Гуманизированные анти-тау-антитела

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному моноклональному антителу анти-тау. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с ТАУ. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 11 ил., 5 табл., 8 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка притязает на приоритет согласно 35 U.S.C. 119(e) заявки на патент США 62/170,036, поданной 2 июня 2015, заявки на патент США 62/080,903, поданной 17 ноября 2014, и заявки на патент США 62/018,436, поданной в 27 июня 2014, содержания которых включены в данное описание во всей своей полноте в качестве ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Материалы в прилагаемом списке последовательностей включены в объем настоящей заявки в виде ссылки. Текстовый файл прилагаемого списка последовательностей, имеющий название: C2N1 120_4WO_Sequence_Listing, создан 26 июня 2015, и его размер составляет 9 Кбит. Доступ к этому файлу можно получить, используя Microsoft Word на компьютере, управляемом операционной системой Windows.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0003] Настоящее изобретение относится к области гуманизированных антител и их антиген-связывающих фрагментов, которые связываются с тау, и способам применения таких антител для лечения таупатий. В частности, настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу и его антиген-связывающим фрагментам, которые связываются с конкретными эпитопами тау и предотвращают распространение тау.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Таупатии имеют одно общее свойство, заключающееся в накоплении в головном мозге нерастворимого гиперфосфорилированного белка тау. Более 20 различных нейродегенеративных нарушений характеризуются определенной степенью нейрофибриллярной дегенерацией и могут быть отнесены к таупатиям (Williams, 2006). Для классических таупатий, таких как прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП, PSP) и кортикобазальная дегенерация (КБД, CBD), характерны тау включения виде единичного или множественных очагов поражения центральной нервной системы. Классические таупатии отличаются от других видов таупатий, при которых тау агрегаты присутствуют совместно с другими нейропатологическими признаками, такими как бета-амилоидные (Aβ) бляшки, наблюдаемые при болезни Альцгеймера (БА), или тельца Леви, наблюдаемые при болезни Паркинсона (БП). При таких неклассических видах таупатий вопрос о том, является ли тау патология первичным фактором, стимулирующим развитие заболевания, или она вторична по отношению к неправильной укладке другого белка и нейродегенерации, становится еще более неопределенным.

[0005] Прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП, также известный как синдром Стила-Ричардсона-Ольшевского) представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное нарушение, частота возникновения которого, судя по оценкам, составляет 5-7 случаев на 100000 человек (Golbe, 2014). В США этим заболеванием поражено примерно 20000 человек. В частоте ПНП не выявлено никаких видимых географических, этнических, половых или расовых различий. На ранней стадии, ПНП может иметь клинические симптомы, сходные с симптомами других расстройств мозговой деятельности, включая идиопатическую болезнь Паркинсона. По этой причине, постановка правильного диагноза ПНП возможна через какое-то время, как правило, через 1-3 года после первого появления клинических симптомов. Симптомы чаще всего начинают проявляться в возрасте от 50 до 70 лет, и несмотря на различия, наблюдаемые в клинической картине течения болезни, продолжительность жизни с момента появления симптомов обычно оставляет от 5 до 9 лет (Houghton, 2007). Хотя клиническая картина гетерогенна, наиболее обычным и первоначально описанным синдромом ПНП, теперь называемым синдромом Ричардсона, является наличие выраженной постуральной нестабильности и ригидности осевой мускулатуры, приводящей к падениям, надъядерного паралича взора, вызывающего ряд зрительных нарушений, лобно-подкоркового деменция и дисфагии, приводящей к аспирации. Заболевание является прогрессирующим и всегда со смертельным исходом (Williams and Lees, 2009).

[0006] Патологически, ПНП характеризуется аномальным накоплением гиперфосфорилированных нерастворимых агрегатов белка тау в нейронах и глии в стволовой части головного мозга, мозжечке, базальных ганглиях и коре головного мозга (Williams and Lees, 2009). Степень и распределение агрегатов тау при ПНП сильно коррелирует с симптоматикой этого заболевания в течение жизни (Schofield et al., 2012). Научные критерии национального института неврологических расстройств и общества прогрессирующего надъядерного паралича (NINDS-SPSP), которые описывают синдром Ричардсона, позволяют с высокой степенью достоверности предсказывать патологию, лежащую в основе ПНП (Litvan et al., 1996). Образование нейрофибриллярных клубков (НФК, NFT), которые состоят из агрегатов тау, сопровождается потерей нейронов в различных областях мозга. Возникают многочисленные нарушения нейротрансмиттеров, а также, нарушения, затрагивающие конкретные дофаминергическую, холинергическую, ГАМК-ергическую и норадренергическую системы.

[0007] В настоящее время отсутствует одобренное лечение ПНП (Stamelou et al., 2010). Отрицательные результаты, полученные при изучении эффективности лечения ПНП, исключают возможность рекомендации эмпирически обоснованной стандартной терапии (Boxer et al., 2014). В отсутствие любой эффективной нейропротективной и болезнь-модифицирующей терапии, имеется насущная неудовлетворенная медицинская потребность в методах лечения ПНП.

[0008] Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой общее хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, при котором происходит необратимая потеря когнитивных и поведенческих функций. Заболевание может развиваться в течение более 10 лет от слабо выраженных симптомов до очень серьезных проявлений. Следует отметить, что БА поражает примерно 10% населения в возрасте старше 65 лет и более 30% населения в возрасте старше 80 лет. Сама болезнь Альцгеймера патологически проявляется в виде внеклеточных амилоидных бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков. Нейрофибриллярные клубки состоят, например, из связывающего микротрубочки белка тау, который собирается в спаренных спиральных и прямых филаментах. Было высказано предположение, что эти структуры могут быть функционально связаны между собой, хотя не ясны механизмы, с помощью которых амилоидное отложение способствует патологической сборке тау в филаменты, или наоборот.

[0009] Внутриклеточные нейрофибриллярные структуры при тауопатиях (нейрофибриллярные клубки, дистрофические невриты и нейропильные нити) имеют спаренные спиральные филаменты (ССФ). Основная субъединица белка в ССФ представляет собой ассоциированный с микротрубочками белок тау в аномально гиперфосфорилированной форме. Нейроны с нейрофибриллярными изменениями вырождаются, и степень этого вырождения напрямую коррелирует со степенью деменции у пораженных индивидуумов.

[0010] Другие виды тауопатий, о которых известно, что они имеют филаментные клеточные включения, содержащие ассоциированный с микротрубочками белок тау, включают болезнь Пика (БПи), группу родственных расстройств под общим названием лобно-височная деменция с паркинсонизмом, связанным с хромосомой 17 (ЛВДП-17), амиотрофический боковой склероз (АБС), болезнь Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ), деменцию боксеров (ДБ), синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера (СГШШ), болезнь телец Леви, хроническую травматическую энцефалопатию (ХТЭ) и болезнь Хантингтона. Несмотря на то, что этиология, клинические симптомы, патологические отклонения и биохимический состав филаментных клеточных включений при этих заболеваниях различны, имеются свидетельства в пользу предположения о том, что механизмы, участвующие в агрегации нормальных клеточных белков с образованием различных филаментных включений являются аналогичными. Считается, что одной из ключевых особенностей является первичное изменение в конформации ассоциированного с микротрубочками белка тау, которое инициирует образование ядер или зерен для сборки в филаменты. Этот процесс может быть обусловлен посттрансляционной модификацией нормальных белков, мутацией или делецией в определенных генах и факторами, которые связываются с нормальными белками и, таким образом, изменяют их конформацию.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] В качестве одного из аспектов настоящего изобретения предоставляется выделенное антитело или антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком тау. Антитело или фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), и каждая из областей VH и VL имеет последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг. 1 и 2. Более конкретно, область VL может иметь аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4 [VK1, VK2, VK3 и VK4], а область VH может иметь аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6, 7 и 8 [VH1, VH2, VH3 и VH4]. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения область VL имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 [VK2], а область VH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 [VH1]. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит Fc-фрагмент, который может быть человеческим IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или их вариантами, такими как человеческий IgG4, содержащий мутацию S241P, стабилизирующую шарнирную область. Антитело может содержать константную область легкой цепи человеческого каппа-изотипа или ее варианты. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или фрагмент представляют собой ScFv или Fab. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или фрагмент или химерное антитело или фрагмент. Антитело или фрагмент могут быть моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или фрагмент конкурируют с HJ8.5 за специфическое связывание с человеческим белком тау. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или фрагмент связываются с человеческим белком тау с равновесной константой диссоциации (Kd), равной по меньшей мере 10^-4M.

[0012] В качестве другого аспекта настоящего изобретения предоставляется мультиспецифическое антитело или антиген-связывающий фрагмент, имеющие множество антиген-связывающих участков. По меньшей мере один антиген-связывающий участок мультиспецифического антитела или фрагмента связывается с человеческим белком тау. В качестве альтернативы предоставляется биспецифическое антитело или антиген-связывающий фрагмент, имеющие два антиген-связывающих участка. Один из антиген-связывающих участков биспецифического антитела или фрагмента связывается с человеческим белком тау. В качестве альтернативы, предоставляется биспецифическое антитело или антиген-связывающий фрагмент, где одно плечо антитела или антиген-связывающего фрагмента конкурирует с HJ8.5 за специфическое связывание с человеческим белком тау. В качестве альтернативы, предоставляется биспецифическое антитело или антиген-связывающий фрагмент, где одно плечо антитела или антиген-связывающего фрагмента состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), причем каждая из областей VH и VL имеет последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг. 1 и 2.

[0013] Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов может дополнительно содержать токсическую нагрузку, необязательно конъюгат лекарственного средства или радионуклид.

[0014] В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения предоставляется выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающий фрагмент, или область VH, или область VL, приведенные на Фиг. 1 или 2. Может быть предоставлен вектор (например, экспрессирующий вектор), содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты. Может быть предоставлена выделенная клетка-хозяин, содержащая такой вектор. Может быть предоставлена прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, такая как клетка млекопитающего.

[0015] В качестве другого аспекта настоящего изобретения предоставляется фармацевтическая композиция. Фармацевтическая композиция содержит любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов, или молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0016] В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения предоставляется выделенная аминокислотная последовательность, содержащая последовательность одной из легких цепей, приведенных на Фиг. 1 и 2. В качестве альтернативы или дополнительно предоставляется выделенная аминокислотная последовательность, содержащая последовательность одной из тяжелых цепей, приведенных на Фиг. 1 и 2.

[0017] В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения предоставляется выделенное гуманизированное антитело или антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим аминокислотную последовательность DQGGYT (SEQ ID NO: 9). Антитело или антиген-связывающий фрагмент могут содержать CDR областей VH и VL из донорского антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит Fc-фрагмент, например, Fc-фрагмент, полученный из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или его варианта. Fc-фрагмент может представлять собой человеческий IgG4 или его вариант, например, человеческий IgG4, содержащий мутацию S241P, стабилизирующую шарнирную область. Антитело может содержать константную область легкой цепи человеческого каппа-изотипа или ее варианты. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или фрагмент представляют собой ScFv или Fab. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или фрагмент или химерное антитело или фрагмент. Антитело или фрагмент могут быть моноклональным антителом. Антитело или фрагмент могут представлять собой биспецифическое антитело или антиген-связывающий фрагмент, где одно плечо антитела или фрагмента специфически связывается с эпитопом, содержащим аминокислотную последовательность DQGGYT (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах осуществления предоставляется иммуноконъюгат, содержащий одно из указанных выше антител или фрагментов, связанных с детектируемым или терапевтическим компонентом.

[0018] В качестве другого аспекта предоставляется выделенное гуманизированное антитело или антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом, содержащим аминокислотную последовательность GYTMHQDQ (SEQ ID NO: 10). Антитело или фрагмент могут иметь CDR областей VH и VL из донорского антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержат Fc-фрагмент, такой как Fc-фрагмент IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или его вариант. Fc-фрагмент может представлять собой человеческий IgG4 и его варианты, содержащие мутацию S241P, стабилизирующую шарнирную область. Антитело может содержать константную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или фрагмент представляют собой ScFv или Fab. Предоставляется биспецифическое антитело или антиген-связывающий фрагмент, где одно плечо антитела специфически связывается с эпитопом, содержащим аминокислотную последовательность GYTMHQDQ (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат, содержащий любое из вышеуказанных антител или фрагментов, связан с детектируемым или терапевтическим компонентом.

[0019] В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения предоставляется способ профилактики или лечения таупатии у субъекта, содержащий введение человеку, нуждающемуся в лечении таупатии, одного или более антител или фрагментов, описанных в настоящей заявке. Антитела или антиген-связывающий фрагмент вводят в условиях и в количестве, эффективном для профилактики или лечения таупатии. Тауопатия может представлять собой одно из следующего: болезнь Альцгеймера (БА), прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП), кортикобазальную дегенерацию (КБД), болезнь Пика (БПи), группу родственных расстройств под общим названием лобно-височная деменция с паркинсонизмом, связанным с хромосомой 17 (ЛВДП-17), амиотрофический боковой склероз (АБС), болезнь Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ), деменцию боксеров (ДБ), синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера (СГШШ), болезнь телец Леви, хроническую травматическую энцефалопатию (ХТЭ) и болезнь Хантингтона.

[0020] Предоставляется способ лечения таупатии, содержащий введение анти-тау антитела или фрагмента субъекту, нуждающемуся в лечении, причем антитело или антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с белком тау и содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), причем каждая из областей VH и VL имеет последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг. 1 и 2, и антитело или фрагмент вводят субъекту в дозе от примерно 0,1 мг/кг до примерно 250 мг/кг, альтернативно от примерно 1 мг/кг до примерно 25 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или фрагмент имеют область VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4 [VK1, VK2, VK3 и VK4]; альтернативно или дополнительно, антитело или фрагмент имеют область VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6, 7 и 8 [VH1, VH2, VH3 и VH4].

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[0021] На фиг. 1 показаны последовательности вариабельных областей мышиного антитела HJ8.5, а также 4 последовательности гуманизированных вариантов для каждой из тяжелых и легких цепей (4 последовательности VH и 4 последовательности VL/VK). На фиг. 1 показаны последовательности MuVL (SEQ ID NO:11); VK1 (SEQ ID NO:1); VK2 (SEQ ID NO:2); VK3 (SEQ ID NO:3); VK4 (SEQ ID NO:4); MuVH (SEQ ID NO:12); VH1 (SEQ ID NO:5); VH2 (SEQ ID NO:6); VH3 (SEQ ID NO:7); VH4 (SEQ ID NO:8).

[0022] На фиг. 2A показаны последовательности гуманизированных вариабельной и константной областей для тяжелой цепи VH1 (SEQ ID NO:13). На фиг. 2B показаны последовательности гуманизированных вариабельной и константной областей для тяжелой цепи VH2 (SEQ ID NO:14). На фиг. 2C показаны последовательности гуманизированных вариабельной и константной областей для тяжелой цепи VH3 (SEQ ID NO:15). На фиг. 2D показаны последовательности гуманизированных вариабельной и константной областей для тяжелой цепи VH4 (SEQ ID NO:16). Вариабельная область тяжелой цепи привита к константной области тяжелой цепи человеческого IgG4, содержащего мутацию S241P, стабилизирующую шарнирную область. На фиг. 2E показаны последовательности гуманизированных вариабельной и константной областей для легкой цепи VL1 (SEQ ID NO:17). На фиг. 2F показаны последовательности гуманизированных вариабельной и константной областей для легкой цепи VL2 (SEQ ID NO:18). На фиг. 2G показаны последовательности гуманизированных вариабельной и константной областей для легкой цепи VL3 (SEQ ID NO:19). На фиг. 2H показаны последовательности гуманизированных вариабельной и константной областей для легкой цепи VL4 (SEQ ID NO:20).

[0023] На фиг. 3 приведены данные экспрессии, полученные из двух циклов транзиентной экспрессии клеток, трансфицированных полинуклеотидом, кодирующим области VH и VK. Результаты суммированы для 13 гуманизированных анти-тау антител, образованных на основе различных комбинаций гуманизированных вариабельных областей тяжелых и легких цепей, имеющих различные наблюдаемые уровни экспрессии.

[0024] На фиг. 4 приведены данные анализа активности в формате ИФА (ELISA), выполненного для оценки способности заявленных анти-тау антител конкурировать с исходным мышиным HJ8.5 (родительским) антителом за связывание с человеческим белком тау.

[0025] На фиг. 5 приведены результаты анализа методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР), определяющие кинетику связывания шести лучших экспрессирующих гуманизированных конструкций с человеческим тау.

[0026] На фиг. 6 показано связывание четырех вариантов гуманизированных антител с растворимым человеческим тау в сэндвич варианте ИФА.

[0027] На фиг. 7A-7H показано связывание гуманизированных и контрольных антител в ткани, полученной от мышей дикого типа (отрицательный тканевой контроль), мышей P301S (которые экспрессируют человеческий тау, имеющий мутацию P301S, и у которых развивается ассоциированная с возрастом тау патология), а также людей либо с болезнью Альцгеймера, либо прогрессирующим надъядерным параличом (ПНП). Фиг. 7А. Связывание химеры (положительный контроль) в мышиной и человеческой ткани. Фиг. 7В. Связывание неспецифического человеческого IgG4 (отрицательный контроль) в мышиной и человеческой ткани. Фиг. 7C. Связывание VH1/VK2 в мышиной и человеческой ткани. Фиг. 7D. Связывание VH1/VK3 в мышиной и человеческой ткани. Фиг. 7Е. Связывание VH2/VK2 в мышиной и человеческой ткани. Фиг. 7F. Связывание VH2/VK3 в мышиной и человеческой ткани. Фиг. 7G. Связывание VH3/VK2 в мышиной и человеческой ткани. Фиг. 7Н. Связывание VH3/VK3 в мышиной и человеческой ткани.

[0028] На фиг. 8 показано картирование эпитопа для мышиного HJ8.5 антитела относительно аминокислотной последовательности человеческого тау. На фиг. 8 показаны последовательности тау человека, макаки-резус и мыши (SEQ ID NO:21, 22, 23, соответственно).

[0029] На фиг. 9 в деталях показано основанное на пептидах картирования эпитопа у HJ8.5 и C₂N-8E12. Картирование свидетельствует о том, что эпитоп связывания у C₂N-8E12 представляет собой ₂₅DQGGYT₃₀ (SEQ ID NO: 9) и соответствует эпитопу мышиного родительского HJ8.5. На фиг. 9 показаны последовательности пептидов с PEP_2875800 до PEP_2875830 (SEQ ID NO:24–54, соответственно).

[0030] На фиг. 10 показаны результаты связывания различных антител к человеческому тау либо с человеческим тау, либо с тау макака-резуса. Результаты показывают, что C₂N-8E12 и HJ8.5 не связываются с тау макака-резуса, при этом демонстрируют положительное связывание с человеческим тау. HJ8.7 вызывается как с человеческим тау, так и с тау макака-резуса.

[0031] На фиг. 11 показано связывание гуманизированного анти-тау антитела с тау в СМЖ (CSF), полученной от больных, страдающих различными тауопатиями. Оценивали связывание C₂N-8E12 с тау в образцах СМЖ, полученных от пациентов с диагнозом различных тауопатий.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0032] Имеются веские экспериментальные свидетельства и биологические обоснования в пользу стратегии, ориентированной на тау иммунотерапию как способа борьбы с тау патологией при нейродегенерации. Во-первых, в нормальном состоянии тау является хорошо растворимым, нативно развернутым, внутриклеточным белком, так что находящееся вне клетки антитело вряд ли сможет оказать влияние на нормальные функции тау. Во-вторых, нагрузка тау патологии коррелирует с прогрессирующей дисфункцией нейронов, потерей синапсов и снижением функциональных возможностей организма у человека и в моделях таупатии у трансгенных мышей. В-третьих, при патологических состояниях тау становится неправильно свернутым и образует агрегаты в виде внутринейрональных нейрофибриллярных клубков (НФК), состоящих из патологических тау-фибрилл. При человеческих тауопатиях эта патология прогрессирует от одного участка мозга к другому в специфических для заболевания паттернах. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что агрегаты тау могут распространяться от клетки к клетке, индуцируя дальнейшую агрегацию тау и распространение тау патологии в головном мозге. Эти данные показывают, что агрегаты, образованные в одной клетке, высвобождаются во внеклеточное пространство и могут способствовать агрегации в соседних или сопряженных клетках. Наконец, в уровне техники показано, что анти-тау антитела могут предотвращать или замедлять прогрессирование тау патологии в мозге мышей, несущих мутированную человеческую форму тау.

[0033] "Гуманизированное антитело" представляет собой антитело или его вариант, производное, аналог или фрагмент, который был модифицирован с целью уменьшения риска появления иммунного ответа у человека на нечеловеческое антитело после его введения. Гуманизированное антитело, как используется в настоящей заявке, иммуноспецифично связывается с тем же или схожим эпитопом, что и нечеловеческое антитело (донорское антитело). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит каркасную (FR) область, имеющую по существу аминокислотную последовательность человеческого антитела, и определяющую комплементарность область (CDR), имеющую по существу аминокислотную последовательность нечеловеческого антитела. Термин "по существу" в контексте CDR относится к CDR, имеющей аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности CDR нечеловеческого антитела. Гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, а обычно два вариабельных домена (Fab, Fab', F(аb')2, FabC, Fv), в которых все или по существу все области CDR соответствуют областям нечеловеческого иммуноглобулина (т.е. донорского антитела), и все или по существу все из каркасных областей являются каркасными областями консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Предпочтительно, гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. В настоящем изобретении предоставляется гуманизированное антитело, которое содержит новую каркасную область.

[0034] В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело также может включать области CH1, шарнирную, CH2, CH3 и CH4 тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную тяжелую цепь. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированный вариабельный домен легкой цепи и/или гуманизированную тяжелую цепь.

[0035] Антитело может быть выбрано из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая, без ограничения, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Гуманизированное антитело может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа, а для оптимизации желаемых эффекторных функций могут быть выбраны конкретные константные области методами, хорошо известными в данной области техники.

[0036] Антитело или его антиген-связывающий фрагмент выбирают из группы, состоящей из: связанного дисульфидными связями Fv, моноклонального антитела, одноцепочечного вариабельного фрагмента (ScFv), химерного антитела, CDR-привитого антитела, диатела, гуманизированного антитела, мультиспецифического антитела, Fab (антиген-связывающего фрагмента), биспецифического антитела, F(аb')2 (двухплечевого, антиген-связывающего фрагмента, как правило, получаемого путем расщепления антитела пепсином), Fab' (результат расщепления F(аb')2 на два антиген-связывающих фрагментов, как правило, с помощью деления в мягких условиях), или Fv (антиген-связывающий вариабельный фрагмент).

[0037] Термин "химерное антитело" относится к антителам, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей одного вида и последовательности константных областей другого вида, например, антитела, имеющие вариабельные области мышиной тяжелой и легкой цепей, связанные с человеческими константными областями.

[0038] "Область VH", "область VL" или "область VKʺ относится к вариабельной области тяжелой цепи (VH), вариабельной области легкой лямбда-цепи (VL) или вариабельной области легкой каппа цепь (VK), соответственно. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые перемежаются более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке от амино-конца к карбокси-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Иммуноглобулиновые молекулы бывают разного типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

[0039] Термин "каркасная область" или "последовательность каркасной области" относится к остальным последовательностям вариабельной области минус CDR. Поскольку точное определение последовательности CDR может быть выполнено в рамках различных систем, то содержание последовательности каркасной области, зависит от соответствующих различных способов интерпретации. Шесть CDR (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 легкой цепи и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 тяжелой цепи) также разделяют каркасные области в легкой цепи и тяжелой цепи на четыре подобласти (FR1, FR2, FR3 и FR4) на каждой цепи, причем CDR1 располагается между FR1 и FR2, CDR2 между FR2 и FR3, а CDR3 между FR3 и FR4. Без обозначения конкретных подобластей как FR1, FR2, FR3 или FR4, каркасная область, согласно другим взглядам, представляет собой объединенные FR внутри вариабельной области одной встречающейся в природе иммуноглобулиновой цепи. ʺFRʺ представляет собой одну из четырех подобластей, а ʺFRsʺ представляет собой две или более из четырех подобластей, составляющих каркасную область.

[0040] Многие гуманизированные иммуноглобулины, которые были описаны ранее (Jones et al., Verhoeyen et al., Riechmann et al.), содержат каркасную область, которая идентична каркасной области конкретной человеческой иммуноглобулиновой цепи, акцептор, и три CDR, полученные из нечеловеческой имуноглобулиновой цепи. "Гуманизированное анти-тау" антитело означает антитело, которое образовано из нечеловеческого (донорского) антитела, способного связываться с тау, и это связывание переносится на человеческое антитело (акцептор).

[0041] Термин "CDR" относится к определяющей комплементарность области внутри вариабельных последовательностей антитела. В каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи содержатся три CDR, которые для каждой из вариабельных областей обозначаются как CDR1, CDR2 и CDR3. Аминокислотные последовательности этих CDR для областей VH и VL/K заявленного изобретения представлены на фиг. 1.

[0042] В данном описании термин одноцепочечный Fv, называемый также одноцепочечное антитело, относится к рекомбинантным конструктам антитела, полученным путем выделения связывающих доменов (как тяжелой, так и легкой цепей) связывающего антитела и обеспечения сшивающего фрагмента, который позволяет сохранить функцию связывания. Линкерный пептид, вставляемый между двумя цепями обеспечивает стабилизацию вариабельных доменов, не нарушая правильную сборку и образуя активный связывающий участок. Этот линкер может быть длиной от 5 до 30 аминокислот и обычно состоит из повторов аминокислотной последовательности ʺGGGGSʺ ((Gly)4Ser) (SEQ ID NO:55). По сути, образуется радикально укороченное антитело, имеющее только вариабельный домен, необходимый для связывания антигена.

[0043] Диатела, триатела и тетратела и варианты более высокого порядка, как правило, создают путем изменения длины указанного выше линкерного пептида, от нуля до нескольких аминокислот. Такие варианты являются поливалентными, мультиспецифическими антителами, у которых домены VH и VL экспрессируются на полипептидной цепи с использованием линкера, который является слишком коротким для спаривания двух доменов на одной и той же цепи, тем самым обеспечивая спаривание доменов с комплементарными доменами другой цепи с образованием двух антиген-связывающих участков (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Такие связывающие участки антител известны в данной области (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. p. 790 (ISBN 3-540-41354-5)). В качестве альтернативы, в данной области также хорошо известно, что поливалентные связывающие варианты антител могут быть получены с использованием самособирающихся звеньев, соединенных с вариабельным доменом.

[0044] Биспецифические, триспецифические или антитела со множественной специфичностью создаются путем объединения тяжелых и легких цепей одного антитела с тяжелыми и легкими цепями одного другого или нескольких других антител. Эти цепи могут быть ковалентно связанными. Например, термин "биспецифическое антитело" относится к антителу полной длины, получаемому методом квадрома (см. Milstein and Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40), путем химической конъюгации двух различных моноклональных антител (см. Staerz et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31) или с помощью подхода "выступ-во-впадину" (knob-into-hole) или с помощью аналогичных подходов, позволяющих вносить мутацию в Fc-фрагмент (см. Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14):6444-6448), получая множество различных видов иммуноглобулинов, из которых только один является функциональным биспецифическим антителом. С точки зрения молекулярной функции, биспецифическое антитело связывает один антиген (или эпитоп) на одном из двух связывающих плечах (одна пара HC/LC), а на другом плече (другая пара HC/LC) связывает другой антиген (или эпитоп). Биспецифическое антитело имеет два разных антиген-связывающих плеча (в обеих специфичностях и CDR последовательностях) и является моновалентным для каждого антигена, с которым оно связывается.

[0045] Несколько мышиных антител, способных связывать тау, получали методами, известными в данной области. См. Holtzman et al., WO2014/08404. Далее, эти антитела подвергали скринингу для выявления антител со специфической биологической активностью, позволяющей рассматривать их в качестве подходящих кандидатов для терапевтического применения.

[0046] В одном из аспектов настоящее изобретение предоставляет композитные гуманизированные антитела. Метод создания Композитного Человеческого Антитела^TM позволяет получать гуманизированные антитела путем идентификации потенциальных Т-клеточных эпитопов в последовательностях вариабельных областей (V областей) донорского антитела и создания антитела или антиген-связывающих фрагментов таким образом, что связывание с потенциальными Т-клеточными эпитопами исключается (см. EP2,388,871). В отличие от других методов гуманизации, в которых в качестве 'акцепторов' легкой и тяжелой цепей для соответствующих определяющих комплементарность областей (CDR) из донорского антитела (как правило, мышиного) используется один каркасный участок человеческой V области легкой и тяжелой цепей или каркасный участок человеческой консенсусной последовательности, Композитные Человеческие Антитела™ содержат множество сегментов последовательностей ("композиты"), полученных из V областей, которые не являются родственными многочисленным человеческим антителам.

[0047] Сегменты последовательностей, полученные из базы данных, неродственных человеческих V областей выбирают после определения аминокислот, которые считаются критическими для связывания антигена исходным антителом. Все выбранные сегменты последовательностей, полученные из базы данных человеческих V областей, фильтруют на наличие потенциальных CD4+ Т-клеточных эпитопов с помощью средств компьютерного моделирования, известных в данной области техники. Композитные Человеческие Антитела™ сохраняют аффинность и специфичность лучше, чем стандартные гуманизированные антитела, благодаря близкому соответствию сегментов человеческой последовательности всем секциям V областей исходного антитела. Композитные Человеческие Антитела™ обеднены Т-клеточными эпитопами, и, следовательно, их можно рассматривать как гуманизированные и деиммунизированные.

[0048] В одном из вариантов осуществления человеческие вариабельные области в человеческом акцепторном IgG заменяют мышиными вариабельными областями из донорского антитела, получая химерное антитело.

[0049] В другом варианте осуществления CDR последовательности в человеческом акцепторном IgG заменяют последовательностями мышиных CDR из донорского антитела, получая гуманизированное антитело. Для удаления потенциальных Т-клеточных эпитопов и остатков в каркасных областях, которые считаются важными для сохранения связывающих характеристик донорского антитела, в гуманизированное антитело вносят дополнительные изменения. Специалисту в данной области известно, что для гуманизации антитела могут быть использованы другие способы, такие как прививка CDR.

[0050] В другом варианте осуществления гуманизируют нечеловеческие антитела, способные связываться с человеческим тау.

[0051] Антитела по настоящему изобретению могут проявлять измененную аффинность связывания и/или измененную иммуногенность по сравнению с донорскими антителами. В некоторых вариантах осуществления химерные или гуманизированные антитела имеют по существу такую же аффинность связывания с тау эптопом, как донорское антитело.

[0052] В другом варианте осуществления одноцепочечный вариабельный фрагмент, основанный на гуманизированном антителе, описанном в настоящей заявке, например, гуманизированном анти-тау антителе, может связываться в виде мономера.

[0053] В другом варианте осуществления, используя фрагменты антитела, может быть достигнуто поливалентное связывание с помощью диател, триател, тетрател и других вариантов более высокого порядка, которые могут быть получены.

[0054] В другом варианте осуществления тяжелая и легкая цепи гуманизированного анти-тау антитела могут быть объединены с тяжелой и легкой цепями других антител с образованием биспецифических или других дополнительных мультиспецифических антител.

[0055] Далее, гуманизированные антитела по изобретению, например, гуманизированное анти-тау антитело также может быть в виде фрагмента антитела, например, Fab, мономера Fab', димера F(аb)'2 или полной молекулы иммуноглобулина.

[0056] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности DQGGYT (SEQ ID NO: 9). Этот пептид представляет собой коровый эпитоп для описанных в настоящей заявке антител, таких как C₂N-8E12 или HJ8.5. В одном из аспектов настоящего изобретения пептид включает Х_(0-8)DQGGYTX_(0-8) (SEQ ID NO: 56), где Х представляет собой любую аминокислоту. Несмотря на то, что в иллюстративном примере показано 15 мер (см. Фиг. 11), специалисту в данной области техники будет очевидно, что настоящее изобретение включает пептиды разной длины. Соответственно, заявленные антитела или фрагменты могут специфически связываться с эпитопом, содержащим аминокислотную последовательность DQGGYT (SEQ ID NO: 9). Эпитоп может быть линейным или представлять собой конформационные эпитопы и может содержать от примерно 6 до 22 аминокислот.

[0057] В других вариантах осуществления заявленные способы относятся к лечению таупатии с помощью антитела или антиген-связывающего фрагмента, где антитело или фрагмент вводят в определенной дозе субъекту с таупатией.

[0058] Подходящие дозы антитела или антиген-связывающего фрагмента могут быть выражены в мг лекарственного средства на кг веса тела субъекта. Подходящие дозы антитела или его антиген-связывающего фрагмента включают по меньшей мере примерно 0,1 мг/кг, в качестве альтернативы от примерно 0,2 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 0,25 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 0,3 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 0,5 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 0,75 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 1 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 1,25 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 1,5 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 2 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 5 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 7,5 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 10 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 12,5 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 15 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 20 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 25 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 30 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 50 мг/кг, в качестве альтернативы примерно 100 мг/кг. Подходящие дозы антитела или его антиген-связывающего фрагмента могут составлять не более чем примерно 250 мг/кг, в качестве альтернативы не более чем примерно 200 мг/кг, в качестве альтернативы не более чем примерно 175 мг/кг, в качестве альтернативы не более чем примерно 150 мг/кг, в качестве альтернативы не более чем примерно 125 мг/кг, в качестве альтернативы не более чем примерно 100 мг/кг, в качестве альтернативы не более чем примерно 75 мг/кг, в качестве альтернативы не более чем примерно 50 мг/кг, в качестве альтернативы не более чем примерно 25 мг/кг, в качестве альтернативы не более чем примерно 20 мг/кг, в качестве альтернативы не более чем примерно 15 мг/кг. Любые из вышеуказанных минимальных и максимальных значений могут быть объединены для определения диапазона (например, от примерно 0,1 мг/кг до примерно 250 мг/кг) при условии, что минимальное значение диапазона меньше, чем его максимальное значение.

[0059] Подходящие дозы антитела или антиген-связывающего фрагмента могут быть выражены в мг лекарственного средства, вводимого субъекту. Подходящие дозы гуманизированного антитела или антиген-связывающего фрагмента включают по меньшей мере примерно 2,5 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 5 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 10 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 15 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 20 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 25 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 30 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 40 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 50 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 60 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 70 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 80 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 90 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 100 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 125 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 150 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 175 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 200 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 250 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 100 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 125 мг, в качестве альтернативы по меньшей мере примерно 300 мг. Подходящие дозы антитела или антиген-связывающего фрагмента могут составлять не более чем примерно 2500 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 2000 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 1500 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 1000 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 750 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 500 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 400 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 300 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 275 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 250 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 200 мг, в качестве альтернативы не более чем примерно 150 мг. Любые из вышеуказанных минимальных и максимальных значений могут быть объединены для определения диапазона (например, от примерно 5 мг до примерно 2500 мг) при условии, что минимальное значение диапазона меньше, чем его максимальное значение.

[0060] C₂N-8E12 представляет собой гуманизированное рекомбинантное IgG4 антитело к человеческому тау. IgG4 остов у C₂N-8E12 содержит мутацию S241P, стабилизирующую шарнирную область, которая сводит к минимуму образование полу-антител. C₂N-8E12 связывается с аминокислотами 25-30 в человеческом тау (DQGGYT) (SEQ ID NO: 9), последовательность которого присутствует во всех сплайсинговых вариантах человеческого тау, а также с амино-концевыми фрагментами тау. Антитело связывается как с мономерным тау, так и агрегированным тау в ткани головного мозга человека, страдающего тауопатией. C₂N-8E12 является очень стабильным с незначительной степенью агрегации или деградации. Общие физические свойства C₂N-8E12 представлены в таблице 1.

Таблица 1
Молекулярный вес	145,72 кДа
Стереохимия	L-аминокислоты
Внешний вид	Прозрачная жидкость от бесцветного до светло-желтого цвета
Растворимость	~130 мг/мл

[0061] Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на прилагаемые примеры, очевидно, что возможны различные модификации и изменения в настоящем изобретении без отхода от сущности или объема настоящего изобретения. Приложения к настоящей заявке являются иллюстративными примерами данного изобретения и включены в настоящую заявку во всей своей полноте в качестве ссылки.

Пример 1

[0062] Этот пример описывает действия по гуманизации мышиного анти-тау антитела HJ8.5 и полученные результаты. В результате этих действий были получены четыре гуманизированные вариабельные области легкой цепи (VL или VK) и четыре гуманизированные вариабельные области тяжелой цепи (VH).

[0063] Гуманизация, как правило, относится к методам уменьшения вероятности потенциальной иммуногенности, связанной с использованием нечеловеческого моноклонального антитела для лечения хронического заболевания. Два способа, обычно используемые для уменьшения вероятности иммуногенности, представляют собой прививку CDR и деиммунизацию. Мышиное антитело HJ8.5 деиммунизировали методом, разработанным компанией Antitope.

[0064] Прививка CDR является одним из подходов в рамках белковой инженерии. Говоря вкратце, он основан как на понимании общей архитектуры антитела, так и на ее схожести у различных видов. Мышиные и человеческие антитела имеют сходную общую/консервативную архитектуру. Структурно антитело подразделяется на константные и вариабельные области. Вариабельная область может быть дополнительно разделена на так называемые каркасные области и области CDR. Как можно видеть, вариабельная область состоит из четырех каркасных (Fwk) и трех CDR областей. В вариабельных доменах легких и тяжелых цепей расположение каркасных и CDR областей одинаковое.

[0065] В случае прививки CDR, нечеловеческие константные области заменяют человеческими константными областями, создавая так называемое химерное антитело. Кроме того, мышиные области CDR переносят в человеческие каркасные области; полученный вариабельный домен представляет собой смесь человеческих каркасных областей и мышиных CDR. В качестве последнего этапа, переносят несколько остатков из мышиных каркасных областей, которые предположительно являются важными для сохранения аффинности (не показаны).

[0066] Деиммунизация: Метод Композитного Человеческого Антитела™ компании Antitope называется методом деиммунизации, который используется в сочетании с идентификацией как CDR областей, так и ключевых аминокислот в пределах рамки считывания, которые предположительно влияют на связывание. Полученные полностью гуманизированные антитела сохраняют аффинность связывания и специфичность исходного моноклонального антитела, и к тому же лишены CD4+ T-клеточных эпитопов, что позволяет избегать нежелательной иммуногенности в организме человека.

[0067] Композитные Человеческие Антитела™ создают путем объединения множества сегментов последовательностей человеческого антитела, полученных из базы данных компании Antitope, содержащей 100000 последовательностей вариабельных областей неродственных полностью человеческих антител. Начальное моделирование последовательностей вариабельных областей антитела HJ8.5 используется для определения аминокислот, которые являются критичными для связывания антитела и которые затем используются для ограничения выбора сегментов человеческих последовательностей. После этого анализируют отдельные сегменты последовательностей и стыки между соседними сегментами с помощью двух запатентованных методов компьютерного моделирования (iTope™ и TCED™) для выбора последовательностей полностью человеческих вариабельных областей, которые лишены CD4+ Т-клеточных эпитопов. ДНК, кодирующую вариабельные области для Композитных Человеческих Антител, синтезируют, клонируют в экспрессирующем векторе с человеческими константными областями и трансфицируют в клетки млекопитающего для получения гуманизированных антител.

[0068] Гуманизация HJ8.5: Структурные модели V областей анти-тау-412 мышиного антитела HJ8.5 получали с помощью швейцарского PDB и анализировали для определения важных "незаменимых" аминокислот в V областях, которые, вероятно, являются существенными для сохранения связывающих свойств антитела. Анализ выявил ряд незаменимых остатков в каркасной области в качестве кандидатов для включения в полностью гуманизированные V области. Сегменты последовательностей человеческих вариабельных областей выбирали таким образом, чтобы они включали один или более из этих остатков.

[0069] Предварительный набор сегментов человеческих последовательностей, которые могут быть использованы для создания полностью гуманизированных антител HJ8.5, выбирали и анализировали методом iTope™ для анализа связывания пептидов с аллелями человеческого МНС класса II методом компьютерного моделирования (Perry et al., 2008), а также с помощью TCED™ (базы данных Т-клеточных эпитопов) Т-клеточных эпитопов известных антител с аналогичными последовательностями (Bryson et al., 2010). Отбрасывали сегменты последовательностей, которые были идентифицированы как значимые нечеловеческие связующие гаметического типа с человеческим МНС класса II, или которые имели значимые попадания относительно TCED™. Комбинации сегментов последовательностей также анализировали для гарантии того, что стыки между сегментами не содержат потенциальные Т-клеточные эпитопы. Затем выбранные сегменты объединяли, получая последовательности V областей легкой и тяжелой цепей для синтеза. Для HJ8.5 разработали и сконструировали четыре цепи VH и четыре цепи VК.

[0070] На фиг. 1 показаны последовательности вариабельных областей мышиного антитела HJ8.5, а также 4 последовательности гуманизированных вариантов для каждой из тяжелых и легких цепей (4 последовательности VH и 4 последовательности VL/VK). Аминокислотные последовательности этих четырех цепей VH и четырех цепей VК приведены на фиг. 1. Последовательности CDR, определенные по Кабату и др., выделены красным цветом (подчеркнуты). Изменения в каркасных областях по сравнению с исходной мышиной последовательностью выделены синим цветом и жирным шрифтом.

[0071] В таблице B-1 суммированы данные о количестве изменений в каркасных областях, введенных в каждый вариант вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей.

Таблица B-1
Вариабельный домен	Количество замен в каркасной области
VH1	4
VH2	5
VH3	10
VH4	11
VK1	6
VK2	7
VK3	11
VK4	12

[0072] На фиг. 2 показаны последовательности гуманизированных вариабельной и константной областей для каждой из тяжелых и легких цепей (4 последовательности VH и 4 последовательности VL/VK). Вариабельную область тяжелой цепи прививают к константной области тяжелой цепи человеческого IgG4, содержащего мутацию S241P, стабилизирующую шарнирную область. Вариабельную область легкой цепи прививают к константной области человеческой легкой каппа-цепи. В этой таблице также приведены теоретически вычисленная изоэлектрическая точка (PI) и молекулярный вес (Mw, MW).

[0073] На фиг. 3 показаны данные экспрессии, полученные из 2 циклов транзиентной экспрессии клеток, трансфицированных полинуклеотидами, кодирующими области VH и VK. Результаты по 13 гуманизированным анти-тау антителам суммированы. Различные комбинации тяжелых и легких цепей дают заметно разные наблюдаемые уровни экспрессии. В 1-м цикле все варианты областей VH и VL объединяли друг с другом (показаны результаты только для 13 из 16, протестированных). Во втором цикле были протестированы 6 лучших экспрессирующих комбинаций, наблюдаемых в 1 цикле. Экспрессия показана в мкг антитела, измеренная на 1 мл культуральной среды. Более высокие уровни экспрессии являются предпочтительными, так как это свидетельствует о том, что антитело имеет правильную сборку, секретируется, как и ожидалось, является нетоксичным и в целом стабильным.

[0074] На фиг. 4 представлены данные по анализу активности. Для получения дополнительной характеристики гуманизированных вариантов анти-тау антитела, с помощью анализа активности оценивали способность антител конкурировать с исходным мышиным HJ8.5 (родительским антителом) за связывание с человеческим тау в формате метода ИФА. Формат анализ включает покрытие пластины ELISA человеческим тау, после чего обеспечивают возможность тестируемому антителу, а также биотинилированному HJ8.5, конкурировать за связывание с тау. Анализ позволяет измерять относительную величину IC50 для каждого гуманизированного варианта антитела. Значения IC50 нормируют относительно значения для химерного HJ8.5 для сравнения результатов, полученных для разных пластин. Эти данные показывают, что процесс гуманизации не привел к значительным изменениям в способности гуманизированных антител связывать человеческий тау.

Пример 2

[0075] В данном исследовании описано использование Biacore T200 для измерения и сравнения характеристик связывания при взаимодействии шести полностью гуманизированных (VH1/VK2, VH1/VK3, VH2/VK2, VH2/VK3, VH3/VK2 и VH3/VK3, описанных выше в примере 1) моноклональных антител и одного химерного моноклонального антитела, полученного на основе HJ8.5, с рекомбинантным человеческим белком тау-412. Цель данного исследования состояла в использовании прибора Biacore T200 на эффекте поверхностного плазмонного резонанса для определения с высоким разрешением кинетических характеристик взаимодействия между тау-412 и семью указанными mAb.

[0076] Антитела хранили при температуре 4°С. Тау-412 хранили при -20°С в соответствии с инструкциями изготовителя. После восстановления, раствор тау-412 хранили на льду и использовали в течение 24 часов. Аликвоты восстановленного тау-412 замораживали в течение 30 минут после восстановления и хранили при -20°С.

[0077] При работе прибора Biacore использовали программное обеспечение Biacore T200 evaluation software v1.0 (Uppsala, Sweden). Все материалы приобретали в компании Biacore, если не указано иное:

Набор 2 для профилактического обслуживания Biacore	BR-1006-51
Сенсорные чипы S серии CM5	BR-1006-68
Набор для связывания аминов	BR-1000-50
10 мМ ацетатный буфер, pH 4.5	BR-1003-51
HBS-EP рабочий буфер	BR-1006-69
10 мМ буфер глицин-HCl, pH 1,5	BR-1003-54
10 мМ буфер глицин-HCl, pH 2,0	BR-1003-55
Белок А (Sigma)	P6031
4М MgCl2 гексагидрат (Sigma)	M9272-500G

[0078] Все эксперименты разрабатывали с помощью экспертного программного обеспечения Biacore. Использовали следующие методы компании Biacore: иммобилизация; кинетика/аффинность; и десорбция и очистка.

[0079] Перед прогоном любых образцов, а также в ходе исследования, проводили проверку системы (Набор 2 для профилактического обслуживания Biacore). Все системы тестировали (насос для реагентов, рефрактометр, инъекции, селекторы шума, микширования и буфера) для обеспечения гарантии того, что прибор функционирует согласно критериям, установленным изготовителем.

[0080] После установки чипа CM5/белок А запускали систему и затем нормировали, используя нормализующий раствор BIA (Набор 2 для профилактического обслуживания Biacore). Все образцы прогоняли при 25°C, при этом штатив с образцами держали в инкубаторе при 5°С. Чип добавляли в систему с HBS-EP, используемым в качестве рабочего буфера.

[0081] Образцы mAb хранили в том виде, как они были получены и разбавляли до 100 нМ для всех прогонов в методе иммобилизации (захвата). Антиген тау-412 восстанавливали из сухого порошка, используя воду Milli-Q, до конечной концентрации 1 мг/мл; в прогонах для определения кинетических характеристик использовали дополнительные разведения. Массу и молекулярный вес тау-412, используемого при расчете концентрации, получали от изготовителя реагента (100 мкг/флакон и 42,9 кДа). Белок-носитель к этому раствору не добавлялся. Флаконы с антигеном восстанавливали только при необходимости и до момента их использования хранили в виде порошка при температуре -20°С. После восстановления, раствор антигена держали на льду не более 24 часов.

[0082] Для этого исследования был выбран анализ захвата белком А. Эффективность поверхности с белком А превосходила таковую поверхности с анти-человеческими белком A/G, белком G и белком L, которые также были протестированы. Чип с белком А готовили путем иммобилизации, используя стандартную химическую реакцию связывания амина. Иммобилизацию выполняли при концентрации белка 5 мкг/мл в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4,5) до получения целевого ответа величиной 500 RU на сенсорном чипе S серии CM5 (Biacore).

[0083] Окончательные уровни ответа для всех чипов с белком А, обозначенные F_cs показаны в таблице G-1.

Таблица G-1
Лиганд	Конечный уровень ответа (RU)
Fс1	Белок А	697,1
Fс2	Белок А	691,4
Fс3	Белок А	708,3
Fс4	Белок А	704,6

[0084] Для кинетических экспериментов, количество иммобилизованного/захваченного лиганда должно быть ограниченным, чтобы избежать эффектов массопереноса на поверхности чипа. Для кинетических экспериментов поверхность в идеале должна иметь максимальный уровень связывания аналита (R_max), равный 50-100 RU. Таким образом, количество лиганда для иммобилизации рассчитывают по уравнению 1:

[0085] Принимая средний MW для аналита тау-412, равный 42,9 кДа (получено от изготовителя реагентов), для лиганда, равным 150 кДа (рассчитанное значение для антител) (mAb), R_max, равное 100 RU, и стехиометрию (S_m), равную 1, для захвата всех тестируемых антител устанавливали целевое значение, равное 300 RU. Уровни захвата, полученные в исследовании, варьировали от ~280 до 400 RU. Для второго и третьего прогонов регулировали количество инъецируемого антитела, чтобы приблизиться к желаемому уровню захвата, 300 RU.

[0086] Неспецифическое связывание (НСС) может быть обусловлено либо аналитом, либо примесями в аналите, вступающими во взаимодействие либо с лигандом (неспецифическое и трудно обнаруживаемое), белком захвата, либо с поверхностью сенсорного чипа. При анализе ответа на пустой поверхности F_c1 после 300 секундной инъекции относительно высокой концентрации (40 нМ) тау-412, НСС не наблюдалось ни с карбоксидекстрановой поверхностью, ни с поверхностью с белком захвата А. При концентрации тау-412 >100 нм наблюдали значимое НСС с карбоксидекстрановой поверхностью чипа; однако для последующего кинетического анализа концентрации в пределах этого диапазона не были востребованы.

[0087] Осуществляли определение условий восстановления, при этом оптимальные условия для восстановления химерных и VH1/VK2 антител на поверхности с белком А оказались следующими: три инъекции по 240 секунд 10 мМ глицин-HCl буфера (рН 1,7) с последующей единичной 300-секундной инъекцией 4М MgCl₂, все вводимые со скоростью 40 мкл/мин. После последней инъекции для восстановления следовал этап 600 секундного ожидания для стабилизации поверхности перед началом следующего цикла связывания.

[0088] Поиск буфера не проводился, так как первоначальные тесты показали, что выбранный буфер 'HBS-EP' обеспечивал воспроизводимую систему, подходящую для кинетического анализа.

[0089] Эффективность поверхности анализировали с помощью повторных контрольных инъекций 2,5 нМ тау-412 в начале, в середине и в конце кинетического прогона. Стабильное связывание наблюдали на протяжении всего кинетического прогона, уделяя особое внимание вопросу пригодности системы для кинетического анализа.

[0090] Ограничение массопереноса происходит при наличии важного компонента, ассоциированного со скоростью переноса аналита на поверхность и с поверхности чипа. Там, где массоперенос является значительным, результаты кинетического анализа могут быть неточными. Понижение плотности иммобилизованного лиганда или увеличение скорости потока может снизить ограничения массопереноса. Для данного исследования была выбрана скорость потока, равная 40 мкл/мин, исходя из предыдущего опыта использования поверхностей с низкой плотностью и антигенов со сходными значениями Mw.

[0091] Контрольный эксперимент по реакции связывания использовали для оценки взаимодействия лиганд-аналит для проверки на наличие отклонений от модели связывания 1-к-1. Аналит инъецировали на поверхность в течение различных периодов времени (времени контакта), и анализировали скорость диссоциации для определения, изменяется ли она в зависимости от времени контакта. Если такая зависимость наблюдается, это указывает на наличие второго события взаимодействия после первичного события связывания, которое приводит к стабилизации комплекса на поверхности.

[0092] Исходя из предыдущего эксперимента, в котором использовались форматы для анализа захвата, наблюдаемой стехиометрии связывания, равной 1,5, и того факта, что модель 1-к-1 могла бы с определенной долей достоверности соответствовать кинетическим данным, контроль реакций связывания не проводили, в связи с отсутствием дополнительного доказательства в поддержку более сложных кинетических взаимодействий.

[0093] Модель связывания 1-к-1 использовали для аппроксимации полученных кинетических данных (уравнение 2). Из-за различий в количестве захваченного антитела, параметр R_max устанавливали локально, в отличие от глобального анализа, для каждого кинетического анализа связывания антитела.

[0094] Характеристика антитела: Полученные характеристики и контрольные эксперименты, проведенные для изучения поверхности с белком захвата А подтвердили, что она является подходящей системой для определения кинетических значений взаимодействий с тау-412. Стехиометрию связывания оценивали с помощью инъекции насыщенного раствора тау-412 (1000 нМ) при 277 RU для захваченного VH1/VK2 на исследуемой поверхности с белком А. Две последовательные инъекции 1000 нМ тау-412, судя по всему, обеспечивали в результате насыщенное связывание при 122 RU. Это дало 150% стехиометрию связывания, превышающую ожидаемую для связывания одной молекулы антитела с одной молекулой тау-412. Причины этого могут заключаться в связывании антитела с двумя молекулами тау-412 или в олигомеризации тау-412 на поверхности чипа.

[0095] Кинетические данные получали при скорости потока 40 мкл/мин для минимизации любых потенциальных эффектов массопереноса. В кинетическом прогоне было запрограммировано по два повтора холостой пробы (без антигена) и аналита с концентрацией 2,5 нМ для проверки стабильности как поверхности, так и аналита во время кинетических циклов. Для начальных кинетических прогонов, выполняли 2-кратные разведения тау-412 в пределах от 40 нМ до 0,156 нМ. Для кинетического анализа и последующих прогонов выбирали диапазон концентраций аналита от 20 нМ до 0,625 нМ. Этот диапазон покрывал множество концентраций аналита выше и ниже зарегистрированного K_D.

[0096] Фазу ассоциации контролировали в течение 500 секунд, чтобы обеспечить возможность достижения устойчивого состояния аналита при некоторых более высоких концентрациях. Для получения достаточного снижения сигнала (> 10%) во время фазы диссоциации кинетического цикла, диссоциацию измеряли в течение 1200 секунд. Как уже обсуждалось в разделе 5, после каждой стадии восстановления, обеспечивали возможность для стабилизации F_cs в течение 600 секунд. Сигнал из контрольного канала F_c1 вычитали из сигналов из F_c2, F_c3 и F_c4.

[0097] Кинетические параметры для взаимодействия тау-412 с семью mAb, измеренные с использованием системы с белком захвата А на Biacore T200, приведены в Таблице F-2. Для корректировки различий в уровне захвата антитела между каждым циклом связывания, использовали локальный параметр R_max в модели связывания 1-к-1. Кинетический анализ выполняли в трех независимых прогонах, используя свежие препараты тау-412 и антитела. В прогоне 1 и прогонах 2+3 использовали разные флаконы антигена тау-412; поэтому зарегистрированные ошибки, ассоциированные со средним ответом, вероятно, связаны с изменениями при приготовлении аналита и различиями в настройках анализа и прогона. От прогона 1 до прогонов 2+3, подбирали количество инъецируемого антитела таким образом, чтобы приблизиться к целевым уровням захвата, 300 RU. Для прогона 1 химерное антитело прогоняли три раза, и анализ всех трех наборов данных показан в таблице F-2. % CV для K_D, полученного из этих трех наборов данных, составил 4,3%, указывая на то, что результаты находятся в пределах вариативности рассматриваемого анализа.

Таблица F-2
Лиганд	Чип	ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)	Chi-2	Аппендикс II
VH1/VK2	А11/1	2,80×105	4,40×102	6,11×10-4	2,80×10-7	2,18		1,28	A3-4
VH1/VK2	А11/3	3,25×105	1,00×102	6,32×10-4	8,20×10-7	1,95		0,44	A5-6
		ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)(nM)
Среднее значение		3,02×105	3,19×104	6,21×10-4	1,48×10-5	2,06	0,17
Лиганд	Чип	ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)	Chi-2	Аппендикс II
VH1/VK3	А11/1	2,80×105	9,10×102	6,26×10-4	8,50×10-7	2,24		0,99	A7-8
VH1/VK3	А11/2	2,95×105	4,40×102	5,72×10-4	2,70×10-7	1,94		0,52	A9-10
		ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)(nM)
Среднее значение		2,87×105	1,07×104	5,99×10-4	3,76×10-5	2,09	0,21
Лиганд	Чип	ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)	Chi-2	Аппендикс II
VH2/VK2	А11/1	2,62×105	4,30×102	6,28×10-4	2,80×10-7	2,40		0,83	A11-12
VH2/VK2	А11/2	2,84×105	4,10×102	5,87×10-4	2,60×10-7	2,06		0,70	A13-14
		ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)(nM)
Среднее значение		2,73×105	1,59×104	6,08×10-4	2,94×10-5	2,23	0,24
Лиганд	Чип	ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)	Chi-2	Аппендикс II
VH2/VK3	А11/1	2,68×105	8,80×102	6,53×10-4	9,00×10-7	2,44		1,11	A15-16
VH2/VK3	А11/2	2,92×105	4,40×102	5,33×10-4	2,60×10-7	1,83		0,50	A17-18
		ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)(nM)
Среднее значение		2,80×105	1,71×104	5,93×10-4	8,44×10-5	2,13	0,43
Лиганд	Чип	ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)	Chi-2	Аппендикс II
VH3/VK2	А11/1	2,62×105	3,20×102	5,46×10-4	2,20×10-7	2,08		0,45	A19-20
VH3/VK2	А11/2	2,90×105	3,70×102	4,85×10-4	2,20×10-7	1,67		0,71	A21-22
		ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)(nM)
Среднее значение		2,76×105	1,99×104	5,15×10-4	4,28×10-5	1,88	0,29
Лиганд	Чип	ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)	Chi-2	Аппендикс II
VH3/VK3	А11/1	2,54×105	3,10×102	5,59×10-4	2,00×10-7	2,20		0,80	A23-24
VH3/VK3	А11/2	2,76×105	3,80×102	4,54×10-4	2,20×10-7	1,65		0,80	A25-26
		ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)(nM)
Среднее значение		2,65×105	1,56×104	5,07×10-4	7,40×10-5	1,92	0,39
Лиганд	Чип	ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)	Chi-2	Аппендикс II
Химерное	А11/1	7,18×105	1,60×103	1,60×10-3	2,40×10-6	2,23		1,17	A27-29
Химерное	А11/2	7,22×105	3,00×103	1,30×10-3	3,50×10-6	1,79		0,97	А30-31
Химерное	А11/3	7,23×105	2,60×103	1,40×10-3	3,30×10-6	1,94		0,49	A32-33
		ka(1/Ms)	SE(ka)	kd(1/s)	SE(kd)	KD(nM)	SD(KD)(nM)
Среднее значение		7,21×105	2,87×103	1,43×10-4	1,54×10-4	1,99	0,22

[0098] Значения Chi² показывают, насколько хорошо данные ассоциации и диссоциации соответствует предлагаемой модели связывания 1-к-1: чем ниже значение, тем лучше соответствие. Ассоциированное значения SE для констант скоростей представляют неопределенность, связанную с подгонкой данных к описанной модели и не отражают общую неопределенность для истинных кинетических значений. Данные по среднему ответу представляют собой средние кинетические значения и ассоциированные SD для 2 или 3 независимых анализов.

[0099] Согласно средним значениям K_D, приведенным в таблице F-2, антитела могут быть ранжированы по аффинности следующим образом: VH3/VK2>VH3/VK3>химерное>VH2/VK3>VH1/VK3>VH1/VK2>VH2/VK2. % CV ассоциирован со средними кинетическими параметрами в диапазоне от 10-20%, и, таким образом, вполне вероятно, что все антитела имеют практически одинаковую аффинность, и что различия являются исключительно результатом погрешности анализа. В целом, различия в связывании между антителами могут быть связаны с погрешностью анализа, и предполагается, что значения K_D гуманизированных антител не отличаются значимо от таковых для химерного антитела.

[0100] Показано сравнение кинетических значений, определенных с помощью анализа захвата белком А на Biacore T200 для взаимодействия этих антител с тау-412. Оказалось, что химерное антитело имеет профиль связывания, который значимо отличается от профиля гуманизированных антител, несмотря на их сходство по аффинности. График зависимости k_d от k_a показывает относительные кинетические значения взаимодействия тестируемых антител с тау-412, определенные с помощью анализа захвата белком А на Biacore T200. Пунктирные диагонали представляют линии изоаффинности. Следует отметить, что оси отображают различные диапазоны данных с целью улучшения четкости отображения гуманизированных антител на графике.

[0101] На фиг. 5 приведены результаты анализа методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР), определяющего кинетику связывания шести лучших экспрессирующих гуманизированных конструкций с человеческим белком тау. Тестируемое антитело иммобилизуют на чипе ППР, и затем чип омывают потоком человеческого тау с различными концентрациями. Для каждого из вариантов вычисляют скорости ассоциации и диссоциации, а также аффинность на основании измеренных событий связывания. Химерный вариант тоже тестировали.

Пример 3

[0102] На фиг. 6 показано связывание четырех вариантов гуманизированных антител с растворимым человеческим тау в сэндвич варианте ИФА. Методы анализа, которые основаны на пассивной адсорбции, могут потенциально привести к недостоверным результатам связывания. Для определения указанной проблемы был использован метод, основанный на применении растворов для измерения активности связывания вариантов гуманизированных антител. В формате этого анализа антиген (человеческий тау) захватывается моноклональным антителом к человеческому тау, который распознает эпитоп, отличный от эпитопа, распознаваемого HJ8.5. Последующее связывание гуманизированных анти-тау антител с захваченным человеческим тау зависит от концентрации антигена, в то время как контроли IgG4 изотипов вообще не показывают связывание. Этот анализ показывает, что связывание гуманизированных анти-тау антител с человеческим тау специфичен, и что антитела связываются с растворимым человеческим тау.

Пример 4

[0103] На фиг. 7A-7H показано связывание гуманизированных и контрольных антител в тканях мышей дикого типа (отрицательный тканевой контроль), мышей P301S (которые экспрессируют человеческий тау, имеющий мутацию P301S, и у которых развивается ассоциированная с возрастом тау патология), а также людей либо с болезнью Альцгеймера, либо с прогрессирующим надъядерным параличом (ПНП). Целью данного исследования было подтверждение сохранения способности гуманизированных антител связываться с агрегированным тау в ткани по сравнению с химерной формой HJ8.5. На снимках приведены репрезентативные изображения окрашивания мышиного и человеческого мозга с различными вариантами гуманизированного антитела HJ8.5. Тестировали мышей P301S в возрасте 4 и 9 месяца, и обе временные точки показывают наличие патологических агрегатов тау, причем 9 месячные мыши имеют больше патологий тау, чем 4-месячные мыши. В случае окрашивания человеческого мозга, изучали образец ткани мозга, полученный от одного пациента с ПНП, и образец ткани мозга, полученный от одного пациента с БА. На фиг. 7А показано окрашивание химерного HJ8.5 для мышиной ткани и человеческой ткани с БА. На фиг. 7В показано окрашивание для антитела негативного контроля (неспецифический человеческий IgG4). На фиг. 7С-7Н показано окрашивание для шести гуманизированных антител. Все гуманизированные варианты мышиного антитела HJ8.5 связываются с агрегатами тау, обнаруженными в головном мозге мышей P301S, а также агрегатами тау, обнаруженными в тканях головного мозга пациентов с диагнозом либо БА, либо ПНП.

Пример 5

[0104] На фиг. 8 показаны эпитопы HJ8.5 в человеческом тау. Эпитоп картирован с помощью дрожжевого дисплея. Для осуществления этого метода, используя дрожжи, экспрессировали различные пептиды, охватывающие последовательность человеческого тау. Связывание антитела HJ8.5 в дрожжах измеряли в культуре методом иммуннофлуоресценции. Наблюдали связывание в дрожжах, экспрессирующих варианты тау, которые включали первые 34 аминокислоты, при этом связывание отсутствовало, если дрожжи экспрессировали только первые 32 аминокислоты тау. Это служит подтверждением того, что эпитоп находится в пределах первых 34 аминокислот. Кроме этого, HJ8.5 связывается если пептид включает аминокислоты 27-135, но связывание отсутствует, если пептид охватывает аминокислоты 30-135. Это служит подтверждением того, что эпитоп включает аминокислоты, следующие за аминокислотой 27. Исходя из этих данных, эпитоп содержится в пределах последовательности 27-34 человеческого тау (GYTMHQDQ) (SEQ ID NO:10). На Фиг. 8 также показаны последовательности тау макака-резуса и мыши, и красным цветом отмечены аминокислотные изменения относительно человеческого тау.

[0105] На фиг. 9 более подробно показано основанное на пептидах картирование эпитопа у HJ8.5 и C₂N-8E2. Создавали библиотеку линейных пептидов длиной 15 аминокислот, охватывающих всю последовательность человеческого тау (IN4R, 412 аминокислот). Дополнительно также продуцировали двойные аланиновые варианты этих пептидов, у которых аминокислоты 10 и 11 заменяли аланином. Для библиотеки двойных аланиновых пептидов, любые встречающиеся в природе аланины в положении 10 или 11 заменяли на глицин. Все пептиды наносили на пептидную матрицу, затем вносили образцы HJ8.5 или C₂N-8E12, и измеряли связывание. Эпитоп(ы) связывания тау обоих антител были достоверно картированы с помощью этих пептидных матриц. Эпитоп связывания для C₂N-8E12 представляет собой ₂₅DQGGYT₃₀ (SEQ ID NO: 9) и совпадает с эпитопом мышиного родительского HJ8.5. Связывание HJ8.5 и C₂N-8E12 с пептидами тау сильно уменьшается, когда аминокислоты D, Q, Y или Т в эпитопе заменены аланином, что говорит о их ключевой роли в связывании антитела. Тем не менее, когда два центральных глицина в эпитопе были заменены аланином, связывание антител с пептидами тау не уменьшилось существенным образом (PEP 2875811). Вероятно, этот факт не свидетельствует о того, что эти аминокислоты не являются важными для связывания, скорее это связано с консервативной природой замещений между аланином и глицином. Эпитоп картировали, используя эти подробно описанные методы, которые немного отличаются от картирования с помощью дрожжевого дисплея (фиг. 8). Это отличие связано с отличием в анализах связывания: в системе дрожжевого дисплея используются пептиды более крупного размера. Метод использования матрицы пептидов длиной 15 аминокислот по своим результатам превосходит метод дрожжевого дисплея.

Пример 6

[0106] На фиг. 10 показаны результаты связывания различных антител к человеческому тау либо с человеческим тау, либо с тау макака-резуса. Тестировали мышиные антитела HJ8.5 и HJ8.7 к человеческому тау, наряду с гуманизированным вариантом VH1/VK2 (также упоминаемым как C₂N-8E12). На Фиг.8 показано, что заявленная последовательность эпитопа связывания GYTM(H/L)QDQ (SEQ ID NO:57) отличается у человеческого тау и тау макака-резуса одной аминокислотой в положении 32. На Фиг. 8 показано, что заявленная последовательность эпитопа связывания DQ(G/E)GYT (SEQ ID NO:58) отличается у человеческого тау и тау макака-резуса одной аминокислотой в положении 27. Для определения, влияют ли эти различия в аминокислотах между двумя видами тау на связывающую способность антител HJ8.5/C₂N-8E12, проводили следующий эксперимент. Связывание C₂N-8E12, HJ8.5 (мышиный предшественник C₂N-8E12) и HJ8.7 (мышиное антитело к человеческому тау, которое связывается с эпитопом тау, в котором аминокислотная последовательность человека и макака-резуса идентичны на 100%) измеряли для человеческого тау и тау макака-резуса путем нанесения на 96 луночные планшеты ELISA либо человеческого тау, либо тау макака-резуса при различных концентрациях. Результаты показали, что C₂N-8E12 и HJ8.5 не связываются с тау макака-резуса, но показывают положительное связывание с человеческим тау. Как ожидалось, HJ8.7 связывается как с человеческим тау, так и с тау макака-резуса.

Пример 7

[0107] На фиг. 11 показано связывание гуманизированного анти-тау антитела с тау в СМЖ, полученной от людей с различными тауопатиями. Оценивали связывание C₂N-8E12 с тау в образцах СМЖ, полученных от пациентов с диагнозом различных тауопатий, а также от пациентов того же возраста и молодых/здоровых пациентов, использованных в качестве контрля. Для демонстрации связывания C₂N-8E12 с тау в человеческой СМЖ, полученной от пациентов с БА, КБД, ЛВД или ПНП, а также от субъектов такого же возраста и молодых/взрослых субъектов, использованных в качестве контроля, применяли метод сэндвич-ИФА. C₂N-8E12 использовали в качестве антитела покрытия для захвата тау в образцах СМЖ. Биотинилированные мышиные моноклональные антитела HJ8.7 к тау использовали в качестве антитела-маркера. Лунки покрывали контрольным человеческим IgG4, выполняющим в эксперименте роль отрицательного контроля. Наблюдаемые сигналы из лунок с C₂N-8E12 сильно отличались от сигналов из лунок, покрытых контрольным IgG4, что говорит о специфическом связывании C₂N-8E12 с тау в образцах человеческой СМЖ. Используя стандартную кривую (рекомбинантный тау), можно получить количественную информацию о концентрации тау в этих образцах СМЖ.

Пример 8

[0108] Данное исследование представляет собой рандомизированное, двойное слепое исследование фазы 1 с использованием плацебо в качестве контроля и однократной нарастающей дозы (SAD), предназначенное для проведения в десяти (10) центрах. Оно разработано для оценки безопасности, переносимости, иммуногенности и фармакокинетики (ФК) введения однократной дозы C₂N-8E12, а также для определения МПД для использования в будущих повторных исследованиях.

[0109] Основная цель данного исследования заключается в определении безопасности, переносимости, иммуногенности и максимально переносимой дозы (МПД) однократной дозы C₂N-8E12 для субъектов с ПНП. Оценка безопасности включает физическое и неврологическое обследование, лабораторные исследования по клинической безопасности и в анализе иммуногенности, побочных эффектов, жизненно важных признаков и сопутствующих лекарственных препаратов.

[0110] Второстепенной целью является определение: системных фармакокинетических параметров при приеме однократной дозы, которые включают: максимальную концентрацию в плазме после единичной инфузии; площадь под кривой (AUC) после единичной инфузии; время достижения максимальной концентрации после инфузии; период полувыведения C₂N-8E12 в конечной фазе; распределение C₂N-8E12 в спинномозговой жидкости (СМЖ); и взаимодействие с биологической мишенью путем измерения уровней растворимого тау в крови и СМЖ, а также оценки наличия комплексов C₂N-8E12-тау.

[0111] Данное исследование предназначено для регистрации 32 субъектов с ПНП (24 в терапевтической группе и 8 в группе плацебо). Субъекты распределяются по 8 блокам по 4 пациента в каждом, где в каждом блоке случайным образом отбирают одного пациента, которому вводится плацебо, а у 3 оценивается МПД. В случае проявления ДЛТ (дозолимитирующей токсичности) могут быть привлечены дополнительные субъекты. Однако в процессе повышения дозы ни одна из доз не должна быть пропущена.

[0112] Метод непрерывной переоценки (continual reassessment method, CRM) для повышения дозы используется в том виде, как описано в разделе статистической модели. Для определения вероятности проявления ДЛТ используется логистическая модель.

[0113] C₂N-8E12 доставляется в клинику в виде замороженной жидкости в отдельных бутылях при номинальной концентрации 20 мг/мл. Каждая бутыль содержит 300 мг C₂N-8E12 и должна храниться в замороженном состоянии при температуре от -70°C до -80°C.

[0114] Пациенты подвергаются отбору для оценки соответствия критериям включения и исключения. Отбор также включает анализ крови, СМЖ и МРТ. В день введения дозы (день 0) внутривенно вводится однократная доза C₂N-8E12, и в течение 24 часов после введения дозы пациенты находятся под тщательным наблюдением в медицинском учреждении, которое включает анализ образцов крови на безопасность и оценку ФК параметров. В течение следующих 3-х дней, а также одной и двух недель после инфузии, проводится дополнительное клиническое обследование и отбор образцов крови. Через 4 дня после инфузии для дополнительной оценки безопасности выполняется МРТ и осуществляется отбор образцов СМЖ. Обследование пациентов продолжается через каждые 28 дней, в течение не менее двух месяцев со дня введения дозы (например, до дня 56). После чего проводятся ежемесячные измерения до появления любого из следующих событий: (i) C₂N-8E12 больше не обнаруживается в крови; (ii) спонсор определяет время завершения исследования; (iii) субъект принимает решение о досрочном прекращении участия в исследовании.

[0115] Цель исследования фазы 1 заключается в определении МПД согласно оценке безопасности, включая клинические лабораторные тесты, обследование физического и неврологического состояния, а также проявление неблагоприятных событий, для определения рекомендуемого диапазона доз для оценки в последующем исследовании на фазе 2/MAD. Случайное распределение субъектов и включение группы, получающей плацебо, позволяет избежать ошибки случайной выборки и увеличивает вероятность того, что известные и неизвестные факторы риска будут распределены между терапевтическими группами равномерно.

[0116] Комитет по мониторингу безопасности данных (КМБД) рассматривает данные по безопасности о мере их поступления. Комитет по мониторингу безопасности может состоять как минимум из двух независимых врачей, одного биостатиста, одного врача с опытом работы с ПНП и одного представителя от спонсора, не имеющего права голоса. Если у какого-либо принимающего участие в исследованиях субъекта проявится СНЯ (серьезное нежелательное явление), изучаются все доступные данные по безопасности по данному субъекту с целью определения, соответствует ли это событие определению ДЛТ, и была ли установлена МПД. Если МПД не была установлена, и пациент продолжает участвовать в исследовании, КМБД предоставляет рекомендации спонсору о наличии необходимости в дополнительных действиях или необходимости изменения протокола для обеспечения в дальнейшем безопасности пациентов. Спонсор принимает окончательное решение о любых изменениях или о преждевременном окончании исследования.

[0117] Дозолимитирующая токсичность определяется следующим образом: (i) любое нежелательное явление (НЯ) степени 3 или выше согласно критерию v2 общей токсичности в ревматологии, относительно которой имеется обоснованная вероятность того, что это событие вызвано C₂N-8E12; (ii) любое НЯ степени 2 при системно-органном классе нарушений нервной системы и психики согласно критерию общей токсичности национального института рака США для НЯ v4.0. (CTCAE), которое считается клинически значимым, и относительно которого имеется обоснованная вероятность того, что это событие вызвано C₂N-8E12; или (iii) любая токсичность, связанная с инфузией (например, аллергические реакции/гиперчувствительность), возникшая в процессе инфузии C₂N-8EI2 или в течение 24 часов после завершения инфузии, которую нельзя оперативно устранить путем уменьшения скорости инфузии и/или с помощью поддерживающей терапии.

[0118] Повышение дозы: Распределение субъектов по когортам вводимой дозы осуществляется согласно следующим правилам: (1) в каждом блоке из 4 пациентов одному пациенту назначают плацебо; (2) для по меньшей мере 3 пациентов требуется полная информация о токсичности для уровня дозы перед ее повышением до более высокого уровня; (3) максимальное увеличение при повышении из одной когорты в следующую составляет 1 уровень дозы; и (4) по меньшей мере 12 субъектов (3 блока) должны получать дозу на уровне дозы, равной МПД.

[0119] В каждой когорте из 4 пациентов, пациентам последовательно вводят дозы с минимальным интервалом по меньшей мере в два дня между введениями дозы следующим субъектам с тем, чтобы обеспечить дополнительную меру безопасности.

[0120] Первой когорте присваивается di. Статистическая модель обновляется после получения полной информации о токсичности по каждой когорте. Согласно правилу, одна дополнительная когорта может быть введена до получения полной информации по всем субъектам самой последней когорты. Неполные данные по токсичности допускаются не более чем для 3-х пациентов до регистрации и рандомизации следующей когорты.

[0121] Каждой последующей когорте назначается доза, которая оценивается на возможность ее отнесения к МПД в соответствии с приведенным выше определением. В случае медленного приращения модель может быть обновлена, после регистрации каждого пациента и каждого последующего пациента, получившего текущую оцененную МПД.

[0122] Исследуемая популяция: Это исследование проводится с участием мужчин и женщин с прогрессирующим надъядерным параличом (ПНП) в возрасте от 50 до 85 лет.

[0123] Критерии включения: Для включения в исследование каждый субъект должен проявить желание в участии и быть способным на предоставление согласия, принятого на основе полученной информации. До начала протокола лечения оно будет служить подтверждением того, что каждый субъект способен дать согласие с протоколом лечения. Субъекты приглашаются для участия в исследовании, и после подписания формы о согласии, принятом на основе полученной информации, проводится процедура отбора. Если субъекты не отвечают критериям включения или отвечают любому из критериев исключения, они не зачисляются для отборочной оценки или в график лечения.

[0124] Каждый субъект должен отвечать следующим критериям для зачисления в качестве участника в данном исследовании: мужчина или женщина; возраст от 50 до 85 лет; соответствие возможным или вероятным критериям NINDS-SPSP, модифицированным для NNIPPS и AL-l08-231 клинических испытаний, в том числе: (d) надъядерный паралич взора или снижение скорости саккад, (ii) неустойчивая походка или падения в течение первых 3 лет проявления симптомов; МРТ головного мозга при скрининге соответствует ПНП (<4 микрогеморрагий, отсутствие обширных инсультов или тяжелого заболевания белого вещества мозга); баллы по рейтинговой шкале ПНП от 20 до 50; способность, будучи в исходном состоянии, предоставить согласие, принятое на основе полученной информации, на участие либо, в случае неспособности дать согласие, принятое на основе полученной информации, возможность получения подтверждения на участке и наличие авторизованного медицинского представителя, который может дать такое согласие; наличие партнера по исследованию, который смотрит за пациентом по меньшей мере 5 часов в неделю, который может сопровождать пациента во время посещений и согласен на участие в исследовании; возможно получение других сопутствующих не-биологических методов лечения, но доза должна быть стабильной в течение по меньшей мере 30 дней до регистрации; в состоянии сделать 5 шагов с предоставлением минимальной помощи (стабилизация одной руки или использование трости/ходунков); стабильный прием лекарственных препаратов при паркинсонизме по меньшей мере в течение 2 месяцев до отбора, включая леводоп, агонисты дофамина, разагалин, ингибиторы КОМТ, амантадин, мемантин или ингибиторы холинэстеразы; согласие на проведение максимум 3-х поясничных пункций в течение 4-18 месяцев, 6 поясничных пункций, если субъект участвует в исследовании в обеих фазах: 1/SAD и 2/MAD; получение от субъекта подписанного и датированного письменного согласия на основе полученной информации; согласие на использование методов контрацепции, указанных в протоколе (см. ниже).

[0125] Субъекты, которые соответствуют любому из следующих критериев исключаются из исследования: признаки прогрессирующего неврологического расстройства, которые лучше отвечает критериям для типов неврологических расстройств, отличных от ПНП, в том числе: (а) отвечают критериям вероятной болезни Альцгеймера или (b) отвечают диагностическим показателям деменции при болезни Паркинсона с тельцами Леви, множественной системной атрофии (МСА) или амиотрофического бокового склероза (АБС); любые злокачественные новообразования (кроме неметастатической базально-клеточной карциномы кожи) в течение 5 лет скрининга; клинически значимая почечная или печеночная дисфункция при скрининге согласно профессиональной оценке исследователя; клинически значимое нарушение сердечно-сосудистой системы в течение трех месяцев до начала исследования, согласно профессиональной оценке исследователя; клинически значимые аномальные результаты гематологических или химических лабораторных тестов во время скрининга согласно профессиональной оценке исследователя; прохождение любой предшествующей терапии моноклональными антителами по любой причине в течение последних 90 дней или введение какого-либо другого исследуемого агента в предыдущие 30 дней или 5 периодов полураспада (в зависимости от того, что длиннее). Предварительное введение C₂N-8E12 не относится к этим критериям исключения и, следовательно, не влияет на отклонение субъекта от участия в исследовании на фазе 2/MAD; получение в настоящий момент любой другой биологической или иммуномодулирующей терапии; продолжительность заболевания более 5 лет с момента появления симптомов; объем среднего мозга > 8600 мм³ на снимке МРТ; проживание в учреждениях с квалифицированным медицинским уходом или уходом за слабоумными пациентами; наличие четких показателей заболевания двигательных нейронов при обследовании, в соответствии с БАС патологией (описано у носителей C90RF72 с наличием КБС); диагностика других значимых неродственных неврологических или психических расстройств, которые можно отнести к когнитивным нарушениям (например, активная форма эпилепсии, инсульт, сосудистая деменция), согласно профессиональной оценке исследователя; запущенная глубокая депрессия при начальной оценке согласно клинической оценке и результатам в GDS; случаи других глубоких психических расстройств; любые ранее имевшиеся случаи суицидальных попыток; тяжелые когнитивные нарушения, оцененные по шкале MMSE (<17), которые, по мнению исследователя, исключает сбор результатов измерения; неспособность участвовать в протоколе оценки; значимые, аномальные значения, полученные в целом из образцов крови, взятых во время отбора, которые будут представлять угрозу безопасности или мешать соответствующей интерпретации данных исследования; текущая или недавно имевшая место (в течение четырех недель до отбора) клинически значимая бактериальная, грибковая или микобактериальная инфекция; неспособность переносить МРТ сканирование при скрининге или любое другое противопоказание к МРТ; любое противопоказание или неспособность переносить спинномозговую пункцию при отборе, в том числе введения антикоагулянтных препаратов, таких как варфарин. Ежедневное введение 81 мг аспирина или аналогичных антикоагулянтов может быть разрешено при условии, что доза является стабильной в течение 30 дней до скрининга; субъекты, которые, по мнению исследователя, не могут или вряд ли смогут соблюдать график дозирования или оценку исследования; участие в другом интервенционном клиническом испытании в течение 3-х месяцев отбора; лечение с помощью другого исследуемого препарата в течение 30 дней отбора; любые существовавшие ранее QTcF продолжительностью более 450 мс; субъект является работником или членом семьи спонсора или сотрудником места проведения исследования или членом его семьи.

[0126] Субъекты должны дать согласие на применение (и/или применение их партнером) приемлемых методов контрацепции, начиная с первоначального визита на протяжении всего исследования и в течение 56 дней после последней дозы исследуемого препарата в последний период лечения. Приемлемые методы контрацепции перечислены ниже.

[0127] Исследуемое лекарственное средство: На фазе 1/SAD исследования используется C₂N-8E12 из DP лота № 1018775 - материал из банка клеток для исследования (RCB), используемый в настоящее время под индексом 119404 для расширенного доступа (Expanded Access IND). Оно находится в 25 мМ ацетатном буфере (рН 5,5) с концентрацией 20 мг/мл. Плацебо: Плацебо готовится аналогично C₂N-8E12, но не содержит изучаемое лекарственное средство в качестве активного вещества.

[0128] Обоснование дозы: Максимальную рекомендуемую начальную дозу (МРСД) рассчитывают согласно руководству управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами (FDA) для промышленной "Оценки безопасной стартовой дозы в клинических испытаниях для терапии у взрослых здоровых добровольцев". Согласно руководству, для исследуемых терапевтических белков с молекулярной массой > 100000 дальтон, которые вводятся внутривенно, МРСД следует оценивать путем нормализации по всем видам, а не путем масштабирования площади поверхности тела. Исходя из уровня, при котором не наблюдается эффект (NOEL), равного 250 мг/кг в токсикологическом исследовании на мышах, доза до 25 мг/кг ограничена стандартным коэффициентом безопасности 10.

[0129] Стартовая доза для исследования на фазе 1/SAD составляет 2,5 мг/кг для в/в введения. Эта стартовая доза в 10 раз ниже, чем максимально разрешенная стартовая доза согласно 4-недельному токсикологическому исследованию на мышах, и в 6 раз ниже, чем текущая максимальная доза (15 мг/кг), вводимая согласно протоколу лечения человека в режиме расширенного доступа и применения препарата из соображений гуманности касательно C₂N-8E12 (см. брошюру исследователя).

[0130] Исходя из предварительных ФК параметров плазмы, полученных в единичном исследовании пациентов, можно оценить процент тау в СМЖ, который связывается с C₂N-8E12 через разные промежутки время после введения 2,5 мг/кг дозы C₂N-8EI2. Для проведения такого вычисления предполагается, что концентрация гуманизированных антител в СМЖ составляет 0,1% от их концентрации в плазме крови, и что концентрация тау в СМЖ составляет 500 пг/мл. Исходя из этого предположения, доза, равная 2,5 мг/кг будет давать в первый месяц концентрацию C₂N-8E12 в СМЖ в 3-40 раз выше молярной концентрации тау в СМЖ. Учитывая K_D для C₂N8E12, при дозе, равной 2,5 мг/кг, 3-26% тау в СМЖ будет связано с антителом. Аналогичное моделирование осуществляли на основе ФК данных, полученных при введении пациентам самой высокой дозы на сегодняшний день (15 мг/кг) и оценили, что средний уровень связывания тау в течение 28 дней составляет примерно 50% (максимальное связывание - 72%, а минимальное - 40%). По всей вероятности, в головном мозге присутствует избыточное количество внеклеточного тау, не доступного через СМЖ компартмент, но с которым антитело способно связываться. Следовательно, повышение дозы осуществляют до 25 мг/кг для оценки безопасности дозы, которая может обеспечить значимое взаимодействие с мишенью в головном мозге.

[0131] Если не одобрено исследователем, в течение периода лечения субъект не должен получать: никакое другое биологическое или иммуномодулирующее лечение; никакой другой проходящий клиническое испытание агент; варфарин; любой антикоагулянт (кроме ежедневного приема 81 мг аспирина) в состоянии, при котором временное прекращение лечения до отбора проб СМЖ может оказаться опасным для здоровья.

[0132] Согласие на основе полученной информации: После получения согласия на основе полученной информации каждый субъект проходит отбор с целью подтверждения его соответствия критериям включения и отсутствия каких-либо противопоказаний для получения лечения в соответствии с этим протоколом. В частности, каждый субъект оценивается при отборе путем проведения клинического и неврологического обследования для подтверждения диагноза. Краткий отбор по когнитивным способностям проводится с помощью шкалы бальной оценки симптомов ПНП и шкалы депрессии путем опроса для получения полного медицинского и лекарственного анамнеза. Если субъект удовлетворяет всем критериям включения, при этом показания, соответствующие критериям исключения, отсутствуют, проводится дальнейшее исследование. Визит по отбору назначается за 28-7 дней до начального/день 0 визита.

[0133] Оценка фармакокинетических параметров: Для анализа ФК параметров отбирают образцы в различные моменты времени, как указано ниже в таблице 3.

Таблица 3
Перед введением	15 мин (#)	3 часа	6 часов	12 часов	24 сача	48 часов	168 часов	336 часов	28 дней	После 28 дней
Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х	@

(*) В случае досрочного прекращения, окончательный образец крови получают во время визита по досрочному прекращению для окончательной оценки ФК параметров;

(#) в пределах 15 минут после окончания инфузии;

(@) после 28-го дня образцы для анализа ФК отбирают каждые 28 дней до появления любого из следующих событий: (i) прекращение исследования; (ii) отсутствие детектируемых уровней C₂N-8EI2 в крови.

[0134] Оценка нежелательных реакций (НР): С целью контроля НЯ проводится следующая оценка: жизненно важных показателей (артериальное давление, пульс/частота сердечных сокращений, температура, частота дыхания, SPO2); полное неврологическое обследование, в том числе оценка когнитивных показателей (тесты на оценку психического статуса); лабораторные тесты: (1) гематологический анализ крови: общий анализ крови (CBC) с подсчетом форменных элементов, гематокрита и гемоглобина (Hb), количество тромбоцитов; (2) биохимический анализ крови: электролиты сыворотки крови, глюкоза, мочевая кислота, азот мочевины крови (АМК), креатинин, общий белок, альбумин, билирубин (общий, прямой и непрямой), щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа (ЛДГ), ферменты печени (АСТ, АЛТ и ГГТ), железо, анализ холестерина, КФК, амилаза, липаза и; (3) анализ параметров коагуляции: протромбиновое время (ПВ), МНИ и частичное тромбопластиновое время (ЧТВ); анализ мочи, включая измерение содержания Hb, WBC и белка; ЭКГ - непрерывный мониторинг или ЭКГ в 12 отведениях; получение МРТ изображение мозга, в том числе в методом инверсия-восстановление с ослаблением сигнала от жидкости (FLAIR); отбор образцов СМЖ с подсчетом количества клеток крови (WBC и RBC) и измерения уровня общего белка и глюкозы.

[0135] Определение C₂N-8E12 в человеческой плазме и СМЖ: Для измерения концентрации C₂N-8E12 в плазме крови и СМЖ были разработаны сэндвич-ИФА методы анализа. Эти тесты проверяли на достоверность на различных планшетах в лабораториях Чарльз Ривер (Charles River) (см. таблицу 4).

Таблица 4
Исследование CRL #	Название исследования
20056682 Завершено	Оценка достоверности способа иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA (энзим-связанного иммуносорбентного анализа)) для определения С2N-8E12 в человеческой плазме (K2ЭДТА)
20057088 Завершено	Оценка достоверности способа иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA (энзим-связанного иммуносорбентного анализа)) для определения С2N-8E12 в человеческой спинномозговой жидкости

[0136] Определение анти-C₂N-8E12 антител в человеческой плазме крови: Образцы крови отбирают для оценки развития антител к лекарственному препарату (ADA) до введения стартовой дозы и на 14-й и 28-й дни после введения препарата. Финальное измерение выполняют при завершении. Для измерения наличия антител против C₂N-8E12 в плазме (ADA) разработали сэндвич-ИФА, основанный на ЭХЛ. Этот анализ для обнаружения реакции на ADA в человеческой плазме крови проверяли на достоверность в лабораториях Чарльз Ривер (Charles River) (таблица 5).

Таблица 5
Исследование CRL #	Название исследования
20056686 Завершено	Оценка достоверности количественного электрохемилюминисцентного анализа (ЭХЛ) для обнаружения анти-С2N-8E12 антител в человеческой плазме (K2ЭДТА)

[0137] Клинический и функциональный анализ включают колумбийскую шкалу оценки тяжести суицида (Colombia-Suicide Severity Rating Scale): В качестве параметра безопасности, используют колумбийскую шкалу оценки тяжести суицида (C-SSRS) для выявления суицидальных наклонностей (Posner et al., 2011). Гериатрическая шкала депрессии: По аналогии с C-SSRS, гериатрическую шкалу депрессии (GDS) используют для оценки общего настроения в ходе исследования. Гериатрическая шкала депрессии (GDS) является анализом на основе анкеты-самоотчета из 30 пунктов, используемым для выявления депрессии у пожилых людей (Yesavage et al., 1983). Шкала бальной оценки симптомов ПНП: Шкалу бальной оценки симптомов ПНП (PSPRS) используют при отборе на включение, а также вначале и в конце исследования для оценки изменений по шкале с течением времени (Golbe and Ohman-Strickland, 2007). Общее клиническое впечатление: Шкалы оценки изменения общего клинического впечатления (CGIC) и тяжести заболевания (CGI) используют для оценки тяжести симптомов. Шкала повседневной активности Шваба и Ингланда: Шкалу повседневной активности Шваба и Ингланда (SEADL) используют в качестве средства оценки способности субъектов выполнять повседневную работу (Schwab and England 1969). Клиническая оценка деменции с помощью суммы боксированных баллов при лобно-височной лобарной дегенерации: Клиническая оценка деменции с помощью суммы боксированных баллов при лобно-височной лобарной дегенерации (CDR-SB-FTLD) представляет собой версию теста CDR-SB на оценку когнитивных способностей, которая включает оценку поведения, манер, личности и языка (Knopman et al., 2008). Краткое исследование психического состояния: Краткое исследование психического состояния (MMSE) представляет собой объективный опрос из 30 пунктов для измерения когнитивных нарушений (Folstein, Folstein, and McHugh, 1975).

[0138] Спинномозговая жидкость: СМЖ отбирается из промежутка L3-4 путем люмбальной пункции. Если отбор образца СМЖ оказался неуспешным, то по усмотрению местного медперсонала можно провести люмбальную пункцию под контролем КТ/флюороскопии согласно местному протоколу. Данные лабораторного анализа на безопасность на основе образцов СМЖ анализируют на месте на соответствующей клинической площадке после каждой люмбальной пункции/сбора СМЖ. Эти меры включают: подсчет клеток (WBC и RBC), определение содержания общего белка и глюкозы. Другие измерения параметров СМЖ (например, концентрация C2N-8E12, взаимодействие с мишенью и другие поисковые биомаркеры) анализируют в подходящим образом оснащенной лаборатории.

[0139] Получение изображения: В начале исследования субъект также подвергается процедуре МРТ с получением структурного, FLAIR, диффузно-взвешенного по чувствительности изображения. Анализ изображения, полученного после введения препарата осуществляется согласно графику мероприятий.

[0140] Исследовательский фармакогеномный анализ: Образец крови отбирается для выделения ДНК в начале исследования. Все индивидуумы подвергаются расширенному анализу последовательности MAPT-гаплотипа для определения статуса носителя H1(A-D) и H2. ДНК выделяют из образцов и вводят в определенное фармакогеномное ядро для данного исследования.

[0141] Субъекты участвуют в данном исследовании до появления любого из следующих событий: (i) они завершили свое участие и прошли весь график мероприятий; (ii) они или исследователь решил что их участие должно быть завершено; или (III) у принятого субъекта наблюдается любая ДЛТ или любой СНЯ, относительно которого исследователь принимает решение о прекращении дальнейшего участия в этом исследовании и исключает из участия в исследовании на следующей 2/MAD фазе. Кроме того, по усмотрению исследователя, субъекты, которые перестают удовлетворять любому критерию включения или соответствуют одному или нескольким критериям исключения в ходе исследования, могут быть определены как неподходящие для продолжения участия в исследовании или в последующем участии в исследовании на 2/MAD фазе.

1. Выделенное моноклональное анти-тау антитело, содержащее

легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и

тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 антитело.

3. Антитело по п.2, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированный IgG4, содержащий мутацию S241P, стабилизирующую шарнирную область.

4. Выделенное моноклональное анти-тау антитело, содержащее:

легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и

тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.