Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов

Авторы патента:

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

G01N33/00 - Исследование или анализ материалов особыми способами, не отнесенными к предыдущим группам

Владельцы патента RU 2741199:

Федеральное государственное учреждение"Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) (RU)

Изобретение относится к иммунологии, медицинской и ветеринарной диагностике и представляет собой способ проведения иммунохроматографической серодиагностики. Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов для определения специфических антител посредством использования (1) мультимембранного композита, в котором на функциональном участке иммобилизуется антиген патогенного организма, (2) раствора, содержащего меченый иммуноглобулин-связывающий белок; (3) смывающего буфера характеризуется тем, что на разные участки начальной мембраны мультимембранного композита последовательно добавляются: проба, раствор, содержащий меченый иммуноглобулин-связывающий белок; и смывающий буфер; при этом зоны для нанесения реагентов располагаются следующим образом: зона для меченого иммуноглобулин-связывающего белка располагается между зоной для нанесения пробы и зоной для нанесения смывающего буфера; зона для нанесения пробы соприкасается с рабочей мембраной тест-полоски, на которой располагается аналитическая зона, и при этом отсутствует подложка для нанесения конъюгата. Изобретение обеспечивает повышение достоверности анализа. 1 пр., 2 ил.

Изобретение относится к области иммунологии, медицинской и ветеринарной диагностике и представляет собой способ проведения иммунохроматографической серодиагностики. Одним из основных методов скрининговой диагностики бруцеллеза является серодиагностика - определение специфических антител против антигенов возбудителя бруцеллеза в крови зараженных животных (P. Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology-E-Book, 13th ed.; Elsevier Ltd.: St. Louis, MO, USA, 2013; p. 1056. ISBN 9780323083300.). Особенно перспективным представляется реализация серодиагностики в формате иммунохроматографии (ИХ), позволяющей проводить диагностику непосредственно на месте отбора проб неквалифицированным персоналом. Принцип работы ИХ основан на движении жидкой пробы вдоль мембран (формирующих тест-полоску) под действием капиллярных сил, которое приводит к последовательному взаимодействию реагентов на разных участках мембран и окрашиванию функциональных участков тест-полоски. Благодаря такой реализации анализа количество манипуляционных стадий сводится к минимуму, что делает ИХ идеальным решением для внелабораторной диагностики.

Традиционная схема иммунохроматографического анализа для серодиагностики основана на взаимодействии иммуноглобулинов в тестируемой сыворотке крови с меченым иммуноглобулин-связывающим реагентом (обычно в качестве такового реагента выбирают антивидовые антитела, белок А из Staphylococcus aureus или белок G из Streptococcus spp.). Традиционно меченый иммуноглобулин-связывающий реагент предварительно наносится и высушивается на специальной подложке, расположенной между мембраной для нанесения пробы и рабочей мембраной с аналитической зоной. После добавления жидкой пробы она протекает через подложку с меченым иммуноглобулин-связывающим реагентом. Вследствие этого проба смешивается с меченым иммуноглобулин-связывающим реагентом, который связывает все иммуноглобулины в пробе. Последующая детекция специфических антител, образовавших комплекс с меткой, осуществляется путем их взаимодействия в аналитической зоне тест-полоски с иммобилизованным антигеном, что приводит к концентрированию метки в аналитической зоне и формированию окрашенной полосы (Sajid, M., Kawde, A.N., & Daud, M. (2015). Designs, formats and applications of lateral flow assay: A literature review. Journal of Saudi Chemical Society, 19(6), 689-705.). На данном принципе основано большинство используемых на сегодняшний день систем для ИХ-серодиагностики, в частности тест-система для серодиагностики лейкоза крупного рогатого скота, описанная Mukantayev и соавт. (Mukantayev, K., Tursunov, K., Raimbek, G., Shustov, A., Begaliyeva, A., Ingirbay, B., Mukanov, K. & Ramanculov, E. (2018). IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY FOR DIAGNOSIS OF BOVINE LEUKAEMIA VIRUS INFECTION IN COWS USING THE RECOMBINANT PROTEIN GP51. Veterinarija ir Zootechnika, 76(98). https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/mukantayev.pdf), использованная в настоящей заявке в качестве наиболее близкого аналога.

Схематичное изображение тест-полоски, основанной на данном принципе, представлено на рис. 1А. Тест-полоска для ИХ-серодиагностики с традиционной схемой включает следующий набор компонентов:

• начальная мембрана, абсорбирующая образец, на которую наносится анализируемая проба;

• подложка под конъюгат, на которую наносится конъюгат маркера с рецепторными молекулами (антивидовыми антителами, белками A/G и пр.);

• рабочей мембраны с иммобилизованным антигеном патогена;

• конечной абсорбирующей мембраны, впитывающей жидкость, протекающую через рабочую мембрану.

Процедура анализа в данной системе сводится к добавлению на один и тот же участок начальной абсорбирующей мембраны пробы и разбавляющего буфера и, через 10-15 мин, регистрацию результатов анализа.

Данная схема ИХ-серодиагностики предполагает взаимодействие всех иммуноглобулинов, содержащихся в пробе, с реагентом для связывания иммуноглобулинов. С антигеном же взаимодействует только небольшая доля специфичных к нему иммуноглобулинов, которая обычно не превышает 1% от общей концентрации иммуноглобулинов в крови. Таким образом, сигнал ИХ-анализа (интенсивность окраски аналитической зоны) в традиционной схеме зависит не только от концентрации специфических антител, но и от общего содержания иммуноглобулинов в пробе, что не является диагностически значимым параметром. Конкуренция между специфическими и общими иммуноглобулинами за связывание с иммуноглобулин-связывающим белком негативно сказывается на достоверности диагностики. Поэтому иммунохроматография зачастую уступает по чувствительности альтернативным методам серодиагностики (Sotnikov, D.V., Zherdev, A.V., & Dzantiev, B.B. (2017). Theoretical and experimental comparison of different formats of immunochromatographic serodiagnostics. Sensors, 18(1), 36.).

Предлагаемый альтернативный способ ИХ-серодиагностики заключается в разделении стадий связывания специфических иммуноглобулинов с иммобилизованным антигеном и меченым иммуноглобулин-связывающим белком. Для последовательного связывания иммуноглобулинов и меченого реагента в аналитической зоне проба, раствор, содержащий меченый иммуноглобулин-связывающий белок и смывающий буфер последовательно наносятся на начальную мембрану тест-полоски как показано на рис. 1Б. На первой стадии специфические иммуноглобулины в пробе сначала взаимодействуют с антигеном в аналитической зоне, при этом не связавшиеся иммуноглобулины увлекаются потоком жидкости и вымываются из реакционной зоны. На второй стадии иммуноглобулины, связавшиеся в аналитической зоне, проявляются посредством взаимодействия с меченым иммуноглобулин-связывающим белком. Смывающий буфер необходим для поддержания постоянного потока жидкости через мембраны теста. Состав тест-полоски отличается от традиционного только отсутствием подложки под конъюгат. Продолжительность анализа составляет 10-15 мин.

Преимущество предлагаемого подхода продемонстрировано на примере ИХ-системы для определения специфических антител против рекомбинантного антигена P24 вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Пример

Для формирования тест-систем использовали набор мембран компании Advanced Microdevices (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC15, подложку под конъюгат PT-R5 (только в тест-системе с традиционным форматом), мембрану для нанесения образца GFB-R4 и конечную адсорбирующую мембрану CFSP 223000 Millipore (США).

Для формирования аналитической зоны использовали антиген P24 производства РГП «Национальный центр биотехнологии» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан. На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора антигена (1 мг/мл в 100 мМ Na - цитратном буфере, рН 6). Конъюгат коллоидного золота (средний диаметр частиц 25 нм) со стрептококковым белком G синтезировали при концентрации белка 10 мкг/мл и оптической плотности золота D₅₂₀=1. Конъюгат очищали от не связавшегося белка посредством центрифугирования при 10000 g и концентрировали до D₅₂₀=20. Для тест-системы в традиционном формате (рис. 1А) конъюгат наносили на подложку в объеме 15 мкл на 1 см полосы. В тест-системе в предложенном альтернативном формате (рис. 1Б) конъюгат использовали в жидком виде, нанося 5 мкл конъюгата D₅₂₀=20 на начальную адсорбирующую мембрану непосредственно после добавления анализируемой пробы. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). Листы мембран с нанесенными иммунореагентами нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 3,5 мм.

Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. В тест-системе с традиционным форматом анализа (рис. 1А) на начальную адсорбирующую мембрану наносили 10 мкл сыворотки крови коровы зараженной вирусом лейкоза КРС. Затем в то же место наносили 50 мкл разбавляющего раствора (50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCl и 1% Tween-20). Фиксацию результата тестирования осуществляли через 10 мин.

В тест-системе с предложенным альтернативным форматом анализа (рис. 1Б) на начальную адсорбирующую мембрану наносили 5 мкл сыворотки крови коровы зараженной вирусом лейкоза КРС. Далее примерно на 1 см ниже места нанесения сыворотки наносили 5 мкл конъюгата белка G с коллоидным золотом D520=20. Затем примерно на 1 см ниже места нанесения конъюгата наносили 50 мкл смывающего раствора (50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCl и 1% Tween-20). Фиксацию результата тестирования осуществляли через 10 мин.

Пример результата тестирования сыворотки крови коровы с диагнозом «лейкоз» в двух форматах анализа представлен на рис. 2. Представленные результаты демонстрируют повышение интенсивности сигнала в аналитической зоне в предложенном способе серодиагностики и, таким образом, повышение достоверности анализа.

Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов для определения специфических антител посредством использования (1) мультимембранного композита, в котором на функциональном участке иммобилизуется антиген патогенного организма, (2) раствора, содержащего меченый иммуноглобулин-связывающий белок; (3) смывающего буфера, характеризующийся тем, что на разные участки начальной мембраны мультимембранного композита последовательно добавляются: проба, раствор, содержащий меченый иммуноглобулин-связывающий белок; и смывающий буфер; при этом зоны для нанесения реагентов располагаются следующим образом: зона для меченого иммуноглобулин-связывающего белка располагается между зоной для нанесения пробы и зоной для нанесения смывающего буфера; зона для нанесения пробы соприкасается с рабочей мембраной тест-полоски, на которой располагается аналитическая зона, и при этом отсутствует подложка для нанесения конъюгата.

Изобретение относится к области медицины, а именно к терапии, кардиологии и пульмонологии. Раскрыт способ прогнозирования развития жизнеугрожающих осложнений у пациентов с инфарктом миокарда на фоне хронической обструктивной болезни легких на основе определения в плазме крови уровня гомоцистеина, в котором для прогнозирования кардиогенного шока и отека легких как жизнеугрожающих осложнений у пациентов с инфарктом миокарда на фоне хронической обструктивной болезни легких определяют уровень гомоцистеина в плазме крови методом иммуноферментного анализа в сочетании с определением фенотипа хронической обструктивной болезни легких и далее рассчитывают вероятность развития кардиогенного шока и отека легких.

Способ прогнозирования преэклампсии у беременных с гестационным сахарным диабетом // 2740852

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии, и раскрывает способ прогнозирования преэклампсии у беременных с гестационным сахарным диабетом.

Способ прогнозирования осложненного течения родового акта у юных первородящих женщин // 2740803

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии. Предложен способ прогноза осложненного течения родового акта у юных первородящих.

Способ неинвазивной молекулярно-биологической диагностики болезней пульпы // 2740429

Изобретение относится к медицине и касается способа неинвазивной молекулярно-биологической диагностики болезней пульпы, где в дентинной жидкости исследуемого зуба определяют уровень экспрессии белка альфа-1-антихимотрипсин методом иммуноферментного анализа и при значениях более 5.35 нг/мл диагностируют начальный пульпит с развитием обратимого воспаления в тканях пульпы, при значениях 2.06-5.34 нг/мл - острый пульпит с необратимым воспалением в тканях пульпы, а при значениях альфа-1-антихимотрипсин менее 1.54 нг/мл у пациентов диагностируют хронические формы пульпита с низкими репаративными возможностями пульпы.

Способ выявления пациентов с повышенным риском развития рака простаты // 2740382

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской биохимии и онкологии, и предназначено для выявления пациентов с повышенным риском развития рака простаты.

Способ прогнозирования трансформации хронических диссеминированных энцефаломиелитов в рассеянный склероз у детей // 2740243

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической лабораторной диагностике и инфекционным болезням центральной нервной системы у детей, и может быть использовано в широкой клинической практике для прогноза трансформации диссеминированных энцефаломиелитов в рассеянный склероз у детей.

Способ выбора тактики лечения пациентов с регионарной лимфаденопатией неясного генеза при аденокарциноме желудка // 2740145

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложен способ выбора тактики лечения пациентов с регионарной лимфаденопатией неясного генеза при аденокарциноме желудка.

Способ прогнозирования на ранних стадиях хронической обструктивной болезни легких риска прогрессирования заболевания // 2740071

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и касается способа прогнозирования прогрессирования хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Сущность спрособа заключается в том, что у пациента в венозной крови определяют относительное число гранулоцитов, экспрессирующих Toll-подобный рецептор 2 (CD282+ гранулоциты); относительное число гранулоцитов, экспрессирующих рецептор к интерлейкину-6 (CD126+ гранулоциты); относительное количество Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+CD127-).

Способ прогнозирования бесплодия у женщин с гипоталамическим синдромом // 2740013

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования бесплодия у женщин с гипоталамическим синдромом, заключающемуся в том, что в периферической крови женщин репродуктивного возраста с гипоталамическим синдромом одновременно определяют уровни провоспалительных цитокинов: интерлейкина - 1 бета - IL-1β, интерлейкина - 6 - IL-6, интерлейкина - 8 - IL-8, фактора некроза опухолей - альфа - TNF-α, интерферона - гамма - IFN-g и уровни противовоспалительных цитокинов: интерлейкина - 4 - IL-4, интерлейкина - 10 - IL-10 в зависимости от дня менструального цикла, а именно на 5 и 21 день и в зависимости от индекса массы тела - ИМТ больше или равно 30, и при уровнях цитокинов на 5-й день менструального цикла: IL-1β от 2,7 до 3,9 пг/мл, IL-6 от 5,5 до 6,8 пг/мл, IL-8 от 2,9 до 3,7 пг/мл, TNF-α от 3,9 до 4,8 пг/мл, IFN-g от 3,1 до 4,5 пг/мл, IL-4 от 2,8 до 3,3 пг/мл, IL-10 от 5,1 до 6,9 пг/мл, и на 21 день менструального цикла при уровнях IL-1β от 2,9 до 4,3 пг/мл, IL-6 от 6,2 до 7,6 пг/мл, IL-8 от 3,2 до 4,1 пг/мл, TNF-α от 4,9 до 5,7 пг/мл, IFN-g от 3,3 до 4,9 пг/мл, IL-4 от 2,9 до 3,6 пг/мл, IL-10 от 5,3 от 7,4 пг/мл прогнозируют бесплодие у женщин с гипоталамическим синдромом.

Способ оценки поствакцинального иммунитета против бруцеллеза // 2740009

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки поствакцинального иммунитета против бруцеллеза in vitro. Способ включает определение концентрации спонтанного и антиген индуцированного интерферона гамма в культуральном супернатанте в иммуноферментном анализе с последующим расчетом индекса стимуляции.

Способ прогнозирования ургентных сердечно-сосудистых осложнений при остром коронарном синдроме у больных с онкологическим заболеванием в анамнезе // 2741195

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии и может быть использовано для прогнозирования развития ургентных сердечно-сосудистых осложнений в госпитальном периоде при остром коронарном синдроме у больных с онкологическим заболеванием в анамнезе.