Способы производства стр-модифицированных полипептидов гормона роста длительного действия

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному гормону роста человека (hGH), и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет получить гликозилированную форму соматотропина (hGH), модифицированного CTP-удлиняющими сегментами и обладающего увеличенным периодом полувыведения, а также повышенной стабильностью в сравнении с известными аналогами. Изобретение может быть использовано в терапии заболеваний, ассоциированных с дефицитом гормона роста или нарушением его секреции у субъекта. 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 24 ил., 3 пр., 3 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[001] Настоящее изобретение относится к способу производства рекомбинантного гормона роста человека (hGH), модифицированного CTP- удлиняющими сегментами, в системе культивирования клеток млекопитающих.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[002] Гормон роста (соматотропин) находится в клиническом применении более 50 лет, главным образом, для лечения дефицита гормона роста у детей, который приводит к карликовости. В 1985 году гормон роста человека (hGH) из рекомбинантного ДНК-источника заменил hGH из трупного гипофиза, который был единственным, доступным до того времени, источником материала. Замещающая терапия hGH была стандартом ухода за десятками тысяч пациентов и доказала свою безопасность и эффективность. Необходимость поддержания уровней содержания hGH в крови в эффективном терапевтическом диапазоне требует подкожных или внутримышечных инъекций, которые выполняться ежедневно или день через день. Большая часть коммерческого hGH производится в бактериальных системах.

[003] Гормон роста (GH) представляет собой 191-аминокислотный белок гипофиза, который стимулирует печеночную выработку и высвобождение инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) в систему кровообращения. Большинство препаратов GH, доступных в настоящее время, требуют ежедневного введения; следовательно, соблюдение может быть проблемой, особенно у подростков. При дефиците GH (GHD) у взрослого, ежедневное введение и сопутствующие побочные эффекты (например, дискомфорт в месте инъекции, преходящий отек и артралгия) ограничивают терапевтическую полезность существующих составов. Длительно действующая форма GH имеет потенциал для того, чтобы уменьшить дискомфорт, требуя меньшее количество инъекций и, возможно, минимизируя неблагоприятные события, связанные с подъемами и спадами концентрации в плазме, что возникают при ежедневной инъекции.

[004] Способы, раскрытые в данном документе, включают производство длительно действующего hGH (MOD-4023; Фиг. 1), который устраняет необходимость в многочисленных инъекциях, что в данное время необходимы для лечения GHD. Эта технология основана на использовании природного пептида, C-концевого пептида (CTP) бета-цепи гонадотропина хориона человека (hCG), что обеспечивает hCG требуемой долговечностью для поддержания беременности (начальный T_1/2 ~10 ч, предельный T_1/2 ~37 часов). CTP имеет 28 аминокислот и от четырех до шести O-связанных углеводных цепей, которые все связаны с остатком серина. Бета-цепь лютеинизирующего гормона (LH), гормона фертильности, который вызывает овуляцию, почти идентична hCG, но не содержит CTP. В результате LH имеет значительно более короткий период полувыведения из крови (начальный T_1/2 ~1 ч, предельный T_1/2 ~10 ч).

[005] MOD-4023 представляет собой молекулу hGH, слитую с тремя копиями CTP; одна находится на N-конце и две на С-конце (CTP-hGH-CTP-CTP, как указано в SEQ ID NO: 7) (Фиг. 1). MOD-4023 представляет собой одноцепочечный белок из 275 аминокислот с 12-18 O-связанными углеводами. Как показано на моделях животных (увеличение массы крыс с гипофизэктомией), MOD-4023 иметь потенциал к введению от одного раза в неделю до одного раза в две недели с аналогичной для ежедневных инъекций hGH клинической эффективностью.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[006] В одном аспекте, в данном документе раскрыт способ изготовления полипептида гормона роста человека (hGH), модифицированного карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека, включающий стадии в которых: а) стабильно трансфицируют заданное количество клеток с помощью вектора экспрессии, содержащего кодирующую часть, что кодирует указанный CTP-модифицированный гормон роста человека, причем указанная трансфицированная клетка экспрессирует и секретирует указанный CTP-модифицированный hGH; б) получают клоны клеток, которые сверхэкспрессируют упомянутый CTP-модифицированный hGH; в) увеличивают количество указанных клонов в растворе до заданной величины; г) собирают указанный раствор, содержащий указанные клоны; д) фильтруют указанный собранный раствор, содержащий указанные клоны, для получения отфильтрованного собранного раствора; и е) очищают указанный отфильтрованный собранный раствор для получения очищенного белкового раствора, имеющего желаемую концентрацию CTP-модифицированного hGH, тем самым продуцируя полипептид гормона роста человека (hGH), модифицированный карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека, при этом аминокислотная последовательность указанного CTP-модифицированного hGH представлена в SEQ ID NO: 7. В связанном аспекте, указанный изготовленный CTP-модифицированный hGH сильно гликозилирован. В связанном аспекте, указанный изготовленный CTP-модифицированный hGH сильно сиалилирован. В другом связанном аспекте, шаблон гликозилирования указанного изготовленного CTP-модифицированного hGH включает гликозилирование по меньшей мере четырех О-связанных сайтов для каждого CTP.

[007] В одном аспекте, в данном документе раскрыт полипептид гормона роста человека (hGH), модифицированный карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека, изготовленный способами, описанными в данном документе. В связанном аспекте, гликозилирование CTP-модифицированного hGH включает более чем четыре О-связанных гликанов для каждого CTP. В связанном аспекте, гликозилирование включает по меньшей мере 4-6 O-гликанов для каждой единицы CTP.

[008] Другие особенности и преимущества станут очевидными из следующих подробных примеров и фигур. Следует, однако, понимать, что подробное описание и конкретные примеры, наряду с указанием вариантов реализации способа изготовления и, следовательно, конечного продукта, приводятся только для иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах сущности и объема способов и продуктов, раскрытых в данном документе, станут очевидными для специалистов в данной области техники исходя из данного подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[009] Объект изобретения, рассматриваемый как рекомбинантный длительно действующий полипептид гормона роста человека (hGH), модифицированный карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека (CTP-модифицированный hGH), и способы его изготовления, конкретно указаны и отчетливо заявлены в заключительной части спецификации. Тем не менее, CTP-модифицированный hGH и способы его изготовления, как в отношении организации, так и в отношении способа эксплуатации, вместе с их объектами, особенностями и преимуществами, могут быть лучше поняты через ссылку на следующее подробное описание при чтении с прилагаемыми графическими материалами, на которых:

[010] Фиг. 1. Представляет схему, иллюстрирующую MOD-4023 (CTP-hGH-CTP-CTP).

[011] Фиг. 2. Показывает карту плазмиды pCI-dhfr MOD-4023.

[012] Фиг. 3. Показывает восходящую блок-схему процесса производства CTP-модифицированных полипептидов, например MOD-4023.

[013] Фиг. 4. Представляет блок-схему процесса очистки CTP-модифицированных полипептидов, например MOD-4023.

[014] Фиг. 5. Представляет обзор блок-схемы процесса производства лекарственного препарата (DP) MOD-4023.

[015] Фиг. 6. Представляет окрашенный кумасси SDS-PAGE, демонстрирующий очистку высокогликозилированных форм MOD-4023 с помощью первой колонки ионообменной хроматографии (ИОХ). Полоса (1) собраний тотальный белок, этап 8 на Фиг. 3; полоса (2) ультрафильтрация/диафильтрация, этап 1 на Фиг. 4 (УФДФ1) концентрированный и диафильтрованный тотальный белок; полоса (3) прошедший через ИОХ раствор, этап 3 на Фиг. 4; полоса (4) промывочный материал ИОХ, этап 3 на Фиг. 4; и полоса (5) ИОХ-смыв, этап 3 на Фиг. 4.

[016] Фиг. 7. Представляет данные, показывающие устойчивый O-гликановый состав MOD-4023 из разных партий. Молярное содержание O-гликана на моль MOD-4023 было определено для разных партий лекарственного вещества MOD-4023 (DS) и лекарственного продукта (DP).

[017] Фиг. 8. Представляет периодическое сравнение партий отдельных О-гликозилированных пептидов на основе масс-спектрометрии (МС). Аннотации столбцов представляют собой аминокислотные последовательности с «O» в виде аббревиатуры для O-связанного гликана. MС-ответ первого пептида был использован для нормализации данных и принят за 100%.

[018] Фиг. 9. Представляет профиль MOD-4023, полученный с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ). Пик 4 соответствует основному пику MOD-4023. Также присутствуют четыре минорных родственных формы (пики 1, 2, 3 и 5).

[019] Фиг. 10. Представляет профиль MOD-4023, полученный с помощью эксклюзионной высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ЭК-ВЭЖХ). Пик 3 соответствует мономерам MOD-4023. Пики 1 и 2 соответствуют димерам и полимерам MOD-4023, соответственно.

[020] Фиг. 11. Представляет сравнение эталонного стандарта MOD-4023 SR-929SI.1 (верхний профиль) с MOD-4023 I15-PP (образец УФДФ1) (нижний профиль), как проанализировано с помощью ОФ-ВЭЖХ при 220 нм. Пик 1 соответствует гликозилированной форме MOD-4023, а пик 2 соответствует негликозилированной форме.

[021] Фиг. 12. Представляет сравнение эталонного стандарта MOD-4023 SR-929SI.1 (верхний профиль) с MOD-4023 C10-PP (Elution DEAE Sepharose), как проанализировано с помощью ОФ-ВЭЖХ при 220 нм. На этом этапе производственного процесса, в образце MOD-4023 наблюдается только гликозилированный пик.

[022] Фиг. 13. Показывает активацию hGH-рецептора MOD-4023 в стабильно трансфицированных клетках. Типичная кривая активации эффекта дозы MOD-4023. Активация hGH-рецепторов белком MOD-4023 на клетках Baf, стабильно экспрессирующих hGH-рецептор на их клеточной поверхности.

[023] Фиг. 14. Представляет отдельный этап процесса и общие факторы процесса выведения, полученные в результате исследований по оценке вирусной безопасности с вирусом лейкемии Абелсона (A-MuLV), мелким вирусом мышей (MVM), реовирусом типа 3 (Reo-3) и вирусом псевдорецептов (PrV). Теоретические вирусные нагрузки на дозу рассчитывались на максимальной дозе 15 мг/доза.

[024] Фиг. 15A и 15B. Показывают структуры с O-связанными гликанами, и их обилие в двух продуктах MOD-4023, как измерено с помощью маркировки 2AB устраненных гликанов, разделенных на ВЭЖХ с использованием колонки с нормальной фазой (НФ). (Фиг. 15А), вдобавок показывает обилие типа сиаловой кислоты в двух образцах продукта MOD-423, как оценено с помощью мечения 1,2-диамино-4,5-метилендиоксибензол-2HCl (DMB) вытесненной сиаловой кислоты, разделенной с применением ультра-эффективной жидкостной хроматографии (УЭЖХ) и идентифицированной в соответствии с коммерческими стандартами (Фиг. 15B)

[025] Фиг. 16. Показывает совмещение из трех хроматограмм Total Ion Current, полученных в результате анализа последовательно соединенными жидкостной хроматографией/электрораспылительной масс-спектроскопией (ЖХ/ЭР-МС) продуктов расщепления трипсином трех серий MOD-4023.

[026] Фиг. 17. Показывает оценку сигналов, полученных из анализа последовательно соединенными жидкостной хроматографией/электрораспылительной масс-спектроскопией (ЖХ/ЭР-МС) трипсин-обработаных, де-сиалилированных, восстановленных и карбоксиметилированных серий белка MOD-4023 (как показано на Фиг. 16 и обсуждается в Примере 2) с акцентом на сигнал, модифицированный, по меньшей мере, одним остатком HexNAc-Hex.

[027] Фиг. 18. Показывает аминокислотную последовательность 1-30 MOD-4023 SEQ ID NO: 7, причем O-гликозилирование происходит по остаткам серина (S) в положениях 10, 13, 15 и 21 (показаны красным). Все эти серины (S) в последовательности следуют за остатками пролина (Р). По меньшей мере два из S-остатков в позициях с первой по четвертую (1-4) заняты сайтами O-гликозилирования (показаны фиолетовым).

[028] Фиг. 19. Показывает аминокислотные последовательности 211-275 MOD-4023 SEQ ID NO: 7, причем O-гликозилирование происходит по остаткам серина (S), показанным красным. Все эти серины (S) в последовательности следуют за остатками пролина (Р). Кроме того, в области повторов серина по меньшей мере два из S-остатков заняты сайтами O-гликозилирования (показаны фиолетовым).

[029] Фиг. 20. Показывает очищенный от шума масс-спектр, полученный при элюировании поглощающего ультрафиолетовое излучение компонента на tR 19,8 мин, полученный из анализа последовательно соединенными ЖХ/ЭР-МС образца MOD4023 Lot 648-01-10-014A после де-сиалилирования.

[030] Фиг. 21. Показывает степень чистоты MOD-4023 (DS), как оценено с использованием (ОФ)-ВЭЖХ с обратной фазой.

[031] Фиг. 22. Показывает степень чистоты MOD-4023 (DS), как оценено с помощью эксклюзионного хроматографа (Э-ВЭЖХ).

[032] Фиг. 23. Показывает результаты активности.

[033] Фиг. 24. Показывает результаты анализов по загрязнению белками клеток-хозяев (БКХ), ДНК, метотрексатом (MTХ); пропиленгликолем (PG); Тriton; инсулином; ДМСО; и бионагрузки.

[034] Понятно, что для простоты и ясности иллюстрации, элементы, показанные на рисунках, необязательно были нарисованы в настоящем масштабе. Например, размеры некоторых элементов могут быть преувеличены относительно других элементов для ясности. Кроме того, там, где это считается целесообразным, ссылочные цифры могут повторяться среди фигур для обозначения соответствующих или аналогичных элементов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[035] В нижеследующем подробном раскрытии изобретения излагаются многочисленные конкретные детали для того, чтобы обеспечить полное понимание рекомбинантного длительно действующего полипептида гормона роста человека (hGH), модифицированного карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека (CTP-модифицированный hGH; MOD-4023, SEQ ID NO: 7) и способы его изготовления. В других случаях, подробно не описываются хорошо известные способы, процедуры и компоненты для того, чтобы не запутывать описания CTP-модифицированного полипептида hGH и способов его изготовления.

[036] В одном варианте реализации изобретения, описанный в данном документе длительно действующий CTP-модифицированный полипептид hGH содержит карбокси-концевой пептид (CTP) гонадотропина хориона человека (hCG). В другом варианте реализации изобретения, CTP действует как защитное средство против деградации белков или пептидов, полученных из него. В другом варианте реализации изобретения, CTP расширяет периоды полувыведения циркулирующих белков или пептидов, полученных из него. В некоторых вариантах реализации изобретения, CTP усиливает активность белков или пептидов, полученных из него.

[037] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термины «CTP-пептид», «карбоксиконцевой пептид» и «CTP-последовательность» могут использоваться в данном документе взаимозаменяемо. В одном варианте реализации изобретения, карбоксиконцевой пептид представляет собой полноразмерный CTP. В одном варианте реализации изобретения, карбоксиконцевой пептид представляет собой урезанный CTP.

[038] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термины «сигнальная последовательность» и «сигнальный пептид» могут использоваться взаимозаменяемо. Кроме того, специалист в данной области техники поймет, что термин «последовательность», когда речь идет о полинуклеотиде, может охватывать кодирующую часть полинуклеотидной последовательности.

[039] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термины «полипептид», «пептид», «представляющий интерес пептид», «представляющий интерес полипептид» и «представляющая интерес полипептидная последовательность» могут быть взаимозаменяемы. В одном варианте реализации изобретения, представляющий интерес пептид является полноразмерным белком. В другом варианте реализации изобретения, представляющий интерес пептид является гормоном роста. В другом варианте реализации изобретения, представляющий интерес пептид является гормоном роста человека. В другом варианте реализации изобретения, представляющий интерес пептид является белковым фрагментом гормона роста человека.

[040] В другом варианте реализации изобретения, в данном документе описан полипептид, состоящий из гормона роста, одного карбоксиконцевого пептида (CTP) гонадотропина хориона человека, присоединенного к аминоконцу гормона роста человека (hGH), и двух карбоксильных терминальных пептидов (CTP) гонадотропина хориона человека, присоединенных к карбоксильному концу GH, причем указанный полипептид не имеет сигнального пептида, и указанный CTP-модифицированный полипептид hGH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7. В другом варианте реализации изобретения, в данном документе описан CTP-модифицированный полипептид hGH, состоящий из GH, одного CTP, присоединенного к аминоконцу концу GH, двух CTP, присоединенных к карбоксильному концу GH, и одного сигнального пептида, присоединенного к аминоконцу аминоконцевого CTP, указанный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. Специалисту в данной области техники будет понятно, что у зрелого секретируемого полипептида отсутствует сигнальный пептид.

[041] В одном варианте реализации изобретения, в данном документе раскрыт способ изготовления полипептида гормона роста человека (hGH), модифицированного карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека (CTP-модифицированный hGH), включающий стадии в которых: а) стабильно трансфицируют заданное количество клеток с помощью вектора экспрессии, содержащего кодирующую часть, что кодирует указанный CTP-модифицированный hGH, причем указанная трансфицированная клетка экспрессирует и секретирует указанный CTP-модифицированный hGH; б) получают клоны клеток, которые сверхэкспрессируют упомянутый CTP-модифицированный hGH; в) увеличивают количество указанных клонов в растворе до заданной величины; г) собирают указанный раствор, содержащий указанные клоны; д) фильтруют указанный собранный раствор, содержащий указанные клоны, для получения отфильтрованного собранного раствора; и е) очищают указанный отфильтрованный собранный раствор для получения очищенного белкового раствора, имеющего желаемую концентрацию CTP-модифицированного hGH, тем самым продуцируя полипептид гормона роста человека (hGH), модифицированный карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека, при этом аминокислотная последовательность CTP-модифицированного hGH представлена в SEQ ID NO: 7.

[042] В другом варианте реализации изобретения, способ изготовления включает клоны, что экспрессируют и секретируют CTP-модифицированный hGH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7. В другом варианте реализации изобретения, в данном документе раскрыт способ изготовления CTP-модифицированного полипептида hGH, описанного в данном документе, имеющего повышенную степень гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, раскрытый в данном документе, изготовленный способами, описанными в данном документе, имеет большее количество гликозилированных О-связанных сайтов гликозилирования. Специалисту в данной области техники будет понятно, что фраза «увеличенное количество гликозилированих О-связанных сайтов гликозилирования», также может быть выражена как «увеличенное заполнение О-гликаном».

Полипептиды, модифицированные СТР-пептидом гонадотропина хориона человека

[043] В одном варианте реализации изобретения, в данном документе описаны длительно действующие полипептиды GH, и способы их получения или изготовления, и применения. В другом варианте реализации изобретения, длительно действующие полипептиды содержат карбоксиконцевой пептид (CTP) гонадотропина хориона человека (hCG). В другом варианте реализации изобретения, CTP действует как защитное средство против деградации белков или пептидов, полученных из него. В другом варианте реализации изобретения, CTP расширяет периоды полувыведения циркулирующих белков или пептидов, полученных из него. В некоторых вариантах реализации изобретения, CTP усиливает активность белков или пептидов, полученных из него.

[044] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термины «CTP-пептид», «CTP», «карбоксиконцевой пептид гонадотропина хориона человека», «карбоксиконцевой пептид» и «последовательность CTP» могут использоваться взаимозаменяемо в данном документе. В одном варианте реализации изобретения, карбоксиконцевой пептид представляет собой полноразмерный CTP. В одном варианте реализации изобретения, карбоксиконцевой пептид представляет собой урезанный CTP.

[045] В другом варианте реализации изобретения, в данном документе описан полипептид, состоящий из GH, одного CTP, присоединенного к аминоконцу концу GH, двух CTP, присоединенных к карбоксильному концу GH, и одного сигнального пептида, присоединенного к аминоконцу N-концевого CTP, причем указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. Специалисту в данной области техники будет понятно, что у зрелого, секретированого полипептида может отсутствовать сигнальный пептид. Таким образом, в еще одном варианте реализации изобретения, в данном документе раскрыт полипептид, состоящий из GH, одного CTP, присоединенного к аминоконцу GH, двух CTP, прикрепленных к карбоксильному концу GH, и не содержащий сигнального пептида, причем указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.

[046] В другом варианте реализации изобретения, в данном документе описан способ получения полипептида, содержащего полипептид, состоящий из GH, одного CTP, присоединенного к аминоконцу GH, двух CTP, присоединенных к карбоксильному концу GH, и одного сигнального пептида, присоединенного к аминоконцу аминоконцевого CTP, причем указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. В еще одном варианте реализации изобретения, в данном документе раскрыт способ получения полипептида, состоящего из GH, одного CTP, присоединенного к аминоконцу GH, двух CTP, прикрепленных к карбоксильному концу GH, и не содержащего сигнальный пептида, причем указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.

[047] В другом варианте реализации изобретения, GH, содержащий CTP, представленный в SEQ ID NO: 7, обладает повышенной биологической активностью in vivo по сравнению с тем же GH без CTP.

[048] В другом варианте реализации изобретения, субъект является человеком. В другом варианте реализации изобретения, субъектом является домашнее животное. В другом варианте реализации изобретения, субъектом является млекопитающее. В другом варианте реализации изобретения, субъект является фермерским животным. В другом варианте реализации изобретения, субъектом является собака. В другом варианте реализации изобретения, субъектом является кошка. В другом варианте реализации изобретения, субъектом является обезьяна. В другом варианте реализации изобретения, субъектом является лошадь. В другом варианте реализации изобретения, субъектом является корова. В другом варианте реализации изобретения, субъектом является мышь. В другом варианте реализации изобретения, субъектом является крыса. В одном варианте реализации изобретения, субъект является самцом. В другом варианте реализации изобретения, субъект является самкой.

[049] В одном варианте реализации изобретения, последовательность карбоксиконцевого пептида (CTP) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1: DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILQ (SEQ ID NO: 1).

[050] В некоторых вариантах реализации изобретения, последовательность CTP, как на аминовом конце полипептида, так и на карбоксильном конце полипептида обеспечивает повышенную защиту от разрушения белка. В некоторых вариантах реализации изобретения, последовательности CTP, как на аминовом конце полипептида, так и на карбоксильном конце полипептида, обеспечивают удлиненный период полувыведения присоединенному белку.

[051] В некоторых вариантах реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, обладает повышенной защитой от деградации полипептида. В некоторых вариантах реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, имеет удлиненный период полураспада присоединенного белка. В некоторых вариантах реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, обладает повышенной активностью hGH.

[052] В другом варианте реализации изобретения, описанный в данном документе CTP-модифицированный полипептид hGH имеет удлиненное время клиренса. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, обладает повышенным C_max hGH. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, раскрытый в данном документе, обладает повышенным T_max hGH. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, обладает повышенным T_1/2 hGH. В некоторых вариантах реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, как описано в данном документе, обеспечивает удлиненный период полувыведения hGH.

[053] В другом варианте реализации изобретения, описанный в данном документе карбоксиконцевой пептид (CTP) содержит аминокислотную последовательность от аминокислоты 112 до позиции 145 гонадотропина хориона человека, как указано в SEQ ID NO: 1. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность CTP содержит аминокислотную последовательность от аминокислоты 118 до позиции 145 гонадотропина хориона человека, как указано в SEQ ID NO: 2: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ. В другом варианте реализации изобретения, последовательность CTP также начинается с любого положения между позициями 112-118 и заканчивается в положении 145 гонадотропина хориона человека. В некоторых вариантах реализации изобретения, пептид последовательности CTP имеет длину 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34 аминокислот и начинается в позиции 112, 113, 114, 115, 116, 117 или 118 аминокислотной последовательности CTP.

[054] В другом варианте реализации изобретения, пептид CTP представляет собой вариант CTP гонадотропина хориона, который отличается от нативного CTP 1-5 консервативными аминокислотными заменами, как описано в патенте США № 5712122. В другом варианте реализации изобретения, пептид CTP представляет собой вариант CTP гонадотропина хориона, который отличается от нативного CTP одной консервативной аминокислотной заменой. В другом варианте реализации изобретения, пептид CTP представляет собой вариант CTP гонадотропина хориона, который отличается от нативного CTP двумя консервативными аминокислотными заменами. В другом варианте реализации изобретения, пептид CTP представляет собой вариант CTP гонадотропина хориона, который отличается от нативного CTP тремя консервативными аминокислотными заменами. В другом варианте реализации изобретения, пептид CTP представляет собой вариант CTP гонадотропина хориона, который отличается от нативного CTP четырьмя консервативными аминокислотными заменами. В другом варианте реализации изобретения, пептид CTP представляет собой вариант CTP гонадотропина хориона, который отличается от нативного CTP пятью консервативными аминокислотными заменами. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе аминокислотная последовательность пептида CTP по меньшей мере на 70% гомологична природной аминокислотной последовательности CTP или таковой пептида. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе аминокислотная последовательность пептида CTP по меньшей мере на 80% гомологична природной аминокислотной последовательности CTP или таковой пептида. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе аминокислотная последовательность пептида CTP по меньшей мере на 90% гомологична природной аминокислотной последовательности CTP или таковой пептиду. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе аминокислотная последовательность пептида CTP по меньшей мере на 95% гомологична природной аминокислотной последовательности CTP или таковой пептида.

[055] В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность ДНК пептида CTP по меньшей мере на 70% гомологична нативной ДНК-последовательности CTP или таковой пептида. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность ДНК пептида CTP по меньшей мере на 80% гомологична нативной ДНК-последовательности CTP или таковой пептида. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность ДНК пептида CTP по меньшей мере на 90% гомологична нативной ДНК-последовательности CTP или таковой пептида. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность ДНК пептида CTP по меньшей мере на 95% гомологична нативной ДНК-последовательности CTP или таковой пептида.

[056] В одном варианте реализации изобретения, по меньшей мере одна из аминокислотных последовательностей CTP гонадотропина хориона является усеченной. В другом варианте реализации изобретения, обе аминокислотных последовательности CTP гонадотропина хориона являются усеченными. В другом варианте реализации изобретения, две из аминокислотных последовательностей CTP гонадотропина хориона являются усеченными. В другом варианте реализации изобретения, две или больше из аминокислотных последовательностей CTP гонадотропина хориона являются усеченными. В другом варианте реализации изобретения, все аминокислотные последовательности CTP гонадотропина хориона являются усеченными. В одном варианте реализации изобретения, усеченный CTP содержит первые 10 аминокислот SEQ ID NO: 3: SSSSKAPPPSLP. В одном варианте реализации изобретения, усеченный CTP содержит первые 11 аминокислот SEQ ID NO:3. В одном варианте реализации изобретения, усеченный CTP содержит аминокислоты SEQ ID NO:3.

[057] В одном варианте реализации изобретения, по меньшей мере одна из аминокислотных последовательностей CTP гонадотропина хориона является гликозилированной. В другом варианте реализации изобретения, обе аминокислотных последовательности CTP гонадотропина хориона являются гликозилированными. В другом варианте реализации изобретения, две из аминокислотных последовательностей CTP гонадотропина хориона являются гликозилированными. В другом варианте реализации изобретения, две или больше из аминокислотных последовательностей CTP гонадотропина хориона являются гликозилированными. В другом варианте реализации изобретения, все аминокислотные последовательности CTP гонадотропина хориона являются гликозилированными. В одном варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность CTP содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность CTP содержит по меньшей мере два сайты гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность CTP содержит по меньшей мере три сайты гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность CTP содержит по меньшей мере четыре сайты гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность CTP содержит по меньшей мере пять сайтов гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность CTP содержит по меньшей мере шесть сайтов гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность CTP содержит по меньшей мере семь сайтов гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, описанная в данном документе последовательность CTP содержит по меньшей мере восемь сайтов гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, сайты гликозилирования представляют собой сайты O-гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, гликозилирование происходит по сериновому остатку. В другом варианте реализации изобретения, гликозилирование происходит по треониновому остатку.

[058] В одном варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы вырабатывают полипептид, модифицированный карбоксиконцевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека, причем указанный CTP-модифицированный полипептид обладает является высокогликозилированым. В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы продуцируют CTP-модифицированный человеческий гормон роста (CTP-hGH), причем указанный CTP-модифицированный hGH является высокогликозилированым. В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы продуцируют CTP-модифицированный hGH, причем указанный CTP-модифицированный hGH является высокосиалилированным. Сиалилирование важно, поскольку чем выше сиалилирование, тем более продолжительным может быть период полувыведения.

[059] В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы продуцируют CTP-модифицированный hGH, причем по меньшей мере одна из аминокислотных последовательностей CTP гонадотропина хориона является гликозилированной. В другом варианте реализации изобретения, обе аминокислотных последовательности CTP гонадотропина хориона являются гликозилированными. В другом варианте реализации изобретения, две из аминокислотных последовательностей CTP гонадотропина хориона являются гликозилированными. В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы продуцируют CTP-модифицированный hGH, причем три аминокислотных последовательности CTP гонадотропина хориона являются гликозилированными. В другом варианте реализации изобретения, три или больше из аминокислотных последовательностей CTP гонадотропина хориона являются гликозилированными. В другом варианте реализации изобретения, все аминокислотные последовательности CTP гонадотропина хориона являются гликозилированными.

[060] В одном варианте реализации изобретения, каждая последовательность CTP CTP-модифицированного hGH содержит гликозилирование в, по меньшей мере, одном сайте гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, каждая последовательность CTP указанного CTP-модифицированного hGH содержит гликозилирование в, по меньшей мере, двух сайтах. В другом варианте реализации изобретения, каждая последовательность CTP указанного CTP-модифицированного hGH содержит гликозилирование в, по меньшей мере, трех сайтах гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, каждая последовательность CTP указанного CTP-модифицированного hGH содержит гликозилирование в четырех сайтах гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, каждая последовательность CTP указанного CTP-модифицированного hGH содержит гликозилирование в, по меньшей мере, пяти сайтах гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, каждая последовательность CTP указанного CTP-модифицированного hGH содержит гликозилирование в, по меньшей мере, шести сайтах гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, каждая последовательность CTP указанного CTP-модифицированного hGH содержит гликозилирование в, по меньшей мере, семи сайтах гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, каждая последовательность CTP указанного CTP-модифицированного hGH содержит гликозилирование в, по меньшей мере, восьми сайтах гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, сайты гликозилирования представляют собой сайты O-гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, гликозилирование происходит по сериновому остатку. В другом варианте реализации изобретения, гликозилирование происходит по треониновому остатку.

[061] В одном варианте реализации изобретения, в котором изготовленный CTP-модифицированный hGH SEQ ID NO: 7 состоит из двух CTP, прикрепленных к карбоксильному концу hGH, и одного CTP, прикрепленного к аминоконцу hGH, CTP-модифицированный hGH содержит гликозилирование в от 12 до 18 сайтах гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hTP содержит гликозилирование в от 12 до 21 сайтах гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hTP содержит гликозилирование в от 12 до 24 сайтах гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, между 13 и 18, 14 и 18, 15 и 18, 16 и 18, 17 и 18, 13 -21, 14-21, 15-21, 16-21, 17-21, 18-21, 19-21, 20-21, 13-24, 14-24, 15-24, 16-24, 17-24, 18-24, 19-24, 20-24, 21-24, 22-24 или 23 24. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH содержит гликозилирование в 12 сайтах гликозилирования, в 13 сайтах гликозилирования, в 14 сайтах гликозилирования, в 15 сайтах гликозилирования, в 16 сайтах гликозилирования, в 17 сайтах гликозилирования, в 18 сайтах гликозилирования, в 19 сайтах гликозилирования, в 20 сайтах гликозилирования, в 21 сайте гликозилирования, в 21 сайте гликозилирования, в 22 сайтах гликозилирования, в 23 сайтах гликозилирования или в 24 сайтах гликозилирования. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации изобретения.

[062] В другом варианте реализации изобретения, в котором аминокислотная последовательность CTP-модифицированного hGH представлена в SEQ ID NO: 7, O-связанное гликозилирование происходит по доступным остаткам серина (S), присутствующим в каждой единице CTP. В другом варианте реализации изобретения, каждый CTP содержит 4-6 О-связанных гликанов, причем гликозилирование есть по остаткам серина (S), присутствующим в каждом блоке CTP. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 12-18 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 12-21 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 12-24 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 12 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 13 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 14 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 15 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 16 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 17 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 18 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 19 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 20 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 21 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 22 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 23 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, O-связанное гликозилирование по остаткам серина (S) каждой единицы CTP включает 24 О-связанных углеводных цепей. В другом варианте реализации изобретения, на последовательности hGH (SEQ ID NO: 8) указанного CTP-модифицированного hGH не присутствуют O-связанные углеводные цепей.

[063] В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере 4 O-гликана на каждом CTP. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере 5 O-гликанов на каждом CTP. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере 6 O-гликанов на каждом CTP. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере 7 O-гликанов на каждом CTP. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере 8 O-гликанов на каждом CTP. Специалист в данной области техники распознает, что заполнение О-гликанами может отличаться для каждого CTP, содержащегося в CTP-модифицированном полипептиде hGH.

[064] В другом варианте реализации изобретения, полипептид CTP-hGH-CTP-CTP, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере один CTP, содержащий более 4 O-гликанов. В другом варианте реализации изобретения, полипептид CTP-hGH-CTP-CTP, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере один CTP, содержащий более 5 O-гликанов. В другом варианте реализации изобретения, полипептид CTP-hGH-CTP-CTP, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере один CTP, содержащий более 6 O-гликанов. В другом варианте реализации изобретения, полипептид CTP-hGH-CTP-CTP, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере один CTP, содержащий более 7 O-гликанов.

[065] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «гомология» может охватывать делеции, вставки или варианты замещения, включая их аминокислотную замену, и их биологически активные полипептидные фрагменты. В одном варианте реализации изобретения, вариант замены представляет собой вариант, в котором глутамин в позиции 65 hGH замещается валином [Gellerfors et al., J Pharm Biomed Anal 1989, 7:173-83].

[066] В одном варианте реализации изобретения, «пептид» или «пептидный фрагмент» включает соединение, в котором множество аминокислот связано пептидной связью. В данном документе, когда включена неаминокислота, существует случай, когда связь между неаминокислотой и соседней аминокислотой не является пептидной связью. Однако, соединение в этом случае также совместно упоминается как пептид или пептидный фрагмент.

[067] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «защищенный пептидный фрагмент» может включать фрагмент пептида, в котором один или большее реакционноспособных заместителей, выбранных из группы, состоящей из гидроксигруппы, аминогруппы, гуанидиновой группы, имидазолильной группы, индолильной группы, меркаптогруппы и карбоксильной группы боковой цепи аминокислоты или неаминокислоты пептидного фрагмента, которые могут вызвать нежелательную побочную реакцию при приготовлении фрагмента пептида или реакции конденсации пептидных фрагментов, являются защищенными защитной группой. В дальнейшем, это сокращенно обозначается как «защищенный пептидный фрагмент» в настоящей спецификации.

[068] В некоторых вариантах реализации изобретения, гормон роста человека (hGH) используют в соответствии с раскрытыми в данном документе методами. В некоторых вариантах реализации изобретения, присоединение последовательности(-стей) CTP как к амино, так и карбоксильныму концу белка hGH приводит к увеличению активности. В некоторых вариантах реализации изобретения, присоединение последовательности CTP как к амино, так и карбоксильныму концу белка hGH приводит к продлению активности in vivo.

[069] В одном варианте реализации изобретения, описанный в данном документе полипептид-предшественник CTP-модифицированного hGH представлен в SEQ ID NO: 4.

[070] SEQ ID NO: 4:

MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.

[071] Специалисту в данной области техники будет понятно, что фраза «гормон роста человека» (hGH) может включать полипептид-предшественник, включающий сигнальный пептид, такой как указанный в Genbank Accession No. P01241 (SEQ ID NO: 5), который проявляет активность hGH (т.е. стимуляцию роста). SEQ ID NO: 5: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF. В другом варианте реализации изобретения, дозревший hGH, раскрытый в данном документе, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8:

FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF.

[072] Специалисту в данной области техники будет понятно, что раскрытый в настоящем документе «hGH» может включать гомологи. В другом варианте реализации изобретения, аминокислотная последовательность GH способов и композиций, описанных в данном документе, по меньшей мере на 50% гомологична последовательности hGH, изложенной в данном документе, как определено с использованием программного обеспечения BlastP Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с применением параметров по умолчанию. В другом варианте реализации изобретения, процент гомологии составляет 60%. В другом варианте реализации изобретения, процент гомологии составляет 70%. В другом варианте реализации изобретения, процент гомологии составляет 80%. В другом варианте реализации изобретения, процент гомологии составляет 90%. В другом варианте реализации изобретения, процент гомологии составляет по меньшей мере 95%. В другом варианте реализации изобретения, процент гомологии составляет больше чем 95%.

[073] В одном варианте реализации изобретения, после экспрессии и секреции CTP-модифицированного пептида hGH, описанного в данном документе, сигнальный пептид отщепляется от белка-предшественника, что приводит к образованию зрелого белка. Например, в SEQ ID NO: 4, аминокислоты 1-26, MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO: 6) представляют собой сигнальный пептид CTP-модифицированного полипептида hGH, и аминокислоты SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 7) представляет собой зрелый сконструированный CTP-модифицированный полипептид hGH без сигнального пептида (MOD-4023). В одном варианте реализации изобретения, аминокислотная последовательность CTP-модифицированного hGH без сигнального пептида представлена в SEQ ID NO: 7. В другом варианте реализации изобретения, сигнальный пептид CTP-модифицированного hGH представлен в SEQ ID NO: 6. В другом варианте реализации изобретения, аминокислоты 29-219 CTP-модифицированной последовательности hGH, как указано в SEQ ID NO: 7, представляют собой hGH. В другом варианте реализации изобретения, аминокислоты 1-28, 220-247 и 248-275 CTP-модифицированной последовательности hGH, как указано в SEQ ID NO: 7, представляют собой каждую из единиц CTP, одну N-концевую для hGH, и две C-концевые для hGH, CTP-модифицированного hGH.

[074] В одном варианте реализации изобретения, MOD-4023 (SEQ ID NO: 7) содержит два дисульфидных (S-S) мостика, причем оба S-S мостика находятся внутри молекулы hGH. В другом варианте реализации изобретения, один дисульфидный мостик находится между остатком цистеина 81 и остатком цистеина 193 SEQ ID NO: 7, а второй дисульфидный мостик находится между остатком цистеина 210 и остатком цистеина 217 SEQ ID NO: 7.

[075] В другом варианте реализации изобретения, способы, раскрытые в данном документе, относятся к CTP-модифицированному полипептиду hGH для стимуляции роста мышц.

[076] В одном варианте реализации изобретения, способ изготовления, описанный в данном документе, продуцирует аминокислотную последовательность зрелого CTP-модифицированного полипептида hGH, описанного в данном документе, без сигнального пептида. В другом варианте реализации изобретения, способ изготовления, описанный в данном документе, продуцирует аминокислотную последовательность зрелого CTP-модифицированного полипептида hGH, как указано в SEQ ID NO: 7.

[077] В другом варианте реализации изобретения, способы, раскрытые в данном документе, относятся к CTP-модифицированному полипептиду hGH, представленному в SEQ ID NO: 7, для стимуляции роста мышц.

[078] В другом варианте реализации изобретения, способы, раскрытые в данном документе, включают применение нуклеотидной последовательности, кодирующей CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе. В одном варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы включают использование нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 9, кодирующей пептид hGH с одним CTP-аминокислотным пептидом на N-конце и двумя CTP-аминокислотными пептидами на С-конце. SEQ ID NO: 9: ATGGCCACCGGCAGCAGGACCAGCCTGCTGCTGGCCTTCGGCCTGCTGTGCCTGCCATGGCTGCAGGAGGGCAGCGCCAGCTCTTCTTCTAAGGCTCCACCCCCATCTCTGCCCAGCCCCAGCAGACTGCCGGGCCCCAGCGACACACCCATTCTGCCCCAGTTCCCCACCATCCCCCTGAGCAGGCTGTTCGACAACGCCATGCTGAGGGCTCACAGGCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTCGAGGAAGCCTACATCCCCAAGGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTGTGCTTCAGCGAGAGCATCCCCACCCCCAGCAACAGAGAGGAGACCCAGCAGAAGAGCAACCTGGAGCTGCTGAGGATCTCCCTGCTGCTGATCCAGAGCTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTGAGAAGCGTGTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCAGCGACAGCAACGTGTACGACCTGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAGACCCTGATGGGCCGGCTGGAGGACGGCAGCCCCAGGACCGGCCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAGAACTACGGGCTGCTGTACTGCTTCAGAAAGGACATGGACAAGGTGGAGACCTTCCTGAGGATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAGGGCAGCTGCGGCTTCAGCTCCAGCAGCAAGGCCCCTCCCCCGAGCCTGCCCTCCCCAAGCAGGCTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCTCCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCGGCTGCCTGGCCCCTCTGACACCCCTATCCTGCCTCAG.

[079] В одном варианте реализации изобретения, способы включают использование нуклеотидной последовательности, содержащей кодирующую часть, что кодирует CTP-модифицированный hGH, раскрытый в данном документе. В другом варианте реализации изобретения, способ, раскрытый в данном документе, включает использование последовательности нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 9. Специалисту в данной области техники будет понятно, что нуклеотидная последовательность может быть частью вектора экспрессии, содержащего кодирующую часть, что кодирует CTP-модифицированный hGH, раскрытый в данном документе.

[080] В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы относятся к нуклеотидной последовательности, кодирующей CTP-модифицированный пептид hGH, для терапевтического использования при многочисленных показаниях, представленных в патенте США № 8946155, который включен в данном документе посредством ссылки. Кроме того, такие CTP-модифицированные полипептиды hGH хорошо описаны в публикации заявки на патент США US-2014-0113860-A1, в патенте США № 8450269 и в патенте США № 8304386, все из которых включены в данный документ в полном объеме.

[081] В некоторых вариантах реализации изобретения, полипептиды, описанные в данном документе, используются в лекарственных средствах, которые требуют, чтобы полипептиды были в растворимой форме.

[082] В некоторых вариантах реализации изобретения, полипептиды, описанные в данном документе, синтезируют биохимически, например, с использованием стандартных твердофазных методов. В некоторых вариантах реализации изобретения, эти биохимические способы изготовления включают исключающий твердофазный синтез, частичный твердофазный синтез, конденсацию фрагментов или классический синтез раствора. В некоторых вариантах реализации изобретения, эти способы используют, когда полипептид является относительно коротким (около 5-15 кДа) и/или когда он не может быть получен рекомбинантными методами (т.е. не кодируется нуклеотидной последовательностью) и, следовательно, включает применение различных химических способов.

[083] В некоторых вариантах реализации изобретения, твердофазные способы синтеза полипептидов хорошо известны специалистам в данной области техники и дополнительно описаны Morrow Stewart и Janis Dillaha Young, Solid Phase Polypeptide Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984). В некоторых вариантах реализации изобретения, синтетические полипептиды очищают препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией [Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.], и их состав может быть подтвержден посредством способов аминокислотного секвенирования, которые являются известными специалисту в данной области техники.

[084] В некоторых вариантах реализации изобретения, способы рекомбинантного белка используют для создания описанных в данном документе полипептидов. В некоторых вариантах реализации изобретения, способы рекомбинантного белка используют для получения относительно длинных полипептидов (например, более 18-25 аминокислот). В некоторых вариантах реализации изобретения, способы рекомбинантного белка используют для создания больших количеств полипептида, описанного в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантные методы описаны в Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 и Brogli et al, (1984) Science 224:838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 and Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463.

[085] В одном варианте реализации изобретения, полипептид, описанный в данном документе, синтезируют с использованием полинуклеотида, кодирующего описанный в данном документе полипептид. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид, кодирующий описанный в данном документе полипептид, лигируют в вектор экспрессии, содержащий транскрипционный контроль цис-регуляторной последовательности (например, промоторной последовательности). В некоторых вариантах реализации изобретения, цис-регуляторная последовательность подходит для направления конститутивной экспрессии описанного в данном документе полипептида. В некоторых вариантах реализации изобретения, цис-регуляторная последовательность подходит для направления тканеспецифической экспрессии описанного в данном документе полипептида. В некоторых вариантах реализации изобретения, цис-регуляторная последовательность подходит для направления индуцируемой экспрессии описанного в данном документе полипептида.

[086] В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотиды, которые экспрессируют описанный в данном документе полипептид, содержат нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.

[087] В некотором варианте реализации изобретения, тканеспецифические промоторы, подходящие для использования с полинуклеотидными последовательностями, раскрытыми в данном документе, включают последовательности, которые являются функциональными в конкретной популяции клеток, например, включают, но не ограничиваются лишь этими: промоторы, такие как альбуминовый, специфичный для клеток печени [Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277], промоторы специфичные для клеток лимфоидной ткани [Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]; в частности промоторы Т-клеточных рецепторов [Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733] и иммуноглобулинов; [Banerji et al. (1983) Cell 33729-740], нейроспецифические промоторы, такие как промотор нейрофиламентов [Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], промоторы, специфичные для клеток поджелудочной железы [Edlunch et al. (1985) Science 230:912-916], или промоторы, специфичные для клеток молочной железы, такие как промотор молочной сыворотки (патент США № 4873316 и публикация европейской заявки № 264166). Индуцибельные промоторы, подходящие для использования в описанных в данном документе способах, включают, например, тетрациклин-индуцибельный промотор, (Srour, M.A., et al., 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405).

[088] Специалисту в данной области техники будет понятно, что фраза «полинуклеотид» может включать одноцепочечную или двухцепочечную нуклеотидную последовательность, которую выделяют и получают в форме РНК-последовательности, комплементарной полинуклеотидной последовательности (кДНК), геномной полинуклеотидной последовательности и/или составных полинуклеотидных последовательностей (например, комбинация из вышеизложенных).

[089] Специалисту в данной области техники будет понятно, что фраза «комплементарная полинуклеотидная последовательность» может включать последовательность, которая является результатом обратной транскрипции мРНК с использованием обратной транскриптазы или любой другой РНК-зависимой ДНК полимеразы. В одном варианте реализации изобретения, количество копий последовательности может быть постепенно увеличено in vivo или in vitro с использованием ДНК-полимеразы.

[090] Специалисту в данной области техники будет понятно, что фраза «геномная полинуклеотидная последовательность» может включать последовательность, полученную (выделенную) из хромосомы и, таким образом, она представляет собой смежную часть хромосомы.

[091] Специалисту в данной области техники будет понятно, что фраза «составная полинуклеотидная последовательность» может включать последовательность, которая по меньшей мере частично комплементарна и, по меньшей мере, частично геномна. В одном варианте реализации изобретения, составная последовательность может включать некоторые экзонные последовательности, необходимые для кодирования описанного в данном документе полипептида, а также некоторые интронные последовательности, расположенные между ними. В одном варианте реализации изобретения, интронные последовательности могут быть из любого источника, включая другие гены, и обычно будут включать консервативные последовательности сигналов сплайсинга. В одном варианте реализации изобретения, интронные последовательности включают цис-действующие регуляторные элементы экспрессии.

[092] В одном варианте реализации изобретения, описанные в данном документе полинуклеотиды дополнительно содержат сигнальную последовательность, кодирующую сигнальный пептид для секреции описанных в данном документе полипептидов. В некоторых вариантах реализации изобретения, последовательности сигналов включают, но не ограничиваются эндогенной сигнальной последовательностью для hGH, представленной в SEQ ID NO: 6. В другом варианте реализации изобретения, сигнальная последовательность является N-терминальной для последовательности CTP, которая, в свою очередь, является N-терминальной для представляющей интерес полипептидной последовательности; например, последовательность представляет собой: а) сигнальную последовательность - б) CTP- в) последовательность интереса - г) необязательную одну или больше дополнительных последовательностей CTP. В другом варианте реализации изобретения, одну или больше последовательностей CTP вставляют между сигнальной последовательностью представляющей интерес полипептидной последовательности и самой представляющей интерес полипептидной последовательностью, тем самым прерывая представляющую интерес последовательность дикого типа.

[093] В другом варианте реализации изобретения, полипептиды и способы их получения, описанные в данном документе, относятся к зрелому CTP-модифицированному GH, не имеющему сигнального пептида, как указано в SEQ ID NO: 7.

[094] В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотиды, описанные в данном документе, готовят с использованием методов ПЦР, или любого другого способа или процедуры, известных специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения, процедура включает легирования двух различных последовательностей ДНК (см., например, ''Current Protocols in Molecular Biology'', eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992).

Биологическая активность и применение

[095] В одном варианте реализации изобретения, в данном документе описан способ уменьшения частоты введений доз GH субъекту, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из hGH, одного карбоксиконцевого пептида (CTP) гонадотропина хориона, присоединенного к аминоконцу указанного GH, и двух CTP гонадотропина хориона, присоединенных к кабоксильному концу указанного GH, причем указанный полипептид не имеет сигнального пептида, и при этом аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7, тем самым снижая частоту введения доз GH субъекту.

[096] В другом варианте реализации изобретения, в данном документе описан способ улучшения площади под кривой (AUC - area under the curve) GH у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из hGH, одного карбоксиконцевого пептида (CTP) гонадотропина хориона, присоединенного к аминоконцу указанного hGH, и двух CTP гонадотропина хориона, присоединенных к кабоксильному концу указанного hGH, причем указанный полипептид не имеет сигнального пептида, и при этом аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7, тем самым улучшая площадь под кривой для GH.

[097] В одном варианте реализации изобретения, в данном документе описан способ лечения субъекта нуждающегося в терапия GH, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из hGH, одного карбоксиконцевого пептида (CTP) гонадотропина хориона, присоединенного к аминоконцу указанного hGH, и двух CTP гонадотропина хориона, присоединенных к кабоксильному концу указанного hGH, причем указанный полипептид не имеет сигнального пептида, и при этом аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7, тем предоставляя лечение указанному субъекту, нуждающемуся в терапии GH.

[098] В другом варианте реализации изобретения, в данном документе описан способ повышения уровней инсулин-подобного фактора роста (IGF-1) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из hGH, одного карбоксиконцевого пептида (CTP) гонадотропина хориона, присоединенного к аминоконцу указанного hGH, и двух CTP гонадотропина хориона, присоединенных к кабоксильному концу указанного hGH, причем указанный полипептид не имеет сигнального пептида, и при этом аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7, тем самым повышая уровни инсулин-подобного фактора роста (IGF-1) у субъекта.

[099] В другом варианте реализации изобретения, в данном документе описан способ поддержания уровней инсулин-подобного фактора роста (IGF-1) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из hGH, одного карбоксиконцевого пептида (CTP) гонадотропина хориона, присоединенного к аминоконцу указанного hGH, и двух CTP гонадотропина хориона, присоединенных к кабоксильному концу указанного hGH, причем указанный полипептид не имеет сигнального пептида, и при этом аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7, тем самым поддерживая уровни инсулин-подобного фактора роста (IGF-1) у субъекта. В другом варианте реализации изобретения, уровни IGF-I сохраняются в определенном диапазоне, как дополнительно описано в данном документе.

[0100] В другом варианте реализации изобретения, в данном документе описан способ увеличения и поддержания уровней инсулин-подобного фактора роста (IGF-1) в определенном диапазоне у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из hGH, одного карбоксиконцевого пептида (CTP) гонадотропина хориона, присоединенного к аминоконцу указанного hGH, и двух CTP гонадотропина хориона, присоединенных к кабоксильному концу указанного hGH, причем указанный полипептид не имеет сигнального пептида, и при этом аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7, тем самым увеличивая и поддерживая уровни инсулин-подобного фактора роста (IGF-1) в определенном диапазоне у субъекта.

[0101] В другом варианте реализации изобретения, определенный диапазон представляет собой диапазон терапевтической дозы, который достигается путем введения CTP-модифицированного hGH, описанного в данном документе. В другом варианте реализации изобретения, определенный диапазон представляет собой тот, в котором Cmax и Coutrough синусоидального поведения IGF-I поддерживается после последовательных введений CTP-модифицированного hGH, описанного в данном документе. В другом варианте реализации изобретения, определенный диапазон представляет собой диапазон терапевтической дозы для последовательного введения CTP-модифицированного hGH, описанного в данном документе, с отличной отзывчивостью у субъекта и с минимальной потребностью в модификации дозы. В другом варианте реализации изобретения, определенный диапазон сопоставим с диапазоном уровней IGF-I у индивидов, которые считаются нормальным. В другом варианте реализации изобретения, определенный диапазон является нормальным диапазоном уровней/значений IGF-I у обычных индивидов. В еще одном варианте реализации изобретения, определенный диапазон находится в пределах нормального диапазона, когда значения бала стандартного отклонения IGF-I находятся в пределах ±2 балов стандартного отклонения (SDS).

[0102] В другом варианте реализации изобретения, способы, раскрытые в данном документе, относятся к CTP-модифицированному полипептиду hGH, описанному в данном документе, для стимуляции роста костей.

[0103] В другом варианте реализации изобретения, способы, раскрытые в данном документе, относятся к нуклеотидной последовательности, кодирующей CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, для стимуляции роста костей.

[0104] В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH, описанный в данном документе, используется таким же образом, как и немодифицированные GH. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH, раскрытый в данном документе, имеет увеличенный период полувыведения и времени пребывания в плазме, уменьшенный клиренс и повышенную клиническую активность in vivo. В другом варианте реализации изобретения, благодаря улучшенным свойствам CTP-модифицированного hGH, описанного в данном документе, этот конъюгат вводят реже, чем немодифицированные GH. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный GH, как описано в данном документе, вводят от одного раз в неделю до одного раза в две недели. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный GH, как описано в данном документе, вводят от одного раз в две недели до одного раза в три недели. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный GH, как описано в данном документе, вводят от одного раз в день до трех раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, сниженная частота введения приведет к улучшению соответствия пациентам, что приведет к улучшению результатов лечения, а также к улучшению качества жизни пациентов. В другом варианте реализации изобретения, по сравнению с обычными конъюгатами GH, связанными с поли(этиленгликолем), было обнаружено, что конъюгаты GH CTP, имеющие молекулярную массу и линкерную структуру конъюгатов, описанных в данном документе, обладают улучшенной эффективностью, улучшенной стабильностью, повышенными уровнями AUC и улучшенными периодом полувыведения. В другом варианте реализации изобретения, по сравнению с обычными конъюгатами GH, связанными с поли(этиленгликолем), было обнаружено, что GH, имеющие молекулярную массу и линкерную структуру конъюгата, описанного в данном документе, обладают улучшенной эффективностью, улучшенной стабильностью, повышенными уровнями AUC и улучшенными периодом полувыведения. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество CTP-модифицированного hGH представляет собой количество конъюгата, необходимое для измеряемой in vivo ожидаемой биологической активности. В другом варианте реализации изобретения, GH, используемый в соответствии с раскрытыми в данном документе методами, проявляет повышенную активность. В некоторых вариантах реализации изобретения, присоединение последовательности CTP как к амино-, так и к карбокси-концу GH приводит к продлению активности in vivo.

[0105] В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество CTP-модифицированного hGH определяют в соответствии с такими факторами, как точный тип состояния, подвергаемого лечению, состояние пациента, подвергаемого лечению, а также другие составляющие в композиции. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество CTP-модифицированного hGH составляет от 0,01 до 10 мкг на кг массы тела, вводимое один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество CTP-модифицированного hGH составляет от 0,1 до 1 мкг на кг массы тела, вводимое один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество CTP-модифицированного hGH составляет от 1 мкг на кг массы тела до 1 мг на кг массы тела, вводимое один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество CTP-модифицированного hGH составляет 1 мг на кг массы тела, вводимое один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество для взрослого пациента с дефицитом гормона роста, включающее CTP-модифицированный hGH, составляет 1 мг - 15 мг, вводимое один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество для взрослого пациента с дефицитом гормона роста, включающее CTP-модифицированный hGH, составляет больше чем 1 мг, вводимое один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество для пациента детского возраста с дефицитом гормона роста, включающее CTP-модифицированный hGH, составляет от 1 мкг на кг массы тела до 1 мг/кг массы тела, вводимое один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество для пациента детского возраста с дефицитом гормона роста, включающее CTP-модифицированный hGH, составляет до 600 мкг на кг массы тела, вводимое один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество для пациента детского возраста с дефицитом гормона роста, включающее CTP-модифицированный hGH, составляет до 700 мкг на кг массы тела, вводимое один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, терапевтически эффективное количество для пациента детского возраста с дефицитом гормона роста, включающее CTP-модифицированный hGH, находится между около 600 мкг на кг массы тела и 700 мкг на кг массы тела, вводимое один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическую композицию, содержащую CTP-модифицированный hGH, составляют в концентрации, эффективной для введения различными способами пациенту-человеку.

[0106] В одном варианте реализации изобретения, способы, полинуклеотиды и полипептиды, раскрытые в данном документе, применяют в ветеринарной медицине. В одном варианте реализации изобретения, в данном документе описано лечение одомашненных млекопитающих, которых содержат в качестве человеческих спутников (например, собак, кошек, лошадей), которые имеют значительную коммерческую ценность (например, молочные коровы, крупный рогатый скот мясного типа, спортивные животные), и которые имеют значительную научную ценность (например, содержащиеся в неволе или на свободе экземпляры исчезающих видов) или которые в каком-либо другом случае являются ценными.

[0107] В одном варианте реализации изобретения, полипептиды или полинуклеотиды, описанные в данном документе, вводят животному (например, мыше, крысе, кролику, хомяку, морской свинке, свинье, микро-свинье, курице, верблюду, козе, лошади, корове, овце, собаке, кошке, примату, низшему примату, и человеку). В одном варианте реализации изобретения, заявленные применения могут быть применены для широкого круга хозяев. В некоторых вариантах реализации изобретения, такие хозяева включают, но не ограничиваются лишь этими: человека, морскую свинку, кролика, козу, морскую свинку, верблюда, лошадь, мышь, крысу, хомяка, свинью, микро-свинью, курицу, козу, корову, овцу, собаку, кошку или низшего примата.

[0108] В одном варианте реализации изобретения, фермерских животных лечат с помощью способов, описанных в данном документе. В одном варианте реализации изобретения, фермерские животные включают свиней, крупный рогатый скот, молочных коров, лошадей, коз, овец, цыплят, индюков, гусей, уток и родственные виды. В одном варианте реализации изобретения, лабораторных животных лечат с помощью способов, описанных в данном документе. В одном варианте реализации изобретения, лабораторные животные включают крыс, мышей, морских свинок, кроликов, коз, обезьян, собак, кошек и других. В одном варианте реализации изобретения, содержащихся в зоопарке животных лечат с помощью способов, описанных в данном документе. В одном варианте реализации изобретения, содержащиеся в зоопарке животные включают всех позвоночных животных, которых содержат в зоопарках. В одном варианте реализации изобретения, водных животных лечат с помощью способов, описанных в данном документе. В одном варианте реализации изобретения, водные животные включают рыб, угрей, черепах, тюленей, пингвинов, акул, китов и родственные виды. В одном варианте реализации изобретения, одомашненных животных лечат с помощью способов, описанных в данном документе. В одном варианте реализации изобретения, одомашненные животные включают любое домашнее животное, такое как кошки и собаки, или животное, которое содержится людьми, например лошадей, крупный рогатый скот, свиней, коз, кроликов, цыплят, индюков, гусей, уток и тому подобное.

[0109] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «свиньи» включает свиней, поросят, кабанов, подсвинок, боровов, хряков и свиноматок. Подобным же образом квалифицированный специалист поймет, что термин «крупный рогатый скот» охватывает телят, коров, молочных коров, телок, кастрированных быков и быков.

[0110] В некоторых вариантах реализации изобретения, модификация последовательностей CTP является преимуществом при разрешении использования более низких доз.

Изотовления

[0111] В одном варианте реализации изобретения, в данном документе раскрыт способ изготовления полипептида гормона роста человека (hGH), модифицированного карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека (CTP-модифицированный hGH), включающий стадии в которых: а) стабильно трансфицируют заданное количество клеток с помощью вектора экспрессии, содержащего кодирующую часть, что кодирует указанный CTP-модифицированный hGH, причем указанная трансфицированная клетка экспрессирует и секретирует указанный CTP-модифицированный hGH; б) получают клоны клеток, которые сверхэкспрессируют упомянутый CTP-модифицированный hGH; в) увеличивают количество указанных клонов в растворе до заданной величины; г) собирают указанный раствор, содержащий указанные клоны; д) фильтруют указанный собранный раствор, содержащий указанные клоны, для получения отфильтрованного собранного раствора; и е) очищают указанный отфильтрованный собранный раствор для получения очищенного белкового раствора, имеющего желаемую концентрацию CTP-модифицированного hGH, причем аминокислотная последовательность изготовляемого CTP-модифицированого hGH приводится в SEQ ID NO: 7, тем самым изготавливая полипептид гормона роста человека (hGH), модифицированный карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека. В альтернативном варианте реализации изобретения, на стадии «д)» клетки и дебрис удаляют центрифугированием. При изготовлении CTP-модифицированного hGH трансфекция является ранней стадией. В другом варианте реализации изобретения, способ изготовления включает клоны, что экспрессируют и секретируют CTP-модифицированный hGH. После отбора конечного клона с высокой экспрессией, каждое производство включает оттаивание банка рабочих ячеек (WCB), увеличение количества, сбор и очистку. (См. Пример: этапы 1-8 на Фиг. 3, описывающие увеличение количества клона путем сбора, этапы 8-16 на Фиг. 4, описывающие очистку). В альтернативном варианте реализации изобретения, когда выбран конечный клон с высокой экспрессией, каждое производство включает в себя оттаивание банка стоковых клеток (MCB), увеличения количества клеток, сбор и очистку. (См. Пример: этапы 1-8 на Фиг. 3, описывающие увеличение количества клона путем сбора, этапы 8-16 на Фиг. 4, описывающие очистку).

[0112] В одном варианте реализации изобретения, полинуклеотиды, описанные в данном документе, вставляют в экспрессирующие векторы (то есть конструкцию нуклеиновой кислоты), чтобы обеспечить экспрессию рекомбинантного полипептида. В одном варианте реализации изобретения, вектор экспрессии, описанный в данном документе, содержит дополнительные последовательности, которые делают этот вектор подходящим для репликации и интеграции в прокариотах. В одном варианте реализации изобретения, вектор экспрессии, описанный в данном документе, содержит дополнительные последовательности, которые делают этот вектор подходящим для репликации и интеграции в эукариотах. В одном варианте реализации изобретения, вектор экспрессии, описанный в данном документе, включает челночный вектор, что делает этот вектор подходящим для репликации и интеграции как в прокариотах, так и в эукариотах. В некоторых вариантах реализации изобретения, векторы клонирования содержат последовательности инициации транскрипции и трансляции (например, промоторы, энхансер) и терминаторы транскрипции и трансляции (например, сигналы полиаденилирования).

[0113] В одном варианте реализации изобретения, способ изготовления CTP-модифицированного полипептида, например, CTP-модифицированного hGH, включает стадию, включающую использование вектора экспрессии, причем указанный вектор экспрессии содержит промотор, кодирующую последовательность для CTP-модифицированного полипептида и последовательность полиаденилирования. В другом варианте реализации изобретения, кодирующая последовательность представлена в SEQ ID NO: 9. В другом варианте реализации изобретения, последовательность полиаделирования представляет собой последовательность полиаденилирования вируса обезьян (SV) 40.

[0114] В одном варианте реализации изобретения, множество эукариотических клеток может быть использовано в качестве хозяйских систем экспрессии для экспрессии описанных в данном документе полипептидов. В некоторых вариантах реализации изобретения, они включают, но не ограничиваются лишь этими: микроорганизмы, такие как дрожжи, трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжей, содержащими кодирующую полипептид последовательность; системы на основе растительных клеток, инфицированных векторами экспрессии на основе рекомбинантного вируса (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса мозаики табака, TMV) или трансформированных векторами экспрессии на основе рекомбинантных плазмид, таких как Ti-плазмида, содержащая кодирующую полипептид последовательность.

[0115] В одном варианте реализации изобретения, применяются небактериальные системы экспрессии (например, системы экспрессии на основе клеток млекопитающих, таких как клетки СНО или клетки, происходящие от клеток СНО), для экспрессии описанного в данном документе полипептида. В одном варианте реализации изобретения, вектор экспрессии, используемый для экспрессии полинуклеотидов, описанных в данном документе, в клетках млекопитающих, представляет собой вектор pCI-DHFR, содержащий промотор CMV и ген устойчивости к неомицину. В другом варианте реализации изобретения, клетки выращивают в виде клеточной адгезивной культуры. В другом варианте реализации изобретения, клетки выращивают в виде суспензионной культуры.

[0116] В одном варианте реализации изобретения, вектор экспрессии, описанный в данном документе, дополнительно содержит дополнительные полинуклеотидные последовательности, которые делают возможной, например, трансляцию нескольких белков из одной мРНК, такие как внутренний рибосомальный сайт входа (IRES - internal ribosome entry site), и последовательности для геномной интеграции промотор-химерного полипептида.

[0117] В некоторых вариантах реализации изобретения, векторы экспрессии млекопитающих включают, но не ограничиваются лишь этими: pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, pZeoSV2 (+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, PCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, которые доступны в Invitrogen, pCI, который доступен в Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV и pBK-CMV, которые доступны в Strategene, pTRES, который доступный в Clontech и их производных.

[0118] В некоторых вариантах реализации изобретения, векторы экспрессии, содержащие регуляторные элементы из вирусов эукариот, таких как ретровирусы, могут быть найдены в векторах, раскрытых в данном документе. SV40-векторы включают pSVT7 и pMT2. В некоторых вариантах реализации изобретения, векторы, полученные из вируса папилломы крупного рогатого скота, включают pBV-1MTHA, а векторы, полученные из вируса Эпштейна Бар, включают pHEBO и p2O5. Другие иллюстративные векторы включают pMSG, pAV009/A⁺, pMTO10/A⁺, pMAMneo-5, бакуловирусный pDSVE и любой другой вектор, делающий возможной экспрессию белков под управлением раннего промотора SV-40, позднего промотора SV-40, промотора металлотионеина, промотора вируса мышиной опухоли молочной железы, промотора вируса саркомы Рауса, промотора полиэдрина, или других промоторов, для которых доказана эффективность для экспрессии в эукариотических клетках.

[0119] В одном варианте реализации изобретения, различные способы могут быть применены для введения вектора экспрессии, кодирующего CTP-модифицированный hGH, описанного в данном документе, в клетки. «Трансфекция» эукариотических клеток-хозяев полинуклеотидом или экспрессирующим вектором, в результате которой получают генетически модифицированные клетки или трансгенные клетки, может быть выполнена любым способом, хорошо известным в данной области техники и описанным, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) and Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] и включают, например, стабильную или временную трансфекцию и электропорацию. Кроме того, смотрите патенты США № 5464764 и № 5487992 для положительно-отрицательных способов отбора. Способы трансфекции дополнительно включают, но не ограничиваются лишь этими: липосом-опосредованную трансфекцию, совместную преципитацию фосфатом кальция, электропорацию, поликатион (такой как DEAE-декстран)-опосредованую трансфекцию, трансфекцию протопластов, вирусные инфекции (включая рекомбинантные вирусные инфекции) и микроинъекцию. Предпочтительно трансфекция является стабильной трансфекцией. Предпочтительным является способ трансфекции, который обеспечивает оптимальную частоту трансфекции и экспрессию гетерологичных генов, кодирующих представляющий интерес пептид, описанный в данном документе, в конкретной линии и типе клеток-хозяев. Подходящие способы могут быть определены рутинными процедурами. Для получения стабильных трансфектантов конструкции либо интегрируют в геном клетки-хозяина или искусственную хромосому/минихромосому, либо локализируют эписомально для того, чтобы они стабильно поддерживались внутри клетки-хозяина.

[0120] Будут применятся способы, описанные в настоящем документе, если не указано иное, такие как обычные методы клеточной биологии, молекулярной биологии, клеточного культивирования, иммунологии и тому подобное, которые находятся в компетенции специалиста в данной области техники. Эти методы полностью раскрыты в современной литературе. Смотрите, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, updated); Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991); Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell et al. eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ. (1990); Wu et al., eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990); McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991); Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990); Freshney et al., eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1995); Melamed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990); Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (updated); Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells, in: Biotechnology Vol. 2, Pühler ed., VCH, Weinheim 663-744; серия Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.), и Harlow et al., eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987).

[0121] Представляющий интерес гетерологичный ген, кодирующий CTP-модифицированный hGH, описанный в данном документе, может быть введен в клетку, описанную в данном документе, различными способами, например, путем вирусной трансформации, трансфекции или микроинъекции. Представляющий интерес гетерологичный ген, может быть введен в клетку в виде линейной ДНК или как часть вектора экспрессии. Известен ряд эукариотических векторов экспрессии, которые допускают наличие множества сайтов клонирования для вставки одного или нескольких гетерологичных генов, и их экспрессию. Среди коммерческих поставщиков есть такие компании, как Stratagene, La Jolla, Калифорния, США; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США; Promega, Мэдисон, Висконсин, США или BD Biosciences Clontech, Пало-Альто, Калифорния, США. Трансфекцию клеток с помощью ДНК или вектора экспрессии, который кодирует(-уют) один или несколько генов интереса, проводят обычными способами, как описано, например, в Sambrook et al., 1989 или Ausubel et al., 1994. Подходящие способы трансфекции включают, например, липосом-опосредованную трансфекцию, совместную преципитацию фосфатом кальция, электропорацию, поликатион- (такой как DEAE-декстран)-опосредованую трансфекцию, трансфекцию протопластов, микроинъекцию и вирусные инфекции. Предпочтительно проводят стабильную трансфекцию, в которой молекулы ДНК либо интегрированы в геном клетки-хозяина или искусственную хромосому/минихромосому, либо содержатся эписомально в стабильном состоянии в клетке-хозяине. Предпочтительным является способ трансфекции, который дает оптимальную частоту трансфекции и экспрессию одного или более представляющих интерес гетерологичных генов, в клетке-хозяине. В одном варианте реализации изобретения, представляющий интерес ген кодирует CTP-модифицированный GH, как описано в данном документе.

[0122] В некоторых вариантах реализации изобретения, введение нуклеиновой кислоты путем вирусной инфекции дает ряд преимуществ по сравнению с другими способами, такими как липофекция и электропорация, поскольку из-за инфекционной природы вирусов может быть получена более высокая эффективность трансфекции.

[0123] В одном варианте реализации изобретения, следует понимать, что описанные в данном документе полипептиды также могут быть экспрессированы из конструкции нуклеиновой кислоты, введенной индивиду с применением любого подходящего способа введения, описанного выше (т.е. генной терапии in vivo). В одном варианте реализации изобретения, конструкцию нуклеиновой кислоты вводят в подходящую клетку с помощью подходящего носителя/способа доставки гена (трансфекция, трансдукция, гомологичная рекомбинация и т. д.), и, по мере необходимости, системы экспрессии, затем модифицированные клетки размножают в культуре и возвращают индивиду (т.е. генная терапия ex-vivo).

[0124] Гетерологичный ген интереса обычно функционально связан с промотором, который обеспечивает транскрипцию гена интереса, и с другими регуляторными элементами, которые обеспечивают транскрипцию и трансляцию (экспрессию) гена интереса, или повышают ее эффективность.

[0125] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «промотор» может включать полинуклеотидную последовательность, которая позволяет и контролирует транскрипцию генов или последовательностей, связанных с ней функционально. Промотор содержит последовательности распознавания для связывания РНК-полимеразы, и сайт инициации для транскрипции (сайт инициации транскрипции). Для того чтобы экспрессировать желаемую последовательность в определенном типе клетки или клетке-хозяине, должен быть выбран подходящий функциональный промотор. Специалист в данной области техники будет знаком с различными промоторами из различных источников, включая конститутивные, индуцируемые и подавляемые промоторы. Например, они депонируются в банках данных, таких как ГенБанк, и могут быть получены в виде отдельных элементов или элементов, клонированных в пределах полинуклеотидных последовательностей из коммерческих или отдельных источников. В индуцибельных промоторах активность промотора может быть уменьшена или увеличена в ответ на сигнал. Одним из примеров индуцибельного промотора является промотор тетрациклина (tet). Он содержит последовательности тетрациклинового оператора (tetO), который может быть индуцирован трансактиваторным белком (tTA), регулируемым тетрациклином. В присутствии тетрациклина связывание tTA с tetO ингибируется. Примерами других индуцибельных промоторов являются промотор jun, fos, металлотионеина и теплового шока (см. также Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Gossen, M. et al., Curr Opi Biotech 1994, 5, 516-520). Из промоторов, которые особенно подходят для высокой экспрессии у эукариот, выделяют, например, промотор убиквитин/S27a хомяка (WO 97/15664), ранний промотор SV 40, основной поздний промотор аденовируса, промотор металлотионеина-1 мыши, область длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса и ранний промотор цитомегаловируса человека. Примерами других гетерологичных промоторов млекопитающих являются промотор(ы) актина, иммуноглобулина или теплового шока.

[0126] Например, промотор может быть функционально связан с энхансерными последовательностями для увеличения активности транскрипции. Для этого можно использовать один или больше энхансеров и/или несколько копий энхансерной последовательности, например, энхансер CMV или SV40. Например, промотор может быть функционально связан с энхансерными последовательностями для увеличения активности транскрипции. Для этого можно использовать один или больше энхансеров и/или несколько копий энхансерной последовательности, например, энхансер CMV или SV40.

[0127] Специалист в данной области должен распознать, что термин «энхансер» обозначает полинуклеотидную последовательность, которая в цис-положении действует на активность промотора и, таким образом, стимулирует транскрипцию гена, функционально связанного с этим промотором. В отличие от промоторов, эффект энхансеров не зависит от положения и ориентации, и поэтому они могут располагаться перед транскрипционной единицей или за ней, внутри интрона или даже внутри кодирующей области. Энхансер может быть расположен как в непосредственной близости от транскрипционной единицы, так и на значительном удалении от промотора. Также является возможным физическое и функциональное перекрытие с промотором. Специалист в данной области техники будет осведомлен о множестве энхансеров из различных источников (и они депонированы в банках данных, таких как ГенБанк, например, энхансеры SV40, энхансеры ЦМВ, энхансеры полиомы, энхансеры аденовируса), которые доступны в качестве независимых элементов, или элементов, клонированных в пределах полинуклеотидных последовательностей (например, депонированных в АТСС или из коммерческих и индивидуальных источников). Ряд промоторных последовательностей также содержит энхансерные последовательности, такие как часто используемый промотор CMV. Энхансер ЦМВ человека является одним из самых сильных энхансеров, идентифицированных до сих пор. Одним из примеров индуцибельного энхансера является энхансер металлотионеина, который может стимулироваться глюкокортикоидами или тяжелыми металлами.

[0128] В основном, регуляторные элементы включают промоторы, энхансеры, сигналы терминации и полиаденилирования и другие элементы управления экспрессией. Как индуцибельные, так и конститутивно регуляторные последовательности являются известными для различных типов клеток. «Элементы, регулирующие транскрипцию», как правило, включают: промотор перед последовательностью гена, который должен быть экспрессирован, сайты инициации транскрипции и терминации, и сигнал полиаденилирования.

[0129] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «сайт инициации транскрипции» может включать нуклеиновую кислоту в конструкции, которая соответствует первой нуклеиновой кислоте, которая включена в первичный транскрипт, то есть мРНК-предшественник. Сайт инициации транскрипции может перекрываться с последовательностями промотора.

[0130] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «сайт терминации транскрипции» может включать нуклеотидную последовательность, которая обычно находится на 3'-конце гена интереса, или секцию гена, которая должна быть транскрибирована, и которая приводит к прекращению транскрипции РНК-полимеразой.

[0131] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «сигнал полиаденилирования» включает понятие сигнальной последовательности, которая вызывает расщепление в определенном месте на 3'-конце эукариотической мРНК и посттранскрипционное добавление последовательности из примерно 100-200 адениновых нуклеотидов (polyA tail) к 3'-концу в месте расщепления. Сигнал полиаденилирования содержит последовательность AATAAA, на растоянии примерно 10-30 нуклеотидов перед сайтом расщепления и последовательность, расположенную ниже ее. Известны различные полиаденилирующие элементы, такие как tk polyA, поздний и ранний polyA SV40, или polyA BGH (описанные, например, в патенте США № 5122458).

[0132] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «элементы, регулирующие трансляцию» может включать сайт инициации трансляции (AUG), стоп-кодон и сигнал polyA для каждого экспрессируемого полипептида. Для оптимальной экспрессии может быть целесообразно удалить, добавить или изменить 5'- и/или 3'-нетранслируемые области нуклеотидной последовательности, которая должна быть экспрессирована, с целью устранения любых потенциально неподходящих дополнительных кодонов инициации трансляции или других последовательностей, которые могут повлиять на экспрессию на уровне транскрипции или экспрессии. Чтобы поспособствовать экспрессии, рибосомальные консенсусные сайты связывания могут альтернативно быть вставлены непосредственно перед стартовым кодоном. Для получения секретируемого полипептида, представляющий интерес ген обычно содержит сигнальную последовательность, которая кодирует сигнальный пептид-предшественник, который транспортирует синтезированный полипептид в мембрану ЭР (эндоплазматический ретикулюм) и через нее. Сигнальная последовательность часто, но не всегда находится на аминоконце секретируемого белка и отщепляется сигнальными пептидазами после того, как белок был профильтрован через мембрану ЭР. Последовательность гена, обычно, но не обязательно, содержит свою собственную сигнальную последовательность. Если нативная сигнальная последовательность отсутствует, гетерологичная сигнальная последовательность может быть введена известным образом. Многочисленные сигнальные последовательности такого типа известны специалисту в данной области техники, и они депонированы в банках данных последовательностей, таких как ГенБанк и EMBL.

[0133] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «полипептиды», «полипептид» или их грамматические эквиваленты, используют для обозначения аминокислотных последовательностей или белков, и он включает полимеры аминокислот любой длины. Этот термин также включает белки, которые были посттрансляционно модифицированы с помощью реакций, таких как гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование или процесинг белка. Структура полипептида может быть модифицирована, например, заменами, делециями или вставками аминокислот, и слиянием с другими белками при сохранении его биологической активности.

[0134] Для получения одного или нескольких продуктов гена, представляющих интерес в клетках, клетки можно выращивать в бессывороточной культуральной среде и в суспензионной культуре при условиях, которые делают возможной экспрессию представляющего интерес гена. Если, например, ген интереса находится под контролем конститутивного промотора, нет необходимости добавлять специальные индукторы. Если экспрессия гена интереса происходит под контролем индуцируемого промотора то, например, в культуральную клеточную среду должен быть добавлен соответствующий индуктор в достаточной, но нетоксичной концентрации. По желанию, может быть увеличено количество клеток с помощью множественного субпассирования и переноса в подходящие сосуды для культивирования клеток. Продукт(ы) гена получают или производят как клеточный, связанный с мембраной или секреторный продукт.

[0135] В одном варианте реализации изобретения, стадия изготовления CTP-модифицированного hGH, раскрытого в данном документе, включает стабильную трансфекцию заданного количества клеток вектором экспрессии, содержащим кодирующую часть, кодирующую CTP-модифицированный hGH, раскрытый в данном документе. В другом варианте реализации изобретения, нуклеотидная последовательность кодирующей части представлена в SEQ ID NO: 9. В другом варианте реализации изобретения, стадия изготовления CTP-модифицированного hGH включает стабильную трансфекцию клеток вектором экспрессии, содержащим кодирующую часть, что кодирует указанный CTP-модифицированный hGH. В одном варианте реализации изобретения, клетки являются клетками СНО. В другом варианте реализации изобретения, клетки являются клетками DG44. В другом варианте реализации изобретения, клетки являются любыми клетками, известными в данной области техники, подходящими для экспрессии и секреции CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, вектор экспрессии представляет собой вектор экспрессии pCI-dhfr-MOD-23 (Фиг. 2). В другом варианте реализации изобретения, трансфицированные клетки экспрессируют CTP-модифицированный hGH, описанный в данном документе. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH, что был изготовлен и экспрессирован, состоит из двух карбокси-концевых пептидов гонадотропина хориона, прикрепленных к карбоксильному концу указанного hGH, и одного карбокси-концевого пептида гонадотропина хориона, прикрепленного к аминоконцу указанного hGH, причем аминокислота последовательность экспрессированного несозревшего CTP-модифицированного hGH представлена в SEQ ID NO: 4. В другом варианте реализации изобретения, созревший CTP-модифицированный hGH, что был изготовлен и экспрессирован и секретирован, состоит из двух карбокси-концевых пептидов гонадотропина хориона, прикрепленных к карбоксильному концу указанного hGH, и одного карбокси-концевого пептида гонадотропина хориона, прикрепленного к аминоконцу указанного hGH, причем аминокислота последовательность экспрессированного и секретированого созревшего CTP-модифицированного hGH представлена в SEQ ID NO: 7. В другом варианте реализации изобретения, экспрессия CTP-модифицированного hGH находится на высоком уровне экспрессии. В другом варианте реализации изобретения, указанный CTP-модифицированный hGH является сильно гликозилированым. В другом варианте реализации изобретения, указанный CTP-модифицированный hGH является сильно сиалилированным. Как описано выше более подробно, CTP-модифицированный hGH может иметь различные паттерны гликозилирования и гликозидный состав. CTP-модифицированный hGH, изготовленный способами, описанными в данном документе, может включать любой из паттернов гликозилирования и состав гликозидов, как описано выше. В общем, как правило, представленный в данном документе способ изготовления относиться к CTP-модифицированному hGH, имеющему высокое содержание гликозилирования и высокий процент гликозилированных сайтов гликозилирования.

[0136] В одном варианте реализации изобретения, этап изготовления CTP-модифицированного hGH включает получение клонов клеток, которые сверхэкспрессируют CTP-модифицированный hGH. В другом варианте реализации изобретения, экспрессия CTP-модифицированного hGH является оптимальной. В одном варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 200 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 300 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 400 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 500 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 600 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 700 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 800 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 900 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 1 г/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет, по меньшей мере, 1,2 г/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 1,4 г/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 1,6 г/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 1,8 г/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 2 г/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 2,2 г/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 2,4 г/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 2,6 г/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 2,8 г/л. В другом варианте реализации изобретения, уровень экспрессии составляет по меньшей мере 3 г/л. В другом варианте реализации изобретения, клоны на стадии б) размножают в среде для того, чтобы сформировать банк стоковых клеток (MCB - master cell bank) и банк рабочих клеток (WCB - working cell bank). В одном варианте реализации изобретения, клоны на этапе в) получают из MCB. В другом варианте реализации изобретения, клоны на стадии в) получают из WCB.

[0137] Зрелый CTP-модифицированный продукт полипептида hGH, описанный в данном документе, получают из клеточной культуральной среды в виде секретируемого продукта гена. Специалист в данной области техники распознает, что секретируемый продукт гена не будет иметь сигнального пептида, содержащегося в полноразмерном продукте трансляции, и кодируемого в нуклеотидной последовательности. Однако, если белок или полипептид экспрессируется без сигнала секреции, генный продукт также может быть выделен из клеточных лизатов. Для получения чистого гомогенного продукта, который по существу не содержит других рекомбинантных белков и белков клетки-хозяина, проводят обычные процедуры очистки. Прежде всего, клетки и клеточный дебрис часто удаляют из культуральной среды или лизата. Затем желаемый продукт гена может быть освобожден от загрязнения растворимыми белками, полипептидами и нуклеиновыми кислотами, например, путем фракционирования на иммуноаффинных и ионообменных колонках, осаждением этанолом, ВЭЖХ с обращенной фазой или хроматографией на Sephadex, гидроксиапатите, кремнеземе или катионообменной смоле, такой как DEAE ( см. Примеры в данном документе). Способы, известные в данной области техники и результатом которых является очистка гетерологичного белка, экспрессированного рекомбинантными клетками-хозяевами, являются известными специалисту и описаны в литературе, например, (Harris et al., Protein Purification: A Practical Approach, Pickwood and Hames, eds., IRL Press, Oxford, 1995) и Scopes (Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, 1988). Эти способы могут быть использованы целиком или частично в описанных в данном документе способах. На основе предложенной в данном документе методологии, специалист в данной области техники оценит, и сможет адаптировать и модифицировать применение конкретных методик хроматографии на основе потребностей и знаний в данной области техники. Например, специалист в данной области техники может выбрать альтернативную катионообменную колонку вместо колонки DEAE, причем будет сохранена цель - разделение путем катионного обмена. Подобные альтернативы, известные в данной области техники, будут распознаны специалистом в данной области техники для фракционирования, иммуноаффинирования, осаждения белка, осаждения нуклеиновой кислоты, осаждения этанолом, ВЭЖХ с обращенной фазой или хроматографии на Sephadex, гидроксиапатите, диоксиде кремния, анионообменной или катионообменной смоле.

[0138] В другом варианте реализации изобретения, раскрытом в данном документе, представлен способ приготовления одного или нескольких продуктов в клетках млекопитающего в условиях без сыворотки, характеризующийся тем, что: а) клетки млекопитающих содержат ген, который кодирует CTP-модифицированный полипептид hGH, раскрытый в данном документе; б) клетки млекопитающих выращивают в условиях без сыворотки, которые делают возможной репликацию клеток млекопитающего; в) в каждом случае по меньшей мере одну (1) из этих клеток млекопитающего помещают в сосуд для культивирования клеток в условиях без сыворотки; г) подходящим образом размещенные клетки млекопитающего реплицируют в условиях без сыворотки; д) реплицированные клетки культивируют в условиях без сыворотки, в которых экспрессируется ген, и секретируется CTP-модифицированный hGH ; и е) продукт гена затем выделяют из супернатанта культуры и очищают (смотреть Примеры в данном документе). В другом варианте реализации изобретения, способ изготовления включает клоны, что экспрессируют и секретируют CTP-модифицированный полипептид hGH. В другом варианте реализации этого процесса, клетка млекопитающего представляет собой трансфицированную клетку млекопитающего, в которую был введен ген интереса. Соответственно, способ получения продуктов рекомбинантных генов, описанный в данном документе, может характеризоваться тем, что перед стадией а) описанного выше процесса, клетки млекопитающего трансфицируют нуклеиновой кислотой, которая, по меньшей мере, кодирует ген, представляющий интерес. Предпочтительной является стабильная трансфекция соответствующей клетки млекопитающего.

[0139] Примеры бессывороточной, безбелковой или химически определенной среды включают, например, коммерчески доступную среду F12 Хамса (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI 1640 (Sigma), модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM, Sigma), минимальную основную среду (MEM; Sigma), модифицированную среду Дульбекко Искова (IMDM; Sigma), CDCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, США), CHO-S-SFMII (Invitrogen), среду без CHO (Sigma), среду CD-PowerCHO2 (Lonza) и белковую среду CHO (Sigma). Каждая из этих сред может по желанию быть дополнена различными соединениями, такими как гормоны и/или другие факторы роста (например, инсулин, трансферрин, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста), соли (например, хлорид натрия, кальций, магний, фосфат), буферы (например, HEPES), нуклеозиды (например, аденозин, тимидин), глутамин, глюкоза или другие эквивалентные питательные вещества, антибиотики и/или микроэлементы или коммерчески доступные корма, такие как Power Feed A (Lonza) или Cell Boost 6 (HyCLone). Если реплицируемые клетки являются рекомбинантными клетками, которые экспрессируют один или больше маркеров отбора, один или больше подходящих селективных агентов, таких как антибиотики, также могут быть добавлены к среде.

[0140] Понятно, что помимо содержания необходимых элементов для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности (кодирующей полипептид), конструкция экспрессии, раскрытая в данном документе, может также включать последовательности, сконструированные для оптимизации стабильности, продуцирования, очистки, выхода или активности экспрессированного полипептида.

[0141] В некоторых вариантах реализации изобретения, трансформированные клетки культивируют при эффективных условиях, которые обеспечивают экспрессию больших количеств рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах реализации изобретения, эффективные условия культивирования включают, но не ограничиваются лишь этими: эффективная среда, биореактор, температура, рН и кислородные условия, которые позволяют производить белок. В одном варианте реализации изобретения, эффективная среда может включать любую среду, в которой клетка культивируется для получения описанного в данном документе рекомбинантного полипептида. В некоторых вариантах реализации изобретения, среда обычно включает водный раствор, содержащий усвояемый углерод, источники азота и фосфата, а также соответствующие соли, минералы, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины. В некоторых вариантах реализации изобретения, раскрытые в данном документе клетки могут культивировать в обычных ферментационных биореакторах, встряхиваемых колбах, пробирках, микротитрационных чашках и чашках Петри. В некоторых вариантах реализации изобретения, культивирование проводят при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантной клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения, условия культивирования находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники.

[0142] В одном варианте реализации изобретения, условия культивирования включают содержание растворенного кислорода (DO - dissolved oxygen) примерно в количестве 20-80%. В другом варианте реализации изобретения, содержание DO составляет около 20-30%. В другом варианте реализации изобретения, содержание DO составляет около 30-40%. В другом варианте реализации изобретения, содержание DO составляет около 40-50%. В другом варианте реализации изобретения, содержание DO составляет около 50-60%. В другом варианте реализации изобретения, содержание DO составляет около 60-70%. В другом варианте реализации изобретения, содержание DO составляет около 70-80%.

[0143] В одном варианте реализации изобретения, условия культивирования включают рН со стартовым значением при одной температуры, и смещающимся к другому в течение процесса производства. В другом варианте реализации изобретения, стартовое значение рН составляет около 7,3 и сдвигается к около 6,7 во время инкубации в биореакторе. В другом варианте стартовое значение рН составляет около 7,3, около 7,2 или около 7,1 и сдвигается к около 6,7, около 6,8, около 6,9 или к около 7,0 во время инкубации в биореакторе. Каждая возможность представляет собой вариант реализации изобретения, раскрытый в данном документе.

[0144] В некоторых вариантах реализации изобретения, в зависимости от системы вектора и хозяина, используемой для производства, результирующие полипептиды, описанные в данном документе, или остаются в рекомбинантной клетке, или секретируются в среду.

[0145] В одном варианте реализации изобретения, после нахождения предопределенное время в культуре, проводят изъятие рекомбинантного полипептида.

[0146] Специалисту в данной области техники будет понятно, что выражение «изъятие рекомбинантного полипептида» может включать сбор всей среды, содержащей полипептид, и может включать дополнительные стадии разделения или очистки.

[0147] В одном варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе полипептиды очищают с применением различных стандартных способов очистки белка, таких как перечисленные ниже, но не ограничиваясь лишь этими: аффинная хроматография, ионообменная хроматография, фильтрация, электрофорез, хроматография с гидрофобным взаимодействием, гельфильтрационная хроматография, хроматография с обращенной фазой, хроматография с конканавалином A, хроматография на гидроксиапатите, хроматофокусировка и дифференциальная солюбилизация.

[0148] В одном варианте реализации изобретения, каждая колонка запускается при контролируемой или неконтролируемой температурой.

[0149] В одном варианте реализации изобретения, для того, чтобы облегчить восстановление, экспрессированная кодирующая последовательность может быть сконструирована для кодирования описанного в данном документе полипептида и слита с отщепляемой частью. В одном варианте реализации изобретения, гибридный белок сконструирован так, что полипептид может быть легко выделен с помощью аффинной хроматографии; например, путем иммобилизации на колонке, специфичной к отщепляемой части. В одном варианте реализации изобретения, сайт расщепления встроен между полипептидом и отщепляемой частью, и полипептид может быть высвобожден из хроматографической колонки путем обработки подходящим ферментом или веществом, который(-ое) специфически расщепляет гибридный белок белок в этом сайте [например, смотрите Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); и Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].

[0150] В одном варианте реализации изобретения, описанный в данном документе полипептид получают в «по существу чистой» форме.

[0151] Специалисту в данной области техники будет понятно, что фраза «по существу чистая» может включать чистоту, которая позволяет эффективно использовать белок в описанных в данном документе применениях. Такая форма может также включать высокогликозилированные и высокосиалилированные формы, также раскрытые в данном документе.

[0152] В одном варианте реализации изобретения, описанный в данном документе полипептид синтезируют с использованием систем экспрессии in vitro. В одном варианте реализации изобретения, способы синтеза in vitro хорошо известны в данной области техники, и компоненты системы являются коммерчески доступными.

[0153] В одном варианте реализации изобретения, осуществляют изготовление GH, модифицированного CTP, с использованием технологии рекомбинантной ДНК.

[0154] В некоторых вариантах реализации изобретения, рекомбинантные полипептиды синтезируют и очищают; их терапевтическая эффективность может быть проанализирована как in vivo, так и in vitro. В одном варианте реализации изобретения, активности связывания рекомбинантного GH, модифицированного CTP, раскрытого в данном документе, могут быть определены с использованием различных анализов.

[0155] В одном варианте реализации изобретения, способ изготовления CTP-модифицированного hGH, описанного в данном документе, включает этап получения клонов, которые оптимально экспрессируют и секретируют упомянутый CTP-модифицированный hGH из упомянутого WCB, и увеличения количества указанных клонов. В другом варианте реализации изобретения, способ изготовления CTP-модифицированного hGH включает этап получения клонов, которые оптимально экспрессируют и секретируют упомянутый CTP-модифицированный hGH из указанного MCB, и увеличения количества указанных клонов. В другом варианте реализации изобретения, способ изготовления включает клоны, что отимально экспрессируют и секретируют CTP-модифицированный hGH. В другом варианте реализации изобретения, клеточные клоны размножают в растворе с помощью серии субкультивирующих стадий до уровня промышленного биореактора. В другом варианте реализации изобретения, раствор, содержащий указанные суб-культивированные клоны, высевают в биореактор. В другом варианте реализации изобретения, биореактор представляет собой одноразовый биореактор. В другом варианте реализации изобретения, биореактор включает: биореактор из нержавеющей стали, биореактор возвратно-поступательного движения, такой как система Wave от GE, перфузионный биореактор или любую другую биореакторную систему, известную в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения, изъятие клеток из биореактора осуществляется с использованием одноразовой системы фильтров. Если проводиться крупномасштабное производство, перед применением фильтрующей системы возможно применение непрерывного центрифугирования.

[0156] В одном варианте реализации изобретения, клеточные клоны дополнительно размножают или увеличивают их количество путем последовательного культивирования указанных клеток в биореакторах, размер которых увеличивают до достижения желаемого масштаба. В другом варианте реализации изобретения, биореактор запускают в режиме периодического культивирования с подпиткой. В другом варианте реализации изобретения, биореактор запускают в режиме периодической загрузки. В другом варианте реализации изобретения, биореактор запускают в режиме повторяющейся периодической загрузки. В другом варианте реализации изобретения, биореактор запускают в перфузионном режиме. Каждая возможность, описанная выше, является другим вариантом реализации изобретения.

[0157] Пиковая жизнеспособная плотность клеток различается в зависимости от типа используемого биореактора. В одном варианте реализации изобретения, пиковая жизнеспособная плотность клеток биореактора, используемого в способах изготовления, описанных в данном документе, составляет около 0,2 × 10^6-1,4 × 10⁶ клеток/мл. В другом варианте реализации изобретения, пиковая жизнеспособная плотность клеток биореактора, используемого в способах изготовления, описанных в данном документе, составляет около 0,05 × 10^6-100 × 10⁶ клеток/мл. В другом варианте реализации изобретения, пиковая жизнеспособная плотность клеток биореактора составляет около 0,05 × 10^6-0,5 × 10⁶. В другом варианте реализации изобретения, пиковая жизнеспособная плотность клеток биореактора составляет около 0,5 × 10^6-5 × 10⁶. В другом варианте реализации изобретения, пиковая жизнеспособная плотность клеток биореактора составляет около 5,0 × 10^6-50 × 10⁶. В другом варианте реализации изобретения, пиковая жизнеспособная плотность клеток биореактора составляет около 50 × 10^6-100 × 10⁶. Каждая возможность представляет собой отдельные варианты реализации изобретения, раскрытые в данном документе.

[0158] Схемы подачи питания для использования биореактора могут быть разными, например, повторное ежедневное кормление с определенного дня или фиксированное через несколько дней, кроме того, % добавленного корма может отличаться - от нескольких % до даже 50% или более. Каждая возможность представляет собой вариант реализации изобретения, раскрытый в данном документе.

[0159] В биореактор может быть добавлен ДМСО в различных концентрациях, как известно в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения, в биореактор добавляют 0,1-3% ДМСО во время его использования. В другом варианте реализации изобретения, добавляют 0,1-0,5% ДМСО. В другом варианте реализации изобретения, добавляют 0,5-1,0% ДМСО. В другом варианте реализации изобретения, добавляют 1,0-1,5% ДМСО. В другом варианте реализации изобретения, добавляют 1,5-2,0% ДМСО. В другом варианте реализации изобретения, добавляют 2,0-2,5% ДМСО. В другом варианте реализации изобретения, добавляют 2,5-3,0% ДМСО.

[0160] В одном варианте реализации изобретения, способ изготовления CTP-модифицированного hGH включает этап очистки очищенного собранного «урожайного» раствора, чтобы получить очищенный белковый раствор. В другом варианте реализации изобретения, очищенный белковый раствор, полученный с использованием способов, представленных в данном документе, содержит по меньшей мере 40% CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, очищенный белковый раствор содержит по меньшей мере 50% CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, очищенный белковый раствор содержит по меньшей мере 60% CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, очищенный белковый раствор содержит по меньшей мере 70% CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, очищенный белковый раствор содержит по меньшей мере 80% CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, очищенный белковый раствор содержит по меньшей мере 90% CTP-модифицированного hGH.

[0161] В одном варианте реализации изобретения, очищенный собранный продукт выдерживают до 24 часов при температуре 2-25 ° С. В другом варианте реализации изобретения, очищенный собранный продукт хранят при температуре 5 ° С в течение одного месяца.

[0162] В одном варианте реализации изобретения, очищенный собранный продукт, полученный на стадии д), тестируют на бионагрузку, бактериальный эндотоксин, конкретное содержание белка, остаточную ДНК, вирусы, вирусоподобные частицы и/или микоплазму, или любую их комбинацию.

[0163] В одном варианте реализации изобретения, очистка очищенного собранного продукта на стадии (f) осуществляется путем последовательного выполнения этапов, включающих: (g) концентрирование, диафильтрацию и очистку указанного очищенного собранного раствора продукта, причем указанное концентрирование, диафильтрация и очистка осуществляются с помощью кассеты с полыми волокнами или кассеты тангенциального потока, с последующим прохождением указанного очищенного собранного раствора продукта через анионообменную колонку и колонку с гидрофобным взаимодействием; (h) получение указанного очищенного собранного продукта, полученного на следующем этапе; (i) и инактивацию вирусов, присутствующих в указанном очищенном собранном продукте, путем инкубации в растворе, токсичном для указанных вирусов; (j) получение указанного очищенного раствора собранного продукта из (h) и концентрирование, диафильтрация и очистка указанного очищенного раствора собранного продукта, причем после указанного концентрирования, диафильтрации и очистки следует последовательное пропускание указанного очищенного собранного продукта через колонку с гидроксиапатитом в смешанном режиме и катионообменную колонку; (j) получение указанного очищенного раствора собранного продутка после этапа (i) и физическое удаление вирусов из указанного очищенного собранного раствора путем нанофильтрации; (k) получения указанного очищенного раствора собранного продукта после стадии (j) и концентрирования, диафильтрации и очистки указанного очищенного раствора собранного продукта для получения максимально очищенного собранного продукта, содержащего указанную высокогликозилированную форму CTP-модифицированных полипептидов. В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы включают стадию центрифугирования перед окончательной фильтрацией. Специалисту в данной области техники будет понятно, что как центрифугирование, так и фильтрация являются методами очистки раствора.

[0164] В одном варианте реализации изобретения, ультрафильтрация и диафильтрация для концентрирования и фильтрации очищенного собранного продукта могут выполняться с использованием половолоконного картриджа или эквивалентной стадии UFDF (УФДФ) на основе TFF. Номинальная молекулярная масса отсечения картриджа составляет 10000 кДа. В другом варианте реализации изобретения, мембранный картридж может соответствовать мембранам PES/PS/RC с отсечением от 3 кДа до 30 кДа.

[0165] В другом варианте реализации изобретения, анионообменная колонка стадии (g) является колонкой DEAE-Sepharose Fast Flow. В другом варианте реализации изобретения, колонка DEAE очищает высокогликозилированную форму s CTP-модифицированного hGH, описанную в данном документе. В одном варианте реализации изобретения, чем выше гликозилирование, тем лучше фармакодинамика CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, анионообменная колонка может включать другие анионообменные колонки, известные в данной области техники, например, анионообменную колонку Capto DEAE или другие смолы, такие как Eshmuno Q.

[0166] В одном варианте реализации изобретения, гидрофобная колонка на стадии (g) представляет собой колонку хроматографии гидрофобного взаимодействия c фенилом (HIC). Количество циклов использования HIC с фенилом может составлять от около 1 до 10. В одном варианте реализации изобретения, выполняют 1-3 цикла. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-5 циклов. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-6 циклов. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-7 циклов. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-8 циклов. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-9 циклов. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-10 циклов. В другом варианте реализации изобретения, буферы, известные в данной области техники, используются для промывки и элюирования. В одном варианте реализации изобретения, элюирующий буфер содержит сульфат аммония с пропиленгликолем. В одном варианте реализации изобретения, элюирующий буфер содержит сульфат аммония с этиленгликолем.

[0167] В одном варианте реализации изобретения, гидроксиапатитная колонка комбинированого режима содержит колонку комбинированого режима с керамическим гидроксиапатитом (CHT - ceramic hydroxyapatite). Количество циклов использования CHT может составлять от около 1 до 10. В одном варианте реализации изобретения, выполняют 1-3 цикла. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-5 циклов. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-6 циклов. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-7 циклов. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-8 циклов. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-9 циклов. В другом варианте реализации изобретения, выполняют 1-10 циклов. Элюирование из колонны CHT может выполняться в пределах около 3-10 объемов колонки (CV - column volumes). В одном варианте реализации изобретения, элюирование проводят с около 3 CV. В другом варианте реализации изобретения, элюирование проводят с около 4 CV. В другом варианте реализации изобретения, элюирование проводят с около 5 CV. В другом варианте реализации изобретения, элюирование проводят с около 6 CV. В другом варианте реализации изобретения, элюирование проводят с около 7 CV. В другом варианте реализации изобретения, элюирование проводят с около 8 CV. В другом варианте реализации изобретения, элюирование проводят с около 9 CV. В другом варианте реализации изобретения, элюирование проводят с около 10 CV.

[0168] В одном варианте реализации изобретения, вирусы, которые могут присутствовать в очищенном собранном продукте из-за загрязнения, инактивируют в очищенном собранном продукте. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 1% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 0,1-2% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 0,2% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 0,5% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 1-4% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 0,2-0,5% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 0,5-1,0% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 2% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 3% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 4% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусы инактивируют с применением 5-10% раствора Triton-X 100. В другом варианте реализации изобретения, вирусная инактивация в растворе Triton-X 100 продолжается около 0,5-24 часов. В другом варианте реализации изобретения, вирусная инактивация в растворе Triton-X 100 продолжается около 0,5-1 часа. В другом варианте реализации изобретения, вирусная инактивация в растворе Triton-X 100 продолжается около 1-2 часов. В другом варианте реализации изобретения, вирусная инактивация в растворе Triton-X 100 продолжается около 2-3 часов. В другом варианте реализации изобретения, вирусная инактивация в растворе Triton-X 100 продолжается около 3-4 часов. В другом варианте реализации изобретения, вирусная инактивация в растворе Triton-X 100 продолжается около 4-6 часов. В другом варианте реализации изобретения, вирусная инактивация в растворе Triton-X 100 продолжается около 6-8 часов. В другом варианте реализации изобретения, вирусная инактивация в растворе Triton-X 100 продолжается около 8-10 часов. В другом варианте реализации изобретения, вирусная инактивация в растворе Triton-X 100 продолжается около 10-12 часов. В другом варианте реализации изобретения, вирусная инактивация в растворе Triton-X 100 продолжается около 12-24 часов.

[0169] Специалисту в данной области техники будет понятно, что в описанных в данном документе способах могут использоваться другие концентрации или другие растворы, доступные в данной области техники, и которые являются токсичными для этих вирусов, включая, но не ограничиваясь лишь этими: холат натрия и Tween 80. В другом варианте реализации изобретения, смесь три-н-бутилфосфата (TNBP - Tri-n-butyl phosphate) и полисорбата 80 (Tween 80) применяют для инактивации вируса на стадии (h). В другом варианте реализации изобретения, способы инактивации вирусов включают снижение рН. Специалисту в данной области техники будет понятно, что инактивация вирусов может включать изменяющиеся условия раствора, как известно в данной области техники.

[0170] В одном варианте реализации изобретения, вирусы физически удаляют с применением нанофильтрации. Специалисту в данной области техники будет понятно, что любой фильтр, известный в данной области техники для удаления вирусов, может быть применен в способах, описанных в данном документе. В другом варианте реализации изобретения, нанофильтрацию осуществляют с применением фильтрующего картриджа Planova или катриджа похожего типа (1-60 мм²). После таких способов следует подтверждение удаления вируса из очищенного собранного продукта с помощью способов, известных в данной области техники.

[0171] В одном варианте реализации изобретения, катионообменная колонка на стадии (i) в данном документе представляет собой колонку SP-Sepharose Fast Flow. В другом варианте реализации изобретения, катионообменная колонка включает CM sepharose Capto S. В другом варианте реализации изобретения, катионообменная колонка включает любые известные в данной области техники для цели в данном документе.

[0172] В одном варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы достигают, по меньшей мере, 20% уровня извлечения высокогликозилированного CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, способы обеспечивают уровень извлечения, по меньшей мере, 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,9% уровень извлечения высокогликозилированного CTP-модифицированного hGH.

[0173] В одном варианте реализации изобретения, после очистки высокогликозилированного CTP-модифицированного hGH, описанного в данном документе, способы, раскрытые в данном документе, дополнительно включают оценивание указанного CTP-модифицированного полипептида. В другом варианте реализации изобретения, определяют чистоту CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, определяют содержание гликозилирования. В другом варианте реализации изобретения, определяют заполнение сайтов гликозилирования. В одном варианте реализации изобретения, чистота, содеражание гликозилирования и заполнение сайта гликозилирования определяются в изготовленном CTP-модифицированном hGH.

[0174] В другом варианте реализации изобретения, клоны клеток, используемые в описанных в данном документе способах, хранят в банке замороженных клеток. В другом варианте реализации изобретения, клоны клеток хранят в банке лиофилизированных клеток.

[0175] В другом варианте реализации изобретения, банк клеток способов и композиций, описанных в данном документе, представляет собой банк стоковых клеток. В другом варианте реализации изобретения, банк клеток представляет собой банк рабочих клеток. В другом варианте реализации изобретения, банк клеток представляет собой банк клеток «Хорошей Производственной Практики» (GMP - Good Manufacturing Practice). В другом варианте реализации изобретения, банк клеток предназначен для производства материала клинического качества. В другом варианте реализации изобретения, банк клеток соответствует нормативным требованиям для использования человеком. В другом варианте реализации изобретения, банк клеток представляет собой любой другой тип банка клеток, известный в данной области техники.

[0176] «Надлежащие производственные практики», в другом варианте варианте реализации изобретения, определяются (21 CFR 210-211) Кодексом федеральных правил Соединенных Штатов. В другом варианте реализации изобретения, «Надлежащие производственные практики» определяются другими стандартами для производства материала клинического качества или для потребления человеком; например, стандарты другой страны, помимо Соединенных Штатов.

[0177] В другом варианте реализации изобретения, среда, используемая для размножения клеток, содержит метотрексат (MXT). В другом варианте реализации изобретения, среда представляет собой среду, не содержащую метотрексата. В другом варианте реализации изобретения, концентрация MXT, присутствующая в среде, составляет около 0,1-2 мкМ. В другом варианте реализации изобретения, концентрация MXT, присутствующая в среде, составляет около 0,1-0,5 мкМ. В другом варианте реализации изобретения, концентрация MXT, присутствующая в среде, составляет около 0,5-1,0 мкМ. В другом варианте реализации изобретения, концентрация MXT, присутствующая в среде, составляет около 1,0-1,5 мкМ. В другом варианте реализации изобретения, концентрация MXT, присутствующая в среде, составляет около 1,0-2,0 мкМ. Понятно, что термин «среда» может включать жидкость, или гель, или порошок, который подходит для выращивания или культивирования клеток, содержащих CTP-модифицированный hGH, раскрытый в данном документе. Такая среда может альтернативно упоминаться как «среда для выращивания» или «культуральная среда» и может включать, но не ограничивается лишь этими: питательные среды, обогащенные среды, минимальные среды, дифференциальные среды, транспортные среды или селективные среды. В дополнительном аспекте, селективная среда может быть подходящей для отбора конкретной группы клеток во время производственного процесса.

[0178] В одном варианте реализации изобретения, очищенный белковый раствор содержит по меньшей мере 70% CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, очищенный белковый раствор содержит по меньшей мере 80% CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, очищенный раствор содержит по меньшей мере 90-95% CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, очищенный раствор содержит 95,1-99,9% CTP-модифицированного hGH. В другом варианте реализации изобретения, очищенный раствор содержит 100% CTP-модифицированного hGH.

[0179] В одном варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH, описанный в данном документе, сильно гликозилирован. Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «высокогликозилированный», когда речь идет о собранных CTP-модифицированных полипептидах hGH, присутствующих в собранном продукте, может включать уровень гликозилирования около 60-80% от общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH очищенного раствора. (См., например, как измерено с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой на Фиг.11). В другом варианте реализации изобретения, собранный продукт, содержащий высокогликозилированный CTP-модифицированный hGH, имеет уровень гликозилирования по меньшей мере 50% CTP-модифицированных полипептидов hGH в очищенном растворе. В другом варианте реализации изобретения, собранный продукт, содержащий высокогликозилированный CTP-модифицированный hGH, имеет уровень гликозилирования по меньшей мере 60% CTP-модифицированных полипептидов hGH в очищенном растворе. В другом варианте реализации изобретения, собранный продукт, содержащий высокогликозилированный CTP-модифицированный hGH, имеет уровень гликозилирования по меньшей мере 70% CTP-модифицированных полипептидов hGH в очищенном растворе. В другом варианте реализации изобретения, собранный продукт, содержащий высокогликозилированный CTP-модифицированный hGH, имеет уровень гликозилирования по меньшей мере 80% CTP-модифицированных полипептидов hGH в очищенном растворе. В другом варианте реализации изобретения, собранный продукт включает уровень гликозилирования по меньшей мере 81-90% общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH в очищенном растворе. В другом варианте реализации изобретения, собранный продукт, содержащий высокогликозилированный CTP-модифицированный hGH, имеет уровень гликозилирования по меньшей мере 90% CTP-модифицированных полипептидов hGH в очищенном растворе. В другом варианте реализации изобретения, собранный продукт включает уровень гликозилирования по меньшей мере 91-95% общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH в очищенном растворе. В другом варианте реализации изобретения, собранный продукт включает уровень гликозилирования по меньшей мере 95.1-99% общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH в очищенном растворе. В другом варианте реализации изобретения, собранный продукт включает уровень гликозилирования равный 100% общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH в очищенном растворе.

[0180] В другом варианте реализации изобретения, очищенный раствор CTP-модифицированного hGH (лекарственное вещество (DS - drug substance)) включает раствор, в котором по меньшей мере 90% молекул являются высокогликозилироваными. В другом варианте реализации изобретения, очищенный раствор CTP-модифицированного hGH (лекарственное вещество (DS - drug substance)) включает раствор, в котором по меньшей мере 95% молекул являются высокогликозилироваными. В другом варианте реализации изобретения, очищенный раствор CTP-модифицированного hGH (лекарственное вещество (DS - drug substance)) включает раствор, в котором 100% молекул являются высокогликозилироваными. Специалист в данной области техники должен распознать, что очищенное лекарственное вещество (DS) CTP-модифицированный hGH может включать CTP-модифицированный hGH, в котором каждая молекула содержит 12-18 O-гликанов.

[0181] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «лекарственное вещество» (DS) может охватывать или быть эквивалентным активному фармацевтическому ингредиенту (API - active pharmaceutical ingredient). В одном варианте реализации изобретения, лекарственное вещество (DS) CTP-модифицированного полипептида hGH, как он представлен в SEQ ID NO: 7, включает нефасованный очищенный лекарственный препарат. Специалисту в данной области техники также будет понятно, что термин «готовая лекарственная форма» (DP) может включать окончательно приготовленное лекарственное средство, когда оно уже расфасовано в конечный контейнер, например флакон, в асептических условиях. В одном варианте реализации изобретения, готовая лекарственная форма (DP) CTP-модифицированного полипептида hGH, как представлен в SEQ ID NO: 7, включает окончательно приготовленный CTP-модифицированный полипептид hGH.

[0182] Высокогликозилированные CTP-модифицированные полипептиды hGH могут иметь полезные свойства в способах применения для длительно действующего hGH (например, MOD-4023), поддерживая уменьшенную частоту введения, например, одна инъекция раз в неделю, пациентам с дефицитом гормона роста. Высокие уровни гликозилирования способствуют значительному увеличению гидродинамического объема CTP-модифицированного hGH, например, CTP-модифицированного hGH, по сравнению с рекомбинантным hGH. Это может привести к более длительному времени циркуляции CTP-модифицированного hGH.

[0183] В одном варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP составляет по меньшей мере 4-6. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP составляет от 4 до 6. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP составляет по меньшей мере 4-8. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP составляет от 4 до 8. В одном варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP составляет по меньшей мере 6-8. В одном варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP составляет от 6 до 8. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP составляет 4, 5, 6, 7 или 8. Каждая возможность представляет собой другой вариант реализации изобретения по CTP O-связанному гликозилированию.

[0184] В одном варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем один прикрепленный CTP, составляет по меньшей мере 4-6. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем один прикрепленный CTP, составляет по меньшей мере 6-8. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем один прикрепленный CTP, составляет по меньшей мере 4-8. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем два прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 8-12. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем два прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 12-16. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем два прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 8-16. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем три прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 12-18. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем три прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 18-24. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем три прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 12-24. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем четыре прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 16-24. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем четыре прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 24-32. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем четыре прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 16-32. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем пять прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 20-30. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем пять прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 30-40. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-модифицированном полипептиде hGH, имеющем пять прикрепленных CTP, составляет по меньшей мере 20-40.

[0185] В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом CTP-hGH-CTP-CTP (также известный как «MOD-4023») составляет по меньшей мере 12-18. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом MOD-4023 составляет по меньшей мере 18-24. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом MOD-4023 составляет по меньшей мере 12-24. В другом варианте реализации изобретения, количество O-гликанов на каждом MOD-4023 составляет по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24. Каждая возможность представляет собой другой вариант реализации изобретения по CTP O-связанному гликозилированию.

[0186] В одном варианте реализации изобретения, степень О-гликанового заполнения на каждом CTP составляет по меньшей мере 70%. В другом варианте реализации изобретения, степень О-гликанового заполнения на каждом CTP составляет по меньшей мере 80%. В другом варианте реализации изобретения, степень О-гликанового заполнения на каждом CTP составляет по меньшей мере 90%. В другом варианте реализации изобретения, степень О-гликанового заполнения на каждом CTP составляет 100%.

[0187] В одном варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH сильно сиалилирован. Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «сильно сиалилированный», применительно к CTP-модифицированному hGH, может включать уровень сиалилирования около 60-80% от общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH очищенного раствора. В другом варианте реализации изобретения, уровень сиалилирования составляет около 60-70% от общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH очищенного раствора. В другом варианте реализации изобретения, уровень сиалилирования составляет около 70-80% от общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH очищенного раствора. В другом варианте реализации изобретения, уровень сиалилирования составляет около 80-90% от общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH очищенного раствора. В другом варианте реализации изобретения, уровень сиалилирования составляет около 90-95% от общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH очищенного раствора. В другом варианте реализации изобретения, уровень сиалилирования составляет около 95,1-99% от общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH очищенного раствора. В другом варианте реализации изобретения, уровень сиалилирования составляет 100% общего количества CTP-модифицированных полипептидов hGH очищенного раствора. В другом варианте реализации изобретения, O-гликановая структура в CTP-модифицированном hGH содержит моносилиалированное ядро 1.

[0188] В одном варианте реализации изобретения, вектор экспрессии, содержащий кодирующую часть, что кодирует CTP-модифицированный GH человека, раскрытый в данном документе, также содержит промотор, кодирующую последовательность для CTP-модифицированного полипептида и последовательность полиаденилирования. В одном варианте реализации изобретения, последовательность полиаденилирования представляет собой последовательность полиаденилирования вируса обезьян (SV - simian virus) 40.

[0189] В одном варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 600 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 600-700 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 701-800 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 801-900 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 901-1000 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 1001-1100 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 1101-1200 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне, по меньшей мере, 1201-1300 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне, по меньшей мере, 1301-1400 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 1401-1500 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 1501-1600 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 1601-1700 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 1701-1800 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 1801-1900 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 1901-2000 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 2001-2100 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне, по меньшей мере, 2101-2200 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне, по меньшей мере, 2201-2300 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 2301-2400 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 2401-2500 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне по меньшей мере 2501-2600 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне, по меньшей мере, 2601-2700 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне, по меньшей мере, 2701-2800 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне, по меньшей мере, 2801-2900 мг/л. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH экспрессируется на уровне, по меньшей мере, 2901-3000 мг/л.

[0190] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «экспрессия» может включать транскрипцию и/или трансляцию гетерологичной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине. Уровень экспрессии желаемого продукта/белка интереса, в клетке-хозяине, может быть определен на основе либо количества соответствующей мРНК, или кДНК, которая присутствует в клетке, либо количества желаемого полипептида/белка интереса, кодируемого выбранной последовательностью, как показано в настоящих примерах. Например, мРНК, транскрибируемая из выбранной последовательности, может быть количественно определена путем гибридизации с использованием Нозерн-блоттинга, рибонуклеазной защиты РНК, гибридизацией in situ с клеточной РНК или с помощью ПЦР (см. Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987, обновленный). Белки, кодируемые выбранной последовательностью, могут быть количественно определены различными способами, например, с помощью ELISA, путем Вестерн-блоттинга, путем радиоиммуноанализов, путем иммунопреципитации, путем анализа биологической активности белка, путем иммуноокрашивания белка с последующим анализом FACS (см. Sambrook et Al., 1989; Ausubel et al., 1987) или путем анализа гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF - homogeneous time-resolved fluorescence). В одном варианте реализации изобретения, количественное определение CTP-модифицированного hGH включает использование высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ). В другом варианте реализации изобретения, ОФ-ВЭЖХ содержит колонку С-18. В другом варианте реализации изобретения, ОФ-ВЭЖХ содержит колонку С-8. В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы используют ОФ-ВЭЖХ для количественного определения CTP-модифицированного hGH в собранном продукте (см. этапы 3-8 Примеров). В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы используют ОФ-ВЭЖХ для количественного определения CTP-модифицированного hGH в первых этапах очистки (см. этапы 9-12 Примеров).

[0191] В другом варианте реализации изобретения, банк клеток или замороженный сток, раскрытый в данном документе, демонстрирует жизнеспособность более 90% после оттаивания. В другом варианте реализации изобретения, хранилище является хранилищем для хранения в течение неопределенного промежутка времени. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации изобретения, раскрытый в данном документе.

[0192] В другом варианте реализации изобретения, хранение осуществляют в течение 2 недель. В другом варианте реализации изобретения, хранение осуществляют в течение 3 недель. В другом варианте реализации изобретения, хранение осуществляют в течение 1 месяца. В другом варианте реализации изобретения, хранение осуществляют в течение 2 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, хранение осуществляют в течение 3 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, хранение осуществляют в течение 5 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, хранение осуществляют в течение 6 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, хранение осуществляют в течение 9 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, хранение осуществляют в течение 1 года.

[0193] В другом варианте реализации изобретения, банк клеток или замороженный сток, описанный в данном документе, криоконсервируют способом, который включает выращивание культуры клеток в определенной среде, описанной в данном документе, замораживание культуры в растворе, содержащем глицерин, и хранение клонов клеток ниже - 20 градусов по Цельсию. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет около -70 градусов Цельсия. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет около ^-70-^-80 градусов Цельсия. В другом варианте реализации изобретения, в этом способе могут быть использованы любые обозначенные среды, раскрытые в данном документе. Каждая определенная среда представляет собой отдельный вариант реализации изобретения, раскрытый в данном документе.

[0194] В другом варианте реализации способов и композиций, описанных в данном документе, культуру инокулируют клетками из банка клеток. В другом варианте реализации изобретения, культуру инокулируют клетками из замороженного стока. В другом варианте реализации изобретения, культуру инокулируют клетками из начальной культуры. В другом варианте реализации изобретения, культуру инокулируют клетками из колонии. В другом варианте реализации изобретения, культуру инокулируют в средине логарифмической стадии роста. В другом варианте реализации изобретения, культуру инокулируют примерно в средине логарифмической стадии роста. В другом варианте реализации изобретения, культуру инокулируют в другой фазе роста.

[0195] В другом варианте реализации способов и композиций, описанных в данном документе, раствор, используемый для замораживания, содержит ДМСО в количестве 2-20%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 2%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 20%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 1%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 1,5%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 3%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 4%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 5%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 2%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 2%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 7%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 7,5%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 9%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 10%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 12%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 14%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 16%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 18%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 22%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 25%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 30%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 35%. В другом варианте реализации изобретения, количество составляет 40%.

[0196] В другом варианте реализации изобретения, добавка представляет собой сахарозу. В другом варианте реализации изобретения, добавка представляет собой любую другую коллигативную добавку или добавку с антифризными свойствами, что являются известными в данной области техники. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации изобретения, раскрытый в данном документе.

[0197] В одном варианте реализации изобретения, замораживающий раствор, используемый в способах и для раскрытых в данном документе композиций, содержит кондиционную среду (среду, что уже частично была использована клетками, и которая содержит клеточный материал и определенные вещества, такие например как факторы роста) и ДМСО. В одном варианте реализации изобретения, раствор для замораживания, используемый в способах и для раскрытых в данном документе композиций, содержит около 46,255% кондиционной среды и 7,5% ДМСО.

[0198] В одном варианте реализации изобретения, культуру клеток выращивают по методикам, применяемым в данной области техники. В другом варианте реализации изобретения, во время роста клеточной культуры поддерживается постоянный рН. В другом варианте реализации изобретения, рН поддерживают примерно равным 7,0. В другом варианте реализации изобретения, рН составляет около 6. В другом варианте реализации изобретения, рН составляет около 6,5. В другом варианте реализации изобретения, рН составляет около 7,5. В другом варианте реализации изобретения, рН составляет около 8. В другом варианте реализации изобретения, рН составляет 6,5-7,5. В другом варианте реализации изобретения, рН составляет 6-8. В другом варианте реализации изобретения, рН составляет 6-7. В другом варианте реализации изобретения, рН составляет 7-8. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации изобретения, раскрытый в данном документе.

[0199] В другом варианте реализации изобретения, во время роста культуры поддерживают постоянную температуру. В другом варианте реализации изобретения, температуру поддерживают примерно равной 37 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 37 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 25 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 27 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 28 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 30 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 32 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 34 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 35 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 36 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 38 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет 39 ° С.

[0200] В другом варианте реализации изобретения, во время роста культуры поддерживают постоянную концентрацию растворенного кислорода. В другом варианте реализации изобретения, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 20% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 15% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 16% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 18% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 22% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 25% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 30% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 35% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 40% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 45% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 50% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 55% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 60% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 65% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 70% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 75% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 80% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 85% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 90% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 95% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет 100% от насыщения. В другом варианте реализации изобретения, концентрация составляет около 100% насыщения.

[0201] В другом варианте реализации способов и композиций, раскрытых в данном документе, культуру выращивают в среде, имеющей максимальный объем равный 2 литрам (L) в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, максимальный объем среды составляет 200 мл в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, максимальный объем среды составляет 300 мл в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, максимальный объем среды составляет 500 мл в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, максимальный объем среды составляет 750 мл в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, максимальный объем среды составляет 1 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, максимальный объем среды составляет 1,5 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, максимальный объем среды составляет 2,5 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, объем среды составляет 3 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, объем среды составляет 5 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, объем среды составляет по меньшей мере 5 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, объем среды составляет по меньшей мере 10 л в каждом сосуде.

[0202] В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 2 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 500 мл в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 750 мл в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 1 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 1,5 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 2,5 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 3 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 4 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 5 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 6 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 8 л в каждом сосуде. В другом варианте реализации изобретения, минимальный объем среды составляет 10 л в каждом сосуде.

[0203] В другом варианте реализации изобретения, стадию замораживания выполняют, когда культура имеет плотность 1 × 10⁶ жизнеспособных клеток (ЖК, VC - viable cells)/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 1,5 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 1,5 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 2 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 3 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 4 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 5 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 7 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 9 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 10 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 12 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 15 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 20 × 10⁷ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 25 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 30 × 10⁷ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 33 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 40 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет 50 × 10⁶ ЖК/мл. В другом варианте реализации изобретения, биомасса составляет более чем 50 × 10⁶ ЖК/мл.

[0204] В другом варианте реализации способов и композиций, описанных в данном документе, культуру клеток быстро замораживают в жидком азоте с последующим хранением при конечной температуре замерзания. В другом варианте реализации изобретения, культуру замораживают более постепенным образом; например, путем помещения во флакон культуры в конечную температуру хранения. В другом варианте реализации изобретения, культуру замораживают любым другим способом, известным в данной области техники для замораживания клеточных культур.

[0205] Специалисту должно быть понятно, что термины «культура клеток» и «культура ткани» могут использоваться взаимозаменяемо и обозначают поддержание клеток in vitro, в суспензионной культуре в жидкой среде или на поверхности, такой как стекло, пластик или агар, предоставляемой вместе с жидкой средой. В целом, как правило, «клеточная культура» требует среды, которую буферизуют для поддержания постоянного подходящего рН. Среды, используемые в клеточном культивировании, обычно составляют так, чтобы включать достаточный запас необходимых питательных веществ, и они могут быть осмотически адаптированы к конкретным поддерживаемым клеткам, причем температуру и газовую фазу также контролируют в подходящих пределах. Методи культивирования клеток хорошо известны в данной области техники. Смотрите, например, Morgan et al. 1993 Animal Cell Culture, BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK; и Adams, R. L. P. 1990 Cell Culture for Biochemists, Second Edition, Elsevier.

[0206] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «пассаж» может включать процесс субкультивирования популяции клеток. «Субкультура» может включать клеточную культуру, образованную путем инокуляции стерильной среды, которая в одном варианте реализации изобретения представляет собой свежую стерильную среду, образцом из предшествующей культуры.

[0207] Специалисту в данной области техники также будет понятно, что термин «клеточный штамм» может охватывать популяцию клеток, полученных из первичной культуры применяя методы субкультивирования. Таким образом, первичная культура может быть субкультивирована в две или более новых культур, а субкультивирование повторяют с периодическими интервалами в течение нескольких месяцев для поддержания клеточного штамма. Субкультивирование в соответствии с раскрытыми в данном документе способами может быть осуществлено с использованием адаптированных методов клеточного культивирования.

[0208] В одном варианте реализации изобретения, пассированные клеточные штаммы и иммортализованные клеточные линии могут быть охарактеризованы по их экспрессии определенных функциональных маркеров, таких как кератины, гормональные рецепторы и рецепторы факторов роста и тому подобное.

[0209] В некоторых вариантах реализации изобретения, культуры могут быть осуществлены в свободной от сыворотки среде с добавленными факторами роста. В других аспектах, среда содержит сыворотку с добавленными факторами роста или без них. Такие модификации могут быть эмпирически определены специалистом в данной области техники с целью оптимизации клеточной пролиферации.

[0210] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «клеточная линия» может включать популяцию клеток, полученных из одного эксплантата, которые характеризуются тем, что имеют потенциал к неограниченной пролиферации in vitro. Как описано в данном документе, клеточная линия может быть выделена из первичной культуры на основе ее способности выживать и продолжать расти в культуре. Клеточные линии, которые изначально были получены из ткани опухоли, могли быть трансформированы in vivo, хотя не все популяции неопластических клеток имеют способность к бесконечному росту in vitro. Кроме того, клеточные линии в целом, как правило, сохраняют свой признак дифференциированости во многих раундах деления.

[0211] Подходящие клеточные культуральные субстраты обычно представляют собой контейнер, который: можно стерилизовать, не выщелачивает токсичные факторы, и не искажает полученные при помощи микроскопа изображения. Таким образом, чашки произведенные из стекла и пластика являются подходящими субстратами для использования в описанных в данном документе способах. Могут дополнительно обрабатывать пластиковые контейнеры для стимулирования прикрепления клеток с применением методов, известных в данной области техники (Ramsey et al., 1984 In vitro 20: 802). Подходящие среды для тканевой культуры в целом, как правило, состоят из изотонической, забуференной, основной питательной среды, которая обеспечивает источник энергии вместе с неорганическими солями, аминокислотами, витаминами и различными добавками. Добавки могут включать сыворотку (например, фетальную телячью сыворотку или тому подобное), различные антибиотики для предотвращения загрязнения или для обеспечения селективных условий, прикрепления, и факторы роста или тому подобное. В данной области техники известен ряд составов сред, таких как, но не ограничиваясь лишь этими: минимальная питательная среда (MEM), Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, или среда Игла модифицированная Дульбекко (DMEM). Подходящие условия для культивирования тканей также известны в данной области техники. Смотрите, например, Morgan et al. 1993 Animal Cell Culture, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford, UK, и Adams, R. L. P. 1990 Cell Culture for Biochemists, Second Edition, Elsevier. В другом варианте реализации изобретения, раскрытом в данном документе, способы изготовления CTP-модифицированного hGH представляют собой бессывороточный технологический способ. В другом варианте реализации изобретения, раскрытом в данном документе, способы получения CTP-модифицированного hGH представляют собой технологический способ, исключающий вовлечение животных.

[0212] В другом варианте реализации способов и композиций, описанных в данном документе, температура хранения культуры составляет от ^-20 до ^-80 градусов Цельсия (° C). В другом варианте реализации изобретения, температура значительно ниже ^-20 ° C. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет не ниже ^-70 ° C. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-70 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет около ^-70 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-20 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет около ^-20 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-30 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-40 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-50 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-60 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-80 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-30-^-70 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-40-^-70 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-50-^-70 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-60-^-70 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-30-^-80 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-40-^-80 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-50-^-80 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-60-^-80 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ^-70-^-80 ° С. В другом варианте реализации изобретения, температура составляет ниже чем ^-70 ° C. В другом варианте температура составляет ниже чем ^-80 ° C.

[0213] В другом варианте реализации изобретения, для криоконсервации клетки медленно замораживают до тех пор, пока они не достигнут температуры ниже -70 ° C в среде, которая содержит криопротектор, и затем флаконы переносятся в морозильник с жидким азотом для их сохранения при температурах ниже -130 ° C.

[0214] В другом варианте реализации способов и композиций, описанных в данном документе, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 24 часа. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 2 дня. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация, хранение в замороженном состоянии длится максимум 3 дня. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 4 дня. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 1 неделю. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 2 недели. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 3 недели. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 1 месяц. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 2 месяца. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 3 месяца. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 5 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 6 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 9 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится максимум 1 год.

[0215] В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 1 неделю. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 2 недели. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 3 недели. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 1 месяц. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 2 месяца. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 3 месяца. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 5 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 6 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 9 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 1 год. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 1,5 года. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 2 года. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 3 года. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 5 лет. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 7 лет. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится минимум 10 лет. В другом варианте реализации изобретения, криоконсервация или хранение в замороженном состоянии длится более чем 10 лет.

[0216] В другом варианте реализации способов и композиций, раскрытых в данном документе, клетки проявляют рост после оттаивания, после длительного периода криоконсервации или замораживания. В другом варианте реализации изобретения, клетки проявляют рост в течение примерно 15-22 часов после инокуляции свежей среды клетками из банка клеток или стартовой культуры. В другом варианте реализации изобретения, клетки проявляют рост в течение примерно 12-20 часов после инокуляции свежей среды клетками из банка клеток или стартовой культуры. В одном варианте реализации изобретения, для обеспечения жизнеспособности, генетической стабильности и фенотипической стабильности, клеточные линии необходимо поддерживать в фазе экспоненциального роста (через субкультивирование на регулярной основе).

[0217] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «продолжительный период» криоконсервации или хранения в замороженном состоянии может составлять 1 месяц. В другом варианте реализации изобретения, период составляет 2 месяца. В другом варианте реализации изобретения, период составляет 3 месяца. В другом варианте реализации изобретения, период составляет 5 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, период составляет 6 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, период составляет 9 месяцев. В другом варианте реализации изобретения, период составляет 1 год. В другом варианте реализации изобретения, период составляет 1,5 года. В другом варианте реализации изобретения, период составляет 2 года. В другом варианте реализации изобретения, период составляет 2-7 лет. В другом варианте реализации изобретения, период составляет не менее 7 лет. В другом варианте реализации изобретения, период составляет не менее 10 лет.

[0218] В другом варианте реализации изобретения, более 90% клеток способов и композиций, описанных в данном документе, сохраняют жизнеспособность после оттаивания после криоконсервации. В другом варианте реализации изобретения, жизнеспособность после оттаивания близка к 100% после периода криоконсервации. В другом варианте реализации изобретения, жизнеспособность после оттаивания близка к 90%. В другом варианте реализации изобретения, жизнеспособность после оттаивания составляет по меньшей мере 90%. В другом варианте реализации изобретения, жизнеспособность после оттаивании составляет более 80%.

[0219] В другом варианте реализации изобретения, банк клеток, замороженный сток или партию доз вакцины, раскрытых в данном документе, выращивают в определенной среде для культивирования клеток. Такие среды известны в данной области техники и могут включать, но не ограничиваясь лишь этими: среду Игла модифицированную Дульбекко (DMEM) (ATCC® № 30-2002), среду Дульбекко модифицированную Исковым (IMDM) (ATCC® № 30-2005), Hybri-Care Medium (ATCC® № 46-X), McCoy's 5A и RPMI-1640 (ATCC® № 30-2007), питательные смеси Хамса (ATCC® CCL-61 ™), химически определенную, без сыворотки среду CHO PowerCHO ™ (Lonza кат. № 12-771Q); или любые другие среды, известные в данной области техники. В другом варианте реализации изобретения, в эти среды могут быть добавлены антибиотики или сыворотки животных, как это будет эмпирически определено специалистом в данной области техники.

[0220] В одном варианте реализации изобретения, раскрытом в данном документе, представлены биореакторы и способы, которые позволяют культивировать клетки млекопитающих в больших объемах. Кроме того, и в другом варианте реализации изобретения, указанные биореакторы и способы позволяют культивировать клетки млекопитающих в оптимальных условиях, даже если они выращиваются в больших объемах и, следовательно, позволяют определять технологические показатели и качество продукта независимо от размера биореактора. Продолжительность инкубации в биореакторе можно варьировать просто путем изменения масштаба и биореакторной системы, например, продолжительность может составлять от 8 до 9, или может составлять от 15 до 16 дней. В другом варианте реализации изобретения, продолжительность инкубации в биореакторе составляет около 7 дней, около 8 дней, около 9 дней, около 10 дней, около 11 дней, около 12 дней, около 13 дней, около 14 дней, около 15 дней, около 16 дней, около 17 дней, около 18 дней, около 19 дней, около 20 дней или больше. В другом варианте реализации изобретения, когда используется перфузионный биореактор, продолжительность инкубации может составлять до 7-120 дней. Каждая возможность перечисленная выше представляет собой вариант реализации изобретения, раскрытый в данном документе.

[0221] В другом варианте реализации изобретения, раскрытом в данном документе, представлены биореакторы большого объема, которые позволяют культивировать клетки млекопитающих в гомогенной среде по отношению к таким параметрам процесса как рН, давление растворенного кислорода (DOT - dissolved oxygen tension) и температура, поддерживая хорошо перемешанную клеточную суспензию и смешивая питательные кома внутри биореактора. В другом варианте реализации изобретения, биореактор представляет собой одноразовый биореактор.

[0222] Способы изготовления, раскрытые в настоящем документе, решают технические проблемы, лежащие в основе изготовления CTP-модифицированных полипептидов hGH, путем предоставления биореакторов, биореакторных систем и способов культивирования эукариотических клеток, особенно клеток млекопитающих.

[0223] В одном варианте реализации изобретения, биореактор имеет объем, по меньшей мере, 250 литров (л). В другом варианте реализации изобретения, биореактор имеет объем, по меньшей мере, 500 л. В другом варианте реализации изобретения, объем составляет, по меньшей мере 1000 л, по меньшей мере 2000 л, по меньшей мере 5000 л, по меньшей мере 10000 л, по меньшей мере 12000 л или по меньшей мере 15000 л.

[0224] В другом варианте реализации изобретения, клетки субкультивируют в биореакторах с увеличением их объема (см. Примеры в).

Композиции

[0225] В некоторых вариантах реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды гормона роста человека (hGH), описанные в данном документе и изготовленные с применением способов, описанных в данном документе, могут быть использованы для лечения субъекта с патологиями, связанными с ростом и весом, такими как расстройство дефицита роста, СПИД-истощение, старение, нарушение иммунной функции ВИЧ-инфицированных, катаболическая болезнь, хирургическое восстановление, застойная кардиомиопатия, трансплантация печени, регенерация печени после гепатэктомии, хроническая почечная недостаточность, почечная остеодистрофия, остеопороз, ахондроплазия/гипохондроплазия, скелетная дисплазия, хроническое воспаление или пищевое расстройство такое как болезнь Крона, синдром короткой кишки, ювенильный хронический артрит, кистозный фиброз, мужское бесплодие, X-связанный гипофосфатемический рахит, синдром Дауна, расщепление позвоночника, синдром Ноонана, ожирение, нарушение мышечной силы и фибромиалгия. В одном варианте реализации изобретения, описанные в данном документе полипептиды могут быть предложены индивиду per se (как таковые). В одном варианте реализации изобретения, описанные в данном документе полипептиды могут быть предложены индивиду в качестве части фармацевтической композиции, где ее смешивают с фармацевтически приемлемым носителем.

[0226] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «фармацевтическая композиция» может включать приготовление одного или нескольких активных ингредиентов, описанных в данном документе, с другими химическими компонентами, такими как физиологически приемлемые носители и вспомогательные материалы. Целью фармацевтической композиции является облегчение введения соединения в организм.

[0227] Модифицированные пептиды, описанные в данном документе, могут быть приготовлены в качестве подходящих фармацевтических препаратов, таких как капсулы и инъекции в смеси с носителями, разбавителями и т. д., известными per se, которые могут вводиться перорально или парентерально млекопитающим (например, коровам, лошадям, свиньям, овцам, людям).

[0228] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «активный ингредиент» может включать полипептидную последовательность интереса, которая отвечает за биологический эффект.

[0229] В некоторых вариантах реализации изобретения, любая из описанных в данном документе композиций будет содержать, по меньшей мере, две последовательности CTP связанные с представляющим интерес белком, в любой форме. В одном варианте реализации изобретения, в данном документе описаны комбинированные препараты. Специалист в данной области техники поймет, что термин «комбинированный препарат» может включать «набор частей» в том смысле, что партнеры по комбинации, как определено выше, могут дозироваться независимо или с использованием различных фиксированных комбинаций с выделенными количествами партнеров комбинации, т.е., одновременно, паралельно, отдельно или последовательно. В некоторых вариантах реализации изобретения, части набора могут затем, например, вводиться одновременно или хронологически ступенчато, то есть в разные моменты времени и с равными или разными временными интервалами для любой части набора. Соотношение общих количеств партнеров по комбинации, в некоторых вариантах реализации изобретения, может быть введено в комбинированном препарате. В одном варианте реализации изобретения, комбинированный препарат можно варьировать, например, для того, чтобы справится с потребностями субпопуляции пациентов, подлежащих лечению, или с потребностями одного пациента, различные потребности которого могут быть связаны с конкретным заболеванием, тяжестью заболевания, возрастом, полом или весом тела, что может быть легко сделано специалистом в данной области техники.

[0230] Специалист в данной области техники поймет, что фразы «физиологически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый носитель», которые могут использоваться взаимозаменяемо, могут включать носитель или разбавитель, который не вызывает значительного раздражения организма и не аннулирует биологическую активность и свойства вводимого соединения. К этим фразам относится адъювант. В одном варианте реализации изобретения, один из ингредиентов, включенных в фармацевтически приемлемый носитель, может представлять собой, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), биосовместимый полимер с широким спектром растворимости в органической и водной средах (Mutter et al. (1979).

[0231] Специалисту в данной области техники будет понятно, что термин «вспомогательный материал» может включать инертное вещество, добавленное в фармацевтическую композицию, для дальнейшего облегчения введения активного ингредиента. В одном варианте реализации изобретения, вспомогательные материалы включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.

[0232] Методы приготовления и введения лекарств приведены в «Remington's Pharmaceutical Sciences», «Mack Publishing Co.», Easton, PA, последнее издание, которое включено в данный документ посредством ссылки.

[0233] В одном варианте реализации изобретения, подходящие пути введения, например, включают пероральную, ректальную, трансмукозальную, трансназальную, кишечную или парентеральную доставку, включая внутримышечные, подкожные и интрамедуллярные инъекции, а также интратекальные, прямые внутрижелудочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции.

[0234] В одном варианте реализации изобретения, препарат вводят локальным, а не системным способом, например, путем инъекции препарата непосредственно в конкретную область тела пациента.

[0235] В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH, описанные в данном документе, вводят в дозе 1-90 мкг в 0,1-5 мл раствора. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH вводят в дозе 1-50 мкг в 0,1-5 мл раствора. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH вводят в дозе 1-25 мкг в 0,1-5 мл раствора. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH вводят в дозе 50-90 мкг в 0,1-5 мл раствора. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH вводят в дозе 10-50 мкг в 0,1-5 мл раствора.

[0236] В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH вводят в дозе 1-90 мкг в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной инъекции (IM), подкожной инъекции (SC) или внутривенной инъекции (IV) один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH вводят в дозе 1-90 мкг в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной инъекции (IM), подкожной инъекции (SC) или внутривенной инъекции (IV) два раза в неделю. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH вводят в дозе 1-90 мкг в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной инъекции (IM), подкожной инъекции (SC) или внутривенной инъекции (IV) три раза в неделю. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH вводят в дозе 1-90 мкг в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной инъекции (IM), подкожной инъекции (SC) или внутривенной инъекции (IV) один раз в две недели. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH вводят в дозе 1-90 мкг в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной инъекции (IM), подкожной инъекции (SC) или внутривенной инъекции (IV) один раз каждые 17 дней. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированные полипептиды hGH вводят в дозе 1-90 мкг в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной инъекции (IM), подкожной инъекции (SC) или внутривенной инъекции (IV) один раз каждые 19 дней.

[0237] Предусматриваются различные варианты реализации диапазонов доз. Дозировка полипептида, описанного в данном документе, в одном варианте реализации изобретения, находится в диапазоне от 0,05 до 80 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,05-50 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,1-20 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,1-10 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,1-5 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,5-5 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,5-50 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 5-80 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 35-65 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 35-65 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 20-60 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 45-60 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 60-120 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 120-240 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 240-400 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 45-60 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 15-25 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 55-65 мг/день.

[0238] В одном варианте реализации изобретения, дозировка составляет 20 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 30 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 40 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 50 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 60 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 70 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 80 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 90 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 100 мг/день.

[0239] Дозировка CTP-модифицированных полипептидов hGH, описанных в данном документе, в одном варианте реализации изобретения, находится в диапазоне 0,005-100 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,005-5 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находиться в диапазоне 0,01-50 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,1-20 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,1-10 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,01-5 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,001-0,01 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,001-0,1 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,1-5 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,5-50 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,2-15 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 0,8-65 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 1-50 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 8-15 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 10-20 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 20-40 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 60-120 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 12-40 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 50-100 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 1-60 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 15-25 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 55-65 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 1-5 мг/неделя.

[0240] В другом варианте реализации изобретения, дозировка CTP-модифицированных полипептидов hGH, назначенная субъекту, составляет 50% стандартной дозы, назначенной эталонному субъекту из той же популяции субъектов (например, детей, пожилых людей, мужчин, женщин, людей с дефицитом GH, людей конкретной национальности и т. д.). В другом варианте реализации изобретения, доза составляет 30% дозы, назначенной субъекту из определенной популяции субъектов. В другом варианте реализации изобретения, доза составляет 45% дозы, назначенной субъекту из определенной популяции субъектов. В другом варианте реализации изобретения, доза составляет 100% дозы, назначенной субъекту из определенной популяции субъектов.

[0241] В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-5 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 2 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 4 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1,2 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1,8 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка является примерно дозировками, описанными в данном документе.

[0242] В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-5 мг/введение. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 2 мг/введение. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 4 мг/введение. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1,2 мг/введение. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1,8 мг/введение. В одном варианте реализации изобретения, композицию вводят один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, композицию вводят раз в две недели. В другом варианте реализации изобретения, композицию вводят ежемесячно. В другом варианте реализации изобретения, композицию вводят ежедневно.

[0243] В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, готовят в виде интраназальной лекарственной формы. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH готовят в виде инъекционной лекарственной формы. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 0,0001 мкг до 0,6 мг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 0,001 мг до 0,005 мг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 0,005 мг до 0,01 мг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 0,01 мг до 0,3 мг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 0,2 мг до 0,6 мг.

[0244] В другом варианте реализации изобретения, описанный в данном документе CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 1 до 100 мкг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 10 до 80 мкг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 20 до 60 мкг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 10 до 50 мкг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 40 до 80 мкг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 10 до 30 мкг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 30 до 60 мкг.

[0245] В другом варианте реализации изобретения, GH модифицированный CTP вводят субъекту в дозе варьирующей от 0,2 мг до 2 мг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 2 мг до 6 мг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 4 мг до 10 мг. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту в дозе варьирующей от 5 мг до 15 мг.

[0246] В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, вводят в мышцу (внутримышечная инъекция). В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводится под кожу (подкожная инъекция). В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводится в мышцу. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят под кожу.

[0247] В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы включают повышение степени соблюдения предписанного режима терапии при использовании терапии GH, включая предоставление субъекту, нуждающемуся в этом, CTP-модифицированного полипептида hGH, как раскрыто в данном документе, тем самым повышая степень соблюдения предписанного режима терапии при использовании терапии GH.

[0248] В другом варианте реализации изобретения, белковые лекарственные средства с молекулярной массой менее 50 000 дальтон, такие как CTP-модифицированные полипептиды hGH, описанные в данном документе, являются в целом, как правило, недолговечными видами in vivo, имеющие короткий период полувыведения в течение нескольких часов. В другом варианте реализации изобретения, подкожный способ введения в целом, как правило, обеспечивает более медленное высвобождение в кровоток. В другом варианте реализации изобретения, описанный в данном документе CTP-модифицированный полипептид продлевает период полувыведения белковых лекарств с молекулярной массой менее 50 000 дальтон, таких как GH.

[0249] В другом варианте реализации изобретения, иммуногенность CTP-модифицированного hGH равна выделенному GH. В другом варианте реализации изобретения, иммуногенность CTP-модифицированного hGH сопоставима с выделенным GH. В другом варианте реализации изобретения, модификация GH, как описано в данном документе, CTP-пептидами, уменьшает иммуногенность GH. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH является таким же активным, как выделенный белок GH. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH более активен, чем выделенный GH. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH максимизирует защитную способность GH против деградации, сводя к минимуму снижение биологической активности.

[0250] В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы включают повышение степени соблюдения предписанного режима терапии субъектами, страдающих хроническими заболеваниями, которые нуждаются в терапии ГР. В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы позволяют снизить частоту дозирования GH путем модификации GH с помощью CTP, как описано в данном документе выше. В другом варианте реализации изобретения, термин соблюдение включает строгое соблюдение. В другом варианте реализации изобретения, раскрытые в данном документе способы включают увеличение степени соблюдения предписанного режима терапии пациентами, нуждающимися в терапии GH, путем снижения частоты введения GH. В другом варианте реализации изобретения, снижение частоты введения GH достигается за счет CTP-модификаций, которые делают CTP-модифицированный GH более стабильным. В другом варианте реализации изобретения, снижение частоты введения GH достигается в результате увеличения T_1/2 GH. В другом варианте реализации изобретения, уменьшение частоты введения GH достигается в результате увеличения времени клиренса GH. В другом варианте реализации изобретения, снижение частоты введения GH достигается в результате увеличения показателя AUC (area under curve - площади под кривой) GH.

[0251] В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH, описанный в данном документе, вводят субъекту один раз в день. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту один раз в два дня. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту один раз в три дня. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту один раз в четыре дня. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту один раз в пять дней. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту один раз каждые шесть дней. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту один раз в неделю. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту один раз каждые 7-14 дней. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту один раз каждые 10-20 дней. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту один раз каждые 5-15 дней. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят субъекту один раз каждые 15-30 дней.

[0252] В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 50-500 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 50-150 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 100-200 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 150-250 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 200-300 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 250-400 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 300-500 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка находится в диапазоне 350-500 мг/день.

[0253] В одном варианте реализации изобретения, дозировка составляет 20 мг/день. В одном варианте реализации изобретения, дозировка составляет 30 мг/день. В одном варианте реализации изобретения, дозировка составляет 40 мг/день. В одном варианте реализации изобретения, дозировка составляет 50 мг/день. В одном варианте реализации изобретения, дозировка составляет 0,01 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 0.1 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 0,530 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 0,05 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 50 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 10 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 20-70 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 5 мг/день.

[0254] В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-90 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-90 мг/2 дня. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-90 мг/3 дня. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-90 мг/4 дня. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-90 мг/5 дней. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-90 мг/6 дней. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-90 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-90 мг/9 дней. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-90 мг/11 дней. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 1-90 мг/14 дней.

[0255] В другом варианте реализации изобретения, доза CTP-модифицированного hGH составляет 10-50 мг/день. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 10-50 мг/2 дня. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 10-50 мг/3 дня. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 10-50 мг/4 дня. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 10-50 мг/5 дней. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 10-50 мг/6 дней. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 10-50 мг/неделя. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 10-50 мг/9 дней. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 10-50 мг/11 дней. В другом варианте реализации изобретения, дозировка составляет 10-50 мг/14 дней.

[0256] Пероральное введение, в одном варианте реализации изобретения, включает стандартную лекарственную форму, включающую таблетки, капсулы, леденцы, жевательные таблетки, суспензии, эмульсии и тому подобное. Такие стандартные лекарственные формы содержат безопасное и эффективное количество желаемого соединения или соединений, где каждое, в одном вариант реализации изобретения, составляет от примерно 0,7 или 3,5 мг до примерно 280 мг/70 кг, или, в другом варианте реализации изобретения, составляет примерно от 0,5 или 10 мг до примерно 210 мг/70 кг. Фармацевтически приемлемые носители, подходящие для приготовления стандартных лекарственных форм для перорального введения, хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения, таблетки обычно содержат стандартные фармацевтически совместимые адъюванты в качестве инертных разбавителей, таких как карбонат кальция, карбонат натрия, маннит, лактоза и целлюлоза; связующие, такие как крахмал, желатин и сахароза; разрыхлители, такие как крахмал, альгиновая кислота и кроскармелоза; смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота и тальк. В одном варианте реализации изобретения, могут быть использованы скользящие вещества, такие как диоксид кремния, для улучшения текучести порошковой смеси. В одном варианте реализации изобретения, красители, такие как FD&C-красители, могут быть добавлены для внешнего вида. Подсластители и ароматизаторы, такие как аспартам, сахарин, ментол, мята и фруктовые ароматизаторы, являются полезными адъювантами для жевательных таблеток. Капсулы обычно содержат один или несколько твердых разбавителей, описанных выше. В некоторых вариантах реализации изобретения, выбор компонентов-носителей зависит от вторичных факторов, таких как вкус, стоимость и стабильность при хранении, которые не являются критическими для целей, описанных в данном документе, и может быть легко сделан специалистом в данной области техники.

[0257] В одном варианте реализации изобретения, пероральная лекарственная форма включает предопределенный профиль высвобождения. В одном варианте реализации изобретения, описанная в данном документе пероральная лекарственная форма включает таблетки, капсулы, леденцы, или жевательные таблетки с пролонгированным высвобождением. В одном варианте реализации изобретения, описанная в данном документе пероральная лекарственная форма включает таблетки, капсулы, леденцы, или жевательные таблетки с замедленным высвобождением. В одном варианте реализации изобретения, описанная в данном документе пероральная лекарственная форма включает таблетки, капсулы, леденцы, или жевательные таблетки с немедленным высвобождением. В одном варианте реализации изобретения, пероральная лекарственная форма приготовлена в соответствии с желаемым профилем высвобождения фармацевтического активного ингредиента, как известно специалисту в данной области техники.

[0258] Пероральные композиции, в некоторых вариантах реализации изобретения, включают жидкие растворы, эмульсии, суспензии и тому подобное. В некоторых вариантах реализации изобретения, фармацевтически приемлемые носители, подходящие для приготовления таких композиций, хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения, жидкие пероральные композиции содержат от примерно 0,012% до примерно 0,933% желаемого соединения или соединений, или, в другом варианте реализации изобретения, от примерно 0,033% до примерно 0,7%.

[0259] В некоторых вариантах реализации изобретения, композиции для использования в описанных в данном документе способах включают растворы или эмульсии, которые в некоторых вариантах реализации изобретения представляют собой водные растворы или эмульсии, содержащие безопасное и эффективное количество соединений, описанных в данном документе, и необязательно другие соединения, предназначенные для местного внутриназального введения. В некоторых вариантах реализации изобретения, композиции содержат от около 0,01% до около 10,0% мас./об. испытуемого соединения, более предпочтительно от около 0,1% до около 2,0%, которые используют для системной доставки соединений интраназальным путем.

[0260] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтические композиции вводят внутривенной, внутриартериальной или внутримышечной инъекцией жидкого препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения, жидкие композиции включают растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и тому подобное. В одном варианте реализации изобретения, фармацевтические композиции вводят внутривенно и, потому, готовят в форме, подходящей для внутривенного введения. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтические композиции вводят внутриартериально и, потому, готовят в форме, подходящей для внутриартериального введения. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтические композиции вводят внутримышечно и, потому, готовят в форме, подходящей для внутримышечного введения.

[0261] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтические композиции вводят наружно через поверхности тела и, потому, их готовят в форме, подходящей для наружного введения. Подходящие наружные составы включают гели, мази, кремы, лосьоны, капли и тому подобное. Для поверхностного введения, соединения, описанные в данном документе, объединяют с дополнительным подходящим терапевтическим веществом или веществами, приготовленными и примененными в виде растворов, суспензий или эмульсий в физиологически приемлемом растворителе с фармацевтическим носителем или без него.

[0262] В одном варианте реализации изобретения, фармацевтические композиции, раскрытые в данном документе, производят способами, хорошо известными в данной области техники, например, посредством обычных процессов смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, левигации, эмульгирования, инкапсулирования, захвата или лиофилизации.

[0263] В одном варианте реализации изобретения, фармацевтические композиции для использования в соответствии с настоящим изобретением готовят обычным образом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, содержащих эксципиенты и вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных ингредиентов в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически. В одном варианте реализации изобретения, рецептура зависит от выбранного способа введения.

[0264] В одном варианте реализации изобретения, вводимые вещества, раскрытые в данном документе, готовят в виде водных растворов. В одном варианте реализации изобретения, вводимые вещества, раскрытые в данном документе, готовят в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. В некоторых вариантах реализации изобретения, для введения через слизистую оболочку в состав вводят пенетранты, соответствующие барьеру через которое он должен проникнуть. Такие пенетранты обычно известны в данной области техники.

[0265] В одном варианте реализации изобретения, описанные в данном документе препараты составлены для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. В некоторых вариантах реализации изобретения, композиции для инъекций представлены в виде стандартной дозированной формы, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с необязательно добавленным консервантом. В некоторых вариантах реализации изобретения, композиции представляют собой суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и содержат рецептурные средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества.

[0266] Композиции также содержат, в некоторых вариантах реализации изобретения, консерванты, такие как хлорид бензалкония и тимеросал и тому подобное; хелатирующие вещества, такие как этилендиаминтетроацетат натрия и другие; буферы, такие как фосфатный, цитратный и ацетатные; тонизирующие вещества, такие как хлорид натрия, хлорид калия, глицерин, маннит и другие; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, ацетилцистин, метабисульфот натрия и другие; ароматические вещества; регуляторы вязкости, такие как полимеры, включая целлюлозу и ее производные; и поливиниловый спирт, а также кислоты и основания для корректировки рН этих водных композиций по мере необходимости. Композиции также содержат, в некоторых вариантах реализации изобретения, местные анестетики или другие активные вещества. Композиции могут быть использованы как спреи, аэрозоли, капли и тому подобное.

[0267] В некоторых вариантах реализации изобретения, фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активного препарата в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных ингредиентов, в некоторых вариантах реализации изобретения, готовят в виде подходящих инъекционных суспензий на масляной или водной основе. В некоторых вариантах реализации изобретения, подходящие липофильные растворители или носители включают: жирные масла, такие как кунжутное масло или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. В некоторых вариантах реализации изобретения, водные инъекционные суспензии содержат вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. В другом варианте реализации изобретения, суспензия также содержит подходящие стабилизаторы или вещества, которые увеличивают растворимость активных ингредиентов, чтобы обеспечить получение высококонцентрированных растворов.

[0268] В другом варианте реализации изобретения, активное соединение может быть доставлено в везикуле, в частности липосоме (см. Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease и Cancer, Lopez- Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327, см. в целом там же).

[0269] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, доставляемая системой с контролируемым высвобождением, составляется для внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. В одном варианте реализации изобретения, применяется насос (смотрите Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). В другом варианте реализации изобретения, могут быть использованы полимерные материалы. В еще одном варианте реализации изобретения, система контролируемого высвобождения может быть размещена вблизи терапевтической мишени, то есть мозга, что требует лишь доли системной дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Лангера (Science 249:1527-1533 (1990).

[0270] В некоторых вариантах реализации изобретения, активный ингредиент находится в порошкообразной форме для разбавления перед использованием подходящим носителем, например, стерильным, аппирогенным раствором на водной основе. Композиции готовят, в некоторых вариантах реализации изобретения, для распыления и ингаляции. В другом варианте реализации изобретения, композиции содержатся в контейнере с прикрепленными распыляющими средствами.

[0271] В одном варианте реализации изобретения, препарат, описанный в данном документе, готовят в виде ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, с использованием, например, обычных основ для суппозиториев, таких как масло какао или другие глицериды.

[0272] В некоторых вариантах реализации изобретения, фармацевтические композиции, подходящие для использования в контексте, раскрытом в данном документе, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения намеченной цели. В некоторых вариантах реализации изобретения, терапевтически эффективное количество означает количество активных ингредиентов, эффективных для предотвращения, облегчения или улучшения симптомов заболевания, или продления выживания субъекта, подвергающегося лечению.

[0273] В одном варианте реализации изобретения, определение терапевтически эффективного количества является хорошо известным в пределах компетенции специалистов в данной области техники.

[0274] Композиции также содержат консерванты, такие как хлорид бензалкония и тимеросал, и тому подобное; хелатирующие вещества, такие как этилендиаминтетроацетат натрия и другие; буферы, такие как фосфатный, цитратный и ацетатные; тонизирующие вещества, такие как хлорид натрия, хлорид калия, глицерин, маннит и другие; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, ацетилцистин, метабисульфот натрия и другие; ароматические вещества; регуляторы вязкости, такие как полимеры, включая целлюлозу и ее производные; и поливиниловый спирт, а также кислоты и основания для корректировки рН этих водных композиций по мере необходимости. Композиции также содержат местные анестетики или другие активные вещества. Композиции могут быть использованы как спреи, аэрозоли, капли и тому подобное.

[0275] Некоторыми примерами веществ, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей или их компонентов, являются: сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и метилцеллюлоза; порошкообразный трагакант; солод; желатин; тальк; твердые смазки, такие как стеариновая кислота и стеарат магния; сульфат кальция; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло какао-бобов; полиолы, такие как пропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; альгиновая кислота; эмульгаторы, такие как эмульгаторы марки Tween™; смачивающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия; красители; ароматизаторы; таблетирующие вещества, стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты; апирогенная вода; изотонический физиологический раствор; и фосфатные буферные растворы. Выбор фармацевтически приемлемого носителя, который должен использоваться в сочетании с соединением, в основном определяется тем, как вводится соединение. Если желаемое соединение должно быть введено, в одном варианте реализации изобретения, фармацевтически приемлемый носитель представляет собой стерильный физиологический раствор с совместимым с кровью суспендирующим агентом, рН которого доводится до примерно 7,4.

[0276] Кроме того, композиции дополнительно содержат связующие вещества (например, аравийскую камедь, кукурузный крахмал, желатин, карбомер, этилцеллюлозу, гуаровую камедь, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, повидон), дезинтегрирующие вещества (например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота, диоксид кремния, натрий-кроскармелоза, кросповидон, гуаровая камедь, натрий-крахмалгликолят), буферы (например, Трис-HCl, ацетатный, фосфатный) с различной pH и ионной силы, добавки, такие как альбумин или желатин, для предотвращения абсорбции на поверхностях, детергенты (например, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, соли желчных кислот), ингибиторы протеазы, поверхностно-активные вещества (например, лаурилсульфат натрия), усилители проницаемости, солюбилизирующие агенты (например, глицерин, полиэтиленглицерин), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия, бутилированный гидроксианизол), стабилизаторы (например, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза), вещества, повышающие вязкость (например, карбомер, коллоидный диоксид кремния, этилцеллюлоза, гуаровая камедь), подсластители (например, аспартам, лимонная кислота), консерванты (например, тимеросал, бензиловый спирт, парабены), смазывающие вещества (например, стеариновая кислота, стеарат магния, полиэтиленгликоль, лаурилсульфат натрия), вещества для повышения текучести (например, коллоидный диоксид кремния), пластификаторы (например, диэтилфталат, триэтилцитрат), эмульгаторы (например, карбомер, гидроксипропилцеллюлоза, лаурилсульфат натрия), полимерные покрытия (например, полоксамеры или полоксамины), покрывающие и пленкообразующие вещества (например, этилцеллюлоза, акрилаты, полиметакрилаты) и/или адъюванты.

[0277] Типичные компоненты носителей для сиропов, эликсиров, эмульсий и суспензий включают этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, жидкую сахарозу, сорбит и воду. Для суспензии типичные суспендирующие вещества включают метилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, целлюлозу (например, Avicel™, RC-591), трагакант и альгинат натрия; типичные смачивающие агенты включают лецитин и полиэтиленоксид сорбитан (например, полисорбат 80). Типичные консерванты включают метилпарабен и бензоат натрия. В другом варианте реализации изобретения, пероральные жидкие композиции также содержат один или несколько компонентов, таких как подсластители, ароматизаторы и красители, описанные выше.

[0278] Композиции также включают введение или нанесение активного вещества в или на частицы полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота, гидрогели и т. д., или липосомы, микроэмульсии, мицеллы, однослойные или многослойные везикулы, «призраки» эритроцитов или сферопласты. Такие композиции будут влиять на физическое состояние, растворимость, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo.

[0279] В другом варианте реализации изобретения, композиции включают композиции в виде частиц, покрытых полимерами (например, полоксамерами или полоксаминами), и соединение, связанное с антителами, направленными против тканеспецифических рецепторов, лигандов или антигенов, или связанное с лигандами тканеспецифических рецепторов.

[0280] В некоторых вариантах реализации изобретения, соединения модифицированны ковалентным присоединением водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозы, декстрана, поливинилового спирта, поливинилпирролидона или полипролина. В другом варианте реализации изобретения, модифицированные соединения проявляют значительно более длительный период полувыведения из крови после внутривенной инъекции, чем соответствующие немодифицированные соединения. В одном варианте реализации изобретения, модификации также увеличивают растворимость соединения в водном растворе, устраняют агрегацию, усиливают физическую и химическую стабильность соединения и значительно снижают иммуногенность и реакционную способность соединения. В другом варианте реализации изобретения, желаемая биологическая активность in vivo достигается за счет введения таких полимерных соединений, которые захватываются реже или в более низких дозах, чем с немодифицированным соединением.

[0281] В некоторых вариантах реализации изобретения, приготовление эффективного количества или дозы может быть оценено первоначально из анализов in vitro. В одном варианте реализации изобретения, доза может быть приготовлена на животных моделях, и такая информация может использоваться для более точного определения полезных доз у людей.

[0282] В одном варианте реализации изобретения, токсичность и терапевтическая эффективность активных ингредиентов, описанных в данном документе, могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами in vitro, в культурах клеток или на экспериментальных животных. В одном варианте реализации изобретения, данные, полученные из этих анализов in vitro и клеточных культур, и исследований на животных, могут быть использованы при составлении диапазона доз для применения на человеке. В одном варианте реализации изобретения, дозы варьируют в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого способа введения. В одном варианте реализации изобретения, точная рецептура, способ введения и дозировка могут быть выбраны отдельным врачом с учетом состояния пациента. [См., например, Fingl, et al., (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1].

[0283] В одном варианте реализации изобретения, в зависимости от тяжести и чувствительности состояния, подлежащего лечению, дозирование может быть проведено одним или несколькими введениями, причем курс лечения длится от нескольких дней до нескольких недель, или до тех пор, пока не будет достигнуто излечение, или достигнуто ослабления состояния заболевания.

[0284] В одном варианте реализации изобретения, количество композиции, что должно быть введено, будет, конечно, зависеть от подлежащего лечению субъекта, степени тяжести заболевания, способа введения, решения назначающего врача и т. д.

[0285] В одном варианте реализации изобретения, также будут готовить композиции, включая составы, описанные в данном документе, приготовленные в совместимом фармацевтическом носителе, помещать в соответствующий контейнер, и маркировать для лечения указанного состояния.

[0286] В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH вводят посредством системного введения. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный hGH, описанный в данном документе, вводят путем внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекцией. В другом варианте реализации изобретения, CTP-модифицированный полипептид hGH является лиофилизированным (то есть высушенным сублимацией) препаратом в комбинации со сложными органическими эксципиентами и стабилизаторами, такими как неионные поверхностно-активные вещества (то есть суфрактанты), различные сахара, органические полиолы и/или сывороточный альбумин человека. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный GH, модифицированный CTP, как описано, в стерильной воде для инъекций. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный CTP-модифицированный hGH, описанный в данном документе, в стерильном ФСБ (фосфатно-солевом буфере) для инъекций. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный CTP-модифицированный hGH, описанный в данном документе, в стерильном 0,9% NaCl для инъекций.

[0287] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержит GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, и сложные носители, такие как человеческий сывороточный альбумин, полиолы, сахара и анионные поверхностно-активные стабилизирующие вещества. См., например, WO 89/10756 (Hara et al., - cодержат полиол и р-гидроксибензоат). В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция содержит CTP-модифицированный hGH, как описано в данном документе, и лактобионовую кислоту и ацетат/глициновый буфер. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, и глицин или человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), буфер (например, ацетатный) и изотоническое вещество (например, NaCl). В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный GH, модифицированный CTP, описанный в данном документе, и фосфатный буфер, глицин и ЧСА.

[0288] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическую композицию, содержащую GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, стабилизируют внесением в буферные растворы, имеющие рН от около 4 до 7,2. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическую композицию, содержащую GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, стабилизируют аминокислотой в качестве стабилизирующего агента, а в некоторых случаях солью (если аминокислота не содержит заряженной боковой цепи).

[0289] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, представляет собой жидкую композицию, содержащую стабилизирующий агент между около 0,3% и 5% по массе, который представляет собой аминокислоту.

[0290] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, обеспечивает точность дозирования и безопасность продукта. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, образовывает биологически активный, стабильный жидкий состав для использования в инъекционных формах выпуска. В одном варианте реализации изобретения, описанная в данном документе композиция включает невязкий жидкий состав. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция содержит не лиофилизированный GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе.

[0291] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, образовывает жидкий состав, обеспечивающий хранение в течение длительного периода времени в жидком состоянии, облегчая хранение и перевозку перед введением.

[0292] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит твердые липиды в качестве материала матрицы. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция для инъекций, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит твердые липиды в качестве материала матрицы. В другом варианте реализации изобретения, изготовление липидных микрочастиц путем распылительной кристаллизации описано (Speiser and al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54), с последующими липидными наногранулами для перорального введения (Speiser EP 0167825 (1990)). В другом варианте реализации изобретения, липиды, которые используются, хорошо переносятся телом (например, глицериды, состоящие из жирных кислот, которые присутствуют в эмульсиях для парентерального питания).

[0293] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, находится в форме липосом (J. E. Diederichs and al., Pharm./nd. 56 (1994) 267- 275).

[0294] В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит полимерные микрочастицы. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция для инъекций, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит полимерные микрочастицы. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит наночастицы. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит липосомы. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит липидную эмульсию. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит микросферы. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит липидные наночастицы. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит липидные наночастицы, содержащие амфифильные липиды. В другом варианте реализации изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая GH, модифицированный CTP, как описано в данном документе, содержит липидные наночастицы, содержащие лекарственное средство, липидную матрицу и поверхностно-активное вещество. В другом варианте реализации изобретения, липидная матрица имеет долю моноглицерида(-ов), которая составляет по меньшей мере 50% w/w.

[0295] В одном варианте реализации изобретения, композиции, раскрытые в данном документе, содержаться в упаковке или дозаторе, такой(-ом) как набор, одобренный FDA, который содержит одну или несколько стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. В одном варианте реализации изобретения, упаковка, например, содержит металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. В одном варианте реализации изобретения, упаковка или дозатор сопровождается инструкциями для введения. В одном варианте реализации изобретения, пакет или дозатор сопровождают примечанием, присоединенным к контейнеру, в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов, которое отражает одобрение агентством формы композиций или введение человеку или введение животному. Такое примечание, в одном варианте реализации изобретения, представляет собой маркировку, одобренную Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США, для лекарств, отпускаемых по рецепту, или одобренной вставки продукта.

[0296] В одном варианте реализации изобретения, будет понятно, что GH, модифицированный CTP, описанный в данном документе, может быть предоставлен индивидууму с дополнительными активными веществами для достижения улучшенного терапевтического эффекта по сравнению с лечением каждым веществом отдельно. В другом варианте реализации изобретения, принимаются меры (например, дозирование и выбор дополняющего вещества) для сведения к минимуму неблагоприятных побочных эффектов, которые связаны с комбинированной терапией.

[0297] В другом варианте реализации изобретения, раскрытом в данном документе, предлагается набор, содержащий описанные в данном документе композиции, клетки, плазмиды и т. д., а также аппликатор и учебный материал, который описывает использование описанных в данном документе способов. Хотя типовые наборы описаны ниже, содержимое других полезных наборов будет очевидным специалисту в данной области техники в свете настоящего раскрытия изобретения. Каждый из этих наборов представляет собой отдельный вариант реализации изобретения, раскрытый в данном документе.

[0298] Дополнительные объекты, преимущества и новые признаки, раскрытые в данном документе, станут очевидными для обычного специалиста в данной области техники после изучения следующих примеров, которые не предназначены для ограничения. Кроме того, каждый из различных вариантов реализации изобретения и аспектов, раскрытых в данном документе, как описано выше и как заявлено в формуле изобретения ниже, находит экспериментальную поддержку в следующих примерах.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Производство конструкций hGH

Экспрессия MOD-4023 (CTP-hGH-CTP-CTP)

[0299] Трансфекция клеток (нуклеофекция). Стабильная экспрессия достигалась путем интеграции гена MOD-4023 в хромосому клетки-мишени: первоначально ген вводили в клетку, затем в ядро и, наконец, интегрировали в хромосомную ДНК. После переноса гена, клетки культивировали в среде, содержащей селекционный маркер, такой как дигидрофолатредуктаза (DHFR). Кратко:

[0300] Ген мышиной дигидрофолатредуктазы (dhfr) из плазмиды pSV2-dhfr субклонировали в сайт неомицина в плазмиде pCI-neo. Чтобы создать модифицированный вектор экспрессии, pCI-dhfr (Фиг. 2). Соответственно, экспрессирующий вектор MOD-4023 содержит IE (immediate-early, немедленный-ранний) энхансер/промотор цитомегаловируса (CMV) и ген dhfr для отбора клеток. Ген MOD-4023 содержит одну копию кодирующей C-концевой пептид (CTP) последовательности, предшествующей 5'-концу гена hGH, и две копии CTP-кодирующей последовательности сразу после 3'-конца гена hGH. Ген MOD-4023 субклонировали в открытую рамку считывания pCI-dhfr (Фиг. 2). Следовательно, кассета экспрессии MOD-4023 состоит из промотора CMV, последовательности гена CTP-hGH-CTP-CTP и последовательности полиаденилирования SV40.

[0301] Отбор клонов - предельное разведение одиночной клетки путем посева в 96-луночные планшеты. Был применен отбор к культуре одной клетки, и его можно повторять несколько раз, чтобы получить 100%-ную клональную чистоту. Наиболее продуктивный клон, исходя из кривой роста, характеристики клона, специфической продуктивности и белкового профиля, размножали в 1 л колбе для встряхивания перед инокуляцией биореактора. Кратко:

[0302] Линия клеток, продуцирующих белок MOD-4023, была создана с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Среда, не содержащая компонентов животного происхождения, была использована на протяжении всего процесса создания банков стоковых клеток и рабочих клеток (MCB; WCB). Трансфекцию dhfr-отрицательных CD-клеток DG44 (клеток CHO), которые были адаптированы к безбелковой среде и росту в суспензии, проводили с использованием FuGENE-6 (Roche Applied Science). Стабильные клоны выделяли путем выполнения стадий предельного разбавления в клеточной культуре. Количество наиболее продуктивных клонов было увеличено повышением концентрации метотрексата (MTX). На основе уровня удвоения популяции клонов (PDL - population doubling level), продуцирования MOD-4023 (пикограмм на клетку в день, PCD - picogram per cell per day) и максимальной концентрации клеток в выбранной среде, наиболее продуктивные клоны были выделены и использованы для приготовления научно-исследовательских банков, после чего следовало производство подходящих банка стоковых клеток (MCB) и банка рабочих клеток (WCB).

Процесс накопления

[0303] Восходящий процесс MOD-4023 состоял из двух типов составов среды; среда роста (Среда 1) и среда производства (Среда 2). Среда 1 содержала метотрексат (MTX), а Среда 2 была идентична Среде 1, за исключением MTX. Среда 1 использовалась для размножения клеточной культуры (этап 1-4 на Фиг. 3) до посева в 200-литровом биореакторе, а Среду 2 использовали на этапах N-2 (два размножения до конечного продукта. N относится к конечному продукту), 200-литровый биореактор (этапы 5-6 на Фиг. 3) и производственный биореактор на 1000 литров (этап 7 на Фиг. 3).

Производственный процесс: MOD-4023

[0304] Клон № 28 производили в 1000-литровом (л) масштабе в среде, свободной от сыворотки. Культуру линии клеток СНО размножали в несколько этапов - от одного флакона банка рабочих клеток (WCB) до конечного объема производственной культуры. Супернатант производственной клеточной культуры тестировали на бионагрузку, бактериальный эндотоксин, продуктивность и случайный вирус. Процесс проводили с использованием 50-литрового и 200-литрового затравочных биореакторов и 1000-литрового биореактора для увеличения количества культуры. Все поверхности с которыми контактирует продукт являются одноразовыми, а не одноразовое оборудование, которое контактирует с продуктом, предназначено для контакта с продуктом. Эти части оборудования очищали и дезинфицировали между партиями. Культуру размножали до объема 50-л и 200-л затравочных биореакторов перед инокуляцией 1000-л биореактора для увеличения количества. Конечное масштабирование и производство в биореакторе с периодической загрузкой проводили в одноразовых биореакторах на 1000 л. Удаление клеток осуществляли с использованием одноразовой фильтрующей системы (пористый фильтр Millipore).

[0305] Один или два флакона WCB оттаивали при 37 ° C. Клетки центрифугировали и клеточный осадок ресуспендировали до целевой концентрации с помощью 10 мл свежей среды в колбе для встряхивания с малым объемом, и инкубировали при 37 ± 0,5 ° С, 5 ± 1% СО₂. После второго субкультивирования культура клеток с более высокой жизнеспособностью была дополнительно размножена; другая клеточная культура была удалена. Четыре стадии субкультивирования во встряхиваемой колбе с увеличивающимися объемами проводили с заранее определенными параметрами шага, такими как концентрация посева и рабочий объем. За объемами следовали две стадии с затравочными биореакторами для типичного пробега 1000-литрового биореактора.

[0306] В качестве затравочных биореакторов использовали 50-литровые и 200-литровые биореакторы. Перед инокуляцией, 200-литровий биореактор заполняли примерно 50 л PowerCHO 2CD Medium 2 (масса/объем MTX). Контроль процесса был установлен с такими параметрами: pH 7, температура 37 ° C, DO 50%. Эти параметры применимы к предварительному подготавливанию среды и процессу культивации затравочной культуры.

[0307] Перенос инокулята начинали когда параметры процесса контролировали в пределах их заранее определенных диапазонов. В процессе увеличение массы клеток в затравочных биореакторах на 50 л и 200 л не добавляли кормовой среды. Ожидаемое время культивирования в затравочных биореакторах составляло от 3 до 4 дней, перед тем, как клетки переносили в биореактор на 1000 л. Образцы для контроля процесса (IPC - in process control) отбирали ежедневно.

Увеличение количества клеток в производственном 1000-литровом биореакторе (этап 7 на Фиг. 3)

[0308] Культуру инкубируют в биореакторе в течение 11 дней (в зависимости от жизнеспособности клеток) при 37 ° C, 20% растворенного кислорода (DO - dissolved oxygen) и pH 7,2. На третий день рН сдвигается до 6,9 до сбора урожая. На 4-й день добавляется кормовая среда (Power Feed A без липидов). Объем кормовой среды равен 33% от конечного объема биореактора. На 6-й день в биореактор добавляется DMSO. В культуру добавляли кормовой раствор глюкозы для поддержания желаемой концентрации и добавляли болюс 1 М бикарбоната натрия для поддержания желаемой концентрации культуры (НСО₃). Сбор проводился с использованием предопределенных критериев. В течение первых четырех дней культуру клеток ежедневно отбирали для подсчета клеток, жизнеспособности и метаболического анализа. С 5-го дня культуру отбирали дважды в день для подсчета клеток, жизнеспособности и метаболического анализа, а с 9-го дня также для анализа специфической продуктивности с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Продуцирование MOD-4023 составляло не менее 500 г/л вместе с сильно гликозилированной формой, составляющей, по меньшей мере, 70% от общего количества белка hGH-CTP в сборе.

[0309] Представленный в данном документе пример показывает производство с использованием режима периодической подпитки, но специалист в данной области техники может разработать режим перфузии, используя, в целом, аналогичную схему очистки. Альтернативно, специалист в данной области техники может разработать способ перфузии, в котором продолжительность инкубации может составлять до 7-120 дней.

Сбор клеток и их хранение (этап 8 на Фиг. 3)

[0310] Сбор клеток проводили с применением одноразовой системы фильтрации. Для очистки собранного было проведено глубинное фильтрование и фильтрование 0,2 мкм. После очистки проводили фильтрацию 0,45/0,2 мкм. Поровые фильтры промывали, и остаточная жидкость выдувалась из системы воздухом. Процесс фильтрации проводили со скоростью насоса ≤ 15 л/мин и максимальным заданным давлением. Затем фильтры промывали буфером Трис-HCl и продували сжатым воздухом для увеличения извлечения продукта.

[0311] Очищенный собранный продукт был проверен на бионагрузку, бактериальный эндотоксин, содержание специфического белка, с помощью ОФ-ВЭЖХ, SDS-PAGE, Вестерн блота, анализа HPC Elisa, остаточного ДНК, анализа на вирусы in vitro, вирусоподобные частицы, S+L- и Mycoplasma.

Процесс очистки

[0312] Схема очистки покзана на Фиг. 4.

Ультрафильтрация и диафильтрация 1 - УФДФ 1 (этап 8)

[0313] Очищенный собранный продукт концентрировали и подвергали диафильтрации с использованием половолоконного картриджа или эквивалентного шага УФДФ на основе TFF. Номинальная молекулярная масса отсечения картриджа составляет 10,000 кДа. Концентрированный и диафильтрованный собранный продукт проверяли на содержание конкретного белка с помощью ОФ-ВЭЖХ и HCP Elisa.

Инактивация вирусов путем инкубации с 1% Triton-X100 (этап 9)

[0314] Материал фильтровали через фильтр Millipore 1,55 м2, а затем через стерильный фильтр Sartopore 2 XLG 10" в стерильный мешок для смешивания (этап глубинной фильтрации). Затем к окончательному объему фильтрата добавляли раствор Tris/10% Triton, доводя концентрацию Triton до 1% (масса/масса). После инкубации, перед загрузкой в колонку DEAE, раствор продукта фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм.

Хроматография с быстрым потоком с DEAE-сефарозой (этап 10)

[0315] Для этой стадии использовали колонку DEAE, заполненную DEAE-сефарозной смолой. Колонка была заполнена до определенного объема. Специфический белок в растворе, наносимом на колонку, определяли перед добавлением Triton из-за помех, вызванных Triton при анализе. Колонку DEAE уравновешивали и загружали вирусным инактивированным пулом, а затем промывали. Проводили вторую промывку, и материал элюировали 20 мМ Трис-HCl/150 мМ NaCl, pH 8,2, а затем хранили при температуре окружающей среды (18-26 ° C) для обработки на следующий день, или при 2-8 ° C в течение более длительного времени. Все этапы хроматографии проводили в режиме нисходящего потока. В качестве альтернативы, этапы могли быть выполнены в режиме восходящего потока. Элюат тестировали на специфический белок с помощью ОФ-ВЭЖХ (Цель: главный пик элюируется как один пик), HCP Elisa, SDS-PAGE, Вестерн блота и остаточной ДНК.

Фенилгидрофобная хроматография взаимодействия (HIC) с колоночной хроматографией (этап 11)

[0316] Для этого этапа использовали фенильную смолу HIC. Колонка была заполнена до определенного объема. HIC-хроматографию проводили в течение 1-5 циклов в зависимости от количества продукта. В качестве альтернативы можно было запустить до 10 циклов. Раствор для загрузки HIC был подготовлен путем корректировки элюата DEAE сульфатом аммония. Колонку уравновешивали и загружали скорректированным и профильтрованным через фильтр 0,2 мкм DEAE элюатом, а затем промывали 10 мМ фосфатом натрия/600 мМ сульфатом аммония, содержащим пропиленгликоль, pH 7,3. Материал элюировали с помощью пониженной концентрации сульфата аммония и повышенной концентрации пропиленгликоля, pH 7,3, а затем хранили при 2-8 ° C до дальнейшей обработки.

Ультрафильтрация и диафильтрация элюата HIC 2 (этап 12)

[0317] Элюат HIC концентрировали и подвергали диафильтрации в 10 мМ буфере фосфата натрия, рН 6,8, чтобы уменьшить объем и подготовить материал для этапа колонки CHT. Картридж был уравновешен 10 мМ фосфатом натрия, pH 6,8. Элюат HIC концентрировали и затем проводили диафильтрацию провив фосфатного буфера натрия до достижения рН 6,8 ± 0,1 и проводимости, которая была в пределах 10% от проводимости буфера для диафильтрации. Когда было установлено, что рН и проводимость находятся в диапазоне, систему осушали и фильтровали через 0,45/0,2 мкм в стерильный мешок. Конечный объем концентрированного, диафильтрованого элюата HIC хранили при комнатной температуре (18-26°C) в течение ночи. Ретентат был протестирован на бионагрузку, бактериальный эндотоксин и специфический белок с помощью А₂₈₀.

Хроматография на керамическом гидроксиапатите (CHT) в смешанном режиме (этап 13)

[0318] Для этого этапа использовали колонку CHT, заполненную гидроксиапатитовой смолой. Колонка была колонкой, заполненной до определенного объема. Колонку уравновешивали фосфатом натрия, pH 6,8 и загружали концентрированным и диафильтрированным элюатом HIC, и промывали 4 объемами колонки (CV - column volumes) фосфата натрия, pH 6,8. Проточный и промывочный материал собирают и выдерживают в течение ночи при температуре окружающей среды (18-26 ° C) до дальнейшей обработки.

SP-сефарозная хроматография (этап 14)

[0319] Для этой стадии использовали колонку, заполненную SP Sepharose Resin. Колонка была колонкой, заполненной до определенного объема. Загрузка SP была приготовлена путем корректировки потока CHT через дробление до pH 5,0-6,0 лимонной кислотой. После корректировки рН раствор загружали в колонку с последующей стадией промывки. Элюат был собран для дополнительной обработки. рН доводили до рН 6,0-6,5 с помощью 0,1 М гидроксида натрия, и материал фильтровали через фильтр 0,45/0,2 мкм. Материал хранили при температуре окружающей среды (18-26 ° C) в течение ночи, или при 2-8 ° C в течение до 24 часов. Все этапы хроматографии проводили в режиме нисходящего потока.

Вирусная инактивация путем нанофильтрации (этап 15)

[0320] Вирусную фильтрацию проводили с применением вирусного фильтра Asahi Planova 20N. В качестве префильтра для нанофильтра применяли фильтр Sartopore 2 с мембраной 0,45/0,2 мкм или 0,1 мкм. Вирусный фильтр предварительно уравновешивали и наполняли конечным составом, приготовленным с помощью WFI. Скорректированный SP-элюат пропускали через фильтровальную машину при постоянном давлении и собирали в стерильный биопроцессорный пакет. Фильтровальную машину промывали буфером для состава, чтобы максимизировать извлечение продукта. Фильтр прошел проверку на целостность до и после использования в соответствии с рекомендованными изготовителем процедурами. Тест на целостность после использования включает тест с золотыми частицами, в соответствии с рекомендованными изготовителем процедурами.

УФДФ3 и фильтрация и хранения лекарственного вещества (этап 16)

[0321] Фильтрат, полученный после применения вирусного фильтра, концентрировали до конечной концентрации DS (которая может варьировать от 5 до 100 мг/мл) при подготовке к фильтрованию в потоке и заполнению. Для этого шага использовалась одноразовая или многоразовая кассета с молекулярной массой отсечения 3-30 кДа. Продукт концентрировали на первой стадии до 5-25 мг/мл и подвергали диафильтрации против 10 мМ цитрата, 147 мМ NaCl, рН 6,4 (7 объемов ДФ). Альтернативно, продукт концентрировали на первой стадии до 5-25 мг/мл и подвергали диафильтрации против 10 мМ цитратного гистидинового буфера, включая консерванты для поддержки повторного дозирования с помощью устройства, в частности 0,3% м-крезола, а также добавляли P-188 до 0,2% для уменьшения количества агрегатов и частиц, не видимых невооруженным глазом. Корректировали конечную концентрацию продукта, и фильтровали с помощью фильтра Millipak 100. Делали аликвоты раствора фильтрованного продукта и замораживали при температуре -70 ± 5 ° С.

Производство лекарственного препарата MOD-4023

[0322] Процесс приготовления лекарственного препарата (DP - drug product) начинается с оттаивания MOD-4023 DS. Лекарственный препарат получали путем разбавления лекарственного вещества (DS - drug substance) до требуемой концентрации с использованием буфера для составов, асептической фильтрации и заполнения стандартных флаконов 2R или другой первичной упаковки, такой как картриджи или предварительно заполненные шприцы. Описание конкретного процесса показано на Фиг. 5.

Иследование MOD-4023

[0323] Содержание MOD-4023 в собранном продукте и процент сильно гликозилированных форм определяли с помощью специального способа ОФ-ВЭЖХ. Суммарное количество белка в собранном продукте было определено анализом Брэдфорда. Процент специфического белка MOD-4023 в собранном продукте, производимом клоном № 28, был выше 70% относительно суммарного количества белка в собранном продукте. Этот уникальный высокий уровень специфического белка можно также наблюдать по сильной интенсивности полос MOD-4023 с сильным и слабым гликозилированием по сравнению с интенсивностью полос других белков клеток-хозяев в образцах собранного продукта и образцах УФДФ, проанализированных с помощью окрашивания кумасси SDS-PAGE (Фиг. 6). Кроме того, были разработаны начальные этапы технологического процесса производства МОД-4023 для получения высокой доли сильно гликозилированного белка MOD-4023 по сравнению с слабо гликозилированной формой. Сильно гликозилированная форма является целевой формой MOD-4023, так как это приводит к увеличению срока полувыведения GH.

O-гликановый состав

[0324] Гликопрофилирование проводили путем высвобождения гликанов MOD-4023 с последующей маркировкой гликанов 2-аминобензамидом (2AB), очищали и анализировали с помощью НФ-ВЭЖХ (нормально фазовая ВЭЖХ). Кратко

[0325] Анализ O-гликанового состава проводили для расчета количества молей O-гликанов на моль белка MOD-4023. Конечные галактозные единицы O-гликанов ферментативно отщепляли от белка β-галактозидазой. Эти свободные галактозные единицы разделяли на колонке CarboPac PA20 и детектировали с помощью импульсной амперометрии. Количество галактозы (Gal) определяли с использованием внешней калибровки с эталонным стандартом галактозы. Содержание галактозы может быть непосредственно связано с содержанием O-гликановой структуры, Gal-GalNAc. Содержание сиаловой кислоты (SA - sialic acid) измеряется в лекарственном веществе (DS) и не должно отличаться от содержания SA в конечном лекарственном препарате (DP). Как DS, так и DP могут использоваться для отображения уровней содержания SA и O-гликана CTP-модифицированного hGH. Анализ 5 различных партий лекарственного вещества и лекарственного препарата MOD-4023, показанных на Фиг. 7, демонстрирует сильную однородность от партии до партии. Это неожиданно устойчивое содержание гликанов является значительным, показывая, что количество O-гликанов на каждом CTP в CTP-hGH-CTP-CTP было повышено по сравнению с таковым известным в данной области техники. CTP-hGH-CTP-CTP, изготовленный как описано в данном документе, имел 4-6 O-гликанов на каждом CTP по сравнению с уровнями, известными в данной области техники, в которых hCG имеет только 4 O-гликана.

Анализ интактной молекулярной массы образцов MOD-4023

[0326] Анализ молекулярной массы 4 различных партий DS MOD-4023 выполнялся с целью получения информации о количестве сайтов O-сцепленного гликозилирования. (См. подробные результаты в Примере 3.) Интактные образцы MOD-4023, а также де-сиалилированные с помощью нейраминидазы образцы MOD-4023, и де-O-гликозилированные с помощью O-гликозидазы образцы анализировали соединенными последовательно ЖХ/ЭР-МС. Данные, полученные в результате интактного измерения массы де-сиалилированных образцов дают возможность предположить, что белок модифицирован 12-18 сайтами гликозилирования GalNac-Gal, причем наиболее выражен белок, что модифицирован 15 сайтами гликозилирования. Этот результат, показывающий высокий процент содержания серина, был неожиданным по сравнению с уровнями, известными в данной области техники (всего 4 гликозилированных серины, по сравнению с вплоть до 6 в модифицированном CTP hGH, полученном в данном изобретении.

Содержание сайтов О-связанного гликозилирования образцов белка MOD-4023

[0327] Анализ содержания сайтов O-связаного гликозилирования 4 различных партий DS MOD-4023 выполнялся на М-скан с целью получения информации о количестве сайтов O-связаного гликозилирования, припадающих на каждую молекулу MOD-4023. Образцы MOD-4023 были де-сиалилированы с использованием нейраминидазы с последующим трипсиновым расщеплением образцов восстановленного/карбоксиметилированного MOD-4023. Наконец, обработанные образцы анализировали с помощью последовательно соединенных ЖХ/ЭР-МС, и интерпретацию данных MС (масс спектрометрии, МS - mass spectrometry) проводили с применением предназначенного для этого программного обеспечения. Оценка данных, полученных при анализе смесей триптического расщепления, привела к сигналам, позволяющим картировать 100% последовательности белка. O-гликозилирование происходит как на N-концевой, так и на C-концевой области CTP. Сайты, по которым возможно гликозилирование, были определенны как сериновые остатки после пролина, а также как два из четырех серинов в областях сериновых повторов. В общей сложности до 18 сериновых остатков могут служить местами прикрепления для O-гликанов. Не было обнаружено никаких существенных различий между партиями, как показано на Фиг. 8.

[0328] Заполнение сайтов О-связанного гликозилирования образцов белка MOD-4023 MOD-4023 (SEQ ID NO: 7) содержит один CTP на N-конце и два CTP в тандеме на C-конце. Анализ О-связанного гликозилирования показал, что каждый CTP содержит 4-6 О-связанных гликанов - все они связаны с остатками Серина (S). В целом, на каждом MOD-4023 было 12-18 О-связанных углеводных цепей, с наиболее распространенной формой, содержащей 15 O-гликанов на каждом MOD-4023. (См. результаты и выводы Примеров 2 и 3 ниже). На последовательности GH отсутствовали углеводыне цепи.

[0329] Используя аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 в качестве ориентира, результаты анализа сайтов заполнения показали, что O-гликозилирование происходило на каждом CTP по сериновым остаткам в положениях 10, 13, 15, 21 единицы CTP, что соответствует позициям 229, 232, 234, 240 во второй последовательности CTP, и 257, 260, 262 и 268 в третьей последовательности CTP. Были идентифицированы два дополнительных сайта О-гликозилированого заполнения, встречающихся на остатках серина Ser1-Ser4 N-концевого CTP (соответствующих положениям 220-223 во второй последовательности CTP и 248-251 в третьей последовательности CTP). Однако, с помощью масс-спектрометрии невозможно было определить, какие два из четырех остатков серина были модифицированы. Подробная информация о заполнении и структуре O-гликанов приведена в Примере 2 ниже.

[0330] O-гликановые структуры

[0331] Основной О-гликановый пик соответствовал моносилиалированному ядру 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc). Кроме того, наблюдали небольшие количества нейтрального ядра 1 (Galβ1-3GalNAc), моносилиалированного ядра 1 (Neu5Acα2-6 (Galβ1-3) GalNAc) и дисилиалированного ядра 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3 (Neu5Acα2-6) GalNAc). Основной сиаловой кислотой в образце была Neu5Ac (NANA). Структуры О-связанных гликанов и тип сиаловой кислоты представлены на Фиг. 15A и 15B, соответственно.

Чистота MOD-4023

[0332] ОФ-ВЭЖХ разделяет молекулы в соответствии с их полярностью. Подвижный фазовый градиент от более полярного до менее полярного растворителя использовался чтобы элюировать молекулы с сильной полярностью раньше, чем менее полярные молекулы. ОФ-ВЭЖХ разделяет лекарственное вещество MOD-4023 на основной пик, наблюдаемый на 21,0-25,0 минутах, и незначительные пики, представляющие варианты, связанные с продуктом (Фиг. 9). Родственные формы отделяют от нативного белка, используя УФ-детектирование при 220 нм. Относительные площади пиков (площадь%) соответствующих форм и основной пик можно рассчитать, объединив соответствующие области пиков. Основной пик лекарственного вещества и лекарственного препарата MOD-4023 составляет более 97% площади пика, что указывает на высокоочищенный продукт и эффективный процесс очистки (см. Фиг. 21).

[0333] Эксклюзионная ВЭЖХ представляет собой хроматографический метод, который разделяет молекулы по размеру. В пределах выбранного диапазона фракционирования более крупные молекулы элюируются раньше, чем более мелкие молекулы. Механизм разделения не адсорбционный, а молекулы элюируют в изократических условиях. SEC (size exclusion chromatography) позволяет мономерам отделяться от форм с более высокой молекулярной массой (таких как димеры и полимеры) молекулы-мишени. Метод SEC был разработан для анализа содержания димеров и полимеров MOD-4023 в лекарственном веществе и лекарственном препарате (Фиг. 10). Мономер MOD-4023 составляет более чем 98% площади пика, что указывает на высокоочищенный продукт и эффективный процесс очистки (см. Фиг. 22).

Способ содержания HP-HPLC

[0334] Этот способ используется для определения содержания MOD-4023 промежуточных образцов MOD-4023 и определения %-негликозилированного MOD-4023 в промежуточных образцах методом обращенной фазовой хроматографии. Обращенно-фазовая ВЭЖХ разделяет молекулы благодаря их полярности. Относительно неполярные молекулы, такие как MOD-4023, лигируют к материалу колонки, в то время как заряженные и полярные молекулы элюируются без взаимодействия с колонкой.

[0335] Лигированные молекулы элюировали с помощью градиента от полярного до менее полярного раствора. Сначала элюируются молекулы с самой сильной полярности, за которыми следуют менее полярные молекулы. Обнаружение проводили через поглощение при 214 нм.

[0336] На ранних стадиях очистки (образец УФДФ1) наблюдались два пика. Пик 1 представляет собой сильно гликозилированную форму MOD-4023, а пик 2 представляет собой слабо гликозилированную форму (Фиг. 11). Относительные области пиков (площадь%) двух пиков можно рассчитать, объединив соответствующие области пиков. Относительная площадь пика I составляет 75%. На первой стадии очистки колонка DEAE Sepharose разделяет между этими пиками, а фракция элюирования содержит только гликозилированную форму MOD-4023 (100%) (Фиг. 12).

Действенность MOD-4023

[0337] Активацию рецептора роста человека белком MOD-4023 оценивали с использованием клеток Baf, стабильно экспрессирующих рецептор hGH. Клетки подвергали голоданию в среде без GH с последующей стадией промывки и повторного суcпендирования в буфере для анализа, и переносили в 96-луночные планшеты (100 мкл/лунка). Во время инкубации клеток при 37 ° С в течение 30 мин добавляли MOD-4023 в возрастающих концентрациях и клетки инкубировали в течение ночи при 37 ° С с 5% СО₂. Анализ заканчивали добавлением 30 мкл CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (MTS) в лунки с культурой. Через три часа после добавления MTS измеряли оптическую плотность (OD) лунок с культурой при 492 нм. Поглощение при 492 нм прямо пропорционально количеству живых клеток в культуре. MOD-4023 продемонстрировал специфическое связывание с клетками Baf-hGH в типичной кривой зависимости от дозы (Фиг. 13 и Фиг. 23).

[0338] Кроме того, тест на биосоответствие проводили у крыс с гипофизэктомией, в которых активность MOD-4023 для всех партий составляла не менее 2 единиц фармакопеи США соматотропина (USP - United States Pharmacopeia) на милиграмм (Фиг. 23).

Вирусный клиренс

[0339] Предметом предварительной оценки была способность производственного процесса решать проблему загрязнения конечного лекарственного препарата эндогенным и адвентитивным вирусом, и устранения такого загрязнения. Исследование, соответствующее хорошей лабораторной практике, проводилось в соответствии с применимым руководством для исследовательских продуктов с использованием трех модельных вирусов, добавленных к продукту на этапах производственного процесса уменьшенного масштаба, для количественной оценки способности этих этапов инактивировать или очищать добавленную популяцию вирусов. Если количество вируса выражено как log10 скорректированный титр, log10 коэффициент клиренса определяется просто путем вычитания получаемого значения из исходного значения. Коэффициенты клиренса суммируют поскольку они являются числами log10, чтобы получить общий коэффициент клиренса для всех оцениваемых этапов. Факторы клиренса для отдельных этапов рассчитываются на Фиг. 14. Исследования по оценке вирусной безопасности проводились с использованием вируса мышиного лейкоза Абельсона (A-MuLV), мелкого вируса мышей (MVM), реовируса типа 3 (Reo-3) и вируса псевдобешенства (PrV). Теоретические вирусные нагрузки на дозу рассчитывали при максимальной дозе 15 мг/доза. A-MuLV считается модельным вирусом, представляющим возможное присутствие ретровирусов CHO; меры, принятые для инактивации и удаления загрязняющего вируса A-MuLV, достигли коэффициента клиренса, по меньшей мере, antilog10 22,74, что указывает на то, что весь процесс получения MOD-4023 имеет исключительную способность к удалению вируса.

Примеси

[0340] Результаты анализа ряда примесей, присутствующих в очищенном белке MOD-4023, представлены на Фиг. 24. Было найдено менее чем или равное 100 нг/мг (ppm) количество белков клетки-хозяина (HCP - host cell proteins). Количество присутствующего ДНК было меньше или равно 10 мкг/мг (ppb). В тоже время, остаточный уровень метотрексата (МТХ) составлял менее 50 нг/мл. Остаточное количество пропиленгликоля (PG) было меньше или равно 60 мкг/мл. Было найдено количество Triton менее чем или равное 2,5 мкг/мл. Кроме того, в конечном очищенном белке MOD-4023 присутствовало количество инсулина менее чем или равное 115 мкг/мл. Наконец, в очищенном белковом продукте MOD-4023 присутствовало менее чем 250 мкг/мл ДМСО. Результаты анализа бионагрузки также представлены на Фиг. 24 и показывают, что в очищенном лекарственном препарате присутствует количество колониеобразующих единиц меньше чем или равно 10 КОЕ/10 мл.

ПРИМЕР 2

Заполнение сайтов гликозилирования белка MOD-4023

[0341] Задача

[0342] Цель исследования состояла в том, чтобы предоставить информацию о заполнении сайтов гликозилирования белка MOD-4023 (гликопротеин с примерно 12 O-связанными сайтами гликозилирования).

[0343] Способы

[0344] Де-сиалилирование MOD-4023 с использованием нейраминидазы

[0345] Использовали образцы Mod-4023, имеющие концентрацию примерно 21 мг/мл. Брали примерно 200 мкг образца, заменяли в нем буфер на воду, и сушили его сублимацией. Высушенный образец повторно суспендировали в нейраминидазе и инкубировали при 37 ° С.

[0346] Триптическое переваривание восстановленного/карбоксиметилированного белка MOD-4023

[0347] После де-сиалилирования, брали примерно 200 мкг MOD-4023, заменяли буфер на буфер Трис/Гуанидин гидрохлорид, восстанавливали дитиотреитолом и карбоксиметилировали с использованием йодоуксусной кислоты. Для образцов затем заменяли буфер на буфер бикарбоната аммония и расщепляли трипсином при 37 ° С.

[0348] Соединенные последовательно жидкостная хроматография/масс-спектрометрия с электрораспылением ЖХ/ЭР-МС

[0349] Соединенные последовательно жидкостная хроматография/масс-спектрометрия с электрораспылением (ЖХ/ЭР-МС) были применены к аликвоте расщепленных образцов, полученных с использованием колонки Jupiter Phenomenex (C18, 5μ, 250×2,1 мм, длина волны 214 нм, скорость потока 0,2 мл/мин). Растворитель А представлял собой 0,05 мл муравьиной кислоты в 1 л H₂O. Растворитель В представлял собой 0,05 мл муравьиной кислоты в 100 мл H₂O плюс 900 мл ацетонитрила. Градиент, представленный ниже в Таблице 1, использовался для неповрежденного и восстановленного продукта.

[0350] Таблица 1: Градиент колонки

Время (мин)	%В
0	2
10	10
50	60
60	90
70	90
70,1	2
80	2

[0351]

[0352] Ионизацию усиливали за счет использования азот-высушующего газа и повышенной температуры источника. Для облегчения фрагментации источника было применено слабое усиление вольтажа конуса. Диапазон просканированных масс был от m/z 200 до m/z 2000.

[0353] Интерпретация данных

[0354] В интерпретации данных масс-спектрометрии помогало использование программного обеспечения General Protein/Mass Analysis для Windows (GPMAW) (Lighthouse data) в сочетании с белковой последовательностью CTP-модифицированного hGH (SEQ ID NO: 7), причем последовательности для которых ожидают то, что они должны быть O-гликозилированными, являются теми, которые представлены в единицах CTP.

[0355] Результаты

[0356] Оценка данных привела к полному картированию последовательности белка MOD-4023 между аминокислотами 37 и 224 SEQ ID NO: 7, хотя была проанализирована полная последовательность SEQ ID NO: 7.

[0357] ЖХ/ЭР-МС расщепленной трипсином смеси де-сиалилированного, восстановленного и карбоксиметилированного MOD-4023

[0358] Соединенные последовательно ЖХ/ЭР-МС применяли к расщепленному трипсином, де-сиалилированному, восстановленному и карбоксиметилированному MOD-4023. Для сравнения партий на Фиг. 16 показано наложение трех хроматограмм полного ионного тока (TIC - total ion current). Данные, полученные для трех партий, были очень сопоставимы как по обнаруженным пептидам, так и по интенсивности.

[0359] На Фиг. 17 представлена оценка сигнала, полученного в результате анализа соединенными последовательно ЖХ/ЭР-МС расщепленных трипсином де-сиалилированных восстановленных и карбоксиметилированных партий белка MOD-4023 с акцентом на сигнал, модифицированный по меньшей мере одним остатком HexNAc-Hex. Результаты, представленные на Фиг. 17, предусматривают заполнение сайтов О-гликозилирования в N-концевой области как показано на Фиг. 18. На Фиг. 18 представлена аминокислотная последовательность 1-30 MOD-4023 SEQ ID NO: 7, причем O-гликозилирование происходит по остаткам серина (S) в позициях 10, 13, 15 и 21 (показано красным). Все эти серины (S) в последовательности следуют за остатками пролина (Р). По меньшей мере два из S-остатков в позициях с первой по четвертую (1-4) заняты сайтами O-гликозилирования (показаны фиолетовым).

[0360] Дополнительные сигналы полной единицы CTP наблюдались в соответствии с ожидаемой массой аминокислот 1-36 SEQ ID NO: 7 с вплоть до шести сайтами O-гликозилирования. Возникновение таких больших триптических пептидов, содержащих пропущенные сайты расщепления, согласуется с наличием O-гликозилирования, поскольку гликановые остатки вблизи остатков аргинина или лизина препятствуют трипсическому расщеплению в результате стерической и электростатической интерференции.

[0361] Данные, представленные на Фиг. 17, также показывают сопоставимость с предыдущими данными (не показаны), то есть для C-концевой CTP-CTP-области MOD-4023. В результате можно сказать, что O-гликозилирование происходит по остаткам серина после остатков пролина (показано красным) на Фиг. 18 и Фиг. 19. Кроме того, в областях сериновых повторов по крайней мере два из четырех серинов были заняты O-гликозилированием.

[0362] Из полученных результатов были сделаны следующие выводы относительно N-концевой CTP-единицы. O-гликозилирование происходило по остаткам серина в позициях 10, 13, 15 и 21 (аминокислоты 10, 13, 15 и 21 SEQ ID NO: 7). В последовательности все эти серины следовали за остатками пролина. Из четырех остатков серина в позициях с 1 по 4 от N-конца белка (аминокислоты 1-4 SEQ ID NO: 7) по меньшей мере два заняты сайтами O-гликозилирования. В C-концевых CTP-CTP-единицах: аминокислоты 229, 232, 234, 240, 257, 260, 262 и 268 SEQ ID NO: 7). Кроме того, в областях сериновых повторов по меньшей мере два из четырех серинов были заняты сайтами O-гликозилирования (аминокислоты 1-4 SEQ ID NO: 7 N-концевой единицы CTP и аминокислоты 220-223 и 248- 251 SEQ IDNO: 7 C-концевых единиц CTP-CTP).

[0363] Понятно, что пептиды с большим количеством сайтов O-гликозилирования могли ускользнуть от масс-спектрометрического детектирования в результате плохой ионизации. По этой причине идентичный образец вводили в большем количестве и при измененных условиях ионизации, что было более предпочтительно для триптических пептидов с большей массой.

[0364] Выводы

[0365] В ходе этого исследования были собраны доказательства, подтверждающие следующие утверждения. Оценка данных, полученных при анализе расщепленных трипсином смесей, приводила к сигналам, позволяющим картировать 100% последовательности белка. O-гликозилирование происходит как на N-концевых, так и на C-концевых CTP- и -CTP-CTP областях соответственно. Занятыми сайтами были остатки серина, следующие за остатками пролина, а также два из четырех серинов в областях повторов серина. Таким образом, в общей сложности до 18 сериновых остатков могут служить сайтами прикрепления для O-гликанов. Так, удивительно и неожиданно, используя описанные в данном документе способы изготовления, количество O-гликанов, занимающих сайты гликозилирования, составляло до 6 O-гликанов на единицу CTP каждого MOD-4023 (полипептид CTP-hGH-CTP-CTP). Анализ молекулярного веса белка MOD-4023 после де-сиалилирования показал, что белок был модифицирован 12-18 сайтами гликозилирования структуры HexNAc-Hex (см. Пример 3).

ПРИМЕР 3.

Анализ интактной молекулярной массы MOD-4023

[0366] Задача

[0367] Цель исследования состояла в том, чтобы обеспечить точную информацию о интактной молекулярной массе трех партий белка MOD-4023 (гликопротеин с примерно 12 O-связанными сайтами гликозилирования).

[0368] Способы

[0369] Анализ молекулярной массы образцов до и после обработки

[0370] Пробы анализировали при концентрациях 21 мг/мл и 41 мг/мл. Проводили ЖХ/ЭР-МС, что были соединены последовательно, с использованием следующих условий:

ВЭЖХ: система жидкостной хроматографии GE AKTAmicro, содержащая

Насос P-905, Triple Wavelength Absorbance UV-900, детектор

Проводимости и автосамплер A-905, коллектор фракций Frac-950

MС: Микромасса/микро квадрупольный времяпролетный спектрометр Q-TOF от Waters

Длина волны: 280 нм

Колонка: Phenomenex Jupiter 3p C18 300A 150×2,0 мм

(Колонка № 74 SGS M-Scan GmbH)

Температура колонки 40 ° C

Скорость потока: 0,2 мл/мин

Растворитель A: 1,0 мл муравьиной кислоты на 1 л H₂O

Растворитель B: 1,0 мл муравьиной кислоты на 100 мл H₂O плюс 800 мл ацетонитрила и 100 мл тетрагидрофурана

[0371] Градиент, описанный ниже, использовался для анализа де-сиалилированного продукта. Следует отметить, что время удерживания при оценке данных было скорректировано к началу градиента (tRo=при 10 мин):

[0372] Таблица 2: Градиент колонки

Время (мин)	%В
0	20
10	20
40	70
41	90
50	90
50,1	20
60	20

[0373] Ионизацию усиливали за счет использования азот-высушующего газа и повышенной температуры источника. Диапазон просканированных масс был от m/z 350 до m/z 3500. Для калибровки прибора использовались ионы фрагмента Glu-Fibrinopeptide в режиме MС/MС.

[0374] Де-сиалилирование с использованием нейраминидазы

[0375] Брали примерно 100 пкг образца, заменяли в нем буфер на воду, и сушили его сублимацией. Высушенный образец повторно суспендировали в нейраминидазе и инкубировали при 37 ° С. Примерно 10 пкг анализировали, как описано выше.

[0376] Интерпретация данных

[0377] Интерпретации данных масс-спектрометрии способствовало использование программного обеспечения GPMAW (Lighthouse data) в сочетании с последовательностями белка MOD-4023 (SEQ ID NO: 7).

[0378] Результаты

[0379] Анализ интактной молекулярной массы образцов непосредственно после получения

[0380] На Фиг. 20 показан скорректированный c поправкой на помехи масс-спектр, полученный при элюировании поглощающего ультрафиолетовое излучение компонента при tR 19,8 мин, полученный из анализа соединенными последовательно ЖХ/ЭР-МС образца MOD4023 партии 648-01-10-014A после де-сиалилирования.

[0381] В Таблице 3 представлена сводка результатов, полученных при масс-спектрометрическом детектировании, проведенном при анализе соединенными последовательно ЖХ/ЭР-МС образца MOD4023 партии 648-01-10-014A после де-сиалилирования

[0382] Таблица 3:

Образец	УФ пик в tR (мин)	Основной наблюдаемый сигнал (Да)	Возможное присвоение	Рассчитанная средняя химическая масса (Да)
MOD4023 Партия 648-01-10-014А после де-сиалилирования (SGS № 2307)	18,5	35232,8	MOD4023 + 13 HexNAc-Hex+1 Оксиген	35230,4
		35597,3	MOD4023 + 14 HexNAc-Hex+1 Оксиген	35595,7
		35962,5	MOD4023 + 15 HexNAc-Hex+1 Оксиген	35961,0
	36328,3	MOD4023 + 16 HexNAc-Hex+1 Оксиген	36326,0
	19,0	34851,0	MOD4023 + 12 HexNAc-Hex	34849,0
		35217,0	MOD4023 + 13 HexNAc-Hex	35214,3
		35582,3	MOD4023 + 14 HexNAc-Hex	35579,7
		35947,5	MOD4023 + 15 HexNAc-Hex	35945,0
		36312,8	MOD4023 + 16 HexNAc-Hex	36310,3
		36678,0	MOD4023 + 17 HexNAc-Hex	36675,7
	37042,9	MOD4023 + 18 HexNAc-Hex	37041,0
	19,8	35600,3	MOD4023 + 14 HexNAc-Hex+18 Да	---
35964,8	MOD4023 + 15 HexNAc-Hex+18 Да	---

[0383] Выводы

[0384] Анализ молекулярной массы трех партий белка MOD4023 проводили на образцах после де-сиалилирования с целью получения информации о количестве О-связанных сайтов гликозилирования. Систематически для всех трех партий, данные, полученные при измерении интактной массы десалиализированных образцов, приводили к сигналам, согласующимся со средней химической массой белка MOD4023 с 12-18 сайтами гликозилирования структуры HexNAc-Hex (в пределах экспериментальной погрешности прибора). Для всех трех партий наиболее интенсивным был белок, модифицированный 15 сайтами гликозилирования.

[0385] Каждый из соответствующих сигналов масс-спектра характеризовался наличием сопутствующих сигналов примерно на +16,5 Да. Этот сдвиг массы мог быть результатом добавления кислородных остатков или остатков NH₃. Последнее может происходить из-за протонирования NH₄⁺ вместо протонирования H+, приводящего к добавлению к чистому весу NH₃ (+17 Дa). Поскольку окисление, возможно, приведет к сдвигу времени элюирования (как видно из присутствия УФ-сигналов на 18,5 мин, что согласуется с массой основного пика+1 кислород), данные дают возможность предположить, что последнее объяснение является предпочтительным (сопутствующие сигналы являются результатом протонирования NH₄⁺). Тем не менее, это невозможно выяснить только из измерения интактной массы.

[0386] Результаты, полученные из данного исследования, согласуются с предыдущими анализами белка MOD4023 (данные не показаны), в которых также было обнаружено максимум 18 O-гликозилированных остатков, причем наиболее интенсивным был белок, модифицированный 15 позициями гликозилирования.

[0387] Хотя некоторые признаки, раскрытые в данном изобретении, были проиллюстрированы и описаны в данном документе, многие модификации, замены, изменения и эквиваленты теперь будут встречаться обычными специалистами в данной области техники. Поэтому следует понимать, что прилагаемая формула изобретения охватывает все такие модификации и изменения, которые относятся к истинному смыслу, раскрытому в данном документе.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> OPKO Biologics Ltd

HERSHKOVITZ, Oren

MOSCHCOVICH, Laura

<120> СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА ДОЛГОДЕЙСТВУЮЩИХ CTP-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ ГОРМОНА РОСТА

<130> P-77718-PC

<150> US 62/090,104

<151> 2014-12-10

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 1

Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser

1 5 10 15

Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu

20 25 30

Gln

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 2

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg

1 5 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

20 25

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 3

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro

1 5 10

<210> 4

<211> 301

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 4

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu

1 5 10 15

Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala

20 25 30

Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp

35 40 45

Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe

50 55 60

Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp

65 70 75 80

Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr

85 90 95

Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile

100 105 110

Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu

115 120 125

Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val

130 135 140

Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser

145 150 155 160

Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln

165 170 175

Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile

180 185 190

Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp

195 200 205

Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met

210 215 220

Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu

225 230 235 240

Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu

245 250 255

Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro

260 265 270

Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser

275 280 285

Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

290 295 300

<210> 5

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu

1 5 10 15

Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu

20 25 30

Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln

35 40 45

Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys

50 55 60

Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe

65 70 75 80

Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp

100 105 110

Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val

115 120 125

Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu

130 135 140

Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg

145 150 155 160

Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser

165 170 175

His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe

180 185 190

Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys

195 200 205

Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe

210 215

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 6

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu

1 5 10 15

Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala

20 25

<210> 7

<211> 275

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 7

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg

1 5 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile

20 25 30

Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu

35 40 45

His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile

50 55 60

Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu

65 70 75 80

Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln

85 90 95

Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln

100 105 110

Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser

115 120 125

Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp

130 135 140

Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser

145 150 155 160

Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr

165 170 175

Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr

180 185 190

Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val

195 200 205

Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys

210 215 220

Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser

225 230 235 240

Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro

245 250 255

Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile

260 265 270

Leu Pro Gln

275

<210> 8

<211> 191

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg

1 5 10 15

Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu

20 25 30

Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro

35 40 45

Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg

50 55 60

Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu

65 70 75 80

Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val

85 90 95

Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp

100 105 110

Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu

115 120 125

Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser

130 135 140

Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr

145 150 155 160

Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe

165 170 175

Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe

180 185 190

<210> 9

<211> 903

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота человеческого происхождения

<400> 9

atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg cctgccatgg 60

ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccatctct gcccagcccc 120

agcagactgc cgggccccag cgacacaccc attctgcccc agttccccac catccccctg 180

agcaggctgt tcgacaacgc catgctgagg gctcacaggc tgcaccagct ggcctttgac 240

acctaccagg agttcgagga agcctacatc cccaaggagc agaagtacag cttcctgcag 300

aacccccaga cctccctgtg cttcagcgag agcatcccca cccccagcaa cagagaggag 360

acccagcaga agagcaacct ggagctgctg aggatctccc tgctgctgat ccagagctgg 420

ctggagcccg tgcagttcct gagaagcgtg ttcgccaaca gcctggtgta cggcgccagc 480

gacagcaacg tgtacgacct gctgaaggac ctggaggagg gcatccagac cctgatgggc 540

cggctggagg acggcagccc caggaccggc cagatcttca agcagaccta cagcaagttc 600

gacaccaaca gccacaacga cgacgccctg ctgaagaact acgggctgct gtactgcttc 660

agaaaggaca tggacaaggt ggagaccttc ctgaggatcg tgcagtgcag aagcgtggag 720

ggcagctgcg gcttcagctc cagcagcaag gcccctcccc cgagcctgcc ctccccaagc 780

aggctgcctg ggccctccga cacaccaatc ctgccacaga gcagctcctc taaggcccct 840

cctccatccc tgccatcccc ctcccggctg cctggcccct ctgacacccc tatcctgcct 900

cag 903

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 10

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile

1 5 10 15

Pro Leu Ser Arg

20

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 11

Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser

1 5 10 15

Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg

20 25 30

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 12

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

1 5 10

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 13

Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys

1 5 10

<210> 14

<211> 51

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 14

Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser

1 5 10 15

Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro

20 25 30

Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile

35 40 45

Leu Pro Gln

50

<210> 15

<211> 36

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 15

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg

1 5 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile

20 25 30

Pro Leu Ser Arg

35

<210> 16

<211> 23

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 16

Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser

1 5 10 15

Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

20

<210> 17

<211> 64

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислота человеческого происхождения

<400> 17

Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro

1 5 10 15

Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro

20 25 30

Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro

35 40 45

Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

50 55 60

<---

1. Длительно действующий гормон роста человека (hGH), состоящий из двух единиц С-концевого пептида (CTP) бета-цепи хорионического гонадотропина человека, присоединенных к карбоксильному концу гормона роста человека, и одной единицы CTP, присоединенной к аминоконцу указанного hGH, при этом аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7 и каждая единица CTP содержит от 3 до 7 O-связанных гликанов.

2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанное гликозилирование происходит на указанных CTP-единицах и гликозилирование у указанного hGH отсутствует.

3. Полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что каждый CTP содержит 4, 5 или 6 O-гликанов.

4. Полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гликозилирование указанных CTP-единиц содержит по меньшей мере 15 O-гликанов.

5. Полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что полипептид содержит O-гликозилирование остатков 10, 13, 15, 21, 229, 232, 234, 240, 257, 260, 262 и 268 последовательности SEQ ID NO: 7.

6. Полипептид по п.5, отличающийся тем, что профиль гликозилирования указанного полипептида дополнительно включает O-гликозилирование между одним и четырьмя остатками, выбранными из аминокислотных остатков 1-4, между одним и четырьмя остатками, выбранными из аминокислотных остатков 220-223, между одним и тремя остатками, выбранными из аминокислотных остатков 248-251 в последовательности SEQ ID NO: 7, или их комбинации.

7. Полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что O-гликановые структуры содержат сиалилированные структуры остова.

8. Полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гликозилирование в каждом из указанных сайтов О-гликозилирования содержит структуру гликанового остова, выбранную из группы, включающей моносиалилированный остов 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc), нейтральный остов 1 (Galβ1-3GalNAc), моносиалилированный остов 1 (Neu5Acα2-6(Galβ1-3) GalNAc) или дисилиалированный остов 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAc).

9. Полипептид по любому из пп.1-8, полученный способом, включающим стадии:

a) стабильного трансфицирования заданного количества клеток, где указанные клетки не являются зародышевыми или эмбриональными клетками человека, при этом вектор экспрессии содержит кодирующую часть, кодирующую указанный CTP-модифицированный hGH; где указанная трансфицированная клетка экспрессирует и секретирует указанный CTP-модифицированный hGH;

b) получения клеточных клонов, которые сверхэкспрессируют указанный CTP-модифицированный hGH;

c) размножения указанных клонов в растворе до заданной величины;

d) сбора указанного раствора, содержащего указанные клоны;

e) фильтрования указанного раствора, содержащего указанные клоны, для получения отфильтрованного собранного раствора; и,

f) очистки указанного отфильтрованного собранного раствора с получением очищенного белкового раствора, имеющего желаемую концентрацию CTP-модифицированного hGH;

g) где указанный полипептид состоит из двух CTP, присоединенных к карбоксиконцу hGH, и одного CTP, присоединенного к аминоконцу hGH, и где указанный полученный модифицированный hGH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.

10. Композиция для лечения субъекта, нуждающегося в терапии гормоном роста или для лечения субъекта с дефицитом гормона роста, где композиция содержит в эффективном количестве полипептид по любому из предшествующих пунктов и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Композиция по п. 10, отличающаяся тем, что по меньшей мере около 90% полипептидов, присутствующих в композиции, гликозилированы путем присоединения О-гликанов между 10 и 20 положением.

12. Композиция по любому из пп. 10, 11, отличающаяся тем, что наиболее богатая О-гликанами форма гликозилированного полипептида, присутствующая в композиции, содержит между 15 и 16 O-гликанов.

13. Композиция по любому из пп. 10-12, отличающаяся тем, что по меньшей мере около 60% полипептидов, присутствующих в композиции, являются сиалилированными.

14. Композиция по любому из пп. 10-13, отличающаяся тем, что полипептид, присутствующий в композиции, содержит O-гликановую структуру с моносиалилированным остовом 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc).

15. Композиция по любому из пп. 11-14, отличающаяся тем, что основной O-гликан в композиции представляет собой моносиалилированный остов 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc).

16. Композиция по любому из пп. 13-15, отличающаяся тем, что основная сиаловая кислота в композиции представляет собой Neu5Ac.

17. Композиция по любому из пп. 10-16, имеющая одну или более следующих характеристик:

i) менее или равно 100 нг/мг (ppm - частей на миллион)) белков клетки-хозяина;

ii) менее или равно 10 пг/мг ДНК;

iii) менее 50 нг/мл метотрексата;

iv) менее или равно 60 мкг/мл пропиленгликоля;

v) менее или равно 2,5 мкг/мл Тритона;

vi) менее или равно 115 пг/мл инсулина;

vii) менее 250 мкг/мл ДМСО; или

viii) менее или равно 10 КОЕ/10 мл в анализе микробиологической нагрузки.

18. Композиция по любому из пп.10-17, полученная способом, включающим стадии:

h) стабильного трансфицирования заданного количества клеток, где указанные клетки не являются зародышевыми или эмбриональными клетками человека, причем вектор экспрессии содержит кодирующую часть, кодирующую указанный CTP-модифицированный hGH; где указанная трансфицированная клетка экспрессирует и секретирует указанный CTP-модифицированный hGH;

i) получения клеточных клонов, которые сверхэкспрессируют указанный CTP-модифицированный hGH;

j) размножения указанных клонов в растворе до заданной величины;

k) сбора указанного раствора, содержащего указанные клоны;

l) фильтрования указанного раствора, содержащего указанные клоны, для получения отфильтрованного собранного раствора; и

m) очистки указанного отфильтрованного собранного раствора с получением очищенного белкового раствора, имеющего желаемую концентрацию CTP-модифицированного hGH;

n) где указанный полипептид состоит из двух CTP, присоединенных к карбоксильному концу hGH, и одного CTP, присоединенного к аминоконцу hGH, и где указанный полученный модифицированный hGH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.

19. Способ получения полипептида по любому из пп. 1-8, включающий стадии:

(a) стабильного трансфицирования заданного количества клеток CHO или DG44 при помощи вектора экспрессии, содержащего кодирующую часть, которая кодирует указанный полипептид; причем указанная трансфицированная клетка экспрессирует и секретирует указанный полипептид;

(b) получения клеточных клонов, которые экспрессируют указанный полипептид;

(c) размножение указанных клонов в растворе до заданной величины;

(d) сбора указанного раствора, содержащего указанные клоны;

(e) фильтрования указанного раствора, содержащего указанные клоны, для получения отфильтрованного собранного раствора; и,

(f) очистки указанного отфильтрованного собранного раствора для того, чтобы получить очищенный белковый раствор, имеющий желаемую концентрацию указанного полипептида;

тем самым изготавливая CTP-модифицированный hGH, причем аминокислотная последовательность изготовленного CTP-модифицированного hGH представлена в SEQ ID NO: 7.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанная очистка (стадия f) указанного отфильтрованного собранного продукта дополнительно включает последовательное выполнение следующих стадий, включающих:

(I) концентрирование и диафильтрацию указанного отфильтрованного собранного раствора;

(II) получение указанного отфильтрованного собранного продукта, полученного на стадии (g), и инактивацию вирусов, присутствующих в указанном отфильтрованном собранном продукте, путем инкубации в растворе, токсичном для указанных вирусов;

(III) получение указанного отфильтрованного собранного раствора со стадии (h) и очистка указанного отфильтрованного собранного раствора,

a) причем указанную очистку осуществляют путем последовательного пропускания указанного отфильтрованного собранного раствора через анионообменную колонку и колонку гидрофобного взаимодействия, после чего следует стадия концентрирования и диафильтрации,

b) при этом после указанной очистки следует последовательное пропускание указанного отфильтрованного собранного раствора через колонку смешанного режима с гидроксиапатитом и катионообменную колонку;

(IV) получение указанного отфильтрованного собранного раствора после стадии (ii) и физическое отделение указанного отфильтрованного собранного раствора от вирусов путем нанофильтрации;

(V) получение указанного отфильтрованного собранного раствора после стадии (j) и концентрирование и диафильтрацию указанного отфильтрованного собранного раствора для получения максимально очищенного отфильтрованного собранного продукта, содержащего указанный CTP-модифицированный hGH.

21. Длительно действующий гормон роста человека, состоящий из двух звеньев C-концевого пептида (CTP) бета-цепи хорионического гонадотропина человека, присоединенного к карбоксиконцу гормона роста человека (hGH), и одного звена CTP, присоединенного к аминоконцу указанного hGH, где аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7 и где гормон роста человека длительного действия включает гликозилирование между 15 и 16 моносиалилированными О-гликанами с ядром 1.