяина. Организмы-хозяева, содержащие трансформированные фрагменты нуклеиновых кислот, называются "трансгенными" или "рекомбинантными", или "трансформированными" организмами.

[67] Термины "трансформированный", "трансгенный" и "рекомбинантный", при использовании в настоящем описании в отношении клеток-хозяев, должны иметь свои соответствующие обычные и общепринятые значения, известные среднему специалисту в данной области техники, и используются без ограничения для обозначения клетки организма-хозяина, такой как растительная или микробная клетка, в которую была введена гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно интегрирована в геном клетки-хозяина, или молекула нуклеиновой кислоты может присутствовать как внехромосомная молекула. Такая внехромосомная молекула может быть самореплицирующейся. Трансформированные клетки, ткани или субъекты, как понимают, охватывают не только конечный продукт процесса трансформации, но и его трансгенное потомство.

[68] Термины "рекомбинантный", "гетерологичный" и "экзогенный", при использовании в настоящем описании в отношении полинуклеотидов, должны иметь свои обычные и общепринятые значения, известные среднему специалисту в данной области техники, и используются без ограничения для обозначения полинуклеотида (например, последовательности ДНК или гена), который происходит из источника, чужеродного для конкретной клетки-хозяина или, если он происходит из того же источника, изменен относительно своей исходной формы. Таким образом, гетерологичный ген в клетке-хозяине включает ген, который является эндогенным по отношению к конкретной клетке-хозяину, но был изменен, например, при использовании сайт-направленного мутагенеза или других рекомбинантных технологий. Указанные термины также включают не встречающиеся в природе множественные копии природной последовательности ДНК. Таким образом, термины относятся к сегменту ДНК, который является чужеродным или гетерологичным по отношению к клетке или гомологичным по отношению к клетке, но находящимся в таком положении или форме в клетке-хозяине, в котором данный элемент обычно не находится.

[69] Аналогичным образом термины "рекомбинантный", "гетерологичный" и "экзогенный", при использовании в настоящем описании в отношении полипептидной или аминокислотной последовательности, означают полипептидную или аминокислотную последовательность, которая происходит из источника, чужеродного по отношению к конкретной клетке-хозяину или, если она происходит из того же источника, изменена относительно своей исходной формы. Таким образом, рекомбинантные сегменты ДНК могут экспрессироваться в клетке-хозяине с получением рекомбинантного полипептида.

[70] Термины "плазмида", "вектор" и "кассета" должны иметь свои соответствующие обычные и общепринятые значения, известные среднему специалисту в данной области техники, и используются без ограничения для обозначения внехромосомного элемента, часто несущего гены, которые не являются частью центрального метаболизма клетки, и который обычно находится в форме кольцевых молекул двухцепочечной ДНК. Такие элементы могут быть автономно реплицирующимися последовательностями, интегрирующимися в геном последовательностями, фаговыми или нуклеотидными последовательностями, линейными или кольцевыми, одно- или двухцепочечными ДНК или РНК, полученными из любого источника, в котором несколько нуклеотидных последовательностей были соединены или рекомбинированы с получением уникальной конструкции, которая способна вводить промоторный фрагмент и последовательность ДНК для выбранного продукта гена вместе с подходящими 3’ нетранслируемыми последовательностями в клетку. "Трансформационная кассета" относится к определенному вектору, содержащему чужеродный ген и имеющему другие элементы в дополнение к чужеродному гену, которые способствуют трансформации конкретной клетки-хозяина. "Кассета экспрессии" относится к определенному вектору, содержащему чужеродный ген и имеющему другие элементы в дополнение к чужеродному гену, которые обеспечивают повышенную экспрессию данного гена в чужеродном хозяине.

[71] Стандартные методики генной инженерии и молекулярного клонирования, используемые в настоящей заявке, известны в уровне техники и описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (в дальнейшем "Maniatis"); и в Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1984; а также в Ausubel, F. M. et al., в Current Protocols in Molecular Biology, издательство Greene Publishing and Wiley-Interscience, 1987;, которые полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

[72] Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, под которым их обычно понимает средний специалист в области техники, к которой относится настоящее описание. Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, могут использоваться при осуществлении или тестировании настоящего описания, ниже описаны предпочтительные материалы и методы.

[73] Настоящее описание будет понято более полно при рассмотрении следующих неограничивающих Примеров. Следует понимать, что данные Примеры, притом, что в них указываются предпочтительные варианты осуществления рассматриваемой технологии, даны лишь в качестве иллюстрации. Из приведенного выше обсуждения и этих Примеров, специалист в данной области техники сумеет установить существенные характеристики рассматриваемой технологии и без отступления от ее сущности и объема сможет внести различные изменения и модификации рассматриваемой технологии, чтобы адаптировать ее к различным применениям и условиям.

Рекомбинантные полипептиды

[74] В одном аспекте настоящее описание относится к рекомбинантному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:6. Предпочтительно аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида обладает по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO:6. Более предпочтительно аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже 100% идентичностью с SEQ ID NO:6. В примере осуществления аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида состоит из SEQ ID NO:6. Соответственно, рекомбинантный полипептид, описанный в настоящей заявке, включает функциональные фрагменты SEQ ID NO:6, функциональные варианты SEQ ID NO:6 и другие гомологичные полипептиды, которые обладают, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:6.

[75] В другом аспекте настоящее описание относится к выделенной нуклеиновой кислоте, имеющей нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный полипептид, описанный в настоящей заявке. Например, выделенная нуклеиновая кислота может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:6. Предпочтительно выделенная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6. Более предпочтительно выделенная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:6. Выделенная нуклеиновая кислота, таким образом, включает нуклеиновые кислоты, которые кодируют функциональные фрагменты SEQ ID NO:6, функциональные варианты SEQ ID NO:6 или другие гомологичные полипептиды, которые обладают, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:6.

[76] В варианте осуществления настоящее описание относится к выделенной нуклеиновой кислоте, имеющей нуклеотидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже 100% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:7. Предпочтительно выделенная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:7. Более предпочтительно выделенная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже 100% идентичностью с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:7.

[77] В другом аспекте рассматриваемая технология относится к вектору, содержащему нуклеиновые кислоты, описанные в настоящей заявке, и клетке-хозяину, содержащей вектор, описанный в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления настоящее описание относится к вектору экспрессии, включающему по меньшей мере один полинуклеотид рассматриваемой технологии, и где вектор экспрессии при трансфекции в клетку-хозяина способен к экспрессии по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида HV1, описанного в настоящей заявке. В варианте осуществления вектор экспрессии включает нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, или ее вариант.

[78] Конструкция вектора экспрессии зависит от таких факторов как выбор трансформируемой клетки-хозяина, требуемый уровень экспрессии белка и т.п. Векторы экспрессии могут быть введены в клетку-хозяина для получения в результате рекомбинантного полипептида рассматриваемой технологии, такого как рекомбинантный полипептид HV1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или ее вариант.

[79] Экспрессию белков в прокариотах чаще всего проводят в бактериальной клетке-хозяине с использованием векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, направляющие экспрессию слитых или неслитых белков. Слитые векторы добавляют некоторое количество аминокислот к белку, кодируемому в них, обычно на N-конец рекомбинантного белка. Такие слитые векторы обычно служат трем целям: 1) повысить экспрессию рекомбинантного белка; 2) повысить растворимость рекомбинантного белка; и 3) способствовать очистке рекомбинантного белка, действуя как лиганд при аффинной очистке. Часто в место соединения слитого фрагмента и рекомбинантного белка вводят сайт протеолитического расщепления, позволяющий отделить рекомбинантный белок от слитого фрагмента после очистки слитого белка. Такие векторы включены в объем настоящего описания.

[80] В варианте осуществления вектор экспрессии включает такие генетические элементы для экспрессии рекомбинантного полипептида в бактериальных клетках. Элементы для транскрипции и трансляции в бактериальной клетке могут включать промотор, кодирующую область белкового комплекса и терминатор транскрипции.

[81] В варианте осуществления векторы экспрессии рассматриваемой технологии включают бактериальные векторы экспрессии, например, рекомбинантную ДНК бактериофага, плазмидную ДНК или космидную ДНК, дрожжевые векторы экспрессии например, рекомбинантные дрожжевые векторы экспрессии, векторы для экспрессии в клетках насекомых, например, рекомбинантные вирусные векторы экспрессии, например бакуловирус, или векторы для экспрессии в клетках растений, например, рекомбинантные вирусные векторы экспрессии, такие как вирус мозаики цветной капусты (CaMV), вирус табачной мозаики (ВТМ), или рекомбинантные плазмидные векторы экспрессии, такие как Ti-плазмиды.

[82] В варианте осуществления вектор включает бактериальный вектор экспрессии. В другом варианте осуществления вектор экспрессии включает высококопийный вектор экспрессии; в альтернативе вектор экспрессии включает низкокопийный вектор экспрессии, например, плазмиду Mini-F.

[83] Среднему специалисту в данной области техники будут известны методики молекулярной биологии, доступные для получения векторов экспрессии. Полинуклеотид, используемый для включения в вектор экспрессии рассматриваемой технологии, как описано выше, может быть получен с помощью стандартных методик, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР).

[84] Было разработано много методик молекулярной биологии для функционального связывания ДНК с векторами через комплементарные липкие концы. В одном варианте осуществления дополнительные гомополимерные участки могут быть добавлены к молекуле нуклеиновой кислоты, которую предполагается вставить в векторную ДНК. Вектор и молекулу нуклеиновой кислоты затем соединяют с образованием водородной связи между дополнительными гомополимерными концевыми участками, получая рекомбинантные молекулы ДНК.

[85] В альтернативном варианте осуществления синтетические линкеры, содержащие один или более введенных сайтов рестрикции, используют для функционального связывания полинуклеотида рассматриваемой технологии с вектором экспрессии. В варианте осуществления полинуклеотид получают при обработке эндонуклеазой рестрикции. В варианте осуществления молекулу нуклеиновой кислоты обрабатывают ДНК-полимеразой бактериофага T4 или ДНК полимеразой I E. coli, ферментами, которые удаляют выступающие 3’-одноцепочечные концы с помощью своей 3’-5’-экзонуклеазной активности и заполняют углубленные 3’-концы с помощью своей полимеразной активности, с получением в результате сегментов ДНК с тупыми концами. Затем сегменты с тупыми концами инкубируют с большим молярным избытком молекул линкера в присутствии фермента, который способен катализировать лигирование молекул ДНК с тупыми концами, такого как ДНК-лигаза бактериофага T4. Таким образом, продуктом реакции является полинуклеотид, несущий полимерные линкерные последовательности на своих концах. Затем эти полинуклеотиды расщепляют подходящей рестриктазой и лигируют в вектор экспрессии, который был разрезан ферментом, который дает концы, совместимые с концами полинуклеотида.

[86] В альтернативе может использоваться вектор, имеющий сайты безлигазного клонирования (LIC). Затем требуемый ПЦР амплифицированный полинуклеотид можно клонировать в вектор LIC без рестрикции или лигирования (Aslanidis and de Jong, Nucl. Acid. Res. 18, 6069-6074, (1990), Haun, et al., Biotechniques 13, 515-518 (1992), которая включена в настоящее описание в той мере, в которой это соответствует настоящему описанию).

[87] В варианте осуществления для выделения и/или модификации целевого полинуклеотида, предназначенного для вставки в выбранную плазмиду, предпочтительно использовать ПЦР. Подходящие праймеры для использования при получении последовательности с помощью ПЦР могут быть подобраны для выделения требуемой кодирующей области молекулы нуклеиновой кислоты, добавления сайтов эндонуклеаз рестрикции или LIC, помещения кодирующей области в нужную рамку считывания.

[88] В варианте осуществления полинуклеотид для включения в вектор экспрессии рассматриваемой технологии получают при помощи ПЦР с использованием подходящих олигонуклеотидных праймеров. Кодирующую область амплифицируют, при этом сами праймеры включаются в последовательность амплифицируемого продукта. В варианте осуществления амплификационные праймеры содержат сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, которые позволяют клонировать последовательность амплифицированного продукта в подходящий вектор.

[89] В варианте осуществления полинуклеотид SEQ ID NO:7 или его вариант получают с помощью ПЦР и включают в вектор экспрессии при использовании расщепления эндонуклеазами рестрикции и лигирования согласно методикам, которые известны в уровне техники.

[90] Настоящее описание также относится к клетке-хозяину, включающей вектор экспрессии, описанный в настоящей заявке. Подходящие хозяева рассматриваемой технологии обычно включают микробные хозяева или растения-хозяева. Например, клетка-хозяин рассматриваемой технологии выбрана из группы, состоящей из клеток бактерий, дрожжей, нитчатых грибов, цианобактерий и растений.

[91] Микробные хозяева могут включать любой организм, способный к экспрессии полинуклеотида (такого как SEQ ID NO:7) с получением рекомбинантного полипептида HV1, описанного в настоящей заявке. Микроорганизмы, применимые в рассматриваемой технологии, включают бактерии, такие как кишечные бактерии (например, Escherichia и Salmonella), а также Bacillus, Acinetobacter, актиномицеты, такие как Streptomyces, Corynebacterium, метанотрофы, такие как Methylosinus, Methylomonas, Rhodococcus и Pseudomona; цианобактерии, такие как Rhodobacter и Synechocystis; дрожжи, такие как Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Pichia и Torulopsis; и нитчатые грибы, такие как Aspergillus и Arthrobotrys, а также водоросли, и Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella, Corynebacterium, Clostridium и Clostridium acetobutylicum, например. Предпочтительно, микробный хозяин является бактериями (такой как Escherichia) или дрожжами (такими как Saccharomyces). Векторы экспрессии могут быть включены в эти и другие микробные хозяева для получения большого, коммерчески применимого количества стевиол-гликозидов.

[92] В варианте осуществления рекомбинантный полипептид может быть экспрессирован в клетке-хозяине, которая является растительной клеткой. При использовании в настоящем описании, термин "растительная клетка", как подразумевают, означает любую клетку, полученную из однодольного или двудольного растения и способную формировать недифференцированные ткани, такие как каллусы, дифференцированные ткани, такие как эмбрионы, части однодольных растений, однодольные растения или семя. Термин "растение", как подразумевают, означает любой дифференцированный многоклеточный организм, способный к фотосинтезу, включая однодольные и двудольные. В некоторых вариантах осуществления растительная клетка может быть растительной клеткой Arabidopsis, растительной клеткой табака, растительной клеткой сои, растительной клеткой петунии или клеткой из другой масличной культуры, включающей, без ограничения, растительную клетку канолы, растительную клетку рапса, растительную клетку пальмы, растительную клетку подсолнечника, растительную клетку хлопка, растительную клетку кукурузы, растительную клетку арахиса, растительную клетку льна и растительную клетку кунжута.

[93] Применимые растения-хозяева могут включать любое растение, которое обеспечивает продукцию рекомбинантных полипептидов рассматриваемой технологии. Подходящие зеленые растения для использования в качестве хозяев включают, без ограничения перечисленными, сою, рапс (Brassica napus, B. campestris), подсолнечник (Helianthus annus), хлопок (Gossypium hirsutum), кукурузу, табак (Nicotiana tabacum), люцерну (Medicago sativa), пшеницу (Triticum sp.), ячмень (Hordeum vulgare), овес (Avena sativa), сорго (Sorghum bicolor), рис (Oryza sativa), Arabidopsis, крестоцветные овощи (брокколи, цветную капусту, капусту, пастернак и т.д.), дыню, морковь, сельдерей, петрушку, томаты, картофель, землянику, арахис, виноград, кормовые посевные культуры, сахарную свеклу, сахарный тростник, бобы, горох, рожь, лен, деревья лиственных пород, деревья хвойных пород и кормовые травы. Виды водорослей включают, без ограничения перечисленными, коммерчески значимых хозяев, таких как Spirulina, Haemotacoccus и Dunaliella. Подходящие растения для способа рассматриваемой технологии также включают культуры для получения биотоплива, биомассы и биоэнергии. Примеры растений включают Arabidopsis thaliana, рис (Oryza sativa), Hordeum vulgare, просо прутьевидное (Panicum vigratum), Brachypodium spp., Brassica spp. и Crambe abyssinica.

[94] В некоторых вариантах осуществления настоящее описание включает трансгенные клетки-хозяева или хозяева, которые были трансформированы одним или более векторами, раскрытыми в настоящей заявке.

[95] В альтернативе клетки-хозяева могут быть клетками-хозяевами, подходящими для продукции биосинтеза включая одноклеточные организмы, микроорганизмы, многоклеточные организмы, растения, грибы, бактерии, водоросли, сельскохозяйственные культуры, несельскохозяйственные культуры и/или подобные.

[96] Векторы экспрессии могут быть введены в растение или микробные клетки-хозяева с помощью стандартных методик трансформации или трансфекции. Трансформацию подходящих клеток вектором экспрессии рассматриваемой технологии осуществляют способами, известными в уровне техники, при этом обычно она зависит от типа вектора и клетки. Подходящие методики включают соосаждение с фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, липофекцию, хемопорацию или электропорацию.

[97] Успешно трансформированные клетки, то есть клетки, содержащие вектор экспрессии, могут быть идентифицированы с помощью методик, известных в уровне техники. Например, клетки, трансфицированные вектором экспрессии рассматриваемой технологии, можно культивировать с получением полипептидов, описанных в настоящей заявке. Клетки можно проверить на наличие ДНК вектора экспрессии с помощью методик, известных в уровне техники.

[98] Клетки-хозяева могут содержать одну копию вектора экспрессии, описанного ранее, или, альтернативно, множество копий вектора экспрессии.

[99] В некоторых вариантах осуществления трансформированная клетка является клеткой животного, клеткой насекомого, клеткой растения, клеткой водоросли, клеткой гриба или клеткой дрожжей. В некоторых вариантах осуществления клетка является растительной клеткой, выбранной из группы, состоящей из: растительной клетки канолы, растительной клетки рапса, растительной клетки пальмы, растительной клетки подсолнечника, растительной клетки хлопка, растительной клетки кукурузы, растительной клетки арахиса, растительной клетки льна, растительной клетки кунжута, растительной клетки сои и растительной клетки петунии.

[100] Системы экспрессии на основе микробных клеток-хозяев и векторы экспрессии, содержащие регуляторные последовательности, которые направляют экспрессию с высоким уровнем чужеродных белков, известны специалистам в данной области техники. Любые из них могут применяться для создания векторов для экспрессии рекомбинантного полипептида рассматриваемой технологии в микробной клетке-хозяине. Такие векторы могут быть затем введены в подходящие микроорганизмы с помощью трансформации для обеспечения экспрессии с высоким уровнем рекомбинантного полипептида рассматриваемой технологии.

[101] Векторы или кассеты, применимые для трансформации подходящих микробных клеток-хозяев, известны в уровне техники. Как правило, вектор или кассета содержат последовательности, направляющие транскрипцию и трансляцию соответствующего полинуклеотида, селективного маркера и последовательностей, обеспечивающих автономную репликацию или хромосомную интеграцию. Подходящие векторы включают 5’ область полинуклеотида, которая содержит области регуляции инициации транскрипции и 3’ область фрагмента ДНК, которая регулирует терминацию транскрипции. Предпочтительно, чтобы обе области регуляции были получены из генов, гомологичных трансформированной клетке-хозяину, хотя следует понимать, что такие области регуляции не должны быть обязательно получены из генов, нативных по отношению к определенным видам, выбранным в качестве хозяина.

[102] Области регуляции инициации или промоторы, которые могут применяться для направления экспрессии рекомбинантного полипептида в требуемой микробной клетке-хозяине, являются многочисленными и известны специалистам в данной области техники. Фактически любой промотор, способный к направлению этих генов, подходит для рассматриваемой технологии, в том числе, без ограничения перечисленными, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (применимый для экспрессии в Saccharomyces); AOX1 (применимый для экспрессии в Pichia); а также lac, trp, IP_L, IP_R, T7, tac и trc (применимые для экспрессии в Escherichia coli).

[103] Области регуляции терминации могут быть также получены из различных генов, нативных по отношению к микробным хозяевам. Необязательно может быть включен участок терминации для микробных хозяев, описанных в настоящей заявке.

[104] В растительных клетках векторы экспрессии рассматриваемой технологии могут включать кодирующую область, функционально связанную с промоторами, способными направлять экспрессию рекомбинантного полипептида рассматриваемой технологии в требуемых тканях на нужной стадии развития. По причинам удобства экспрессируемые полинуклеотиды могут включать промоторные последовательности и лидерные последовательности трансляции, полученные из одного и того же полинуклеотида. Также должны присутствовать 3’ некодирующие последовательности, кодирующие сигналы терминации транскрипции. Векторы экспрессии могут также включать один или более интронов, способствующих экспрессии полинуклеотида.

[105] В отношении растительных клеток-хозяев, любая комбинация любого промотора и любого терминатора, способная вызывать экспрессию кодирующей области, может использоваться в векторных последовательностях рассматриваемой технологии. Некоторые подходящие примеры промоторов и терминаторов включают промоторы и терминаторы генов нопалинсинтазы (nos), октопинсинтазы (ocs) и вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Одним из типов эффективного растительного промотора, который может использоваться, является высокоэффективный растительный промотор. Такие промоторы, функционально связанные с вектором экспрессии рассматриваемой технологии, должны быть способны активировать экспрессию вектора. Высокоэффективные растительные промоторы, которые могут использоваться в рассматриваемой технологии, включают промотор малой субъединицы (ss) рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы, например, из сои (Berry-Lowe et al., J. Molecular and App. Gen., 1:483 498 (1982), которая полностью включена в настоящее описание в той мере, в которой это соответствует настоящей заявке), и промотор хлорофилл a/b-связывающего белка. Эти два промотора, как известно, индуцирует свет в растительных клетках (см., например, Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum, N.Y. (1983), страницы 29 38; Coruzzi, G. et al., The Journal of Biological Chemistry, 258:1399 (1983), и Dunsmuir, P. et al., Journal of Molecular and Applied Genetics, 2:285 (1983), которые полностью включены в настоящее описание в той мере, в которой это соответствует настоящей заявке).

[106] Выбор плазмидного вектора зависит от способа, который будет использоваться для трансформации растений-хозяев. Специалисту хорошо известны генетические элементы, которые должны присутствовать в плазмидном векторе для успешной трансформации, отбора и размножения клеток-хозяев, содержащих химерный полинуклеотид. Специалисту также известно, что различные независимые события трансформации приводят к различным уровням и профилям экспрессии (Jones et al., EMBO J. 4:2411 2418 (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics 218:78 86 (1989), которые полностью включены в настоящее описание в той мере, в которой это соответствует настоящей заявке) и, следовательно, что множество событий требуется подвергнуть скринингу для получения линий, демонстрирующих требуемый уровень и профиль экспрессии. Такой скрининг может быть выполнен с помощью Саузерн-анализа ДНК-блотов, Нозерн-анализая экспрессии мРНК, Вестерн-анализа экспрессии белка или фенотипического анализа.

[107] Введение вектора экспрессии рассматриваемой технологии в растительную клетку может быть выполнено множеством способов, известных средним специалистам в данной области техники, включающих вставку целевой последовательности нуклеиновой кислоты в Ri-плазмиду Agrobacterium rhizogenes или Ti-плазмиду Agrobacterium tumefaciens, микроинъекцию, электропорацию или прямое осаждение. В качестве примера, в некоторых вариантах осуществления транзиентная экспрессия целевого полинуклеотида может быть выполнена методами агро-инфильтрации. В этом отношении, суспензия Agrobacterium tumefaciens, содержащая целевой полинуклеотид, может быть выращена в культуре и затем введена в растение с помощью шприца, конец которого прижимают к нижней стороне листа, мягко надавливая при этом на другую сторону листа. При этом раствор агробактерии поступает в воздушные полости внутри листа через устьица. Попав внутрь листа, агробактерия трансформирует целевой ген в части растительных клеток, где ген затем транзиентно экспрессируется.

[108] В качестве другого примера, трансформация целевой плазмиды в растительную клетку может быть выполнена с помощью методик бомбардировки ускоренными частицами (то есть биолистики). В этом отношении, суспензия зародышей растения может быть выращена в жидкой культуре и затем подвергнута бомбардировке плазмидами или полинуклеотидами, которые прикреплены к частицам золота, где частицы золота, связанные с целевой плазмидой или нуклеиновой кислотой, могут проникать через мембраны растительных тканей, таких как зародышевая ткань. После бомбардировки трансформированные эмбрионы могут быть отобраны при использовании подходящего антибиотика с получением новых, клонально размноженных, трансформированных эмбриогенных суспензионных культур.

[109] Клетки-хозяева могут быть немодифицированными клетками или клеточными линиями, или клеточными линиями, которые были генетически модифицированы. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин является клеточной линией, которая была модифицирована с целью выращивания в требуемых условиях, например, при более низкой температуре.

[110] Стандартные методики генной инженерии могут использоваться для получения нуклеиновой кислоты, которая кодирует рекомбинантный полипептид, описанный в настоящей заявке, включения нуклеиновой кислоты в вектор экспрессии и введения вектора в клетку-хозяина, как описано в Sambrook, et al. (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, (2001); и Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1995). Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, может быть вставлена в вектор или векторы экспрессии таким образом, чтобы нуклеиновые кислоты были функционально связаны с последовательностями регуляции транскрипции и трансляции (такими как последовательность промотора, последовательность терминации транскрипции и т.д.). Вектор экспрессии и последовательности регуляции экспрессии обычно выбирают так, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином.

[111] Экспрессия полипептида в хозяине, описанном в настоящей заявке, может быть дополнительно улучшена путем оптимизации кодонов. Например, замена менее распространенного кодона более распространенным кодоном может влиять на полупериод существования мРНК или изменять ее структуру посредством введения вторичной структуры, которая препятствует трансляции мРНК. Вся или часть кодирующей области может быть оптимизирована. В некоторых случаях требуемую модуляцию экспрессии достигают путем оптимизации по существу всего гена. В других случаях требуемую модуляцию достигают при оптимизации части, а не всей последовательности гена.

[112] Использование кодонов в любой кодирующей последовательности можно регулировать для достижения требуемого свойства, например, высоких уровней экспрессии в определенном типе клеток. Исходной точкой для такой оптимизации может быть кодирующая последовательность со 100% распространенных кодонов или кодирующая последовательностью, которая содержит смесь распространенных и малораспространенных кодонов.

[113] Две или более кандидатных последовательностей, которые отличаются по своей частоте использования кодонов, могут быть получены и проверены с целью определения, обладают ли они нужным свойством. Кандидатные последовательности могут быть оценены при использовании компьютера для поиска присутствия регуляторных элементов, таких как сайленсеры или энхансеры, и поиска присутствия областей кодирующей последовательности, которая могла быть преобразована в такие регуляторные элементы при изменении использования кодонов. Дополнительные критерии могут включать обогащение специфическими нуклеотидами, например, A, C, G или U, смещение кодонов по определенной аминокислоте или присутствие или отсутствие специфической вторичной или третичной структуры мРНК. Регулирование кандидатной последовательности может быть выполнено на основе ряда таких критериев.

[114] В некоторых вариантах осуществления оптимизированная по кодонам последовательность нуклеиновой кислоты может экспрессировать свой белок на уровне, который составляет приблизительно 110%, приблизительно 150%, приблизительно 200%, приблизительно 250%, приблизительно 300%, приблизительно 350%, приблизительно 400%, приблизительно 450% или приблизительно 500% от уровня белка, экспрессируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, которая не была оптимизирована по кодонам.

[115] В дополнение к нуклеиновой кислоте, которая кодирует рекомбинантный полипептид рассматриваемой технологии, вектор экспрессии рассматриваемой технологии может дополнительно нести регуляторные последовательности, которые регулируют экспрессию белка в клетке-хозяине, такие как промоторы, энхансеры или другие элементы регуляции экспрессии, которые регулируют транскрипцию или трансляцию нуклеиновой кислоты (кислот). Такие регуляторные последовательности известны в уровне техники. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что конструкция вектора экспрессии, в том числе выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов как выбор клетки-хозяина, которую предполагается трансформировать, требуемый уровень экспрессии белка и т.д. Кроме того, рекомбинантные векторы экспрессии рассматриваемой технологии могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и селективные маркерные гены.

Биосинтез стевиол-гликозидов

[116] Как описано в настоящей заявке, рекомбинантные полипептиды настоящей технологии обладают УДФ-гликозилтрансферазной активностью, более конкретно включающей 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующую активность, и могут применяться для разработки биосинтетических способов получения стевиол-гликозидов, которые обычно мало распространены в природных источниках, таких как ребаудиозид D и ребаудиозид E. Рекомбинантные полипептиды настоящей технологии обладают УДФ-гликозилтрансферазной активностью, могут применяться для разработки биосинтетических способов получения новых стевиол-гликозидов, таких как ребаудиозид Z1 и ребаудиозид Z2.

[117] Таким образом, в одном аспекте рассматриваемая технология также относится к способу получения композиции стевиол-гликозидов, включающему инкубирование субстрата с рекомбинантным полипептидом, включающим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO:6.

[118] Субстрат может быть любым природным или синтетическим соединением, способным к превращению в стевиол-гликозидное соединение в реакции, катализируемой одной или более УДФ-гликозилтрансферазами. Например, субстрат может быть натуральным экстрактом стевии, стевиолом, стевиол-13-O-глюкозидом, стевиол-19-O-глюкозидом, стевиол-1,2-биозидом, рубузозидом, стевиозидом, ребаудиозидом A, ребаудиозидом G или ребаудиозидом E. Субстрат может быть чистым соединением или смесью различных соединений. Предпочтительно субстрат включает соединение, выбранное из группы, состоящей из рубузозида, стевиозида, ребаудиозида A, ребаудиозида E и их комбинаций.

[119] Способ, описанный в настоящей заявке, также обеспечивает комбинированную реакционную систему, в которой рекомбинантные пептиды, описанные в настоящей заявке, могут функционировать в комбинации с одним или более дополнительными ферментами для повышения эффективности или изменения результата общего биосинтеза стевиол-гликозидных соединений. Например, дополнительный фермент может регенерировать УДФ-глюкозу, необходимую для реакции гликозилирования, превращая УДФ, образующийся в реакции гликозилирования, обратно в УДФ-глюкозу (при использовании, например, сахарозы в качестве донора остатка глюкозы), что повышает эффективность реакции гликозилирования. В другом примере рекомбинантный полипептид рассматриваемой технологии может давать промежуточный стевиол-гликозидный продукт (например, ребаудиозид E), который затем превращается в другой стевиол-гликозид (например, ребаудиозид D) в реакции, катализируемой другой УДФ-гликозилтрансферазой, такой как UGT76G1. В другом примере рекомбинантный полипептид рассматриваемой технологии может давать промежуточный стевиол-гликозидный продукт (например, ребаудиозид E), который затем превращается в другой стевиол-гликозид (например, ребаудиозид Z1 и ребаудиозид Z2) в реакции, катализируемой УДФ-гликозилтрансферазой, такой как HV1.

[120] Таким образом, в одном варианте осуществления способ рассматриваемой технологии дополнительно включает инкубирование рекомбинантной сахарозосинтазы (СС) с субстратом и рекомбинантным полипептидом, описанным в настоящей заявке. Рекомбинантная сахарозосинтаза превращает УДФ в УДФ-глюкозу, используя сахарозу в качестве источника глюкозы. Подходящая сахарозосинтаза включает сахарозосинтазы, полученные из генов СС Arabidopsis thaliana и Vigna radiate, или из любого гена, который кодирует функциональный гомолог сахарозосинтазы, кодируемой последовательностью SUS1 Arabidopsis thaliana и Vigna radiate, или их функциональные гомологи. Подходящими сахарозосинтазами может быть, например, сахарозосинтаза 1 Arabidopsis; сахарозосинтаза 3 Arabidopsis; и сахарозосинтаза Vigna radiate. Наиболее подходящей сахарозосинтазой может быть, например, сахарозосинтаза 1 Arabidopsis. Например, рекомбинантная СС включает аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с аминокислотной последовательности AtSUS1, представленной в SEQ ID NO:9. Предпочтительно рекомбинантная СС рассматриваемой технологии включает аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью AtSUS1, представленной в SEQ ID NO:9.

[121] Рекомбинантная сахарозосинтаза рассматриваемой технологии может быть получена при экспрессии нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, кодирующую целевую аминокислотную последовательность (например, аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью с аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9), в клетке-хозяине, как описано выше. Например, вектор, включающий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, может быть введен в микробного хозяина (такого как E. coli) с использованием стандартных методик трансформации, с получением рекомбинантной сахарозосинтазы.

[122] В другом варианте осуществления способ рассматриваемой технологии дополнительно включает инкубирование рекомбинантной УДФ-гликозилтрансферазы с рекомбинантной сахарозосинтазой, субстратом и рекомбинантным полипептидом, описанным в настоящей заявке. Рекомбинантная УДФ-гликозилтрансфераза может катализировать другую реакцию гликозилирования, отличную от реакции, катализируемой рекомбинантным полипептидом рассматриваемой технологии. Например, рекомбинантная УДФ-гликозилтрансфераза может катализировать реакцию, которая переносит сахарную группу на C-3’ C-13-O-глюкозы стевиозида с получением ребаудиозида A (или аналогично с получением ребаудиозида D из ребаудиозида E), тогда как рекомбинантный полипептид рассматриваемой технологии переносит вторую сахарную группу на C-2’ 19-O-глюкозы стевиозида с получением ребаудиозида E (или аналогично с получением ребаудиозида D из ребаудиозида A).

[123] Подходящая УДФ-гликозилтрансфераза включает любую УГТ, известную в уровне техники как способную катализировать одну или более реакций в биосинтезе стевиол-гликозидных соединений, таких как UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1 или их функциональные гомологи. Например, УДФ-гликозилтрансфераза, как описано в настоящей заявке, может включать аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью UGT76G1, представленной в SEQ ID NO:11. Предпочтительно УДФ-гликозилтрансфераза включает аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью UGT76G1, представленной в SEQ ID NO:11.

[124] Рекомбинантная УДФ-гликозилтрансфераза может быть получена при экспрессии нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, кодирующую целевую аминокислотную последовательность (например, аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:11), в клетке-хозяине, как описано выше. Например, вектор, включающий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, может быть введен в микробного хозяина (такого как E. coli) с помощью стандартных методик трансформации с получением рекомбинантной УДФ-гликозилтрансферазы рассматриваемой технологии.

[125] Рассматриваемая технология охватывает как in vitro, так и in vivo получение стевиол-гликозидных соединений.

[126] Например, инкубирование может быть in vitro процессом, в котором субстрат взаимодействует с рекомбинантным полипептидом рассматриваемой технологии. Предпочтительно в in vitro процессе рекомбинантный полипептид очищают перед инкубированием с субстратом. Стандартные методики очистки полипептидов, такие как центрифугирование, лизис клеток и хроматография, включены в способы рассматриваемой технологии. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный полипептид рассматриваемой технологии, может быть клонирована в вектор экспрессии с гистидиновой меткой, в результате чего экспрессированный рекомбинантный полипептид может быть очищен с помощью аффинной колоночной хроматографии.

[127] In vitro способ рассматриваемой технологии включает любую буферную систему, которая является подходящей для получения стевиол-гликозида с применением одного или более рекомбинантных полипептидов рассматриваемой технологии. Как правило, буферная система является водным раствором, таким как буфер Трис, буфер HEPES, буфер MOPS, фосфатный буфер, с pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0. Более предпочтительно pH составляет от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5. Еще более предпочтительно pH составляет от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,5.

[128] Как правило, в in vitro способе рассматриваемой технологии субстрат присутствует в буфере в концентрации от приблизительно 0,2 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 2 мг/мл, более предпочтительно от приблизительно 0,7 мг/мл до приблизительно 1,5 мг/мл.

[129] Как правило, в in vitro способе рассматриваемой технологии УДФ-глюкоза включена в буфер в концентрации от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 5 мМ, предпочтительно от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 2 мМ, более предпочтительно от приблизительно 0,7 мМ до приблизительно 1,5 мМ. В варианте осуществления, в случае включения рекомбинантной сахарозосинтазы в реакцию, сахарозу также включают в буфер в концентрации от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ, предпочтительно от приблизительно 200 мМ до приблизительно 400 мМ, более предпочтительно от приблизительно 250 мМ до приблизительно 350 мМ.

[130] Как правило, в in vitro способе рассматриваемой технологии весовое соотношение рекомбинантного полипептида к субстрату, в расчете на сухой вес, составляет от приблизительно 1:100 до приблизительно 1:5, предпочтительно от приблизительно 1:50 до приблизительно 1:10, более предпочтительно от приблизительно 1:25 до приблизительно 1:15.

[131] Как правило, температура реакции in vitro способа составляет от приблизительно 20°C до приблизительно 40°C, предпочтительно от 25°C до приблизительно 37°C, более предпочтительно от 28°C до приблизительно 32°C.

[132] В настоящем описании также предусмотрена композиция стевиол-гликозидов, полученная с применением биосинтетического способа, описанного в настоящей заявке. Точная природа композиции стевиол-гликозидов, полученной с применением способа, описанного в настоящей заявке, например, типы соединений и их процентное содержание в конечном продукте, зависит от используемого субстрата, условий инкубирования и ферментативной активности, включенных в реакционную систему. Например, в случае использования стевиозида в качестве субстрата, полученная композиция стевиол-гликозидов может включать ребаудиозид A, ребаудиозид D, ребаудиозид E, ребаудиозид Z1 и ребаудиозид Z2 и их комбинации.

[133] Рассматриваемая технология обеспечивает способ превращения преобладающих стевиол-гликозидных соединений (то есть стевиозида и ребаудиозида A) в натуральном экстракте стевии в ребаудиозид D и ребаудиозид E, которые в иных случаях мало распространены в натуральном экстракте. Таким образом, рассматриваемая технология также обеспечивает способ обогащения содержания одного или более определенных стевиол-гликозидов (таких как ребаудиозид D и ребаудиозид E), включающий инкубирование субстрата (такого как натуральный экстракт стевии) с рекомбинантным полипептидом, включающим аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO:6. Например, при использовании натурального экстракта стевии в качестве субстрата, получаемая композиция стевиол-гликозидов может быть обогащена ребаудиозидом D и/или ребаудиозидом E, которые мало распространены в натуральном экстракте стевии.

[134] Специалисту в данной области будет известно, что композиция стевиол-гликозидов, полученная способом, описанным в настоящей заявке, может быть затем очищена и смешана с другими стевиол-гликозидами, вкусоароматическими веществами или подсластителями, с получением требуемого вкуса и аромата или композиции подсластителя. Например, композиция, обогащенная ребаудиозидом D, получанная, как описано в настоящей заявке, может быть смешана с натуральным экстрактом стевии, содержащим ребаудиозид A в качестве преобладающего стевиол-гликозида, или с другими синтетическими или натуральными стевиол-гликозидными продуктами, с получением требуемой композиции подсластителя. В альтернативе по существу очищенный стевиол-гликозид (например, ребаудиозид D), полученный из композиции стевиол-гликозидов, описанной в настоящей заявке, может быть объединен с другими подсластителями, такими как сахароза, мальтодекстрин, аспартам, сукралоза, неотам, ацесульфам калия и сахарин. Количество стевиол-гликозида относительно других подсластителей можно регулировать для получения требуемого вкуса, как известно в уровне техники. Композиция стевиол-гликозидов, описанная в настоящей заявке (включающая ребаудиозид D, ребаудиозид E, ребаудиозид Z1, ребаудиозид Z2 или их комбинацию), может быть включена в пищевые продукты (такие как напитки, безалкогольные напитки, мороженое, молочные продукты, кондитерские изделия, изделия из дробленого зерна, жевательную резинку, хлебобулочные изделия и т.д.), биологически активные пищевые добавки, диетическое питание, а также фармацевтические продукты.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Выбор кандидатных генов УГТ

[135] Филогенетический и белковый BLAST анализ использовали для идентификации 7 кандидатных генов, которые относятся к подсемейству UGT91, с 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующей активностью (Таблица 1).

Таблица 1 Список кандидатных генов УГТ
Название	Описание	Рег. номер	ID последовательности
BD1	Предсказанный: УДФ-гликозилтрансфераза 91C1-подобный [Brachypodium distachyon]	XP_003560664.1	SEQ ID NO: 1
BD2	Предсказанный: УДФ-гликозилтрансфераза 91C1-подобный [Brachypodium distachyon]	XP_003560669.1	SEQ ID NO: 2
BD3	Предсказанный: белок низкого качества: УДФ-гликозилтрансфераза 91C1-подобный [Brachypodium distachyon]	XP_003581636.1	SEQ ID NO: 3
BD4	Предсказанный: УДФ-гликозилтрансфераза 91C1-подобный [Brachypodium distachyon]	XP_003580515.1	SEQ ID NO: 4
BD5	Предсказанный: белок низкого качества: УДФ-гликозилтрансфераза 91B1-подобный [Brachypodium distachyon]	XP_003559500.1	SEQ ID NO: 5
HV1	предсказанный белок [Hordeum vulgare subsp. vulgare]	BAJ98242.1	SEQ ID NO: 6
HV2	предсказанный белок [Hordeum vulgare subsp. vulgare]	BAJ93155.1	SEQ ID NO: 8

Пример 2: Скрининг ферментной активности кандидатных генов УГТ

[136] Фрагменты полноразмерной ДНК всех кандидатных генов УГТ синтезировали коммерчески. Почти все кодоны кДНК были заменены кодонами, предпочтительными для E. coli (Genscript, NJ). Синтезированную ДНК клонировали в бактериальный вектор экспрессии pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen).

[137] Каждую экспрессионную конструкцию трансформировали в E. coli BL21 (DE3), которую затем выращивали в среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, при 37°C до достижения OD600 0,8-1,0. Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и выращивали культуру далее при 16°C в течение 22 ч. Клетки собирали центрифугированием (3000×g; 10 мин; 4°C). Осадки клеток собирали и использовали немедленно или хранили при -80°C.

[138] Осадки клеток обычно ресуспендировали в лизисном буфере (50 мМ калий фосфатный буфер, pH 7,2, 25 мкг/мл лизоцима, 5 мкг/мл ДНКазы I, 20 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 10% глицерина и 0,4% Triton X-100). Клетки разрушали ультразвуком при 4°C и удаляли клеточный дебрис центрифугированием (18000×g; 30 мин). Супернатант наносили на уравновешенную (уравновешивающий буфер: 50 мМ калий фосфатный буфер, pH 7,2, 20 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 10% глицерина) аффинную колонку Ni-NTA (Qiagen). После нанесения образца белка колонку промывали уравновешивающим буфером для удаления не связавшихся белковых примесей. His-меченные рекомбинантные полипептиды УГТ элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 250 мМ имидазола.

[139] Очищенные кандидатные УГТ рекомбинантные полипептиды исследовали на наличие 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующей активности при использовании стевиозида или Reb A в качестве субстрата (Фигура 1). Как правило, рекомбинантный полипептид (10 мкг) тестировали в 200 мкл in vitro реакционной системе. Реакционная система содержит 50 мМ калий фосфатный буфер, pH 7,2, 3 мМ MgCl₂, 1 мг/мл стевиозида или ребаудиозида A, 1 мМ УДФ-глюкозы. Реакцию проводили при 30°C и останавливали добавлением 200 мкл 1-бутанола. Образцы экстрагировали три раза 200 мкл 1-бутанола. Смешанную фракцию сушили и растворяли в 70 мкл 80% метанола для анализа с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Экстракт стевии (Blue California, CA), содержащий 95% стевиозида, использовали в качестве стевиозид-содержащего субстрата. Ребаудиозид (чистота 99%) был также поставлен Blue California.

[140] Катализируемую УГТ реакцию гликозилирования объединяли с реакцией образования УДФ-глюкозы, катализируемой сахарозосинтазой (такой как AtSUS1 из SEQ ID NO:9). В этом способе УДФ-глюкоза образовывалась из сахарозы и УДФ (Фигура 2), при этом можно исключить добавление дополнительных количеств УДФ-глюкозы. Последовательность AtSUS1 (Bieniawska et al., Plant J. 2007, 49: 810-828) синтезировали и встраивали в бактериальный вектор экспрессии. Рекомбинантный белок AtSUS1 экспрессировали и очищали с помощью аффинной хроматографии. Очищенный рекомбинантный полипептид AtSUS1 анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (молекулярная масса: 106,3 кДа, Фигура 7).

[141] Таким образом, активности рекомбинантных полипептидов УГТ тестировали без AtSUS1 (50 мМ калий фосфатный буфер, pH 7,2, 3 мМ MgCl₂, 1 мг/мл стевиозида или ребаудиозида A, 1 мМ УДФ) или при объединении с AtSUS (50 мМ калий фосфатный буфер, pH 7,2, 3 мМ MgCl₂, 1 мг/мл стевиозида или ребаудиозида A, 1 мМ УДФ и 285 мМ сахарозы). Как правило, 10 мкг AtSUS1 использовали для 200 мкл in vitro реакции. Реакцию in vitro инкубировали при 30°C и останавливали экстракцией при использовании 1-бутанола.

[142] Затем проводили анализ ВЭЖХ при использовании системы Dionex UPLC ultimate 3000 (Sunnyvale, CA), включающей насос для четырехкомпонентных смесей, термостатируемое колоночное отделение, автодозатор и УФ-детектор. Для исследования стевиол-гликозидов использовали Phenomenex Luna NH2 с предколонкой. Ацетонитрил в воде использовали для изократического элюирования в анализе ВЭЖХ. Продукты ребаудиозид D, ребаудиозид E, ребаудиозид Z идентифицировали с помощью ЯМР-анализа.

[143] Рекомбинантный полипептид (SEQ ID NO:6), кодируемый SEQ ID NO:7, показал 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующую активность и был подвергнут дополнительному анализу. Ген был получен из Hordeum vulgare subsp. vulgare (в настоящей заявке сокращенно обозначен "HV1"). Очищенный рекомбинантный полипептид HV1 анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (Фигура 6). Как показано на Фигуре 6, рекомбинантный белок HV1 (молекулярная масса: 61,4 кДа) очищали с помощью аффинной хроматографии. Полипептиды, кодируемые другими кандидатными генами (Таблица 1), не показали обнаруживаемой активности в анализах, описанных в настоящей заявке, несмотря на то, что они обладали приблизительно 62-74% идентичностью последовательности с рекомбинантным полипептидом HV1.

[144] Как описано в настоящей заявке, рекомбинантный полипептид HV1 переносил сахарную группу на ребаудиозид A с получением ребаудиозида D при любых условиях реакции, с или без AtSUS1. Ребаудиозид A полностью превращался в ребаудиозид D под действием рекомбинантного полипептида HV1 в УГТ-СС комбинированной реакционной системе (Фигура 3B-E). Однако ребаудиозид A лишь частично превращался в ребаудиозид D через 24 часа под действием только одного рекомбинантного полипептида HV1 без объединения с AtSUS1 (Фигура 3F-G). Таким образом, рекомбинантный полипептид HV1 показал 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующую активность с получением ребаудиозида D из ребаудиозида A, при этом AtSUS1 повышала эффективность превращения в УГТ-СС комбинированной системе.

[145] Кроме того, рекомбинантный полипептид HV1 в комбинации с AtSUS1 (SEQ ID NO:9) превращал стевиозид в ребаудиозид E in vitro (Фигура 4). Было получено неожиданное соединение ("Reb Z"), имеющее время удержания ВЭЖХ 6,68 минуты (см. Фигуру 4), которое отличалось от ребаудиозидов D и E. Это соединение представляло собой новый стевиол-гликозид и было названо "ребаудиозид Z" ("Reb Z"). Для подтверждения превращения Reb E в Reb Z, субстрат Reb E (0,5 мг/мл) инкубировали с рекомбинантным полипептидом HV1 (20 мкг) и AtSUS1 (20 мкг) в УГТ-СС комбинированной реакционной системе (200 мкл) при условиях, аналогичных используемым в примерах выше. Как показано на Фигуре 8, Reb Z был получен с применением комбинации рекомбинантного полипептида HV1 и AtSUS1. Эти результаты показали, что HV1 может переносить глюкозную группу на Reb E с получением Reb Z.

ПРИМЕР 3: Биосинтез стевиол-гликозида с применением рекомбинантного полипептида HV1

[146] Как показано на Фигуре 1, ребаудиозид D также может образовываться при гликозилировании C-3’ C-13-O-глюкозы ребаудиозида E. Таким образом, ребаудиозид D может быть получен различными биосинтетическими методами (например, через ребаудиозид, а не ребаудиозид E), в зависимости от порядка, в котором проходят реакции гликозилирования. Например, гликозилирование по C-3’ C-13-O-глюкозы стевиозида может проходить сначала, с образованием промежуточного ребаудиозида A, с последующим гликозилированием по C-2’ 19-O-глюкозы ребаудиозида A с получением ребаудиозида D. На настоящий момент, UGT76G1 (SEQ ID NO:11) из стевии был идентифицирован как фермент, который переносит сахарный остаток на C-3’ C-13-O-глюкозы стевиозида с образованием ребаудиозида A.

[147] Кодон-оптимизированную кДНК UGT76G1 встраивали в бактериальный вектор экспрессии и рекомбинантный белок UGT76G1 экспрессировали и очищали с помощью аффинной хроматографии. Очищенный рекомбинантный полипептид UGT76G1 анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (молекулярная масса: 65,4 кДа, Фигура 9). Субстрат ребаудиозид E инкубировали с рекомбинантной UGT76G1, с или без AtSUS1, при условиях, аналогичных используемым в Примерах выше. Продукты анализировали с помощью ВЭЖХ. Как показано на Фигуре 12, ребаудиозид D образовывался под действием рекомбинантной UGT76G1. Добавление рекомбинантной AtSUS в реакцию повышало эффективность превращения в УГТ-СС комбинированной системе. Таким образом, рекомбинантный полипептид UGT76G1 показал 1,3-13-O-глюкоза-гликозилирующую активность с получением Reb D из Reb E.

[148] Таким образом, каталитическую активность рекомбинантного полипептида HV1 для биосинтеза стевиол-гликозидов (например, получения ребаудиозида D) также определяли в комбинации с UGT76G1. Субстрат стевиозид инкубировали с рекомбинантным полипептидом HV1 (10 мкг), UGT76G1 (10 мкг) и AtSUS1 (10 мкг) в УГТ-СС комбинированной реакционной системе (200 мкл) при условиях, аналогичных используемым в примерах выше. Продукты анализировали с помощью ВЭЖХ. Как показано на Фигуре 5, ребаудиозид D образовывался под действием комбинации рекомбинантного полипептида HV1, UGT76G1 и AtSUS1. Таким образом, рекомбинантный полипептид HV1, который показал, по меньшей мере, 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующую активность, может применяться в комбинации с другими УГТ ферментами (такими как UGT76G1) для комплексного, многостадийного биосинтеза стевиол-гликозидов.

Пример 4: ЯМР-анализ структуры Reb Z

[149] Материал, используемый для исследования ребаудиозида Z (Reb Z), получали при использовании ферментативного превращения ребаудиозида E и очищали с помощью ВЭЖХ.

[150] Данные МСВР были получены с использованием масс-спектрометра высокого разрешения LTQ Orbitrap Discovery, с установкой разрешения на 30000; сканирования m/z от 150 до 1500 в режиме детектирования положительно заряженных ионов с ионизацией электрораспылением. Напряжение на игле устанавливали на 4 кВ; другие исходные условия были следующими: защитный газ = 25, вспомогательный газ = 0, продувочный газ = 5 (все потоки газа указаны в условных единицах), напряжение на капилляре = 30 В, температура капилляра = 300°C и напряжение на цилиндрической линзе = 75. Образец разбавляли смесью ацетонитрила:метанола:воды 2:2:1 (такой же, как элюент для введения) и вводили 50 микролитров.

[151] Спектры ЯМР получали на спектрометрах Bruker Avance DRX 500 МГц или Varian INOVA 600 МГц при использовании стандартных последовательностей импульсов. Одномерные (¹H и ¹³C) и двумерные (COSY, TOCSY, HMQC и HMBC) спектры ЯМР получали в C₅D₅N.

[152] Соединение Reb Z, показанное как смесь Reb Z1 и Reb Z2, показано на Фигуре 10. Молекулярная формула соединения Reb Z была выведена как C₅₀H₈₀O₂₈ на основе его положительного масс-спектра высокого разрешения (ВР), который показал присутствие ионов-аддуктов, соответствующих [M+Na]⁺ при m/z 1151,4713; такой состав подтверждался данными ¹³C-ЯМР спектра. Данные ¹H-ЯМР спектра Reb Z показали присутствие смеси двух соединений (Reb Z1 и Reb Z2) в соотношении от 60:40 до 70:30. Следовательно, данные ¹H и ¹³C-ЯМР спектров Reb Z показали наборы пиков для каждого протона и углерода, присутствующих в его структуре. Кислотный гидролиз Reb Z 5% H₂SO₄ дал D-глюкозу, которую идентифицировали при непосредственном сравнении с аутентичным образцом с помощью ТСХ. Ферментативный гидролиз Reb Z дал агликон, который идентифицировали как стевиол при сравнении ¹H-ЯМР и ТСХ со стандартным соединением. Значения ¹H и ¹³C-ЯМР для соединения Reb Z были установлены на основе данных TOCSY, HMQC и HMBC. Высокие константы взаимодействия, наблюдаемые для пяти аномерных протонов глюкозных групп, указывали на их β-ориентацию, как сообщали для стевиол-гликозидов.

Таблица 2. Данные 1H и 13C-ЯМР спектров (химические сдвиги и константы взаимодействия) ребаудиозида Z ("Reb Z") и ребаудиозида E a-c.
Положение	Reb Z	Ребаудиозид E
	1H ЯМР	13C ЯМР	1H ЯМР	13C ЯМР
1	0,74 т (12,7), 1,65 м	41,2	0,73 т (13,2), 1,68 м	41,0
2	1,45 м, 2,12 м	20,6	1,46 м, 2,13 м	20,6
3	1,13 м, 2,922 д (13,2)/2,79 д (12,8)	38,2	1,12 м, 2,78 д (12,8)	38,2
4	---	44,9/44,8	---	44,8
5		58,1	0,97 д (11,8)	57,9
6	1,87 м, 2,14 м	22,6	1,85 м, 2,09 м	22,6
7	1,24 м, 1,68 м	42,2	1,27 м, 1,63 м	42,1
8	---	43,2/43,1	---	43,0
9	0,88 шс	54,5	0,88 шс	54,5
10	---	40,2	---	40,2
11		21,1		21,1
12	1,92 м, 2,28 м	37,8	1,96 м, 2,16 м	37,8
13	---	86,6	---	86,6
14	1,72 м, 2,48 д (10,8)	44,9/44,8	1,74 д (11,4), 2,54 д (11,0)	44,8
15	1,92 м, 2,14 м	48,5	2,04 м, 2,12 м	48,5
16	---	155,2/155,0	---	154,9
17	5,09/5,12 с, 5,68/5,74 с	105,4/105,2	5,09 с, 5,76 с	105,4
18	1,43/1,49 с	29,9	1,43 с	29,8
19	---	176,3/176,1	---	176,2
20	1,09 с	17,3	1,10 с	17,2
1′	6,30 д (7,9)/ 6,35 д (7,8)	93,9/93,6	6,30 д (7,9)	93,9
2′		81,8		81,7
3′		78,5		78,4
4′		71,8		71,8
5′		79,6		79,5
6′	4,33 м, 4,46 м	62,6	4,33 м, 4,43 м	62,6
1′′	5,12 д (7,4)/ 5,14 д (7,4)/	98,4/98,2	5,16 д (7,5)	98,4
2′′		84,9		84,9
3′′		78,6		78,5
4′′		72,1		72,1
5′′		78,5		78,2
6′′	4,32 м, 4,38 м	62,8	4,26 м, 4,35 м	62,9
1′′′	5,33 д (7,8)/ 5,46 д (7,8)/	106,7/104,5	5,32 д (7,5)	107,2
2′′′	4,14 т (8,4)	85,7/77,7	4,15 т (8,4)	77,7
3′′′		78,7		78,6
4′′′		72,1/71,5		72,3
5′′′		79,1		79,0
6′′′	4,43 м, 4,56 м	63,1	4,46 м, 4,56 м	63,2
1′′′′	5,48 д (7,9)/ 5,40 д (7,6)	106,3/104,4	5,48 д (7,9)	106,2
2′′′′	4,04 т (7,9)	85,6/77,3	4,06 т (7,9)	76,8
3′′′′		78,8		78,7
4′′′′		71,4/71,0		71,2
5′′′′		79,1		79,1
6′′′′	4,38 м, 4,57 м	63,4	4,42 м, 4,54 м	63,4
1′′′′′	5,29 д (7,5)/ 5,34 д (7,5)/	107,1
2′′′′′		77,0
3′′′′′		78,6
4′′′′′		71,6/71,2
5′′′′′		79,1
6′′′′′	4,34 м, 4,48 м	63,3
a отнесения сделаны на основе TOCSY, HMQC и HMBC корреляций; b значения химических сдвигов указаны в δ (м.д.); c константы взаимодействия указаны в Гц.

[153] На основе результатов из данные ЯМР-спектров и экспериментов гидролиза Reb Z, а также тщательного сравнения значений ¹H и ¹³C ЯМР Reb Z с ребаудиозидом E предположили, что смесь двух соединений, получаемая при ферментативном превращении, была установлена как 13-[(2-O-β-D-глюкопиранозил-2-O-β-D-глюкопиранозил-β-D-глюкопиранозил)окси]энт-каур-16-ен-19-овой кислоты 2-O-β-D-глюкопиранозил-β-D-глюкопиранозиловый эфир (Reb Z1) или 13-[(2-O-β-D-глюкопиранозил-β-D-глюкопиранозил)-окси]энт-каур-16-ен-19-овой кислоты [(2-O-β-D-глюкопиранозил-2-O-β-D-глюкопиранозил-β-D-глюкопиранозиловый) эфир (Reb Z2).

[154] Кислотный гидролиз соединения Reb Z. К раствору соединения Reb Z (5 мг) в MeOH (10 мл) добавляли 3 мл 5% H₂SO₄ и нагревали смесь с обратным холодильником в течение 24 часов. Затем реакционную смесь нейтрализовали насыщенным карбонатом натрия и экстрагировали этилацетатом (EtOAc) (2×25 мл), получив водную фракцию, содержащую сахар, и фракцию EtOAc, содержащую часть агликона. Водную фазу выпаривали и сравнивали со стандартным сахаром при использовании системы ТСХ EtOAc/н-бутанол/вода (2:7:1) и CH₂Cl₂/MeOH/вода (10:6:1); сахар идентифицировали как D-глюкоза.

[155] Ферментативный гидролиз соединения Reb Z. Соединение Reb Z (1 мг) растворяли в 10 мл 0,1М натрий ацетатного буфера, pH 4,5, и добавляли неочищенную пектиназу из Aspergillus niger (50 мкл, Sigma-Aldrich, P2736). Смесь перемешивали при 50°C в течение 96 ч. В ходе реакции осаждался продукт, который фильтровали и затем кристаллизовали. Полученный продукт, полученный в результате гидролиза 1, идентифицировали как стевиол при сравнении его ТСХ со стандартным соединением и данными ¹H ЯМР спектра (Фигура 11).

[156] Смесь двух соединений, названную Reb Z, получили путем биоконверсии Ребаудиозида E с использованием ферментативной методики, и структуры охарактеризовали как 13-[(2-O-β-D-глюкопиранозил-2-O-β-D-глюкопиранозил-β-D-глюкопирано-зил)окси]энт-каур-16-ен-19-овой кислоты 2-O-β-D-глюкопиранозил-β-D-глюкопиранозиловый эфир (Reb Z1) или 13-[(2-O-β-D-глюкопиранозил-β-D-глюкопиранозил)окси]энт-каур-16-ен-19-овой кислоты [(2-O-β-D-глюкопиранозил-2-O-β-D-глюкопиранозил-β-D-глюкопиранозиловый) эфир (Reb Z2), на основе обширных исследований с помощью одно и двухмерного ЯМР, а также масс-спектральных данных высокого разрешения и гидролитических исследований.

[157] Таким образом, 1,2-19-O-глюкоза-гликозилирующая активность рекомбинантного полипептида HV1 была подтверждена его способностью переносить вторую сахарную группу на C-2' 19-O-глюкозы стевиозида с получением Ребаудиозида E. Рекомбинантный полипептид HV1 также обладает способностью переносить третью группу глюкозы на C-2’ 13-O-глюкозы или C-2’ 19-O-глюкозы ребаудиозида E с получением Reb Z1 или Reb Z2.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Conagen, Inc.

Mao, Guohong

Yu, Xiaodan

<120> RECOMBINANT PRODUCTION OF STEVIOL GLYCOSIDES

<130> 32559-17

<150> US 61/898,571

<151> 2013-11-01

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 470

<212> Белок

<213> Brachypodium distachyon

<400> 1

Met Asp Asp Ala Gly Tyr Ser Ser Ala Tyr Ser Pro Leu His Val Val

1 5 10 15

Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Gln Leu Pro Cys Leu Asp Leu

20 25 30

Ala Glu Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr

35 40 45

Pro Arg Ile Ile Ala Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Thr Ala Ala Gln

50 55 60

Leu Ile Asn Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Ser Val Asp Gly Leu Pro

65 70 75 80

Glu Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro Phe Asp Lys Phe Glu Leu

85 90 95

His Arg Lys Ala Phe Asp Gly Leu Ala Leu Pro Phe Ser Glu Phe Leu

100 105 110

Gly Ala Ala Cys Ala Lys Gly Gln Gly His Lys Pro Asp Trp Ile Leu

115 120 125

Val Asp Ile Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Val Glu His Lys

130 135 140

Val Pro Cys Ala Met Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ser Phe Ile Ala Ser

145 150 155 160

Gly Ala Gly Gln Leu Phe Glu His Ala Ala Ser Gly Val Gln Val Gln

165 170 175

Glu Arg Pro Ser Ser Thr Glu Pro Pro Lys Phe Glu Ile Glu Met Arg

180 185 190

Glu Leu Ile Ile Thr Gln Arg Ala Ser Gly Met Ser Ile Ala Glu Arg

195 200 205

Val Ser Leu Thr Leu Gln Arg Ser Asn Leu Ala Ala Met Arg Ser Cys

210 215 220

Val Glu Trp Glu Pro Glu Ser Val Pro Leu Val Ala Ser Leu Gly Val

225 230 235 240

Gly Gly Lys Pro Val Val Pro Leu Gly Leu Leu Pro Pro Ser Pro Glu

245 250 255

Gly Gly Arg Gly Val Cys Lys Asp Gly Lys Lys Asp Ala Thr Val Lys

260 265 270

Trp Leu Asp Val Gln Pro Ala Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Met Gly

275 280 285

Thr Glu Val Pro Leu Pro Ala Glu Gln Val His Glu Leu Ala Phe Gly

290 295 300

Ile Glu Leu Ala Gly Thr Arg Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Ser

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Asp Ala Asp Ile Leu Pro Pro Gly Phe Glu Asp Arg

325 330 335

Thr Ala Gly Arg Gly Leu Val Arg Thr Gly Trp Val Pro Gln Met Ser

340 345 350

Ile Leu Gly His Asp Ala Val Gly Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp

355 360 365

Asn Ser Ile Ile Glu Gly Leu Leu Phe Gly His Pro Leu Val Met Leu

370 375 380

Pro Ile Leu Gly Asp Gln Gly Pro Asn Ala Arg Leu Met Glu Gly Lys

385 390 395 400

Lys Val Gly Val Gln Val Gln Arg Asp Gly Asn Asp Gly Ser Phe Asn

405 410 415

Arg Glu Gly Val Ala Met Ala Val Arg Ala Val Met Val Glu Glu Glu

420 425 430

Ser Lys Lys Ile Phe Lys Ala Asn Ala Lys Lys Met Gln Glu Ile Val

435 440 445

Ala Asp Thr Glu Arg His Glu Arg Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln

450 455 460

Leu Arg Ser Tyr Lys Glu

465 470

<210> 2

<211> 460

<212> Белок

<213> Brachypodium distachyon

<400> 2

Met Asp Asn Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Leu His Val Val

1 5 10 15

Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Gln Leu Pro Cys Leu Asp Leu

20 25 30

Ala Glu Arg Leu Ala Leu Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr

35 40 45

Pro Arg Ile Ile Ala Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Val Ala Ala Ser

50 55 60

Leu Val Asp Leu Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Asp Gly Leu Pro

65 70 75 80

Glu Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro Tyr Glu Lys Phe Glu Leu

85 90 95

His Arg Lys Ala Phe Asp Gly Leu Ala Val Pro Phe Ser Glu Phe Leu

100 105 110

Arg Ala Ala Cys Ala Glu Glu Gly Lys Lys Pro Asp Trp Ile Ile Val

115 120 125

Asp Thr Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Ile Glu His Lys Val

130 135 140

Pro Cys Ala Met Leu Met Leu Gly Ala Ala Gly Leu Ile Val Ala Trp

145 150 155 160

Ala Thr Gln Pro Ser Lys His Val Thr Ser Glu Gln Gln Glu Gln Ser

165 170 175

Ala Ala Glu Pro Pro Arg Phe Glu Thr Glu Arg Arg Lys Leu Ala Thr

180 185 190

Thr Gln Arg Ala Ser Gly Met Ser Ile Ala Glu Arg Cys Ser Val Thr

195 200 205

Leu Glu Arg Cys Asn Leu Val Ala Met Arg Ser Cys Leu Glu Trp Glu

210 215 220

Pro Glu Ser Ile Pro Leu Ala Thr Thr Ile Gly Gly Lys Gln Leu Val

225 230 235 240

Pro Leu Gly Leu Leu Pro Pro Ser Pro Glu Gly Gly Arg Gly Val Ser

245 250 255

Lys Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Thr Lys Ser

260 265 270

Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Ala Lys Glu

275 280 285

Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg Phe Leu

290 295 300

Trp Ser Leu Arg Lys Pro Ser Gly Val Ser Asp Ala Asp Ile Leu Pro

305 310 315 320

Ser Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Leu Val Thr Met Gly

325 330 335

Trp Val Pro Gln Ile Ser Val Leu Ala His Gly Ala Val Gly Ala Phe

340 345 350

Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Ile Glu Gly Leu Gln Phe Gly

355 360 365

His Pro Leu Val Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro Asn Ala

370 375 380

Arg Met Met Glu Gly Arg Lys Val Gly Val Gln Val Pro Arg Asp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Thr Thr Val Arg Ala

405 410 415

Val Ala Val Glu Glu Glu Gly Asn Arg Ile Phe Thr Ala Asn Ala Lys

420 425 430

Lys Met Gln Glu Ile Val Ala Asp Lys Gly Cys His Asp Lys Tyr Val

435 440 445

Asp Lys Phe Ile Gln Lys Leu Arg Ser Tyr Met Glu

450 455 460

<210> 3

<211> 466

<212> Белок

<213> Brachypodium distachyon

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (407)..(407)

<223> Неизвестный

<400> 3

Met Asp Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Ser Pro Leu Arg Ile Ala Ile

1 5 10 15

Val Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Tyr Leu Glu Leu Ala

20 25 30

Glu Arg Leu Ala Ala Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr Pro

35 40 45

Arg Asn Leu Ala Arg Leu Pro Pro Leu Arg Pro Ala Ala Ala Pro Arg

50 55 60

Val Asp Leu Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly Leu Pro Asp

65 70 75 80

Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro Asp Asp Glu Arg Glu Pro Leu

85 90 95

Trp Lys Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Ala Gly Phe Leu Thr

100 105 110

Ala Ala Cys Ala Asp Glu Gly Thr Arg Pro His Trp Ile Ile Ala Asp

115 120 125

Ser Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro

130 135 140

Cys Ala Met Leu Leu Pro Thr Ala Ala Leu Ile Ala Ala Ser Ala Gly

145 150 155 160

Ala Gly Arg Pro Ser Pro Glu Glu His Ala Glu Gln Gln Pro Gln Pro

165 170 175

Arg Tyr Glu Gln Glu Gly Arg Ala Thr Leu Leu Thr Asp Gly Asp Met

180 185 190

Ser Gly Met Ser Ile Met Gln Arg Ser Val Leu Thr Leu Glu Arg Cys

195 200 205

Lys Leu Thr Ala Ile Arg Ser Cys Val Glu Trp Glu Pro Glu Cys Leu

210 215 220

Pro Leu Val Ser Glu Phe Ile Gly Lys Pro Val Val Pro Leu Gly Leu

225 230 235 240

Leu Pro Pro Ser Pro Asp Gly Gly Arg Arg Ala Ala Asn Thr Asn Gly

245 250 255

Glu Asp Ala Thr Ile Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Pro Asn Ser Val

260 265 270

Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Pro Val Glu Gln Thr

275 280 285

His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Lys Thr Arg Phe Leu Trp

290 295 300

Ala Leu Arg Lys Pro Ser Gly Val Leu Asp Ala Glu Met Leu Pro Met

305 310 315 320

Gly Phe Gln Glu Arg Ile His Gly His Gly Leu Val Thr Thr Gly Trp

325 330 335

Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Gly Ala Val Gly Ser Phe Leu

340 345 350

Thr His Cys Gly Arg Asn Ser Leu Ile Glu Gly Leu Leu Phe Gly His

355 360 365

Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro Asn Ala Arg

370 375 380

Leu Met Glu Gly Lys Lys Val Gly Leu Gln Val Ala Arg Asn Glu Asn

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Asp Arg Xaa Gly Val Ala Ser Ala Val Arg Ser Val

405 410 415

Met Leu Glu Glu Asp Ala Arg Lys Ser Phe Val Ala Asn Ala Leu Glu

420 425 430

Met Gln Lys Ile Val Ala Asp Lys Glu Arg His Glu Arg Tyr Ile Asp

435 440 445

Glu Phe Ile His Gln Leu Arg Ser Tyr Thr Ser Ala Pro Thr Ser Asp

450 455 460

Arg Asn

465

<210> 4

<211> 460

<212> Белок

<213> Brachypodium distachyon

<400> 4

Met Asp Ala Ala Gly Ser Ser Pro Pro Leu Arg Ile Val Ile Val Pro

1 5 10 15

Trp Leu Ala Phe Gly His Met Leu Pro Tyr Leu Glu Leu Ala Glu Arg

20 25 30

Leu Ala Ala Arg Gly His Arg Val Ser Tyr Val Ser Thr Pro Arg Asn

35 40 45

Leu Ala Arg Leu Pro Pro Leu Arg Pro Ala Ala Ala Pro Arg Val Asp

50 55 60

Leu Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly Leu Pro Asp Gly Ala

65 70 75 80

Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro Asp Asp Glu Arg Glu Pro Leu Trp Lys

85 90 95

Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Arg Ser Val Pro Arg Gln Arg

100 105 110

Cys Ala Arg Asp Asp Thr Arg Pro His Trp Ile Leu Ala Asp Cys Phe

115 120 125

His His Trp Ala Val Asp Ala Ala Leu Asp His Lys Val Pro Cys Ala

130 135 140

Met Phe Leu Pro Thr Ala Ala Val Ile Ala Thr Met Pro Gln Arg Gln

145 150 155 160

Pro Asp His Ala Ala Ser Ala Pro Ala Glu His Ala Val Pro Arg His

165 170 175

Glu Ile Glu Ala Thr Ala Pro Leu Leu Ser Asp Gln Gly Val Ser Gly

180 185 190

Met Ser Ile Val Gln Arg Tyr Leu Leu Thr Lys Glu Arg Cys Thr Val

195 200 205

Gly Ala Ile Arg Ser Cys Val Glu Trp Glu Pro Asp Ser Tyr Pro Leu

210 215 220

Ala Ala Thr Ile Leu Gly Met Pro Val Val Pro Leu Gly Leu Leu Pro

225 230 235 240

Pro Ser Pro Asp Gly Gly Arg Arg Ala Pro Asp Gly Ser Glu His Ala

245 250 255

Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Pro Ser Ser Val Val Tyr Val

260 265 270

Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Pro Val Asp His Val His Glu Leu

275 280 285

Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg Phe Leu Trp Ala Leu Arg

290 295 300

Lys Pro Asn Gly Val Pro Asp Ala Asp Met Leu Pro Ala Gly Phe Gln

305 310 315 320

Asp Arg Thr Arg Gly His Gly Leu Val Thr Thr Gly Trp Val Pro Gln

325 330 335

Met Ser Ile Leu Ala His Gly Ala Val Gly Ala Phe Leu Thr His Cys

340 345 350

Gly Arg Asn Ser Leu Ile Glu Gly Leu Leu Leu Gly His Pro Leu Val

355 360 365

Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro Asn Ala Arg Ala Met Glu

370 375 380

Arg Lys Lys Val Gly Leu Gln Val Lys Arg Asp Asp Asn Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Asn Arg Glu Gly Val Ala Asp Ala Val Arg Gly Val Met Val Asp

405 410 415

Gly Glu Ala Arg Arg Gly Phe Val Ala Asn Ala Arg Lys Met Gln Asn

420 425 430

Val Val Ala Asp Glu Glu Leu Gln Glu Arg Tyr Val Asp Gly Phe Val

435 440 445

Gln Glu Leu Arg Ser Tyr Thr Thr Ala Ala Ser Glu

450 455 460

<210> 5

<211> 471

<212> Белок

<213> Brachypodium distachyon

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (323)..(323)

<223> Неизвестный

<400> 5

Met Asp Asp Gly Ser Ser Ser Ser Pro Leu His Val Val Ile Cys Pro

1 5 10 15

Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu Asp Leu Ala Gln Cys

20 25 30

Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr Pro Cys Asn

35 40 45

Ile Ala Cys Leu Leu Leu Val Pro Pro Ala Met Ala Pro Leu Val Asp

50 55 60

Phe Val Glu Leu Pro Phe Pro Phe Pro His Val Asp Gly Leu Ser Glu

65 70 75 80

Arg Lys Leu His Ile Pro Pro Pro Ile Gly Asp Lys Phe Glu Leu His

85 90 95

Arg Lys Ala Phe Asp Gly Leu Ala Met Pro Phe Ser Glu Leu Leu Gly

100 105 110

Ala Ser Cys Ala Glu Gly Gly Lys Lys Leu Asp Trp Val Ile Val Asp

115 120 125

Ile Phe His His Trp Ala Ala Ala Asp Thr Leu Glu Tyr Lys Val Pro

130 135 140

Ile Gly Ala Ala Asn Val Ile Ala Thr Trp His Gly Arg Leu Val Lys

145 150 155 160

His Thr Thr Met Ser Lys Gln Glu Gln Pro Ala Ser Lys Leu Pro Arg

165 170 175

Phe Glu Ile Glu Arg Arg Gln Leu Ser Thr Thr Gln Arg Ala Ser Gly

180 185 190

Met Ser Ile Ala Glu Arg Ile Ser Leu Thr Leu Arg Arg Cys Asn Leu

195 200 205

Val Val Met Arg Thr Arg Leu Glu Trp Glu Pro Glu Ser Val Pro Leu

210 215 220

Ala Ala Ser Leu Gly Gly Lys Pro Val Ile Ser Leu Gly Leu Leu Pro

225 230 235 240

Pro Leu Arg Lys Gly Cys Cys Gly Val Thr Glu Asp Gly Lys Asn Ile

245 250 255

Met Cys Trp Leu Asp Leu Gln Pro Ala Lys Ser Val Val Tyr Val Ala

260 265 270

Leu Gly Thr Glu Val Pro Leu Pro Val Glu Gln Met His Glu Leu Ala

275 280 285

Leu Arg Leu Glu Leu Ala Gly Met Gln Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys

290 295 300

Pro Arg Gly Val His Glu Ala Glu Ile Leu Pro Leu Gly Phe Glu Glu

305 310 315 320

Arg Met Xaa Gly Leu Val Thr Thr Gly Leu Ala Pro Gln Ile Asn Ile

325 330 335

Leu Ala His Gly Ala Val Gly Thr Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Ser

340 345 350

Leu Thr Ile Glu Gly Leu Leu Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro

355 360 365

Met Phe Gly Asp Gln Gly Pro Asn Ala Arg Leu Met Glu Gly Arg Lys

370 375 380

Val Gly Val Gln Val Pro Arg Asn Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg

385 390 395 400

Glu Gly Val Ala Thr Thr Val Arg Ala Val Thr Val Glu Glu Glu Gly

405 410 415

Lys Arg Ile Phe Thr Ser Asn Ala Lys Lys Met Gln Glu Ile Lys Ala

420 425 430

Asp Thr Glu Cys Gln Glu Arg Tyr Ile Asn Gly Phe Ile Lys Lys Leu

435 440 445

Arg Ser Tyr Lys Glu Pro Asp Leu Ala His Pro Ile Cys Pro Val Thr

450 455 460

Ser Ser Pro Thr His Tyr Glu

465 470

<210> 6

<211> 459

<212> Белок

<213> Hordeum vulgare

<400> 6

Met Asp Gly Asn Ser Ser Ser Ser Pro Leu His Val Val Ile Cys Pro

1 5 10 15

Trp Leu Ala Leu Gly His Leu Leu Pro Cys Leu Asp Ile Ala Glu Arg

20 25 30

Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr Pro Arg Asn

35 40 45

Ile Ala Arg Leu Pro Pro Leu Arg Pro Ala Val Ala Pro Leu Val Asp

50 55 60

Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro His Val Asp Gly Leu Pro Glu Gly Ala

65 70 75 80

Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro Tyr Asp Lys Phe Glu Leu His Arg Lys

85 90 95

Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Ser Glu Phe Leu Arg Ala Ala

100 105 110

Cys Ala Glu Gly Ala Gly Ser Arg Pro Asp Trp Leu Ile Val Asp Thr

115 120 125

Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Val Glu Asn Lys Val Pro Cys

130 135 140

Val Met Leu Leu Leu Gly Ala Ala Thr Val Ile Ala Gly Phe Ala Arg

145 150 155 160

Gly Val Ser Glu His Ala Ala Ala Ala Val Gly Lys Glu Arg Pro Ala

165 170 175

Ala Glu Ala Pro Ser Phe Glu Thr Glu Arg Arg Lys Leu Met Thr Thr

180 185 190

Gln Asn Ala Ser Gly Met Thr Val Ala Glu Arg Tyr Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Met Arg Ser Asp Leu Val Ala Ile Arg Ser Cys Ala Glu Trp Glu Pro

210 215 220

Glu Ser Val Ala Ala Leu Thr Thr Leu Ala Gly Lys Pro Val Val Pro

225 230 235 240

Leu Gly Leu Leu Pro Pro Ser Pro Glu Gly Gly Arg Gly Val Ser Lys

245 250 255

Glu Asp Ala Ala Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala Lys Ser Val

260 265 270

Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Arg Ala Glu Gln Val

275 280 285

His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly Ala Arg Phe Leu Trp

290 295 300

Ala Leu Arg Lys Pro Thr Asp Ala Pro Asp Ala Ala Val Leu Pro Pro

305 310 315 320

Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Leu Val Val Thr Gly Trp

325 330 335

Val Pro Gln Ile Gly Val Leu Ala His Gly Ala Val Ala Ala Phe Leu

340 345 350

Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Leu Phe Gly His

355 360 365

Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Ser Ser Asp Gln Gly Pro Asn Ala Arg

370 375 380

Leu Met Glu Gly Arg Lys Val Gly Met Gln Val Pro Arg Asp Glu Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Arg Arg Glu Asp Val Ala Ala Thr Val Arg Ala Val

405 410 415

Ala Val Glu Glu Asp Gly Arg Arg Val Phe Thr Ala Asn Ala Lys Lys

420 425 430

Met Gln Glu Ile Val Ala Asp Gly Ala Cys His Glu Arg Cys Ile Asp

435 440 445

Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Ala

450 455

<210> 7

<211> 1380

<212> ДНК

<213> Hordeum vulgare

<400> 7

atggatggta actcctcctc ctcgccgctg catgtggtca tttgtccgtg gctggctctg 60

ggtcacctgc tgccgtgtct ggatattgct gaacgtctgg cgtcacgcgg ccatcgtgtc 120

agttttgtgt ccaccccgcg caacattgcc cgtctgccgc cgctgcgtcc ggctgttgca 180

ccgctggttg atttcgtcgc actgccgctg ccgcatgttg acggtctgcc ggagggtgcg 240

gaatcgacca atgatgtgcc gtatgacaaa tttgaactgc accgtaaggc gttcgatggt 300

ctggcggccc cgtttagcga atttctgcgt gcagcttgcg cagaaggtgc aggttctcgc 360

ccggattggc tgattgtgga cacctttcat cactgggcgg cggcggcggc ggtggaaaac 420

aaagtgccgt gtgttatgct gctgctgggt gcagcaacgg tgatcgctgg tttcgcgcgt 480

ggtgttagcg aacatgcggc ggcggcggtg ggtaaagaac gtccggctgc ggaagccccg 540

agttttgaaa ccgaacgtcg caagctgatg accacgcaga atgcctccgg catgaccgtg 600

gcagaacgct atttcctgac gctgatgcgt agcgatctgg ttgccatccg ctcttgcgca 660

gaatgggaac cggaaagcgt ggcagcactg accacgctgg caggtaaacc ggtggttccg 720

ctgggtctgc tgccgccgag tccggaaggc ggtcgtggcg tttccaaaga agatgctgcg 780

gtccgttggc tggacgcaca gccggcaaag tcagtcgtgt acgtcgcact gggttcggaa 840

gtgccgctgc gtgcggaaca agttcacgaa ctggcactgg gcctggaact gagcggtgct 900

cgctttctgt gggcgctgcg taaaccgacc gatgcaccgg acgccgcagt gctgccgccg 960

ggtttcgaag aacgtacccg cggccgtggt ctggttgtca cgggttgggt gccgcagatt 1020

ggcgttctgg ctcatggtgc ggtggctgcg tttctgaccc actgtggctg gaactctacg 1080

atcgaaggcc tgctgttcgg tcatccgctg attatgctgc cgatcagctc tgatcagggt 1140

ccgaatgcgc gcctgatgga aggccgtaaa gtcggtatgc aagtgccgcg tgatgaatca 1200

gacggctcgt ttcgtcgcga agatgttgcc gcaaccgtcc gcgccgtggc agttgaagaa 1260

gacggtcgtc gcgtcttcac ggctaacgcg aaaaagatgc aagaaattgt ggccgatggc 1320

gcatgccacg aacgttgtat tgacggtttt atccagcaac tgcgcagtta caaggcgtga 1380

<210> 8

<211> 488

<212> Белок

<213> Hordeum vulgare

<400> 8

Met Asp Ala Gly Ser Ser Thr Ala Gly Pro Leu Arg Ile Val Ile Cys

1 5 10 15

Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Tyr Leu Glu Leu Ala Glu

20 25 30

Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ala Phe Val Ser Thr Pro Arg

35 40 45

Asn Leu Ala Arg Leu Pro Pro Pro Ala Ser Pro Cys Ser Val Asp Leu

50 55 60

Val Ala Leu Gln Leu Pro Arg Val Asp Gly Leu Pro Glu Gly Ala Glu

65 70 75 80

Ser Thr Asn Asp Val Pro Asp Glu Met Arg Glu Leu His Trp Lys Ala

85 90 95

Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Ala Asp Phe Leu Ala Ala Ala Cys

100 105 110

Ala Asp Asp Gly Arg Arg Pro His Trp Ile Ile Ala Asp Cys Phe His

115 120 125

His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Asp His Lys Val Pro Cys Ala Val

130 135 140

Leu Leu Pro Thr Ala Ala Met Leu Ala Ala Ala Pro Arg Gln Gln Pro

145 150 155 160

Leu Gly Ser Lys Pro Val Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ser Val Leu Gly

165 170 175

Gln Ala Ala Ala Ala Val Arg Leu Ala Val Pro Ser Tyr Glu Arg Asp

180 185 190

Asp Val Ala Pro Ala Tyr Ala Asp Asp Cys Ala Ser Gly Met Ser Ile

195 200 205

Ala Gln Arg Trp Phe Leu Ala Lys Glu Arg Cys Thr Val Leu Ala Ile

210 215 220

Arg Ser Cys Val Glu Trp Glu Pro Glu Thr Phe Pro Leu Val Glu Ala

225 230 235 240

Leu Leu Gly Lys Pro Val Val Pro Leu Gly Leu Leu Pro Pro Ser Ala

245 250 255

Asp Gly Gly Arg Arg Arg Ala Ala Gly Ser Ser Glu Asp His Val Thr

260 265 270

Leu Arg Trp Leu Glu Glu Gln Pro Pro Asp Ser Val Val Tyr Ile Ala

275 280 285

Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Ser Ile Glu Gln Val His Glu Leu Ala

290 295 300

Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys

305 310 315 320

Pro Ala Gly Ala Val Val Gly Asn Asn Asp Asp Asp Thr Leu Pro Pro

325 330 335

Gly Phe Arg Asp Cys Thr Arg Gly His Gly Leu Val Thr Met Gly Trp

340 345 350

Val Pro Gln Ile Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly Ala Phe Leu

355 360 365

Thr His Cys Gly Arg Asn Ser Leu Ile Glu Gly Leu Leu Phe Gly His

370 375 380

Pro Leu Val Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro Asn Ala Arg

385 390 395 400

Gln Met Glu Ala Lys Lys Val Gly Leu Gln Val Ala Arg Asp Asp Asp

405 410 415

Asp Gly Ser Phe Asp Arg His Gly Val Ala Thr Ala Val Arg Ala Val

420 425 430

Met Val Asp Gly Glu Ala Arg Arg Gly Phe Val Ala Asn Ala Ile Lys

435 440 445

Met Gln Ala Ile Val Ala Asp Lys Glu Arg His Glu Arg Tyr Ile Asp

450 455 460

Gly Phe Val Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Leu Gln Ala Thr Asp Asp Leu

465 470 475 480

Thr Thr Ala Thr Pro Asn Ser Ser

485

<210> 9

<211> 808

<212> Белок

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 9

Met Ala Asn Ala Glu Arg Met Ile Thr Arg Val His Ser Gln Arg Glu

1 5 10 15

Arg Leu Asn Glu Thr Leu Val Ser Glu Arg Asn Glu Val Leu Ala Leu

20 25 30

Leu Ser Arg Val Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln Gln Asn Gln

35 40 45

Ile Ile Ala Glu Phe Glu Ala Leu Pro Glu Gln Thr Arg Lys Lys Leu

50 55 60

Glu Gly Gly Pro Phe Phe Asp Leu Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile

65 70 75 80

Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val

85 90 95

Trp Glu Tyr Leu Arg Val Asn Leu His Ala Leu Val Val Glu Glu Leu

100 105 110

Gln Pro Ala Glu Phe Leu His Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Val

115 120 125

Lys Asn Gly Asn Phe Thr Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn Ala

130 135 140

Ser Ile Pro Arg Pro Thr Leu His Lys Tyr Ile Gly Asn Gly Val Asp

145 150 155 160

Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Asp Lys Glu Ser

165 170 175

Leu Leu Pro Leu Leu Lys Phe Leu Arg Leu His Ser His Gln Gly Lys

180 185 190

Asn Leu Met Leu Ser Glu Lys Ile Gln Asn Leu Asn Thr Leu Gln His

195 200 205

Thr Leu Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Ala Glu Leu Lys Ser Glu Thr

210 215 220

Leu Tyr Glu Glu Phe Glu Ala Lys Phe Glu Glu Ile Gly Leu Glu Arg

225 230 235 240

Gly Trp Gly Asp Asn Ala Glu Arg Val Leu Asp Met Ile Arg Leu Leu

245 250 255

Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu Glu Thr Phe Leu

260 265 270

Gly Arg Val Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly

275 280 285

Tyr Phe Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln

290 295 300

Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Ile Glu Met Leu

305 310 315 320

Gln Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Lys Pro Arg Ile Leu Ile

325 330 335

Leu Thr Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Glu Arg

340 345 350

Leu Glu Arg Val Tyr Asp Ser Glu Tyr Cys Asp Ile Leu Arg Val Pro

355 360 365

Phe Arg Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu

370 375 380

Val Trp Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Ala Ala Val Glu Leu

385 390 395 400

Ser Lys Glu Leu Asn Gly Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser

405 410 415

Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr

420 425 430

Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Asp Ser

435 440 445

Asp Ile Tyr Trp Lys Lys Leu Asp Asp Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln

450 455 460

Phe Thr Ala Asp Ile Phe Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr

465 470 475 480

Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Glu Thr Val Gly Gln Tyr

485 490 495

Glu Ser His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His

500 505 510

Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala

515 520 525

Asp Met Ser Ile Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Glu Lys Arg Arg Leu Thr

530 535 540

Lys Phe His Ser Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser Asp Val Glu Asn

545 550 555 560

Lys Glu His Leu Cys Val Leu Lys Asp Lys Lys Lys Pro Ile Leu Phe

565 570 575

Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Leu Ser Gly Leu Val Glu

580 585 590

Trp Tyr Gly Lys Asn Thr Arg Leu Arg Glu Leu Ala Asn Leu Val Val

595 600 605

Val Gly Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Asn Glu Glu Lys Ala

610 615 620

Glu Met Lys Lys Met Tyr Asp Leu Ile Glu Glu Tyr Lys Leu Asn Gly

625 630 635 640

Gln Phe Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asp Arg Val Arg Asn Gly Glu

645 650 655

Leu Tyr Arg Tyr Ile Cys Asp Thr Lys Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala

660 665 670

Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly

675 680 685

Leu Pro Thr Phe Ala Thr Cys Lys Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val

690 695 700

His Gly Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly Asp Gln Ala

705 710 715 720

Ala Asp Thr Leu Ala Asp Phe Phe Thr Lys Cys Lys Glu Asp Pro Ser

725 730 735

His Trp Asp Glu Ile Ser Lys Gly Gly Leu Gln Arg Ile Glu Glu Lys

740 745 750

Tyr Thr Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Arg Leu Leu Thr Leu Thr Gly Val

755 760 765

Tyr Gly Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg Leu Glu Ala Arg

770 775 780

Arg Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Pro Leu Ala Gln

785 790 795 800

Ala Val Pro Leu Ala Gln Asp Asp

805

<210> 10

<211> 2427

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 10

atggcaaacg ctgaacgtat gataacgcgc gtccacagcc aacgtgagcg tttgaacgaa 60

acgcttgttt ctgagagaaa cgaagtcctt gccttgcttt ccagggttga agccaaaggt 120

aaaggtattt tacaacaaaa ccagatcatt gctgaattcg aagctttgcc tgaacaaacc 180

cggaagaaac ttgaaggtgg tcctttcttt gaccttctca aatccactca ggaagcaatt 240

gtgttgccac catgggttgc tctagctgtg aggccaaggc ctggtgtttg ggaatactta 300

cgagtcaatc tccatgctct tgtcgttgaa gaactccaac ctgctgagtt tcttcatttc 360

aaggaagaac tcgttgatgg agttaagaat ggtaatttca ctcttgagct tgatttcgag 420

ccattcaatg cgtctatccc tcgtccaaca ctccacaaat acattggaaa tggtgttgac 480

ttccttaacc gtcatttatc ggctaagctc ttccatgaca aggagagttt gcttccattg 540

cttaagttcc ttcgtcttca cagccaccag ggcaagaacc tgatgttgag cgagaagatt 600

cagaacctca acactctgca acacaccttg aggaaagcag aagagtatct agcagagctt 660

aagtccgaaa cactgtatga agagtttgag gccaagtttg aggagattgg tcttgagagg 720

ggatggggag acaatgcaga gcgtgtcctt gacatgatac gtcttctttt ggaccttctt 780

gaggcgcctg atccttgcac tcttgagact tttcttggaa gagtaccaat ggtgttcaac 840

gttgtgatcc tctctccaca tggttacttt gctcaggaca atgttcttgg ttaccctgac 900

actggtggac aggttgttta cattcttgat caagttcgtg ctctggagat agagatgctt 960

caacgtatta agcaacaagg actcaacatt aaaccaagga ttctcattct aactcgactt 1020

ctacctgatg cggtaggaac tacatgcggt gaacgtctcg agagagttta tgattctgag 1080

tactgtgata ttcttcgtgt gcccttcaga acagagaagg gtattgttcg caaatggatc 1140

tcaaggttcg aagtctggcc atatctagag acttacaccg aggatgctgc ggttgagcta 1200

tcgaaagaat tgaatggcaa gcctgacctt atcattggta actacagtga tggaaatctt 1260

gttgcttctt tattggctca caaacttggt gtcactcagt gtaccattgc tcatgctctt 1320

gagaaaacaa agtacccgga ttctgatatc tactggaaga agcttgacga caagtaccat 1380

ttctcatgcc agttcactgc ggatattttc gcaatgaacc acactgattt catcatcact 1440

agtactttcc aagaaattgc tggaagcaaa gaaactgttg ggcagtatga aagccacaca 1500

gcctttactc ttcccggatt gtatcgagtt gttcacggga ttgatgtgtt tgatcccaag 1560

ttcaacattg tctctcctgg tgctgatatg agcatctact tcccttacac agaggagaag 1620

cgtagattga ctaagttcca ctctgagatc gaggagctcc tctacagcga tgttgagaac 1680

aaagagcact tatgtgtgct caaggacaag aagaagccga ttctcttcac aatggctagg 1740

cttgatcgtg tcaagaactt gtcaggtctt gttgagtggt acgggaagaa cacccgcttg 1800

cgtgagctag ctaacttggt tgttgttgga ggagacagga ggaaagagtc aaaggacaat 1860

gaagagaaag cagagatgaa gaaaatgtat gatctcattg aggaatacaa gctaaacggt 1920

cagttcaggt ggatctcctc tcagatggac cgggtaagga acggtgagct gtaccggtac 1980

atctgtgaca ccaagggtgc ttttgtccaa cctgcattat atgaagcctt tgggttaact 2040

gttgtggagg ctatgacttg tggtttaccg actttcgcca cttgcaaagg tggtccagct 2100

gagatcattg tgcacggtaa atcgggtttc cacattgacc cttaccatgg tgatcaggct 2160

gctgatactc ttgctgattt cttcaccaag tgtaaggagg atccatctca ctgggatgag 2220

atctcaaaag gagggcttca gaggattgag gagaaataca cttggcaaat ctattcacag 2280

aggctcttga cattgactgg tgtgtatgga ttctggaagc atgtctcgaa ccttgaccgt 2340

cttgaggctc gccgttacct tgaaatgttc tatgcattga agtatcgccc attggctcag 2400

gctgttcctc ttgcacaaga tgattga 2427

<210> 11

<211> 458

<212> Белок

<213> Stevia rebaudiana

<400> 11

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

20 25 30

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

35 40 45

Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

50 55 60

Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro

65 70 75 80

Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His

85 90 95

Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

100 105 110

Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr

115 120 125

Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu

130 135 140

Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln

145 150 155 160

Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile

195 200 205

Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro

225 230 235 240

Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro

260 265 270

Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln

290 295 300

Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp

305 310 315 320

Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val

325 330 335

Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala

340 345 350

Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu

355 360 365

Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn

370 375 380

Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val

405 410 415

Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln

420 425 430

Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu

435 440 445

Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

<210> 12

<211> 1377

<212> ДНК

<213> Stevia rebaudiana

<400> 12

atggagaata agacagaaac aaccgtaaga cggaggcgga ggattatctt gttccctgta 60

ccatttcagg gccatattaa tccgatcctc caattagcaa acgtcctcta ctccaaggga 120

ttttcaataa caatcttcca tactaacttt aacaagccta aaacgagtaa ttatcctcac 180

tttacattca ggttcattct agacaacgac cctcaggatg agcgtatctc aaatttacct 240

acgcatggcc ccttggcagg tatgcgaata ccaataatca atgagcatgg agccgatgaa 300

ctccgtcgcg agttagagct tctcatgctc gcaagtgagg aagacgagga agtttcgtgc 360

ctaataactg atgcgctttg gtacttcgcc caatcagtcg cagactcact gaatctacgc 420

cgtttggtcc ttatgacaag ttcattattc aactttcacg cacatgtatc actgccgcaa 480

tttgacgagt tgggttacct ggacccggat gacaaaacgc gattggagga acaagcgtcg 540

ggcttcccca tgctgaaagt caaagatatt aagagcgctt atagtaattg gcaaattctg 600

aaagaaattc tcggaaaaat gataaagcaa accaaagcgt cctctggagt aatctggaac 660

tccttcaagg agttagagga atctgaactt gaaacggtca tcagagaaat ccccgctccc 720

tcgttcttaa ttccactacc caagcacctt actgcaagta gcagttccct cctagatcat 780

gaccgaaccg tgtttcagtg gctggatcag caacccccgt cgtcagttct atatgtaagc 840

tttgggagta cttcggaagt ggatgaaaag gacttcttag agattgcgcg agggctcgtg 900

gatagcaaac agagcttcct gtgggtagtg agaccgggat tcgttaaggg ctcgacgtgg 960

gtcgagccgt tgccagatgg ttttctaggg gagagaggga gaatcgtgaa atgggttcca 1020

cagcaagagg ttttggctca cggagctata ggggcctttt ggacccactc tggttggaat 1080

tctactcttg aaagtgtctg tgaaggcgtt ccaatgatat tttctgattt tgggcttgac 1140

cagcctctaa acgctcgcta tatgtctgat gtgttgaagg ttggcgtgta cctggagaat 1200

ggttgggaaa ggggggaaat tgccaacgcc atacgccggg taatggtgga cgaggaaggt 1260

gagtacatac gtcagaacgc tcgggtttta aaacaaaaag cggacgtcag ccttatgaag 1320

ggaggtagct cctatgaatc cctagaatcc ttggtaagct atatatcttc gttataa 1377

<---

1. Способ получения соединения стевиол-гликозида или композиции стевиол–гликозидов, включающий (А) инкубацию субстрата и уридиндифосфат (УДФ)-глюкозы в присутствии рекомбинантной УДФ-гликозилтрансферазы, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности с SEQ ID No: 6, или (B) инкубацию субстрата, сахарозы, УДФ и УДФ-глюкозы в присутствии рекомбинантной УДФ-гликозилтрансферазы, содержащей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности с SEQ ID No: 6, и сахарозосинтазы в течение времени, достаточного для получения композиции стевиол-гликозида или соединения стевиол-гликозида; причем субстратом является ребаудиозид Е.

2. Способ по п.1, в котором используют сахарозосинтазу, выбранную из группы, состоящей из сахарозосинтазы 1 Arabidopsis, сахарозосинтазы 3 Arabidopsis, сахарозосинтазы Vigna radiate и их функциональных гомологов.

3. Способ по п.2, в котором указанная сахарозосинтаза имеет по меньшей мере 80% идентичности с аминокислотной последовательностью сахарозосинтазы 1 Arabidopsis thaliana, как указано в SEQ ID No: 9.

4. Способ по п.1, в котором рекомбинантная УДФ-гликозилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID NO: 6.

5. Способ по п.1, в котором рекомбинантная УДФ-гликозилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности с SEQ ID NO: 6.

6. Способ по п.1, в котором рекомбинантная УДФ-гликозилтрансфераза состоит из аминокислотной последовательности гликозилтрансферазы HV1 согласно SEQ ID NO: 6.

7. Способ по п.1, в котором глюкозный фрагмент из УДФ-глюкозы переносят и ковалентно связывают с С2'-19-О-глюкозой ребаудиозида Е с получением ребаудиозида Z2.

8. Соединение ребаудиозида Z2, имеющее структуру:

.

9. Подсластитель, содержащий соединение, имеющее химическую структуру:

.

10. Подсластитель по п.9, содержащий по меньшей мере один компонент из числа наполнителя, объемообразующего вещества и ингибитора слеживания.

11. Применение подсластителя по п.9 в пищевом продукте.

12. Применение по п.11, в котором пищевой продукт выбран из группы, состоящей из напитков, кондитерских изделий, хлебобулочных изделий, печенья и жевательной резинки.