Тест-система "essc-tipe-1" для молекулярно-генетического типирования плоскоклеточного рака пищевода

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии. Предложена тест-система «ESSC-tipe-1» для молекулярно-генетического типирования плоскоклеточного рака пищевода, содержащая контрольные смеси и реагенты для амплификации ДНК в режиме реального времени ПЦР-РВ: смесь для ПЦР-РВ реакции, состоящую из 0,57 мМ dNTPs, 7,1 мМ MgCl₂, 2,7-кратного ПЦР-буфера с 2,9-кратной концентрацией красителя EvaGreen Dye и 7,1% ДМСО, ДНК-полимеразы Thermus aquaticus 5 ед./мкл и высокоспецифичных прямых и обратных олигонуклеотидных праймеров для локусов CUL3: SEQ ID3 и SEQ ID4, ATG7: SEQ ID5 и SEQ ID6, SOX2: SEQ ID7 и SEQ ID8, ТР63: SEQ ID9 и SEQ ID10, YAP1: SEQ ID11 и SEQ ID12, VGLL4: SEQ ID13 и SEQ ID14, CDK6: SEQ ID15 и SEQ ID16, KDM6A: SEQ ID 17 и SEQ ID8 и В2М: SEQ ID1 и SEQ ID2 с концентрацией 1,8 мкМ каждого в водном растворе. Изобретение обеспечивает новую, простую в исполнении, недорогостоящую и точную тест-систему с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов для молекулярно-генетического типирования плоскоклеточного рака пищевода. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и может быть использовано для молекулярно-генетического типирования плоскоклеточного рака пищевода.

Рак пищевода (РП) занимает 6 место в структуре онкологической смертности во всем мире: ежегодно регистрируется более 400 тысяч смертей от этого заболевания (см. Xiong Т, Wang М, Zhao J, et al. An esophageal squamous cell carcinoma classification system that reveals potential targets for therapy. Oncotarget. 2017; 8(30):49851-49860; см. Кит О.И., Водолажский Д.И., Базаев А.Л., Златник Е.Ю., Колесников Е.Н., Трифанов B.C., Харин Л.В., Кутилин Д.С. Молекулярные маркеры плоскоклеточного рака пищевода // Современные проблемы науки и образования. - 2017. - №5.; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26709 (дата обращения: 29.11.2018)). Выделяют два основных гистологических типа РП: плоскоклеточный рак пищевода (ПРП, ESCC) и аденокарциному пищевода, которые существенно отличаются по этиологии, географическому распространению, 5-летней общей выживаемости и молекулярно-генетическому профилю, при этом ПРП составляет приблизительно 80% от всех случаев заболевания (см. Колесников Е.Н., Максимов А.Ю., Кит О.И., Кутилин Д.С. Зависимость общей и безрецидивной выживаемости больных от молекулярно-генетического подтипа плоскоклеточного рака пищевода. Вопросы Онкологии. 2019. 65 (5), С. 691-700, Cancer Genome Atlas Research Network et al. "Integrated genomic characterization of oesophageal carcinoma" Nature vol. 541, 7636 (2017): 169-175).

ПРП представляет собой группу гетерогенных опухолей с различным прогнозом, однако клинические сигнатуры, такие как TNM и локализация опухоли, не являются значимыми факторами прогноза при лечении данного заболевания.

Ранее была создана молекулярная классификация ПРП, на основании молекулярно-генетического анализа были идентифицированы три подтипа ПРП, отличающиеся наличием полиморфизмов (SNP) и/или уровнем копийности (CNV) генов NFE2L2, CUL3, ATG7, SOX2, ТР63, YAP1, ATG7, NOTCH 1, ZNF750, KDM6A и CDK6 (Cancer Genome Atlas Research Network et al. "Integrated genomic characterization of oesophageal carcinoma" Nature vol. 541, 7636(2017): 169-175).

Поэтому, в качестве маркеров для молекулярно-генетического типирования плоскоклеточного рака пищевода была выбрана панель из 8 генетических локусов (CUL3, ATG7, SOX2, ТР63, YAP1, VGLL4, CDK6, KDM6A).

Анализ патентных источников (www.fips.ru) показал отсутствие действующих патентов и заявок на патент тест-системы «ESSC-tipe-1» для молекулярно-генетического типирования плоскоклеточного рака пищевода.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание и внедрение новой, простой в исполнении, не дорогостоящей и точной тест-системы с высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для молекулярно-генетического типирования плоскоклеточного рака пищевода.

Сущность тест-системы заключается в том, что геномную ДНК экстрагируют из операционных биоптатов опухолевой ткани пищевода и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для генов CUL3, ATG7, SOX2, ТР63, YAP1, VGLL4, CDK6, KDM6A и В2М, анализируют первичные данные и вычисляют относительную копийность (rC) по формуле 2^-ΔCt, где ΔCt=Ct(исследуемого гена) - Ct(B2M)). Затем сравнивают полученные значения rC с классифицирующими индексами копийности, и при значениях r_CUL3>0.7, rC_ATG7>1.7, rC_SOX2>20.0, rC_TP63>1.0, rC_YAP1>5.0, rC_VGLL4>11.2 и rC_CDK6<1.1, r_CKDM6A<14.8 диагностируют 1-ый подтип ПРП (ESCC1) (чувствительность 75%), при значениях rC_CUL3<0.1, rC_ATG7<0.4, rC_SOX2<2.0, rC_TP63<0.3, rC_YAP1<1.0, rC_VGLL4<1.0 и rC_CDK6>1.5, rC_KDM6A>15.0 диагностируют 2-ый подтип ПРП (ESCC2) (чувствительность 65%), а при значениях rC_CUL3<0.1, rC_CDK6<1.0, rC_KDM6A<14.0, rC_SOX2<1.0, rC_TP63<0.3, tC_YAP1<1.0, rC_VGLL4<1.1 и rC_ATG7>7.2 диагностируют 3-ый подтип ПРП (ESCC3) (чувствительность 75%).

Заявленный анализ основан на определении количества копий 8 генетических локусов (CUL3, ATG7, SOX2, ТР63, YAP1, VGLL4, CDK6, KDM6A) относительно референсного локуса В2М (β-2 микроглобулин) в опухолевой ткани пищевода, и последующем сравнении полученных значений с классифицирующим индексом rC_i характерным для ESCC1-3.

Заявленная тест-система включает следующие приемы: выделение тотальной ДНК из тканевых проб или из парафиновых блоков с помощью метода фенол-хлороформной экстракции; определение относительной копийности генетических локусов методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной ДНК; анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора; расчет копийности гена (rC) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей, сравнением rC пробы с значениями классифицирующего индекса rC_i.

Заявленная тест-система, рассчитанная на 50 определений, включает:

1. Смесь для ПЦР-РВ реакции (Mix_PCR) - 12000 мкл (6 флаконов по 2 мл), содержащую 0,57 мМ dNTPs, 7,1 мМ MgCl₂, 2,7-кратный ПНР-буфер с 2,9-кратной концентрацией красителя EvaGreen Dye и 7,1% ДМСО.

2. ДНК-полимеразу Thermus aquaticus 5ед./мкл (Taq) - 350 мкл.

3. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1,8 мкМ каждого для локусов CUL3, ATG7, SOX2, ТР63, YAP1, VGLL4, CDK6, KDM6A (название гена_Mix) - 500 мкл (смесь включает Milli-Q воду для ПЦР - реакции).

4. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1,8 мкМ каждого для гена В2М (Ref_Mix) - 1500 мкл (смесь включает Milli-Q воду для ПНР - реакций).

5. Контроль реакционной смеси (стандартная ДНК с концентрацией 2 нг/мкл) - 500 мкл.

6. Отрицательный контроль (контроль без матрицы, Milli-Q вода обработанная DEPC) - 500 мкл.

Из расчета на одну ПЦР-РВ реакцию смесь должна содержать перечисленные выше компоненты в следующем соотношении:

7,0 мкл Mix_PCR+0,2 мкл Taq+6,8 мкл «Исследуемый ген»_Mix (или Ref_Mix)+6 мкл матрицы*

* - ДНК нормализованная до концентрации 2 нг/мкл, отрицательный контроль или контроль реакционной смеси.

Для тест-системы были разработаны высокоспецифичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для локусов CUL3, ATG7, SOX2, ТР63, YAP1, VGLL4, CDK6, KDM6A и В2М. Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1) осуществлялся с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank на основе следующих принципов: область отжига олигонуклеотидных праймеров должна быть в диапазоне 58-63°С; GC-состав в диапазоне 40-60%; в последовательности праймера должны отсутствовать стабильные вторичные структуры - шпильки и димеры, e-value последовательности праймера должно стремится к нулю и быть не больше 0,05, a query coverage (покрытие целевой последовательности) 100%) (для версии BLASTN 2.3.1+), температуры отжига праймеров (forward и reverse) не должны различаться друг от друга более чем на 0,5°.

Работу с тест-системой, содержащей разработанные специфичные олигонуклеотидные праймеры, осуществляют следующим образом.

На первом этапе отбираются образцы опухолевых тканей из операционного или биопсийного материала. Для транспортировки в лабораторию и хранения образцы замораживаются в жидком азоте.

Фрагменты ткани измельчаются скальпелем и/или ножницами, затем растираются в фарфоровых ступках в присутствии лизирующего SDS-содержащего буфера. К лизатам добавляется протеиназа К и инкубируется при t=56°C в течение 1 часа.

ДНК выделяется из прозрачного лизата тканей с использованием фенол-хлороформной экстракции (см. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Вейко В.П. и др. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел. - Ростов-н/Д.: ООО Ростиздат, 2001). Концентрация полученных препаратов ДНК измеряется на флюориметре. Для проведения ПЦР-РВ концентрацию ДНК в каждом образце нормализуют до 2 нг/мкл. Реагенты для выделения ДНК и определения концентрации ДНК не входят в состав тест-системы.

Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицировали в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 12 нг ДНК, 0,20 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl₂, 1х ПНР-буфер, 1х краситель EvaGreen, 2,5% ДМСО и 0,05 е.а./мкл реакционной смеси ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, и по 612 нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена или гена-мишени.

Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводили на термоциклере по следующей программе: t=95°C в течение 4 мин. 40 циклов: t=95°C в течение 10 с, t=58°C в течение 30 с, t=72°C в течение 30 с. Разработанные праймеры обеспечивали специфичную амплификацию необходимого количества продукта и не образовывали между собой высокоэнергетических внутренних структур: шпилек и дуплексов.

Для выполнения анализа необходимо провести две амплификации (реакции ПЦР-РВ). В первой проверяется качество ДНК и работоспособность тест системы. Реакция проводится с использование смеси праймеров для В2М. Дальнейшее использование ДНК в тест-системе и тест-системы возможно, если соблюдаются следующие условия:

1) Ct _B2M для образца ДНК не превышает 26 цикла.

2) Ct _В2М контроля реакционной смеси должно быть не выше 24 цикла

3) Ct_B2M для отрицательного контроля должен отсутствовать.

Во второй амплификации определяется уровень сигналов, продуцируемых амплификатами локусов CUL3, ATG7, SOX2, ТР63, YAP1, VGLL4, CDK6, KDM6A и референсного В2М.

Относительную копийность локуса мишени (CUL3, ATG7, SOX2, ТР63, YAP1, VGLL4, CDK6, KDM6A) вычисляется следующим образом:

- рассчитывали медиану C_t по трем повторам для целевого локуса и референсного В2М,

- далее рассчитывали величину ΔC_t - Ct(целевой локус) - Ct(В2М)

- копийность генетического локуса относительно референсного гена (rC) рассчитывали по формуле 2^-ΔCt.

Далее сравнивают полученные значения rC с значениями классифицирующего индекса rC_i, и при значениях r_CUL3>0.7, rC_ATG7>1.7, rC_SOX2>20.0, rC_TP63>1.0, rC_YAP1>5.0, rC_VGLL4>11.2 и rC_CDK6<1.1, rC_KDM6A<14.8 диагностируют 1-ый подтип ПРП (ESCC1) (чувствительность 75%), при значениях rC_CUL3<0.1, rC_ATG7<0.4, rC_SOX2<2.0, rC_TP63<0.3, rC_YAP1<1.0, rC_VGLL4<1.0 и rC_CDK6>1.5, rC_KDM6A>15.0 диагностируют 2-ый подтип ПРП (ESCC2) (чувствительность 65%), а при значениях rC_CUL3<0.1, rC_CDK6<1.0, rC_KDM6A<14.0, rC_SOX2<1.0, rC_TP63<0.3, tC_YAP1<1.0, rC_VGLL4<1.1 и rC_ATG7>7.2 диагностируют 3-ый подтип ПРП (ESCC3) (чувствительность 75%).

Предлагаемым способом было осуществлено молекулярно-генетическое типирование плоскоклеточного рака пищевода у 120 больных. Для доказательства работоспособности предлагаемого способа приводятся 3 выписки из историй болезни.

1. Пациент В., 55 лет, обратился в феврале 2018 года в ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ с жалобами на снижение массы тела, трудности прохождения твердой пищи по пищеводу, общую слабость. По результатам гистологического исследования была верифицирована плоскоклеточная карцинома. В РНИОИ больному был проведен курс лучевой терапии.

СРКТ органов грудной клетки: внутригрудные лимфоузлы не увеличены, опухоль средней трети пищевода 5,1×1,3 см.

СРКТ органов брюшной полости: печень - без очагов. Брюшина - не изменена. Асцита нет. Патологических изменений со стороны органов брюшной полости, забрюшинного пространства не выявлено.

Диагноз клинический: рак средней трети пищевода St II, T3N0M0

Выполнена торакоскопия справа, лапаротомия, субтотальная эзофагэктомия, проксимальная резекция желудка с формированием эзофаго-гастроанастомза на шеи слева, лимфодиссекция. Послеоперационный период протекал без особенностей. Больной консультирован химиотерапевтом: химиотерапия не показана.

В операционном материале определены следующие значения rC: rC_CUL3=0.054, rC_ATG7=0.031, rC_SOX2=1.014, rC_TP63=0.213, rC_YAP1=0.075, rC_VGLL4=0.856, rC_CDK6=3.002, rC_KDM6A=16.100, которые соответствуют 2-ому подтипу ПРП (ESCC2).

Послеоперационный гистологический анализ: умеренно-дифференцированная плоскоклеточная карцинома пищевода с тенденцией к ороговению, изъязвлением, хроническим воспалением, инвазией в мышечную оболочку, периневральные пространства.

Спустя 2 года после операции состояние больного удовлетворительное. Данных за рецидив и метастазирование по данным инструментальных и лабораторных методов исследования нет.

2. Больной Р., обратился в ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ с жалобами на похудение, общую слабость, нарушение акта глотания в декабре 2018 г, когда появились вышеуказанные симптомы. При обследовании в РНИОИ:

СРКТ ОГК, ОБП и ОМТ Заключение: t-r нижней трети пищевода 3,9×2,3 см, выраженно суживает его просвет. Данных за мтс поражение печени и легких не выявлено. Гистологическое исследование: высокодифференцированная плоскоклеточная карцинома.

ЭФГДС Заключение: Опухоль нижней трети пищевода. Недостаточность кардии. Умеренно активный гастродуоденит.

С диагнозом (МКБ) Рак пищевода St II, T3N0M0, кл. гр. 2 (С 15) госпитализирован для оперативного лечения. Больному выполнена операция: лапаротомия, торакотомия справа, проксимальная резекция желудка, резекция нижне- и средне-грудного отделов пищевода с одномоментной внутриплевральной пластикой пищевода желудочным стеблем.

Послеоперационный период протекал без особенностей. Больной консультирован химиотерапевтом: химиотерапия не показана.

В операционном материале определены следующие значения rC_CUL3=0.096, rC_CDK6=0.123, rC_KDM6A=10.002, rC_SOX2=0.527, rC_TP63=0.256, rC_YAP1=0.500, rC_VGLL4=1.025 и rC_ATG7=11.599, которые соответствуют 3-ему подтипу ПРП (ESCC3).

Послеоперационный гисто-анализ: умеренно-дифференцированная плоскоклеточная карцинома с ороговением, изъязвлением, хроническим воспалением, прорастанием всех слоев стенки пищевода до адвентициальной оболочки, с инвазией периневральных пространств, наличием опухолевых эмболов в лимфатических сосудах - pT3N1. В 1 из 3 лимфатических узлах клетчатки желудка метастаз плоскоклеточной карциномы с частичным замещением лимфоидной ткани. Послеоперационный диагноз: Рак пищевода St III А, T3N1M0, кл. гр. 2 (С15).

Спустя 2 года после операции диагностирован рецидив.

3. Больной Т., обратился в ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ с жалобами на похудение, общую слабость, нарушение акта глотания в сентябре 2019 года. При обследовании в РНИОИ: эндоскопические признаки опухоли нижней трети пищевода. Госпитализирован для оперативного лечения с диагнозом (МКБ) Рак пищевода St II, T3N0M0, кл. гр. 2 (С 15)

Больному выполнена операция: миниинвазивная, гибридная (торакоскопическая) эзофагэктомия, проксимальная резекция желудка с формированием эзофагогастроанастомоза на шеи слева, лимфодиссекция.

Послеоперационный период протекал без особенностей. Больной консультирован химиотерапевтом: химиотерапия не показана.

В операционном материале определены следующие значения rC: rC_CUL3=1.237, rC_ATG7=2.500, rC_SOX2=25.622, rC_TP63=2.000, rC_YAP1=6.000, rC_VGLL4=11.500, rC_CDK6=0.500, rC_KDM6A=1.001, которые соответствуют 1-ому подтипу ПРП (ESCC1).

Послеоперационный гисто-анализ: умеренно-дифференцированная плоскоклеточная карцинома с ороговением, изъязвлением, хроническим воспалением, инвазией до мышечной оболочки - pT2N2. В 3 лимфатических узлах метастазы плоскоклеточной карциномы с субтотальным замещением лимфоидной ткани. Послеоперационный диагноз: (МКБ) Рак пищевода St III A, T2N2M0.

Спустя 6 месяцев после операции состояние больного удовлетворительное. Данных за рецидив нет.

«Тест-система «ESSC-tipe-1» для молекулярно-генетического типирования плоскоклеточного рака пищевода» позволяет с высокой точностью диагностировать 3 подтипа ПРП.

Заявляемая тест-система, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданной для уточнения подтипа ПРП ассоциированного с различным уровнем общей выживаемости и дает возможность скорректировать тактику лечения, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью, осуществление анализа возможно с операционными биоптатами и парафиновыми блоками (FFPE-блоки), занимает не более 8 часов (с учетом подготовительных этапов), и не более 3 часов (при непосредственном использовании тест-системы).

--->

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 1

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

TGAGTGCTGT CTCCATGTTT GA 22

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 2

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ATTCTCTGCT CCCCACCTCT 20

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ACGAGCACCA TGTCGAATCT 20

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 4

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

CGAGGAGAGA CTCACCGGA 19

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

CTCCCACCGT TCCTCCTAGA 20

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

GTAGATAGCC ACCCACTGGC 20

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 7

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

TTTGTCGGAG ACGGAGAAGC 20

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 8

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

CCGGGCAGCG TGTACTTAT 19

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 9

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

GGCCTGTCTA GATGTCTGCC 20

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 10

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ATCCCAGCTA GGTCTGCTCA 20

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 11

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

GTAACCTGAC TTAACAGTGG GA 22

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 12

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

CACCGTATAG AGACAAAGCA GGAT 24

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 13

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ACATCGCACA ACGTCTCAGT 20

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 14

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

TCGTGCACGT TTTACTCGGA 20

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 15

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

TCTCCGAGGT CTGGACTTTC T 21

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 16

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

GGCCGAAGTC AGCGAGTTT 19

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 17

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

TGACACAATT ACAACAACTT TGTGC 25

<110> Kit, Oleg; Natsional'nyy meditsinskiy issledovatel'skiy tsentr onkologii

<120> Test system "ESSC-tipe-1" for molecular genetic typing of esophagus squamous

cell carcinoma.

<160> 18

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

GAGCACTGAG GGGATTCGTT 20

<---

Тест-система «ESSC-tipe-1» для молекулярно-генетического типирования плоскоклеточного рака пищевода, содержащая контрольные смеси и реагенты для амплификации ДНК в режиме реального времени ПЦР-РВ: смесь для ПЦР-РВ реакции, состоящую из 0,57 мМ dNTPs, 7,1 мМ MgCl₂, 2,7-кратного ПЦР-буфера с 2,9-кратной концентрацией красителя EvaGreen Dye и 7,1% ДМСО, ДНК-полимеразы Thermus aquaticus 5 ед./мкл и высокоспецифичных прямых и обратных олигонуклеотидных праймеров для локусов CUL3: SEQ ID3 и SEQ ID4, ATG7: SEQ ID5 и SEQ ID6, SOX2: SEQ ID7 и SEQ ID8, ТР63: SEQ ID9 и SEQ ID10, YAP1: SEQ ID11 и SEQ ID12, VGLL4: SEQ ID13 и SEQ ID14, CDK6: SEQ ID15 и SEQ ID16, KDM6A: SEQ ID 17 и SEQ ID8 и В2М: SEQ ID1 и SEQ ID2 с концентрацией 1,8 мкМ каждого в водном растворе.