Способы получения промышленных продуктов из растительных липидов

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения нефтепродукта, включающий стадии:(i) обработки в реакторе композиции, содержащей (a) вегетативные части растения, сухая масса которых составляет по меньшей мере 2 г и в которых общее содержание неполярных липидов составляет по меньшей мере 5% масс., в пересчете на сухую массу,(b) растворитель, который содержит воду, спирт или и то, и другое, и (c) необязательно катализатор, причем обработка включает нагревание композиции при температуре от около 270°C до около 400°C и давлении от 70 до 350 бар на протяжении периода от 1 до 120 минут в окислительной, восстановительной или инертной среде,(ii) извлечение нефтепродукта из реактора с выходом по меньшей мере 35% масс., в пересчете на сухую массу вегетативных частей растения, с получением таким образом нефтепродукта, где нефтепродукт является углеводородным продуктом, включающим эфиры жирных кислот, один или несколько алканов, один или несколько алкенов или комбинацию любых двух или нескольких из них. Изобретение позволяет получать нефтепродукты с высокой степенью эффективности. 9 н. и 15 з.п. ф-лы, 18 ил., 19 табл., 18 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение связано со способами получения промышленных продуктов из растительных липидов, особенно из вегетативных частей растений. В частности, в настоящем изобретении предлагаются нефтепродукты, такие как биодизельное топливо и синтетическое дизельное топливо, и способы их получения, а также растения, содержащие повышенный уровень одного или более неполярных липидов, таких как триацилглицериды, и повышенное общее содержание неполярных липидов. В одном конкретном варианте реализации изобретения настоящее изобретение связано с комбинациями модификаций двух или более ферментов, процессирующих липиды, белков масляных включений, снижения уровня ферментов, катализирующих липиды, и/или факторов транскрипции, регулирующих биосинтез липида, с повышением уровня одного или более неполярных липидов и/или общего содержания неполярных липидов и/или содержания мононенасыщенных жирных кислот в растениях или любой их части. В варианте реализации настоящее изобретение связано со способом экстракции липидов. В другом варианте реализации изобретения липид превращается в один или более углеводородных продуктов в собранных вегетативных частях растения, с целью получения алкиловых эфиров жирных кислот, пригодных для применения в качестве возобновляемого биодизельного топлива.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Большая часть энергии в мире, особенно для транспортных целей, поставляется видами топлива, полученными из нефти, запас которой ограничен. Необходимы альтернативные, возобновляемые источники энергии, например, из вырабатываемых биологическим путем масел.

Биосинтез триацилглицеридов

Триацилглицериды (ТАГ) представляют собой основную форму липидов в семенах и состоят из трех ацильных цепей, присоединенных сложноэфирной связью к глицериновому скелету. Жирные кислоты синтезируются в пластиде как промежуточные соединения ацил-ацил-переносящего белка (АПБ), и в их молекуле может образовываться первая кратная связь под действием катализатора. Данная реакция катализируется стеароил-АПБ-десатуразой и дает олеиновую кислоту (C18:1Δ9). Впоследствии ацильные цепи транспортируются к цитозолю и эндоплазматическому ретикулуму (ЭР) как тиоэфиры ацил-Коэнзим (КоА). До вхождения в основной путь биосинтеза ТАГ, также известный как путь Кеннеди или путь глицерил-3-фосфата (G3P), ацильные цепи обычно интегрируются в фосфолипиды мембраны ЭР, где в их молекулах могут образовываться дополнительные кратные связи. Двумя ключевыми ферментами в получении полиненасыщенных жирных кислот являются связанные с мембраной десатуразы FAD2 и FAD3, которые дают линолевую (C18:2Δ9,12) и α-линоленовую кислоту (C18:3Δ9,12,15), соответственно.

Биосинтез ТАГ по пути Кеннеди состоит из серии последовательных реакций ацилирования, в каждой из которых эфиры ацил-КоА используются в качестве доноров ацила. Первая стадия ацилирования обычно происходит в положении sn1 скелета G3P и катализируется глицерин-3-фосфатацилтрансферазой (sn1-GPAT). Продукт, sn1-лизофосфатидиновая кислота (sn1-LPA) служит субстратом для ацилтрансферазы лизофосфатидиновой кислоты, (LPAAT), которая осуществляет присоединение второй цепи ацила в положении sn2, с образованием фосфатидиновой кислоты (ФК). Далее ФК дефосфорилируется до диацилглицерина (ДАГ) фосфатазой фосфатидиновой кислоты (PAP), таким образом, обеспечивая субстрат для заключительной стадии ацилирования. В заключение, третья цепь ацила присоединяется сложноэфирной связью в положении sn3 ДАГ в ходе реакции, катализируемой диацилглицерилацилтрансферазой (DGAT), с образованием ТАГ, который аккумулируется в масляных включениях. Вторая ферментная реакция, осуществляемая фосфатидилглицерилацилтрансферазой (PDAT), также приводит к превращению ДАГ в ТАГ. Данная реакция не связана с DGAT, и в ней используются фосфолипиды в качестве доноров ацила.

Для максимизации выхода с целью коммерческого получения липидов существует потребность в дополнительных средствах повышения уровней липидов, особенно неполярных липидов, например, ДАГ и ТАГ, в трансгенных организмах или их частях, например, растениях, семенах, листьях, водорослях и грибах. Попытки повышения выхода нейтрального липида из растений большей частью были сосредоточены на отдельных критических ферментных стадиях, принимающих участие в биосинтезе жирных кислот или сборке ТАГ. Эти стратегии, однако, привели к скромному повышению содержания масла в семени или листьях. Недавняя работа по конструированию в области метаболизма маслянистых дрожжей Yarrowia lipolytica продемонстрировала, что комбинированный подход к повышению выхода глицерин-3-фосфата и предупреждения разложения ТАГ посредством β-окисления приводил к кумулятивному повышению общего содержания липида (Dulermo c соавт., 2011).

Липиды растений, например, триацилглицериды масла из семян (ТАГ), находят широкое применение, например, в кулинарии (рассыпчатость, текстура, аромат), промышленности (мыло, свечи, духи, косметика, пригодны в качестве агентов для сушки, изолирующих веществ, любрикантов) и обеспечивают питательную ценность. Кроме того, растет интерес к использованию липидов растительного происхождения в качестве биологического топлива.

Для максимизации выхода при коммерческом получении липидов биологическим способом существует потребность в дополнительных средствах для повышения уровней липидов, особенно неполярных липидов, например, ДАГ и ТАГ, в трансгенных организмах или их частях, например, растениях, семенах, листьях, водорослях и грибах.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторами настоящего изобретения идентифицирован способ получения нефтепродукта из вегетативных частей растения.

В первом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения нефтепродукта, включающий стадии:

(i) обработки в реакторе композиции, содержащей:

(a) вегетативные части растения, сухая масса которых составляет по меньшей мере 2 г, и в которых общее содержание неполярных липидов составляет по меньшей мере 5% масс., в пересчете на сухую массу,

(b) растворитель, который содержит воду, спирт или и то, и другое, и

(c) необязательно катализатор,

причем обработка включает нагревание композиции при температуре от около 50°C до около 450°C и давлении от 5 до 350 бар на протяжении периода от 1 до 120 минут, в окислительной, восстановительной или инертной среде,

(ii) извлечение нефтепродукта из реактора с выходом по меньшей мере 35% масс., в пересчете на сухую массу вегетативных частей растения,

с получением таким образом нефтепродукта.

В варианте реализации изобретения сухая масса вегетативных частей растения составляет по меньшей мере 1 кг.

В варианте реализации изобретения общее содержание неполярных липидов в вегетативных частях растения составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, около 25%, около 30%, около 35%, от 10% до 75%, от 20% до 75% или предпочтительно от 30% до 75%, в пересчете на сухую массу.

В варианте реализации изобретения концентрация твердых веществ в композиции составляет от 5% до 90%, предпочтительно от 15% до 50% (сухая масса/масса).

Можно применять любой подходящий катализатор. В варианте реализации изобретения катализатор представляет собой щелочь, кислоту или катализатор на основе драгоценного металла. Например, в варианте реализации изобретения катализатор содержит NaOH или KOH или оба, предпочтительно в концентрации 0,1-2 М.

В варианте реализации изобретения время обработки составляет от 1 до 60 минут, предпочтительно от 10 до 60 минут, более предпочтительно, от 15 до 30 минут. В варианте реализации изобретения, в котором давление составляет менее чем 50 бар, время реакции может составлять до 24 часов или даже до 7 дней. В предпочтительном варианте реализации изобретения температура составляет от 275°C до 360°C, давление составляет от 100 до 200 бар, и длительность реакции составляет 10-60 минут.

В варианте реализации изобретения, в котором растворитель является водой, выход нефтепродукта в результате способа составляет от по меньшей мере 36%, 37%, 38%, 39% или 40% до максимального значения 55% или предпочтительно 60% масс., в пересчете на сухую массу вегетативных частей растения. В данном варианте реализации изобретения нефтепродукт содержит по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 3 раза больше углеводородных соединений, чем эфиров жирного ацила. Предпочтительно, нефтепродукт содержит 35%, более предпочтительно, 40% C13-C22 углеводородных соединений.

В другом варианте реализации изобретения, в котором растворитель содержит спирт, предпочтительно метанол, выход нефтепродукта в результате способа составляет от по меньшей мере 36%, 37%, 38%, 39% или 40% до максимального значения 65% или предпочтительно 70% масс., в пересчете на сухую массу вегетативных частей растения. В данном варианте реализации изобретения нефтепродукт содержит по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза больше эфиров жирного ацила, чем углеводородных соединений. Предпочтительно, нефтепродукт содержит 40%, более предпочтительно, 50% метиловых эфиров жирных кислот.

В дальнейшем варианте реализации изобретения, в котором растворитель содержит около 80% воды, нефтепродукт содержит около 30% C13-C22 углеводородных соединений, предпочтительно около 35%, более предпочтительно, около 40% C13-C22 углеводородных соединений.

В другом варианте реализации изобретения, в котором растворитель содержит около 50% метанола, нефтепродукт содержит около 50% метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК).

В дальнейшем варианте реализации изобретения содержание воды в извлеченном нефтепродукте составляет менее чем около 15% масс., предпочтительно менее чем 5% масс.

В другом варианте реализации изобретения выход нефтепродукта по меньшей мере на 2% масс. больше, предпочтительно по меньшей мере на 4% масс. больше, чем выход соответствующего способа с применением соответствующих вегетативных частей растения, в которых содержание неполярного липида составляет менее чем 2%, в пересчете на сухую массу.

В варианте реализации изобретения вегетативные части растения на стадии (i)(a) физически обрабатывают одним или больше из сушки, рубки, нарезания, помола, вальцовки, прессования, дробления или перетирания. В альтернативном варианте реализации изобретения вегетативные части растения не подвергают сушке до содержания влаги менее чем 10% до приготовления композиции. Например, вегетативные части растения содержат по меньшей мере 20% или по меньшей мере 30% влаги, или вегетативные части растения сохраняют по меньшей мере 50% от содержания воды, присутствующей в них на момент их сбора.

В варианте реализации изобретения способ дополнительно включает одно или более из:

(i) гидродезоксигенации извлеченного нефтепродукта,

(ii) обработки извлеченного нефтепродукта водородом, с целью снижения уровней кетонов или сахара в нефтепродукте,

(iii) выработки синтетического газа из извлеченного нефтепродукта, и

(iv) фракционирования извлеченного нефтепродукта, с целью получения одного или более из мазута, дизельного топлива, керосина или бензина Например, стадия фракционирования может представлять собой фракционную перегонку.

В варианте реализации изобретения вегетативные части растения включают листья растения, стебли или оба.

В варианте реализации изобретения вегетативные части растения содержат комбинацию экзогенных полинуклеотидов и/или генетических модификаций, как определяется в настоящем документе.

Авторами настоящего изобретения дополнительно продемонстрировано значительное повышение содержания липидов в организмах, особенно в вегетативных частях и семени растений, путем манипулирования биосинтезом жирных кислот, сборкой липидов и путями упаковки липидов, а также снижения катаболизма липидов. Различные комбинации генов и снижение экспрессии генов применяли для достижения значительного повышения содержания масла, что имеет большое значение для выработки биотоплива и других промышленных продуктов, получаемых из масла.

Во втором аспекте настоящего изобретения предлагается рекомбинантная эукариотная клетка, содержащая:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке,

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, и любое одно или два или все три из:

c) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей генетической модификации,

d) третьего экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептида, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей четвертого экзогенного полинуклеотида, и

e) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего второй полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке.

В варианте реализации изобретения клетка содержит a), b) и c), и необязательно d) или e).

В варианте реализации изобретения клетка содержит a), b) и d), и необязательно c) или e).

В варианте реализации изобретения клетка содержит a), b) и e), и необязательно c) или d).

В варианте реализации изобретения клетка дополнительно содержит один или более или все из:

a) пятого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно связанный с липидной капелькой белок (БСЛК),

b) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей второй генетической модификации, и

c) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицеридов (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей третьей генетической модификации.

В варианте реализации изобретения рекомбинантная эукариотная клетка содержит:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке,

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, и

c) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей генетической модификации,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке, и необязательно клетка дополнительно содержит один или более или все из:

d) третьего экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК,

e) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей четвертого экзогенного полинуклеотида,

f) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей второй генетической модификации, и

g) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицеридов (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей третьей генетической модификации.

В варианте реализации изобретения клетка является растительной клеткой из или в вегетативной части растения, причем один или более или все промоторы экспрессируются в вегетативной части с более высокими уровнями, чем в семени растения.

В предпочтительном варианте реализации изобретения присутствие c), d) или e), вместе с первым и вторым экзогенными полинуклеотидами повышает общее содержание неполярных липидов в клетке, предпочтительно клетке в вегетативной части растения, такой как лист или стебель, относительно соответствующей клетки, которая содержит первый и второй экзогенные полинуклеотиды, но не содержит каждый из c), d) и e). Более предпочтительно, повышение является синергетическим. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере промотор, направляющий экспрессию первого экзогенного полинуклеотида, является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам.

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT, и полипептид, принимающий участие в катаболизме ТАГ в клетке, является липазой SDP1.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, и полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, и полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, и полипептид, принимающий участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, является липазой SDP1.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT, и полипептид, принимающий участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, является липазой SDP1.

В варианте реализации изобретения два фактора транскрипции, если они присутствуют, представляют собой WRI1 и LEC2 или WRI1 и LEC1.

В упомянутых выше вариантах реализации изобретения клетка предпочтительно находится в вегетативной части растения, которое растет на грунте или которое было выращено на грунте, с последующим сбором урожая части растения, причем клетка содержит по меньшей мере 8% масс. ТАГ (% от сухой массы), например, от 8% до 75% или от 8% до 30%. Более предпочтительно, содержание ТАГ составляет по меньшей мере 10%, например, от 10% до 75% или от 10% до 30%. Предпочтительно, указанные уровни ТАГ присутствуют в вегетативных частях до или в ходе стадии цветения или до стадии завязывания семян в ходе развития растения. В указанных вариантах реализации изобретения соотношение содержания ТАГ в листьях к содержанию ТАГ в стеблях растения предпочтительно составляет от 1:1 до 10:1, и/или соотношение повышено по сравнению с соответствующей клеткой, содержащей первый и второй экзогенные полинуклеотиды, но не содержащей первой генетической модификации.

В упомянутых выше вариантах реализации изобретения клетка предпочтительно содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, и генетическую модификацию, подавляющую выработку эндогенной липазы SDP1. Более предпочтительно, клетка не содержит экзогенного полинуклеотида, кодирующего PDAT, и/или представляет собой клетка, не являющуюся клеткой Nicotiana benthamiana, и/или WRI1 представляет собой WRI1, не являющийся WRI1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 21 или 22). Наиболее предпочтительно, по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов в клетке экспрессируется промотором, который не является конститутивным промотором, таким как промотор, который экспрессируется предпочтительно в зеленых тканях или стеблях растения или который активизируется после начала цветения или в ходе старения.

В третьем аспекте настоящего изобретения предлагается рекомбинантная эукариотная клетка, содержащая:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке,

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, и

c) третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно связанный с липидными капельками полипептид (СЛКП),

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке, и, при этом, рекомбинантная эукариотная клетка содержит повышенный уровень одного или более неполярных липидов и/или повышенное количество полипептида ПМВ, относительно соответствующей клетки, которая содержит третий экзогенный полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого комплементарна последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 176.

В варианте реализации изобретения клетка согласно упомянутому выше аспекту дополнительно содержит одно или более или все из:

d) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей первой генетической модификации,

e) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей четвертого экзогенного полинуклеотида,

f) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей второй генетической модификации, и

g) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицеридов (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей третьей генетической модификации.

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT и полипептид ПМВ является олеозином. В качестве альтернативы, полипептид ПМВ представляет собой БСЛК.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, и полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, и полипептид ПМВ является олеозином. В качестве альтернативы, полипептид ПМВ представляет собой БСЛК.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT, и полипептид ПМВ является олеозином. В качестве альтернативы, полипептид ПМВ представляет собой БСЛК.

В варианте реализации изобретения клетка содержит два экзогенных полинуклеотида, кодирующие два различных полипептида фактора транскрипции, которые повышают экспрессию в клетке одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот, такие как WRI1 и LEC2 или WRI1 и LEC1.

В предпочтительном варианте реализации изобретения присутствие третьего экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид ПМВ, предпочтительно БСЛК, вместе с первым и вторым экзогенными полинуклеотидами, повышает общее содержание неполярных липидов в растительной клетке, предпочтительно клетке в вегетативной части растения, такой как лист или стебель, относительно клетки соответствующего растения, которая содержит первый и второй экзогенные полинуклеотиды, но не содержит третьего экзогенного полинуклеотида. Более предпочтительно, повышение является синергетическим. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере промотор, направляющий экспрессию первого экзогенного полинуклеотида, является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам.

В четвертом аспекте настоящего изобретения предлагается рекомбинантная эукариотная клетка, содержащая пластиды и первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, и один или более или все из:

a) второго экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей второго экзогенного полинуклеотида,

b) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей первой генетической модификации, и

c) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей второй генетической модификации,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке.

В варианте реализации изобретения клетка, предпочтительно растительная клетка, содержит a) и необязательно b) или c).

В варианте реализации изобретения клетка согласно упомянутому выше аспекту дополнительно содержит одно или более или все из:

d) третьего экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов,

e) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей третьей генетической модификации, и

f) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК.

В предпочтительном варианте реализации изобретения клетка, предпочтительно растительная клетка, содержит первый, второй и третий экзогенные полинуклеотиды и необязательно третью генетическую модификацию или четвертый экзогенный полинуклеотид.

В предпочтительном варианте реализации изобретения присутствие второго экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, предпочтительно являющегося тиоэстеразой жирного ацила, такой как полипептид FATA, вместе с первым и, если они присутствуют, третьими экзогенными полинуклеотидами повышает общее содержание неполярных липидов в растительной клетке, предпочтительно клетке в вегетативной части растения, такой как лист или стебель, по сравнению с соответствующей растительной клеткой, которая содержит первый и, если они присутствуют, третьи экзогенные полинуклеотиды, но не содержит второго экзогенного полинуклеотида. Более предпочтительно, повышение, обеспечиваемое вторым экзогенным полинуклеотидом, является синергетическим. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере промотор, направляющий экспрессию первого экзогенного полинуклеотида, является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, предпочтительно фактором транскрипции, не являющимся WRI1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 21 или 22), а полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, является тиоэстеразой жирных кислот, предпочтительно полипептидом FATA или FATB, более предпочтительно, полипептидом FATA или тиоэстеразой жирных кислот, не являющейся тиоэстеразой среднецепочечных жирных кислот. На присутствие тиоэстеразы, не являющейся среднецепочечной тиоэстеразой, указывает процент C12:0 и/или C14:0 жирных кислот в общем содержании жирных кислот в клетке, которое является примерно таким же, как и в соответствующей клетке, не содержащей экзогенного полинуклеотида, кодирующего тиоэстеразу. Предпочтительно, клетка дополнительно содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, и генетическую модификацию, подавляющую выработку эндогенной липазы SDP1. В варианте реализации изобретения сниженная выработка липазы SDP1 действует синергетически с фактором транскрипции и тиоэстеразой жирных кислот для повышения общего содержания неполярных липидов в клетке. Более предпочтительно, клетка не содержит экзогенного полинуклеотида, кодирующего PDAT, и/или представляет собой клетку, не являющуюся клеткой Nicotiana benthamiana. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов в клетке экспрессируется промотором, который не является конститутивным промотором, таким как промотор, который предпочтительно экспрессируется в зеленых тканях или стеблях растения или активизируется в ходе старения.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, и полипептид, принимающий участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, является полипептидом ТГД.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, и полипептид, принимающий участие в выработке диацилглицерида (ДАГ), является пластидной GPAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, является тиоэстеразой жирных кислот, предпочтительно полипептидом FATA или FATB, и полипептид, принимающий участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, является полипептидом ТГД.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, является тиоэстеразой жирных кислот, предпочтительно полипептидом FATA или FATB, и полипептид, принимающий участие в выработке диацилглицерида (ДАГ), является пластидной GPAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, принимающий участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, является полипептидом ТГД, и полипептид, принимающий участие в выработке диацилглицерида (ДАГ), является пластидной GPAT.

В варианте реализации изобретения клетка содержит два экзогенных полинуклеотида, кодирующие два различных полипептида фактора транскрипции, которые повышают экспрессию в клетке одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот, такие как WRI1 и LEC2 или WRI1 и LEC1.

В вариантах реализации второго, третьего и четвертого аспектов изобретения, в которых клетка содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий тиоэстеразу жирных кислот, такую как полипептид FATA или FATB, тиоэстераза предпочтительно является полипептидом FATA или тиоэстеразой жирных кислот, не являющейся среднецепочечной тиоэстеразой жирных кислот.

В пятом аспекте настоящего изобретения предлагается рекомбинантная эукариотная клетка, содержащая:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, предпочтительно фактор транскрипции WRI,

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, которые представляют собой LPAAT с преимущественной активностью в отношении жирных кислот со средней длиной цепи (C8-C14), и

c) третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, который повышает экспорт C8-C14 жирных кислот из пластид клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей третьего экзогенного полинуклеотида,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке.

В варианте реализации изобретения третий экзогенный полинуклеотид кодирует тиоэстеразу, предпочтительно тиоэстеразу FATB с преимущественной активностью в отношении жирных кислот со средней длиной цепи (C8-C14).

В предпочтительном варианте реализации изобретения присутствие третьего экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт C8-C14 жирных кислот из пластид клетки, вместе с первыми и вторыми экзогенными полинуклеотидами повышает общее содержание СЦЖК в клетке, предпочтительно клетке вегетативной части растения, такой как лист, корень или стебель, по сравнению с соответствующей растительной клеткой, содержащей первый и второй экзогенные полинуклеотиды, но не содержащей третьего экзогенного полинуклеотида. Более предпочтительно, повышение, обеспечиваемое третьим экзогенным полинуклеотидом, является синергетическим. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере промотор, направляющий экспрессию первого экзогенного полинуклеотида, является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам.

В варианте реализации изобретения экзогенный полинуклеотид, кодирующий тиоэстеразу FATB с преимущественной активностью в отношении жирных кислот со средней длиной цепи (C8-C14), содержит аминокислоты, последовательность которых приведена в любой из SEQ ID NO: 193-199, или биологически активный фрагмент любой из них или полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 30% идентична любой одной или более из SEQ ID NO: 193-199. Более предпочтительно, экзогенный полинуклеотид, кодирующий тиоэстеразу FATB с преимущественной активностью в отношении жирных кислот со средней длиной цепи (C8-C14), содержит аминокислоты, последовательность которых приведена в SEQ ID NO: 193-199, или биологически активный фрагмент любой из них или полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 30% идентична любой одной или обеим из SEQ ID NO: 193-199.

В варианте пятого аспекта фактор транскрипции не является WRI1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 21 или 22).

В варианте пятого аспекта экзогенный полинуклеотид, кодирующий LPAAT, содержит аминокислоты, последовательность которых приведена как SEQ ID NO: 200, или его биологически активный фрагмент или полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 30% идентична им.

В варианте пятого аспекта клетка дополнительно содержит одно или более или все из:

d) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего дополнительный полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов,

e) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей первой генетической модификации,

f) пятого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК,

g) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей второй генетической модификации, и

h) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей третьей генетической модификации,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке.

В варианте пятого аспекта клетка является растительной клеткой из или в вегетативной части растения, и один или более или все из промоторов экспрессируются в вегетативной части с более высокими уровнями, чем в семени растения.

В варианте пятого аспекта жирная кислота со средней длиной цепи является по меньшей мере миристиновой кислотой. В предпочтительном варианте реализации изобретения содержание миристиновой кислоты в клетке составляет по меньшей мере около 8%, по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, от 8% до 25%, от 8% до 20%, от 10% до 25%, от 11% до 25%, от около 15% до 25%, от около 20% до 25% (масс./масс, в пересчете на сухую массу).

В вариантах реализации третьего, четвертого и пятого аспектов клетка предпочтительно находится в вегетативной части растения, которое растет на грунте или которое было выращено на грунте, с последующим сбором урожая частей растения, причем клетка содержит по меньшей мере 8% масс. ТАГ (% от сухой массы), например, от 8% до 75% или от 8% до 30%. Более предпочтительно, содержание ТАГ составляет по меньшей мере 10%, например, от 10% до 75% или от 10% до 30%. Предпочтительно, указанные уровни ТАГ присутствуют в вегетативных частях до или в ходе стадии цветения или до стадии завязывания семян в ходе развития растения. В указанных вариантах реализации изобретения соотношение содержания ТАГ в листьях к содержанию ТАГ в стеблях растения предпочтительно составляет от 1:1 до 10:1, и/или соотношение повышено по сравнению с соответствующей клеткой, содержащей первый и второй экзогенные полинуклеотиды, но не содержащей первой генетической модификации.

В вариантах второго, третьего, четвертого и пятого аспектов клетка предпочтительно содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, и генетическую модификацию, подавляющую выработку эндогенной липазы SDP1. В предпочтительном варианте реализации изобретения клетка не содержит экзогенного полинуклеотида, кодирующего PDAT, и/или клетка не является клеткой Nicotiana benthamiana и/или клетка не является клеткой Brassica napus. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов в клетке экспрессируется промотором, который не является конститутивным промотором, таким как промотор, который предпочтительно экспрессируется в зеленых тканях или стеблях растения или активизируется в ходе старения.

В варианте реализации изобретения клетка по изобретению (включая второй, третий, четвертый и пятый аспекты) обладает одним или более или всеми из следующих признаков (если это уместно):

i) в клетке повышен синтез общих жирных кислот относительно соответствующей клетки, не содержащей первого экзогенного полинуклеотида, или снижен катаболизм общих жирных кислот относительно соответствующей клетки, не содержащей первого экзогенного полинуклеотида, или присутствуют оба этих признака, таким образом, что клетка содержит повышенный уровень общих жирных кислот относительно соответствующей клетки, не содержащей первого экзогенного полинуклеотида,

ii) в клетке повышена экспрессия и/или активность ацилтрансферазы ацилов жирных кислот, катализирующей синтез ТАГ, ДАГ или МАГ, предпочтительно ТАГ, относительно соответствующей клетки, содержащей первый экзогенный полинуклеотид и не содержащей экзогенного полинуклеотида, который кодирует полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов,

iii) в клетке снижена выработка лизофосфатидиновой кислоты (LPA) из ацил-АПБ и G3P в пластидах клетки относительно соответствующей клетки, содержащей первый экзогенный полинуклеотид и не содержащей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде клетки,

iv) в клетке изменено соотношение C16:3 и C18:3 жирных кислот в содержании общих жирных кислот и/или содержании галактолипидов относительно соответствующей клетки, не содержащей экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) и/или генетической(их) модификации(й), предпочтительно соотношение снижено,

v) клетка находится в вегетативной части растения, причем общее содержание в ней неполярных липидов составляет по меньшей мере около 8%, по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75% или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу);

vi) клетка находится в вегетативной части растения, причем содержание ТАГ в ней составляет по меньшей мере около 8%, по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75% или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу),

vii) полипептид(ы) фактора транскрипции выбран(ы) из группы, состоящей из Wrinkled 1 (WRI1), Leafy Cotyledon 1 (LEC1), LEC1-подобного, Leafy Cotyledon 2 (LEC2), BABY BOOM (BBM), FUS3, ABI3, ABI4, ABI5, Dof4 и Dof11 или из группы, состоящей из MYB73, bZIP53, AGL15, MYB115, MYB118, TANMEI, WUS, GFR2a1, GFR2a2 и PHR1,

viii) олеиновая кислота составляет по меньшей мере 20% (моль %), по меньшей мере 22% (моль %), по меньшей мере 30% (моль %), по меньшей мере 40% (моль %), по меньшей мере 50% (моль %) или по меньшей мере 60% (моль %), предпочтительно около 65% (моль %) или от 20% до около 65% от содержания общих жирных кислот в клетке,

ix) неполярный липид в клетке содержит жирную кислоту, которая содержит гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, конъюгированные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них или любую из двух, трех, четырех, пяти или шести вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей,

x) неполярный липид в клетке содержит одну или более полиненасыщенных жирных кислот, выбранных из эйкозадиеновой кислоты (ЭДК), арахидоновой кислоты (АРК), стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозатриеновой кислоты (ЭТрК), эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), докозапентаеновой кислоты (ДПК), докозагексаеновой кислоты (ДГК) или комбинации двух или более из них,

xi) клетка находится в растении или его части, предпочтительно вегетативной части растения, или клетка является клеткой водорослей, например, диатомовых (бацилляриофитов), зеленых водорослей (хлорофитов), зелено-голубых водорослей (цианофитов), золотисто-коричневых водорослей (хризофитов), гаптофитов, коричневых водорослей или водорослей гетероконтов, или клетка получена из или представляет собой микроорганизм, подходящий для ферментации, такой как гриб,

xii) один или более или все из промоторов выбраны промотором, не являющегося конститутивным промотором, предпочтительно тканеспецифического промотора, такого как специфичный для листьев и/или стеблей промотор, регулируемого развитием промотора, такого как специфичный для старения промотор, например, промотор SAG12, индуцибельного промотора или регулируемого циркадным ритмом промотора, причем по меньшей мере один из промоторов, функционально связанных с экзогенным полинуклеотидом, кодирующим полипептид фактора транскрипции, предпочтительно является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам,

xiii) клетка содержит, в числе общих жирных кислот, среднецепочечные жирные кислоты, предпочтительно C12:0, C14:0 или обе, на уровне по меньшей мере 5% от общего содержания жирных кислот, и необязательно экзогенный полинуклеотид, кодирующий LPAAT, которая проявляет преимущественную активность в отношении жирных кислот со средней длиной цепи (C8-C14), предпочтительно C12:0 или C14:0;

xiv) клетка содержит, в числе общих жирных кислот, уровень олеиновой кислоты и/или уровень пальмитиновой кислоты, по меньшей мере на 2% выше, чем в соответствующей клетке,не содержащей экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) и/или генетической(их) модификации(й), и/или уровень α-линоленовой кислоты (АЛК) и/или уровень линолевой кислоты по меньшей мере на 2% ниже, чем в соответствующей клетке, не содержащей экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) и/или генетической(их) модификации(й),

xv) неполярный липид в клетке содержит модифицированный уровень общих стеролов, предпочтительно свободных (неэтерифицированных) стеролов, стероильных эфиров, стероилгликозидов, относительно неполярного липида в соответствующей клетке, не содержащей экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) и/или генетической(их) модификации(й),

xvi) неполярный липид в клетке содержит воски и/или эфиры восков,

xvii) клетка является одним из членов популяции или коллекции размером по меньшей мере около 1000 таких клеток, предпочтительно в вегетативной части растения или семени,

xviii) клетка содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий супрессор сайленсинга, причем экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке,

xix) уровень одного или более неполярных липидов и/или общее содержание неполярных липидов в клетке по меньшей мере на 2% масс. выше, чем в соответствующей клетке, которая содержит экзогенные полинуклеотиды, кодирующие WRI1 Arabidposis thaliana (SEQ ID NO: 21) и DGAT1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1), и

xx) общее содержание полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), сниженное относительно общего содержания ПНЖК в соответствующей клетке, не содержащей экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) и/или генетической(их) модификации(й).

Следующие варианты реализации изобретения применяются к клетке по изобретению (включая второй, третий, четвертый и пятый аспекты), а также к способам получения клеток и к способам применения клеток. В указанных вариантах реализации изобретения, в которых клетка находится в вегетативной части растения, предпочтительно растение растет на грунте или было выращено на грунте.

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является ацилтрансферазой ацилов жирных кислот, который принимает участие в биосинтезе ТАГ, ДАГ или моноацилглицерида (МАГ) в клетке, предпочтительно ТАГ в клетке, такой как, например, DGAT, PDAT, LPAAT, GPAT или MGAT, предпочтительно DGAT или PDAT.

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, является липазой SDP1, полипептидом Cgi58, ацил-КоА оксидазой, такой как ACX1 или ACX2 или полипептидом, принимающим участие в β-окислении жирных кислот в клетке, такой как пероксисомальный транспортер АТФ-связывающей кассеты PXA1, предпочтительно липазой SDP1.

В варианте реализации изобретения полипептид покрытия масляного включения (ПМВ) является олеозином, таким как полиолеозин или калеозин, или предпочтительно связанным с липидными капельками белком (БСЛК).

В варианте реализации изобретения полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, является тиоэстеразой C16 или C18 жирных кислот, такой как полипептид FATA или полипептид FATB, переносчиком жирных кислот, таким как полипептид ABCA9, или длинноцепочечной ацил-КоА синтетазой (ДЦАС).

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, является переносчиком жирных кислот или его субъединицей, предпочтительно полипептидом ТГД, таким как, например, полипептид TGD1, полипептид TGD2, полипептид TGD3 или полипептид TGD4.

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, является пластидной GPAT, пластидной LPAAT или пластидной PAP.

В одном варианте реализации изобретения клетка получена из или находится в растении 16:3 или в его вегетативной части или семени, причем клетка содержит одно или более или все из следующего:

a) экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей экзогенного полинуклеотида,

b) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей первой генетической модификации, и

c) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей второй генетической модификации,

причем экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке.

В альтернативном варианте реализации изобретения клетка получена из или находится в растении 18:3 или в его вегетативной части или семени.

В варианте реализации изобретения клетка получена из или находится в листе стебле или корне растения, перед цветением растения, причем общее содержание неполярных липидов в клетке составляет по меньшей мере около 8%, по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 11%, от 8% до 15%, или от 9% до 12% (масс., в пересчете на сухую массу). В варианте реализации изобретения общее содержание неполярных липидов в клетке составляет по меньшей мере на 3%, более предпочтительно по меньшей мере на 5% больше, чем общее содержание неполярных липидов в соответствующей клетке, трансформированной генами, кодирующими WRI1 и DGAT, но не содержащей других экзогенных полинуклеотидов и генетических модификаций, описанных в настоящем документе для второго, третьего, четвертого и пятого аспектов. Более предпочтительно, степень повышения находится в клетке, расположенной в стебле или корне растения.

В варианте реализации изобретения введение одного или более экзогенных полинуклеотидов или генетических модификаций, предпочтительно экзогенного полинуклеотида, кодирующего ПМВ или тиоэстеразу жирного ацила, или генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, более предпочтительно, экзогенного полинуклеотида, кодирующего тиоэстеразу FATA или БСЛК или снижающего экспрессию эндогенной липазы ТАГ, такой как липаза ТАГ SDP1, в клетке, приводит к синергетическому повышению общего содержания неполярного липида в клетке, при добавлении к паре трансгенов WRI1 и DGAT, особенно перед цветением растения и, даже более конкретно, в стеблях и/или корнях растения. Например, см. Примеры 8, 11 и 15. В предпочтительном варианте реализации изобретения повышение содержания ТАГ в клетке, расположенной в стебле или корне растения, по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно, по меньшей мере в 3 раза больше, чем в соответствующей клетки, трансформированной генами, кодирующими WRI1 и DGAT1, но не содержащей тиоэстеразы FATA, БСЛК и генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере промотор, направляющий экспрессию первого экзогенного полинуклеотида, является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам.

Генетическая модификация может быть любой модификацией природной клетки, которая обеспечивает желательный эффект. Способы генетической модификации клеток хорошо известны из уровня техники. В варианте реализации изобретения каждая из одной или более или всех генетических модификаций представляет собой мутацию эндогенного гена, которая частично или полностью инактивирует ген, предпочтительно введенную мутацию, такую как точечная мутация, инсерция или делеция (или комбинация одного или более из этого). Точечная мутация может представлять собой преждевременный стоп-кодон, мутацию сайта сращивания, мутацию сдвига рамки или мутацию замены аминокислоты, которая снижает активность гена или кодируемого полипептида. Делеция может состоять из одного или более нуклеотидов в пределах транскрибированного экзона или промотора гена, или простираться сквозь или в более чем один экзон, или расширяться до делеции всего гена. Предпочтительно делецию вводят с применением технологий ZF, ПАТЭН или ККППРП. В варианте реализации изобретения одна или более или все генетические модификации представляют собой экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая подавляет экспрессию эндогенного гена, причем экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке. Примеры экзогенного полинуклеотида, снижающего экспрессию эндогенного гена, выбраны из группы, состоящей из антисмыслового полинуклеотида, смыслового полинуклеотида, микроРНК, полинуклеотида, кодирующего полипептид, который связывается с эндогенным ферментом, молекулой двухцепочечной РНК и полученной из нее процессированной молекулой РНК. В варианте реализации изобретения клетка содержит генетические модификации, которые представляют собой введенную мутацию в эндогенном гене и экзогенном полинуклеотиде, кодирующем молекулу РНК, снижающую экспрессию другого эндогенного гена.

В варианте реализации изобретения экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, содержит одно или более из следующего:

i) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых приведена в любой из SEQ ID NO: 21-75 или 205-210, или его биологически активный фрагмент или полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 30% идентична любой одной или более из SEQ ID NO: 21-75 или 205-210,

ii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i), и

iii) нуклеотиды, которые гибридизуются с i) и/или ii) в строгих условиях. Предпочтительно, полипептид WRI1 представляет собой полипептид WRI1, не являющийся WRI1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 21 или 22). Более предпочтительно, полипептид WRI1 содержит аминокислоты, последовательность которых приведена в SEQ ID NO: 208, или их биологически активный фрагмент или полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 30% идентична им.

В варианте реализации второго, третьего, четвертого или пятого аспектов изобретения рекомбинантная клетка представляет собой клетку клубня картофеля (Solanum tuberosum), клетку клубня или листа сахарной свеклы (Beta vulgaris), клетку сахарного тростника (вид Saccharum) или стебля или листа сорго (Sorghum bicolor), клетку эндосперма однодольного растения, причем клетка содержит повышенное количество общих жирных кислот относительно соответствующей клетки эндосперма дикого типа, такой как, например, клетка зерна пшеницы (Triticum aestivum), зерна риса (вид Oryza) или семени кукурузы (Zea mays), клетка семени вида Brassica, содержащая повышенное количество общих жирных кислот, например, семя рапса, или клетка зерна боба, содержащая повышенное количество общих жирных кислот, например, семени сои (Glycine max).

В шестом аспекте настоящего изобретения предлагается организм, не относящийся к человеческому роду, или его часть, содержащий или состоящий из одной или более клеток по изобретению.

В варианте реализации изобретения часть организма, не относящегося к человеческому роду, представляет собой семя, плод или вегетативную часть растения, такую как воздушная часть растения или зеленая часть, например, лист или стебель.

В другом варианте реализации изобретения организм, не относящийся к человеческому роду, представляет собой фототрофный организм, такой как растение или водоросль или организм, подходящий для ферментации, такой как гриб.

В седьмом аспекте настоящего изобретения предлагается трансгенное растение или его часть, предпочтительно вегетативная часть растения, содержащее:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении,

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, и любое одно или два или все три из:

c) генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим генетической модификации,

d) третьего экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клеток растения, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей четвертого экзогенного полинуклеотида, и

e) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего второй полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении.

В варианте реализации изобретения растение или его часть содержит a), b) и c), и необязательно d) или e).

В варианте реализации изобретения растение или его часть содержит a), b) и d), и необязательно c) или e).

В варианте реализации изобретения растение или его часть содержит a), b) и e), и необязательно c) или d).

В предпочтительном варианте реализации изобретения присутствие c), d) или e), вместе с a) и b), повышает общее содержание неполярного липида в растении или его части, предпочтительно вегетативной части растения, такой как лист, корень или стебель, относительно соответствующего растения или его части, которое содержит a) и b), но не содержит каждого из c), d) и e). Более предпочтительно, повышение является синергетическим. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере промотор, направляющий экспрессию первого экзогенного полинуклеотида, является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам.

В варианте реализации изобретения растение или его часть дополнительно содержит одно или более или все из:

a) пятого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК,

b) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим второй генетической модификации, и

c) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим третьей генетической модификации.

В варианте реализации изобретения трансгенное растение или его часть содержит:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, предпочтительно экспрессирующийся промотором, не являющегося конститутивным промотором,

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, и

c) генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим генетической модификации,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении, и необязательно растение или его часть дополнительно содержит одно или более или все из:

d) третьего экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК,

e) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим четвертого экзогенного полинуклеотида,

f) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим второй генетической модификации, и

g) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим третьей генетической модификации.

В варианте реализации изобретения часть является вегетативной частью, причем один или более или все из промоторов экспрессируются в вегетативной части с более высокими уровнями, чем в семени растения.

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT, и полипептид, принимающий участие в катаболизме ТАГ в растении, является липазой SDP1.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, и полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, и полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, и полипептид, принимающий участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении, является липазой SDP1.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT, и полипептид, принимающий участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении, является липазой SDP1.

В варианте реализации изобретения два фактора транскрипции, если они присутствуют, представляют собой WRI1 и LEC2 или WRI1 и LEC1.

В упомянутых выше вариантах реализации изобретения растение предпочтительно растет на грунте или было выращено на грунте, с последующим сбором урожая части растения. Предпочтительно, вегетативная часть растения содержит по меньшей мере 8% масс. ТАГ (% от сухой массы), например, от 8% до 75% или от 8% до 30%. Более предпочтительно, содержание ТАГ составляет по меньшей мере 10%, например, от 10% до 75% или от 10% до 30%. Предпочтительно, указанные уровни ТАГ присутствуют в вегетативной части до или во время стадии цветения или до стадии завязывания семян в ходе развития растения. В указанных вариантах реализации изобретения соотношение содержания ТАГ в листьях к содержанию ТАГ в стеблях растения предпочтительно составляет от 1:1 до 10:1, и/или соотношение повышено по сравнению с соответствующей клеткой, содержащей первый и второй экзогенные полинуклеотиды, но не содержащей первой генетической модификации.

В упомянутых выше вариантах реализации изобретения общее содержание неполярного липида в растении или его части предпочтительно по меньшей мере на 3%, более предпочтительно, по меньшей мере на 5% выше, чем общее содержание неполярного липида в соответствующем растении или его части, трансформированной генами, кодирующими WRI1 и DGAT, но не содержащем других экзогенных полинуклеотидов и генетических модификаций, описанных в настоящем документе. Более предпочтительно, указанная степень повышения присутствует в тканях стебля или корня растения.

В упомянутых выше вариантах реализации изобретения введение одного или более экзогенных полинуклеотидов или генетических модификаций, предпочтительно экзогенного полинуклеотида, кодирующего ПМВ или тиоэстеразу жирных кислот, или генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, более предпочтительно, экзогенного полинуклеотида, кодирующего тиоэстеразу БСЛК или FATA или снижающего экспрессию эндогенной липазы ТАГ, такой как липаза ТАГ SDP1 в клетке, предпочтительно приводит к синергетическому повышению общего содержания неполярного липида в растении или его части, при добавлении к паре трансгенов WRI1 и DGAT, особенно перед цветением растения, и даже более конкретно, в ткани стебля и/или корня растения. Например, см. Примеры 8, 11 и 15. В предпочтительном варианте реализации изобретения повышение содержания ТАГ в тканях листа, стебля или корня или всех трех частей растения составляет по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно, по меньшей мере в 3 раза, относительно соответствующей части, трансформированной генами, кодирующими WRI1 и DGAT1, но не содержащей экзогенного полинуклеотида, кодирующего ПМВ или тиоэстеразу жирных кислот и генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке.

В упомянутых выше вариантах реализации изобретения растение или его часть предпочтительно содержит второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, и первую генетическую модификацию, подавляющую выработку эндогенной липазы SDP1 Более предпочтительно, растение или его часть не содержит экзогенного полинуклеотида, кодирующего PDAT, и/или представляет собой растение или его часть, не принадлежащие к Nicotiana benthamiana и/или Brassica napus, и/или WRI1 не является WRI1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 21 или 22). В варианте реализации изобретения растение не является сахарным тростником. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов в растении экспрессируется промотором, который не является конститутивным промотором, например, таким как промотор, который предпочтительно экспрессируется в зеленых тканях или стеблях растения или который регулируется после начала цветения или в ходе старения. Предпочтительно, по меньшей мере первый экзогенный полинуклеотид (кодирующий фактор транскрипции) экспрессируется таким промотором.

В восьмом аспекте настоящего изобретения предлагается трансгенное растение или его часть, предпочтительно вегетативная часть растения, содержащее:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении,

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, и

c) третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении, и, при этом, растение содержит повышенный уровень одного или более неполярных липидов и/или повышенное количество полипептида ПМВ относительно соответствующего растения, которое содержит третий экзогенный полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого комплементарна последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 176.

В предпочтительном варианте реализации изобретения присутствие третьего экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид ПМВ, вместе с первым и вторым экзогенными полинуклеотидами, повышает общее содержание неполярного липида в растении или его части, предпочтительно вегетативной части растения, такой как лист, корень или стебель, относительно соответствующей части растения, которая содержит первый и второй экзогенные полинуклеотиды, но не содержит третьего экзогенного полинуклеотида. Более предпочтительно, повышение является синергетическим. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере промотор, направляющий экспрессию первого экзогенного полинуклеотида, является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам.

В варианте реализации восьмого аспекта изобретения растение или его часть дополнительно содержит одно или более или все из:

d) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим первой генетической модификации,

e) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим четвертого экзогенного полинуклеотида,

f) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим второй генетической модификации, и

g) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим третьей генетической модификации.

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT и полипептид ПМВ является олеозином. В качестве альтернативы, полипептид ПМВ представляет собой БСЛК.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, и полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, а полипептид ПМВ является олеозином. В качестве альтернативы, полипептид ПМВ представляет собой БСЛК.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT, и полипептид ПМВ является олеозином. В качестве альтернативы, полипептид ПМВ представляет собой БСЛК.

В варианте реализации изобретения клетка содержит два экзогенных полинуклеотида, кодирующие два различных полипептида фактора транскрипции, которые повышают экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, такие как WRI1 и LEC2 или WRI1 и LEC1.

В девятом аспекте настоящего изобретения предлагается трансгенное растение или его часть, предпочтительно вегетативная часть растения, содержащее первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, и одно или более или все из:

a) второго экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим второго экзогенного полинуклеотида,

b) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим первой генетической модификации, и

c) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим второй генетической модификации,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении.

В варианте реализации изобретения растение или его часть, предпочтительно вегетативная часть растения, содержит a) и необязательно b) или c)

В варианте реализации девятого аспекта изобретения растение или его часть дополнительно содержит одно или более или все из:

d) третьего экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов,

e) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим третьей генетической модификации, и

f) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК.

В предпочтительном варианте реализации изобретения растение или его часть, предпочтительно вегетативная часть растения, содержит первый, второй и третий экзогенные полинуклеотиды и необязательно третью генетическую модификацию или четвертый экзогенный полинуклеотид.

В предпочтительном варианте реализации изобретения присутствие второго экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид растения, предпочтительно являющийся тиоэстеразой жирного ацила, такой как полипептид FATA, вместе с первым и, если они присутствуют, третьими экзогенными полинуклеотидами повышает общее содержание неполярного липида в части растения, предпочтительно вегетативной части растения, такой как лист, корень или стебель, относительно соответствующей части растения, которая содержит первый и, если они присутствуют, третьи экзогенные полинуклеотиды, но не содержит второго экзогенного полинуклеотида. Более предпочтительно, повышение, обеспечиваемое вторым экзогенным полинуклеотидом, является синергетическим. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере промотор, направляющий экспрессию первого экзогенного полинуклеотида, является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, и полипептид, принимающий участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, является полипептидом ТГД.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, а полипептид, принимающий участие в выработке диацилглицерида (ДАГ), является пластидной GPAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид растения, является тиоэстеразой жирных кислот, предпочтительно полипептидом FATA или FATB, и полипептид, принимающий участие в импорте жирных кислот в пластиды растения, является полипептидом ТГД.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид растения, является тиоэстеразой жирных кислот, предпочтительно полипептидом FATA или FATB, и полипептид, принимающий участие в выработке диацилглицерида (ДАГ), является пластидной GPAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, принимающий участие в импорте жирных кислот в пластиды растения, является полипептидом ТГД, и полипептид, принимающий участие в выработке диацилглицерида (ДАГ), является пластидной GPAT.

В варианте реализации изобретения растение содержит два экзогенных полинуклеотида, кодирующие два различных полипептида фактора транскрипции, которые повышают экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, таких как WRI1 и LEC2 или WRI1 и LEC1.

В вариантах реализации седьмого, восьмого и девятого аспектов изобретения, в которых растение содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий тиоэстеразу жирных кислот, такую как, например, полипептид FATA или FATB, тиоэстераза предпочтительно является полипептидом FATA или тиоэстеразой жирных кислот, кроме тиоэстеразы среднецепочечных жирных кислот.

В десятом аспекте настоящего изобретения предлагается трансгенное растение или его часть, предпочтительно вегетативная часть, содержащее:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении, предпочтительно фактора транскрипции WRI,

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, которые представляют собой LPAAT с преимущественной активностью в отношении жирных кислот со средней длиной цепи (C8-C14), и

c) третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, который повышает экспорт C8-C14 жирных кислот из пластид растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим третьего экзогенного полинуклеотида,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении.

В предпочтительном варианте реализации изобретения присутствие третьего экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт C8-C14 жирных кислот из пластид растения, вместе с первым и вторым экзогенными полинуклеотидами, повышает общее содержание СЦЖК в части растения, предпочтительно вегетативной части растения, такой как лист, корень или стебель, относительно соответствующей части растения, которая содержит первый и второй экзогенные полинуклеотиды, но не содержит третьего экзогенного полинуклеотида. Более предпочтительно, повышение, обеспечиваемое третьим экзогенным полинуклеотидом, является синергетическим. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере промотор, направляющий экспрессию первого экзогенного полинуклеотида, является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам.

В варианте реализации десятого аспекта изобретения трансгенное растение или его часть дополнительно содержит одно или более или все из:

d) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего дополнительный полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов,

e) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим первой генетической модификации,

f) пятого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК,

g) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим второй генетической модификации, и

h) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим третьей генетической модификации,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении.

В варианте реализации десятого аспекта изобретения фактор транскрипции не является WRI1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 21 или 22), и/или растение не является N. benthamiana.

В варианте реализации десятого аспекта изобретения экзогенный полинуклеотид, кодирующий LPAAT, содержит аминокислоты, последовательность которых приведена в SEQ ID NO: 200, или их биологически активный фрагмент или полипептид LPAAT, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 30% идентична им.

В варианте реализации десятого аспекта изобретения один или более или все из промоторов экспрессируются в вегетативной части с более высокими уровнями, чем в семени растения, предпочтительно включая по меньшей мере промотор, который экспрессирует первый экзогенный полинуклеотид.

В варианте реализации десятого аспекта изобретения жирная кислота со средней длиной цепи представляет собой по меньшей мере миристиновую кислоту (C14:0). В предпочтительном варианте реализации изобретения содержание миристиновой кислоты в части растения, предпочтительно вегетативной части растения, составляет по меньшей мере около 8%, по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, от 8% до 25%, от 8% до 20%, от 10% до 25%, от 11% до 25%, от около 15% до 25%, от около 20% до 25% (масс./масс., в пересчете на сухую массу).

В вариантах реализации шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого аспектов изобретения растение предпочтительно растет на грунте или было выращено на грунте, с последующим сбором урожая части растения, предпочтительно вегетативной части растения, причем часть растения содержит по меньшей мере 8% масс. ТАГ (% от сухой массы), например, от 8% до 75% или от 8% до 30%. Более предпочтительно, содержание ТАГ составляет по меньшей мере 10%, например, от 10% до 75% или от 10% до 30%. Предпочтительно, указанные уровни ТАГ присутствуют в вегетативной части до или во время стадии цветения или до стадии завязывания семян в ходе развития растения. В указанных вариантах реализации изобретения соотношение содержания ТАГ в листьях к содержанию ТАГ в стеблях растения предпочтительно составляет от 1:1 до 10:1, и/или соотношение повышено по сравнению с соответствующей клеткой, содержащей первый и второй экзогенные полинуклеотиды, но не содержащей первой генетической модификации.

В вариантах реализации шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого аспектов изобретения растение или его часть предпочтительно содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, и генетическую модификацию, подавляющую выработку эндогенной липазы SDP1. В предпочтительном варианте реализации изобретения растение или его часть не содержит экзогенного полинуклеотида, кодирующего PDAT, и/или растение не является растением Nicotiana benthamiana. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов в растении или его части экспрессируется промотором, который не является конститутивным промотором, например, таким как промотор, который предпочтительно экспрессируется в зеленых тканях или стеблях растения или который регулируется в ходе старения.

В одиннадцатом аспекте настоящего изобретения предлагается растение, содержащее вегетативную часть, или его вегетативная часть, причем общее содержание неполярного липида в вегетативной части составляет по меньшей мере около 18%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 18% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75% или от около 25% до 50% (масс., в пересчете на сухую массу), и, при этом, неполярный липид содержит по меньшей мере 90% триглицеридов (ТАГ).

В предпочтительных вариантах реализации изобретения вегетативная часть растения отличается признаками, описанными в седьмом, восьмом, девятом и десятом аспектах. Растение предпочтительно является растением 18:3.

В варианте реализации упомянутых выше аспектов изобретения растительную клетку или часть растения обрабатывают таким образом, что она становится неспособной размножаться или дать начало живому растению, т.е. ее убивают. Например, растительную клетку или часть растения высушивают и/или перемалывают.

В двенадцатом аспекте настоящего изобретения предлагается растение, содержащее вегетативную часть, или его вегетативная часть, причем содержание ТАГ в вегетативной части составляет по меньшей мере около 18%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 18% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75% или от около 25% до 50% (масс., в пересчете на сухую массу), и, при этом, неполярный липид содержит по меньшей мере 90% триацилглицеридов (ТАГ). Растение предпочтительно является растением 18:3.

В тринадцатом аспекте настоящего изобретения предлагается растение, содержащее вегетативную часть, или его вегетативная часть, причем общее содержание неполярного липида в вегетативной части составляет по меньшей мере 8%, по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс., в пересчете на сухую массу), и, при этом, неполярный липид содержит по меньшей мере 90% триацилглицеридов (ТАГ), при том, что растение является растением 16:3 или его вегетативной частью.

В четырнадцатом аспекте настоящего изобретения предлагается растение, содержащее вегетативную часть, или его вегетативная часть, причем содержание ТАГ в вегетативной части составляет по меньшей мере 8%, по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс., в пересчете на сухую массу), и, при этом, неполярный липид содержит по меньшей мере 90% триацилглицеридов (ТАГ), при том, что растение является растением 16:3 или его вегетативной частью.

В варианте реализации изобретения клетка по изобретению (включая второй, третий, четвертый или пятый аспекты) представляет собой клетку следующих видов или родов, или растение или его часть по изобретению (включая шестой, седьмой, восьмой, девятый, десятый, одиннадцатый, двенадцатый, тринадцатый и четырнадцатый аспекты) представляет собой Acrocomia aculeata (макаубская пальма), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (арахис), Astrocaryum murumuru (мурумуру), Astrocaryum vulgare (тукума), Attalea geraensis (атталия), Attalea humilis (американская масличная пальма), Attalea oleifera (андайя), Attalea phalerata (урикури), Attalea speciosa (бабассу), Avena sativa (овес), Beta vulgaris (сахарная свекла), виды Brassica, например, Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (рапс), Camelina sativa (ложный лен), Cannabis sativa (конопля), Carthamus tinctorius (сафлор красильный), Caryocar brasiliense (пекви), Cocos nucifera (кокосовый орех), Crambe abyssinica (абиссинская капуста), Cucumis melo (дыня), Elaeis guineensis (африканская пальма), Glycine max (соя), Gossypium hirsutum (хлопчатник), виды Helianthu, например, Helianthus annuus (подсолнечник), Hordeum vulgare (ячмень), Jatropha curcas (лечебный орех), Joannesia princeps (лещина арара), виды Lemna (ряска), такие как Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (ряска горбатая), Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida (ойтика), Linum usitatissimum (лен), Lupinus angustifolius (люпин), Mauritia flexuosa (пальма бурити), Maximiliana maripa (пальма инайя), виды Miscanthus, такие как Miscanthus x giganteus и Miscanthus sinensis, виды Nicotiana (табак), такие как Nicotiana tabacum или Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (бакаба-до-азейте), Oenocarpus bataua (патайя), Oenocarpus distichus (бакаба-де-лек), виды Oryza (рис), такие как Oryza sativa и Oryza glaberrima, Panicum virgatum (просо прутьевидное), Paraqueiba paraensis (марь), Persea amencana (авокадо), Pongamia pinnata (индийский бук), Populus trichocarpa, Ricinus communis (клещевина обыкновенная), виды Saccharum (сахарный тростник), Sesamum indicum (кунжут), Solanum tuberosum (картофель), виды Sorghum, например, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (какао), виды Trifolium, Trithrinax brasiliensis (бразильская игольчатая пальма), виды Triticum (пшеница),Triticum aestivum и Zea mays (кукуруза).

В пятнадцатом аспекте настоящего изобретения предлагается растение картофеля или его часть, предпочтительно клубень, диаметр которого составляет по меньшей мере 2 см, и содержание ТАГ в котором составляет по меньшей мере 0,5%, в пересчете на сухую массу, и/или общее содержание жирных кислот составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 1,5% или по меньшей мере 2,0%, в пересчете на сухую массу. Картофельный клубень предпочтительно содержит повышенный уровень мононенасыщенных жирных кислот (МНЖК) и/или сниженный уровень полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), как в общем содержании жирных кислот, так и во фракции ТАГ общего содержания жирных кислот, например, повышенный уровень олеиновой кислоты и сниженный уровень АЛК, по сравнению с соответствующим картофельным клубнем, не содержащим генетических модификаций и/или экзогенного(ых) полинуклеотида(ов). Предпочтительно, уровень АЛК в общем содержании жирных кислот клубня снижен до менее чем 10%, и/или уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот повышен по меньшей мере до 5%, предпочтительно по меньшей мере до 10% или, более предпочтительно, по меньшей мере до 15%, по сравнению с соответствующим картофельным клубнем, не содержащим генетических модификаций и/или экзогенного(ых) полинуклеотида(ов). Кроме того, в варианте реализации изобретения уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот клубня повышен, и/или уровни стеариновой кислоты (18:0) снижены в общем содержании жирных кислот клубня, по сравнению с соответствующим картофельным клубнем, не содержащим генетических модификаций и/или экзогенного(ых) полинуклеотида(ов). В варианте реализации изобретения содержание крахмала в клубне составляет от около 90% до 100% масс., по сравнению с клубнем дикого типа, при выращивании в одинаковых условиях.

В варианте реализации изобретения растение картофеля или его часть по изобретению, предпочтительно клубень, содержит:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клубне, и

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клубне в процессе роста растения картофеля.

В предпочтительном варианте реализации изобретения картофельный клубень дополнительно содержит одно или более или все из:

c) третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК,

d) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клубне, по сравнению с соответствующим клубнем, не содержащим первой генетической модификации, например, где полипептид является SDP1,

e) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клубня, по сравнению с соответствующим клубнем, не содержащим четвертого экзогенного полинуклеотида,

f) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды клубня, по сравнению с соответствующим клубнем, не содержащим второй генетической модификации, и

g) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиды клубня, по сравнению с соответствующим клубнем, не содержащим третьей генетической модификации.

В дальнейших вариантах реализации изобретения дополнительные генетические модификации в клубне являются такими, как определено в контексте клетки или растения по изобретению.

В шестнадцатом аспекте настоящего изобретения предлагается растение сорго или сахарного тростника или его часть, предпочтительно стебель или лист, общее содержание жирных кислот в котором составляет по меньшей мере 6% или по меньшей мере 8%, в пересчете на сухую массу, и/или содержание ТАГ в стебле составляет по меньшей мере 2% или по меньшей мере 3%, в пересчете на сухую массу, и/или содержание ТАГ повышено по меньшей мере в 50 раз в стебле и/или по меньшей мере в 100 раз в листе, в пересчете на массу. В вариантах реализации изобретения растение сорго или сахарного тростника или его часть, предпочтительно стебель или лист, отличается признаками, определенными в контексте клетки или растения или его части по изобретению.

В семнадцатом аспекте настоящего изобретения предлагается растение сорго или сахарного тростника или его часть, предпочтительно стебель или лист, которое содержит:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении или его части, и

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении или его части в процессе роста растения.

Предпочтительно, промотор, который направляет экспрессию по меньшей мере первого экзогенного полинуклеотида, представляет собой промотор, не являющийся убихитиновым промотором риса (Rubi3). Более предпочтительно, промотор не является убихитиновым промотором или любым другим конститутивным промотором. Предпочтительно, первый и второй экзогенные полинуклеотиды и их соответствующие промоторы объединены в одной генетической конструкции, которая интегрирована в геном растения.

В варианте реализации изобретения содержание сахара в стебле сахарного тростника составляет от около 70% до 100% масс. относительно стебля сахарного тростника дикого типа, при выращивании в одинаковых условиях. В качестве альтернативы, содержание сахара составляет от 50% до 70%.

В варианте реализации изобретения растение сорго или сахарного тростника или его часть, предпочтительно стебель или лист, по изобретению содержит:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в стебле(ях) растения, и

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов,

причем по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере первый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который предпочтительно экспрессируется в стебле(ях) относительно листьев в процессе роста растения.

В варианте реализации изобретения растение сорго или сахарного тростника или его часть по изобретению дополнительно содержит одно или более или все из:

c) третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК,

d) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении или его части, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими первой генетической модификации,

e) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид растения или его части, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими четвертого экзогенного полинуклеотида,

f) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды растения или его части, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими второй генетической модификации, и

g) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластидах растения или его части, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими третьей генетической модификации.

Растение сорго или сахарного тростника или его часть по изобретению предпочтительно содержит повышенный уровень мононенасыщенных жирных кислот (МНЖК) и/или сниженный уровень полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), как в общем содержании жирных кислот, так и во фракции ТАГ общего содержания жирных кислот, например, повышенный уровень олеиновой кислоты и сниженный уровень АЛК, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими генетических модификаций и/или экзогенного(ых) полинуклеотида(ов).

Предпочтительно, уровень АЛК в общем содержании жирных кислот составляет менее чем 10% и/или уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот составляет по меньшей мере 5%, предпочтительно по меньшей мере 10% или более предпочтительно по меньшей мере 15%, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими генетических модификаций и/или экзогенного(ых) полинуклеотида(ов).

В дальнейших вариантах реализации изобретения дополнительные генетические модификации в растении сорго или сахарного тростника или его части являются такими, как определено в контексте клетки или растения по изобретению.

В восемнадцатом аспекте настоящего изобретения предлагается трансгенное однодольное растение или его часть, предпочтительно лист, семя, стебель, корень или эндосперм, общее содержание жирных кислот или содержание ТАГ в котором повышено по меньшей мере в 5 раз, в пересчете на массу, по сравнению с соответствующим нетрансгенным однодольным растением или его частью. В качестве альтернативы, в изобретении предлагается трансгенное однодольное растение, содержание ТАГ в эндосперме которого составляет по меньшей мере 2,0%, предпочтительно по меньшей мере 3%, более предпочтительно, по меньшей мере 4% или по меньшей мере 5%, масс., или часть растения, предпочтительно лист, стебель, корень, зерно или эндосперм. В варианте реализации изобретения содержание ТАГ в эндосперме составляет по меньшей мере 2%, что по меньшей мере в 5 раз выше, чем в соответствующем нетрансгенном эндосперме. Предпочтительно, растение обладает полной мужской и женской фертильностью, его пыльца по существу является на 100% жизнеспособной, и скорость прорастания его семени составляет от 70% до 100% относительно соответствующего семени дикого типа. В варианте реализации изобретения трансгенное растение представляет собой растение-потомок, по меньшей мере через два поколения от начального трансгенного растения пшеницы, и предпочтительно является гомозиготным по трансгенам. В вариантах реализации изобретения однодольное растение или его часть, предпочтительно лист, стебель, семя или эндосперм, дополнительно отличается одним или более признаками, определенными в контексте клетки или растения по изобретению.

В девятнадцатом аспекте настоящего изобретения предлагается однодольное растение или его часть, предпочтительно лист, зерно, стебель или эндосперм, которое содержит:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении или его части, и

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении или его части в процессе роста растения.

Предпочтительно, промотор, который направляет экспрессию по меньшей мере первого экзогенного полинуклеотида, представляет собой промотор, не являющийся конститутивным промотором.

В варианте реализации изобретения содержание крахмала в семени однодольного растения по изобретению составляет от около 70% до 100% масс. относительно семени дикого типа, если растения, от которых они получены, выращены в одинаковых условиях. Предпочтительными однодольными растениями в упомянутых выше двух аспектах являются пшеница, рис, сорго и кукуруза (маис).

В варианте реализации изобретения однодольное растение или его часть, предпочтительно лист, зерно или эндосперм, по изобретению содержит:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в эндосперме растения, и

b) второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов,

причем по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере первый экзогенный полинуклеотид, функционально связан с промотором, который в процессе роста растения экспрессируется в эндосперме с более высокими уровнями, чем в листьях.

В предпочтительном варианте реализации изобретения однодольное растение или его часть дополнительно содержит одно или более или все из:

c) третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), предпочтительно БСЛК,

d) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении или его части, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими первой генетической модификации,

e) четвертого экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид растения или его части, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими четвертого экзогенного полинуклеотида,

f) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды растения или его части, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими второй генетической модификации, и

g) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластидах растения или его части, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими третьей генетической модификации.

В варианте реализации изобретения однодольное растение обладает признаками a), b), одним или обоими из d) и e), и необязательно одним из c), f) и g).

Однодольное растение или его часть, предпочтительно лист, семя, стебель или эндосперм по изобретению предпочтительно содержит повышенный уровень мононенасыщенных жирных кислот (МНЖК) и/или сниженный уровень полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), как в общем содержании жирных кислот, так и во фракции ТАГ общего содержания жирных кислот, например, повышенный уровень олеиновой кислоты и сниженный уровень ЛК (18:2), по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими генетических модификаций и/или экзогенного(ых) полинуклеотида(ов).

Предпочтительно, уровень линолевой кислоты (ЛК, 18:2) в общем содержании жирных кислот семени или эндосперма снижен по меньшей мере на 5%, и/или уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот повышен по меньшей мере на 5% относительно соответствующего растения дикого типа или его части, предпочтительно по меньшей мере на 10% или, более предпочтительно, по меньшей мере на 15%, по сравнению с соответствующим растением или его частью, не содержащими генетических модификаций и/или экзогенного(ых) полинуклеотида(ов).

Следующие варианты реализации изобретения применяются к каждому из растений и их частей в соответствии с пятнадцатым, шестнадцатым, семнадцатым, восемнадцатым и девятнадцатым аспектами.

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT и полипептид ПМВ является олеозином. В качестве альтернативы, полипептид ПМВ представляет собой БСЛК.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении или его части, является полипептидом WRI1, и полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении или его части, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, и полипептид ПМВ является олеозином. В качестве альтернативы, полипептид ПМВ представляет собой БСЛК.

В варианте реализации изобретения полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении или его части, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT, и полипептид ПМВ является олеозином. В качестве альтернативы, полипептид ПМВ представляет собой БСЛК.

В варианте реализации изобретения растение или его часть содержит два экзогенных полинуклеотида, кодирующие два различных полипептида фактора транскрипции, которые повышают экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, например, WRI1 и LEC2 или WRI1 и LEC1.

В каждом из вариантов реализации клеток, растений и их частей по изобретению (включая второй, третий, четвертый, пятый, шестой, седьмой, восьмой, девятый, десятый, одиннадцатый, двенадцатый, тринадцатый, четырнадцатый, пятнадцатый, шестнадцатый, семнадцатый, восемнадцатый и девятнадцатый аспекты), предпочтительно полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT, и полипептид, принимающий участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, является липазой SDP1.

В каждом из вариантов реализации клеток, растений и их частей по изобретению (включая второй, третий, пятый, шестой, седьмой, восьмой, десятый, одиннадцатый, двенадцатый, тринадцатый, четырнадцатый, пятнадцатый, шестнадцатый, семнадцатый, восемнадцатый и девятнадцатый аспекты, но исключая пятый и десятый аспекты) предпочтительно полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является полипептидом WRI1, полипептидом LEC2, полипептидом LEC1 или LEC1-подобным полипептидом, полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT или PDAT, и полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, является тиоэстеразой жирных кислот, предпочтительно полипептидом FATA или FATB, более предпочтительно, полипептидом FATA или тиоэстеразой жирных кислот, кроме тиоэстеразы среднецепочечных жирных кислот.

В каждом из упомянутых выше вариантов реализации клеток, растений и их частей по изобретению (включая второй, третий, четвертый, пятый, шестой, седьмой, восьмой, девятый, десятый, одиннадцатый, двенадцатый, тринадцатый, четырнадцатый, пятнадцатый, шестнадцатый, семнадцатый, восемнадцатый и девятнадцатый аспекты) предпочтительно полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении или его части, является комбинацией по меньшей мере двух полипептидов, предпочтительно полипептида WRI1 и полипептида LEC2. Более предпочтительно, указанные по меньшей мере два полипептида фактора транскрипции экспрессируются различными промоторами. Наиболее предпочтительно, экзогенные полинуклеотиды, кодирующие указанные по меньшей мере два полипептида, объединены на единой генетической конструкции, интегрированной в геном клетки или растения.

В каждом из упомянутых выше вариантов реализации изобретения, в которых растение является двудольным растением, указанный фактор транскрипции может быть фактором транскрипции однодольного растения. С другой стороны, если растение является однодольным растением, указанный фактор транскрипции может быть фактором транскрипции двудольного растения. Указанный фактор транскрипции предпочтительно представляет собой фактор транскрипции, не являющийся WRI1 A. thaliana (SEQ ID NO: 21 или 22).

В каждом из упомянутых выше вариантов реализации изобретения растение предпочтительно является трансгенным растением-потомком, по меньшей мере через два поколения от начального трансгенного растения, и предпочтительно является гомозиготным по трансгенам.

В дальнейших вариантах реализации изобретения дополнительные генетические модификации в растении или его части являются такими, как определено в контексте клетки по изобретению.

В варианте реализации изобретения растение или его часть по изобретению (включая шестой, седьмой, восьмой, девятый, десятый, одиннадцатый, двенадцатый, тринадцатый, четырнадцатый, пятнадцатый, шестнадцатый, семнадцатый, восемнадцатый и девятнадцатый аспекты) обладает одним или более или всеми из следующих признаков (если это уместно):

i) растение содержит часть, предпочтительно вегетативную часть, в которой повышен синтез общих жирных кислот относительно соответствующей части, не содержащей первого экзогенного полинуклеотида, или снижен катаболизм общих жирных кислот относительно соответствующей части, не содержащей первого экзогенного полинуклеотида, или присутствуют оба этих явления, таким образом, что она содержит повышенный уровень общих жирных кислот относительно соответствующей части, не содержащей первого экзогенного полинуклеотида,

ii) растение содержит часть, предпочтительно вегетативную часть, в которой повышена экспрессия и/или активность ацилтрансферазы ацилов жирных кислот, катализирующей синтез ТАГ, ДАГ или МАГ, предпочтительно ТАГ, относительно соответствующей части, содержащей первый экзогенный полинуклеотид и не содержащей экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов,

iii) растение содержит часть, предпочтительно вегетативную часть, в которой снижена выработка лизофосфатидиновой кислоты (LPA) из ацил-АПБ и G3P в пластидах относительно соответствующей части, содержащей первый экзогенный полинуклеотид и не содержащей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластидах части растения,

iv) растение содержит часть, предпочтительно вегетативную часть, которая содержит модифицированное соотношение C16:3 и C18:3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот и/или содержании галактолипидов относительно соответствующей части, не содержащей экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) и/или генетической(их) модификации(й), предпочтительно соотношение снижено,

v) общее содержание неполярного липида в вегетативной части растения составляет по меньшей мере около 8%, по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу), предпочтительно до цветения,

vi) содержание ТАГ в вегетативной части растения составляет по меньшей мере около 8%, по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу), предпочтительно до цветения,

vii) полипептид(ы) фактора транскрипции выбран(ы) из группы, состоящей из WRI1, LEC1, LEC1-подобного, LEC2, BBM, FUS3, ABI3, ABI4, ABI5, Dof4 и Dof11, предпочтительно WRI1, LEC1 или LEC2, или из группы, состоящей из MYB73, bZIP53, AGL15, MYB115, MYB118, TANMEI, WUS, GFR2a1, GFR2a2 и PHR1,

viii) олеиновая кислота составляет по меньшей мере 20% (моль %), по меньшей мере 22% (моль %), по меньшей мере 30% (моль %), по меньшей мере 40% (моль %), по меньшей мере 50% (моль %), или по меньшей мере 60% (моль %), предпочтительно около 65% (моль %) или от 20% до около 65% от общего содержания жирных кислот в растении или его части,

ix) неполярный липид в растении или его части, предпочтительно вегетативной части, содержит повышенный уровень одной или более жирных кислот, которые содержат гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, конъюгированные двойные связи, разветвленную цепь, например, метилированную или гидроксилированную разветвленную цепь, или комбинацию двух или более из этого, или любые две, три, четыре, пять или шесть из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей,

x) неполярный липид в растении или его части, предпочтительно вегетативной части, содержит одну или более полиненасыщенных жирных кислот, выбранных из эйкозадиеновой кислоты (ЭДК), арахидоновой кислоты (АРК), стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозатриеновой кислоты (ЭТрК), эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), докозапентаеновой кислоты (ДПК), докозагексаеновой кислоты (ДГК) или комбинации двух из более из них,

xi) часть является вегетативной частью растения, такой как лист или стебель или его часть,

xii) один или более или все промоторы выбраны промотором, не являющегося конститутивным промотором, предпочтительно тканеспецифического промотора, такого как специфичный для листьев и/или стеблей промотор, регулируемого развитием промотора, такого как специфичный для старения промотор, например, промотор SAG12, индуцибельного промотора или регулируемого циркадным ритмом промотора, причем по меньшей мере один из промоторов, функционально связанных с экзогенным полинуклеотидом, кодирующим полипептид фактора транскрипции, предпочтительно является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам,

xiii) растение или его часть, предпочтительно вегетативная часть, содержит, в числе общих жирных кислот, среднецепочечные жирные кислоты, предпочтительно C12:0, C14:0 или обе, на уровне по меньшей мере 5% от общего содержания жирных кислот, и необязательно экзогенный полинуклеотид, кодирующий LPAAT, которая проявляет преимущественную активность в отношении жирных кислот со средней длиной цепи (C8-C14), предпочтительно C12:0 или C14:0,

xiv) растение или его часть, предпочтительно вегетативная часть, содержит, в числе общих жирных кислот, уровень олеиновой кислоты и/или уровень пальмитиновой кислоты, по меньшей мере на 2% выше, чем в соответствующем растении или его части, не содержащей экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) и/или генетической(их) модификации(й), и/или уровень α-линоленовой кислоты (АЛК) и/или уровень линолевой кислоты, по меньшей мере на 2% ниже, чем в соответствующей клетке, не содержащей экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) и/или генетической(их) модификации(й),

xv) неполярный липид в растении или его части, предпочтительно вегетативной части, содержит модифицированный уровень общих стеролов, предпочтительно свободных (неэтерифицированных) стеролов, стероильных эфиров, стероилгликозидов, относительно неполярного липида в соответствующей клетке, не содержащей экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) и/или генетической(их) модификации(й),

xvi) неполярный липид в растении или его части содержит воски и/или эфиры восков,

xvii) растение или его часть, предпочтительно вегетативная часть, является членом популяции или коллекции размером по меньшей мере около 1000 таких растений или их частей,

xviii) растение содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий супрессор сайленсинга, причем экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении,

xix) уровень одного или более неполярных липидов и/или общее содержание неполярного липида в растении или его части, предпочтительно вегетативной части растения, по меньшей мере на 2% масс. выше, чем в соответствующей клетке, которая содержит экзогенные полинуклеотиды, кодирующие WRI1 Arabidposis thaliana (SEQ ID NO: 21) и DGAT1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1), и

xx) общее содержание полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), сниженное относительно общего содержания ПНЖК в соответствующей клетке, не содержащей экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) и/или генетической(их) модификации(й).

xxi) часть растения является клубнем картофеля (Solanum tuberosum), сахарной свеклы (Beta vulgaris), стеблем сахарного тростника (вид Saccharum) или сорго (Sorghum bicolor) семенем однодольного растения с повышенным общим содержанием жирных кислот в эндосперме, например, зерном пшеницы (Triticum aestivum) или зернышком кукурузы (Zea mays), листом вида Nicotiana или семенем боба с повышенным общим содержанием жирных кислот, например, семенем вида Brassica или семенем сои (Glycine max),

xxii) если часть растения является семенем, то семя прорастает в существенной мере с такой же скоростью, как и соответствующее семя дикого типа, или при высевании в грунт дает растение, семена которого прорастают в существенной мере с такой же скоростью относительно соответствующего семени дикого типа, и

xxiii) растение является водорослевым растением, например, из числа диатомовых (бацилляриофитов), зеленых водорослей (хлорофитов), зелено-голубых водорослей (цианофитов), золотисто-коричневых водорослей (хризофитов), гаптофитов, коричневых водорослей или водорослей гетероконтов.

В упомянутых выше вариантах реализации изобретения предпочтительной частью растения является фрагмент листа с площадью поверхности по меньшей мере 1 см2 или фрагмент стебля длиной по меньшей мере 1 см.

В варианте реализации упомянутых выше аспектов изобретения растение или часть растения обрабатывают таким образом, что она становится неспособной размножаться или дать начало живому растению, т.е. ее убивают. Например, растение или часть растения высушивают и/или перемалывают.

В упомянутых выше вариантах реализации изобретения общее содержание неполярного липида в части растения предпочтительно по меньшей мере на 3% выше, более предпочтительно, по меньшей мере на 5% выше, чем общее содержание неполярного липида в соответствующей части растения, трансформированной генами, кодирующими WRI1 и DGAT, но не содержащей других экзогенных полинуклеотидов и генетических модификаций, описанных в настоящем документе для упомянутых выше аспектов. Более предпочтительно, указанная степень повышения относится к стеблю или корню растения.

В варианте реализации изобретения введение одного или более экзогенных полинуклеотидов или генетических модификаций, предпочтительно экзогенного полинуклеотида, кодирующего ПМВ или тиоэстеразу жирного ацила, или генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, более предпочтительно, экзогенного полинуклеотида, кодирующего тиоэстеразу FATA или БСЛК или снижающего экспрессию эндогенной липазы ТАГ, такой как липаза ТАГ SDP1, в клетке, приводит к синергетическому повышению общего содержания неполярного липида в клетке, при добавлении к паре трансгенов WRI1 и DGAT, особенно перед цветением растения и, даже более конкретно, в стеблях и/или корнях растения. Например, см. Примеры 8, 11 и 15. В предпочтительном варианте реализации изобретения повышение содержания ТАГ в клетке, расположенной в стебле или корне растения, по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно, по меньшей мере в 3 раза выше, чем в соответствующей клетке, трансформированной генами, кодирующими WRI1 и DGAT1, но не содержащей тиоэстеразы FATA, БСЛК и генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении. Наиболее предпочтительно, по меньшей мере промотор, направляющий экспрессию первого экзогенного полинуклеотида, является промотором, не принадлежащим к конститутивным промоторам.

В вариантах реализации шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого, двенадцатого, тринадцатого, четырнадцатого, шестнадцатого, восемнадцатого и девятнадцатого аспектов изобретения растение или его часть предпочтительно является фенотипически нормальным в том смысле, что его способность расти и воспроизводиться в существенной мере не снижена, по сравнению с немодифицированным растением или его частью. Предпочтительно биомасса, скорость роста, скорость прорастания, размер запасающего органа, размер семени и/или количество образованных жизнеспособных семян составляет не менее чем 90% от показателей соответствующего растения дикого типа, при выращивании в идентичных условиях. В варианте реализации изобретения растение обладает мужской и женской фертильностью в той же степени, что и соответствующее растение дикого типа, а его пыльца (если она образуется) так же жизнеспособна, как и пыльца соответствующего растения дикого типа, предпочтительно жизнеспособность составляет около 100%. В варианте реализации изобретения растение образует семя, которому свойственна скорость прорастания по меньшей мере 90% относительно скорости прорастания соответствующего семени растения дикого типа, если вид растений образует семена. В варианте реализации изобретения высота растения по изобретению составляет по меньшей мере 90% относительно высоты соответствующего растения дикого типа, выращенного в таких же условиях. Комбинация каждого из указанных признаков включена. В альтернативном варианте реализации изобретения высота растения по изобретению составляет от 60% до 90% относительно высоты соответствующего растения дикого типа, выращенного в таких же условиях. В варианте реализации изобретения растение или его часть по изобретению, предпочтительно лист растения, не проявляет усиленного некроза, т.е. степень некроза, если он присутствует, такая же, какую демонстрирует соответствующее растение дикого типа или его часть, выращенное в таких же условиях и находящееся на такой же стадии развития растения. Данный признак применяется, в частности, к растению или его части, содержащему экзогенный полинуклеотид, кодирующий тиоэстеразу жирных кислот, такой как тиоэстераза FATB.

Следующие варианты реализации изобретения применяются к растению или его части по изобретению (включая шестой, седьмой, восьмой, девятый, десятый, одиннадцатый, двенадцатый, тринадцатый, четырнадцатый, шестнадцатый, восемнадцатый и девятнадцатый аспекты), а также к способу получения растения или его части или способу их применения. В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является ацилтрансферазой ацилов жирных кислот, принимающей участие в биосинтезе ТАГ, ДАГ или моноацилглицерида (МАГ) в растении или его части, предпочтительно ТАГ в растении или его части, такой как DGAT, PDAT, LPAAT, GPAT или MGAT, предпочтительно DGAT или PDAT.

В другом варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в растении или части растения, является липазой SDP1, полипептидом Cgi58, ацил-КоА оксидазой, такой как ACX1 или ACX2, или полипептидом, принимающим участие в β-окислении жирных кислот в растении, таким как пероксисомальный транспортер АТФ-связывающей кассеты PXA1, предпочтительно липазой SDP1.

В варианте реализации изобретения полипептид покрытия масляного включения (ПМВ) является олеозином, таким как полиолеозин или калеозин, или предпочтительно связанным с липидными капельками белком (БСЛК).

В варианте реализации изобретения полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид растения, является тиоэстеразой C16 или C18 жирных кислот, такой как полипептид FATA или полипептид FATB, переносчиком жирных кислот, таким как полипептид ABCA9 или длинноцепочечная ацил-КоА синтетаза (ДЦАС).

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в импорте жирных кислот в пластиды растения, является переносчиком жирных кислот или его субъединицей, предпочтительно полипептидом ТГД, таким как полипептид TGD1, полипептид TGD2, полипептид TGD3 или полипептид TGD4.

В варианте реализации изобретения полипептид, принимающий участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, является пластидной GPAT, пластидной LPAAT или пластидной PAP.

В варианте реализации изобретения растение или его часть по изобретению является растением 16:3 или его частью, которая содержит одно или более или все из следующего:

a) экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим экзогенного полинуклеотида,

b) первой генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды растения, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим первой генетической модификации, и

c) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующим растением, не содержащим второй генетической модификации,

причем экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении, или его части.

В альтернативном варианте реализации изобретения растение или его часть по изобретению является растением 18:3 или его частью.

В варианте реализации изобретения общее содержание неполярного липида в вегетативной части растения перед цветением растения составляет по меньшей мере около 8%, по меньшей мере около 10%, около 11%, от 8% до 15%, или от 9% до 12% (масс./масс., в пересчете на сухую массу)

В варианте реализации изобретения одна или более или все из генетических модификаций представляют собой мутацию эндогенного гена, которая частично или полностью инактивирует ген, такую как точечная мутация, инсерция или делеция (или комбинация одного или более из этого), предпочтительно введенную мутацию. Точечная мутация может представлять собой преждевременный стоп-кодон, мутацию сайта сращивания, мутацию сдвига рамки или мутацию замены аминокислоты, которая снижает активность гена или кодируемого полипептида. Делеция может состоять из одного или более нуклеотидов в пределах транскрибированного экзона или промотора гена, или простираться сквозь или в более чем один экзон, или расширяться до делеции всего гена. Предпочтительно делецию вводят с применением технологий ZF, ПАТЭН или ККППРП. В альтернативном варианте реализации изобретения одна или более или все генетические модификации представляют собой экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая подавляет экспрессию эндогенного гена, причем экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в растении или его части.

В варианте реализации изобретения экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, содержит одно или более из следующего:

i) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых приведена в любой из SEQ ID NO: 21-75 или 205-210, или его биологически активный фрагмент или полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 30% идентична любой одной или более из SEQ ID NO: 21-75 или 205-210,

ii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i), и

iii) нуклеотиды, которые гибридизуются с i) и/или ii) в строгих условиях. Предпочтительно, полипептид WRI1 представляет собой полипептид WRI1, не являющийся WRI1 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 21 или 22). Более предпочтительно, полипептид WRI1 содержит аминокислоты, последовательность которых приведена в SEQ ID NO: 208, или их биологически активный фрагмент или полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 30% идентична им.

В варианте реализации изобретения общее содержание неполярного липида или одного или более неполярных липидов и/или уровень олеиновой кислоты или ПНЖК в растении или его части определяют методом анализа метиловых эфиров жирных кислот, полученных из растения или его вегетативной части, с применением газовой хроматографии.

В дальнейшем варианте реализации изобретения, в котором часть растения является листом, общее содержание неполярного липида в листе определяют методом анализа с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

В варианте реализации изобретения растение или его часть является членом популяции или коллекции размером по меньшей мере около 1000 таких растений или их частей.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается популяция размером по меньшей мере около 1000 растений, каждое из которых представляет собой растение по изобретению, выращенное в поле.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается коллекция размером по меньшей мере около 1000 вегетативных частей растения, каждая из которых является вегетативной частью растения по изобретению, причем урожай вегетативных частей растения собран с растений, растущих в поле.

В варианте реализации клетки, организма, не относящегося к человеческому роду, растения или его части по изобретению, полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, является фактором транскрипции WRI1, полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов, является DGAT, например, DGAT1 или DGAT2, или PDAT, и полипептид, принимающий участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, является липазой SDP1. В предпочтительном варианте реализации изобретения полипептид покрытия масляного включения (ПМВ) является олеозином, полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, является тиоэстеразой жирных кислот, например, тиоэстеразой FATA или FATB, полипептид, принимающий участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, является полипептидом ТГД, предпочтительно полипептидом TGD1, и полипептид, принимающий участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, является пластидной GPAT. В более предпочтительном варианте реализации изобретения клетка находится в вегетативной части растения, причем содержание ТАГ в вегетативной части растения перед цветением растения составляет по меньшей мере 8% (% от сухой массы).

В варианте реализации изобретения растение, вегетативная часть растения, организм, не относящийся к человеческому роду, или его часть, семя или клубень картофеля содержат первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, второй экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT или ПДАТ, предпочтительно DGAT1, третий экзогенный полинуклеотид, кодирующий РНК, которая уменьшает экспрессию гена, кодирующего полипептид SPD1, и четвертый экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин. В предпочтительных вариантах реализации изобретения, в вегетативной части растения, организме, не относящемся к человеческому роду, или его части, семени или клубне картофеля присутствует один или более, или все из следующих признаков:

i) общее содержание липида по меньшей мере 8%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 14% или по меньшей мере 15,5% (%, масс.);

ii) общее содержание липида в вегетативной части растения или организме, не относящемся к человеческому роду, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз или по меньшей мере в 10 раз выше относительно соответствующей вегетативной части растения или организма, не относящегося к человеческому роду, в которых отсутствуют экзогенные полинуклеотиды;

iii) общее содержание ТАГ составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 6,5% или по меньшей мере 7% (%, масс. в пересчете на массу сухого вещества или массу семени);

iv) общее содержание ТАГ по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз или по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 100 раз или по меньшей мере в 120 раз выше, чем в соответствующей вегетативной части растения или организма, не относящегося к человеческому роду, в которых отсутствуют экзогенные полинуклеотиды;

v) олеиновая кислота составляет по меньшей мере 15%, по меньшей мере 19% или по меньшей мере 22% (%, масс., в пересчете на массу сухого семени) всех жирных кислот в ТАГ;

vi) уровень олеиновой кислоты в ТАГ по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз или по меньшей мере в 17 раз превышает уровень в соответствующей вегетативной части растения или организме, не относящемся к человеческому роду, в которых отсутствуют экзогенные полинуклеотиды;

vii) пальмитиновая кислота составляет по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 33% (%, масс.) жирных кислот в ТАГ;

viii) уровень пальмитиновой кислоты в ТАГ по меньшей мере в 1,5 раза выше относительно соответствующей вегетативной части растения или организма, не относящегося к человеческому роду, в которых отсутствуют экзогенные полинуклеотиды;

ix) линолевая кислота составляет по меньшей мере 22%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 34% (%, масс.) жирных кислот в ТАГ;

x) α-линоленовая кислота составляет менее 20%, менее 15%, менее 11% или менее 8% (%, масс.) жирных кислот в ТАГ,

xi) уровень α-линоленовой кислоты в ТАГ по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 8 раз ниже, чем в соответствующей вегетативной части растения или организме, не относящемся к человеческому роду, в которых отсутствуют экзогенные полинуклеотиды, и

xii) для картофельного клубня, содержание ТАГ составляет по меньшей мере 0,5%, в пересчете на сухую массу, и/или общее содержание жирных кислот составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 1,5% или по меньшей мере 2,0%, в пересчете на сухую массу.

Дополнительно предлагается семя растения по изобретению или полученное от такого растения.

В другом аспекте изобретения предлагается трансгенный стебель растения или часть стебля размером по меньшей мере 1 г сухой массы, содержание ТАГ в которой составляет по меньшей мере 5% масс. (сухая масса), предпочтительно по меньшей мере 6%, более предпочтительно по меньшей мере 7%. В варианте реализации изобретения трансгенный стебель растения или часть стебля принадлежит, или предпочтительно ее урожай собран с двудольного растения. В качестве альтернативы, трансгенный стебель растения или часть стебля принадлежит, или предпочтительно ее урожай собран с однодольного растения. В варианте реализации изобретения стебель растения или часть стебля принадлежит или получена от растения, не являющегося сахарным тростником. В вариантах реализации изобретения стебель растения или часть стебля дополнительно отличается одним или более признаками, определенными в контексте клетки или растения по изобретению.

В другом аспекте изобретения предлагается растительная клетка, содержащая:

a) первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий PDAT,

b) первую генетическую модификацию, подавляющую эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, предпочтительно полипептида ТГД, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей первой генетической модификации, и одно или более из:

c) второй генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, предпочтительно полипептида SDP1, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей генетической модификации,

d) второго экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки, предпочтительно тиоэстеразу жирного ацила, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей второго экзогенного полинуклеотида, и

e) третьей генетической модификации, подавляющей эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей третьей генетической модификации,

причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию полинуклеотида в клетке. В предпочтительном варианте реализации изобретения присутствие в клетке первой, второй или третьей генетической модификации или второго экзогенного полинуклеотида синергетически повышает общее содержание неполярного липида в клетке, по сравнению с соответствующей клеткой, содержащей PDAT, но не содержащей дополнительной генетической модификации или экзогенного полинуклеотида. Более предпочтительно, по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов экспрессируется промотором, который не принадлежит к конститутивным промоторам.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения рекомбинантной эукариотной клетки по изобретению, включающий стадии:

i) введения в эукариотную клетку по меньшей мере одного экзогенного полинуклеотида и/или по меньшей мере одной генетической модификации, определенной в настоящем документе, с получением эукариотной клетки, содержащей набор экзогенных полинуклеотидов и/или генетических модификаций, определенных в настоящем документе,

ii) экспрессии экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) в клетке или ее клетке-потомке,

iii) анализ содержания липидов в клетке или ее клетке-потомке, и

iv) отбор клетки по изобретению.

В варианте реализации изобретения один или более экзогенные полинуклеотиды стабильно интегрированы в геном клетки или ее клетки-потомка.

В варианте реализации изобретения способ дополнительно включает стадию регенерации трансгенного растения из клетки или клетки-потомка, содержащей один или более экзогенных полинуклеотидов.

В дальнейшем варианте реализации изобретения стадия регенерации трансгенного растения выполняется до стадии экспрессии одного или более экзогенных полинуклеотидов в клетке или ее клетке-потомке и/или до стадии анализа содержимого липида в клетке или ее клетке-потомке и/или до стадии отбора клетки или клетки-потомка, содержащей повышенный уровень одного или более неполярных липидов.

В другом варианте реализации изобретения способ дополнительно содержит стадию получения семени или растения-потомка из трансгенного растения, причем семя или растение-потомок содержит один или более экзогенных полинуклеотидов.

Еще в другом варианте реализации изобретения отобранная клетка или регенерированное из нее растение или вегетативная часть растения или семя регенерированного растения обладает одним или более признаками, определенными в настоящем документе.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения растения, в геном которого интегрирован набор экзогенных полинуклеотидов и/или генетических модификаций, определенных в настоящем документе, причем способ включает стадии:

i) скрещивания двух материнских растений, и, при этом, одно растение содержит по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов и/или по меньшей мере одну из генетических модификаций, определенных в настоящем документе, и другоерастение содержит по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов и/или по меньшей мере одну из генетических модификаций, определенных в настоящем документе, притом, что два материнских растения содержат набор экзогенных полинуклеотидов и/или генетических модификаций, определенных в настоящем документе,

ii) скрининг одного или более растений-потомков скрещивания на предмет присутствия или отсутствия набора экзогенных полинуклеотидов и/или генетических модификаций, определенных в настоящем документе, и

iii) отбор растения-потомка, содержащего набор экзогенных полинуклеотидов и/или генетических модификаций, определенных в настоящем документе,

с получением таким образом растения.

Дополнительно предложена трансгенная клетка или трансгенное растение, полученные с применением способа по изобретению, или его часть, полученная из него, которая содержит набор экзогенных полинуклеотидов и/или генетических модификаций, определенных в настоящем документе.

Дополнительно предлагается применение набора экзогенных полинуклеотидов и/или генетических модификаций, определенных в настоящем документе, для получения трансгенной клетки, трансгенного организма, не относящегося к человеческому роду, или его части или семени, обладающих повышенной способностью к выработке одного или более неполярных липидов относительно соответствующей клетки, организма, не относящегося к человеческому роду, или его части или семени, не содержащих набора экзогенных полинуклеотидов и/или генетических модификаций, причем каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию экзогенного полинуклеотида в трансгенной клетке, трансгенном организме, не относящемся к человеческому роду, или его части или семени.

Предпочтительно, по меньшей мере один из промоторов, функционально связанных с экзогенным полинуклеотидом, который кодирует полипептид фактора транскрипции, представляет собой промотор, не принадлежащий к конститутивным промоторам.

В варианте реализации изобретения трансгенная клетка, организм, не относящийся к человеческому роду, или его часть или семя обладает одним или более признаками, определенными в настоящем документе.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения промышленного продукта, включающий стадии:

i) получение рекомбинантной эукариотной клетки по изобретению, трансгенного организма, не относящегося к человеческому роду, или его части по изобретению, трансгенного растения или его части по изобретению, семени по изобретению, или трансгенной клетки или трансгенного растения или его части по изобретению, и

ii) превращение по меньшей мере части липида в клетке, организме, не относящемся к человеческому роду, или его части, растении или его части, или семени в промышленный продукт, с применением нагревания, химических или ферментных средств или любой их комбинации к липиду in situ в организме, не относящемся к человеческому роду, или его части, и

iii) извлечение промышленного продукта,

с получением таким образом промышленного продукта.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения промышленного продукта, включающий стадии:

i) получение рекомбинантной эукариотной клетки по изобретению, трансгенного организма, не относящегося к человеческому роду, или его части по изобретению, трансгенного растения или его части по изобретению, семени по изобретению, или трансгенной клетки или трансгенного растения или его части по изобретению, и

ii) физическая обработка клетки, организма, не относящегося к человеческому роду, или его части, растения или его части или семени со стадии i),

iii) одновременное или последующее превращение по меньшей мере части липида в обрабатываемой клетке, организме, не относящемся к человеческому роду, или его части, растении или его части или семени в промышленный продукт, с применением нагревания, химических или ферментных средств или любой их комбинации к липиду в обрабатываемой клетке, организме, не относящемся к человеческому роду, или его части, растении или его части или семени, и

iv) извлечение промышленного продукта,

с получением таким образом промышленного продукта.

В варианте реализации двух упомянутых выше аспектов изобретения часть растения является вегетативной частью растения.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения промышленного продукта, включающий стадии:

i) получение вегетативной части растения с общим содержанием неполярного липида по меньшей мере около 18%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 18% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу),

ii) превращение по меньшей мере части липида в вегетативной части растения в промышленный продукт, с применением нагревания, химических или ферментных средств или любой их комбинации к липиду in situ в вегетативной части растения, и

iii) извлечение промышленного продукта,

с получением таким образом промышленного продукта.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения промышленного продукта, включающий стадии:

i) получение вегетативной части растения с общим содержанием неполярного липида по меньшей мере около 18%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 18% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу),

ii) физическая обработка вегетативной части растения со стадии i),

iii) одновременное или последующее превращение по меньшей мере части липида в обрабатываемой вегетативной части растения в промышленный продукт, с применением нагревания, химических или ферментных средств или любой их комбинации к липиду в обрабатываемой вегетативной части растения, и

iv) извлечение промышленного продукта,

с получением таким образом промышленного продукта.

Еще в другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения промышленного продукта, включающий стадии:

i) получение вегетативной части растения с общим содержанием неполярного липида по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу), причем растение является растением 16:3 или его вегетативной частью,

ii) превращение по меньшей мере части липида в вегетативной части растения в промышленный продукт, с применением нагревания, химических или ферментных средств или любой их комбинации к липиду in situ в вегетативной части растения, и

iii) извлечение промышленного продукта,

с получением таким образом промышленного продукта.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения промышленного продукта, включающий стадии:

i) получение вегетативной части растения с общим содержанием неполярного липида по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу), причем растение является растением 16:3 или его вегетативной частью,

ii) физическая обработка вегетативной части растения со стадии i),

iii) одновременное или последующее превращение по меньшей мере части липида в обрабатываемой вегетативной части растения в промышленный продукт, с применением нагревания, химических или ферментных средств или любой их комбинации к липиду в обрабатываемой вегетативной части растения, и

iv) извлечение промышленного продукта,

с получением таким образом промышленного продукта.

В варианте реализации изобретения стадия физической обработки клетки, организма, не относящегося к человеческому роду, или его части, растения или его части, или семени включает одно или более из вальцовки, прессования, дробления или помола клетки, организма, не относящегося к человеческому роду, или его части, растения или его части, или семени.

В варианте реализации изобретения способ включает стадии:

(a) экстракция по меньшей мере части неполярного липида, содержащегося в клетке, организме, не относящемся к человеческому роду, или его части, растении или его части, или семени в форме неполярного липида, и

(b) извлечение экстрагированного неполярного липида,

причем стадии (a) и (b) выполняются до стадии превращения по меньшей мере части липида в клетке, организме, не относящемся к человеческому роду, или его части, растении или его части, или семени в промышленный продукт.

В варианте реализации изобретения экстрагированный неполярный липид содержит триацилглицериды, причем триацилглицериды составляют по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% экстрагированного липида.

В варианте реализации изобретения промышленный продукт является углеводородным продуктом, таким как эфиры жирных кислот, предпочтительно метиловые эфиры жирных кислот и/или этиловые эфиры жирных кислот, алкан, например, метан, этан или длинноцепочечный алкан, смесь алканов с более длинной цепью, алкен, биотопливо, газообразный монооксид углерода и/или водород, биоспирт, например, этанол, пропанол или бутанол, биоуголь или комбинация монооксида углерода, водорода и биоугля. В предпочтительном варианте реализации изобретения общие жирные кислоты в вегетативной части растения содержат по меньшей мере 5% C12:0, C14:0, или сумма C12:0 и C14:0 составляет по меньшей мере 5% от общего содержания жирных кислот, и промышленный продукт, полученный из липида вегетативной части растения, является компонентом авиационного топлива.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения экстрагированного липида, включающий стадии:

i) получение рекомбинантной эукариотной клетки по изобретению, трансгенного организма, не относящегося к человеческому роду, или его части по изобретению, трансгенного растения или его части по изобретению, семени по изобретению, или трансгенной клетки или трансгенного растения или его части по изобретению,

ii) экстракция липида из клетки, организма, не относящегося к человеческому роду, или его части, растения или его части, или семени, и

iii) извлечение экстрагированного липида,

с получением таким образом экстрагированного липида.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения экстрагированного липида, включающий стадии:

i) получение вегетативной части растения с общим содержанием неполярного липида по меньшей мере около 18%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 18% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу),

ii) экстракцию липида из вегетативной части растения, и

iii) извлечение экстрагированного липида,

с получением таким образом экстрагированного липида.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения экстрагированного липида, включающий стадии:

i) получение вегетативной части растения с общим содержанием неполярного липида по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу), причем растение является растением 16:3 или его вегетативной частью,

ii) экстракцию липида из вегетативной части растения, и

iii) извлечение экстрагированного липида,

с получением таким образом экстрагированного липида.

В варианте реализации изобретения способ экстракции включает одно или более из сушки, вальцевания, прессования, дробления или помола клетки, организма, не относящегося к человеческому роду, или его части, растения или его части, или семени, и/или очистки экстрагированного липида или масла из семян.

В варианте реализации изобретения органический растворитель применяется в способе в процессе экстракции, для экстрагирования масла.

В дальнейшем варианте реализации изобретения способ включает извлечение экстрагированного липида или масла путем сбора его в емкость и/или одного или более из дегуммации, дезодорирования, обесцвечивания, сушки, фракционирования экстрагированного липида или масла, удаления по меньшей мере некоторых восков и/или эфиров восков из экстрагированного липида или масла или анализа состава жирных кислот экстрагированного липида или масла.

В варианте реализации изобретения объем экстрагированного липида или масла составляет по меньшей мере 1 литр.

В дальнейшем варианте реализации изобретения применяются один или более или все из следующих признаков:

(i) экстрагированный липид или масло содержит триацилглицериды, причем триацилглицериды составляют по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% или по меньшей мере 96% экстрагированного липида или масла,

(ii) экстрагированный липид или масло содержит свободные стеролы, стероильные эфиры, стероилгликозиды, воски или эфиры восков или любую их комбинацию, и

(iii) общее содержание и/или состав стеролов в экстрагированном липиде или масле значительно отличается от содержания и/или состава стеролов в экстрагированном липиде или масле, полученном из соответствующей клетки, организма, не относящегося к человеческому роду, или его части, растения или его части, или семени.

В варианте реализации изобретения способ дополнительно включает превращение экстрагированного липида или масла в промышленный продукт.

В варианте реализации изобретения промышленный продукт является углеводородным продуктом, таким как эфиры жирных кислот, предпочтительно метиловые эфиры жирных кислот и/или этиловые эфиры жирных кислот, алкан, например, метан, этан или длинноцепочечный алкан, смесь алканов с более длинной цепью, алкен, биотопливо, газообразный монооксид углерода и/или водород, биоспирт, например, этанол, пропанол или бутанол, биоуголь или комбинация монооксида углерода, водорода и биоугля. В предпочтительном варианте реализации изобретения общие жирные кислоты в вегетативной части растения содержат по меньшей мере 5% C12:0, C14:0, или сумма C12:0 и C14:0 составляет по меньшей мере 5% от общего содержания жирных кислот, и промышленный продукт, полученный из липида вегетативной части растения, является компонентом авиационного топлива.

В дальнейшем варианте реализации изобретения часть растения является воздушной частью растения или зеленой частью растения, предпочтительно вегетативной частью растения, такой как лист или стебель растения. В альтернативном варианте реализации изобретения часть растения является клубнем или свеклой, таким как клубень картофеля (Solanum tuberosum) или сахарная свекла.

Еще в другом варианте реализации изобретения способ дополнительно включает стадию сбора урожая клетки, организма, не относящегося к человеческому роду, или его части, растения или его части, такого как клубень или свекла, или семени, предпочтительно с помощью механического уборщика, или посредством процесса, включающего фильтрацию, центрифугирование, осаждение, флотацию или флоккуляцию водорослевых или грибковых организмов.

В другом варианте реализации изобретения уровень липида в клетке, организме, не относящемся к человеческому роду, или его части, растении или его части, или семени и/или в экстрагированном липиде или масле может быть определен методом анализа с применением газовой хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, полученных из экстрагированного липида или масла.

Еще в другом варианте реализации изобретения способ дополнительно включает сбор урожая части с растения.

В варианте реализации изобретения часть растения является вегетативной частью растения с общим содержанием неполярного липида по меньшей мере около 18%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 18% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу).

В дальнейшем варианте реализации изобретения часть растения является вегетативной частью растения с общим содержанием ТАГ по меньшей мере около 18%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 18% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу).

В другом варианте реализации изобретения часть растения является вегетативной частью растения с общим содержанием неполярного липида по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу), причем вегетативная часть растения получена от растений 16:3.

Еще в другом варианте реализации изобретения часть растения является вегетативной частью растения с общим содержанием ТАГ по меньшей мере около 11%, по меньшей мере около 12%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, от 8% до 75%, от 10% до 75%, от 11% до 75%, от около 15% до 75%, от около 20% до 75%, от около 30% до 75%, от около 40% до 75%, от около 50% до 75%, от около 60% до 75%, или от около 25% до 50% (масс./масс., в пересчете на сухую массу), причем вегетативная часть растения получена от растений 16:3.

Дополнительно предлагается способ получения семени, включающий:

i) выращивание растения по изобретению, и

ii) сбор урожая семени с растения.

В варианте реализации изобретения упомянутый выше способ включает выращивание популяции размером по меньшей мере около 1000 растений, каждое из которых является растением по изобретению, и сбор урожая семени с популяции растений.

Еще в другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ ферментации, включающий:

i) обеспечение емкости, содержащей жидкую композицию, которая содержит рекомбинантную эукариотную клетку по изобретению или трансгенный организм, не относящийся к человеческому роду, по изобретению, причем клетка или организм, не относящийся к человеческому роду, пригодны для ферментации, и составляющие, необходимые для ферментации и биосинтеза жирных кислот, и

ii) обеспечение условий, способствующих ферментации жидкой композиции, содержащейся в указанной емкости.

Кроме того, предлагается извлеченный или экстрагированный липид, получаемый из рекомбинантной эукариотной клетки по изобретению, трансгенного организма, не относящегося к человеческому роду, или его части по изобретению, трансгенного растения или его части по изобретению, семени по изобретению или трансгенной клетки или трансгенного растения или его части по изобретению или получаемый с применением способа по изобретению.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается промышленный продукт, полученный с применением способа по изобретению, который является углеводородным продуктом, таким как эфиры жирных кислот, предпочтительно метиловые эфиры жирных кислот и/или этиловые эфиры жирных кислот, алкан, например, метан, этан или длинноцепочечный алкан, смесь алканов с более длинной цепью, алкен, биотопливо, газообразный монооксид углерода и/или водород, биоспирт, например, этанол, пропанол или бутанол, биоуголь или комбинация монооксида углерода, водорода и биоугля.

Дополнительно предлагается применение рекомбинантной эукариотной клетки по изобретению, трансгенного организма, не относящегося к человеческому роду, или его части по изобретению, трансгенного растения или его части по изобретению, семени по изобретению или трансгенной клетки или трансгенного растения или его части по изобретению или извлеченного или экстрагированного липида по изобретению для производства промышленного продукта.

Примеры промышленных продуктов по изобретению включают, но не ограничиваясь ими, углеводородный продукт, такой как эфиры жирных кислот, предпочтительно метиловые эфиры жирных кислот и/или этиловые эфиры жирных кислот, алкан, например, метан, этан или длинноцепочечный алкан, смесь алканов с более длинной цепью, алкен, биотопливо, газообразный монооксид углерода и/или водород, биоспирт, например, этанол, пропанол или бутанол, биоуголь или комбинация монооксида углерода, водорода и биоугля.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения топлива, включающий:

i) приведение в реакцию липида по изобретению со спиртом, необязательно в присутствии катализатора, с получением алкиловых эфиров, и

ii) необязательное смешивание алкиловых эфиров с топливом на основе нефти.

В варианте реализации упомянутого выше способа алкиловые эфиры являются метиловыми эфирами.

Еще в другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения синтетического дизельного топлива, включающий:

i) превращение липида в рекомбинантной эукариотной клетке по изобретению, трансгенном организме, не относящемся к человеческому роду, или его части по изобретению, трансгенном растении или его части по изобретению, семени по изобретению, или трансгенной клетке или трансгенном растении или его части по изобретению, в бионефть с применением способа, включающего пиролиз или гидротермическую обработку, или в синтетический газ с применением газификации, и

ii) превращение бионефти в синтетическое дизельное топливо с применением способа, включающего фракционирование, предпочтительно с отбором углеводородных соединений, которые конденсируются при температуре от приблизительно 150°C до приблизительно 200°C или от приблизительно 200°C до приблизительно 300°C, или превращение синтетического газа в биотопливо с применением металлического катализатора или микробного катализатора.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения биотоплива, включающий превращение липида в рекомбинантной эукариотной клетке по изобретению, трансгенном организме, не относящемся к человеческому роду, или его части по изобретению, трансгенном растении или его части по изобретению, семени по изобретению или трансгенной клетке или трансгенном растении или его части по изобретению в бионефть с применением пиролиза, в биоспирт с применением ферментации или в биогаз с применением газификации или анаэробного расщепления.

В варианте реализации упомянутого выше способа часть является вегетативной частью растения.

Кроме того, предлагается способ получения кормов (продуктов питания), включающий смешивание рекомбинантной эукариотной клетки по изобретению, трансгенного организма, не относящегося к человеческому роду, или его части по изобретению, трансгенного растения или его части по изобретению, семени по изобретению или трансгенной клетки или трансгенного растения или его части по изобретению, или получаемых с применением способа по изобретению, или экстракта или его части, по меньшей мере с еще одним питательным ингредиентом.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагаются корма (продукты питания), косметические продукты или химические реактивы, содержащие рекомбинантную эукариотную клетку по изобретению, трансгенный организм, не относящийся к человеческому роду, или его часть по изобретению, трансгенное растение или его часть по изобретению, семя по изобретению или трансгенную клетку или трансгенное растение или его часть по изобретению, или получаемые с применением способа по изобретению, или экстракт или его часть.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ кормления животного, включающий предложение животному трансгенного растения или его части по изобретению, семени по изобретению или трансгенного растения или его части по изобретению, или извлеченного или экстрагированного липида по изобретению.

Любой вариант реализации изобретения будет взят для применения соответствующих поправок к любому другому варианту реализации изобретения, если конкретно не указано иное.

Контекст настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами реализации изобретения, описанными в настоящем документе, которые предназначены только для целей иллюстрации. Функционально равноценные продукты, составы и способы явно находятся в пределах контекста изобретения, как раскрыто в настоящем документе.

В настоящем документе, если конкретно не указано иное или контекст не требует иного, ссылка на одну стадию, состав вещества, группу стадий или группу составов вещества должна интерпретироваться, как включающая единственное и множественное число (т. е., один или более) таких стадий, составов вещества, групп стадий или групп составов вещества.

Изобретение дополнительно раскрыто посредством следующих неограничивающих Примеров и со ссылкой на прилагаемые фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Схема синтеза липида в эукариотных клетках, демонстрирующая экспорт некоторых из жирных кислот, синтезированных в пластидах, в эндоплазматический ретикулум (ЭР) через связанную с пластидой мембрану (СПЛМ), и импорт некоторых из жирных кислот из ЭР в пластиду для эукариотного синтеза галактолипидов. Сокращения:

ацетил-КоА и малонил-КоА: ацетил-кофермент A и малонил-кофермент A;

ACCase: ацетил-КоА карбоксилаза;

FAS: комплекс синтетазы жирных кислот;

16:0-АПБ, 18:0-АПБ и 18:1-АПБ: C16:0-ацилпереносящий белок (АПБ), C18:0-ацилпереносящий белок, C18:1-ацилпереносящий белок;

KAS II: кетоацил-АПБ синтетаза II (EC 2.3.1.41);

PLPAAT: пластидная LPAAT;

PGPAT: пластидная GPAT;

PAP: фосфорилаза ФК (EC 3.1.3.4);

G3P: глицерин-3-фосфат;

LPA: лизофосфатидиновая кислота;

PA: фосфатидиновая кислота;

ДАГ: диацилглицерид;

ТАГ: триацилглицерид;

ацил-КоА и ацил-ФХ: ацил-коэнзим A и ацил-фосфатидилхолин;

ФХ: фосфатидилхолин;

GPAT: глицерил-3-фосфат ацилтрансфераза;

LPAAT: ацилтрансфераза лизофосфатидиновой кислоты (EC 2.3.1.51);

LPCAT: ацил-КоА:лизофосфатидилхолин ацилтрансфераза; или синонимы 1-ацилглицерофосфохолин O-ацилтрансфераза; ацил-КоА:1-ацил-sn-глицеро-3-фосфохолин O-ацилтрансфераза (EC 2.3.1.23),

CPT: холинфосфотрансфераза ХДГ-холин:диацилглицерил холинфосфотрансфераза; или синонимы 1-алкил-2-ацетилглицерил холинфосфотрансфераза; алкилацилглицерил холинфосфотрансфераза; холинфосфотрансфераза; фосфорилхолин-глицерид трансфераза (EC 2.7.8.2),

PDCT: фосфатидилхолин:диацилглицерил холинфосфотрансфераза,

PLC: фосфолипаза C (EC 3.1.4.3),

PLD: фосфолипаза D; холин фосфатаза; лецитиназа D; липофосфодиэстераза II (EC 3.1.4.4),

PDAT: фосфолипид: диацилглисерил ацилтрансфераза; или синоним фосфолипид: 1,2-диацил-sn-глицерил O-ацилтрансфераза (EC 2.3.1.158);

FAD2: Δ 12-десатураза жирных кислот; FAD3, Δ15-десатураза жирных кислот;

UDP-Gal: уридиндифосфатгалактоза;

MGDS: моногалактозилдиацилглицерид синтетаза;

MGDG: моногалактозилдиацилглицерид; ДГДГ: дигалактозилдиацилглицерид

FAD6, 7, 8: пластидная Δ12-десатураза жирных кислот, пластидная ω3-десатураза, пластидная ω3-десатураза, индуцируемые при низкой температуре, соответственно.

Фиг. 2. Схематическая генетическая карта конструкции для повышения содержания масла из семян в двудольных растениях. Сокращения: PRO Pissa-Vicillin, промотор вицилина и 5' НТР Pisum sativum; TMV leader, 5'НТР вируса мозаики табака; Arath-DGAT1, кодирующий белок участок, который кодирует DGAT1 A. thaliana; TER Glyma-Lectin, 3' участок терминатора/полиаденилирования гена лектина G. max; PRO Phavu-Phaseolin, промотор из гена белка фазеолина Phaseolus vulgaris; Arath-WRI1, кодирующий белок участок, который кодирует WRI1 A. thaliana; TER AGRTU-NOS, 3' участок терминатора/полиаденилирования гена НОС Agrobacterium tumefaciens; РRО Phavu-PHA, промотор гена фазеолина Phaseolus vulgaris; Sesin-Oleosin, кодирующий белок участок, который кодирует ген олеозина Sesame indicum; TER Phavu-PHA, 3' участок терминатора/полиаденилирования гена фазеолина Phaseolus vulgaris.

Фиг. 3. Схематическая диаграмма вектора pOIL122. Сокращения: TER Agrtu-NOS, терминатор нопалинсинтетазы Agrobacterium tumefaciens; NPTII, участок кодирования белка неомицинфосфотрансферазы; PRO CaMV35S-Ex2, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты с двойным участком энхансера; Arath-DGAT1, участок кодирования белка ацилтрансферазы DGAT1 Arabidopsis thaliana; PRO Arath-Rubisco SSU, промотор маленькой субъединицы Rubisco A. thaliana; Arath-FATA2, участок кодирования белка тиоэстеразы FATA2 A. thaliana; Arath-WRI, участок кодирования белка фактора транскрипции WRI1 A. thaliana; TER Glyma-Lectin, терминатор лектина Glycine max; промотор enTCUP2, криптический конститутивный промотор Nicotiana tabacum; attB1 и attB2, сайты рекомбинации Gateway; фрагмент NB SDP1, участок SDP1 Nicotiana benthamiana, служащий мишенью для сайленсинга шпРНКи; терминатор ОКС, терминатор октопинсинтетазы A. tumefaciens. Признаки скелета за пределами участка T-ДНК получены из pORE04 (Coutu с соавт., 2007).

Фиг. 4. Профили метиловых эфиров общих жирных кислот (% масс.) (МЭЖК), иллюстрирующие влияние опосредованного WRI1+DGAT1 генетического фона с высоким содержанием масла на выработку среднецепочечных жирных кислот (СЦЖК) в листе Nicotiana benthamiana (n=4). Наиболее высокая выработка СЦЖК наблюдалась после добавления Arath-WRI1.

Фиг. 5. Профили общих МЭЖК в листьях (% масс.), проясняющие влияние WRI1 на аккумуляцию СЦЖК (n=4). Добавление Arath-WRI1 значительно повысило выработку соответствующей жирной кислоты (C12:0, C14:0 или C16:0) относительно предыдущего добавления только Cocnu-LPAAT.

Фиг. 6. Уровни общих жирных кислот (ОЖК) (% масс.), уровни ТАГ, уровни СЦЖК (C16:0 и C14:0, % от общих жирных кислот) в ОЖК и СЦЖК в ТАГ (% от общего содержания жирных кислот в ТАГ) в клетках растения после экспрессии комбинаций трех DGAT масличной пальмы с FATB, LPAAT и WRI1. Номера 1-10 такие же, как приведено в тексте (Пример 9).

Фиг. 7. Уровни ТАГ (% сухой массы листа) в ткани листа N. benthamiana, инфильтрованной генами, кодирующими различные полипептиды WRI1, с (прямоугольники справа) или без (прямоугольники слева) кo-экспрессией DGAT1 (n=3). Все образцы дополнительно были инфильтрованы конструкцией P19.

Фиг. 8. Схематическое представление конструкции шпильки SDP1 N. benthamiana. Проиллюстрированные генетические сегменты являются такими, как описано в Примере 11. Сокращения являются такими, как приведено на Фиг. 3. Сайты attB представляют собой сайты рекомбинации из вектора pHELLSGATE12.

Фиг. 9. Содержание ТАГ в образцах зеленых листьев растений табака, трансформированных T-ДНК из pOIL51, линии №61 и №69, собранных перед цветением. Контрольные (родительские) образцы были получены от растений, трансформированных T-ДНК из pJP3502.

Фиг. 10. Уровни ТАГ (% сухой массы) в корне и ткани ствола дикого типа (дт) и трансгенных растений N. tabacum, содержащих только T-ДНК из pJP3502 или дополнительно содержащих T-ДНК из pOIL051.

Фиг. 11. Уровни ТАГ (% сухой массы) в корне и ткани ствола дикого типа (дт) и трансгенных растений N. tabacum, содержащих только T-ДНК из pJP3502 или дополнительно содержащих T-ДНК из pOIL049.

Фиг. 12. Содержание ТАГ в образцах листьев растений табака в стадии завязывания семян, трансформированных T-ДНК из pOIL049, линии №23c и №32b. Контрольные (родительские) образцы были получены от растений, трансформированных T-ДНК из pJP3502. Верхняя линия иллюстрирует процент 18:2 в ТАГ, а нижняя линия иллюстрирует процент 18:3 (АЛК) в содержании жирных кислот.

Фиг. 13. A. Содержание крахмала в листовой ткани растений дикого типа (ДТ) и трансгенных растений, содержащих T-ДНК из pJP3502 (контроль HO) или Т-ДНК как из pJP3502, так и из pOIL051 (pOIL51.61 и pOIL51.69), или как из pJP3502, так и из pOIL049 (pOIL49.32b). Данные представляют объединенные результаты по меньшей мере для трех индивидуальных растений. B. Корреляция между содержанием крахмала и ТАГ в листовой ткани растений дикого типа (ДТ) и трансгенных растений, содержащих T-ДНК из pJP3502 (контроль HO) или Т-ДНК как из pJP3502, так и из pOIL051 (pOIL51.61 и pOIL51.69), или как из pJP3502, так и из pOIL049 (pOIL49.32b). Данные представляют объединенные результаты по меньшей мере для трех индивидуальных растений.

Фиг. 14. Схематическое представление бинарного вектора pTV55. Сокращения: PRO, промотор; TER, 3' участок терминации/полиаденилирования; Arath, A. thaliana; Linus, Linum usitatissimum; Nicta, Nicotiana tabacum; Glyma, G. max; Cnl1, конлинин 1 из льна; Cnl2, конлинин 2 из льна; MAR Nicat-RB7, участок прикрепления к матриксу из RB7 табака, или как на Фиг. 3. Сокращения генов MGAT2, DGAT1, GPAT4, WRI1 такие же, как в тексте.

Фиг. 15. Содержание масла (%) в семенах T2 C. sativa, по данным ЯМР трансформированных pTV55, pTV56 и pTV57. Каждая точка данных представляет среднее содержание масла для трех независимых партий семени по 50 мг от каждой трансгенной линии. Семена отрицательного контроля представляли собой семена C. sativa дикого типа (нетрансформированные), выращенные в таких же условиях в теплице. N указывает на количество независимых трансгенных событий для каждой конструкции.

Фиг. 16. Филогенетическое дерево полипептидов LDAP (Пример 15).

Фиг. 17. Схематическое представление генетической конструкции pJP3506, включая участок T-ДНК между левой и правой границами. Сокращения такие же, как на Фиг. 3, и: Sesin-Oleosin, участок кодирования белка олеозина Sesame indicum.

Фиг. 18. Выход и изменение калорийности для выработки бионефти методом гидротермической обработки (ГТО) из вегетативного растительного материала табака с высоким содержанием масла, дикого типа и трансгенного, в качестве исходного сырья.

КЛЮЧ К ПЕРЕЧНЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 полипептид DGAT1 Arabidopsis thaliana (CAB44774.1)

SEQ ID NO: 2 полипептид DGAT2 Arabidopsis thaliana (NP_566952.1)

SEQ ID NO: 3 полипептид DGAT2 Ricinus communis (AAY16324.1)

SEQ ID NO: 4 полипептид DGAT2 Vernicia fordii (ABC94474.1)

SEQ ID NO: 5 полипептид DGAT2 Mortierella ramanniana (AAK84179.1)

SEQ ID NO: 6 полипептид DGAT2 Homo sapiens (Q96PD7.2)

SEQ ID NO: 7 полипептид DGAT2 Homo sapiens (Q58HT5.1)

SEQ ID NO: 8 полипептид DGAT2 Bos taurus (Q70VZ8.1)

SEQ ID NO: 9 полипептид DGAT2 Mus musculus (AAK84175.1)

SEQ ID NO: 10 YFP трипептид-консервативная DGAT2 и/или мотив последовательности MGAT1/2

SEQ ID NO: 11 HPHG тетрапептид-консервативная DGAT2 и/или мотив последовательности MGAT1/2

SEQ ID NO: 12 мотив последовательности EPHS тетрапептид-консервативной растительной DGAT2

SEQ ID NO: 13 RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q) -длинный консервативный мотив последовательности DGAT2, который представляет собой часть предполагаемого глицерил фосфолипидного домена

SEQ ID NO: 14 FLXLXXXN - консервативный мотив последовательности DGAT2 и MGAT1/2 мыши, который представляет собой предполагаемый домен связывания с нейтральным липидом

SEQ ID NO: 15 домен plsC ацилтрансферазы (PF01553) GPAT

SEQ ID NO: 16 домен суперсемейства галогенокислоты дегалогеназы (ГКД)-подобной гидролазы (PF12710) GPAT

SEQ ID NO: 17 домен фосфосерин фосфатазы (PF00702). GPAT4-8 содержит N-концевой участок, гомологичный указанному домену.

SEQ ID NO: 18 Консервативная последовательность аминокислоты GPAT GDLVICPEGTTCREP

SEQ ID NO: 19 Консервативная последовательность аминокислоты GPAT/фосфатазы (Мотив I)

SEQ ID NO: 20 Консервативная последовательность аминокислоты GPAT/фосфатазы (Мотив III)

SEQ ID NO: 21 полипептид WRI1 Arabidopsis thaliana (A8MS57).

SEQ ID NO: 22 полипептид WRI1 Arabidopsis thaliana (Q6X5Y6)

SEQ ID NO: 23 полипептид WRI1 Arabidopsis lyrata подвид lyrata (XP_002876251.1)

SEQ ID NO: 24 полипептид WRI1 Brassica napus (ABD16282.1)

SEQ ID NO: 25полипептид WRI1Brassica napus (ADO16346.1)

SEQ ID NO: 26 полипептид WRI1 Glycine max (XP_003530370.1)

]SEQ ID NO: 27 полипептид WRI1 Jatropha curcas (AEO22131.1)

[SEQ ID NO: 28 полипептид WRI1 Ricinus communis (XP_002525305.1)

SEQ ID NO: 29 полипептид WRI1 Populus trichocarpa (XP_002316459.1)

SEQ ID NO:30 полипептид WRI1 Vitis vinifera (CBI29147.3)

SEQ ID NO: 31 полипептид WRI1 Brachypodium distachyon (XP_003578997.1)

SEQ ID NO: 32 полипептид WRI1 Hordeum vulgare подвид. vulgare (BAJ86627.1)

SEQ ID NO: 33 полипептид WRI1 Oryza sativa (EAY79792.1)

SEQ ID NO: 34 полипептид WRI1 Sorghum bicolor (XP_002450194.1)

SEQ ID NO: 35 полипептид WRI1 Zea mays (ACG32367.1)

SEQ ID NO: 36 полипептид WRI1 Brachypodium distachyon (XP_003561189.1)

SEQ ID NO: 37 полипептид WRI1 Brachypodium sylvaticum (ABL85061.1)

SEQ ID NO: 38 полипептид WRI1 Oryza sativa (BAD68417.1)

SEQ ID NO: 39 полипептид WRI1 Sorghum bicolor (XP_002437819.1)

SEQ ID NO: 40 полипептид WRI1 Sorghum bicolor (XP_002441444.1)

SEQ ID NO: 41 полипептид WRI1 Glycine max (XP_003530686.1)

SEQ ID NO: 42 полипептид WRI1 Glycine max (XP_003553203,1)

SEQ ID NO: 43 полипептид WRI1 Populus trichocarpa (XP_002315794.1)

SEQ ID NO: 44 полипептид WRI1 Vitis vinifera (XP_002270149.1)

SEQ ID NO: 45 полипептид WRI1 Glycine max (XP_003533548.1)

SEQ ID NO: 46 полипептид WRI1 Glycine max (XP_003551723.1)

SEQ ID NO: 47 полипептид WRI1 Medicago truncatula (XP_003621117.1)

SEQ ID NO: 48 полипептид WRI1 Populus trichocarpa (XP_002323836.1)

SEQ ID NO: 49 полипептид WRI1 Ricinus communis (XP_002517474.1)

SEQ ID NO: 50 полипептид WRI1 Vitis vinifera (CAN79925.1)

SEQ ID NO: 51 полипептид WRI1 Brachypodium distachyon (XP_003572236.1)

SEQ ID NO: 52 полипептид WRI1 Oryza sativa (BAD10030.1)

SEQ ID NO: 53 полипептид WRI1 Sorghum bicolor (XP_002444429.1)

SEQ ID NO: 54 полипептид WRI1 Zea mays (NP_001170359.1)

SEQ ID NO: 55 полипептид WRI1 Arabidopsis lyrata подвид lyrata (XP_002889265.1)

SEQ ID NO: 56 полипептид WRI1 Arabidopsis thaliana (AAF68121.1)

SEQ ID NO: 57 полипептид WRI1 Arabidopsis thaliana (NP_178088.2)

SEQ ID NO: 55 полипептид WRI1 Arabidopsis lyrata подвид lyrata (XP_002889265.1)

SEQ ID NO: 59 полипептид WRI1 Thellungiella halophila (BAJ33872.1)

SEQ ID NO: 60 полипептид WRI1 Arabidopsis thaliana (NP_563990.1)

SEQ ID NO: 61 полипептид WRI1Glycine max (XP_003530350.1)

SEQ ID NO: 62 полипептид WRI1 Brachypodium distachyon (XP_003578142.1)

SEQ ID NO: 63 полипептид WRI1 Oryza sativa (EAZ09147.1)

SEQ ID NO: 64 полипептид WRI1 Sorghum bicolor (XP_002460236.1)

SEQ ID NO: 65 полипептид WRI1 Zea mays (NP_001146338.1)

SEQ ID NO: 66 полипептид WRI1 Glycine max (XP_003519167.1)

SEQ ID NO: 67 полипептид WRI1 Glycine max (XP_003550676.1)

SEQ ID NO: 68 полипептид WRI1 Medicago truncatula (XP_003610261.1)

SEQ ID NO: 69 полипептид WRI1 Glycine max (XP_003524030.1)

SEQ ID NO: 70 полипептид WRI1 Glycine max (XP_003525949.1)

SEQ ID NO: 71 полипептид WRI1 Populus trichocarpa (XP_002325111.1)

SEQ ID NO: 72 полипептид WRI1 Vitis vinifera (CBI36586.3)

SEQ ID NO: 73 полипептид WRI1 Vitis vinifera (XP_002273046.2)

SEQ ID NO: 74 полипептид WRI1 Populus trichocarpa (XP_002303866.1)

SEQ ID NO: 75 полипептид WRI1 Vitis vinifera (CBI25261.3)

SEQ ID NO: 76 Sorbi-WRL1

SEQ ID NO: 77 Lupan-WRL1

SEQ ID NO: 78 Ricco-WRL1

SEQ ID NO: 79 полипептид WRI1 Lupin angustifolius

SEQ ID NO: 80 полипептид DGAT1 Aspergillus fumigatus (XP_755172.1)

SEQ ID NO: 81 полипептид DGAT1 Ricinus communis (AAR11479.1)

SEQ ID NO: 82 полипептид DGAT1 Vernicia fordii (ABC94472.1)

SEQ ID NO: 83 полипептид DGAT1 Vernonia galamensis (ABV21945.1)

SEQ ID NO: 84 полипептид DGAT1 Vernonia galamensis (ABV21946.1)

SEQ ID NO: 85 полипептид DGAT1 Euonymus alatus (AAV31083.1)

SEQ ID NO: 86 полипептид DGAT1 Caenorhabditis elegans (AAF82410.1)

SEQ ID NO: 87 полипептид DGAT1 Rattus norvegicus (NP_445889.1)

SEQ ID NO: 88 полипептид DGAT1 Homo sapiens (NP_036211.2)

SEQ ID NO: 89 мотив WRI1 (R G V T/S R H R W T G R)

SEQ ID NO: 90 мотив WRI1 (F/Y E A H L W D K)

SEQ ID NO: 91 мотив WRI1 (D L A A L K Y W G)

SEQ ID NO: 92 мотив WRI1 (S X G F S/A R G X)

SEQ ID NO: 93 мотив WRI1 (H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V)

SEQ ID NO: 94 мотив WRI1 (Q E E A A A X Y D)

SEQ ID NO: 95 полипептид олеозин Brassica napus (CAA57545.1)

SEQ ID NO: 96 полипептид олеозин S1-1Brassica napus (ACG69504.1)

SEQ ID NO: 97 полипептид олеозин S2-1 Brassica napus (ACG69503.1)

SEQ ID NO: 98 полипептид олеозин S3-1 Brassica napus (ACG69513.1)

SEQ ID NO: 99 полипептид олеозин S4-1 Brassica napus (ACG69507.1)

SEQ ID NO: 100 полипептид олеозин S5-1 Brassica napus (ACG69511.1)

SEQ ID NO: 101 полипептид олеозин 1 Arachis hypogaea (AAZ20276.1)

SEQ ID NO: 102 полипептид олеозин 2 Arachis hypogaea (AAU21500.1)

SEQ ID NO: 103 полипептид олеозин 3 Arachis hypogaea (AAU21501.1)

SEQ ID NO: 104 полипептид олеозин 5 Arachis hypogaea (ABC96763.1)

SEQ ID NO: 105 полипептид олеозин 1 Ricinus communis (EEF40948.1)

SEQ ID NO: 106 полипептид олеозин 2 Ricinus communis (EEF51616.1)

SEQ ID NO: 107 полипептид олеозин Glycine max изоформа a (P29530.2)

SEQ ID NO: 108 полипептид олеозин Glycine max изоформа b (P29531.1)

SEQ ID NO: 109 полипептид олеозин Linum usitatissimum низкомолекулярная изоформа (ABB01622.1)

SEQ ID NO: 110 последовательность аминокислоты полипептида олеозин Linum usitatissimum высокомолекулярная изоформа (ABB01624.1)

SEQ ID NO: 111 полипептид олеозин Helianthus annuus (CAA44224.1)

SEQ ID NO: 112 полипептид олеозин Zea mays (NP_001105338.1)

SEQ ID NO: 113 полипептид стеролеозин Brassica napus (ABM30178.1)

SEQ ID NO: 114 полипептид стеролеозин SLO1-1 Brassica napus (ACG69522.1)

SEQ ID NO: 115 полипептид стеролеозин SLO2-1 Brassica napus (ACG69525.1)

SEQ ID NO: 116 полипептид стеролеозин Sesamum indicum (AAL13315.1)

SEQ ID NO: 117 полипептид стеролеозин Zea mays (NP_001152614.1)

SEQ ID NO: 118 полипептид калеозин CLO-1 Brassica napus (ACG69529.1)

SEQ ID NO: 119 полипептид калеозин CLO-3 Brassica napus (ACG69527.1)

SEQ ID NO: 120 полипептид калеозин Sesamum indicum (AAF13743.1)

SEQ ID NO: 121 полипептид калеозин Zea mays (NP_001151906.1)

SEQ ID NO: 122 последовательность Т-ДНК pJP3502 (вставленная в геном)

SEQ ID NO: 123 последовательность вектора pJP3507

SEQ ID NO: 124 последовательность линкера

SEQ ID NO: 125 частичная последовательность CGI-58 Nicotiana benthamiana, выбранная для сайленсинга шпРНКи (pTV46)

SEQ ID NO: 126 частичная последовательность АГФазы N. tabacum, выбранная для сайленсинга шпРНКи (pTV35)

SEQ ID NO: 127 мотив липазы GXSXG

SEQ ID NO: 128 мотив ацилтрансферазы HX(4)D

SEQ ID NO: 129 вероятный мотив связывания с липидом VX(3)HGF

SEQ ID NO: 130 полинуклеотид CGi58 Arabidopsis thaliana (NM_118548.1)

SEQ ID NO: 131 полинуклеотид CGi58 Brachypodium distachyon (XM_003578402.1)

SEQ ID NO: 132 полинуклеотид CGi58 Glycine max (XM_003523590.1)

SEQ ID NO: 133 полинуклеотид CGi58 Zea mays (NM_001155541.1)

SEQ ID NO: 134 полинуклеотид CGi58 Sorghum bicolor (XM_002460493.1)

SEQ ID NO: 135 полинуклеотид CGi58 Ricinus communis (XM_002510439.1)

SEQ ID NO: 136 полинуклеотид CGi58 Medicago truncatula (XM_003603685.1)

SEQ ID NO: 137 полинуклеотид LEC2 Arabidopsis thaliana (NM_102595.2)

SEQ ID NO: 138 полинуклеотид LEC2 Medicago truncatula (X60387.1)

SEQ ID NO: 139 полинуклеотид LEC2 Brassica napus (HM370539.1)

SEQ ID NO: 140 полинуклеотид BBM Arabidopsis thaliana (NM_121749.2)

SEQ ID NO: 141 полинуклеотид BBM Medicago truncatula (AY899909.1)

SEQ ID NO: 142 полипептид LEC2 Arabidopsis thaliana (NP_564304.1)

SEQ ID NO: 143 полипептид LEC2 Medicago truncatula (CAA42938.1)

SEQ ID NO: 144 полипептид LEC2 Brassica napus (ADO16343.1)

SEQ ID NO: 145 полипептид BBM Arabidopsis thaliana (NP_197245.2)

SEQ ID NO: 146 полипептид BBM Medicago truncatula (AAW82334.1)

SEQ ID NO: 147 индуцибельный промотор alcA Aspergilus niger

SEQ ID NO: 148 индуктор AlcR, который активирует промотор AlcA в присутствии этанола

SEQ ID NO: 149 LEC1 Arabidopsis thaliana (AAC39488)

SEQ ID NO: 150 LEC1 Arabidopsis lyrata (XP_002862657)

SEQ ID NO: 151 LEC1 Brassica napus (ADF81045)

SEQ ID NO: 152 LEC1 Ricinus communis (XP_002522740)

SEQ ID NO: 153 LEC1 Glycine max (XP_006582823)

SEQ ID NO: 154 LEC1 Medicago truncatula (AFK49653)

SEQ ID NO: 155 LEC1 Zea mays (AAK95562)

SEQ ID NO: 156 LEC1 Arachis hypogaea (ADC33213)

SEQ ID NO: 157 LEC1-подобный Arabidopsis thaliana (AAN15924)

SEQ ID NO: 158 LEC1-подобный Brassica napus (AHI94922)

SEQ ID NO: 159 LEC1-подобный Phaseolus coccineus (AAN01148)

SEQ ID NO: 160 FUS3 Arabidopsis thaliana (AAC35247)

SEQ ID NO: 161 FUS3 Brassica napus

SEQ ID NO: 162 FUS3Medicago truncatula

SEQ ID NO: 163 последовательность кДНК SDP1 Arabidopsis thaliana, номер доступа NM_120486, 3275 нуклеотидов (нт)

SEQ ID NO: 164 кДНК SDP1 Brassica napus номер доступа GN078290

SEQ ID NO: 165 кДНК SDP1 Brachypodium distachyon, 2670 нуклеотидов (нт)

SEQ ID NO: 166 кДНК SDP1 Populus trichocarpa, 3884 нт

SEQ ID NO: 167 кДНК SDP1 Medicago truncatula; XM_003591377; 2490 нт

SEQ ID NO: 168 кДНК SDP1Glycine max XM_003521103; 2783 нт

SEQ ID NO: 169 кДНК SDP1Sorghum bicolor XM_002458486; 2724 нт

SEQ ID NO: 170 кДНК SDP1Zea mays, NM_001175206; 2985 нт

SEQ ID NO: 171 кДНК SDP1Physcomitrella patens, XM_001758117; 1998 нт

SEQ ID NO: 172 кДНК SDP1 Hordeum vulgare, AK372092; 3439 нт

SEQ ID NO: 173 кДНК SDP1Nicotiana benthamiana, Nbv5tr6404201

SEQ ID NO: 174 участок кДНК SDP1 Nicotiana benthamiana, являющийся мишенью для сайленсинга шпРНКи

SEQ ID NO: 175 промотор гена SDP1 Arabidopsis thaliana, 1,5 тысяч пар оснований

SEQ ID NO: 176 нуклеотидная последовательность, комплементарная гену pSSU-Олеозина в Т-ДНК pJP3502. В порядке (комплементарный последовательности): терминатор лектина Glycine max 348 нт, 3' экзон 255 нт, интрон UBQ10 304 нт, 5' экзон 213 нт, промотор SSU 1751 нт

SEQ ID NO: 177 кДНК пластидной GPAT Arabidopsis thaliana, NM_179407

SEQ ID NO: 178 полипептид пластидной GPAT Arabidopsis thaliana, NM_179407

SEQ ID NO: 179 кДНК пластидной GPAT Populus trichocarpa, XP_006368351

SEQ ID NO: 180 кДНК пластидной GPAT Jatropha curcas, ACR61638

SEQ ID NO: 181 кДНК пластидной GPAT Ricinus communis, XP_002518993

SEQ ID NO: 182 кДНК пластидной GPAT Helianthus annuus, ADV16382

SEQ ID NO: 183 кДНК пластидной GPAT Medicago truncatula, XP_003612801

SEQ ID NO: 184 кДНК пластидной GPAT Glycine max, XP_003516958

SEQ ID NO: 185 кДНК пластидной GPAT Carthamus tinctorius, CAHG3PACTR

SEQ ID NO: 186 кДНК пластидной GPAT Solanum tuberosum, XP_006352898

SEQ ID NO: 187 кДНК пластидной GPAT Oryza sativa, японской, NM_001072027

SEQ ID NO: 188 кДНК пластидной GPAT Sorghum bicolor, XM_002467381

SEQ ID NO: 189 кДНК пластидной GPAT Zea mays, NM_001158637

SEQ ID NO: 190 кДНК пластидной GPAT Hordeum vulgare, AK371419

SEQ ID NO: 191 кДНК пластидной GPAT Physcomitrella patens, XM_001771247

SEQ ID NO: 192 кДНК пластидной GPAT Chlamydomonas reinhardtii, XM_001694925

SEQ ID NO: 193 14:0-АПБ тиоэстераза Cinnamomum camphora (Cinca-TE), хлоропластная, 382 аминокислоты (ак), (номер доступа Q39473.1)

SEQ ID NO: 194 ацил-АПБ тиоэстераза FatB1 Cocos nucifera (Cocnu-TE1; 417 ак, номер доступа AEM72519.1

SEQ ID NO: 195 ацил-АПБ тиоэстераза FatB2 Cocos nucifera (Cocnu-TE2; 423 ак, номер доступа AEM72520.1)

SEQ ID NO: 196 ацил-АПБ тиоэстераза FatB3 Cocos nucifera (Cocnu-TE3; 414 ак, номер доступа AEM72521.1)

SEQ ID NO: 197 ацил-(АПБ) тиоэстераза типа B Cuphea lanceolata (Cupla-TE, 419 ак, номер доступа CAB60830.1)

SEQ ID NO: 198 FatB1 Cuphea viscosissima (Cupvi-TE; 419 ак, номер доступа AEM72522.1)

SEQ ID NO: 199 12:0-АПБ тиоэстераза Umbellularia californica (лауроил-ацилпереносящего белка тиоэстераза) (Umbca-TE, 382 ак; номер доступа Q41635.1)

SEQ ID NO: 200 LPAAT Cocos nucifera (Cocnu-LPAAT, 308 ак, номер доступа Q42670.1)

SEQ ID NO: 201 пластидная LPAAT1 Arabidopsis thaliana (Arath-PLPAAT; 356 ак, номер доступа AEE85783.1)

SEQ ID NO: 202 FATA1Arabidopsis thaliana

SEQ ID NO: 203 FATA2 Arabidopsis thaliana

SEQ ID NO: 204 FATB Arabidopsis thaliana

SEQ ID NO: 205 WRI3 Arabidopsis thaliana

SEQ ID NO: 206 WRI4 Arabidopsis thaliana

SEQ ID NO: 207 WRI1Avena sativa

SEQ ID NO: 208 WRI1 Sorghum bicolor

SEQ ID NO: 209 WRI1 Zea mays

SEQ ID NO: 210 WRI1Triadica sebifera

SEQ ID NO: 211 последовательность промотора пататина B33 S. tuberosum

SEQ ID NO 212-215 и 245-254 олигонуклеотидные праймеры

SEQ ID NO: 216 участок промотора SEE1 Z. mays (1970 нт из номера доступа AJ494982)

SEQ ID NO: 217 последовательность промотора AlSAP A. littoralis, номер доступа DQ885219

SEQ ID NO: 218 последовательность промотора ArRolC A. rhizogenes, номер доступа DQ160187

SEQ ID NO: 219 конструкция шпРНКи, содержащая фрагмент 732 пар оснований (по) пластидной GPAT N. benthamiana

SEQ ID NO: 220 DGAT1 Elaeis guineensis (масличная пальма)

SEQ ID NO: 221 MYB73 G. max, номер доступа ABH02868

SEQ ID NO: 222 bZIP53 A. thaliana, номер доступа AAM14360

SEQ ID NO: 223 AGL15 A. thaliana, номер доступа NP_196883

SEQ ID NO: 224 MYB118 A. thaliana, номер доступа AAS58517

SEQ ID NO: 225 MYB115 A. thaliana, номер доступа AAS10103

SEQ ID NO: 226 TANMEI A. thaliana, номер доступа BAE44475

SEQ ID NO: 227 WUS A. thaliana, номер доступа NP_565429

SEQ ID NO: 228 GFR2a1 B. napus, номер доступа AFB74090

SEQ ID NO: 229 GFR2a2 B. napus, номер доступа AFB74089

SEQ ID NO: 230 PHR1 A. thaliana, номер доступа AAN72198

SEQ ID NO: 231 фрагмент TGD1 N. benthamiana

SEQ ID NO: 232 аминокислоты SDP1 картофеля

SEQ ID NO: 233 нуклеотидная последовательность SDP1 картофеля

SEQ ID NO: 234 малая субъединица АГФ-азы картофеля

SEQ ID NO: 235 нуклеотидная последовательность малой субъединицы АГФ-азы картофеля

SEQ ID NO: 236 нуклеотидная последовательность LDAP-1 Sapium sebiferum

SEQ ID NO: 237 аминокислотная последовательность LDAP-1Sapium sebiferum

SEQ ID NO: 238 нуклеотидная последовательность LDAP-2 Sapium sebiferum

SEQ ID NO: 239 аминокислотная последовательность LDAP-2 Sapium sebiferum

SEQ ID NO: 240 нуклеотидная последовательность LDAP-3 Sapium sebiferum

SEQ ID NO: 241 аминокислотная последовательность LDAP-3 Sapium sebiferum

SEQ ID NO: 242 SDP1 S. bicolor (номер доступа XM_002463620)

SEQ ID NO: 243 нуклеотидная последовательность SDP1 T. aestivum (номер доступа AK334547)

SEQ ID NO: 244 фрагмент SDP1 шпРНКи S. bicolor

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Общие методы

Если конкретно не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, следует интерпретировать как имеющие такое же значение, которое им обычно придает средний специалист в данной области (например, культуры клеток, молекулярной генетики, биологии растений, клеточной биологии, химии белка, химии липида и жирной кислоты, получения биотоплива и биохимии).

Если не указано иное, методы химии рекомбинантного белка, культуры клетки и иммунологические методы, применяемые в настоящем изобретении, представляют собой стандартные методики, хорошо известные специалистам из уровня техники. Такие методы описаны и объяснены в литературных источниках, например, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook с соавт., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (редактор), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Glover and B.D. Hames (редакторы), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 и 1996), F.M. Ausubel с соавт. (редакторы), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все обновления, изданные до настоящего времени), Ed Harlow and David Lane (редакторы) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), и J.E. Coligan с соавт. (редакторы), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включая все обновления, изданные до настоящего времени).

Некоторые определения

Термин «трансгенный организм, не относящийся к человеческому роду» обозначает, например, цельное растение, водоросль, не относящиеся к человеческому роду животное или организм, пригодный для ферментации, такой как дрожжи или гриб, содержащий один или более экзогенных полинуклеотидов (трансген) или полипептидов. В варианте реализации трансгенный организм, не относящийся к человеческому роду, не является животным или его частью. В одном варианте реализации трансгенный организм, не относящийся к человеческому роду, представляет собой фототрофный организм (например, растение или водоросль), способный к получению из солнечного света энергии для синтеза питательных органических соединений.

Термин «экзогенный» в контексте полинуклеотида или полипептида обозначает полинуклеотид или полипептид, присутствующий в клетке, которая от природы не содержит полинуклеотида или полипептида. Такая клетка в настоящем документе называется «рекомбинантной клеткой» или «трансгенной клеткой». В варианте реализации экзогенный полинуклеотид или полипептид происходит из другого рода относительно клетки, содержащей экзогенный полинуклеотид или полипептид. В другом варианте реализации экзогенный полинуклеотид или полипептид происходит от другого вида. В одном варианте реализации экзогенный полинуклеотид или полипептид экспрессируется в растении-хозяине или растительной клетке, и экзогенный полинуклеотид или полипептид происходит от другого вида или рода. Экзогенный полинуклеотид или полипептид может быть неприродным, например, таким как синтетическая молекула ДНК, которая получена способами рекомбинации ДНК. Молекула ДНК может, часто предпочтительно, содержать кодирующий белок участок, который является кодон-оптимизированным для экспрессии в клетке, с получением таким образом полипептида, который содержит такую же последовательность аминокислот, что и природный полипептид, даже если нуклеотидная последовательность кодирующего белок участка имеет неприродное происхождение. Экзогенный полинуклеотид может кодировать или экзогенный полипептид может представлять собой: диацилглицерил ацилтрансферазу (DGAT), например, DGAT1 или DGAT2, фактор транскрипции Wrinkled 1 (WRI1), на ПМТ, таком как олеозин или, предпочтительно, БСКЛ, тиоэстераза жирной кислоты, такая как полипептид FATA или FATB или полипептид супрессора сайленсинга.

В настоящем документе термин «экстрагированный липид» обозначает состав, экстрагированный из трансгенного организма или его части, который содержит по меньшей мере 60% (масс./масс.) липида.

В настоящем документе термин «неполярный липид» обозначает жирные кислоты и их производные, растворимые в органических растворителях, но не растворимые в воде. Жирные кислоты могут быть жирными кислотами в свободной и/или этерифицированной форме. Примеры этерифицированных форм включают, без ограничений, триацилглицерид (ТАГ), диацилглицерид (ДАГ), моноацилглицерид (МАГ). Неполярные липиды также включают стероиды, эфиры стероидов и эфиры восков. Неполярные липиды также известны, как «нейтральные липиды». При комнатной температуре неполярный липид обычно представляет собой жидкость. Предпочтительно, неполярный липид в основном (> 50%) содержит жирные кислоты, длина которых составляет по меньшей мере 16 атомов углерода. Более предпочтительно, по меньшей мере 50% общих жирных кислот в неполярном липиде представляют собой C18 жирные кислоты, например, олеиновую кислоту. Предпочтительно, по меньшей мере 5% от общих жирных кислот в неполярных липидах представляют собой жирные кислоты C12 или C14 или те и другие. В варианте реализации по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% жирных кислот в неполярном липиде по изобретению могут представлять собой ТАГ. Неполярный липид может быть дополнительно очищен или обработан, например гидролизом с сильным основанием, чтобы высвободить свободную жирную кислоту, или фракционированием, дистилляцией, или подобным методом. Неполярный липид может присутствовать в или быть получен из частей растения, например, семени, листьев, клубней, свеклы или плода, из рекомбинантных клеток или из организмов, не относящихся к человеческому роду, например, дрожжей. Неполярный липид по изобретению может образовывать часть «масла из семян», если он получен из семени.

Концентрация свободного и этерифицированного стероида (например, ситостерола, кампэстрола, стигмастерола, брассикастерола, Δ5-авенастерола, ситостанола, кампестанола и холестерина) в экстрагированном липиде может быть такой, как описано в Phillips с соавт. (2002). Стероиды в растительных маслах присутствуют, как свободные спирты, эфиры с жирными кислотами (этерифицированные стероиды), гликозиды стероидов и ацилированные гликозиды стероидов. Концентрации стероидов в природных растительных маслах (масло из семян) варьируют до максимального содержания приблизительно 1100 мг/100 г. Гидрогенизированное пальмовое масло содержит одну из самых низких концентраций для природных масел, приблизительно 60 мг/100 г. Извлеченные или экстрагированные масла из семян по изобретению предпочтительно содержат от приблизительно 100 до приблизительно 1000 мг общего стероида/100 г масла. В случае применения в качестве продукта питания или корма, предпочтительно, стероиды присутствуют, главным образом, в свободных или этерифицированных формах вместо гликозилированных форм. В маслах из семян по настоящему изобретению, предпочтительно по меньшей мере 50% стероидов в маслах присутствуют, как этерифицированные стероиды, за исключением соевого масла, которое содержит около 25% этерифицированных стероидов. Масло из семени рапса и рапса по изобретению предпочтительно содержат от приблизительно 500 до приблизительно 800 мг общего стероида/100 г, причем основным стероидом является ситостерол, и вторым по распространенности - кампэстрол. Кукурузное масло из семени по изобретению предпочтительно содержит от приблизительно 600 до приблизительно 800 мг общего стероида/100 г, причем основным стероидом является ситостерол. Соевое масло из семени по изобретению предпочтительно содержит от приблизительно 150 до приблизительно 350 мг общего стероида/100 г, причем основным стероидом является ситостерол, и вторым по распространенности - стигмастерол, и, при этом, содержание свободного стероида выше, чем этерицифированного стероида. Хлопковое масло по изобретению предпочтительно содержит от приблизительно 200 до приблизительно 350 мг общего стероида/100 г, причем основным стероидом является ситостерол. Кокосовое масло и пальмовое масло по изобретению предпочтительно содержат от приблизительно 50 до приблизительно 100 мг общего стероида/100 г, причем основным стероидом является ситостерол. Сафлоровое масло из семени по изобретению предпочтительно содержит от приблизительно 150 до приблизительно 250 мг общего стероида/100 г, причем основным стероидом является ситостерол. Арахисовое масло по изобретению предпочтительно содержит от приблизительно 100 до приблизительно 200 мг общего стероида/100 г, причем основным стероидом является ситостерол. Кунжутное масло из семени по изобретению предпочтительно содержит от приблизительно 400 до приблизительно 600 мг общего стероида/100 г, причем основным стероидом является ситостерол. Масло подсолнечника из семени по изобретению предпочтительно содержит от приблизительно 200 до 400 мг общего стероида/100 г, причем основным стероидом является ситостерол. Масла, полученные из вегетативных частей растения по изобретению, предпочтительно содержат менее 200 мг общего стероида/100 г, более предпочтительно менее 100 мг общего стероида/100 г, и наиболее предпочтительно менее 50 мг общего стероида/100 г, причем большая часть стероидов присутствует в форме свободных стероидов.

В настоящем документе термин «масло из семян» обозначает состав, полученный из семени/зерна растения, содержащего по меньшей мере 60% (масс./масс.) липидов, или такой, который можно получить из семени/зерна, если масло из семян все еще присутствует в семени/зерне. Таким образом, масло из семян по изобретению включает масло из семян, которое присутствует в семени/зерне или его части, а также масло из семян, которое экстрагировано из семени/зерна. Масло из семян предпочтительно является экстрагированным маслом из семян. Масло из семян при комнатной температуре обычно представляет собой жидкость. Предпочтительно, общее содержание жирных кислот (ОЖК) в масле из семян в основном (> 50%) включает жирные кислоты, длина которых составляет по меньшей мере 16 атомов углерода. Более предпочтительно, по меньшей мере 50% общих жирных кислот в масле из семян представляют собой C18 жирные кислоты например, олеиновую кислоту. Жирные кислоты обычно присутствуют в этерифицированной форме, например, такой как ТАГ, ДАГ, ацил-КоА или фосфолипид. Жирные кислоты могут быть жирными кислотами в свободной и/или этерифицированной форме. В варианте реализации изобретения по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% жирных кислот в масле из семян по изобретению могут быть найдены в виде ТАГ. В варианте реализации масло из семян по изобретению представляет собой «в существенной мере очищенное» или «очищенное» масло, которое отделено от одного или более других липидов, нуклеиновых кислот, полипептидов или других загрязняющих молекул, с которыми оно связано в семени или в неочищенном экстракте. Предпочтительно, в существенной мере очищенное масло из семян по меньшей мере на 60% свободно, более предпочтительно по меньшей мере на 75% свободно, и более предпочтительно, по меньшей мере на 90% свободно от других компонентов, с которыми оно связано в семени или экстракте. Масло из семян по изобретению может дополнительно содержать молекулы, не относящиеся к классу жирных кислот, например, без ограничений, стероиды. В варианте реализации масло из семян представляет собой масло рапса (вид Brassica, такой как Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus), горчичное масло (Brassica juncea), масло других видов Brassica (например, Brassica napobrassica, Brassica camelina), масло подсолнечника (вид Helianthus, такой как Helianthus annuus), льняное масло (Linum usitatissimum), соевое масло (Glycine max), сафлоровое масло (Carthamus tinctorius), кукурузное масло (Zea mays), масло табака (вид Nicotiana, такой как Nicotiana tabacum или Nicotiana benthamiana), арахисовое масло (Arachis hypogaea), пальмовое масло (Elaeis guineensis), хлопковое масло (Gossypium hirsutum), кокосовое масло (Cocos nucifera), масло авокадо (Persea americana), оливковое масло (Olea europaea), масло кешью (Anacardium occidentale), масло макадамии (Macadamia intergrifolia), миндальное масло (Prunus amygdalus), масло из семян овса (Avena sativa), рисовое масло (вид Oryza, такой как Oryza sativa и Oryza glaberrima), масло из семян Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) или масло из семян Acrocomia aculeata (макаубская пальма), Aracinis hypogaea (арахис), Astrocaryum murumuru (мурумуру), Astrocaryum vulgare (тукума), Attalea geraensis (атталия), Attalea humilis (американская масличная пальма), Attalea oleifera (андайя), Attalea phalerata (урикури), Attalea speciosa (бабассу), Beta vulgaris (сахарная свекла), Camelina sativa (ложный лен), Caryocar brasiliense (пекви), Crambe abyssinica (абиссинская капуста), Cucumis melo (дыня), Hordeum vulgare (ячмень), Jatropha curcas (лечебный орех), Joannesia princeps (лещина арара), Licania rigida (ойтика), Lupinus angustifolius (люпин), Mauritia flexuosa (пальма бурити), Maximiliana maripa (пальма инайя), вид Miscanthus, такой как Miscanthus x giganteus и Miscanthus sinensis, Oenocarpus bacaba (бакаба-до-азейте), Oenocarpus bataua (патайя), Oenocarpus distichus (бакаба-де-лек), Panicum virgatum (просо прутьевидное), Paraqueiba paraensis (марь), Persea amencana (авокадо), Pongamia pinnata (индийский бук), Populus trichocarpa, Ricinus communis (клещевина), вид Saccharum (сахарный тростник), Sesamum indicum (кунжут), Solanum tuberosum (картофель), вид Sorghum такой как Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (какао) вид Trifolium, Trithrinax brasiliensis (бразильская игольчатая пальма) и вид Triticum. (пшеница) такой как Triticum aestivum. Масло из семян может быть экстрагировано из семени/зерна любым способом, известным из уровня техники. Такие способы обычно включают экстракцию неполярными растворителями, такими как диэтиловый эфир, петролейный эфир, смеси хлороформ/метанол или бутанол, в общем, ассоциирующимися с первым дроблением семян. Липиды, связанные с крахмалом в зерне, могут быть экстрагированы с помощью насыщенного водой бутанола. Масло из семян может быть «дегуммировано» способами, известными из уровня техники, чтобы удалить полисахариды, или обработано другими способами, чтобы удалить загрязняющие вещества или повысить чистоту, стабильность, или улучшить цвет. ТАГ и другие эфиры в масле из семян могут быть гидролизованы с целью высвобождения свободных жирных кислот, или масло из семян может быть гидрогенизировано, обработано химическим или ферментным способом, как известно из уровня техники.

В настоящем документе термин «жирная кислота» обозначает карбоновую кислоту с алифатическим хвостом размером по меньшей мере 8 атомов углерода, насыщенным или ненасыщенным. Предпочтительные жирные кислоты содержат углеродно-углеродную цепь длиной по меньшей мере 12 атомов углерода. Большинство природных жирных кислот содержат четное количество атомов углерода, поскольку в их биосинтезе участвует ацетат, содержащий два атома углерода. Жирные кислоты могут находиться в свободном состоянии (неэтерифицированные) или в этерифицированной форме, например, как часть ТАГ, ДАГ, МАГ, связи ацил-КоА (тиоэфир), связи ацил-ацилпереносящий белок (АПБ) или другой ковалентно связанной форме. Будучи ковалентно связанной в этерифицированной форме, жирная кислота в настоящем документе обозначается как группа «ацил». Жирная кислота может быть этерифицирована как фосфолипид, например, фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерил, фосфатидилинозитол или дифосфатидилглицерил. Насыщенные жирные кислоты не содержат кратных связей или других функциональных групп вдоль цепи. Термин «насыщенный» обозначает водород, в котором все атомы углерода (кроме карбоксильной группы [-COOH]) связаны с максимальным количеством атомов водорода. Иными словами, омега (ω) конец содержит 3 атома водорода (CH3-), и каждый атом углерода в цепи связан с 2 атомами водорода (-CH2-). Ненасыщенные жирные кислоты по форме сходны с насыщенными жирными кислотами, за исключением того, что одна или более алкеновых функциональных групп расположены вдоль цепи, причем каждый алкен заменяет часть одинарной связи «-CH2-CH2-» в цепи частью двойной связи «-CH=CH-» (т. е., двойная связь между двумя атомами углерода). Два последующих атома углерода в цепи, присоединенные к каждому из концов двойной связи, могут находиться в цис- или транс-конфигурации.

В настоящем документе термин "мононенасыщенная жирная кислота" или "МНЖК" обозначает жирную кислоту, содержащую по меньшей мере 12 атомов углерода в углеродной цепи и только одну алкеновую группу (двойная углерод-углеродная связь), которая может находиться в этерифицированной или неэтерифицированной (свободной) форме. В настоящем документе термин "полиненасыщенная жирная кислота" или "ПНЖК" обозначает жирную кислоту, содержащую по меньшей мере 12 атомов углерода в углеродной цепи и по меньшей мере две алкеновые группы (двойные углерод-углеродные связи), которая может находиться в этерифицированной или неэтерифицированной форме.

В настоящем документе жирная кислота со ʺсредней длиной цепиʺ, дополнительно обозначенная как ʺСЦЖКʺ, включает ацильную цепь длиной 8-14 атомов углерода. Ацильная цепь может быть модифицированной (например, она может содержать одну или более двойных связей, гидроксильных групп, эпоксигрупп и т.д) или немодифицированной (насыщенной). Данный термины включают по меньшей мере одну или более или все из каприловой кислоты (C8:0), каприновой кислоты (C10:0), лауриновой кислоты (C12:0) и миристиновой кислоты (C14:0).

«Моноацилглицерид» или «МАГ» представляет собой глицерид, в котором глицерин этерифицирован одной жирной кислотой. В настоящем документе МАГ содержит гидроксильную группу в положении sn-1/3 (также обозначена в настоящем документе как sn-1 МАГ или 1-МАГ или 1/3-МАГ) или sn-2(также обозначена в настоящем документе как 2-МАГ), и, таким образом, МАГ не содержит фосфорилированных молекул, таких как фосфатидиновая кислота (ФК) или фосфатидилхолин (ФХ). МАГ, таким образом, является компонентом нейтральных липидов в клетке.

«Диацилглицерид» или «ДАГ» представляет собой глицерид, в котором глицерин этерифицирован двумя жирными кислотами, которые могут быть одинаковыми или, предпочтительно, разными. В настоящем документе ДАГ содержит гидроксильную группу в положении sn-1,3 или sn-2, и, таким образом, ДАГ не содержит фосфорилированных молекул, таких как ФК или ФХ. ДАГ, таким образом, является компонентом нейтральных липидов в клетке. В пути Кеннеди синтеза ДАГ (Фиг. 1), прекурсор sn-глицерил-3-фосфат (G-3-P) этерифицируется двумя ацильными группами, каждая из которых поступает от сложного эфира жирной кислоты коэнзима A, при этом, первая реакция катализируется глицерин-3-фосфат ацилтрансферазой (GPAT) в положении sn-1 с образованием ЛизоФК, с последующей реакцией присоединения второго ацила в положении sn-2, катализированного ацилтрансферазой лизофосфатидиновой кислоты (LPAAT), с образованием фосфатидиновой кислоты (ФК). Данное промежуточное соединение затем дефосфорилируется PAP с образованием ДАГ. Кроме того, ДАГ может быть образован из ТАГ удалением ацильной группы под действием липазы или из ФХ по существу удалением головной группы холина любым из ферментов карнитинпальмитоилтрансфераза (КПТ), PLC или PLD (Фиг. 1).

«Триацилглицерид» или «ТАГ» представляет собой глицерид, в котором глицерин этерифицирован тремя жирными кислотами, которые могут быть одинаковыми (например, как в триолеине) или, чаще, разными. В пути Кеннеди синтеза ТАГ, ДАГ образуется, как изложено выше, а затем третья ацильная группа присоединяется к основе глицерина под действием DGAT. Альтернативные пути образования ТАГ включают катализированный ферментом PDAT (Фиг. 1) и путь MGAT, описанные в настоящем документе.

В настоящем документе термин "дикий тип" или его вариации обозначает вегетативную часть растения, клетку, семя или не относящийся к человеческому роду организм или его часть, например, клубень или свеклу, которые не были генетически модифицированы, например, введением экзогенного(ых) полинуклеотида(ов) по настоящему изобретению.

Термин "соответствующий" обозначает вегетативную часть растения, клетку, семя или не относящийся к человеческому роду организм или его часть (например, клубень или свекла), которые имеют такой же или подобный генетический фон, как и вегетативная часть растения, клетка, семя или не относящийся к человеческому роду организм или его часть по изобретению, но при этом они не были модифицированы, как описано в настоящем документе (например, вегетативная часть растения, клетка, семя или не относящийся к человеческому роду организм или его часть, в которых отсутствует экзогенный(ые) полинуклеотид(ы) и/или отсутствует генетическая(ие) модификация(и)). В предпочтительном варианте реализации изобретения соответствующая вегетативная часть растения, эукариотная клетка, семя или не относящийся к человеческому роду организм или его часть находятся в той же стадии развития, что и вегетативная часть растения, эукариотная клетка, семя или не относящийся к человеческому роду организм или его часть по изобретению. Например, если не относящийся к человеческому роду организм представляет собой цветущее растение, то соответствующее растение также предпочтительно находится в стадии цветения. Соответствующая вегетативная часть растения, эукариотная клетка, семя или не относящийся к человеческому роду организм или его часть может применяться в качестве контроля для сравнения уровней нуклеиновой кислоты или экспрессии белка или степени и природы модификации признака, например, выработки и/или содержания неполярных липидов, с вегетативной частью растения, эукариотной клеткой, семенем или не относящимся к человеческому роду организмом или его частью по изобретению, которые модифицированы, как описано в настоящем документе. Квалифицированный специалист в данной области с легкостью может определить подходящую "соответствующую" вегетативную часть растения, эукариотную клетку, семя или не относящийся к человеческому роду организм или его часть, ткань, орган или организм для такого сравнения.

В настоящем документе "по сравнению с" или ʺотносительноʺ обозначает сравнение уровней неполярного липида, общего содержания неполярных липидом, содержания жирных кислот или другого параметра вегетативной части растения, эукариотной клетки, семени, не относящегося к человеческому роду организма или его части (такой как клубень или свекла), экспрессирующих один или более экзогенных полинуклеотидов или экзогенных полипептидов, с вегетативной частью растения, эукариотной клеткой, семенем, не относящимся к человеческому роду организма или его частью, в которых отсутствуют один или больше экзогенных полинуклеотидов или полипептидов.

В настоящем документе "повышенная способность к выработке неполярных липидов" является относительным термином, который обозначает повышенное общее количество неполярного липида, выработанного вегетативной частью растения, эукариотной клеткой, семенем или не относящимся к человеческому роду организмом или его частью (например, клубень или свекла) по изобретению, относительно соответствующей вегетативной части растения, эукариотной клетки, семени или не относящегося к человеческому роду организма или его части. В одном варианте реализации изобретения повышено содержание ТАГ и/или полиненасыщенных жирных кислот или содержание олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот неполярного липида, или снижено содержание линоленовой кислоты в общем содержании жирных кислот неполярного липида, например, по меньшей мере на 2% в абсолютных величинах.

В настоящем документе каждый из ʺсинергииʺ, ʺсинергетическогоʺ, ʺдействуя синергетическиʺ и родственных терминов представляет собой сравнительный термин, который означает, что влияние комбинации элементов, присутствующих в клетке, растении или его части по изобретению, например, комбинации элементов A и B, превышает сумму влияния элементов по отдельности в соответствующих клетках, растениях или их частях, например, суммарное влияние A и влияние B. Если более двух элементов присутствуют в клетке, растении или его части, например, элементы A, B и C, это означает, что влияние комбинации всех элементов превышает сумму влияний индивидуальных элементов. В предпочтительном варианте реализации изобретения это означает, что влияние комбинации элементов A, B и C превышает сумму сочетанного влияния элементов A и B и влияния элемента C. В таком случае, может быть указано, что элемент C действует синергетически с элементами A и B. Необходимо понимать, что влияние измеряют в соответствующих клетках, растениях или их частях, например, выращенных в таких же условиях и находящихся в такой же стадии биологического развития.

В настоящем документе "прорастать со скоростью, в существенной мере такой же, как и соответствующее растение дикого типа" обозначает, что семя растения по изобретению относительно способно к прорастанию при сравнении с семенем растения дикого типа, не содержащего определенного(ых) экзогенного(ых) полинуклеотида(ов). Прорастание может быть измерено in vitro на питательной среде для культуры ткани или в грунте, как это происходит в поле. В одном варианте реализации изобретения количество семян, которые прорастают, например, при выращивании в оптимальных условиях теплицы для данного вида растений, составляет по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, по сравнению с соответствующими семенами дикого типа. В другом варианте реализации изобретения семена, которые прорастают, например, при выращивании в оптимальных условиях теплицы для данного вида растений, дают саженцы, растущие со скоростью, которая, в среднем, составляет по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, по сравнению с соответствующими растениями дикого типа. Это обозначается как ʺсила роста саженцевʺ. В варианте реализации изобретения скорость начального роста корней и роста побегов у саженцев по изобретению является по существу такой же, как у соответствующего саженца дикого типа, выращенного в таких же условиях. В варианте реализации изобретения биомасса листьев (сухая масса) растений по изобретению составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% относительно биомассы листьев соответствующих растений дикого типа, выращенных в таких же условиях, предпочтительно в поле. В варианте реализации изобретения высота растений по изобретению составляет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90% высоты растения относительно соответствующего растения дикого типа, выращенного в таких же условиях, предпочтительно в поле и предпочтительно в состоянии зрелости.

В настоящем документе термин "экзогенный полинуклеотид, который подавляет выработку и/или активность эндогенного полипептида" или его вариации обозначают полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК (например, кодирующий искусственную микроРНК (имиРНК) или шпилечную РНК-интерференцию (шпРНКи)), которая подавляет выработку и/или активность или непосредственно подавляет выработку и/или активность (например, представляет собой имиРНК или шпРНК, которая может быть доставлена, например, непосредственно в клетку) эндогенного полипептида, например, SDP1 ТАГ липазы, пластидной GPAT, пластидной LPAAT, полипептида TGD, АГФазы или дельта-12 десатуразы жирных кислот (FAD2), или проявляет комбинацию двух или более из указанных эффектов. Обычно, молекула РНК уменьшает экспрессию эндогенного гена, кодирующего полипептид.

В настоящем документе термин "в пересчете на массу" обозначает массу вещества (например, ТАГ, ДАГ, жирной кислоты) как процент от массы композиции, содержащей вещество (например, семя, лист). Например, если трансгенное семя содержит 25 мкг общих жирных кислот на 120 мкг массы семени, процент от общих жирных кислот в пересчете на массу составляет 20,8%.

В настоящем документе термин "в относительном выражении" обозначает параметр, например, количество вещества в композиции, содержащей вещество, в сравнении с параметром для соответствующей композиции, в процентном выражении. Например, уменьшение с 3 единиц до 2 единиц является уменьшением на 33% в относительном выражении.

В настоящем документе ʺпластидыʺ представляют собой органеллы в растениях, включая морские водоросли, которые являются местом выработки углеродных соединений на основе фотосинтеза, включая сахара, крахмал и жирные кислоты. Пластиды включают хлоропласты, содержащие хлорофилл и осуществляющие фотосинтез, этиопласты, которые являются прекурсорами хлоропластов, а также специализированные пластиды, такие как хромопласты, которые представляют собой окрашенные пластиды для синтеза и хранения пигментов, геронтопласты, которые руководят демонтажем фотосинтетических структур в ходе старения, амилопласты для синтеза и хранения крахмала, элайопласты для хранения липидов и протеинопласты для хранения и модификации белков.

В настоящем документе термин «биологическое топливо» обозначает любой вид топлива, обычно применяемый для выработки энергии машинным оборудованием, например, автомобилями, самолетами, катерами, большими грузовыми машинами или работающими на нефти двигателями, энергия которого происходит от биологической фиксации углерода. Биотопливо включает виды топлива, получаемые в результате превращения биомассы, а также твердой биомассы, жидких видов топлива и биогазов. Примеры биологического топлива включают биоспирты, биодизельное топливо, синтетическое дизельное топливо, вегетативное масло, биоэфиры, биогаз, синтетический газ, твердое биологическое топливо, полученное из водорослей топливо, биоводород, биометанол, 2,5-диметилфуран (ДМФ), биодиметиловый эфир (биоДМЭ), дизельное топливо Фишера-Тропша, биоводородное дизельное топливо, смешанные спирты и древесное дизельное топливо.

В настоящем документе термин «биоспирт» обозначает полученные биологическим способом спирты, например, этанол, пропанол и бутанол. Биоспирты образуются под действием микроорганизмов и/или ферментов посредством ферментации сахаров, гемицеллюлозы или целлюлозы.

В настоящем документе термин «биодизельное топливо» обозначает состав, содержащий метиловые или этиловые эфиры жирной кислоты, полученные из липидов переэтерификацией, причем липиды получены из живых клеток, а не из окаменелых остатков.

В настоящем документе термин «синтетическое дизельное топливо» обозначает форму дизельного топлива, которое получено из возобновляемого сырья вместо окаменелого сырья, используемого в большинстве видов дизельного топлива.

В настоящем документе термин «растительное масло» включает чистое растительное масло (или непосредственно масло) или масло из отходов (побочный продукт других отраслей промышленности), в том числе масло, которое вырабатывается в вегетативной части или семени растения.

В настоящем документе термин «биогаз» обозначает метан или легковоспламеняющуюся смесь метана и других газов, полученные анаэробным расщеплением органического материала анаэробами.

В настоящем документе термин «синтетический газ» обозначает горючую смесь, которая содержит варьирующиеся количества монооксида углерода и водорода, и может содержать другие углеводороды, полученные частичным окислением биомассы. Синтетический газ может быть превращен в метанол в присутствии катализатора (обычно на основе меди), с последующей дегидратацией метанола в присутствии другого катализатора (например, кремния диоксида-алюминия).

В настоящем документе термин «Фишер-Тропш» обозначает набор химических реакций, в ходе которых смесь монооксида углерода и водорода превращается в жидкие углеводороды. Синтетический газ вначале может быть кондиционирован с использованием, например, конверсии водяного газа, чтобы достичь требуемого соотношения H2/CO. Конверсия происходит в присутствии катализатора, обычно железа или кобальта. Температура, давление и катализатор определяют, будет ли образовываться легкая или тяжелая синтетическая нефть. Например, при 330°C образуются в основном бензин и олефины, тогда как при 180-250°C образуются в основном дизельное топливо и воски. Жидкости, полученные из синтетического газа, которые содержат различные углеводородные фракции, представляют собой углеводороды с неразветвленной цепью и высокой степенью чистоты (не содержащие серы).

В настоящем документе термин «биоуголь» обозначает древесный уголь, полученный из биомассы, например, пиролизом биомассы.

В настоящем документе термин «сырье» обозначает материал, например, биомассу или продукт ее превращения (например, синтетический газ), который используют для производства продукта, например, биологического топлива, например, биодизельного топлива или синтетического дизельного топлива.

В настоящем документе термин «промышленный продукт» обозначает углеводородный продукт, который в основном состоит из атомов углерода и водорода, например, метиловые и/или этиловые эфиры жирной кислоты или алканы, такие как метан, смеси алканов с более длинной цепью, которые обычно являются жидкостями при температуре окружающей среды, биологическое топливо, монооксид углерода и/или водорода или биоспирт, например, этанол, пропанол или бутанол или биоуголь. Термин «промышленный продукт» предназначен включать промежуточные продукты, которые могут быть превращены в другие промышленные продукты, например, синтетический газ, который сам по себе рассматривается, как промышленный продукт, может использоваться для синтеза углеводородного продукта, который также рассматривается, как промышленный продукт. Термин «промышленный продукт» в настоящем документе включает обе чистые формы упомянутых выше соединений или, чаще, смесь различных соединений и компонентов, например, углеводородный продукт может содержать соединения с длиной углеродной цепи в определенном интервале, как хорошо известно из уровня техники.

В настоящем документе ʺпотомокʺ подразумевает ближайшее и все последующие поколения потомства, полученные от родительского организма, например, второе, третье или более поздние поколения потомства.

В настоящем документе слово «включают (содержат)» или его вариации, например, «включает (содержит)» или «включающий (содержащий)» следует понимать, как обозначающее включение заявленного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, но исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий.

Термин «и/или», например, «X и/или Y» следует понимать, как обозначающий любое из «X и Y» или «X или Y» и интерпретировать как обеспечивающий явное присутствие обоих значений, или любого из значений.

В настоящем документе термин около (приблизительно), если не указано иное, обозначает +/- 10%, более предпочтительно +/- 5%, более предпочтительно +/- 2%, более предпочтительно +/- 1%, даже более предпочтительно +/- 0,5% от указанного значения.

Выработка неполярных липидов и триацилглицеридов

Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что содержание неполярных липидов в рекомбинантных эукариотных клетках может быть повышено с помощью комбинации модификаций, выбранных из обозначенных в настоящем документе как: (A). Push, (B). Pull, (C). Protect, (D). Package, (E). Plastidial export, (F). Plastidial import и (G). Prokariotyc Pathway. Как описано в настоящем документе, клетки без пластид могут содержать различные комбинации A-D, тогда как клетки с пластидами, такие как растительные и водорослевые клетки, могут содержать различные комбинации A-G.

Таким образом, рекомбинантные клетки, трансгенные животные, не относящиеся к человеческому роду, или их часть, а также трансгенные растения или их часть по изобретению содержат целый ряд комбинаций экзогенных полинуклеотидов и/или генетических модификаций, каждая из которых обеспечивает одну из модификаций. Указанные экзогенные полинуклеотиды и/или генетические модификации включают:

(A) экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора транскрипции, который увеличивает экспрессию одного или боле гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, трансгенном животном, не относящемся к человеческому роду, или его части, или трансгенном растении или его части, обеспечивая модификацию ʺPushʺ

(B) экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, который принимает участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов в клетке, трансгенном животном, не относящемся к человеческому роду, или его части, или трансгенном растении или его части, обеспечивая модификацию ʺPullʺ

(C) генетическая модификация, которая подавляет эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке,трансгенном животном, не относящемся к человеческому роду, или его части, или трансгенном растении или его части, по сравнению с соответствующей клеткой, трансгенным животным, не относящимся к человеческому роду, или его частью, или трансгенным растением или его частью, в которых отсутствует генетическая модификация, обеспечивающая модификацию ʺProtectʺ

(D) экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид покрытия масляного включения (ПМВ), обеспечивая модификацию ʺPackageʺ,

(E) экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, который увеличивает экспорт жирных кислот из пластид клетки, трансгенного животного, не относящегося к человеческому роду, или его части, или трансгенного растения или его части, по сравнению с соответствующей клеткой, трансгенным животным, не относящимся к человеческому роду, или его частью, или трансгенным растением или его частью, в которых отсутствует экзогенный полинуклеотид, обеспечивающий ʺPlastidial exportʺ,

(F) генетическая модификация, подавляющая эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки,трансгенное животное, не относящееся к человеческому роду, или его часть, или трансгенное растение или его часть, по сравнению с соответствующей клеткой,трансгенным животным, не относящимся к человеческому роду, или его частью, или трансгенным растением или его частью, в которых отсутствует генетическая модификация, обеспечивающая ʺPlastidial importʺ, и

(G) генетическая модификация, подавляющая эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицеридов (ДАГ) в пластиде клетки, трансгенном животном, не относящемся к человеческому роду, или его части, или трансгенном растении или его части, по сравнению с соответствующей клеткой,трансгенным животным, не относящимся к человеческому роду, или его частью, или трансгенным растением или его частью, в которых отсутствует генетическая модификация, обеспечивающая модификацию ʺProkaryotic Pathwayʺ.

Предпочтительные комбинации (дополнительно обозначенные в настоящем документе как наборы) экзогенных полинуклеотидов и/или генетические модификации по изобретению представляют собой;

1) A, B и необязательно один из C, D, E, F или G;

2) A, C и необязательно один из D, E, F или G;

3) A, D и необязательно один из E, F или G;

4) A, E и необязательно F или G;

5) A, F и необязательно G;

6) A и G;

7) A, B, C и необязательно один из D, E, F или G;

8) A, B, D и необязательно один из E, F или G;

9) A, B, E и необязательно F или G;

10) A, B, F и необязательно G;

11) A, B, C, D и необязательно один из E, F или G;

12) A, B, C, E и необязательно F или G;

13) A, B, C, F и необязательно G;

14) A, B, D, E и необязательно F или G;

15) A, B, D, F и необязательно G;

16) A, B, E, F и необязательно G;

17) A, C, D и необязательно один из E, F или G;

18) A, C, E и необязательно F или G;

19) A, C, F и необязательно G;

20) A, C, D, E и необязательно F или G;

21) A, C, D, F и необязательно G;

22) A, C, E, F и необязательно пятая модификация G;

23) A, D, E и необязательно F или G;

24) A, D, F и необязательно G;

25) A, D, E, F и необязательно G;

26) A, E, F и необязательно G;

27) шесть из А, B, C, D, E, F и G, за исключением одной из A, B, C, D, E, F или G, и

28) любая из 1-26 выше, где присутствуют два или более экзогенных полинуклеотида, кодирующие два или более различных полипептида фактора транскрипции, которые увеличивают экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке, например, один экзогенный полинуклеотид, кодирующий WRI1, и другой экзогенный полинуклеотид, кодирующий LEC2.

В каждой из приведенных выше предпочтительных комбинаций может присутствовать по меньшей мере два различных экзогенных полинуклеотида, которые кодируют по меньшей мере два различных полипептида фактора транскрипции, увеличивающих экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке,трансгенном животном, не относящемся к человеческому роду, или его части, или трансгенном растении или его части.

Эти модификации описаны, как указано ниже:

A. Модификация ʺPush (Толчок)ʺ отличается повышенным синтезом общих жирных кислот в пластидах эукариотной клетки. В варианте реализации изобретения это происходит благодаря повышенной экспрессии и/или активности фактора транскрипции, который регулирует синтез жирных кислот в пластидах. В одном варианте реализации изобретения это может быть достигнуто путем экспрессии в трансгенной клетке экзогенного полинуклеотида, который кодирует полипептид фактора транскрипции, повышающего экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в клетке. В варианте реализации изобретения повышенный синтез жирных кислот не является вызванным доставкой в клетку модифицированной АККазы, активность которой в меньшей степени ингибируется жирными кислотами, по сравнению с эндогенной АККазой в клетке. В варианте реализации изобретения клетка содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий фактор транскрипции, предпочтительно под контролем промотора, кроме конститутивного промотора. Фактор транскрипции может быть выбран из группы, состоящей из WRI1, LEC1, LEC1-подобного, LEC2, BBM, FUS3, ABI3, ABI4, ABI5, Dof4, Dof11, или из группы, состоящей из MYB73, bZIP53, AGL15, MYB115, MYB118, TANMEI, WUS, GFR2a1, GFR2a2 и PHR1, и предпочтительно представляет собой WRI1, LEC1 или LEC2. В дальнейшем варианте реализации изобретения увеличенный синтез общих жирных кислот является относительным по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа. В варианте реализации изобретения присутствует два или более экзогенных полинуклеотида, кодирующие два или более различных полипептида фактора транскрипции.

B. Модификация ʺPull (Притягивание)ʺ отличается повышенной экспрессией и/или активностью в клетке ацилтрансферазы ацилов жирных кислот, которая катализирует синтез ТАГ, ДАГ или МАГ в клетке, такой как DGAT, PDAT, LPAAT, GPAT или MGAT, предпочтительно DGAT или PDAT. В одном варианте реализации изобретения это может быть достигнуто путем экспрессии в трансгенной клетке экзогенного полинуклеотида, который кодирует полипептид, принимающий участие в биосинтезе одного или более неполярных липидов. В варианте реализации изобретения ацилтрансфераза является мембрано-связанной ацилтрансферазой, которая использует субстрат ацил-КоА в качестве донора ацила в случае DGAT, LPAAT, GPAT или MGAT или ацильную группу ФК в качестве донора ацила в случае PDAT. Модификация Pull может быть относительной по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа или, предпочтительно, относительной по сравнению с соответствующей клеткой, содержащей модификацию Push. В варианте реализации изобретения клетка содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий ацилтрансферазу ацилов жирных кислот.

C. Модификация ʺProtect (Защита)ʺ отличается снижением катаболизма триацилглицеридов (ТАГ) в клетке. В варианте реализации изобретения это может быть достигнуто путем генетической модификации в клетке, которая подавляет эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов (ТАГ) в клетке, по сравнению с соответствующей клеткой без генетической модификации. В варианте реализации изобретения клетка проявляет сниженную экспрессию и/или активность эндогенной ТАГ липазы в клетке, предпочтительно липазы SDP1, полипептида Cgi58, ацил-КоА оксидазы, такой как ACX1 или ACX2, или полипептида, принимающего участие в β-окислении жирных кислот в клетке, такого как пероксисомальный переносчик ATP-связывающей кассеты PXA1. Это может происходить благодаря экспрессии в клетке экзогенного полинуклеотида, кодирующего молекулу РНК, которая снижает экспрессию, например, эндогенного гена, кодирующего ТАГ липазу, такую как липаза SDP1, ацил-КоА оксидаза или полипептид, принимающий участие в β-окислении жирных кислот в клетке, или путем мутации в эндогенном гене, кодирующем, например, ТАГ липазу, ацил-КоА оксидазу или полипептид, принимающий участие в β-окислении жирных кислот. Это может происходить благодаря экспрессии в клетке экзогенного полинуклеотида, кодирующего молекулу РНК, которая снижает экспрессию, например, эндогенного гена, кодирующего ТАГ липазу, такую как липаза SDP1, ацил-КоА оксидаза или полипептид, принимающий участие в β-окислении жирных кислот в клетке, или путем мутации в эндогенном гене, кодирующем, например, ТАГ липазу, ацил-КоА оксидазу или полипептид, принимающий участие в β-окислении жирных кислот. В варианте реализации изобретения сниженная экспрессия и/или активность является относительной по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа или относительной по сравнению с соответствующей клеткой, содержащей модификацию Push.

D. Модификация ʺPackage (Упаковка)ʺ отличается повышенной экспрессией и/или аккумуляцией полипептида покрытия масляного включения (ПМВ). В варианте реализации изобретения это может быть достигнуто путем экспрессии в трансгенной клетке экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид покрытия масляного включения (ПМВ). Полипептид ПМВ может представлять собой олеозин, такой как полиолеозин, каолеозин или стеролеозин или предпочтительно LDAP. В варианте реализации изобретения уровень олеозина, который аккумулируется в эукариотной клетке, по меньшей мере в 2 раза выше относительно соответствующей клетки, содержащей ген олеозина из T-ДНК pJP3502. В варианте реализации изобретения повышенная экспрессия или аккумуляция полипептида ПМВ не является вызванной исключительно модификацией Push. В варианте реализации изобретения экспрессия и/или аккумуляция является относительной по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа или предпочтительно относительно соответствующей клетки, которая содержит модификацию Push.

E. Модификация ʺPlastidial export (Пластидный экспорт)ʺ отличается повышенной скоростью экспорта общих жирных кислот из пластид эукариотной клетки. В одном варианте реализации изобретения это может быть достигнуто путем экспрессии в трансгенной клетке экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который увеличивает экспорт жирных кислот из пластид клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, в которой отсутствует экзогенный полинуклеотид. В варианте реализации изобретения это достигается путем повышения экспрессии и/или активности тиоэстеразы (ТЭ) жирных кислот, полипептида-переносчика жирных кислот, такого как полипептид ABCA9, или длинноцепочечной ацил-КоА синтетазы (ДЦАС). В варианте реализации изобретения клетка содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий ТЭ, полипептид-переносчик жирных кислот или ДЦАС. ТЭ может представлять собой полипептид FATB или, предпочтительно, полипептид FATA. В варианте реализации изобретения ТЭ предпочтительно представляет собой ТЭ со специфичностью в отношении СЦЖК. В варианте реализации изобретения модификация Plastidial export является относительной по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа или предпочтительно относительной по сравнению с соответствующей клеткой, которая содержит модификацию Push.

F. Модификация ʺPlastidial import (Пластидный импорт)ʺ отличается сниженной скоростью импорта жирных кислот в пластиды клетки из пространства за пределами пластид. В варианте реализации изобретения это может быть достигнуто с помощью генетической модификации в клетке, которая подавляет эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в импорте жирных кислот в пластиды клетки, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей генетической модификации. Например, это может происходить благодаря экспрессии в клетке экзогенного полинуклеотида, кодирующего молекулу РНК, которая снижает экспрессию эндогенного гена, кодирующего полипептид-переносчик, такой как полипептид TGD, например полипептид TGD1, TGD2, TGD3 или TGD4, или мутации в эндогенном гене, кодирующем полипептид TGD. В варианте реализации изобретения сниженная скорость импорта является относительной по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа или относительной по сравнению с соответствующей клеткой, которая содержит модификацию Push.

G. Модификация ʺProkaryotic Pathway (Прокариотный путь)ʺ отличается сниженным количеством ДАГ или сниженной скоростью выработки ДАГ в пластидах клетки. В варианте реализации изобретения это может быть достигнуто путем генетической модификации в клетке, которая подавляет эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в выработке диацилглицеридов (ДАГ) в пластиде, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей генетической модификации. В варианте реализации изобретения сниженное количество или скорость выработки ДАГ является результатом сниженной выработки LPA из ацил-АПБ и G3P в пластидах. Сниженное количество или скорость выработки ДАГ может быть результатом экспрессии в клетке экзогенного полинуклеотида, кодирующего молекулу РНК, которая снижает экспрессию эндогенного гена, кодирующего пластидную GPAT, пластидную LPAAT или пластидную PAP, предпочтительно пластидную GPAT, или мутации в эндогенном гене, кодирующем пластидный полипептид. В варианте реализации изобретения сниженное количество или скорость выработки ДАГ является относительным по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа или предпочтительно относительной по сравнению с соответствующей клеткой, которая содержит модификацию Push.

Модификация Push имеет большое значение для изобретения, а модификация Pull является предпочтительной. Модификации Protect и Package могут быть комплементарными, т.е. одной из двух может быть достаточно. Клетка может содержать одну, две или все три из модификаций Plastidial export, Plastidial import и Prokaryotic Pathway. В варианте реализации изобретения по меньшей мере один из экзогенных полинуклеотидов в клетке, предпочтительно по меньшей мере экзогенный полинуклеотид, кодирующий фактор транскрипции, который регулирует синтез жирных кислот в пластидах, экспрессируется под контролем (H) промотора, кроме конститутивного промотора, например, такого как связанный с развитием промотор, промотор, который предпочтительно активен в фотосинтезирующих клетках, тканеспецифичный промотор, промотор, модифицированный путем снижения уровня его экспрессии относительно соответствующего природного промотора, или предпочтительно промотора, представляющего собой специфичный для старения промотор. Более предпочтительно, по меньшей мере экзогенный полинуклеотид, кодирующий фактор транскрипции, который регулирует синтез жирных кислот в пластидах, экспрессируется под контролем промотора, кроме конститутивного промотора, причем экзогенный полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, которая подавляет эндогенную выработку и/или активность полипептида, принимающего участие в катаболизме триацилглицеридов, также экспрессируется под контролем промотора, кроме конститутивного промотора, и, при этом, промоторы могут быть одинаковыми или разными.

Растения вырабатывают некоторые, но не все из их мембранных липидов, такие как MGDG, в пластидах по так называемому прокариотному пути (Фиг. 1). Кроме того, в растениях присутствует эукариотный путь для синтеза галактолипидов и глицеролипидов, по которому ЖК вначале синтезируются в пластиде, а затем в ЭР происходит сборка ЖК в глицеролипиды. MGDG, синтезированный по эукариотному пути, содержит C18:3 жирную кислоту (АЛК), этерифицированную в положении sn-2 MGDG. Сборка скелета ДАГ, содержащего АЛК для синтеза MGDG данным путем, происходит в ЭР, после чего происходит его импорт в пластиду. В противоположность этому, MGDG, синтезированный прокариотным путем, содержит C16:3 жирную кислоту, этерифицированную в положении sn-2 MGDG. Соотношение вклада прокариотного пути относительно эукариотного пути в выработку MGDG (16:3) против MGDG (18:3) представляет собой характерный и отличительный признак различных видов растений (Mongrand с соавт., 1998). Указанный отличительный жирнокислотный состав MGDG позволяет классифицировать все высшие растения (покрытосеменные) на так называемые 16:3 или 18:3 растения. Виды 16:3, примером которых являются Arabidopsis и Brassica napus, в общем содержат активный прокариотный и активный эукариотный пути синтеза MGDG, тогда как виды 18:3, примером которых являются Nicotiana tabacum Pisum sativum и Glycine max, в общем, содержат только (или почти полностью) эукариотный путь синтеза MGDG, с небольшой или отсутствующей аккумуляцией C16:3 жирной кислоты в вегетативных тканях. В настоящем документе ʺрастение 16:3ʺ или ʺвид 16:3ʺ представляет собой такое, которое содержит более чем 2% C16:3 жирной кислоты в общем содержании жирных кислот в его фотосинтезирующих тканях. В настоящем документе ʺрастение 18:3ʺ или ʺвид 18:3ʺ представляет собой такое, которое содержит менее чем 2% C16:3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот в его фотосинтетических тканях. Как описано в настоящем документе, растение может быть превращено из растения 16:3 в растение 18:3 путем подходящих генетических модификаций. Соотношение потока между прокариотным и эукариотным путями не является консервативным для разных видов растений или тканей. В видах 16:3 до 40% потока в листьях проходит по прокариотному пути (Browse с соавт., 1986), тогда как в видах 18:3, таких как горох и соя, около 90% ЖК, которые синтезированы в пластиде, экспортируется из пластиды в ЭР, чтобы обеспечить источник ЖК для эукариотного пути (Ohlrogge и Browse, 1995; Somerville с соавт., 2000).

Таким образом, различные количества 18:3 и 16:3 жирных кислот найдены в гликолипидах различных видов растений. Это используется для того, чтобы отличать растения 18:3, в которых жирные кислоты с 3 двойными связями практически полностью являются C18 жирными кислотами, и растения 16:3, которые содержат как C16-, так и C18-жирные кислоты с 3 двойными связями. В хлоропластах растений 18:3 ферментная активность, катализирующая превращение фосфатидата в диацилглицерид и диацилглицерида в моногалактозилдиацилглицерид (МГД), существенно менее выражена, чем в хлоропластах 16:3. В листьях растений 18:3 хлоропласты синтезируют стеароил-ACP2 в строме, вводят первую двойную связь в насыщенную углеводородную цепь, а затем гидролизуют тиоэфир тиоэстеразами (Фиг. 1). Высвобождающийся олеат экспортируется сквозь конверты хлоропластов в мембраны эукариотной части клетки, вероятно, эндоплазматический ретикулум, где он инкорпорируется в ФХ. В этих мембранах в ФХ-связанные олеоильные группы вводятся кратные связи, и далее они перемещаются обратно в хлоропласт. МГД-связанные ацильные группы представляет собой субстраты для введения третьей двойной связи с образованием МГД с двумя линоленоильными остатками. Данный галактолипид является характерным для растений 18:3, например, таких как Asteraceae и Fabaceae. В фотосинтетически активных клетках растений 16:3, которые представлены, например, членами Apiaceae и Brassicaceae, два пути действуют параллельно, чтобы обеспечить тилакоиды МГД.

В одном варианте реализации изобретения вегетативная часть растения, эукариотная клетка, семя или трансгенный организм, не принадлежащий к человеческому роду, или их часть (например, клубень или свекла) по изобретению вырабатывает более высокие уровни неполярных липидов, таких как ТАГ, или имеет более высокое содержание общих жирных кислот (ОЖК), предпочтительно оба, по сравнению с соответствующей вегетативной частью растения, эукариотной клеткой, семенем или организмом, не принадлежащим к человеческому роду, или их частью, в которой отсутствуют генетические модификации или экзогенные полинуклеотиды. В одном примере растения по изобретению дают семена, листья или имеют части листьев с площадью поверхности по меньшей мере 1 см2, стволы и/или клубни с повышенным содержанием неполярных липидов, например, содержанием ТАГ или ОЖК, предпочтительно обоими, по сравнению с соответствующими семенами, листьями, частями листьев с площадью поверхности по меньшей мере 1 см2, стволами или клубнями.

В другом варианте реализации изобретения вегетативная часть растения, трансгенный организм, не относящийся к человеческому роду, или их часть (такая как клубень или свекла), предпочтительно растение, клубень, свекла или семя, вырабатывают ТАГ, обогащенный одной или более конкретных жирных кислот. Широкий спектр жирных кислот может быть инкорпорирован в ТАГ, в том числе насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты и короткоцепочечные и длинноцепочечные жирные кислоты. Некоторые неограничивающие примеры жирных кислот, которые могут быть инкорпорированы в ТАГ, и уровень которых может быть повышен, включают: каприновую (10:0), лауриновую (12:0), миристиновую (14:0), пальмитиновую (16:0), пальмитолеиновую (16:1), стеариновую (18:0), олеиновую (18:1), вакценовую (18:1), линолевую (18:2), элеостеариновую (18:3), γ-линоленовую (18:3), α-линоленовую (18:3ω3), стеаридоновую (18:4ω3), арахидоновую (20:0), эйкозадиеновую (20:2), дигомо-γ-линолевую (20:3), эйкозатриеновую (20:3), арахидоновую (20:4), эйкозатетраеновую (20:4), эйкозапентаеновую (20:5ω3), бегеновую (22:0), докозапентаеновую (22:5ω), докозагексаеновую (22:6ω3), лигноцериновую (24:0), ацетэруковую (24:1), церотиновую (26:0) и монтановую (28:0) жирные кислоты. В одном варианте настоящего изобретения вегетативная часть растения, эукариотная клетка, семя или трансгенный организм или их часть (как например, клубень или свекла) обогащены ТАГ, содержащими олеиновую кислоту и/или сниженное содержание линоленовой кислоты (АЛК), предпочтительно по меньшей мере на 2% или по меньшей мере на 5%, в пересчете на абсолютное вещество.

Предпочтительно, вегетативная часть растения, эукариотная клетка, семя или трансгенный организм, не принадлежащий к человеческому роду, или их часть по изобретению трансформированы одной или более химерными ДНК (экзогенные полинуклеотиды). В случае нескольких химерных ДНК, предпочтительно они ковалентно соединены в одну молекулу ДНК, например, такую как единая молекула T-ДНК, и предпочтительно интегрированы в один локус генома клетки-хозяина. В качестве альтернативы, химерные ДНК находятся на двух или более молекулах ДНК, которые могут быть несвязанными с геномом хозяина, или молекула(ы) ДНК не являются интегрированными в геном хозяина, например, как это происходит в экспериментах с временной экспрессией. Растение, вегетативная часть растения, эукариотная клетка, семя или трансгенный организм, не принадлежащий к человеческому роду, или их часть предпочтительно являются гомозиготными по одной молекуле ДНК, инкорпорированной в их геном.

Факторы транскрипции

В эукариотных клетках различные факторы транскрипции принимают участие в синтезе жирных кислот и липидов, содержащих жирные кислоты, такие как ТАГ, и, таким образом, существует возможность манипулировать ими с целью модификации Push. Предпочтительным фактором транскрипции является WRI1. В настоящем документе термин «Wrinkled 1» или «WRI1» или «WRL1» обозначает фактор транскрипции класса AP2/ERWEBP, который регулирует экспрессию нескольких ферментов, принимающих участие в гликолизе и биосинтезе жирных кислот de novo. WRI1 содержит два специфичных для растения (AP2/EREB) домена связывания с ДНК. Дополнительно, WRI1, по меньшей мере в Arabidopsis, также регулирует разложение сахарозы посредством гликолиза, таким образом регулируя поступление прекурсоров для биосинтеза жирных кислот. Иными словами, он управляет потоком углерода от продукта фотосинтеза к запасным липидам. Мутанты wri1, по меньшей мере в Arabidopsis, демонстрируют фенотип сморщенного семени, за счет дефекта во встраивании сахарозы и глюкозы в ТАГ.

Примеры генов, которые транскрибируются WRI1, включают, без ограничений, одну или более, предпочтительно все из генов, кодирующих пируваткиназу (At5g52920, At3g22960), субъединицу E1 альфа (At1g01090) пируватдегидрогеназы (ПДГ), ацетил-КоА карбоксилазу (АЦКазу), субъединицу BCCP2 (At5g15530), еноил-АПБ редуктазу (At2g05990; EAR), фосфоглицерат мутазу (At1g22170), цитозольную фруктокиназу и цитозольную фосфоглицерат мутазу, синтетазу сахарозы (SuSy) (см., например, Liu с соавт., 2010b; Baud с соавт., 2007; Ruuska с соавт., 2002).

WRI1 содержит консервативный домен AP2 (cd00018). AP2 представляет собой домен связывания с ДНК, найденный в регуляторах транскрипции в растениях, например, APETALA2 и EREBP (белок, связывающийся с элементом, который реагирует на этилен). В EREBP домен специфично связывается с боксом 11bp GCC элемента, который реагирует на этилен (ЭРЭ), промоторного элемента, незаменимого для реагирования на этилен. EREBP и фактор связывания с C-повтором CBF1, который принимает участие в ответе на стресс, содержат одну копию домена AP2. APETALA2-подобные белки, которые играют роль в развитии растения, содержат две копии.

Другие мотивы последовательности, которые могут быть найдены в WRI1 и его функциональных гомологах, включают:

1. R G V T/S R H R W T G R (SEQ ID NO:89).

2. F/Y E A H L W D K (SEQ ID NO:90).

3. D L A A L K Y W G (SEQ ID NO:91).

4. S X G F S/A R G X (SEQ ID NO:92).

5. H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V (SEQ ID NO:93).

6. Q E E A A A X Y D (SEQ ID NO:94).

В настоящем документе термин «Wrinkled 1» или «WRI1» также включает «подобные Wrinkled 1» или «WRI1-подобные» белки. Примеры белков WRI1 включают номера доступа: Q6X5Y6, (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:22), XP_002876251.1 (подвид Arabidopsis lyrata ; Lyrata; SEQ ID NO:23), ABD16282.1 (Brassica napus; SEQ ID NO:24), ADO16346.1 (Brassica napus; SEQ ID NO:25), XP_003530370.1 (Glycine max; SEQ ID NO:26), AEO22131.1 (Jatropha curcas; SEQ ID NO:27), XP_002525305.1 (Ricinus communis; SEQ ID NO:28), XP_002316459.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:29), CBI29147.3 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:30), XP_003578997.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:31), BAJ86627.1 (Hordeum vulgare подвид. vulgare; SEQ ID NO:32), EAY79792.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:33), XP_002450194.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:34), ACG32367.1 (Zea mays; SEQ ID NO:35), XP_003561189.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:36), ABL85061.1 (Brachypodium sylvaticum; SEQ ID NO:37), BAD68417.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:38), XP_002437819.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:39), XP_002441444.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:40), XP_003530686.1 (Glycine max; SEQ ID NO:41), XP_003553203.1 (Glycine max; SEQ ID NO:42), XP_002315794.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:43), XP_002270149.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:44), XP_003533548.1 (Glycine max; SEQ ID NO:45), XP_003551723.1 (Glycine max; SEQ ID NO:46), XP_003621117.1 (Medicago truncatula; SEQ ID NO:47), XP_002323836.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:48), XP_002517474.1 (Ricinus communis; SEQ ID NO:49), CAN79925.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:50), XP_003572236.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:51), BAD10030.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:52), XP_002444429.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:53), NP_001170359.1 (Zea mays; SEQ ID NO:54), XP_002889265.1 (Arabidopsis lyrata подвид lyrata; SEQ ID NO:55), AAF68121.1 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:56), NP_178088.2 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:57), XP_002890145.1 (Arabidopsis lyrata подвид lyrata; SEQ ID NO:58), BAJ33872.1 (Thellungiella halophila; SEQ ID NO:59), NP_563990.1 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:60), XP_003530350.1 (Glycine max; SEQ ID NO:61), XP_003578142.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:62), EAZ09147.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:63), XP_002460236.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:64), NP_001146338.1 (Zea mays; SEQ ID NO:65), XP_003519167.1 (Glycine max; SEQ ID NO:66), XP_003550676.1 (Glycine max; SEQ ID NO:67), XP_003610261.1 (Medicago truncatula; SEQ ID NO:68), XP_003524030.1 (Glycine max; SEQ ID NO:69), XP_003525949.1 (Glycine max; SEQ ID NO:70), XP_002325111.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:71), CBI36586.3 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:72), XP_002273046.2 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:73), XP_002303866.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:74), и CBI25261.3 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:75). Дальнейшие примеры включают Sorbi-WRL1 (SEQ ID NO: 76), Lupan-WRL1 (SEQ ID NO: 77), Ricco-WRL1 (SEQ ID NO: 78), и Lupin angustifolius WRI1 (SEQ ID NO: 79). Предпочтительным WRI1 является WRI1 маиса или WRI1 сорго.

Позже, подмножество WRI1-подобных факторов транскрипции было повторно классифицировано как факторы транскрипции WRI2, WRI3 или WRI4, которые скорее отличаются преимущественной экспрессией в стволах и/или корнях растений, чем в развивающихся семенах (To с соавт., 2012). Несмотря на повторную классификацию, они входят в определение ʺWRI1ʺ в настоящем документе. Предпочтительными WRI1-подобными факторами транскрипции являются те, которые могут дополнить функцию мутации wri1 в растении, особенно функцию в развивающемся семени растения, например, в мутанте wri1 A. thaliana. Кроме того, функция WRI1-подобного полипептида может быть количественно оценена в N. benthamiana при помощи анализов с временной экспрессией, как описано в настоящем документе.

В настоящем документе полипептид ʺЛИСТОВАЯ СЕМЯДОЛЯʺ или ʺLECʺ обозначает фактор транскрипции, который является фактором транскрипции LEC1, LEC1-подобным, LEC2, ABI3 или FUS3 и демонстрирует широкий контроль над созреванием семени и синтезом жирных кислот. LEC2, FUS3 и ABI3 представляют собой родственные полипептиды, каждый из которых содержит ДНК-связывающий домен B3 размером 120 аминокислот (Yamasaki с соавт., 2004), найденный только в растительных белках. Их можно отличить при помощи филогенетического анализа, чтобы определить связь аминокислотной последовательности с членами множества полипептидов A. thaliana, имеющими указанные ниже номера доступа: LEC2, номер доступа AAL12004.1; FUS3 (также известный как FUSCA3), номер доступа AAC35247. LEC1 принадлежит к другому классу полипептидов и гомологичен полипептиду HAP3 класса фактора связывания CBF (Lee с соавт., 2003). Гены LEC1, LEC2 и FUS3 требуются в ходе раннего эмбриогенеза, чтобы предопределить гибель эмбриональных клеток и определить идентичность семядоли, и позже в ходе инициации и поддержания созревания эмбриона (Santos-Mendoza с соавт., 2008). Кроме того, они индуцируют экспрессию генов, кодирующих запасные белки семени, путем связывания с мотивами RY, присутствующими в промоторах, и генов олеозина. Дополнительно, они могут отличаться характером экспрессии в ходе развития семени или своей способностью дополнить соответствующую мутацию в A. thaliana.

В настоящем документе термин ʺЛистовая Семядоля 1ʺ или ʺLEC1ʺ обозначает фактор транскрипции NF-YB-типа, который принимает участие в развитии зиготы и соматическом эмбриогенезе. Эндогенный ген специфично экспрессируется в семени, как в эмбрионе, так и эндосперме. LEC1 активизирует ген, кодирующий WRI1, а также большой класс генов синтеза жирных кислот. Кроме того, эктопическая экспрессия LEC2 вызывает быструю активацию реагирующих на ауксин генов и может вызывать образование соматических эмбрионов. Примеры полипептидов LEC1 включают белки Arabidopsis thaliana (AAC39488, SEQ ID NO:149), Medicago truncatula (AFK49653, SEQ ID NO:154) and Brassica napus (ADF81045, SEQ ID NO:151), A. lyrata (XP_002862657, SEQ ID NO:150), R. communis (XP_002522740, SEQ ID NO:152), G. max (XP_006582823, SEQ ID NO:153), A. hypogaea (ADC33213, SEQ ID NO:156), Z. mays (AAK95562, SEQ ID NO:155).

LEC1-подобный (L1L) является близкородственным LEC1, но отличается другим характером экспрессии гена, который экспрессируется раньше в ходе эмбриогенеза (Kwong с соавт., 2003). Примеры LEC1-подобных полипептидов включают белки Arabidopsis thaliana (AAN15924, SEQ ID NO:157), Brassica napus (AHI94922, SEQ ID NO:158), and Phaseolus coccineus LEC1-like (AAN01148, SEQ ID NO: 159).

В настоящем документе термин ʺЛистовая семядоля 2ʺ или ʺLEC2ʺ обозначает домен B3 фактора транскрипции, который принимает участие в развитии зиготы и соматическом эмбриогенезе и который активизирует экспрессию гена, кодирующего WRI1. Его эктопическая экспрессия облегчает эмбриогенез из вегетативных тканей растения (Alemanno с соавт., 2008). Примеры полипептидов LEC2 включают белки Arabidopsis thaliana (номер доступа NP_564304.1, SEQ ID NO:142), Medicago truncatula (номер доступа CAA42938.1, SEQ ID NO:143) and Brassica napus (номер доступа ADO16343.1, SEQ ID NO:144).

В варианте реализации изобретения экзогенный полинуклеотид по изобретению, который кодирует LEC2, содержит одно или более из следующего:

i) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых приведена в любой из SEQ ID NO: 142-144, или его биологически активный фрагмент или полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 30% идентична любой одной или больше из SEQ ID NO: 142-144,

ii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i), и

iii) полинуклеотид, который гибридизуется с одним или обоими из i) или ii) в строгих условиях.

В настоящем документе термин ʺFUS3ʺ обозначает домен B3 фактора транскрипции, который принимает участие в развитии зиготы и соматическом эмбриогенезе и обнаружен по большей части в протодермальной ткани эмбриона (Gazzarrini с соавт., 2004). Примеры полипептидов FUS3 включают белки Arabidopsis thaliana (AAC35247, SEQ ID NO:160), Brassica napus (XP_006293066.1, SEQ ID NO:161) and Medicago truncatula (XP_003624470, SEQ ID NO:162). Чрезмерной экспрессией любого из LEC1, L1L, LEC2, FUS3 и ABI3 из экзогенного полинуклеотида предпочтительно управляют с помощью регулируемого развитием промотора, такого как специфичный для старения промотор, индуцибельный промотор, или промотор, который сконструирован с целью обеспечения сниженного уровня экспрессии относительно природного промотора, особенно в растениях, кроме Arabidopsis thaliana и B. napus сорт Westar, во избежание аномалий развития, возникающих в ходе развития растения, которые обычно ассоциируются с повышенной экспрессией этих факторов транскрипции (Mu с соавт., 2008).

В настоящем документе термин «BABY BOOM» или «BBM» обозначает фактор транскрипции AP2/ERF, который индуцирует регенерацию в условиях культуры, в норме не поддерживающий регенерацию в растениях дикого типа. Эктопическая экспрессия генов Brassica napus BBM (BnBBM) в B. napus и Arabidopsis индуцирует спонтанный соматический эмбриогенез и органогенез из саженцев, выращиваемых на свободной от гормона основной среде (Boutilier с соавт., 2002). В табаке эктопическая экспрессия BBM является достаточной для индукции дополнительной регенерации побегов и корней на основной среде, но необходим экзогенный цитокинин для образования соматического зародыша (СЭ) (Srinivasan с соавт., 2007). Примеры полипептидов BBM включают белки Arabidopsis thaliana (номер доступа NP_197245.2, SEQ ID NO: 145), маиса (US 7579529), Sorghum bicolor (номер доступа XP_002458927) и Medicago truncatula (номер доступа AAW82334.1, SEQ ID NO:146).

В варианте реализации изобретения экзогенный полинуклеотид по изобретению, который кодирует BBM, содержит, если не указано иное, одно или более из следующего:

i) нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых приведена в одной из SEQ ID NO: 145 или 146, или его биологически активный фрагмент или полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 30% идентична одной или обеим из SEQ ID NO: 145 или 146,

ii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i), и

iii) полинуклеотид, который гибридизуется с одним или обоими из i) или ii) в строгих условиях.

Полипептид ABI3 (A. thaliana, номер доступа NP_189108), родственный белку VP1 маиса, экспрессируется с низкими уровнями в вегетативных тканях и влияет на развитие пластид. Полипептид ABI4 A. thaliana, номер доступа NP_181551) принадлежит к семейству факторов транскрипции, которые содержат специфический для растений домен AP2 (Finkelstein с соавт., 1998) и действуют ниже ABI3 в биохимическом пути. ABI5 (A. thaliana номер доступа NP_565840) представляет собой фактор транскрипции семейства bZIP, который влияет на чувствительность ABA и управляет экспрессией некоторых генов LEA в семенах. Он связывает с реагирующим на ABA элементом.

Каждый из следующих факторов транскрипции был выбран на основе того, что они функционируют в ходе эмбриогенеза в растениях. Номера доступа приведены в Таблице 10. Гомологи каждого из них могут быть с легкостью идентифицированы во многих другие видах растений и проанализированы, как описано в Примере 10.

MYB73 представляет собой фактор транскрипции, идентифицированный в сое, который принимает участие в стрессовых реакциях.

bZIP53 представляет собой фактор транскрипции в семействе белка bZIP, идентифицированный в Arabidopsis.

AGL15 (бесполо-подобный 15) представляет собой фактор транскрипции бокса MADS, который нативно экспрессируется в ходе эмбриогенеза. Кроме того, AGL15 нативно экспрессируется в листовом примордии, верхушечном меристеме побегов и молодых цветочных почках, наводя на мысль о том, что AGL15 может дополнительно функционировать в ходе развития после прорастания. AGL15 играет роль в эмбриогенезе и катаболизме гиббереловой кислоты. Он нацелен на домен B3 факторов транскрипции, которые являются ключевыми регуляторами эмбриогенеза.

MYB115 и MYB118 представляют собой факторы транскрипции в семействе MYB из Arabidopsis, принимающем участие в эмбриогенезе.

TANMEI, также известный как EMB2757, кодирует белок повтора WD, необходимый Arabidopsis для эмбрионального развития.

WUS, также известный как Wuschel, представляет собой ген гомеобокса, который управляет пулом стволовых клеток в эмбрионах. Он экспрессируется в стволовой клетке, организующей центр меристема, и необходим для удерживания стволовых клеток в недифференцированном состоянии. Фактор транскрипции связывается с мотивом TAAT компонента ядра.

GFR2a1 и GFR2a2 представляет собой факторы транскрипции по меньшей мере из сои.

Ацилтрансферазы ацилов жирных кислот

В настоящем документе термин "ацилтрансфераза ацилов жирных кислот" обозначает белок, способный к переносу ацильной группы с ацил-КоА, ФХ или ацил-АПБ, предпочтительно ацил-КоА или ФХ, на субстрат, с целью образования ТАГ, ДАГ или МАГ. Указанные ацилтрансферазы включают DGAT, PDAT, MGAT, GPAT и LPAAT.

В настоящем документе термин «диацилглицерил ацилтрансфераза» (DGAT) обозначает белок, который переносит жирную ацильную группу из ацил-КоА к субстрату ДАГ, с образованием ТАГ. Таким образом, термин «активность диацилглицерил ацилтрансферазы» обозначает перенос группы ацила от ацил-КоА к ДАГ, с образованием ТАГ. DGAT может дополнительно выполнять функцию MGAT, но, в основном, функционирует, как DGAT, т. е., обладает более выраженной каталитической активностью в роли DGAT, чем в роли MGAT, если активность фермента выражена в единицах нмоль продукта/мин/мг белка (см. например, Yen с соавт., 2005). Активность DGAT может быть лимитирующей скорость в процессе синтеза ТАГ в семенах (Ichihara с соавт., 1988). DGAT использует субстрат ацил-КоА в качестве донора ацила и переносит его в положение sn-3 ДАГ, с образованием ТАГ. Фермент в своем нативном состоянии функционирует в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) клетки.

Существует три известных типа DGAT, обозначаемых, как DGAT1, DGAT2 и DGAT3, соответственно. Полипептиды DGAT1 являются мембранными белками, которые обычно содержат 10 трансмембранных доменов, полипептиды DGAT2 также являются мембранными белками, но обычно содержат 2 трансмембранных домена, тогда как полипептиды DGAT3 обычно не содержат ни одного и считаются растворимыми в цитоплазме, а не интегрированными в мембраны. Растительные полипептиды DGAT1 обычно содержат около 510-550 остатков аминокислот, в то время как полипептиды DGAT2 обычно содержат около 310-330 остатков. DGAT1 является основным ферментом, ответственным за выработку ТАГ из ДАГ в большинстве развивающихся семян растений, тогда как DGAT2 из таких видов растений, как тунговое дерево (Vernicia fordii) и клещевина (Ricinus communis), которые продуцируют высокие количества необычных жирных кислот, по-видимому, играют важную роль в аккумуляции необычных жирных кислот в ТАГ. Повышенная экспрессия AtDGAT1 в листьях табака приводила к повышению содержания ТАГ в 6-7 раз (Bouvier-Nave с соавт., 2000).

Примеры полипептидов DGAT1 включают белки DGAT1Aspergillus fumigatus (XP_755172.1; SEQ ID NO:80), Arabidopsis thaliana (CAB44774.1; SEQ ID NO:1), Ricinus communis (AAR11479.1; SEQ ID NO:81), Vernicia fordii (ABC94472.1; SEQ ID NO:82), Vernonia galamensis (ABV21945.1 and ABV21946.1; SEQ ID NO:83 and SEQ ID NO:84, соответственно), Euonymus alatus (AAV31083.1; SEQ ID NO:85), Caenorhabditis elegans (AAF82410.1; SEQ ID NO:86), Rattus norvegicus (NP_445889.1; SEQ ID NO:87), Homo sapiens (NP_036211.2; SEQ ID NO:88), а также их варианты и/или мутанты. Примеры полипептидов DGAT2 включают белки, кодируемые генами DGAT2 Arabidopsis thaliana (NP_566952.1; SEQ ID NO: 2), Ricinus communis (AAY16324.1; SEQ ID NO: 3), Vernicia fordii (ABC94474.1; SEQ ID NO: 4), Mortierella ramanniana (AAK84179.1; SEQ ID NO: 5), Homo sapiens (Q96PD7.2; SEQ ID NO: 6) (Q58HT5.1; SEQ ID NO: 7), Bos taurus (Q70VZ8.1; SEQ ID NO: 8), Mus musculus (AAK84175.1; SEQ ID NO: 9), а также их варианты и/или мутанты. Аминокислотные последовательности DGAT1 и DGAT2 демонстрируют незначительную гомологию. Экспрессия в листьях экзогенного DGAT2 была в два раза более эффективной, чем DGAT1 с точки зрения повышения содержания масла (ТАГ). Кроме того, DGAT2 A. thaliana проявляет большее предпочтение в отношении линолеоил-КоА и линоленоил-КоА в качестве доноров ацила, по сравнению с олеоил-КоА, сравнению с DGAT1. Указанное предпочтение в отношении субстрата может применяться, чтобы отличить два класса DGAT, в добавление к их аминокислотным последовательностям.

Примеры полипептидов DGAT3 включают белки, кодируемые генами DGAT3 арахиса (Arachis hypogaea, Saha с соавт., 2006), а также их вариантами и/или мутантами. DGAT обладает незначительной или не обладает обнаружимой активностью MGAT, например, менее 300 пмоль/мин/мг белка, предпочтительно менее 200 пмоль/мин/мг белка, более предпочтительно менее 100 пмоль/мин/мг белка.

В варианте реализации изобретения экзогенный полинуклеотид по изобретению, кодирующий DGAT1, содержит одно или больше из следующего:

i) нуклеотиды, кодирующие полипептид, который содержит аминокислоты, последовательность которых приведена в любой из SEQ ID NO: 1 или 80-88, или его биологически активный фрагмент или полипептид, последовательность аминокислот которого по меньшей мере на 30% идентична любой одной или более из SEQ ID NO: 1 или 80-88,

ii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i), и

iii) полинуклеотид, который гибридизуется с одним или обоими из i) или ii) в строгих условиях.

В варианте реализации изобретения экзогенный полинуклеотид по изобретению, кодирующий DGAT2, содержит одно или более из следующего

i) нуклеотиды, кодирующие полипептид, который содержит аминокислоты, последовательность которых приведена в любой из SEQ ID NO: 2-9, или его биологически активный фрагмент или полипептид, последовательность аминокислот которого по меньшей мере на 30% идентична любой одной или больше из SEQ ID NO: 2-9,

ii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i), и

iii) полинуклеотид, который гибридизуется с одним или обоими из i) или ii) в строгих условиях.

В настоящем документе термин ʺфосфолипид:диацилглицерид ацилтрансферазаʺ (PDAT; EC 2.3.1.158) или его синоним ʺфосфолипид:1,2-диацил-sn-глицерид O-ацилтрансферазаʺ обозначает ацилтрансферазу, переносящую ацильную группу с фосфолипида, обычно ФХ, в положение sn-3 ДАГ, с образованием ТАГ. Данная реакция не связана с DGAT, и в ней используются фосфолипиды в качестве доноров ацила. Существует несколько форм PDAT в растительных клетках, включая PDAT1, PDAT2 или PDAT3 (Ghosal с соавт., 2007).

В настоящем документе термин «моноацилглицерил ацилтрансфераза» или «MGAT» обозначает белок, который переносит жирную ацильную группу из ацил-КоА к субстрату МАГ, например, sn-2 МАГ, для образования ДАГ. Таким образом, термин «активность моноацилглицерил ацилтрансферазы» по меньшей мере обозначает перенос ацильной группы от ацил-КоА к МАГ, для образования ДАГ. Термин «MGAT» в настоящем документе включает ферменты, которые действуют на субстраты sn-1/3 МАГ и/или sn-2 МАГ с образованием sn-1,3 ДАГ и/или sn-1,2/2,3-ДАГ, соответственно. В предпочтительном варианте реализации MGAT отдает предпочтение субстрату sn-2 МАГ относительно sn-1 МАГ, или в существенной мере использует в качестве субстрата только sn-2 МАГ. В настоящем документе MGAT не включает ферментов, которые предпочтительно переносят ацильную группу к ЛизоФК относительно МАГ, такие ферменты известны как LPAAT. Таким образом, MGAT предпочтительно использует нефосфорилированные моноацильные субстраты, даже если они также могут обладать низкой каталитической активностью по отношению к ЛизоФК. Предпочтительный MGAT не обладает обнаружимой активностью ацилирования ЛизоФК. Кроме того, MGAT может выполнять функцию DGAT, но, в основном, функционирует как MGAT, т. е., он обладает более выраженной каталитической активностью в роли MGAT, чем в роли DGAT, если активность фермента выражается в единицах нмоль продукта/мин/мг белка (также см. Yen с соавт., 2002). Существует три известных класса MGAT, обозначаемых, как MGAT1, MGAT2 и MGAT3, соответственно. Примеры полипептидов MGAT1, MGAT2 и MGAT3 описаны в WO2013/096993.

В настоящем документе «путь MGAT» обозначает анаболический путь образования ТАГ, отличный от пути Кеннеди, в котором ДАГ образуется ацилированием sn-1 МАГ или, предпочтительно, sn-2 МАГ, катализированным MGAT. В дальнейшем ДАГ может быть использован для образования ТАГ или других липидов. В WO2012/000026 продемонстрировано, во-первых, что листовая ткань растения может синтезировать МАГ из G-3-P таким образом, что МАГ доступен экзогенной MGAT, экспрессирующейся в листовой ткани, во-вторых, что MGAT из различных источников может функционировать в тканях растения, что требует успешного взаимодействия с другими факторами растения, принимающими участие в синтезе липидов, и в-третьих, что ДАГ, образованный под действием экзогенной MGAT, доступен растительной DGAT или экзогенной DGAT для выработки ТАГ. Активность MGAT и DGAT может быть проанализирована путем введения конструкций, кодирующих ферменты (или ферменты-кандидаты) в Saccharomyces cerevisiae, штамм H1246 и демонстрирует аккумуляцию ТАГ.

Некоторые из мотивов, важность которых для каталитической активности DGAT2 продемонстрирована в некоторых DGAT2, также являются консервативными в MGAT ацилтрансферазах. Особый интерес представляет предполагаемый домен связывания с нейтральными липидами с консенсусной последовательностью FLXLXXXN (SEQ ID NO: 14), где каждый X независимо представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, и N представляет собой любую неполярную аминокислоту, расположенную в пределах N-концевого трансмембранного участка, после которого следует предполагаемый домен глицерил/фосфолипид ацилтрансферазы. Мотив FLXLXXXN (SEQ ID NO: 14) найден в DGAT2 мыши (аминокислоты 81-88) и MGAT1/2, но не в DGAT2 дрожжей или растения. Он является важным для активности DGAT2 мыши. Другие мотивы последовательности DGAT2 и/или MGAT1/2 включают:

1. В высокой степени консервативный трипептид YFP (SEQ ID NO: 10) в большинстве полипептидов DGAT2, а также в MGAT1 и MGAT2, например, присутствующий как аминокислоты 139-141 в DGAT2 мыши. Мутация данного мотива в DGAT2 дрожжей посредством неконсервативных замен делает фермент нефункциональным.

2. Тетрапептид HPHG (SEQ ID NO: 11), в высокой степени консервативный в MGAT, а также в последовательностях DGAT2 животных и грибов, например, присутствующий как аминокислоты 161-164 в DGAT2 мыши, и важный для каталитической активности по меньшей мере в DGAT2 дрожжей и мыши. Растительные ацилтрансферазы DGAT2 содержат вместо него консервативную последовательность EPHS (SEQ ID NO: 12), поэтому консервативные модификации в первом и четвертом положениях аминокислот могут быть переносимыми.

3. Более длинный консервативный мотив, который является частью предполагаемого домена фосфолипида глицерина. Примером данного мотива является

RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q) (SEQ ID NO:13), который присутствует как аминокислоты 304-327 в DGAT2 мыши. Последовательность аминокислот в данном мотиве менее консервативна, чем в остальных, как можно было бы ожидать на основании его длины, и гомологи могут быть распознаны путем поиска мотива. Расположение может варьировать для более консервативных аминокислот, т. е., могут присутствовать дополнительные X аминокислоты в пределах мотива или меньшее количество X аминокислот, по сравнению с приведенной выше последовательностью.

Одним важным компонентом в синтезе глицеролипида из жирных кислот, этерифицированных АЦБ или КоА, является фермент, sn-глицерил-3-фосфат ацилтрансфераза (GPAT), которая представляет собой другой полипептид, принимающий участие в биосинтезе неполярных липидов. Указанный фермент принимает участие в различных метаболических путях и осуществлении физиологических функций. Он катализирует следующую реакцию: G3P+жирный ацил-АПБ или -КоА →LPA+свободный-АПБ или -КоА. Катализируемая GPAT реакция происходит в трех отдельных субклеточных структурах растения: пластиде, эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и митохондрии. Указанные реакции катализируются тремя различными видами ферментов GPAT, растворимой формой, которая локализована в строме пластиды, которая использует ацил-АПБ в качестве своего природного ацильного субстрата (ПGPAT на Фиг. 1), и двумя мембраносвязанными формами, локализованными в ЭР и митохондрии, которые используют ацил-КоА и ацил-АПБ в качестве природных доноров ацила, соответственно (Chen с соавт., 2011).

В настоящем документе термин «глицерил-3-фосфат ацилтрансфераза» («GPAT»; EC 2.3.1.15) и его синоним «глицерил-3-фосфат O-ацилтрансфераза» обозначают белок, который ацилирует глицерил-3-фосфат (G-3-P), с образованием ЛизоФК и/или МАГ, причем последний продукт образуется, если GPAT дополнительно обладает активностью фосфатазы по отношению к ЛизоФК. Ацильная группа, которая переносится, происходит от ацил-КоА, если GPAT относится к ЭР-типу GPAT («ацил-КоА:sn-глицерил-3-фосфат 1-O-ацилтрансфераза», дополнительно обозначается как «микросомальная GPAT»), или от ацил-АЦФ, если GPAT является GPAT пластидного типа (GPATПТ). Таким образом, термин «активность глицерил-3-фосфат ацилтрансферазы» обозначает ацилирование G-3-P с образованием ЛизоФК и/или МАГ. Термин «GPAT» включает ферменты, которые ацилируют G-3-P с образованием sn-1 LPA и/или sn-2 LPA, предпочтительно sn-2 LPA. Предпочтительно, GPAT, которая может повышенно экспрессироваться при модификации Pull, представляет собой мембраносвязанную GPAT, которая функционирует в ЭР клетки, более предпочтительно, GPAT9, а пластидная GPAT, которая подавляется при модификации Prokaryotic pathway, представляет собой растворимую GPAT («пластидную GPAT»).В предпочтительном варианте реализации GPAT обладает активностью фосфатазы. В наиболее предпочтительном варианте реализации GPAT представляет собой sn-2 GPAT, обладающий активностью фосфатазы, которая продуцирует sn-2 МАГ.

В настоящем документе термин « sn-1 глицерил-3-фосфат ацилтрансфераза» (sn-1 GPAT) обозначает белок, который ацилирует sn-глицерил-3-фосфат (G-3-P), с предпочтительным образованием 1-ацил -sn-глицерил-3-фосфата (sn-1 LPA). Таким образом, термин «активность sn-1 глицерил-3-фосфат ацилтрансферазы» обозначает ацилирование sn-глицерил-3-фосфата с образованием 1-ацил-sn-глицерил-3-фосфата (sn-1 LPA).

В настоящем документе термин « sn-2 глицерил-3-фосфат ацилтрансфераза» (sn-2 GPAT) обозначает белок, который ацилирует sn-глицерил-3-фосфат (G-3-P) с предпочтительным образованием 2-ацил-sn-глицерил-3-фосфата (sn-2 LPA). Таким образом, термин «активность sn-2 глицерил-3-фосфат ацилтрансферазы» обозначает ацилирование sn-глицерил-3-фосфата с образованием 2-ацил-sn-глицерил-3-фосфата (sn-2 LPA).

Семейство GPAT большое, и все известные члены содержат два консервативных домена, ацилтрансферазный домен plsC (PF01553; SEQ ID NO: 15) и домен суперсемейства галогенкислоты дегалогеназа-подобной гидролазы (PF12710; SEQ ID NO: 16), а также их варианты. В дополнение к этому, по меньшей мере в Arabidopsis thaliana, все GPAT в подклассах GPAT4-GPAT8 содержат N-концевой участок, гомологичный домену фосфосерин фосфатазы (PF00702; SEQ ID NO: 17), и GPAT, которые продуцируют МАГ в качестве продукта, могут быть идентифицированы по наличию такого гомологичного участка. Некоторые GPAT, эндогенно экспрессируемые в ткани листа, содержат консервативную последовательность аминокислот GDLVICPEGTTCREP (SEQ ID NO:18). GPAT4 и GPAT6 содержат консервативные остатки, которые известны как критические для активности фосфатазы, конкретно консервативные аминокислоты в мотиве I (DXDX[T/V][L/V]; SEQ ID NO: 19) и мотиве III (K-[G/S][D/S]XXX[D/N]; SEQ ID NO: 20), расположены на N-конце (Yang с соавт., 2010).

Гомологи Arabidopsis GPAT4 (номер доступа NP_171667.1) и GPAT6 (NP_181346.1) включают AAF02784.1 (Arabidopsis thaliana), AAL32544.1 (Arabidopsis thaliana), AAP03413.1 (Oryza sativa), ABK25381.1 (Picea sitchensis), ACN34546.1 (Zea Mays), BAF00762.1 (Arabidopsis thaliana), BAH00933.1 (Oryza sativa), EAY84189.1 (Oryza sativa), EAY98245.1 (Oryza sativa), EAZ21484.1 (Oryza sativa), EEC71826.1 (Oryza sativa), EEC76137.1 (Oryza sativa), EEE59882.1 (Oryza sativa), EFJ08963.1 (Selaginella moellendorffii), EFJ11200.1 (Selaginella moellendorffii), NP_001044839.1 (Oryza sativa), NP_001045668.1 (Oryza sativa), NP_001147442.1 (Zea mays), NP_001149307.1 (Zea mays), NP_001168351.1 (Zea mays), AFH02724.1 (Brassica napus) NP_191950.2 (Arabidopsis thaliana), XP_001765001.1 (Physcomitrella patens), XP_001769671.1 (Physcomitrella patens), (Vitis vinifera), XP_002275348.1 (Vitis vinifera), XP_002276032.1 (Vitis vinifera), XP_002279091.1 (Vitis vinifera), XP_002309124.1 (Populus trichocarpa), XP_002309276.1 (Populus trichocarpa), XP_002322752.1 (Populus trichocarpa), XP_002323563.1 (Populus trichocarpa), XP_002439887.1 (Sorghum bicolor), XP_002458786.1 (Sorghum bicolor), XP_002463916.1 (Sorghum bicolor), XP_002464630.1 (Sorghum bicolor), XP_002511873.1 (Ricinus communis), XP_002517438.1 (Ricinus communis), XP_002520171.1 (Ricinus communis), ACT32032.1 (Vernicia fordii), NP_001051189.1 (Oryza sativa), AFH02725.1 (Brassica napus), XP_002320138.1 (Populus trichocarpa), XP_002451377.1 (Sorghum bicolor), XP_002531350.1 (Ricinus communis), and XP_002889361.1 (Arabidopsis lyrata).

Были выделены растворимые пластидные GPAT (ПGPAT, также известные как ATS1 в Arabidopsis thaliana), причем кодирующие их гены клонированы из нескольких видов растений, таких как горох (Pisum sativum, номер доступа: P30706.1), шпинат (Spinacia oleraceа, номер доступа: Q43869.1), тыква (Cucurbita moschate, номер доступа: P10349.1), огурец (Cucumis sativus, номер доступа: Q39639.1) и Arabidopsis thaliana (номер доступа: Q43307.2). Растворимая пластидная GPAT представляет собой первую фиксированную стадию того, что известно как прокариотный путь синтеза глицеролипидов и действует только в пластиде (Фиг. 1). Так называемый прокариотный путь расположен исключительно в пластидах растений и обеспечивает сборку ДАГ для синтеза галактолипидов (MGDG и ДГМГ), которые содержат C16:3 жирные кислоты, этерифицированные в положении sn-2 глицеринового скелета.

Консервативные мотивы и/или остатки могут использоваться в качестве основанного на последовательности диагностического признака для идентификации ферментов GPAT. Альтернативно, может применяться более строгий анализ, основанный на функции. Такой анализ включает, например, подкормку меченым глицерил-3-фосфатом клеток или микросом и количественное определение уровней меченых продуктов тонкослойной хроматографией или подобным методом. Активность GPAT приводит к образованию меченой LPA, тогда как активность GPAT/фосфатазы приводит к образованию меченого МАГ.

В настоящем документе термин "ацилтрансфераза лизофосфатидиновой кислоты" (LPAAT; EC 2.3.1.51) и его синонимы ʺ1-ацил-глицерил-3-фосфат ацилтрансферазаʺ, ʺацил-КоА:1-ацил-sn-глицерол-3-фосфат 2-O-ацилтрансферазаʺ и ʺ1-ацилглицерил-3-фосфат O-ацилтрансферазаʺ обозначают белок, который ацилирует лизофосфатидиновую кислоту (LPA) с образованием фосфатидиновой кислоты (ФК, PA). Ацильную группу для переноса получают из ацил-КоА, если LPAAT представляет собой LPAAT ЭР-типа, или из ацил-АПБ, если LPAAT представляет собой LPAAT пластидного типа (ПLPAAT). Таким образом, термин "активность ацилтрансферазы лизофосфатидиновой кислоты" обозначает ацилирование LPA с образованием ФК.

Полипептиды покрытия масляного включения

Семена растения и пыльца аккумулируют ТАГ в субклеточных структурах, называемых масляными включениями, диаметр которых в общем находится в диапазоне 0,5-2,5 мкм. В настоящем документе ʺлипидные капелькиʺ, также называемые ʺмасляными включениямиʺ, представляет собой богатые липидами клеточные органеллы для хранения или обмена нейтральных липидов, в основном содержащие ТАГ. Размер липидных капелек может значительно варьировать, от около 20 нм до 100 мкм. Указанные органеллы содержат ядро ТАГ, окруженное фосфолипидным монослоем, содержащим несколько инкорпорированных белков, принимающих участие в метаболизме и хранении липидов, а также в переносе липидов к другим мембранам, в том числе олеозинов, если масляные включения происходят из растительных семян или тканей цветка (Jolivet с соавт., 2004). В общем, они содержат 0,5-3,5% белка, в то время как остальная часть представлена липидом. Они являются наименее плотными органеллами в большинстве клеток и могут, таким образом, с легкостью быть выделены путем центрифугирования с флотацией. Олеозины представляют самый распространенный (по меньшей мере 80%) белок в мембране масляных включений из семян.

В настоящем документе термин «олеозин» обозначает амфифильный белок, присутствующий в мембране масляных включений в запасных тканях семян (см., например, Huang, 1996; Lin с соавт., 2005; Capuano с соавт., 2007; Lui с соавт., 2009; Shimada и Hara-Nishimura, 2010), и искусственно созданные варианты (см., например WO2011/053169 и WO2011/127118).

Олеозин обладает низкой М.м. (15-26000), что соответствует приблизительно 140-230 аминокислотных остатков, и это позволяет им плотно упаковываться на поверхности масляных включений. В семенах каждого вида обычно представлены два или более олеозинов с различной М.м.. Каждая молекула олеозина содержит относительно гидрофильный, вариабельный N-концевой домен (например, длиной около 48 остатков аминокислоты), центральный полностью гидрофобный домен (например, длиной приблизительно 70-80 остатков аминокислоты), который особенно богат алифатическими аминокислотами, такими как аланин, глицин, лейцин, изолейцин и валин, и амфифильный α-спиральный домен размером около 30-40 остатков аминокислот на C-конце или вблизи него. Обычно центральный гидрофобный домен содержит в центре мотив пролинового узла размером около 12 остатков. В общем, центральный участок гидрофобных остатков вставлен в липидное ядро, и амфифильный N-концевой участок и/или амфифильный C-концевой участок размещен на поверхности масляных включений, причем положительно заряженные остатки инкорпорированы в фосфолипидный монослой, и отрицательно заряженные участки контактируют с внешней средой.

В настоящем документе термин «олеозин» включает полиолеозины, содержащие несколько полипептидов олеозина, соединенных вместе способом «голова к хвосту» в качестве единого полипептида (WO2007/045019), например, 2x, 4x или 6x пептидов олеозина, и калеозины, которые связывают кальций и составляют минорный белковый компонент белков, покрывающих масляные включения в семенах (Froissard с соавт., 2009), а также стеролеозины, которые связываются со стероидами (WO2011/053169). Однако, в общем, значительная часть (по меньшей мере 80%) олеозинов в масляных включениях не будет относиться к калеозинам и/или стеролеозинам. Термин ʺолеозинʺ дополнительно включает полипептиды олеозина, модифицированные искусственным путем, т.е. олеозины, в которых один или более остатков аминокислот природного олеозина искусственно заменены остатками цистеина, как описано в WO2011/053169. Обычно, 4-8 остатков заменены искусственным путем, предпочтительно 6 остатков, но может быть заменено от 2 до 14 остатков. Предпочтительно, амфифильные N-концевой и C-концевой домены содержат замены цистеина. Модификация повышает способность олеозинов к образованию поперечных связей и повышает термостабильность и/или устойчивость белков к разложению протеазами.

Известно значительное количество последовательностей белка олеозина и нуклеотидных последовательностей, кодирующих его, из множества различных видов растений. Примеры включают, без ограничений, олеозины Arabidposis, рапса, кукурузы, риса, арахиса, клещевины, сои, льна, винограда, капусты, хлопчатника, подсолнечника, сорго и ячменя. Примеры олеозинов (с номерами доступа) включают олеозин Brassica napus (CAA57545.1; SEQ ID NO:95), Brassica napus олеозин S1-1 (ACG69504.1; SEQ ID NO:96), Brassica napus олеозин S2-1 (ACG69503.1; SEQ ID NO:97), Brassica napus олеозин S3-1 (ACG69513.1; SEQ ID NO:98), Brassica napus олеозин S4-1 (ACG69507.1; SEQ ID NO:99), Brassica napus олеозин S5-1 (ACG69511.1; SEQ ID NO:100), Arachis hypogaea олеозин 1 (AAZ20276.1; SEQ ID NO:101), Arachis hypogaea олеозин 2 (AAU21500.1; SEQ ID NO:102), Arachis hypogaea олеозин 3 (AAU21501.1; SEQ ID NO:103), Arachis hypogaea олеозин 5 (ABC96763.1; SEQ ID NO:104), Ricinus communis олеозин 1 (EEF40948.1; SEQ ID NO:105), Ricinus communis олеозин 2 (EEF51616.1; SEQ ID NO:106), олеозин Glycine max изоформа a (P29530.2; SEQ ID NO:107), олеозин Glycine max изоформа b (P29531.1; SEQ ID NO:108), олеозин Linum usitatissimum низкомолекулярная изоформа (ABB01622.1; SEQ ID NO:109), олеозин Linum usitatissimum высокомолекулярная изоформа (ABB01624.1; SEQ ID NO:110), олеозин Helianthus annuus (CAA44224.1; SEQ ID NO:111), олеозин Zea mays (NP_001105338.1; SEQ ID NO:112), Brassica napus стеролеозин (ABM30178.1; SEQ ID NO:113), Brassica napus стеролеозин SLO1-1 (ACG69522.1; SEQ ID NO:114), Brassica napus стеролеозин SLO2-1 (ACG69525.1; SEQ ID NO:115), стеролеозин Sesamum indicum (AAL13315.1; SEQ ID NO:116), стеролеозин Zea mays (NP_001152614.1; SEQ ID NO:117), калеозин CLO-1 Brassica napus (ACG69529.1; SEQ ID NO:118), Brassica napus калеозин CLO-3 (ACG69527.1; SEQ ID NO:119), калеозин Sesamum indicum (AAF13743.1; SEQ ID NO:120), калеозин Zea mays (NP_001151906.1; SEQ ID NO:121), калеозин Glycine max (AAB71227). Другими функционально эквивалентными полипептидами липидной инкапсуляции являются пластоглобулины и полипептиды белка жировых капель миокарда (БЖКМ) (WO2011/127118).

В варианте реализации изобретения экзогенный полинуклеотид по изобретению, кодирующий олеозин, содержит, если не указано иное, одно или более из следующего:

i) нуклеотиды, кодирующие полипептид, который содержит аминокислоты, последовательность которых приведена в любой из SEQ ID NO: 95-112, или его биологически активный фрагмент или полипептид, последовательность аминокислот которого по меньшей мере на 30% идентична любой одной или более из SEQ ID NO: 95-112,

ii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i), и

iii) полинуклеотид, который гибридизуется с одним или обоими из i) или ii) в строгих условиях.

В варианте реализации изобретения экзогенный полинуклеотид по изобретению, кодирующий стеролеозин, содержит, если не указано иное, одно или более из следующего:

i) нуклеотиды, кодирующие полипептид, который содержит аминокислоты, последовательность которых приведена в любой из SEQ ID NO: 113-117, или его биологически активный фрагмент или полипептид, последовательность аминокислот которого по меньшей мере на 30% идентична одной или более из SEQ ID NO: 113-117,

ii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i), и

iii) полинуклеотид, который гибридизуется с одним или обоими из i) или ii) в строгих условиях.

В настоящем документе ʺбелок, связанный с липидной капелькойʺ или ʺБСЛКʺ обозначает полипептид, который в растениях связан с липидными капельками в тканях или органах, кроме семян, пыльников и пыльцы, например, тканях фруктов, включая перикарпий и мезокарпий. БСЛК могут быть связаны с масляными включениями в семенах, пыльниках или пыльце, а также в тканях или органах, кроме семян, пыльников и пыльцы. Они отличаются от олеозинов, которые являются полипептидами, связанными с поверхностью липидных капелек в тканях семени, пыльниках и пыльце. БСЛК в настоящем документе включают полипептиды БСЛК, образованные природным путем в тканях растения, а также варианты аминокислотной последовательности, полученные искусственным путем. Функция таких вариантов может быть проанализирована, как проиллюстрировано в Примере 15.

Horn с соавт. (2013) идентифицировали два гена БСЛК, которые экспрессируются в перикарпии авокадо. Аминокислотная последовательность кодируемых полипептидов авокадо БСЛК1 и БСЛК2 была на 62% идентичной, а также обладала гомологией к полипептиду, кодируемому At3g05500 Arabidopsis и SRPP-подобному белку резинового дерева. Gidda с соавт. (2013) идентифицировали три гена БСЛК, которые экспрессировались в мезокарпии, но не в ядрах масличной пальмы (Elaeis guineensis) и сделали вывод о том, что гены БСЛК были специфичными для растения и консервативными для всех видов растений. Полипептиды БСЛК могут содержать дополнительные домены (Gidda с соавт., (2013). Гены, кодирующие БСЛК, в общем, активизируются в тканях, не относящихся к семенам, с обильным содержанием липидов, и могут быть идентифицированы таким образом, однако считается, что они экспрессируются во всех клетках, не относящихся к семенам, которые вырабатывают масло, в том числе для временного хранения. Horn с соавт. (2013) иллюстрируют филогенетическое дерево SRPP-подобных белков в растениях. Характерные полипептиды БСЛК описаны в Примере 15 настоящего документа. Гомологи БСЛК в других видах растений могут быть с легкостью идентифицированы специалистами в данной области.

В варианте реализации изобретения экзогенный полинуклеотид по изобретению, кодирующий БСЛК, содержит, если не указано иное, одно или более из следующего:

i) нуклеотиды, кодирующие полипептид, который содержит аминокислоты, последовательность которых приведена в любой из SEQ ID NO: 237, 239 или 241, или его биологически активный фрагмент или полипептид, последовательность аминокислот которого по меньшей мере на 30% идентична любой одной или более из SEQ ID NO: 237, 239 или 241,

ii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i), и

iii) полинуклеотид, который гибридизуется с одним или обоими из i) или ii) в строгих условиях.

В настоящем документе термин «Полипептид, принимающий участие в биосинтезе крахмала» обозначает любой полипептид, регуляция которого в клетке вниз до уровней ниже нормальных (дикий тип), приводит к снижению уровня синтеза крахмала и снижению уровней крахмала. Примером такого полипептида является АГФаза.

В настоящем документе термин «фосфорилаза АДФ-глюкозы» или «АГФаза» обозначает фермент, который регулирует биосинтез крахмала, катализируя превращение глюкозы-1-фосфата и АТФ в АДФ-глюкозу, которая служит строительным блоком для полимеров крахмала. Активная форма фермента АГФазы состоит из 2 больших и 2 маленьких субъединиц.

Фермент АДФаза в растениях существует, главным образом, в форме тетрамера, который состоит из 2 больших и 2 маленьких субъединиц. Хотя каталитическая и регуляторная роли этих субъединиц отличаются в зависимости от вида (Kuhn с соавт., 2009), в растениях маленькая субъединица проявляет, главным образом, каталитическую активность. Молекулярная масса маленькой субъединицы составляет приблизительно 50-55 кДа. Молекулярная масса большой субъединицы составляет приблизительно 55-60 кДа. Фермент растения интенсивно активизируется 3-фосфоглицератом (ФГА), продуктом фиксации диоксида углерода; в отсутствие ФГА фермент проявляет только около 3% активности. Растительная АГФаза также интенсивно ингибируется неорганическим фосфатом (Фн). Наоборот, бактериальная и водорослевая АГФазы существуют в виде гомотетрамеров размером 50 кДа. Водорослевый фермент, подобно его растительному двойнику, активируется ФГА и ингибируется Фн, тогда как бактериальный фермент активируется фруктозо-1,6-бифосфатом (ФБФ) и ингибируется АМФ и Фн.

ТАГ липазы и бета-окисление

В настоящем документе термин «полипептид, принимающий участие в разложении липида и/или который снижает содержание липида» обозначает любой полипептид, катаболизирующий липид, причем регуляция полипептида в клетке вниз до уровней ниже нормальных (дикий тип) приводит к повышению уровня масла, например, жирных кислот и/или ТАГ, в клетке, предпочтительно клетке вегетативной части, клубне, свекле или семени растения. Примеры таких полипептидов включают, без ограничений, липазы или липазу, такую как полипептид CGi58 (подобный сравнительному идентификатору гена-58), САХАРОЗАВИСИМУЮ триацилглицерил липазу 1 (SDP1) (см., например, Kelly с соавт., 2011) и липазу, описанную в WO 2009/027335.

В настоящем документе термин «ТАГ липаза» (EC.3.1.1.3) обозначает белок, который гидролизует ТАГ до одной или более жирных кислот и любого из ДАГ, МАГ или глицерина. Таким образом, термин «активность ТАГ липазы» обозначает гидролиз ТАГ до глицерина и жирных кислот.

В настоящем документе термин «CGi58» обозначает растворимую ацил-КоА-зависимую ацилтрансферазу лизофосфатидиновой кислоты, кодируемую геном At4g24160 в Arabidopsis thaliana и его гомологами в других растениях, и «Ict1p» в дрожжах и его гомологами. Растительный ген, например, локус гена Arabidopsis At4g24160, экспрессируется как две альтернативные копии: более длинная полноразмерная изоформа (At4g24160.1) и более короткая изоформа (At4g24160.2), в которой отсутствует часть 3' конца (см. James с соавт., 2010; Ghosh с соавт., 2009; US 201000221400). Обе иРНК кодируют белок, гомологичный человеческому белку CGI-58 и другим ортологичным членам данного семейства α/гидролазы (АБГД). В варианте реализации белок CGI58 (At4g24160) содержит три мотива, которые являются консервативными в видах растений: мотив липазы GXSXG (SEQ ID NO: 127), мотив ацилтрансферазы HX(4)D (SEQ ID NO: 128), и VX(3)HGF, вероятный мотив связывания с липидом (SEQ ID NO: 129). Белок CGI-58 человека обладает активностью ацилтрансферазы лизофосфатидиновой кислоты (LPAAT), но не активностью липазы. И наоборот, белки растения и дрожжей содержат канонический мотив последовательности липазы GXSXG (SEQ ID NO: 127), отсутствующий в белках позвоночных (человек, мыши и рыбки данио) и обладающий липазной и фосфолипазной активностью (Ghosh с соавт., 2009). Хотя белки CGI58 растения и дрожжей, похоже, обладают обнаружимыми уровнями активности липазы ТАГ и фосфолипазы А, в дополнение к активности LPAAT, белок человека не проявляет такой активности.

Разрушение гомологичного гена CGI-58 в Arabidopsis thaliana приводит к аккумуляции капелек нейтрального липида в зрелых листьях. Масс-спектроскопический анализ капелек липида, выделенных от мутантов с утратой функции cgi-58,показал, что они содержат триацилглицериды со специфичными жирными кислотами, обычными для листьев. Листья зрелых растений cgi-58 демонстрируют заметное повышение абсолютных уровней триацилглицеридов, более чем в 10 раза превышающих уровни в растениях дикого типа. Уровни липида в запасающих масло семенах cgi-58 оставались неизменными, и, в отличие от мутаций с β-окислением, семена cgi-58 прорастали и росли нормально, не требуя спасения с помощью сахарозы (James с соавт., 2010).

Примеры нуклеотидов, кодирующих полипептиды CGi58, включают нуклеотиды из Arabidopsis thaliana (NM_118548.1 кодирующий NP_194147.2; SEQ ID NO:130), Brachypodium distachyon (XP_003578450.1; SEQ ID NO:131), Glycine max (XM_003523590.1 кодирующий XP_003523638.1; SEQ ID NO:132), Zea mays (NM_001155541.1 кодирующий NP_001149013.1; SEQ ID NO:133), Sorghum bicolor (XM_002460493.1 кодирующий XP_002460538.1; SEQ ID NO:134), Ricinus communis (XM_002510439.1 кодирующий XP_002510485.1; SEQ ID NO:135), Medicago truncatula (XM_003603685.1 кодирующий XP_003603733.1; SEQ ID NO:136), и Oryza sativa (кодирующий EAZ09782.1).

В варианте реализации изобретения генетическая модификация по изобретению подавляет эндогенную выработку CGi58, причем CGi58 кодируется одним или более из следующего:

i) нуклеотиды, содержащие последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 130-136,

ii) нуклеотиды, содержащие последовательность, которая по меньшей мере на 30% идентична любой одной или более из SEQ ID NO: 130-136, и

iii) полинуклеотид, который гибридизуется с одним или обоими из i) или ii) в строгих условиях.

Другие липазы, обладающие активностью липазы в отношении ТАГ, включают САХАРО-ЗАВИСИМУЮ триацилглицерид липазу 1 (SDP1, см., например, Eastmond с соавт., 2006; Kelly с соавт., 2011) и SDP1-подобные полипептиды, найденные в растительных видах, а также дрожжах (полипептид TGL4) и животных клетках, которые принимают участие в расщеплении запасных ТАГ. По-видимому, SDP1 и SDP1-подобные полипептиды ответственны за начало расщепления ТАГ в семенах после прорастания (Eastmond с соавт., 2006). Растения с мутантным SDP1, в отсутствие экзогенных WRI1 и DGAT1, демонстрируют повышенные уровни ПНЖК в ТАГ. В настоящем документе ʺполипептиды SDP1ʺ включают SDP1 полипептиды, SDP1-подобные полипептиды и их гомологи в растительных видах. Размер SDP1 и SDP1-подобных полипептидов в растениях составляет 800-910 остатков аминокислот, причем они содержат пататин-подобный домен ацилгидролазы, который может связываться с поверхностями масляных включений и предпочтительно гидролизовать ТАГ относительно ДАГ или МАГ. Считается, что SDP1 проявляет предпочтение к гидролизу ацильной группы в положении sn-2 ТАГ. Arabidopsis содержит по меньшей мере три гена, кодирующих SDP1 липазы, а именно SDP1 (номер доступа NP_196024, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 163 и гомологи в других видах), SDP1 (номер доступа NM_202720 и гомологи в других видах, Kelly с соавт., 2011) и ATGLL (At1g33270) (Eastmond с соавт., 2006). Особый интерес с точки зрения снижения активности гена представляют гены SDP1, которые экспрессируются в вегетативных тканях растений, например, в листьях, стеблях и корнях. Таким образом, уровни неполярных липидов в вегетативных частях растения могут быть повышены путем снижения активности полипептидов SDP1 в частях растения, например, с помощью мутации эндогенного гена, кодирующего полипептид SDP1, или введением экзогенного гена, который кодирует сайленсинговую РНК молекулу, которая снижает экспрессию эндогенного гена SDP1. Такое снижение приносит конкретную пользу на урожаях клубней, таких как сахарная свекла и картофель, и в ʺвысокосахарозныхʺ растениях, таких как сахарный тростник и сахарная свекла.

Гены, кодирующие гомологи SDP1 (в том числе SDP1-подобные гомологи) в растительных видах выбора, могут быть с легкостью идентифицированы по гомологии к известным последовательностям гена SDP1. Известные нуклеотидные или аминокислотные последовательности SDP1 включают номера доступа: в Brassica napus, GN078290 (SEQ ID NO:164), GN078281, GN078283; Capsella rubella, XP_006287072; Theobroma cacao, XP_007028574.1; Populus trichocarpa, XP_002308909 (SEQ ID NO:166); Prunus persica, XP_007203312; Prunus mume, XP_008240737; Malus domestica, XP_008373034; Ricinus communis, XP_002530081; Medicago truncatula, XP_003591425 (SEQ ID NO:167); Solanum lycopersicum, XP_004249208; Phaseolus vulgaris, XP_007162133; Glycine max, XP_003554141 (SEQ ID NO:168); Solanum tuberosum, XP_006351284; Glycine max, XP_003521151; Cicer arietinum, XP_004493431; Cucumis sativus, XP_004142709; Cucumis melo, XP_008457586; Jatropha curcas, KDP26217; Vitis vinifera, CBI30074; Oryza sativa, Japonica Group BAB61223; Oryza sativa, Indica Group EAY75912; Oryza sativa, Japonica Group NP_001044325; Sorghum bicolor, XP_002458531 (SEQ ID NO:169); Brachypodium distachyon, XP_003567139 (SEQ ID NO:165); Zea mays, AFW85009; Hordeum vulgare, BAK03290 (SEQ ID NO:172); Aegilops tauschii, EMT32802; Sorghum bicolor, XP_002463665; Zea mays, NP_001168677 (SEQ ID NO:170); Hordeum vulgare, BAK01155; Aegilops tauschii, EMT02623; Triticum urartu, EMS67257; Physcomitrella patens, XP_001758169 (SEQ ID NO:171). Предпочтительные последовательности SDP1 для применения в генетических конструкциях с целью подавления экспрессии эндогенных генов, происходят из кДНК, соответствующих генам, которые экспрессируются в наибольшей степени в клетках, вегетативных частях растения или семенах, в зависимости от того, что подлежит модификации. Нуклеотидные последовательности, которые являются в высокой степени консервативными между кДНК, соответствующими всем генам SDP1 в виде растений, являются предпочтительными, если желательно сократить активность всех членов генного семейства в данном виде.

В варианте реализации изобретения генетическая модификация по изобретению подавляет эндогенную выработку SDP1, причем SDP1 кодируется одним или более из следующего:

i) нуклеотиды, последовательность которых приведена в любой из SEQ ID NO: 163-174,

ii) нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична любой одной или более последовательностям, приведенным как SEQ ID NO: 163-174, и

iii) последовательность нуклеотидов, которая гибридизуется с одним или обоими из i) или ii) в строгих условиях.

Как проиллюстрировано в Примерах, снижение экспрессии и/или активности ТАГ липазы SDP1 в листьях растения значительно повышало содержание ТАГ, как с точки зрения количества ТАГ, которые аккумулируются, так и более раннего наступления периода аккумуляции в ходе развития растения, в контексте co-экспрессии фактора транскрипции WRI1 и ацилтрансферазы ацилов жирных кислот. В частности, повышение наблюдалось в растениях до цветения, и составляло до около 70% масс. (% сухой массы) на момент начала старения. Повышение было относительным по сравнению с уровнями ТАГ, наблюдаемыми в соответствующих листьях растений, трансформированных экзогенными полинуклеотидами, кодирующими WRI1 и ацилтрансферазу ацилов жирных кислот, но без модификации, которая снижает экспрессию и/или активность SDP1.

Кроме того, снижение экспрессии других генов катаболизма ТАГ в частях растения может повысить содержание ТАГ, например, генов ACX, кодирующих ацил-КоА оксидазы, таких как гены Acx1 (At4g16760 и гомологи в других видах растений) или Acx2 (At5g65110 и гомологи в других видах растений). Другим полипептидом, принимающим участие в катаболизме липидов, является PXA1, который представляет собой пероксисомальный переносчик АТФ-связывающей кассеты, необходимый для импорта жирных кислот для β-окисления (Zolman с соавт., 2001).

Экспорт жирных кислот из пластид

В настоящем документе термин "полипептид, который повышает экспорт жирных кислот из пластид клетки" обозначает любой полипептид, который способствует переносу жирных кислот из внутреннего пространства пластид (в клетках, которые содержат пластиды, таких как клетка вегетативной части, клубня, свеклы или семени растения) за пределы пластиды, т.е. в любую другую часть клетки, такую как эндоплазматический ретикулум (ЭР). Примеры таких полипептидов включают, но не ограничиваясь ими, тиоэстеразу C16 или C18 жирных кислот, такую как полипептид FATA или полипептид FATB, тиоэстеразу C8-C14 жирных кислот (которая дополнительно является полипептидом FATB), переносчик жирных кислот, такой как полипептид ABCA9 или длинноцепочечная ацил-КоА синтетаза (ДЦАС).

В настоящем документе термина ʺтиоэстераза жирных кислотʺ или ʺТЖК (FAT)ʺ обозначает фермент, катализирующий гидролиз тиоэфирной связи между ацильным фрагментом и ацилпереносящим белком (АПБ) в ацил-АПБ и высвобождение свободной жирной кислоты. Такие ферменты обычно функционируют в пластидах организма, синтезирующего жирные кислоты de novo. В настоящем документе термин ʺтиоэстераза C16 или C18 жирной кислотыʺ обозначает фермент, катализирующий гидролиз тиоэфирной связи между C16 и/или C18 ацильным фрагментом и АПБ в ацил-АПБ и высвобождение свободной C16 или C18 жирной кислоты в пластиде. Далее свободная жирная кислота переэтерифицируется до КоА в пластидном конверте, и в таком виде она транспортируется из пластиды. Специфичность субстрата фермента тиоэстеразы жирных кислот (ТЖК) в пластиде принимает участие в определении спектра длины цепи и степени насыщенности жирных кислот, экспортируемых из пластиды. Ферменты ТЖК могут быть классифицированы в два класса, на основании их специфичности в отношении субстрата и нуклеотидных последовательностей, FATA и FATB (EC 3.1.2.14) (Jones с соавт., 1995). Полипептиды FATA отдают предпочтение олеоил-АПБ в качестве субстрата, в то время как полипептиды FATB демонстрируют более высокую активность в отношении насыщенных ацил-АПБ с различной длиной цепи, например, воздействуя на пальмитоил-АПБ с образованием свободной пальмитиновой кислоты. Примеры полипептидов FATA, пригодных в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваясь ими, полипептиды из Arabidopsis thaliana (NP_189147), Arachis hypogaea (GU324446), Helianthus annuus (AAL79361), Carthamus tinctorius (AAA33020), Morus notabilis (XP_010104178,1), Brassica napus (CDX77369,1), Ricinus communis (XP_002532744,1) и Camelina sativa (AFQ60946,1). Примеры полипептидов FATB, пригодных в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваясь ими, полипептиды из Zea mays (AIL28766), Brassica napus (ABH11710), Helianthus annuus (AAX19387), Arabidopsis thaliana (AEE28300), Umbellularia californica (AAC49001), Arachis hypogaea (AFR54500), Ricinus communis (EEF47013) и Brachypodium sylvaticum (ABL85052.1).

Подкласс полипептидов FATB составляют тиоэстеразы жирных кислот, которые проявляют гидролитическую активность в отношении насыщенного ацильного фрагмента C8-C14, соединенного тиоэфирной связью с АПБ. Такие ферменты дополнительно обозначают как тиоэстеразы среднецепочечных жирных кислот (СЦЖК) или ферменты СЦ-FAT. Такие ферменты могут дополнительно проявлять активность тиоэстеразы в отношении C16-АПБ, в действительности, они могут проявлять более высокую активность тиоэстеразы в отношении субстрата C16 ацил-АПБ, чем субстрата СЦЖК-АПБ, тем не менее, они рассматриваются в настоящем документе как СЦЖК тиоэстеразы, если при экзогенной экспрессии в растительной клетке они продуцируют по меньшей мере 0,5% СЦЖК в общем содержании жирных кислот. Примеры СЦЖК тиоэстераз предоставлены в Примере 9 настоящего документа.

В настоящем документе термин ʺпереносчик жирной кислотыʺ связан с наличием в мембране пластиды полипептида, который принимает активное участие в переносе жирных кислот из пластиды за ее пределы. Примеры полипептидов ABCA9 (ABC переносчик A член семейства 9), пригодных в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваясь ими, полипептиды из Arabidopsis thaliana (Q9FLT5), Capsella rubella (XP_006279962.1), Arabis alpine (KFK27923.1), Camelina sativa (XP_010457652.1), Brassica napus (CDY23040.1) и Brassica rapa (XP_009136512.1).

В настоящем документе термин ʺацил-КоА синтетазаʺ или ʺАКС (ACS)ʺ (EC 6.2.1.3) обозначает полипептид, который входит в состав семейства лигазы, катализирующего образование жирного ацил-КоА в ходе двухстадийного процесса, проходящего через промежуточное аденилированное соединение, с использованием неэтерифицированной жирной кислоты, КоА и АТФ в качестве субстратов, с образованием эфира ацил-КоА, АМФ и пирофосфата в качестве продуктов. В настоящем документе термин ʺдлинноцепочечная ацил-КоА синтетазаʺ (ДАКС) обозначает АКС, которая проявляет активность по меньшей мере в отношении субстрата C18 свободной жирной кислоты, хотя она может обладать более широкой активностью в отношении любой из свободных C14-C20 жирных кислот. Эндогенные пластидные ферменты ДЦАС локализуются во внешней мембране пластиды и функционируют вместе с тиоэстеразой жирной кислоты с целью экспорта жирных кислот из пластиды (Schnurr с соавт., 2002). В Arabidopsis присутствует по меньшей мере девять идентифицированных генов ДЦАС (Shockey с соавт., 2002). Предпочтительными полипептидами ДЦАС являются принадлежащие к подклассу LACS9, которые в Arabidopsis являются основными пластидными ДЦАС. Примеры полипептидов ДЦАС, пригодных в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваясь ими, полипептиды из Arabidopsis thaliana (Q9CAP8), Camelina sativa (XP_010416710.1), Capsella rubella (XP_006301059.1), Brassica napus (CDX79212.1), Brassica rapa (XP_009104618.1), Gossypium raimondii (XP_012450538.1) и Vitis Vinifera (XP_002285853.1). Гомологи вышеупомянутых полипептидов в других видах могут быть с легкостью идентифицированы специалистами в данной области.

Полипептиды, принимающие участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластидах

Уровни неполярных липидов, например, в вегетативных частях растения могут быть дополнительно повышены путем снижения активности полипептидов, принимающих участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде в частях растения, например, мутацией эндогенного гена, кодирующего такой полипептид, или введением экзогенного гена, который кодирует сайленсинговую молекулу РНК, снижающую экспрессию гена-мишени, принимающего участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде.

В настоящем документе термин "полипептид, принимающий участие в выработке диацилглицерида (ДАГ) в пластиде" обозначает любой полипептид в пластиде (в клетках, которые содержат пластиды, таких как клетка вегетативной части, клубня, свеклы или семени растения), который непосредственно принимает участие в синтезе диацилглицерида. Примеры таких полипептидов включают, но не ограничиваясь ими, пластидную GPAT, пластидную LPAAT или пластидную PAP.

GPAT описаны в другом месте настоящего документа. Примеры пластидных полипептидов GPAT, которые могут служить мишенью для подавления согласно изобретению, включают, но не ограничиваясь ими, полипептиды из Arabidopsis thaliana (BAA00575), Capsella rubella (XP_006306544.1), Camelina sativa (010499766.1), Brassica napus (CDY43010.1), Brassica rapa (XP_009145198.1), Helianthus annuus (ADV16382.1) и Citrus unshiu (BAB79529.1). Гомологи в других видах могут с легкостью быть идентифицированы специалистами в данной области.

LPAAT описаны в другом месте настоящего документа. Как будет понятно квалифицированному специалисту, пластидные LPAAT, которые служат мишенью для подавления с целью снижения синтеза ДАГ в пластиде, не являются эндогенными LPAAT, которые функционируют за пределами пластиды, например, в ЭР, например, описанных в настоящем документе как пригодные для выработки ТАГ, содержащих среднецепочечные жирные кислоты. Примеры пластидных полипептидов LPAAT, которые могут служить мишенью для подавления согласно изобретению, включают, но не ограничиваясь ими, полипептиды Brassica napus (ABQ42862), Brassica rapa (XP_009137939.1), Arabidopsis thaliana (NP_194787.2), Camelina sativa (XP_010432969.1), Glycine max (XP_006592638.1) и Solanum tuberosum (XP_006343651.1). Гомологи вышеупомянутых полипептидов в других видах могут быть с легкостью идентифицированы специалистами в данной области.

В настоящем документе термин "фосфатаза фосфатидиновой кислоты (PAP) (EC 3.1.3.4)ʺ обозначает белок, осуществляющий гидролиз фосфатной группы на 3-sn-фосфатидате с образованием 1,2-диацил-sn-глицерида (ДАГ) и фосфата. Примеры пластидных полипептидов PAP, которые могут служить мишенью для подавления согласно изобретению, включают, но не ограничиваясь ими, полипептиды из Arabidopsis thaliana (Q6NLA5), Capsella rubella (XP_006288605.1), Camelina sativa (XP_010452170.1), Brassica napus (CDY10405.1), Brassica rapa (XP_009122733.1), Glycine max (XP_003542504.1) и Solanum tuberosum (XP_006361792.1). Гомологи вышеупомянутых полипептидов в других видах могут быть с легкостью идентифицированы специалистами в данной области.

Импорт жирных кислот в пластиды

Уровни неполярных липидов в вегетативных частях растения могут быть дополнительно повышены путем снижения активности полипептидов ТГД в частях растения, например, с помощью мутации эндогенного гена, кодирующего полипептид ТГД, или введения экзогенного гена, кодирующего сайленсинговую молекулу РНК, которая снижает экспрессию эндогенного гена ТГД. В настоящем документе ʺтригалактозилдиацилглицерид полипептидʺ (ТГД, TGD) представляет собой принимающий участие в переносе липидов хлоропластами в ЭР (Xu с соавт., 2010) и принимающий участие в формировании белкового комплекса, осуществляющего функцию пермеазы для липидов. Четыре таких полипептида известны, как формирующие или связанные с ТГД пермеазой, а именно TGD-1 (номер доступа At1g19800 и гомологи в других видах), TGD-2 (номер доступа At2g20320 и гомологи в других видах), TGD-3 (номер доступа NM-105215 и гомологи в других видах) и TGD-4 (At3g06960 и гомологи в других видах) (US 20120237949). Считается, что полипептиды TGD-1, -2 и -3 являются компонентами переносчика АТФ-связывающей кассеты (АСК), связанного с внутренней мембраной конверта хлоропласта. Полипептиды TGD-2 и TGD-4 связываются с фосфатидиновой кислотой, тогда как полипептид TGD-3 действует, как АТФаза в строме хлоропласта. В настоящем документе ʺэндогенный ген ТГДʺ представляет собой ген, кодирующий полипептид ТГД в растении. Мутации в гене TGD-1 A. thaliana вызывали аккумуляцию триацилглицеридов, олигогалактолипидов и фосфатидиновой кислоты (ФК) (Xu с соавт., 2005). Мутации в генах ТГД или генах SDP1, или, в действительности, в любом целевом гене в растении, могут быть введены в сайт-специфической форме с помощью искусственной цинк-пальцевой нуклеазы (ЦПН), эффектора TAL (ПАТЭН) или технологии ККППРП (с применением нуклеазы Cas9 типа), как известно из уровня техники. Предпочтительными экзогенными генами, кодирующими сайленсинговые РНК, являются кодирующие молекулу двухцепочечной РНК, такой как шпилечная РНК или искусственный прекурсор микроРНК.

Ферменты, модифицирующие жирные кислоты

В настоящем документе термин «FAD2» обозначает связанную с мембраной дельта-12 десатуразу жирной кислоты, которая образует кратные связи в олеиновой кислоте (C18:1Δ9)с образованием линолевой кислоты (C18:2Δ9,12).

В настоящем документе термин «эпоксигеназа» или «эпоксигеназа жирной кислоты» обозначает фермент, который вводит эпоксидную группу в жирную кислоту, с получением в результате эпоксижирной кислоты. В предпочтительном варианте реализации эпоксигруппа вводится при 12-м атоме углерода на цепи жирной кислоты, если эпоксигеназа представляет собой Δ12-эпоксигеназу, особенно цепи жирной кислоты C16 или C18. Эпоксигеназа может быть Δ9-эпоксигеназой, Δ15-эпоксигеназой или оказывать свое действие при другом положении в цепи ацила, как известно из уровня техники. Эпоксигеназа может принадлежать к классу P450. Предпочтительные эпоксигеназы принадлежат к классу монооксигеназ, как описано в WO98/46762. Многочисленные эпоксигеназы или предполагаемые эпоксигеназы клонированы и известны в данной области. Другие примеры эпоксигеназ включают белки, содержащие последовательность аминокислоты, представленную в SEQ ID NO: 21 WO 2009/129582, полипептиды, кодируемые генами Crepis paleastina (CAA76156, Lee с соавт., 1998), Stokesia laevis (AAR23815) (монооксигеназный тип), Euphorbia lagascae (AAL62063) (тип P450), CYP2J2 человека (эпоксигеназа арахидоновой кислоты, U37143); CYPIA1 человека (эпоксигеназа арахидоновой кислоты, K03191), а также их варианты и/или мутанты.

В настоящем документе термин «гидроксилаза» или «гидроксилаза жирной кислоты» обозначает фермент, который вводит гидроксильную группу в жирную кислоту, с образованием гидроксилированной жирной кислоты. В предпочтительном варианте реализации гидроксильная группа вводится при 2-м, 12-м и/или 17-м атоме углерода на цепи жирной кислоты C18. Предпочтительно, гидроксильная группа вводится при 12 атоме углерода, если гидроксилаза представляет собой Δ12-гидроксилазу. В другом предпочтительном варианте реализации гидроксильная группа вводится при 15-м атоме углерода на цепи жирной кислоты C16. Дополнительно, гидроксилазы могут обладать активностью фермента, такого как десатураза жирной кислоты. Примеры генов, кодирующих Δ12-гидроксилазы включают полученные из Ricinus communis (AAC9010, van de Loo 1995); Physaria lindheimeri, (ABQ01458, Dauk с соавт., 2007); Lesquerella fendleri, (AAC32755, Broun с соавт., 1998); Daucus carota, (AAK30206); гидроксилазы жирных кислот, которые гидроксилируют конец жирных кислот, например: A, thaliana CYP86A1 (P48422, ω-гидроксилаза жирной кислоты); Vicia sativa CYP94A1 (P98188, ω-гидроксилаза жирной кислоты); CYP2E1 мыши (X62595, ω-1 гидроксилаза лауриновой кислоты); CYP4A1 крысы (M57718, ω-гидроксилаза жирной кислоты), а также их варианты и/или мутанты.

В настоящем документе термин «конъюгаза» или «конъюгаза жирной кислоты» обозначает фермент, способный к образованию конъюгационной связи в ацильной цепи жирной кислоты. Примеры конъюгаз включают конъюгазы, кодируемые генами Calendula officinalis (AF343064, Qiu с соавт., 2001); Vernicia fordii (AAN87574, Dyer с соавт., 2002); Punica granatum (AY178446, Iwabuchi с соавт., 2003) и Trichosanthes kirilowii (AY178444, Iwabuchi с соавт., 2003); а также их варианты и/или мутанты.

В настоящем документе термин «ацетиленаза» или «ацетиленаза жирной кислоты» обозначает фермент, который вводит тройную связь в жирную кислоту, что приводит в результате к образованию ацетиленсодержащей жирной кислоты. В предпочтительном варианте реализации тройная связь вводится при 2-м, 6-м, 12-м и/или 17-м атоме углерода на цепи жирной кислоты C18. Примеры ацетиленаз включают полученные из Helianthus annuus (AA038032, ABC59684), а также их варианты и/или мутанты.

Примеры таких модифицирующих жирные кислоты генов включают белки в соответствии со следующими номерами доступа, которые сгруппированы по предполагаемой функции, и гомологи из других видов: Δ12-ацетиленазы ABC00769, CAA76158, AAO38036, AAO38032; Δ12 конъюгазы AAG42259, AAG42260, AAN87574; Δ12-десатуразы P46313, ABS18716, AAS57577, AAL61825, AAF04093, AAF04094; Δ12 эпоксигеназы XP_001840127, CAA76156, AAR23815; Δ12-гидроксилазы ACF37070, AAC32755, ABQ01458, AAC49010; и ферменты Δ12 P450, например, AF406732.

Супрессоры сайленсинга

В варианте реализации изобретения рекомбинантная/трансгенная клетка по изобретению может содержать супрессор сайленсинга.

В настоящем документе ʺсупрессор сайленсингаʺ повышает экспрессию трансгена в клетке по изобретению. Например, присутствие супрессора сайленсинга приводит к более высоким уровням полипептида(ов), продуцируемого экзогенным(и) полинуклеотидом(ами) в клетке по изобретению, по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей супрессора сайленсинга. В варианте реализации изобретения супрессор сайленсинга предпочтительно связывается с молекулой дцРНК, размер которой составляет 21 пару оснований, относительно молекулы дцРНК другой длины. Это является признаком по меньшей мере супрессора сайленсинга типа p19, а именно p19 и его функциональных ортологов. В другом варианте реализации изобретения супрессор сайленсинга предпочтительно связывается с двухцепочечной молекулой РНК с нависающими 5' концами, по сравнению с соответствующей двухцепочечной молекулой РНК с тупыми концами. Это признак супрессора сайленсинга типа V2, а именно V2 и его функциональных ортологов. В варианте реализации изобретения молекула дцРНК или ее процессированный РНК продукт содержит по меньшей мере 19 нуклеотидов подряд, длина которого предпочтительно составляет 19-24 нуклеотида, с 19-24 парами оснований подряд в случае двухцепочечной молекулы шпилечной РНК или процессированного РНК продукта, более предпочтительно, состоит из 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов и предпочтительно содержит метилированный нуклеотид, по меньшей мере на 95% идентичный последовательности, комплементарной участку РНК-мишени, причем, участок РНК-мишени находится i) в пределах 5' нетранслируемого участка РНК-мишени, ii) в пределах 5' половины РНК-мишени, iii) в пределах кодирующей белок открытой рамки считывания РНК-мишени, iv) в пределах 3' половины РНК-мишени или v) в пределах 3' нетранслируемого участка РНК-мишени.

Дальнейшие подробности относительно супрессоров сайленсинга хорошо известны из уровня техники и описаны в WO 2013/096992 и WO 2013/096993.

Полинуклеотиды

Термины «полинуклеотид», и «нуклеиновая кислота» используются равнозначно. Они обозначают полимерную форму нуклеотидов любой длины, дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов или их аналогов. Полинуклеотид по изобретению может быть геномного, кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, одноцепочечным или двухцепочечным, и вследствие его происхождения или манипуляций с ним: (1) не связан с полноразмерным или частью полинуклеотида, с которым он связан в природе, (2) связан с другим полинуклеотидом, чем тот, с которым он связан в природе, или (3) не встречается в природе. Ниже приведены неограничивающие примеры полинуклеотидов: кодирующие или не кодирующие участки гена или фрагмента гена, экзоны, интроны, информационная РНК (иРНК), транспортная РНК (тРНК), рибосомальная РНК (рРНК), рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК с любой последовательностью, выделенная РНК с любой последовательностью, химерная ДНК с любой последовательностью, зонды нуклеиновой кислоты и праймеры. Для применения in vitro полинуклеотид может включать нуклеотиды, модифицированные, например, посредством конъюгации с меткой.

В настоящем документе «выделенный полинуклеотид» обозначает полинуклеотид, который отделен от полинуклеотидных последовательностей, с которыми он связан или соединен в природном состоянии, или от неприродного полинуклеотида.

В настоящем документе термин «ген» понимается в самом широком контексте и включает дезоксирибонуклеотидные последовательности, содержащие транскрибированный участок и, при условии трансляции, участок кодирования белка структурного гена и, в том числе, последовательности, смежные с кодирующим участком, на 5' и 3' концах, на расстоянии по меньшей мере около 2 тысяч пар оснований на любом конце, которые принимают участие в экспрессии гена. В этом отношении, ген содержит контрольные сигналы, например, промоторы, энхансеры, сигналы терминации и/или полиаденилирования, которые в природе связаны с указанным геном, или гетерологичные контрольные сигналы, и в этом случае ген обозначается, как «химерный ген». Последовательности, которые размещены в направлении 5' по отношению к кодирующему белок участку, и которые присутствуют в иРНК, обозначаются как 5' нетранслируемые последовательности. Последовательности, которые размещены в направлении 3' или по ходу транскрипции относительно кодирующего белок участка, и которые присутствуют в иРНК, обозначаются, как 3' нетранслируемые последовательности. Термин «ген» включает кДНК и геномные формы гена. Геномная форма или клон гена содержит кодирующий участок, который может перемежаться не кодирующими последовательностями под названием «интроны», «вставочные последовательности» или «встроенные последовательности». Интроны представляют собой сегменты гена, которые транскрибированы в ядерную РНК (яРНК). Интроны могут содержать регуляторные элементы, например, энхансеры. Интроны удаляются, или «происходит укорачивание» ядерной или первичной копии; таким образом, интроны отсутствуют в копии иРНК. Ген, содержащий по меньшей мере один интрон, может подвергаться вариабельному сплайсингу с образованием альтернативных иРНК из одного транскрибированного гена и, таким образом, полипептидных вариантов. В природном или химерном гене интроны могут отсутствовать. Функции иРНК в ходе трансляции состоят в определении последовательности или порядка аминокислот в возникающем полипептиде. Термин «ген» включает синтетическую или слитую молекулу, кодирующую полноразмерные белки по изобретению или их части, как раскрыто в настоящем документе, и нуклеотидную последовательность, комплементарную к любому из упомянутого выше.

В настоящем документе «химерная ДНК» обозначает любую молекулу ДНК, которая не найдена в природе; также обозначается в настоящем документе как «конструкция ДНК» или «генетическая конструкция». Обычно, химерная ДНК содержит регуляторную и транскрибированную или кодирующую белок последовательности, которые не найдены вместе в природе. Соответственно, химерная ДНК может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из различных источников или регуляторных последовательностей, и кодирующие последовательности, происходящие из того же источника, но организованные до некоторой степени отличным образом, чем найденные в природе. Открытая рамка считывания может быть или может не быть связанной с ее природными регуляторными элементами, расположенными против хода транскрипции и по ходу транскрипции. Открытая рамка считывания может быть инкорпорирована, например, в геном растения, в неприродном расположении или в репликоне или векторе, где она не найдена в природе, например, бактериальной плазмиде или вирусном векторе. Термин «химерная ДНК» не ограничивается молекулами ДНК, которые являются реплицируемыми в организме-хозяине, но включает ДНК, способную к лигированию в репликон, например, специфическими адаптерными последовательностями.

«Трансген» представляет собой ген, который введен в геном процедурой трансформации. Термин включает ген в клетке-потомке, растении, семени, организме, не относящемся к человеческому роду, или его части, который был введен в геном их родительской клетки. Такие клетки-потомки, и т. п. могут представлять по меньшей мере 3или 4поколение потомков относительно родительской клетки, которая была первоначально трансформирована, или родительского трансгенного растения (которое в настоящем документе обозначается как растение T0). Потомок может быть получен путем полового воспроизводства или вегетативно, например, из клубней картофеля или отводков сахарного тростника. Термин «генетически модифицированный», «генетическая модификация» и их вариации представляют более широкий термин, который включает введение гена в клетку посредством трансформации или трансдукции, видоизменение гена в клетке и генную модификацию или модуляцию регулирования гена в клетке или потомке любой модифицированной клетки, как изложено выше.

«Геномный участок» в настоящем документе обозначает положение в пределах генома, в котором трансген или группа трансгенов (также обозначается в настоящем документе как кластер) вставлены в клетку или ее предка. Такие участки содержат только нуклеотидны, введенные в результате вмешательства человека, например, способами, раскрытыми в настоящем документе.

«Рекомбинантный полинуклеотид» по изобретению обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая сконструирована или модифицирована способами искусственной рекомбинации. Рекомбинантный полинуклеотид может присутствовать в клетке в измененном количестве или экспрессироваться с измененной скоростью (например, в случае иРНК), по сравнению с его природным состоянием. В одном варианте реализации полинуклеотид введен в клетку, которая от природы не содержит полинуклеотида. Обычно экзогенная ДНК используется в качестве шаблона для транскрипции иРНК, которая в дальнейшем транслируется в непрерывную последовательность остатков аминокислоты, кодируя полипептид по изобретению в пределах трансформированной клетки. В другом варианте реализации полинуклеотид является для клетки эндогенным, и его экспрессия модифицирована рекомбинантными средствами, например, экзогенная контрольная последовательность введена в направлении относительного целевого эндогенного гена, чтобы предоставить возможность трансформированной клетке экспрессировать полипептид, кодируемый геном, или делеция введена в целевой ген методами ZFN, ПАТЭН или ККППРП.

Рекомбинантный полинуклеотид по изобретению содержит полинуклеотиды, которые не были отделены от других компонентов клеточной или неклеточной системы экспрессии, в которой он присутствует, и полинуклеотиды, образованные в указанных клеточных или неклеточных системах, которые впоследствии очищают по меньшей мере от некоторых других компонентов. Полинуклеотид может быть беспрерывным участком нуклеотидов или может содержать два или более смежных участков нуклеотидов из различных источников (природных и/или синтетических), соединенных таким образом, чтобы сформировать единый полинуклеотид. Обычно, такие химерные полинуклеотиды содержат по меньшей мере открытую рамку считывания, кодирующую полипептид по изобретению, функционально связанную с промотором, пригодным для управления транскрипцией открытой рамки считывания в целевой клетке.

С учетом определенных полинуклеотидов, необходимо понимать, что % идентичности, превышающий приведенные выше, будет охватывать предпочтительные варианты реализации изобретения. Таким образом, если это уместно, в свете минимальных значений % идентичности, предпочтительно, полинуклеотид содержит последовательность полинуклеотида, которая по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8%, и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична представленной в соответствующей SEQ ID NO.

Полинуклеотид по настоящему изобретению или пригодный для применения в соответствии с настоящим изобретением может селективно гибридизоваться, в строгих условиях, с полинуклеотидом, определенным в настоящем документе. В настоящем документе строгие условия представляют собой: (1) применение в ходе гибридизации денатурирующего агента, такого как формамид, например, 50%, об/об формамида, содержащего 0,1%, масс/об телячьего сывороточного альбумина, 0,1% Фиколла, 0,1% поливинилпирролидона, 50 мМ натрий фосфатного буфера, pH 6,5, содержащего 750 мМ NaCl, 75 мМ натрия цитрата, при 42°C; или (2) применение 50%, формамида, 5 x натрия хлорида+натрия цитрата (0,75 M NaCl, 0,075 M натрия цитрата), 50 мМ натрия фосфата (pH 6,8), 0,1% натрия пирофосфата, 5 x раствор Денхардта, обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося (50 г/мл), 0,1% натрия лаурилсульфата и 10% декстрана сульфата при 42°C в 0,2 x натрия хлорида+натрия цитрата и 0,1% натрия лаурилсульфата, и/или (3) применение низкой ионной силы и высокой температуры для промывания, например, 0,015 M NaCl/0,0015 M натрия цитрата/0,1% натрия лаурилсульфата при 50°C.

Полинуклеотиды по изобретению могут содержать, по сравнению с природными молекулами, одну или более мутаций, которые представляют собой делеции, вставки или замены нуклеотидных остатков. Полинуклеотиды, которые содержат мутации относительно референтной последовательности, могут быть природными (т. е., выделенными из природного источника) или синтетическими (например, полученными путем сайт-направленного мутагенеза или тасования ДНК в нуклеиновой кислоте, как изложено выше).

Полинуклеотиды для снижения уровней экспрессии генов

РНК-интерференция

РНК-интерференция (РНКи) особенно пригодна для специфичного снижения экспрессии гена, что ведет к уменьшению выработки конкретного белка, если ген кодирует белок. Не желая ограничиваться теорией, Waterhouse с соавт. (1998) предложили модель механизма, по которому двухцепочечная РНК (дцРНК) может использоваться для снижения выработки белка. Данная технология зависит от присутствия молекул дцРНК, которые содержат последовательность, по существу идентичную иРНК целевого гена или его части. Пригодным образом, дцРНК может быть получена с помощью единственного промотора в рекомбинантном векторе или клетке-хозяине, в которых смысловые и антисмысловые последовательности фланкированы посторонней последовательностью, которая позволяет смысловой и антисмысловой последовательностям гибридизоваться с образованием молекулы дцРНК с посторонней последовательностью, образующей структуру петли. Конструирование и получение подходящих молекул дцРНК находится в пределах компетенции специалиста в данной области, особенно с учетом Waterhouse с соавт. (1998), Smith с соавт. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029 и WO 01/34815.

В одном из примеров вводят ДНК, которая направляет синтез по меньшей мере частично двухцепочечного продукта(-ов) РНК, гомологичного гену мишени, который подлежит инактивации, например, такого как SDP1, TGD, пластидная GPAT, пластидная LPAAT, пластидная PAP, ген АДФ-глюкозопирофосфорилазы (АГФазы). Таким образом, ДНК содержит смысловые и антисмысловые последовательности, которые при транскрибировании в РНК могут гибридизоваться с образованием двухцепочечного участка РНК. В одном варианте реализации, смысловая и антисмысловая последовательности отделены спейсерным участком, который содержит интрон, отщепляющийся при транскрибировании в РНК. Показано, что такое размещение приводит к более высокой эффективности сайленсинга гена (Smith с соавт., 2000). Двухцепочечный участок может содержать одну или две молекулы РНК, транскрибированные с одного или двух участков ДНК. Считается, что присутствие двухцепочечной молекулы запускает реакцию эндогенной системы, которая разрушает двухцепочечную РНК, а также гомологичную копию РНК, образованную геном-мишенью, эффективно снижая или устраняя активность гена-мишени.

Длина смысловой и антисмысловой последовательностей, которые гибридизуются, должна составлять для каждой по меньшей мере 19 нуклеотидов подряд, предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов подряд, более предпочтительно, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 нуклеотидов подряд. В общем, применяется последовательность размером 100-1000 нуклеотидов, соответствующая участку иРНК гена-мишени. Может использоваться полноразмерная последовательность, соответствующая полному транскрипту гена. Степень идентичности смысловой последовательности целевому транскрипту (и, таким образом, также идентичности антисмысловой последовательности и последовательности, комплементарной транскрипту-мишени) должна составлять по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или 95-100%. Молекула РНК может, конечно, содержать посторонние последовательности, функция которых может состоять в стабилизации молекулы. Молекула РНК может экспрессироваться под контролем промотора РНК полимеразы II или РНК полимеразы III. Примеры последнего включают промоторы тРНК или мяРНК.

Предпочтительные молекулы малой интерферирующей РНК («миРНК») содержат нуклеотидную последовательность, которая идентична приблизительно 19-25 смежным нуклеотидам иРНК-мишени. Предпочтительно, последовательность миРНК начинается с динуклеотида AA, содержит GC в количестве приблизительно 30-70% (предпочтительно, 30-60%, более предпочтительно 40-60% и более предпочтительно приблизительно 45-55%), и не обладает высокой степенью идентичности ни к одной нуклеотидной последовательности в геноме организма, кроме мишени, в которую она должна быть введена, например, как определяется стандартным поиском BLAST.

МикроРНК

МикроРНК (сокращенно миРНК) в общем представляют собой некодирующие молекулы РНК длиной 19-25 нуклеотидов (в растениях обычно приблизительно 20-24 нуклеотида), происходящие от крупных прекурсоров, которые образуют несовершенные структуры «петля-на-стебле».

миРНК связывают с дополнительными последовательностями на целевых транскриптах информационной РНК (иРНК), что обычно приводит к угнетению трансляции или разложению мишени и сайленсингу гена. Как хорошо известно из уровня техники, на основе природных миРНК могут быть сконструированы искусственные миРНК (имиРНК) для целей уменьшения экспрессии любого целевого гена.

Считается, что в клетках растений процессинг молекул-прекурсоров миРНК в значительной степени происходит в ядре. Процессинг пре-миРНК (содержащих один или более локальных двухцепочечных или «шпилечных» участков, а также обыкновенный 5' «кэп» и полиаденилированный хвост иРНК) происходит до более короткой молекулы-прекурсора миРНК, которая также содержит структуру «петля-на-стебле» или конъюгацию плеч хромосомы и называется «пре-миРНК». В растениях, пре-миРНК расщепляются различными ДАЙСЕР-подобными ферментами (ДСП), образуя дуплексы миРНК:миРНК*. Перед транспортом за пределы ядра, такие дуплексы метилируются.

В цитоплазме, цепь миРНК от спаренной миРНК:миРНК селективно инкорпорируется в активный РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (РИКС) для распознавания мишени. Комплексы РИКС содержат конкретное подмножество белков Argonaute, которые осуществляют специфичное в отношении последовательности подавление гена (см., например, Millar и Waterhouse, 2005; Pasquinelli с соавт., 2005; Almeida и Allshire, 2005).

Косупрессия

Гены могут подавлять экспрессию родственных эндогенных генов и/или трансгенов, уже присутствующих в геноме, причем данный признак, назван зависимым от гомологии сайленсингом гена. В большинстве случаев зависимый от гомологии сайленсинг гена относится к одному из двух классов - функционирующий на уровне транскрипции трансгена или действующий посттранскрипционально.

Посттранскрипциональный зависимый от гомологии сайленсинг (т. е., косупрессия) гена описывает прекращение экспрессии трансгена и родственных эндогенных или вирусных генов в трансгенных растениях. Косупрессия часто, но не всегда, возникает, если копий трансгена много, и, в общем, считается запускаемой на уровне процессинга, локализации и/или разложения иРНК. Существуют различные модели для объяснения того, как осуществляется косупрессия (см. Taylor, 1997).

Косупрессия включает введение добавочной копии гена или его фрагмента в растение, в смысловой ориентации относительно промотора, для его экспрессии. Размер смыслового фрагмента, его соответствие участкам гена-мишени, и степень идентичности его последовательности гену-мишени могут быть определены специалистами в данной области. В некоторых случаях дополнительная копия последовательности гена препятствует экспрессии растительного гена-мишени. В WO 97/20936 и EP 0465572 раскрыты способы осуществления подходов косупрессии.

Антисмысловые полинуклеотиды

Термин «антисмысловой полинуклеотид» следует интерпретировать как обозначающий молекулу ДНК или РНК, которая комплементарна по меньшей мере части конкретной молекулы иРНК, кодирующей эндогенный полипептид, и способна препятствовать посттранскрипциональному событию, например, трансляции иРНК. Применение антисмысловых методов хорошо известно из уровня техники (см., например, G. Hartmann and S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)). Применение антисмысловых методов в растениях рассмотрено Bourque (1995) и Senior (1998). Bourque (1995) перечисляет большое количество примеров того, как антисмысловые последовательности применяются в растительных системах в качестве способа инактивации гена. Bourque также заявляет, что достижение 100% ингибирования любой ферментной активности может не быть необходимым, поскольку частичное ингибирование будет более чем вероятно приводить к измеримому изменению в системе. Senior (1998) указывает, что антисмысловые методы в настоящее время представляют собой хорошо изученную технику для манипуляции экспрессией гена.

В одном варианте реализации антисмысловой полинуклеотид гибридизуется в физиологических условиях, т. е., антисмысловой полинуклеотид (который полностью или частично является одноцепочечным) по меньшей мере способен к образованию двухцепочечного полинуклеотида с иРНК, кодирующей в клетке эндогенный полипептид, например, иРНК SDP1, TGD, пластидной GPAT, пластидной LPAAT, пластидной PAP или АГФазы, в нормальных условиях.

Антисмысловые молекулы могут включать последовательности, которые соответствуют структурным генам или для последовательностей, которые осуществляют контроль над экспрессией гена или событием укорачивания. Например, антисмысловая последовательность может соответствовать целевому кодирующему участку эндогенного гена или 5'-нетранслируемому участку (НТУ) или 3'-НТУ или их комбинации. Она может быть частично комплементарной интронным последовательностям, которые могут быть укорочены в ходе или после транскрипции, предпочтительно только до экзонных последовательностей гена-мишени. Принимая во внимание существенную в общем дивергенцию НТУ, нацеливание данных участков обеспечивает высокую степень специфичности ингибирования гена.

Длина антисмысловой последовательности должна составить по меньшей мере 19 нуклеотидов подряд, предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов и более предпочтительно по меньшей мере 100, 200, 500 или 1000 нуклеотидов. Может использоваться полноразмерная последовательность, комплементарная к полноразмерному транскрипту гена. Наиболее предпочтительно, длина составляет 100-2000 нуклеотидов. Степень идентичности антисмысловой последовательности целевому транскрипту должна составлять по меньшей мере 90% и более предпочтительно 95-100%. Антисмысловая молекула РНК, конечно, может содержать посторонние последовательности, функция которых может состоять в стабилизации молекулы.

Рекомбинантные векторы

Один вариант реализации настоящего изобретения включает рекомбинантный вектор, который содержит по меньшей мере один полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, и способен доставлять полинуклеотид в клетку-хозяина. Рекомбинантные векторы включают векторы экспрессии. Рекомбинантные векторы содержат гетерологичные полинуклеотидные последовательности, т. е., полинуклеотидные последовательности, которые в природе не найдены смежно с полинуклеотидом, раскрытым в настоящем документе, и, предпочтительно, получены от другого вида. Вектор может представлять собой РНК или ДНК, и обычно представляет собой вирусный вектор, полученный из вируса, или плазмиду. Плазмидные векторы обычно содержат дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты, которые включены для простоты селекции, амплификации и трансформации кассеты экспрессии в прокариотных клетках, например, pUC-полученных векторах, pGEM-полученных векторах или бинарных векторах, содержащих один или более участков T-ДНК. Дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты включают источники репликации для автономной репликации вектора, гены селекционного маркера, предпочтительно кодирующие резистентность к антибиотику или гербициду, уникальные множественные сайты клонирования, предусматривающие множественные сайты для вставки последовательностей нуклеиновой кислоты или кодируемых генов в конструкцию нуклеиновой кислоты, и последовательностей, которые увеличивают степень трансформации прокариотных и эукариотных (особенно растительных) клеток.

«Функционально связанный» в настоящем документе обозначает функциональное взаимоотношение двух или более сегментов нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Обычно, это выражение обозначает функциональное взаимоотношение элемента регуляции транскрипции (промотор) с транскрибированной последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью полинуклеотида, раскрытого в настоящем документе, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в пригодной клетке. В общем, промоторные элементы регуляции транскрипции, которые функционально связаны с транскрибированной последовательностью, являются физически смежными с транскрибированной последовательностью, т. е., они цис-действующие. Однако, некоторые элементы регуляции транскрипции, например, энхансеры, не должны быть физически смежными или расположенными поблизости кодирующих последовательностей, транскрипцию которых они усиливают.

Если присутствует несколько промоторов, каждый промотор независимо может быть таким же или другим.

Кроме того, рекомбинантные векторы могут содержать одну или более последовательностей сигнального пептида, чтобы позволить удержание экспрессированного полипептида, раскрытого в настоящем документе, в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) клетки или перенос в пластиду, и/или химерные последовательности, которые приводят к экспрессии молекул нуклеиновой кислоты в виде слитых белков. Примеры пригодных сигнальных сегментов включают любой сигнальный сегмент, способный направлять секрецию или локализацию полипептида, раскрытого в настоящем документе.

Чтобы упростить идентификацию трансформантов, рекомбинантный вектор желательно должен включать ген селекционного или пригодного для скрининга маркера. «Ген маркера» обозначает ген, который передает отличный фенотип клеткам, экспрессирующим ген маркера, и, таким образом, позволяет отличать такие трансформированные клетки от клеток, которые не содержат маркера. Ген селекционного маркера обеспечивает признак, по которому может быть осуществлена «селекция» на основе резистентности к агенту селекции (например, гербициду, антибиотику). Ген пригодного для скрининга маркера (или репортерный ген) обеспечивает признак, который можно идентифицировать посредством наблюдения или тестирования, т. е., «скрининга» (например., β-глюкуронидаза, люцифераза, ЗФБ или другая ферментная активность, отсутствующая в нетрансформированных клетках). Примеры селекционных маркеров для селекции трансформантов растения включают, без ограничений, ген hyg, который кодирует резистентность к гигромицину B; ген неомицинфосфотрансферазы (nptII), обеспечивающий резистентность к канамицину, паромомицину; ген глутатион-S-трансферазы из печени крыс, обеспечивающий резистентность к полученным из глутатиона гербицидам, например, описанный в EP 256223; гена глутаминсинтетазы, при повышенной экспрессии обеспечивающий резистентность к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как фосфинотрицин, например, как раскрыто в WO 87/05327; ген ацетилтрансферазы Streptomyces viridochromogenes, обеспечивающий резистентность к агенту селекции фосфинотрицину, например, как раскрыто в EP 275957; ген, кодирующий 5-енолшикимат-3-фосфат синтетазу (ЕШФС), обеспечивающую переносимость N-фосфонометилглицина, например, как раскрыто Hinchee с соавт. (1988); ген bar, обеспечивающий резистентность к биалафосу, например, раскрытый в WO 91/02071; ген нитрилазы, например, bxn Klebsiella ozaenae, который обеспечивает резистентность к бромоксинилу (Stalker с соавт., 1 988); ген дигидрофолатредуктазы (ДГФР), обеспечивающий резистентность к метотрексату (Thillet с соавт., 1988); мутантный ген ацетолактсинтетазы (АЛС), который обеспечивает резистентность к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим ингибирующим АЛС химическим веществам (EP 154204); модифицированный ген антранилатсинтетазы, который обеспечивает резистентность к 5-метилтриптофану; или ген далапон дегалогеназы, который обеспечивает резистентность к гербициду.

Предпочтительно, рекомбинантный вектор стабильно инкорпорирован в геном клетки, например, растительные клетки. Соответственно, рекомбинантный вектор может содержать пригодные элементы, которые позволяют вектору инкорпорироваться в геном или хромосому клетки.

Вектор экспрессии

В настоящем документе «вектор экспрессии» представляет собой ДНК вектор, который способен к трансформации клетки-хозяина и эффективной экспрессии одного или более указанных полинуклеотидов. Векторы экспрессии по настоящему изобретению содержат регуляторные последовательности, например, последовательности контроля транскрипции, последовательности контроля трансляции, источники репликации и другие регуляторные последовательности, которые совместимы с клеткой-хозяином и которые управляют экспрессией полинуклеотидов по настоящему изобретению. В частности, векторы экспрессии по настоящему изобретению содержат последовательности контроля транскрипции. Последовательности контроля транскрипции представляют собой последовательности, которые управляют инициацией транскрипции, удлинением транскрипта и окончанием транскрипции. Особенно значимыми последовательностями контроля транскрипции являются такие, которые управляют инициацией транскрипции, например, промоторные, энхансерные, операторные и репрессорные последовательности. Выбор используемых регуляторных последовательностей зависит от организма-мишени, например, растения, и/или органа-мишени или целевой ткани. Такие регуляторные последовательности могут быть получены от любого эукариотного организма, такого как растения или вирусы растения, или могут быть химически синтезированы. Целый ряд векторов, пригодных для стабильной трансфекции растительных клеток или для получения трансгенных растений, раскрыт, например, в Pouwels с соавт., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989, и Gelvine с соавт., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Обычно, векторы экспрессии растений содержат, например, один или более клонированных генов растения под транскрипциональным контролем 5' и 3' регуляторных последовательностей и доминирующего селекционного маркера. Кроме того, такие векторы экспрессии растений могут содержать регуляторный участок промотора (например, регуляторный участок, управляющий индуцибельной или конститутивной, регулируемой окружающей средой или стадией развития, клеточно- или тканеспецифичной экспрессией), старт-сайт инициации транскрипции, сайт связывания с рибосомой, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования.

Раскрыт целый ряд конститутивных промоторов, которые активны в клетках растений. Пригодные промоторы для конститутивной экспрессии в растениях включают, без ограничений, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV), 35S вируса мозаики норичника (ВМН), индуцируемый светом промотор маленькой субъединицы (МСЕ) рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы, рисовый промотор цитозольной триозофосфат изомеразы, промотор аденин фосфорибозилтрансферазы Arabidopsis, промотор гена рисового актина 1, промоторы маннопин синтетазы и октопин синтетазы, промотор Adh, промотор синтетазы сахарозы, промотор комплекса R гена и промотор гена белка, связывающегося с α/βхлорофиллом. Эти промоторы использовались для создания векторов ДНК, которые экспрессируются в растениях, см., например, WO 84/02913. Все указанные промоторы использовались для создания различных видов экспрессируемых в растениях рекомбинантных ДНК векторов.

С целью экспрессии в исходных тканях растения, таких как лист, семя, корень или стебель, промоторы, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно демонстрируют относительно высокую экспрессию в указанных конкретных тканях. Для достижения данной цели можно выбирать из целого ряда промоторов для генов с ткане- или клеточноспецифичной или -усиленной экспрессией. Примеры таких промоторов, о которых сообщалось в литературе, включают, промотор глутаминсинтетазы хлоропластов GS2 гороха, промотор фруктозо-1,6-бифосфатазы хлоропласта пшеницы, промотор ядерного фотосинтетического ST-LS1 картофеля, промотор серин/треонинкиназы и промотор глюкоамилазы (CHS) Arabidopsis thaliana. Также сообщалось, что активным в фотосинтетически активных тканях является промотор рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы восточной лиственницы (Larix laricinа), промотор гена Cab сосны, Cab6, промотор гена Cab-1 пшеницы, промотора гена Cab-1 шпината, промотор гена Cab-1R риса, промотор пируват, ортофосфат дикиназы (ПФДК) Zea mays, промотор гена Lhcb1*2 табака, промотор симпортера Suc2 Arabidopsis thaliana сахарозы-H30, и промотор для генов тилакоидного белка мембраны шпината (PsaD, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS). Другие промоторы белков, связывающихся с α/βхлорофиллом также могут использоваться в настоящем изобретении, например, промоторы гена LhcB и гена PsbP белой горчицы (Sinapis albа).

Различные промоторы растительных генов, которые регулируются в ответ на экологические, гормональные, химические и/или связанные с развитием сигналы, также могут использоваться для экспрессии генов РНК-связывающего белка в клетках растения, в том числе, промоторы, регулируемые (1) нагреванием, (2) светом (например, промотор RbcS-3A гороха, промотор RbcS маиса), (3) гормонами, например, абсцизиновая кислота, (4) образованием ран (например, WunI) или (5) химическими веществами, такими как метилжасмонат, салициловая кислота, стероидные гормоны, спирт, сафенеры (WO 97/06269), или дополнительно может быть предпочтительным использование (6) специфичных в отношении органа промоторов.

В настоящем документе термин «промотор, специфичный в отношении запасающего органа растения» обозначает промотор, который предпочтительно, по сравнению с другими тканями растения, направляет транскрипцию гена в запасающем органе растения. С целью экспрессии в акцептирующих тканях растения, например, клубня картофельного растения, плода помидора или семени сои, рапса, хлопка, Zea mays, пшеницы, риса и ячменя, промоторам, используемым в настоящем изобретении, предпочтительно свойственна относительно высокая экспрессия в данных конкретных тканях. Может применяться промотор β-конглицинина или другие специфичные для семени промоторы, например, промоторы напина, зеина, линина и фазеолина. Кроме того, могут применяться специфичные в отношении корней промоторы. Примером такого промотора является промотор гена кислой хитиназы. Дополнительно, экспрессия в корневой ткани могла бы быть достигнута с использованием специфичных в отношении корней субдоменов промотора CaMV 35S, которые идентифицированы.

В особенно предпочтительном варианте реализации промотор направляет экспрессию в тканях и органах, в которых имеет место биосинтез липида. Такие промоторы могут действовать на стадии развития семени, в подходящее время для модификации состава липида в семенах. Предпочтительные промоторы для специфичной экспрессии в семени включают: 1) промоторы генов, кодирующих ферменты, принимающие участие в биосинтезе липида и аккумуляции в семенах, например, десатуразы и элонгазы, 2) промоторы генов, кодирующих запасаемые белки семени, и 3) промоторы генов, кодирующих ферменты, принимающие участие в биосинтезе углеводов и аккумуляции в семенах. Пригодные промоторы, специфичные в отношении семени, представляют собой: промотор гена напина масличного рапса (US 5608152), промотор Фарм. USP Vicia faba (Baumlein с соавт., 1991), промотор олеозина Arabidopsis (WO 98/45461), промотор фазеолина Phaseolus vulgaris (US 5504200), промотор Bce4 Brassica (WO 91/13980) или промотор легумина B4 (Baumlein с соавт., 1992), а также промоторы, которые приводят к специфичной экспрессии в семени однодольных, таких как маис, ячмень, пшеница, рожь, рис и т. п. Следует отметить пригодные промоторы гена lpt2 или lpt1 ячменя (WO 95/15389 и WO 95/23230) или промоторы, описанные в WO 99/16890 (промоторы гена гордеина ячменя, гена глютелина риса, гена оризина риса, гена проламина риса, гена глиадина пшеницы, гена глютелина пшеницы, гена зеина маиса, гена глютелина овса, гена казирина сорго, гена секалина ржи). Другие промоторы включают раскрытые Broun с соавт. (1998), Potenza с соавт. (2004), US 20070192902 и US 20030159173. В варианте реализации специфичный для семени промотор предпочтительно экспрессируется в определенных частях семени, например, семядоле(-ях) или эндосперме. Примеры специфичных для семядоли промоторов включают, без ограничений, промотор FP1 (Ellerstrometal.,1996), промотор легумина гороха (Perrin с соавт., 2000) и промотор фитогемагглютинина боба (Perrin с соавт., 2000). Примеры специфичных для эндоспермы промоторов включают, без ограничений, промотор зеина-1 маиса (Chikwamba с соавт., 2003), промотор глютелина-1 риса (Yang с соавт., 2003), промотор D-гордеина ячменя (Horvath с соавт., 2000) и промоторы высокомолекулярного глютенина пшеницы (Alvarez с соавт., 2000). В дальнейшем варианте реализации специфичный для семени промотор не экспрессируется или экспрессируется только на низком уровне в зародыше и/или после того, как семя прорастает.

В другом варианте реализации промотор, специфичный для запасного органа растения, представляет собой специфичный для фрукта промотор. Примеры включают, без ограничений, промотор полигалактуроназы помидора, E8 и Pds, а также промотор аминоциклопропанкарбоксилат оксидазы (АЦК) яблока (обзор см. в Potenza с соавт., 2004). В предпочтительном варианте реализации промотор предпочтительно направляет экспрессию в съедобных частях плода, например, сердцевине плода, относительно кожуры плода или семян в пределах плода.

В варианте реализации индуцибельный промотор представляет собой систему alc Aspergillus nidulans. Примеры индуцибельных систем экспрессии, которые могут использоваться вместо системы Aspergillus nidulans alc, описаны в обзоре Padidam (2003) и Corrado и Karali (2009). В другом варианте реализации индуцибельный промотор представляет собой индуцируемый сафенером промотор, например, такой как промотор ln2-1 или ln2-2 маиса (Hershey и Stoner, 1991), индуцибельный промотор сафенера представляет собой промотор GST-27 маиса (Jepson с соавт., 1994) или соевый промотор GH2/4 (Ulmasov с соавт., 1995).

В другом варианте реализации индуцибельный промотор представляет собой промотор, индуцируемый старением, например, такой как индуцируемый старением промотор SAG (связанный со старением ген) 12 и SAG 13 Arabidopsis (Gan, 1995; Gan и Amasino, 1995) и LSC54 Brassica napus (Buchanan-Wollaston, 1994). Такие промоторы демонстрируют повышенную экспрессию в период около начала старения растительных тканей, особенно листьев.

Для экспрессии в вегетативных тканях могут использоваться специфичные для листьев промоторы, такие как промоторы рибулозобифосфат карбоксилазы (РБФК). Например, гены RBCS1, RBCS2 и RBCS3A помидора экспрессируются в листьях и растущих под действием света саженцах (Meier с соавт., 1997). Могут использоваться промоторы рибулозобифосфат карбоксилазы, экспрессирующиеся почти исключительно в клетках мезофилла листовых пластинок и влагалищ листьев с высокими уровнями, как раскрыто Matsuoka с соавт. (1994). Другой специфичный для листьев промотор представляет собой легко собирающий урожай промотор гена улавливающего свет белка a/b, связывающегося с хлорофиллом (см. Shiina с соавт., 1997). Родственный myb промотор (Atmyb5) гена Arabidopsis thaliana, описанный Li с соавт. (1996), является специфичным для листьев. Промотор Atmyb5 экспрессируется в процессе развития листовых трихом, прилистников и эпидермальных клеток на краях молодой розетки и стеблевых листьях, а также в незрелых семенах. Кроме того, может использоваться листовой промотор, идентифицированный в маисе Busk с соавт. (1997).

В некоторых случаях, например, если LEC2 или BBM рекомбинантно экспрессируется, может быть желательным, чтобы трансген не экспрессировался с высокими уровнями. Примером промотора, который может использоваться в таких случаях, является укороченный промотор напина A, который сохраняет специфичный для семени характер экспрессии, но со сниженным уровнем экспрессии (Tan с соавт., 2011).

5' Нетранслируемые лидерные последовательности могут быть получены промотором, выбранного для экспрессии последовательности гетерологичного гена полинуклеотида по настоящему изобретению, или могут быть гетерологичными относительно участка кодирования фермента, который должен вырабатываться, и могут быть специфично модифицированы, при желании, с целью увеличения трансляции иРНК. Обзор оптимизации экспрессии трансгенов см. в Koziel с соавт. (1996). 5' Нетранслируемые участки также могут быть получены из РНК вирусов растений (среди прочего, вирус мозаики табака, вирус гравировки табака, вирус карликовой мозаики маиса, вирус мозаики люцерны), из пригодных эукариотных генов, растительных генов (лидер гена белка a/b, связывающегося с хлорофиллом, пшеницы и маиса) или из синтетической последовательности гена. Настоящее изобретение не ограничивается конструкциями, в которых нетранслируемый участок получен из 5' нетранслируемой последовательности, которая сопровождает последовательность промотора. Дополнительно, лидерная последовательность может происходить от постороннего промотора или кодирующей последовательности. Лидерные последовательности, пригодные по форме и содержанию для настоящего изобретения, включают лидер Hsp70 маиса (US 5362865 и US 5859347) и элемент омега вируса мозаики табака (ВМТ).

Терминация транскрипции достигается с помощью 3' нетранслируемой последовательности ДНК, функционально связанной в векторе экспрессии с целевым полинуклеотидом. 3' Нетранслируемый участок рекомбинантной молекулы ДНК содержит сигнал полиаденилирования, функция которого в растениях состоит в присоединении аденилатных нуклеотидов к 3' концу РНК. 3' Нетранслируемый участок может быть получен из различных генов, которые экспрессируются в клетках растения. В данном случае обычно используются 3' нетранслируемые участки синтетазы нопалина, 3' нетранслируемый участок маленькой субъединицы гена РУБИСКО гороха, 3' нетранслируемый участок соевого гена запасаемого белка 7S семени. Кроме того, пригодными являются 3' транскрибированные, нетранслируемые участки, содержащие полиаденилатный сигнал индуцирующих опухоль (ИО) генов плазмиды Agrobacterium.

Рекомбинантные технологии ДНК могут использоваться для улучшения экспрессии трансформированного полинуклеотида посредством манипуляции, например, эффективностью, с которой транслируются образующиеся в результате транскрипты, путем оптимизации кодонов согласно виду клетки-хозяина или делеции последовательностей, которые дестабилизируют транскрипты, и эффективностью посттрансляционных модификаций.

Транспортные нуклеиновые кислоты

Транспортные нуклеиновые кислоты могут использоваться для доставки экзогенного полинуклеотида в клетку и содержат одну, предпочтительно, две граничные последовательности и один или более целевые полинуклеотиды. Транспортная нуклеиновая кислота может кодировать или не кодировать селекционный маркер. Предпочтительно, транспортная нуклеиновая кислота формирует часть бинарного вектора в клетке бактерии, причем бинарный вектор дополнительно содержит элементы, которые позволяют репликацию вектора у бактерии, селекцию или поддержание бактериальных клеток, содержащих бинарный вектор. При переносе в эукариотную клетку, компонент транспортной нуклеиновой кислоты бинарного вектора способен к интеграции в геном эукариотной клетки или пригоден для экспериментов с временной экспрессией, только с экспрессией в клетке.

В настоящем документе термин «внехромосомная транспортная нуклеиновая кислота» обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна к перемещению из бактерии, например, вида Agrobacterium, в эукариотную клетку, например, клетку листа растения. Внехромосомная транспортная нуклеиновая кислота представляет собой генетический элемент, который известен, как элемент, способный к перемещению, с последующей интеграцией с нуклеотидной последовательностью, содержащейся в пределах его границ, в геном клетки-реципиента. В данном отношении, транспортная нуклеиновая кислота фланкирована обычно двумя «граничными» последовательностями, хотя в некоторых случаях может использоваться одна граница на одном конце, и второй конец транспортной нуклеиновой кислоты генерируется случайным образом в процессе переноса. Целевой полинуклеотид обычно размещается между левой, подобной границе, последовательностью и правой, подобной границе, последовательностью транспортной нуклеиновой кислоты. Полинуклеотид, содержащийся в пределах транспортной нуклеиновой кислоты, может быть функционально связан со множеством других промоторных и терминаторных регуляторных элементов, которые облегчают его экспрессию, т. е., транскрипцию и/или трансляцию полинуклеотида. Транспортные ДНК (Т-ДНК) видов Agrobacterium, например, Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes, и созданные человеком их варианты/мутанты, вероятно, представляют собой лучше всего описанные примеры транспортных нуклеиновых кислот. Другой пример представляет собой Р-ДНК («растительная ДНК»), которая содержит подобные границе последовательности T-ДНК из растений.

В настоящем документе «T-ДНК» обозначает T-ДНК ОИ плазмиды Agrobacterium tumefaciens или из плазмиды Ri Agrobacterium rhizogenes, или их варианты, функция которых состоит в переносе ДНК в растительные клетки. T-ДНК может содержать полноразмерную T-ДНК, включая как правую, так и левую граничные последовательности, но необходимыми являются только минимальные последовательности, необходимые в цис для переноса, т. е., правая T-ДНК граничная последовательность. Т-ДНК по изобретению имеют вставленный в них где-либо между правой и левой граничными последовательностями (если они присутствуют) целевой полинуклеотид. Последовательности, кодирующие факторы, необходимые в транс для переноса T-ДНК в растительную клетку, например, гены vir, могут быть вставлены в T-ДНК или могут присутствовать на том же репликоне, что и T-ДНК, или предпочтительно находятся в транс на совместимом репликоне в хозяине Agrobacterium. Такие «системы бинарного вектора» хорошо известны из уровня техники. В настоящем документе «П-ДНК» обозначает транспортную нуклеиновую кислоту, выделенную из генома растения или ее варианты/мутанты, созданные человеком, и содержит на каждом конце или только на одном конце подобную граничной последовательность T-ДНК.

В настоящем документе «граничная» последовательность транспортной нуклеиновой кислоты может быть выделена из выбранного организма, например, растения или бактерии, или представлять собой ее вариант/мутант, созданный человеком. Граничная последовательность способствует и облегчает перенос полинуклеотида, с которым она связана, и может облегчить его интеграцию в геном клетки-реципиента. В варианте реализации длина граничной последовательности составляет 10-80 пар оснований. Граничные последовательности T-ДНК видов Agrobacterium хорошо известны из уровня техники и включают раскрытые Lacroix с соавт. (2008).

Хотя традиционно использовались только виды Agrobacterium для переноса генов в клетки растений, в настоящее время идентифицировано/разработано большое число систем, которые функционируют подобным видам Agrobacterium способом. В последнее время несколько видов, не относящихся к Agrobacterium, были генетически модифицированы таким образом, чтобы сделать их компетентными для переноса гена (Chung с соавт., 2006; Broothaerts с соавт., 2005). Они включают вид Rhizobium NGR234, Sinorhizobium meliloti и Mezorhizobium loti.

Прямой перенос эукариотных экспрессионных плазмид от бактерий эукариотным хозяевам впервые был осуществлен несколько десятилетий тому назад слиянием клеток млекопитающего и протопластов несущей плазмиду Escherichia coli (Schaffner, 1980). С того времени, количество бактерий, способных доставлять гены в клетки млекопитающего, устойчиво возрастало (Weiss, 2003), будучи обнаружено четырьмя независимыми группами (Sizemore с соавт. 1995; Courvalin с соавт., 1995; Powell с соавт., 1996; Darji с соавт., 1997).

В настоящем документе термины «трансфекция», «трансформация» и их вариации, в общем, используются равнозначно. «Трансфицированными» или «трансформированными» клетками можно манипулировать с целью введения целевого полинуклеотида(ов) или получения из них клеток-потомков.

Рекомбинантные клетки

В изобретении также раскрывается рекомбинантная клетка, например, рекомбинантная растительная клетка или грибковая клетка, которая является клеткой-хозяином, трансформированной одним или более полинуклеотидов или векторов, раскрытых в настоящем документе, или их комбинацией. Пригодные клетки согласно изобретению включают любую клетку, которая может быть трансформирована полинуклеотидом или рекомбинантным вектором по изобретению, кодирующим РНК, полипептид или фермент, раскрытые в настоящем документе. Клетка представляет собой клетку, которая, таким образом, пригодна к использованию для получения липида. Рекомбинантная клетка может быть клеткой в культуре, клеткой in vitro или в организме, например, таком как растение, или в органе, например, таком как семя или лист. Предпочтительно, клетка находится в растении, более предпочтительно в семени растения. В одном варианте реализации рекомбинантная клетка представляет собой клетку, не являющуюся клеткой человека.

Клетки-хозяева, в которые введен(ы) полинуклеотид(ы), могут быть нетрансформированными клетками или клетками, которые уже трансформированы по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой. Такие нуклеиновые кислоты могут быть связаны или не связаны с синтезом липида. Клетки-хозяева по настоящему изобретению могут быть эндогенно (т. е., от природы) способны к выработке полипептида(ов), раскрытого в настоящем документе, когда рекомбинантная клетка, полученная из них, обладает повышенной способностью к выработке полипептида(ов) или может быть способна к выработке указанного(ых) полипептида(ов) только после трансформации по меньшей мере одним полинуклеотидом по изобретению. В варианте реализации рекомбинантная клетка по изобретению обладает повышенной способностью к выработке неполярного липида, такого как ТАГ.

Клетки-хозяева по настоящему изобретению могут представлять собой любую клетку, способную к выработке по меньшей мере одного белка, раскрытого в настоящем документе, и включают клетки грибов (в том числе, дрожжей), животных, таких как членистоногие, и растительные клетки, такие как клетки водорослей и растений. В предпочтительном варианте реализации растительная клетка представляет собой клетку семени, в частности, клетку в семядоле или эндосперме семени. Клетки-хозяева могут быть организмом, пригодным для процесса ферментации, например, таким как Yarrowia lipolytica или другие дрожжи. В одном варианте реализации изобретения клетка представляет собой клетку животного. Клетка животного может принадлежать к любому виду животного, например, клетка животного, не относящегося к человеческому роду, клетка позвоночного, не относящегося к человеческому роду, клетка млекопитающего, не относящегося к человеческому роду, или клетки водных животных, например, рыб или ракообразных, беспозвоночных, насекомых и т. п. Примеры клеток водорослей, пригодных в качестве клеток-хозяев по настоящему изобретению, включают, например, виды Chlamydomonas (например, Chlamydomonas reinhardtii), виды Dunaliella, виды Haematococcus, виды Chlorella, виды Thraustochytrium, виды Schizochytrium и виды Volvox.

Трансгенные растения

В изобретении также раскрывается растение, содержащее один или более экзогенных полинуклеотидов или полипептидов и одну или более генетических модификаций по изобретению, клетки по изобретению, вектор по изобретению или их комбинации. Термин «растение» в роли имени существительного обозначает цельные растения, тогда как термин «его часть» обозначает органы растения (например, листья, стебли, корни, цветки, плод), одинарные клетки (например, пыльца), семя, части семени, например, зародыш, эндосперм, щиток зародыша или оболочку семени, ткань растения, например, сосудистую ткань, растительные клетки и их потомки. В настоящем документе части растения включают растительные клетки.

В настоящем документе термин ʺв растенииʺ, в контексте модификации растения означают, что модификация произошла по меньшей мере в одной части растения, включая ситуации, в которых модификация произошла во всем растению, и не исключая ситуаций, в которых модификация происходит только в одной или нескольких, но не во всех частях растения. Например, говорят, что тканеспецифичный промотор экспрессируется ʺв растенииʺ, даже если он может экспрессироваться только в некоторых частях растения. Аналогично, ʺполипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растенииʺ означает, что повышенная экспрессия присутствует по меньшей мере в части растения.

В настоящем документе термин «растение» применяется в самом широком смысле, включая любой организм из царства растений. Кроме того, он включает красные и коричневые водоросли, а также зеленые водоросли. Он включает, без ограничений, любые виды цветковых растений, травы, сельскохозяйственной культуры или злака (например, масличная культура, маис, соя), кормового или силосного, фруктового или овощного растения, травянистого растения, деревянистого растения или дерева. Не подразумевается ограничения растения какой-либо конкретной структурой. Кроме того, он обозначает одноклеточное растение (например, микроводоросль). Термин «его часть» со ссылкой на растение обозначает растительную клетку и ее потомка, множество клеток растения, структуру, которая присутствует на любой стадии развития растения или ткани растения. Такие структуры включают, без ограничений, листья, стебли, цветки, плоды, орехи, корни, семя, оболочку семени, зародыши. Термин «ткань растения» включает дифференцированные и недифференцированные ткани растений, в том числе, присутствующие в листьях, стеблях, цветках, плодах, орехах, корнях, семени, например, зародышевая ткань, эндосперм, ткань кожуры (например, эпидермис, перидерма), сосудистая ткань (например, ксилема, флоэма) или донная ткань (содержащая клетки паренхимы, колленхимы и/или склеренхимы), а также клетки в культуре (например, одинарные клетки, протопласты, каллюс, зародыши, и т. п.). Ткань растения может находиться in planta, в культуре органа, культуре ткани или культуре клеток.

В настоящем документе термин «вегетативная ткань» или «вегетативная часть растения» обозначает любую ткань растения, орган или часть, кроме органов для полового воспроизводства растений. В частности, органы для полового воспроизводства растений представляют собой несущие семена органы, цветки, пыльцу, плоды и семена. Вегетативные ткани и части включают по меньшей мере листья, стебли (в том числе, стрелки и побеги, за исключением головок), клубни и корни растения, за исключением цветков, пыльцы, семени, включая оболочку семени, зародыша и эндосперма, плода, включая ткани мезокарпа, несущие семя стручки и несущие семя головки. В одном варианте реализации изобретения вегетативная часть растения представляет собой воздушную часть растения. В другом или дальнейшем варианте реализации изобретения вегетативная часть растения представляет собой зеленую часть, например, лист или стебель.

«Трансгенное растение» или его вариации обозначают растение, которое содержит трансген, не найденный в растении дикого типа такого же вида, подвида или сорта. Трансгенные растения, раскрытые в контексте настоящего изобретения, включают растения и их потомков, генетически модифицированных с применением рекомбинантных методов, чтобы вызывать выработку по меньшей мере одного полипептида, раскрытого в настоящем документе, в желательном растении или его части. Трансгенные части растения имеют соответствующее значение.

Термины «семя» и «зерно» используются равнозначно в настоящем документе. «Зерно» обозначает зрелое зерно, например, собранное в процессе сбора урожая зерно, или зерно, которое находится на растении, но готово для сбора урожая, а также может обозначать зерно после набухания или прорастания, согласно контексту. Зрелое зерно обычно содержит менее чем приблизительно 18% влаги. В предпочтительном варианте реализации, содержание влаги в зерне находится на уровне, который в общем расценивается как безопасный для хранения, предпочтительно, от 5% до 15%, от 6% до 8%, от 8% до 10% или от 10% до 15%. В настоящем документе «развивающееся семя» обозначает семя до состояния зрелости, обычно найденное в репродуктивных структурах растения после оплодотворения или цветения, но может также обозначать семена до состояния зрелости, которые сняты с растения. Зрелое семя обычно содержит менее чем приблизительно 12% влаги

В настоящем документе термин «запасающий орган растения» обозначает часть растения, специализирующуюся на хранении энергии, например, в форме белков, углеводов, липида. Примерами запасающих органов растения являются семя, плод, клубневидные корни и клубни. Предпочтительным запасающим органом растения по изобретению является семя.

В настоящем документе термин «фенотипически нормальный» обозначает генетически модифицированное растение или его часть, например, трансгенное растение, или запасающий орган, такой как семя, клубень или плод по изобретению, без существенного снижения способности к росту и воспроизводству, по сравнению с немодифицированным растением или его частью. Предпочтительно, биомасса, темпы роста, скорость прорастания, размер запасающего органа, размер семени и/или количество образовавшихся жизнеспособных семян составляет не менее 90% от показателей растения, не содержащего указанных генетических модификаций или экзогенных полинуклеотидов, при выращивании в идентичных условиях. Данный термин не включает признаков растения, которые могут отличаться от растения дикого типа, но которые не влияют на полноценность растения с точки зрения коммерческих целей, например, такие как фенотип балерины листьев саженца. В варианте реализации генетически модифицированное растение или его часть, которые являются фенотипически нормальными, содержат рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий подавляющий сайленсинг, функционально связанный с промотором, специфичным для запасающего органа растения, и обладают способностью к росту или воспроизводству, по существу такой же как соответствующее растение или его часть, не содержащие указанного полинуклеотида.

В настоящем документе "начало цветения" или ʺнаступление цветенияʺ со ссылкой на растение обозначает время раскрытия первого цветка на растении или время начала пыления.

В настоящем документе термин "завязывание семян" со ссылкой на несущее семена растение обозначает время, когда первое семя растения достигает зрелости. Обычно это можно определить по цвету семени или содержанию в нем влаги, как хорошо известно из уровня техники.

В настоящем документе термин "старениеʺ со ссылкой на цельное растение обозначает конечную стадию развития растения, которая следует за завершением роста, обычно после того, как воздушная биомасса или высота растения достигает максимума. Старение начинается, когда воздушная биомасса растения достигает максимума, и ее количество начинает уменьшаться, и в общем заканчивается с гибелью большинства тканей растения. В ходе данной стадии растение мобилизует и рециклизует клеточные компоненты из листьев и других частей, которые накапливались в процессе роста, в другие части, чтобы завершить репродуктивное развитие. Старение представляет собой сложный, регулируемый процесс, в который вовлечена экспрессия новых генов или повышенная экспрессия некоторых генов. Часто, некоторые части растения стареют, в то время как другие части того же растения продолжают расти. Таким образом, относительно листа растения или другого зеленого органа, термин ʺстарениеʺ в настоящем документе обозначает время, когда количество хлорофилла в листе или органе начинает снижаться. Старение обычно сопровождается обезвоживанием листа или органа, по большей части в последней стадии старения. Старение обычно можно определить по изменению цвета листа с зеленого по направлению к желтому и, в конечном счете, к коричневому окрашиванию после полного обезвоживания. Считается, что клеточное старение лежит в основе старения растения и органов.

Растения, раскрытые или предусмотренные для применения в практике настоящего изобретения, включают однодольные или двудольные. В предпочтительных вариантах реализации, растения по настоящему изобретению представляют собой сельскохозяйственные растения (например, злаковые и зернобобовые, маис, пшеницу, различные виды картофеля, рис, сорго, пшено, маниок, ячмень), или другие растения из семейства бобовых, такие как соя, бобы или горох. Растения могут выращиваться для производства съедобных корней, клубней, листьев, стеблей, цветков или плодов. Растения могут быть овощными растениями, вегетативные части которых используются в пищу. Растения по изобретению могут представлять собой: Acrocomia aculeata (макаубская пальма), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (арахис), Astrocaryum murumuru (мурумуру), Astrocaryum vulgare (тукума), Attalea geraensis (атталия), Attalea humilis (американская масличная пальма), Attalea oleifera (андайя), Attalea phalerata (урикури), Attalea speciosa (бабассу), Avena sativa (овес), Beta vulgaris (сахарная свекла), виды Brassica, такие как Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (рапс), Camelina sativa (ложный лен), Cannabis sativa (конопля), Carthamus tinctorius (сафлор красильный), Caryocar brasiliense (пекви), Cocos nucifera (кокос), Crambe abyssinica (абиссинская капуста), Cucumis melo (дыня), Elaeis guineensis (африканская пальма), Glycine max (соя), Gossypium hirsutum (хлопчатник), виды Helianthus, такие как Helianthus annuus (подсолнечник), Hordeum vulgare (ячмень), Jatropha curcas (лечебный орех), Joannesia princeps (лещина арара), виды Lemna (ряска), такие как Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (ряска горбатая), Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida (ойтика), Linum usitatissimum (лен), Lupinus angustifolius (люпин), Mauritia flexuosa (пальма бурити), Maximiliana maripa (пальма инайя), виды Miscanthus, такие как Miscanthus x giganteus и Miscanthus sinensis, виды Nicotiana (табак), такие как Nicotiana tabacum или Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (бакаба-до-азейте), Oenocarpus bataua (патайя), Oenocarpus distichus (бакаба-де-лек), виды Oryza (рис), такие как Oryza sativa и Oryza glaberrima, Panicum virgatum (просо прутьевидное), Paraqueiba paraensis (марь), Persea amencana (авокадо), Pongamia pinnata (индийский бук), Populus trichocarpa, Ricinus communis (клещевина), виды Saccharum (сахарный тростник), Sesamum indicum (кунжут), Solanum tuberosum (картофель), виды Sorghum, такие как Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (какао), виды Trifolium, Trithrinax brasiliensis ((бразильская игольчатая пальма), виды Triticum (пшеница), такие как Triticum aestivum, Zea mays (кукуруза), люцерна (Medicago sativa), рожь (Secale cerale), сладкий картофель (Lopmoea batatus), маниок (Manihot esculenta), кофе (виды Cofea), ананас (Anana comosus), цитрусовое дерево (виды Citrus), какао (Theobroma cacao), чай (Camellia senensis), банан (виды Musa), авокадо (Persea americana), инжир (Ficus casica), гуава (Psidium guajava), манго (Mangifer indica), олива (Olea europaea), папайя (Carica papaya), кешью (Anacardium occidentale), макадамия (Macadamia intergrifolia) и миндаль (Prunus amygdalus).

Другие предпочтительные растения включают травы C4, например, в дополнение к упомянутым выше, Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula, B. gracilis, Buchloe dactyloides, Schizachyrium scoparium, Sorghastrum nutans, Sporobolus cryptandrus; травы C3, например, Elymus canadensis, бобы Lespedeza capitata и Petalostemum villosum, полукустарник Aster azureus; и древесные растения, например, Quercus ellipsoidalis и Q. macrocarpa. Другие предпочтительные растения включают травы C3.

В предпочтительном варианте реализации изобретения растение представляет собой покрытосеменное растение.

В варианте реализации изобретения растение представляет собой растение масличной культуры, предпочтительно сельскохозяйственной масличной культуры. В настоящем документе «растение масличной культуры» представляет собой вид растения, используемый для коммерческого получения липида из семян растения. Растение масличной культуры может представлять собой, например, масличный рапс (например, рапс), маис, подсолнечник, сафлор красильный, сою, сорго, лен (семя льна) или сахарную свеклу. К тому же, растение масличной культуры может быть другим представителем Brassica, хлопчатником, арахисом, маком, брюквой, горчицей, клещевиной, кунжутом, сафлором, Jatropha curcas или орехоносным растением. Растение может вырабатывать высокие уровни липида в плоде, например, олива, масличная пальма или кокосовая пальма. Садовые растения, к которым может быть применено настоящее изобретение, представляют собой салат, эндивий или растения вида Brassica, включая капусту, брокколи или цветную капусту. Настоящее изобретение может быть применено к табаку, тыквам, моркови, землянике, помидору или перцу.

В предпочтительном варианте реализации трансгенное растение является гомозиготным по всем и каждому гену, который введен (трансген), таким образом, что его потомок, не отходит от желательного фенотипа. Кроме того, трансгенное растение может быть гетерозиготным по введенному(ым) трансгену(ам), предпочтительно однородно гетерозиготным по трансгену, например, в потомстве F1, выращенном из гибридного семени. Такие растения могут предлагать преимущества, например, силу гибрида, хорошо известную из уровня техники.

Трансформация растений

Трансгенные растения могут быть получены с применением методов, известных из уровня техники, например, раскрытых в общих чертах в Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), и Christou and Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).

В настоящем документе термин «стабильно трансформирующий», «стабильно трансформированный» и его вариации обозначают интеграцию полинуклеотида в геном клетки таким образом, что он передается клеткам-потомкам в процессе деления клетки, без необходимости в положительной селекции на предмет их присутствия. Стабильные трансформанты или их потомки могут быть идентифицированы любыми средствами, известными из уровня техники, например, Саузерн-блоттингом на хромосомной ДНК или гибридизацией геномной ДНК in situ, которые позволяют осуществить их отбор.

Опосредованный Agrobacterium перенос представляет собой широко применимую систему для введения генов в растительные клетки, поскольку ДНК может быть введена в клетки цельных тканей растения, органов растения или эксплантов в культуре ткани, для временной экспрессии или стабильной интеграции ДНК в геном растительной клетки. Например, можно применять способы с погружением цветков (в полевых условиях). Применение опосредованных Agrobacterium векторов интеграции в растения с целью введения ДНК в растительные клетки хорошо известно из уровня техники. Участок ДНК для переноса определяется последовательностями границы, и перенесенная ДНК (T-ДНК) обычно вставляется в геном растения. Данный способ является способом выбора вследствие простой и надежной природы переноса гена.

Способы ускорения, которые могут применяться, включают, например, баллистическую трансфекцию и т. п. Одним из примеров способа доставки трансформирующих молекул нуклеиновых кислот в растительные клетки является баллистическая трансфекция. Данный способ рассмотрен Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Небиологические частицы (микрочастицы), которые могут быть покрыты нуклеиновыми кислотами и доставлены в клетки, например, незрелых эмбрионов, толкающей силой. Примеры частиц включают состоящие из вольфрама, золота, платины и т.п.

В другом способе пластиды могут быть стабильно трансформированы. Способы, раскрытые для трансформации пластиды в высших растениях, включают доставку с помощью пистолета частицы ДНК, содержащей селекционный маркер, и нацеливание ДНК на геном пластиды посредством гомологичной рекомбинации (US 5451513, US 5545818, US 5877402, US 5932479 и WO 99/05265). Дополнительно, могут применяться другие способы трансформации клетки, которые включают, без ограничений, введение ДНК в растения прямым переносом ДНК в пыльцу, прямой инъекцией ДНК в репродуктивные органы растения или прямой инъекцией ДНК в клетки незрелых зародышей, с последующей регидратацией высушенных зародышей.

Регенерация, развитие и культивирование растений из единичных трансформантов протопласта растения или из различных трансформированных эксплантов хорошо известны из уровня техники (Weissbach с соавт., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)). Такая регенерация и процесс роста обычно включают стадии селекции трансформированных клеток, культивирования таких индивидуализированных клеток через обыкновенные стадии зародышевого развития, включая стадию укоренившегося сеянца. Трансгенные зародыши и семена регенерируют подобным образом. Полученные трансгенные укоренившиеся побеги в дальнейшем пересаживают в пригодную среду для роста растения, например, грунт.

Развитие или регенерация растений, содержащих чужеродный, экзогенный ген, хорошо известны из уровня техники. Предпочтительно, регенерирующиеся растения самоопыляются, чтобы обеспечить гомозиготные трансгенные растения. В другом случае, пыльцу, полученную от регенерирующих растений, скрещивают с выращенными из семени растениями важных с агрономической точки зрения линий. С другой стороны, пыльца растений таких важных линий используется для опыления регенерированных растений. Трансгенное растение по настоящему изобретению, содержащее желательный полинуклеотид, культивируют с использованием способов, хорошо известных специалисту в данной области.

Чтобы подтвердить присутствие трансгенов в трансгенных клетках и растениях, может быть осуществлена амплификация полимеразной цепной реакцией (ПЦР) или анализ методом Саузерн-блоттинга, с применением методов, известных специалистам из уровня техники. Продукты экспрессии трансгенов могут быть обнаружены любым из множества путей, в зависимости от природы продукта, которые включают Нозерн-блоттинг гибридизацию, Вестерн-блоттинг и ферментный анализ. Как только трансгенные растения получены, они могут выращиваться для получения тканей или частей растения, содержащих желательный фенотип. Урожай ткани растения или частей растения может быть собран, и/или семена могут быть собраны. Семя может служить источником для выращивания дополнительных растений с тканями или частями, обладающими желательными характеристиками. Предпочтительно, урожай вегетативных частей растения собирают в то время, когда выход неполярных липидов находится на самом высоком уровне. В одном варианте реализации урожай вегетативных частей растения собирают во время, близкое к цветению или после начала цветения. Предпочтительно, части растения собирают в период около начала старения, на который обычно указывает пожелтение и высыхание листьев.

Трансгенные растения, полученные с использованием Agrobacterium или других способов трансформации, обычно содержат единственный генетический локус на одной хромосоме. Такие трансгенные растения могут обозначаться как гемизиготные по дополнительному(ым) гену(ам). Более предпочтительным является трансгенное растение, гомозиготное по дополнительному(ым) гену(ам), т. е. трансгенное растение, которое содержит два дополнительных гена, по одному гену в одинаковых локусах на каждой хромосоме из пары хромосом. Гомозиготное трансгенное растение может быть получено путем самооплодотворения гемизиготного трансгенного растения, проращиванием части полученных семян и анализом полученных растений на предмет присутствия целевого гена.

Кроме того, необходимо понимать, что два различных трансгенных растения, которые содержат два независимо разделенных экзогенных гена или локуса, могут быть скрещены (получен гибрид), с целью получения потомства, содержащего оба набора генов или локусов. Самоопыление подходящего потомка F1 может давать растения, гомозиготные по обоим экзогенным генам или локусам. Обратное скрещивание с материнским растением и скрещивание с нетрансгенным растением также предусмотрены, как и вегетативное размножение. Подобным образом, трансгенное растение может быть скрещено со вторым растением, содержащим генетическую модификацию, такую как мутантный ген, с идентификацией потомства, содержащего как трансген, так и генетическую модификацию. Описание других способов разведения, которые обычно применяются для различных признаков и сельскохозяйственных культур, можно найти в Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

ИНЛПГ

В одном варианте реализации TILLING (Индуцированные Нацеливанием Локальные Повреждения В Геномах, ИНЛПГ) может применяться для получения растений, в которых эндогенные гены содержат мутацию, например, гены, кодирующие полипептид SDP1 или ТГД, пластидную GPAT, пластидную LPAAT, фосфатазу фосфатидиновой кислоты (PAP) или комбинацию двух или более из указанных компонентов. На первой стадии введение мутаций, например новых модификаций одинарных пар оснований, осуществляют в популяции растений посредством обработки семян (или пыльцы) химическим мутагеном, с последующим разведением растений до поколения, в котором мутации будут устойчиво наследоваться. ДНК извлекают и хранят семена всех членов популяции, чтобы создать ресурс, который может быть доступен повторно через некоторое время. Для анализа ИНЛПГ можно применить гетеродуплексные способы с использованием специфичных эндонуклеаз, с целью выявления однонуклеотидного полиморфизма (ОНП). В качестве альтернативы, секвенирование ДНК следующего поколения из пулов мутантных растений можно применять для идентификации мутаций в выбранном гене. Обычно, достигается частота мутаций один мутант на 1000 растений в популяции мутантных растений. С применением данного подхода может быть осуществлен скрининг многих тысяч растений для идентификации любого индивидуума с модификацией единственного основания, а также небольшими инсерциями или делециями (1-30 пар оснований) в любом гене или конкретном участке генома. ИНЛПГ дополнительно описана Slade и Knauf (2005) и Henikoff с соавт. (2004).

В дополнение к возможности эффективного обнаружения мутаций, высокопроизводительная технология ИНЛПГ идеальна для обнаружения природного полиморфизма. Таким образом, детальное исследование неизвестной гомологичной ДНК, образующей гетеродуплекс с известной последовательностью, выявляет количество и расположение полиморфных сайтов. Идентифицированы нуклеотидные модификации, а также инсерции и делеции небольшого размера, в том числе, по меньшей мере некоторые полиморфизмы количества повторов. Указанный признак получил название Ecotilling (Comai с соавт., 2004).

Редактирование генома с применением сайт-специфичных нуклеаз

Редактирование генома с применением сконструированных нуклеаз, таких как направляемые РНК эндонуклеазы или нуклеазы ДНК, состоящие из доменов связывания ДНК, специфичных для последовательности, слитых с неспецифичным модулем расщепления ДНК. Такие сконструированные нуклеазы дают возможность осуществлять эффективные и точные генетические модификации путем индукции направленных разрывов двухцепочечной ДНК, которые побуждают эндогенные клеточные механизмы восстановления ДНК клетки к восстановлению индуцированного разрыва. Такие механизмы включают, например, подверженное ошибкам негомологичное соединение концов (НГСК) и направляемое гомологией восстановление (НГВ).

В присутствии донорской плазмиды с удлиненными гомологичными плечами, НГВ может приводить к введению одного или нескольких трансгенов для коррекции или замены существующих генов. В отсутствии донорской плазмиды, НГСК-опосредованное восстановление дает незначительные инсерционные или делеционные мутации мишени, которые вызывают разрушение гена.

Сконструированные нуклеазы, пригодные для способов по настоящему изобретению, включают цинк-пальцевые нуклеазы (ЦПН), подобные активатору транскрипции (ПАТ) эффекторные нуклеазы (ПАТЭН) и нуклеазы типа CRISPR/Cas9.

Обычно кодирующие нуклеазу гены доставляются в клетки плазмидной ДНК, вирусными векторами или транскрибированной in vitro мРНК.

Цинк-пальцевая нуклеаза (ЦПН) содержит домен связывания с ДНК и домен расщепления ДНК, причем домен связывания с ДНК состоит по меньшей мере из одного «цинкового пальца» и функционально связан с доменом расщепления ДНК. Домен связывания с ДНК цинкового пальца расположен на N-конце белка, а домен расщепления ДНК расположен на C-конце указанного белка.

ЦПН должна содержать по меньшей мере один «цинковый палец». В предпочтительном варианте реализации изобретения ЦПН должна содержать по меньшей мере три «цинковых пальца», чтобы обладать достаточной специфичностью и быть пригодной для направленной генетической рекомбинации в клетке- или организме-хозяине. Обычно, специфичность ЦПН, содержащей более чем три «цинковых пальца», будет постепенно увеличиваться с наличием каждого дополнительного «цинкового пальца».

Домен «цинкового пальца» может происходить из любого класса или вида «цинковых пальцев». В конкретном варианте реализации изобретения домен «цинкового пальца» включает Cis2His2 тип «цинкового пальца», который в самом общем виде представлен, например, факторами транскрипции «цинкового пальца» TFIIIA или Sp1. В предпочтительном варианте реализации изобретения домен «цинкового пальца» включает три «цинковых пальца» типа Cis2His2. Распознавание ДНК и/или специфичность связывания ЦПН могут быть модифицированы с целью достижения целевой генетической рекомбинации на каком-либо выбранном сайте клеточной ДНК. Такая модификация может быть достигнута с применением известных методов молекулярной биологии и/или химического синтеза (см., например, Bibikova с соавт., 2002).

Домен расщепления ДНК ЦПН получают из класса неспецифичных доменов расщепления ДНК, например домен расщепления ДНК рестрикционного фермента типа II, например, FokI (Kim с соавт., 1996). Другие пригодные эндонуклеазы могут содержать, например, HhaI, HindIII, Nod, BbvCI, EcoRI, BglI и AlwI.

Подобная активатору транскрипции (ПАТ) эффекторная нуклеаза (ПАТЭН) содержит домен связывания с ДНК эффектора ПАТ и домен эндонуклеазы.

Эффекторы ПАТ представляют собой белки патогенных бактерий растения, которые впрыскиваются патогеном в растительную клетку, где они перемещаются к ядру и функционируют, как факторы транскрипции для активизации специфических генов растения. Первичная аминокислотная последовательность эффектора ПАТ диктует нуклеотидную последовательность, с которой он связывается. Таким образом, для эффекторов ПАТ могут быть предсказаны сайты-мишени, и эффекторы ПАТ могут быть сконструированы и сгенерированы для целей связывания с конкретными нуклеотидными последовательностями.

Слитые с эффектором ПАТ кодирующие последовательности нуклеиновых кислот представляют собой последовательности, кодирующие нуклеазу или часть нуклеазы, обычно неспецифический домен расщепления рестрикционной эндонуклеазы типа II, например, FokI (Kim с соавт., 1996). Другие пригодные эндонуклеазы могут содержать, например, HhaI, HindIII, Nod, BbvCI, EcoRI, BglI и AlwI. Тот факт, что некоторые эндонуклеазы (например, FokI) функционируют только в виде димеров, может быть с выгодой использован для повышения специфичности эффектора ПАТ в отношении мишени. Например, в некоторых случаях каждый мономер FokI может быть слит с последовательностью эффектора ПАТ, которая распознает другую последовательность мишени ДНК, и только в случае, когда два сайта распознавания находятся в непосредственной близости, неактивные мономеры сближаются настолько, чтобы совместно образовать функционирующий фермент. С включением необходимости в связывании с ДНК для активизации нуклеазы, может быть создан высокоспецифичный в отношении сайта рестрикционный фермент.

Специфичная для последовательности ПАТЭН может распознавать конкретную последовательность в пределах предварительно выбранной нуклеотидной последовательности-мишени, присутствующей в клетке. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность-мишень может быть просканирована на предмет наличия сайтов для распознавания нуклеазой, и конкретная нуклеаза может быть выбрана на основании последовательности мишени. В других случаях, может быть сконструирована ПАТЭН, нацеленная на конкретную клеточную последовательность.

Редактирование генома с применением программируемых РНК-направляемых ДНК эндонуклеаз

В отличие от сайт-специфичных нуклеаз, описанных выше, система кластеризованных, коротких палиндромных повторов с регулярными промежутками (ККППРП, CRISP)/Cas предлагает альтернативу ЦПН и ПАТЭН для индукции направленных генетических модификаций посредством направляемого РНК расщепления ДНК.

Системы ККППРП зависят от ККППРП РНК (ккРНК) и трансактивирующей химерной РНК (траккРНК) для осуществления специфичного для последовательности расщепления ДНК. Существует три вида систем ККППРП/Cas: в системах II типа Cas9 служит направляемой РНК ДНК эндонуклеазой, которая расщепляет ДНК при распознавании мишени ккРНК-траккРНК. Основание ККППРП РНК спаривается с траккРНК с образованием структуры из двух РНК, которая направляет Cas9 эндонуклеазы к комплементарным сайтам ДНК для расщепления.

Система ККППРП может быть доставлена в растительные клетки путем совместной доставки плазмид, экспрессирующих эндонуклеазу Cas и необходимые компоненты ккРНК. Эндонуклеаза Cas может быть превращена в никазу, чтобы обеспечить дополнительный контроль над механизмом восстановления ДНК (Cong с соавт., 2013).

ККППРП обычно представляют собой короткие, частично палиндромные последовательности размером 24-40 пар оснований, содержащие внутренние и концевые перевернутые повторы размером до 11 пар оснований. Хотя обнаружены изолированные элементы, в общем они организованы в кластеры (в количестве до около 20 или более на геном) повторяющихся фрагментов, разделенных уникальными последовательностями размером 20-58 пар оснований. В общем, ККППРП являются гомогенными в пределах конкретного генома, и большинство из них идентичны. Однако, существуют примеры гетерогенности, например, в Archaea (Mojica с соавт., 2000).

Биомасса растения

Повышение общего содержания липида в биомассе растения эквивалентно более высокому содержанию энергии, что делает ее применение в качестве корма (продукта питания) или фуража или для выработки биологического топлива более экономичным.

Основным компонентом природной биомассы растения являются углеводы (приблизительно 75%, в пересчете на массу сухого вещества) и лигнин (приблизительно 25%), который может варьировать в зависимости от вида растения. Углеводы в основном представляют собой целлюлозные или гемицеллюлозные волокна, которые придают прочность структуре растения, и лигнин, который удерживает волокна вместе. Биомассе растений обычно свойственна низкая плотность энергии в результате двух факторов: физической формы и содержания влаги. Это придает дополнительное неудобство и неэффективность ее хранению и транспортировке без какой-либо предварительной обработки.

Существует целый ряд доступных способов превращения ее в более пригодные формы, в том числе: 1) физическая предварительная обработка (например, размалывание), или 2) трансформация термическими (например, окисление, газификация, пиролиз) или химическими (например, анаэробное расщепление, ферментация, компостирование, переэтерификация) способами. Таким образом, биомассу превращают в то, что может быть описано, как топливная биомасса.

Сжигание

Сжигание представляет собой процесс, в ходе которого легковоспламеняющимся материалам позволяют гореть в присутствии воздуха или кислорода с высвобождением тепла. Основой процесса является окисление. Сжигание представляет собой самый простой способ использования биомассы для получения энергии и применяется для обеспечения теплом. Указанное тепло может непосредственно использоваться множеством способов: 1) нагревание пространства, 2) нагревание воды (или другой жидкости) для центрального или местного нагревания или переработки тепла, 3) получение пара для генерации электричества или движущей силы. Если легковоспламеняющийся горючий материал находится в форме биомассы, окисление касается, в основном, атомов углерода (C) и водорода (H) в целлюлозе, гемицеллюлозе, лигнине и других присутствующих молекулах, с образованием диоксида углерода (CO2) и воды (H2O). Растения по изобретению дают усовершенствованное топливо для сжигания благодаря повышенному содержанию липидов.

Газификация

Газификация представляет собой процесс частичного окисления, посредством которого источник углерода, например, биомасса растения, разлагается на монооксид углерода (CO) и водород (H2), плюс диоксид углерода (CO2) и, возможно, молекулы углеводорода, например, метана (CH4). Если газификация имеет место при относительно низкой температуре, например, от 700°C до 1000°C, газообразный продукт будет содержать относительно высокие уровни углеводородов, по сравнению с высокотемпературной газификацией. В результате, он может использоваться непосредственно для сжигания с целью получения тепла или генерации электричества с помощью паровой турбины или, при условии соответствующего удаления газа, в двигателе внутреннего сгорания для генерации электричества. Камера сжигания для простого парового котла может быть соединена с газификатором, или устройство для получения газа может очищаться от углеводородов с более длинной цепью (смолы), которые хранятся и сжигаются в другом месте. Система газификации может быть тесно связана с газовой турбиной комбинированного цикла для генерации электричества (КЦИГ - комбинированный цикл интегрированной газификации). Высокотемпературная газификация (от 1200°C до 1600°C) приводит к образованию нескольких углеводородов в газообразном продукте и более высокой доле CO и H2. Это известно как синтетический газ (сингаз или биосинтетический газ), который может использоваться для синтеза углеводородов с более длинной цепью, с применением таких методов, как синтез Фишера-Тропша (ФТ). При надлежащем соотношении H2 к CO (2:1), синтез ФТ может применяться для превращения синтетического газа в высококачественное синтетическое биологическое дизельное топливо, совместимое с обычными видами дизельного топлива из окаменелого сырья и дизельными двигателями.

Пиролиз

В настоящем документе термин «пиролиз» подразумевает процесс, в ходе которого используется медленное нагревание в отсутствие кислорода, с целью получения газообразных, нефтяных и угольных продуктов из биомассы. Пиролиз представляет собой термическое или термохимическое превращение материалов на основе липида, особенно на основе триглицерида. Продукты пиролиза включают газ, жидкость и твердый уголь, причем доля каждого зависит от параметров процесса. Более низкие температуры (около 400°C) показывают тенденцию к образованию более твердого угля (медленный пиролиз), тогда как несколько более высокие температуры (около 500°C) дают намного более высокую долю жидкости (бионефть), при условии, что продолжительность обработки паров удерживается на уровне до приблизительно 1 секунды или менее.

Температура от около 275°C до около 375°C может применяться для получения жидкой бионефти с более высоким относительным содержанием углеводородов с большей длиной цепи. Пиролиз включает прямой термической крекинг липидов или комбинацию термического и каталитического крекинга. При температурах приблизительно 400-500°C происходит крекинг, дающий углеводороды с короткой цепью, например, алканы, алкены, алкадиены, ароматические вещества, олефины и карбоновую кислоту, а также монооксид углерода и диоксид углерода.

Могут использоваться четыре основных типа катализатора, в том числе, катализаторы на основе переходного металла, катализаторы типа молекулярного сита, активизированный алюминия оксид и натрия карбонат (Maher с соавт., 2007). Примеры представлены в US 4102938. Алюминия оксид (Al2O3), активированный кислотой, представляет собой эффективный катализатор (US 5233109). Катализаторы типа молекулярного сита представляют собой пористые, высоко кристаллические структуры, которые демонстрируют избирательность в отношении размера, таким образом, что сквозь них могут проникать только молекулы определенных размеров. Они включают катализаторы на основе цеолита, например, ZSM-5 или HZSM-5, которые являются кристаллическими материалами, содержащими AlO4 и SiO4, и другие катализаторы на основе кремния диоксида-алюминия оксида. Активность и селективность указанных катализаторов зависит от кислотности, размера пор и формы пор, и обычно они активны при 300-500°C. Катализаторы на основе переходного металла раскрыты, например, в US 4992605. Катализатор на основе натрия карбоната использовали в пиролизе масел (Dandik и Aksoy, 1998).

В настоящем документе ʺгидротермическая обработкаʺ, ʺГТОʺ, дополнительно называемая ʺтермической деполимеризациейʺ представляет собой вид пиролиза, в ходе которого полученное из растения вещество, конкретно углеродсодержащий материал в полученном растение веществе, вводят в реакцию с водородом для получения продукта в форме бионефти, в основном состоящего из парафиновых углеводородов, наряду с другими газообразными и твердыми веществами. Значительное преимущество ГТО состоит в том, что нет необходимости сушить вегетативный растительный материал перед образованием композиции для введения в реакцию превращения, хотя вегетативный материал растения может быть предварительно высушен, чтобы упростить транспортировку или хранение биомассы. Биомасса может использоваться непосредственно после сбора урожая на поле. Реактор представляет собой любую емкость, способную выдерживать применяемую высокую температуру и давление и устойчивую к коррозии. Растворитель, применяемый для ГТО, содержит воду или полностью является водой или может содержать некоторые углеводородные соединения в форме масла. В общем, растворитель для ГТО не требует добавления спиртов. Реакция превращения может происходить в окислительном, восстановительном или инертном окружении. ʺОкислительныйʺ в настоящем документе означает присутствие воздуха, ʺвосстановительныйʺ означает присутствие восстановительного агента, обычно газообразного водорода или метана, например, 10-15% H2 и остальная часть газообразного N2, и ʺинертныйʺ означает присутствие инертного газа, такого как азот или аргон. Реакцию превращения предпочтительно осуществляют в восстановительных условиях. Углеродсодержащие материалы для превращения включают целлюлозу, гемицеллюлозу, лигнин и белки, а также липиды. Для процесса применяют температуру превращения от 270°C до 400°C и давление от 70 до 350 бар, обычно от 300°C до 350°C и 100-170 бар. В результате процесса образуются пары органических веществ, пиролизные газы и древесный уголь. Пары органических веществ конденсируют для получения бионефти. Извлечение бионефти может быть осуществлено путем охлаждения реактора и снижения давления до атмосферного, что позволяет образование бионефти (органическая) и водной фазы и извлечение бионефти из реактора.

Выход извлеченной бионефти вычисляют как процент от сухой массы исходной биомассы, в пересчете на сухую массу. Его вычисляют по формуле: масса бионефти x 100/сухая масса вегетативных частей растения. Масса бионефти не включает массу воды или твердых веществ, которые могут присутствовать в бионефтяной смеси и с легкостью удаляются фильтрацией или другими известными способами.

Далее бионефть можно разделить на фракции фракционной дистилляцией, с дополнительными процессами очистки или без них. Обычно, фракции, которые конденсируются при этих температурах, носят название: около 370°C, мазут; около 300°C, дизельное масло; около 200°C, керосин; около 150°C, газолин (бензин). Более тяжелые фракции можно расщеплять на более легкие, более желательные фракции, хорошо известные из уровня техники. Дизельное топливо обычно состоит из C13-C22 углеводородных соединений.

В настоящем документе ʺнефтяное дизельное топливоʺ (нефтедиз) обозначает дизельное топливо, полученное из окаменелого топлива, которое регламентируется спецификациями, установленными ASTM D975 в США и EN 590 в Европе. Термин ʺвозобновляемое дизельное топливоʺ в настоящем документе обозначает дизельное топливо, полученное из недавно живой биомассы (не окаменелого топлива), которое удовлетворяет требованиям ASTM D975 и не является моноалкиловыми эфирами. Типичными признаками возобновляемого дизельного топлива являются: цетановое число 75-90, плотность энергии приблизительно 44 МДж/кг, плотность приблизительно 0,78 г/мл, содержание энергии приблизительно 123 кБТЕ/галлон, уровни хлора менее чем 10 пропромилле, точка мутности ниже 0°C.

Переэтерификация

«Переэтерификация» в настоящем документе представляет собой превращение липидов, главным образом, триацилглицеридов, в метиловые эфиры или этиловые эфиры жирных кислот путем приведения в реакцию с короткоцепочечными спиртами, например, метанолом или этанолом, в присутствии катализатора, например, щелочи или кислоты. Метанол применяется чаще за счет низкой стоимости и доступности, однако могут применяться также этанол, пропанол или бутанол или их смеси. Катализаторы могут быть гомогенными катализаторами, гетерогенными катализаторами или ферментными катализаторами. Гомогенные катализаторы включают сульфат железа, и затем KOH. Гетерогенные катализаторы включают CaO, K3PO4 и WO3/ZrO2. Ферментные катализаторы включают Novozyme 435, получаемый из Candida antarctica.

Переэтерификация может осуществляться на экстрагированном масле или предпочтительно непосредственно in situ в вегетативном материале растения. Вегетативные части растения можно высушить и смолоть до использования, чтобы получить композицию для реакции превращения, но это не является необходимым. Преимущество прямого превращения в эфиры жирных кислот, предпочтительно МЭЖК, состоит в том, что для превращения можно применять более низкую температуру и давление, и несмотря на это получать высокий выход продукта, например, содержащего по меньшей мере 50% масс. МЭЖК. Выход извлекаемой посредством переэтерификации бионефти вычисляют так же, как и для процесса ГТО.

Получение неполярных липидов

Методы, которые рутинно применяются в уровне техники, могут применяться для извлечения, обработки, очистки и анализа липидов, таких как ТАГ, выработанных клетками, организмами или их частями по настоящему изобретению. Такие методы раскрыты и к ним дается пояснение в источниках литературы, например, Fereidoon Shahidi, Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc. (2001) D1.1.1-D1.1.11, и Perez-Vich с соавт. (1998).

Получение масла из вегетативных частей растения или семян

Обычно семена растения варят, прессуют и/или экстрагируют для получения неочищенного масла из семян, которое в дальнейшем дегуммируют, рафинируют, отбеливают и дезодорируют. В общем, методы измельчения семени известны из уровня техники. Например, семена масличных культур могут быть смягчены обрызгиванием их водой, чтобы увеличить содержание влаги, например, до 8,5%, и вальцуют, используя гладкий валик со щелью 0,23-0,27 мм. В зависимости от вида семени, вода может не добавляться до измельчения. Применение тепла инактивирует ферменты, облегчает дальнейшее разрушение клеток, слияние капелек липида и агломерацию частиц белка, что облегчает процесс экстракции.

В варианте реализации изобретения большая часть масла из семян высвобождается при прохождении через винтовой пресс. Жмых, выходящий из винтового пресса, в дальнейшем экстрагируют растворителем, например гексаном, с применением колонки с подводом тепла. Альтернативно, неочищенное масло из семян, полученное операцией прессования, может быть пропущено сквозь резервуар для отстаивания, оборудованный проволочным дренажным верхом, для удаления твердых веществ, которые сопровождают масло из семян в ходе операции прессования. Осветленное масло из семян может быть пропущено сквозь планшет и рамочный фильтр для удаления любых оставшихся тонких частиц твердого вещества. При желании, масло из семян, полученное в результате процесса экстракции, может быть объединено с осветленным маслом из семян для получения смеси неочищенного масла из семян.

Как только растворитель удаляют из неочищенного масла из семян, прессованные и экстрагированные части объединяют и обрабатывают обычными процедурами обработки липида (т.е., дегуммирование, рафинация каустической содой, обесцвечивание и дезодорирование).

Для экстракции липида из вегетативных частей растений по изобретению применяются способы, аналогичные известным из уровня техники для экстракции масла из семян. Один из путей представляет собой физическую экстракцию, которая часто исключает экстракцию растворителем. Экстракция с помощью шнекового пресса, как и способы экстракции с помощью винтового пресса и гидравлического пресса, представляет собой распространенный вид экстракции. Механическая экстракция обычно менее эффективна, чем экстракция растворителем, при которой органический растворитель (например, гексан) смешивают по меньшей мере с биомассой растения, предпочтительно после высушивания и перемалывания биомассы. Растворитель растворяет липид в биомассе и подобном материале, после чего раствор отделяют от биомассы механической операцией (например, с помощью описанных выше процессов прессования). Данная стадия отделения также может выполняться посредством фильтрации (например, с помощью пресс-фильтра или подобного устройства) или центрифугирования и т. п. В дальнейшем, органический растворитель может быть отделен от неполярного липида (например, дистилляцией). Вторая стадия разделения дает неполярный липид из растения и может давать повторно используемый растворитель, если он пригоден для традиционного сбора в виде паров. В варианте реализации изобретения содержание масла и/или белка в части растения или семени анализируют отражательной спектроскопией в ближней инфракрасной области, как раскрыто в Hom с соавт. (2007), до экстракции.

Если вегетативные части растения не будут использоваться для экстракции липида немедленно, их предпочтительно перерабатывают, чтобы максимально снизить содержание липида (см., например, Christie, 1993), например, сушкой вегетативных частей растения.

Дегуммирование

Дегуммирование является ранней стадией рафинирования масел, и его основная цель состоит в удалении из масла большинства фосфолипидов, которые могут присутствовать в количестве приблизительно 1-2% от общего экстрагированного липида. Добавление к неочищенному маслу ~2% воды, обычно содержащей фосфорную кислоту, при 70-80° C приводит к отделению большинства фосфолипидов, в сопровождении следовых количеств металлов и пигментов. Удаляемый нерастворимый материал, главным образом представляет собой смесь фосфолипидов и триацилглицеридов, и также известен как лецитин. Дегуммирование может осуществляться добавлением концентрированной фосфорной кислоты к неочищенному маслу из семян, чтобы перевести неспособные к гидратации фосфатиды в способную к гидратации форму, и к незначительному количеству присутствующих хелатов металлов. Смолу отделяют от масла из семян центрифугированием. Масло из семян может быть рафинировано добавлением достаточного количества раствора натрия гидроксида для титрования всех жирных кислот, с удалением образованного таким образом мыла.

Щелочная рафинация

Щелочная рафинация представляет собой один из процессов очистки для обработки неочищенного масла, иногда также называемый нейтрализацией. Она обычно следует за дегуммированием и предшествует обесцвечиванию. После дегуммирования масло из семян может быть обработано добавлением достаточного количества раствора щелочи, чтобы оттитровать все жирные кислоты и фосфорные кислоты, с последующим удалением образованного таким способом мыла. Пригодные щелочные материалы включают натрия гидроксид, калия гидроксид, натрия карбонат, лития гидроксид, кальция гидроксид, кальция карбонат и аммония гидроксид. Данный процесс обычно осуществляется при комнатной температуре и позволяет удалить фракцию свободных жирных кислот. Мыло удаляют центрифугированием или экстракцией растворителем мыла, и нейтрализованное масло промывают водой. При необходимости, любая дополнительная щелочь в масле может быть нейтрализована подходящей кислотой, например, хлористоводородной кислотой или серной кислотой.

Отбеливание

Отбеливание представляет собой процесс очистки, в ходе которого масла нагревают до 90-120°C, выдерживая при этой температуре в течение 10-30 минут в присутствии отбеливающей земли (0,2-2,0%) и в отсутствие кислорода, путем проведения операции в атмосфере азота, под струей пара или в вакууме. Данная стадия обработки масла введена с целью удаления нежелательных пигментов (каротиноиды, хлорофилл, госсипол и т.д.), и в ходе данного процесса также удаляются продукты окисления, следовые металлы, соединения серы и следы мыла.

Дезодорирование

Дезодорирование представляет собой обработку масел и жиров при высокой температуре (200-260°C) и низком давлении (0,1-1 мм рт. ст). Это обычно достигается посредством введения пара в масло из семян со скоростью приблизительно 0,1 мл/минуту/100 мл масла из семян. Дезодорирование может выполняться путем нагревания масла из семян до 260°C под вакуумом, с медленным введением пара в масло из семян со скоростью приблизительно 0,1 мл/минуту/100 мл масла из семян. Приблизительно через 30 минут обрызгивания, маслу из семян дают остыть под вакуумом. Масло из семян обычно переносят в стеклянную емкость и продувают аргоном перед хранением при сниженной температуре. Если количество масла из семян ограничено, масло из семян может быть размещено под вакуумом, например, в реакторе Парра, и нагрето до 260°C с выдерживанием в течение такого периода времени, чтобы запах был уничтожен. Такая обработка улучшает цвет масла из семян и удаляет большинство летучих веществ или пахучих соединений, включая любые оставшиеся свободные жирные кислоты, моноацилглицериды и продукты окисления.

Вымораживание

Вымораживание представляет собой процесс, иногда применяемый в коммерческом производстве масел для разделения масел и жиров на твердые (стеарин) и жидкие (олеин) фракции путем кристаллизации при температурах ниже температуры окружающей среды. Впервые он был применен к хлопковому маслу с целью получения свободного от твердых веществ продукта. Его обычно применяют для уменьшения содержания насыщенных жирных кислот в маслах.

Водоросли для получения липидов

За год водоросли могут образовывать массу, в 10-100 раз превышающую массу наземных растений, причем их можно выращивать в открытых водоемах (таких как водоемы по типу водоводов и озер) или в фотобиореакторах. Наиболее распространенные водоросли, вырабатывающие масло, в общем, могут включать диатомовые (бацилляриофиты), зеленые водоросли (хлорофиты), зелено-голубые водоросли (цианофиты) и коричнево-золотистые водоросли (хризофиты). Дополнительно, пятая группа, известная как гаптофитовые водоросли, может быть использована. Группы включают коричневые водоросли и гетероконты. Конкретные неограничивающие примеры водорослей включают Классы: Chlorophyceae, Eustigmatophyceae, Prymnesiophyceae, Bacillariophyceae. Bacillariophytes, способные к выработке масла, включают рода Amphipleura, Amphora, Chaetoceros, Cyclotella, Cymbella, Fragilaria, Hantzschia, Navicula, Nitzschia, Phaeodactylum и Thalassiosira. Конкретные неограничивающие примеры хлорофитов, способных к выработке масла, включают Ankistrodesmus, Botryococcus, Chlorella, Chlorococcum, Dunaliella, Monoraphidium, Oocystis, Scenedesmus и Tetraselmis. В одном из аспектов, хлорофиты могут представлять собой Chlorella или Dunaliella. Конкретные неограничивающие примеры цианофитов, способных к выработке масла, включают Oscillatoria и Synechococcus. Конкретный пример хризофитов, способных к выработке масла, включает Boekelovia. Конкретные неограничивающие примеры гаптофитовых водорослей включают Isochysis и Pleurochysis

Конкретные водоросли, пригодные в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, виды Chlamydomonas, например, Chlamydomonas reinhardtii, виды Dunaliella, например, Dunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, D. acidophila, D. Lateralis, D. martima, D. parva, D. polmorpha, D. primolecta, D. pseudosalina, D. Quartolecta, D. viridis, виды Haematococcus, виды Chlorella, такие как Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana или Chlorella protothecoides, виды Thraustochytrium, виды Schizochytrium, виды Volvox, виды Nannochloropsis, Botryococcus braunii, который может содержать более 60%, масс липида, Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira pseudonana, виды Isochrysis, виды Pavlova, виды Chlorococcum, виды Ellipsoidion, виды Neochloris, виды Scenedesmus.

Урожай водорослей по изобретению можно собирать с помощью микросит, центрифугирования, флоккуляции (с применением, например, хитозана, алюминиевых квасцов и хлорида железа) и пенной флотации. Прерывание потока диоксида углерода может вынудить водоросли выпасть хлопьями самим по себе, что называется «аутофлоккуляцией». При пенной флотации, фермер аэрирует воду в пену, а затем снимает водоросли с поверхности. Ультразвуковой и другие методы сбора урожая в настоящий момент разрабатываются.

Липид может быть экстрагирован из водорослей механическим измельчением. При высушивании водорослевая масса сохраняет содержание липида, который в дальнейшем может быть «выжат» с помощью масляного пресса. Кроме того, осмотический шок может быть применен для высвобождения клеточных компонентов, например, липида из водорослей, а извлечение с помощью ультразвука может ускорить процессы экстракции. Химические растворители (например, гексан, бензол, петролейный эфир) часто применяются для экстракции липидов из водорослей. Дополнительно, ферментная экстракция с применением ферментов для разложения клеточных стенок может применяться для извлечения липидов из водорослей. Кроме того, суперкритический CO2 может использоваться в качестве растворителя. В данном способе CO2 превращают в жидкость под давлением и нагревают до точки, в которой он становится суперкритическим (обладает свойствами как жидкости, так и газа), что дает ему возможность выполнять роль растворителя.

В настоящем документе «маслянистый организм» обозначает такой, который аккумулирует по меньшей мере 20% сухой массы в виде триацилглицеридов. В настоящем документе «дрожжи» включают виды Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, виды Candida, виды Kluveromyces, виды Pichia, виды Hansenula, виды Trichoderma, Lipomyces starkey и Yarrowia lipolytica. Предпочтительные дрожжи включают Yarrowia lipolytica или другие маслянистые дрожжи и штаммы видов Saccharomyces.

Применение растительных липидов

Липиды, полученные раскрытыми способами, находят множество применений. В некоторых вариантах реализации липиды используются в качестве пищевых масел. В других вариантах реализации липиды рафинируют и используют в качестве смазки или для других промышленных целей, например, синтеза пластмасс. В некоторых предпочтительных вариантах реализации липиды рафинируют для производства биодизельного топлива. Биодизельное топливо может быть получено из масел, получаемых из растений, водорослей и грибов по изобретению. Применение растительных триацилглицеридов для получения биологического топлива рассмотрено в Durrett с соавт. (2008). Полученное топливо обычно обозначается как биодизельное топливо и обладает динамическим интервалом вязкости 1,9-6,0 мм2с-1 (ASTM D6751). Биоспирт можно получить из сахаров биомассы, не принадлежащих к липидам, которые остаются после экстракции липида. Общие способы получения биологического топлива могут быть найдены, например, в Maher и Bressler, 2007; Greenwell с соавт., 2010; Karmakar с соавт., 2010; Alonso с соавт., 2010; Liu с соавт., 2010a. Gong и Jiang, 2011; Endalew с соавт., 2011; и Semwal с соавт., 2011.

В настоящем изобретении предлагаются способы повышения содержания масла в вегетативных тканях. Растения по настоящему изобретению содержат повышенное количество энергии в листьях и/или стеблях, таким образом, что цельные надземные части растения можно собирать и использовать для получения биотоплива. Кроме того, уровень олеиновой кислоты значительно повышен, притом, что уровень полиненасыщенной жирной альфа-линоленовой кислоты (АЛК) снижен. Таким образом, растения, морские водоросли и грибы по настоящему изобретению снижают затраты на производство биотоплива.

Биодизельное топливо

Производство биодизельного топлива или алкиловых эфиров хорошо известно. Существует три основных способа получения сложного эфира из липидов: 1) катализированная основанием переэтерификация липида с использованием спирта; 2) прямая, катализируемая кислотой этерификация липида с использованием метанола; и 3) превращение липида в жирные кислоты, а затем в алкиловые эфиры с помощью кислотного катализа Может применяться любой способ получения алкиловых эфиров и глицериловых эфиров жирных кислот (в ходе которого этерифицируются одна, две или три гидроксигруппы на глицерине). Жирные кислоты могут быть получены, например, гидролизом или омылением ТАГ с использованием кислотных или основных катализаторов, соответственно, или фермента, например, липазы или эстеразы. Алкиловые эфиры жирных кислот могут быть получены путем введения жирной кислоты в реакцию со спиртом в присутствии кислотного катализатора. Кроме того, алкиловые эфиры жирных кислот могут быть получены путем введения ТАГ в реакцию со спиртом в присутствии кислотного или основного катализатора.

Эфиры глицерина могут быть получены, например, введением глицерина в реакцию с алкилгалогенидом в присутствии основания или с олефином или спиртом в присутствии кислотного катализатора. Алкиловые эфиры могут быть непосредственно смешаны с дизельным топливом или промыты водой или другими водными растворами с целью удаления различных примесей, в том числе катализаторов, перед смешиванием.

Авиационное топливо

Для улучшения характеристик биотоплива разработаны технологии термического и каталитического расщепления (разрыва) химических связей, что позволяет превращать бионефть в биологические альтернативы полученному из нефть дизельному топливу и другим видам топлива, такие как реактивное топливо.

Применение источника среднецепочечных жирных кислот, такого как вырабатывается рекомбинантной эукариотной клеткой по изобретению, трансгенным организмом, не относящимся к человеческому роду, или его частью по изобретению, трансгенным растением или его частью по изобретению, семенем по изобретению или трансгенной клеткой или трансгенным растением или его частью по изобретению, предотвращает потребность в высоких энергиях для расщепления цепи жирной кислоты и получения более коротких молекул, необходимых для реактивного топлива и других видов топлива с требованиями низкой температуры потока. Данный способ включает отщепление одной или более групп среднецепочечных жирных кислотных от глицеридов с получением глицерина и одной или больше свободных жирных кислот. Кроме того, способ включает отщепление одной или более среднецепочечных жирных кислот от глицерина и декарбоксилирование одной или более среднецепочечных жирных кислот с получением одного или более углеводородов для выработки реактивного горючего.

Пищевые (кормовые) продукты

Настоящее изобретение включает составы, которые могут применяться в качестве пищевых (кормовых) продуктов. Для целей настоящего изобретения, «пищевые (кормовые) продукты» включают любой пищевой продукт или препарат для потребления человеком или животным, который служит целям питания или образования тканей или снабжения энергией, и/или сохраняет, восстанавливает или поддерживает соответствующий пищевой статус или метаболическую функцию. Пищевые (кормовые) продукты во изобретению включают питательные составы для младенцев и/или маленьких детей.

Пищевые (кормовые) составы по изобретению включают, например, клетку по изобретению, растение по изобретению, часть растения по изобретению, семя по изобретению, экстракт по изобретению, продукт способа по изобретению или состав вместе с пригодным(и) носителем(ями). Термин «носитель» используется в самом широком смысле и включает любой компонент, который может иметь или не иметь пищевой ценности. Как будет понятно специалисту в данной области, носитель должен быть пригодным для использования (или используемым в достаточно низкой концентрации) в пищевом (кормовом) продукте, таким образом, что он не оказывает вредного влияния на организм, который потребляет пищевой (кормовой) продукт.

Пищевой (кормовой) продукт по настоящему изобретению содержит липид, полученный, прямо или косвенно, с применением способов, клеток или организмов, раскрытых в настоящем документе. Кроме того, состав может находиться в твердой или жидкой форме. Дополнительно, состав может содержать съедобные макронутриенты, витамины и/или минералы в количествах, желательных для конкретного применения. Количества таких ингредиентов будут варьировать, в зависимости от того, предназначен ли состав для применения у нормальных индивидуумов или индивидуумов с особыми потребностями например, индивидуумов, страдающих от метаболических расстройств и т. п.

Примеры пригодных носителей, обладающих пищевой ценностью, включают, без ограничений, макронутриенты, например, съедобные жиры, углеводы и белки. Примеры таких съедобных жиров включают, без ограничений, кокосовое масло, масло бораго, грибное масло, масло черной смородины, соевое масло и моно- и диглицериды. Примеры таких углеводов включают, без ограничений, глюкозу, съедобную лактозу и гидролизованный крахмал. Дополнительно, примеры белков, которые могут применяться в питательном составе по изобретению включают, без ограничений, белки сои, обработанную электродиализом сыворотку, обработанное электродиализом снятое молоко, молочную сыворотку или гидролизаты указанных белков.

Относительно витаминов и минералов, следующее может быть добавлено к составам пищевых (кормовых) продуктов по настоящему изобретению: кальций, фосфор, калий, натрий, хлорид, магний, марганец, железо, медь, цинк, селен, йод и витамины A, E, D, C и группы B. Другие такие витамины и минералы также могут быть добавлены.

Дополнительно, состав пищевого (кормового) продукта по настоящему изобретению может быть добавлен к пище даже в тех случаях, когда нет необходимости в дополнении рациона. Например, состав может быть добавлен к пище любого типа, включая, без ограничений, маргарин, масло, сыры, молоко, йогурт, шоколад, конфеты, легкие закуски, салатные масла, кондитерские масла, кондитерские жиры, мясо, рыбу и напитки.

Дополнительно, липид, полученный в соответствии с настоящим изобретением или клетками-хозяевами, трансформированными таким образом, чтобы содержать и экспрессировать указанные гены, может применяться в качестве пищевых добавок к корму для животного, с целью изменения состава жирных кислот в ткани животного или молоке до более желательного для потребления человеком или животным. Примеры таких животных включают овцу, теленка, лошадей и т. п. Дополнительно, пищевые (кормовые) продукты по изобретению могут использоваться в аквакультуре, с целью повышения уровней жирных кислот в организме рыбы, предназначенной для потребления человеком или животным.

Предпочтительные пищевые (кормовые) продукты по изобретению представляет собой растения, семя и другие части растения, такие как листья, плоды и стебли, которые могут быть использованы непосредственно в качестве пищи или корма человеком или другими животными. Например, животные могут пастись непосредственно на таких растениях, выращенных в поле, или получать более точно отмеренные количества в процессе управляемого кормления. Изобретение включает применение таких растений и частей растения в качестве корма, с целью повышения уровней полиненасыщенных жирных кислот в организме человека и других животных.

Для потребления животными, не принадлежащими к человеческому роду, ком может находиться в любой подходящей форме, например, но не ограничиваясь ими, силос, сено или подножный корм в поле. В варианте реализации изобретения корм для потребления животными представляет собой бобовое растение или его часть, принадлежащее к семейству Fabaceae (или Leguminosae) например люцерна, клевер, горох, люцерна посевная, бобы, чечевица, люпин, мескито, кэроб, соя и арахис.

Составы

Настоящее изобретение также включает составы, особенно фармацевтические составы, содержащие один или более липидов, полученных с применением способов по изобретению.

Фармацевтический состав может содержать один или более липидов, в комбинации со стандартным, известным, нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем, адъювантом или растворителем, таким как буферизованный фосфатом раствор соли, вода, этанол, полиолы, растительные масла, увлажнитель или эмульсия, например, эмульсия вода/масло. Состав может находиться в жидкой или твердой форме. Например, состав может находиться в форме таблетки, капсулы, жидкости для приема внутрь, порошка, мази или крема для местного применения. Надлежащая сыпучесть может поддерживаться, например, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсий и применением поверхностно-активных веществ. Кроме того, может быть желательным введение поддерживающих изотоничность агентов, например, сахаров, натрия хлорида и т. п. Помимо таких инертных разбавителей, состав может включать вспомогательные вещества, например, увлажнители, эмульгаторы и суспендирующие агенты, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы.

Типичные дозы конкретной жирной кислоты составляют от 0,1 мг до 20 г, для приема от 1 до 5 раз в сутки (до 100 г в сутки) и, предпочтительно, находятся в интервале от приблизительно 10 мг до приблизительно 1, 2, 5 или 10 г в сутки (в виде одной или нескольких доз). Как известно из уровня техники, желательной является доза по меньшей мере около 300 мг/сутки жирной кислоты, особенно полиненасыщенной жирной кислоты. Однако следует понимать, что любое количество жирной кислоты будет полезным для субъекта.

Возможные способы введения фармацевтических составов по настоящему изобретению включают, например, энтеральный и парентеральный. Например, жидкий препарат можно вводить перорально. Дополнительно, гомогенная смесь может быть полностью диспергирована в воде, смешана в стерильных условиях с физиологически приемлемыми разбавителями, консервантами, буферами или пропеллентами, чтобы получить спрей или средство для ингаляций.

Дозы состава при введении субъекту могут быть определены специалистом, обладающим среднем уровнем квалификации в данной области, и зависят от различных факторов, таких как масса тела, возраст, общее состояние здоровья, анамнез, иммунный статус субъекта и т. п.

Дополнительно, составы по настоящему изобретению могут применяться для косметических целей. Составы могут быть добавлены к уже существующим косметическим составам, таким образом, что смесь, или жирная кислота, полученная согласно изобретению, может применяться в качестве единственного «активного» ингредиента в косметическом составе.

Полипептиды

В настоящем документе термины «полипептид» и «белок» в общем используются равнозначно.

Полипептид или класс полипептидов может быть определен по степени идентичности (% идентичности) его последовательности аминокислот референтной последовательности аминокислот или большему % идентичности одной референтной последовательности аминокислот, чем другой. % идентичности полипептида референтной последовательности аминокислот обычно определяется путем анализа GAP (Needleman и Wunsch, 1970; программное обеспечение GCG) с параметрами штрафа на открытие промежутка=5, и штрафа на продление промежутка=0,3. Длина последовательности запроса составляет по меньшей мере 100 аминокислот, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка длиной по меньшей мере 100 аминокислот. Даже более предпочтительно, длина последовательности запроса составляет по меньшей мере 250 аминокислот, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка длиной по меньшей мере 250 аминокислот. Даже более предпочтительно, анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении их полной длины. Полипептид или класс полипептидов может обладать такой же ферментной активностью как или отличной активностью от или не обладать активностью референтного полипептида. Предпочтительно, полипептид обладает ферментной активностью, составляющей по меньшей мере 10% от активности референтного полипептида.

В настоящем документе «биологически активный фрагмент» представляет собой часть полипептида по изобретению, которая обладает определенным видом активности полноразмерного референтного полипептида, например, активностью MGAT. Биологически активные фрагменты в настоящем документе исключают полноразмерный полипептид. Биологически активные фрагменты могут быть частью любого размера, до тех пор, пока они сохраняют определенную активность. Предпочтительно, биологически активный фрагмент сохраняет по меньшей мере 10% активности полноразмерного полипептида.

Относительно определенного полипептида или фермента, предусматривается, что более высокий % идентичности, чем раскрытый в настоящем документе, будет включать предпочтительные варианты. Таким образом, если это уместно, в свете минимального % идентичности, предпочтительно, полипептид/фермент содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8%, и даже более предпочтительно, по меньшей мере на 99,9% идентична соответствующей указанной SEQ ID NO.

Мутантные последовательности аминокислот полипептидов, раскрытых в настоящем документе, могут быть получены посредством введения подходящих нуклеотидных модификаций в нуклеиновую кислоту, определенную в настоящем документе, или синтезом желательного полипептида in vitro. Такие мутанты включают, например, делеции, вставки или замены остатков в пределах последовательности аминокислот. Комбинация делеций, вставок и замен может быть получена для введения в конечную конструкцию, при условии, что конечный полипептидный продукт обладает желательными характеристиками.

Мутантные (модифицированные) полипептиды могут быть получены с применением любой техники, известной в данной области, например, с применением стратегий направленной эволюции или рационального дизайна (см. ниже). Для продуктов, получаемых из мутантной/модифицированной ДНК, может быть легко проведен скрининг с применением способов, раскрытых в настоящем документе, чтобы определить, обладают ли они активностью фактора транскрипции, ацилтрансферазы жирных кислот или ПМВ.

При конструировании мутантов последовательности аминокислот, расположение сайта мутации и природа мутации будут зависеть от модифицированной характеристики (характеристик). Сайты мутации могут быть модифицированы индивидуально или сериями, например, (1) вначале заменой консервативными альтернативами аминокислот, а затем более радикальными вариантами, в зависимости от полученных результатов, (2) удалением целевого остатка, или (3) вставкой других остатков, смежных с размещенным сайтом.

Длина делеций в последовательности аминокислот, в общем, варьирует от приблизительно 1 до 15 остатков, более предпочтительно, приблизительно 1-10 остатков и обычно приблизительно 1-5 смежных остатков.

В мутантах с заменой по меньшей мере один остаток аминокислоты в полипептиде удален, и другой остаток вставлен на его место. Сайты, представляющие наибольший интерес для мутагенеза с замещением с целью инактивации ферментов, включают сайты, идентифицированные как активный(е) сайт(ы). Другими сайтами, представляющими интерес, являются такие, конкретные остатки которых, полученные от различных штаммов или видов, идентичны. Указанные положения могут быть важны с точки зрения биологической активности. Такие сайты, особенно находящиеся в пределах последовательности по меньшей мере трех других одинаково консервативных сайтов, предпочтительно заменяются относительно консервативным образом. Такие консервативные замены приведены в Таблице 1 под заголовком «примеры замен».

Таблица 1. Примеры замен.

Исходный
Остаток
Примеры
Замен
Ala (A) val; leu; ile; gly
Arg (R) lys
Asn (N) gln; his
Asp (D) glu
Cys (C) ser
Gln (Q) asn; his
Glu (E) asp
Gly (G) pro, ala
His (H) asn; gln
Ile (I) leu; val; ala
Leu (L) ile; val; met; ala; phe
Lys (K) arg
Met (M) leu; phe
Phe (F) leu; val; ala
Pro (P) gly
Ser (S) thr
Thr (T) ser
Trp (W) tyr
Tyr (Y) trp; phe
Val (V) ile; leu; met; phe, ala

В предпочтительном варианте мутантный/вариантный полипептид содержит только или не более чем один, два, три или четыре консервативных модификации аминокислот, по сравнению с природным полипептидом. Подробности относительно консервативных модификаций аминокислот приведены в Таблице 1. Как будет понятно специалисту, такие незначительные модификации могут быть спрогнозированы на рациональной основе как не влияющие на активность полипептида при экспрессии в рекомбинантной клетке. Мутанты с желательной активностью могут быть сконструированы с применением стандартных методик из уровня техники, например, случайным мутагенезом, направленным мутагенезом или мутагенезом насыщения в известных целевых генах, или путем обработки различных генов «тасованием» ДНК.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Общие материалы и методы

Экспрессия генов в растительных клетках в системе временной экспрессии

Гены экспрессируют в клетках растения с использованием системы временной экспрессии, по существу как раскрыто Voinnet с соавт. (2003) и Wood с соавт. (2009). Бинарные векторы, содержащие кодирующий участок, которые экспрессируются высокоактивным конститутивным промотором e35S, содержащим дуплицированный энхансерный участок, вводят в Agrobacterium tumefaciens штамм AGL1. Химерный бинарный вектор, 35S:p19, для экспрессии вирусного супрессора сайленсинга p19 вводят в AGL1 отдельно, как раскрыто в WO2010/057246. Химерный бинарный вектор, 35S:V2, для экспрессии вирусного супрессора сайленсинга V2 вводят в AGL1 отдельно. Рекомбинантные клетки выращивают до стационарной фазы при температуре 28 °C в среде Лурия-Бертани с добавлением 50 мг/л канамицина и 50 мг/л рифампицина. Затем бактерии гранулируют центрифугированием при 5000 g в течение 5 минут при комнатной температуре, перед ресуспендированием до OD600=1,0 в инфильтрационном буфере, содержащем 10 мМ минимальной эссенциальной среды, pH 5,7, 10 мМ MgCl2 и 100 мкМ ацетосирингона. Далее клетки инкубируют при 28°C со встряхиванием в течение 3 часов, после чего измеряют OD600, и объем каждой культуры, содержащей конструкцию вирусного супрессора 35S:p19 или 35S:V2, необходимый для достижения конечной концентрации OD600=0,125, помещают в свежую пробирку. Доводят до конечного объема упомянутым выше буфером. После этого осуществляют инфильтрацию листьев смесью культуры, и растения обычно выращивают еще в течение 3-5 дней после инфильтрации, перед выделением листовых пластинок для получения очищенного лизата клеток или выделения общего липида.

Трансформация Brassica napus

Семена Brassica napus стерилизуют с применением газообразного хлора, как описано Kereszt с соавт. (2007), и проращивают на питательной среде для культуры тканей. Котиледонные черешки с ножкой 2-4 мм выделяют, как описано Belide с соавт. (2013) и используют в качестве эксплантов. Готовят культуры A. tumefaciens AGL1 (Lazo с соавт., 1991), содержащие бинарный вектор, и котиледонные черешки инокулируют культурами, как описано Belide с соавт. (2013). Инфицированные котиледонные черешки культивируют на среде МС с добавлением 1 мг/л тидиазурона (ТДЗ)+0.1 мг/л 1-нафталинуксусной кислоты (НУК)+3 мг/л AgNO3+250 мг/л цефотаксима, 50 мг/л тиментина и 25 мг/л канамицина и культивируют в течение 4 недель при 24 °C с фотопериодом света-темноты 16 часов/8 часов, с двухнедельными пассажами на такую же среду. Экспланты с зеленым каллюсом переносят в среду для инициации побегов (МС+1 мг/л кинетина+3 мг/л AgNO3+250 мг/л цефотаксима+50 мг/л тиментина+25 мг/л канамицина) и культивируют еще в течение 2-3 недель. Маленькие побеги (~1 см) выделяют из устойчивого каллюса и переносят в среду для удлинения побегов (среда МС с добавлением 0,1 мг/л гибберелловой кислоты+3 мг/л AgNO3+250 мг/л цефотаксима+25 мг/л канамицина) и культивируют еще в течение двух недель. Здоровые побеги с одним или двумя листьями отбирают и переносят в среду для корнеобразования (1/2 МС с добавлением 1 мг/л НУК+20 мг/л аденина сульфата (АДС)+3 мг/л AgNO3+250 мг/л цефотаксима) и культивируют в течение 2-3 недель. ДНК выделяют из маленьких листьев устойчивых побегов с применением набора для выделения ДНК растения (Bioline, Александрия, Новый Южный Уэльс, Австралия), в соответствии с протоколом производителя. Присутствие последовательностей T-ДНК определяют методом ПЦР амплификации на геномной ДНК. Положительные, трансгенные побеги с корнями переносят в горшки, содержащие смесь для выращивания саженцев и выращивают в теплице с дневной температурой 24°C/ночной температурой 16°C (стандартные условия).

Анализ ферментов очищенного лизата листа

Ткани листа Nicotiana benthamiana, предварительно обработанные инфильтрацией, как изложено выше, измельчают в растворе, содержащем 0,1 М калий фосфатного буфера (pH 7,2) и 0,33 М сахарозы, с использованием стеклянного гомогенизатора. Гомогенат листьев центрифугируют при 20 000 g в течение 45 минут при температуре 4° C, после чего собирают каждый супернатант. Содержание белка в каждом супернатанте измеряют согласно Bradford (1976), с помощью мультиметочного счетчика Wallac1420 и реактива красителя для анализа белка Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, США, Калифорния). В анализах ацилтрансферазы используют 100 мкг белка согласно Cao с соавт. (2007), с некоторыми модификациями. Реакционная среда содержит 100 мМ Трис-HCl (pH 7,0), 5 мМ MgCl2, 1 мг/мл альбумина телячьей сыворотки (не содержащего жирных кислот), 200 мМ сахарозы, 40 мМ холодного олеоил-КоА, 16,4 мкМ sn-2 моноолеоилглицерил[14C] (55 мКи/ммоль, American Radiochemicals, Сент-Луис, США, Миссури) или 6,0 мкМ динатриевой соли [14C]глицерил-3-фосфата (G-3-P) (150 мКи/ммоль, American Radiochemicals). Анализ проводят через 7,5, 15 или 30 минут.

Анализ липидов

Анализ содержания масла в семенах Arabidposis

Если содержание масла в семени или состав общих жирных кислот следует определить для семян небольшого размера, например, семян Arabidopsis, то жирные кислоты в семенах метилируют напрямую, без раздавливания семян. Семена сушат в эксикаторе в течение 24 часов, и приблизительно 4 мг семян переносят в стеклянный флакон емкостью 2 мл с навинчивающейся крышкой, покрытой слоем Тефлона. Раствор 0,05 мг тригептадеканоина (ТАГ с тремя C17:0 жирными кислотами) в 0,1 мл толуола помещают во флакон в качестве внутреннего стандарта. Жирные кислоты семени метилируют добавлением 0,7 мл 1 н метанольного HCl (Supelco) во флакон, содержащий материал семян. В дроблении семян для полного метилирования нет необходимости в случае семян небольшого размера, например, семян Arabidopsis. Смесь кратковременно обрабатывают вихревым перемешиванием и инкубируют при 80° C в течение 2 часов. После охлаждения смесей до комнатной температуры, 0,3 мл 0,9% NaCl (масс/об) и 0,1 мл гексана добавляют во флакон и тщательно перемешивают в течение 10 минут в Heidolph Vibramax 110. МЭЖК собирают в стеклянную вставку емкостью 0,3 мл и анализируют методом ГХ с плазменно-ионизационным детектором (ПИД), как описано ниже.

Площадь пика индивидуальных МЭЖК вначале корректируют на основе площади пиков известного количества таких же МЭЖК, присутствующих в коммерческом стандартном GLC-411 (NU-CHEK PREP, INC., США). GLC-411 содержит равные количества 31 жирной кислоты (% масс.), в интервале от C8:0 до C22:6. В случае жирных кислот, которые не присутствовали в стандарте, находят площадь пиков наиболее подобного МЭЖК. Например, площадь пика МЭЖК 16:1d9 используют для 16:1d7, и площадь пика МЭЖК C22:6 используют для C22:5. Скорректированные площади пиков используют для вычисления массы каждого МЭЖК в образце, по сравнению с массой внутреннего стандарта. Масло хранится, в основном, в форме ТАГ, и его массу вычисляют на основании массы МЭЖК. Общее количество моль глицерина определяют путем вычисления количества моль каждого МЭЖК и деления общего количества моль МЭЖК на 3. Содержание ТАГ вычисляют как сумму фрагментов глицерина и жирного ацила, с использованием формулы: %, масс. масла=100 x ((41 x общее количество моль МЭЖК/3)+(общее количество г МЭЖК - (15 x общее количество моль МЭЖК)))/грамм семени, где 41 и 15 представляют собой значения молекулярной массы фрагмента глицерина и метильной группы, соответственно.

Анализ содержания жирной кислоты в семенах Camelina и семенах рапса

Для определения состава жирных кислот в одиночных семенах большего размера, таких как семена рапса и Camelina, выполняют прямое метилирование жирных кислот в семени, как и для семян Arabidopsis, за исключением разрушения оболочек семян. Данный способ позволяет экстрагировать достаточное количество масла из семян, чтобы провести анализ состава жирных кислот. Для определения состава жирных кислот общего липида, экстрагированного из семян, семена раздавливают и липиды экстрагируют с помощью CHCl3/MeOH. Аликвоты экстрагированного липида метилируют и анализируют методом ГХ. Содержание общего липида для объединенного в пул семени рапса (содержание масла в семенах) определяют при помощи двукратной экстракции липида с применением CHCl3/MeOH из известной массы высушенных семян после раздавливания, с последующим метилированием аликвот липида вместе с 17:0 жирными кислотами в качестве внутреннего стандарта. В случае Camelina, липид из известного количества семян метилируют вместе с известным количеством 17:0 жирных кислот, как и в случае анализа масла Arabidopsis, и МЭЖК анализируют методом ГХ. Для количественного определения ТАГ, фракционируют ТАГ из экстрагированного липида с применением ТСХ и непосредственно метилируют на кремния диоксиде с применением 17:0 ТАГ в качестве внутреннего стандарта. Эти способы описаны более подробно ниже.

После сбора урожая в стадии зрелости растения, семена Camelina или рапса обезвоживают путем хранения семян в течение 24 часов при комнатной температуре в эксикаторе, содержащем силикагель в качестве поглотителя влаги. Содержание влаги в семенах обычно составляет 6-8%. Общие липиды экстрагируют из известной массы обезвоженных семян путем измельчения семян с помощью смеси хлороформа и метанола (2/1, об/об) в пробирке Эппендорфа, с использованием гомогенизатора для тканей Reicht (частота 22/секунду в течение 3 минут) и металлического шара. Добавляют один объем 0,1 М раствора KCl, и смесь встряхивают в течение 10 минут. Нижнюю неполярную фракцию собирают после центрифугирования смеси в течение 5 минут при скорости 3000 об/мин. Оставшуюся верхнюю (водную) фракцию промывают 2-мя объемами хлороформа при перемешивании в течение 10 минут. Вторую неполярную фракцию также собирают и объединяют в пул с ранее собранной. Растворитель испаряют из липидов в экстракте в потоке азота и высушенный общий липид растворяют в известном объеме хлороформа.

Для измерения количества липида в экстрагированном материале известное количество 17:0-ТАГ добавляют в качестве внутреннего стандарта и липиды из известного количества семян инкубируют в 1 н метанольной HCl (Supelco) в течение 2 часов при 80°C. Полученный таким образом МЭЖК экстрагируют гексаном и анализируют методом ГХ. Количество отдельного МЭЖК определяют на основании количества МЭЖК 17:0 ТАГ. Массу отдельных МЭЖК, после вычитания массы метильных групп, которыми этерифицированы МЭЖК, переводят в моль путем деления на молекулярную массу отдельных МЭЖК. Общее количество моль всех МЭЖК делят на три, чтобы вычислить количество моль ТАГ, и, таким образом, глицерина. Далее, количество моль ТАГ превращают в массу ТАГ. В конце, процент содержания масла на основе массы семени вычисляют с использованием массы семени, предполагая, что весь экстрагированный липид представляет собой ТАГ или эквивалент ТАГ для целей вычисления содержания масла. Данный способ базируется на Li с соавт., (2006). Другие семена подобного размера, кроме семян Camelina или рапса, также могут быть проанализированы данным способом.

Кроме того, содержание масла в семени рапса и других семенах было измерено методами ядерного магнитного резонанса (Rossell и Pritchard, 1991) пульсирующей волной NMS 100 Minispec (Bruker Pty Ltd Scientific Instruments, Германия), как описано в Примере 14. Метод ЯМР позволяет одновременно измерить содержание влаги. Кроме того, содержание масла в семенах можно измерить отражательной спектроскопией в ближнем ИК-диапазоне, например, с применением монохроматора NIRSystems модель 5000. Кроме того, содержание влаги может быть измерено в образце партии семян, посредством сушки семян в образце в течение 18 часов при температуре приблизительно 100°C, согласно Li с соавт. (2006).

Анализ липидов из образцов лизата листа

Липиды из образцов лизата экстрагируют с использованием смеси хлороформ/метанол/0,1 М раствор KCl (2:1:1) и извлекают. Различные классы липидов в образцах разделяют на пластинках Силикагель 60 для тонкослойной хроматографии (ТСХ) (MERCK, Дармштадт, Германия) (ТСХ), пропитанных 10% раствором борной кислоты. Система растворителей, используемых для фракционирования ТАГ из экстракта липидов, представляет собой хлороформ/ацетон (90:10, об/об). Отдельные классы липидов визуализируют посредством контакта пластинок с парами йода и идентифицируют посредством параллельного анализа аутентичных стандартов на такой же пластинке ТСХ. Пластинки приводят в контакт с фосфорными визуализационными экранами на протяжении ночи и анализируют с помощью визуализатора фосфора Fujifilm FLA-5000 перед жидкостно-сцинтиляционным подсчетом для количественного определения импульсов в минуту.

Выделение общего липида и фракционирование липидов из вегетативных тканей

Состав жирных кислот общего липида в образцах листьев и других вегетативных тканей определяли прямым метилированием жирных кислот в лиофилизированных образцах. Для количественной оценки общего липида, жирные кислоты в известной массе лиофилизированных образцов непосредственно метилируют с 17:0 СЖК. Для определения уровней общих ТАГ в образцах листьев, ТАГ из экстрагированного общего липида фракционируют с помощью ТСХ и метилируют в присутствии внутреннего стандарта 17:0 ТАГ, вследствие присутствия в листьях значительных количеств полярных липидов. Это осуществляют, как указано ниже. Ткани, включая образцы листа, лиофилизируют, взвешивают (сухая масса) и общие липиды, экстрагированные как описано Bligh и Dyer (1959) или с использованием смеси хлороформ/метанол/0,1 М раствор KCl (ХМК; 2:1:1) в качестве растворителя. Общие липиды извлекают из образцов листа N. benthamiana после лиофилизации, добавляя 900 мкл смеси хлороформ/метанол (2:1, об/об) на образец листа диаметром 1 см. Добавляют 0,8 мкг ДАГЭ на 0,5 мг массы сухого листа в качестве внутреннего стандарта, если должен быть проведен анализ ТСХ-ПИД. Образцы гомогенизируют с помощью гомогенизатора для тканей ULTRA-TURRAX производства IKA, после чего добавляют 500 мкл 0,1 М раствора KCl. Образцы обрабатывают вихревым перемешиванием, центрифугируют в течение 5 минут, и нижнюю фракцию собирают. Оставшуюся верхнюю фракцию экстрагируют повторно, добавляя 600 мкл хлороформа, обрабатывают вихревым перемешиванием и центрифугируют в течение 5 минут. Нижнюю фракцию извлекают и объединяют в пул с ранее собранной. Липиды сушат в потоке азота и ресуспендируют в 2 мкл хлороформа на мг сухой массы листа. Общие липиды листьев N. tabacum или образцов листа извлекают, как раскрыто выше, с некоторыми модификациями. Если 4 или 6 листовых дисков (каждый с площадью поверхности приблизительно 1 см2) объединяют, то используют 1,6 мл растворителя ХМК, а если объединяют 3 или менее листовых дисков, то используют 1,2 мл ХМК. Лиофилизированные ткани листа гомогенизируют в пробирке Эппендорфа, содержащей металлический шар, с помощью гомогенизатора для тканей Reicht (Qiagen) в течение 3 минут при частоте 20/секунду.

Отделение нейтральных липидов методами ТСХ и переметилирования

Известные объемы полных экстрактов листа, например, 30 мкл, помещают на пластинку ТСХ силикагель 60 (1×20 см) (Merck KGaA, Германия). Нейтральные липиды фракционируют на различные типы и отделяют от полярных липидов методом ТСХ в уравновешенной емкости для проявления, содержащей систему растворителей гексан/диэтиловый эфир (ДЭЭ)/уксусная кислота (70:30:1, об/об/об). Полосы ТАГ визуализируют посредством обрызгивания примулином, маркируют в УФ-свете, соскабливают с пластины ТСХ, переносят во флаконы для ГХ емкостью 2 мл и сушат с помощью N2. Добавляют 750 мкл 1 н метанольного HCl (Supelco analytical, США) в каждый флакон, вместе с известным количеством C17:0 ТАГ в качестве внутреннего стандарта, в зависимости от количества ТАГ в каждом образце. Обычно, добавляют 30 мкг внутреннего стандарта для образцов с низким содержанием ТАГ, тогда как в случае образцов с высоким содержанием ТАГ применяют до 200 мк г внутреннего стандарта.

Образцы липида для анализа состава жирных кислот методом ГХ переметилируют путем инкубирования смесей при 80°C в течение 2 часов в присутствии метанольного HCl. После охлаждения образцов до комнатной температуры, реакцию останавливают, добавляя 350 мкл H2O. Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) извлекают из смеси, добавляя 350 мкл гексана, обрабатывая вихревым перемешиванием и центрифугируя со скоростью 1700 об/мин в течение 5 минут. Верхнюю гексановую фракцию собирают и переносят во флаконы для ГХ с коническими вставками емкостью 300 мкл. После выпаривания, образцы ресуспендируют в 30 мкл гексана. По 1 мкл вводят в прибор для ГХ.

Количество индивидуальных и общих жирных кислот (ОЖК) в липидных фракциях определяют с помощью ГХ, определяя площадь каждого пика, и вычисляя посредством сравнения с площадью пика для известного количества внутреннего стандарта. Содержание ТАГ в листе вычисляют как сумму глицерильных и жирных ацильных фрагментов во фракции ТАГ, с использованием соотношения: %, масс. ТАГ=100 x ((41 x общее количество моль МЭЖК/3)+(общее количество МЭЖК в г - (15 x общее количество моль МЭЖК)))/грамм сухой массы листа, где 41 и 15 представляют собой молекулярную массу глицерильного фрагмента и метильной группы, соответственно.

Капиллярная газожидкостная хроматография (ГХ)

МЭЖК анализируют методом ГХ с использованием ГХ Agilent Technologies 7890A (Пало-Альто, Калифорния, США), оборудованного колонкой SGE BPX70 (70% цианопропил полисилфенилен-силоксан) (30 м x 0,25 мм внутренний диаметр, толщина пленки 0,25 мкм), ПИД, инжектором с расщеплением/без расщепления и аутосемплером с инжектором Agilent Technologies 7693 Series. Гелий используют в качестве газа-носителя. Образцы вводят в режиме расщепления (соотношение 50:1) при температуре печи 150°C. После инжекции температуру печи удерживают на уровне 150°C в течение 1 минуты, затем повышают до 210°C со скоростью 3°C/минуту-1, и в конце до 240°C со скоростью 50°C/минуту-1. Пики количественно измеряют с помощью программного обеспечения Agilent Technologies ChemStation (Rev B.04.03 (16), Пало-Альто, Калифорния, США), на основании ответа известного количества внешнего стандарта GLC-411 (Nucheck) и внутреннего стандарта C17:0-Me.

Количественное определение ТАГ с помощью Iatroscan

1 мкл экстракта липида помещают на один Chromarod-SII для ТСХ-ПИД Iatroscan™ (Mitsubishi Chemical Medience Corporation, Япония). Далее стойку Chromarod переносят в уравновешенную емкость для проявления, содержащую 70 мл системы растворителей гексан/CHCl3 /2-пропанол/муравьиная кислота (85: 10,716:0,567:0,0567, об/об/об/об). После инкубации в течение 30 минут, стойку Chromarod сушат в течение 3 минут при 100° C и немедленно сканируют на анализаторе ТСХ-ПИД Iatroscan MK-6s (Mitsubishi Chemical Medience Corporation. Япония). Площадь пиков внутреннего стандарта ДАГЭ и ТАГ интегрируют с помощью программного обеспечения для интеграции SIC-480II (версия: 7.0-E, SIC System instruments Co., LTD - Япония).

Количественное определение ТАГ осуществляют в две стадии. Вначале во всех образцах сканируют ДАГЭ для коррекции выходов экстракции, после чего концентрированные образцы ТАГ выбирают и разбавляют. Затем, количество ТАГ определяют в разбавленных образцах вторым сканированием в соответствии с внешней калибровкой, используя глицерилтрилинолеат в качестве внешнего стандарта (Sigma-Aldrich).

Количественное определение ТАГ в образцах листа методом ГХ

Площадь пика индивидуального МЭЖК вначале корректируют на основании площади пика известных количеств таких же МЭЖК, присутствующих в коммерческом стандарте GLC-411 (NU-CHEK PREP, Inc., США). Скорректированные значения площади пика используют для вычисления массы каждого МЭЖК в образце, по сравнению с внутренним стандартом. Поскольку масло хранится в основном в форме ТАГ, количество масла вычисляют на основании количества МЭЖК в каждом образце. Общее количество моль глицерина определяют, вычисляя количество моль МЭЖК, с последующим делением общего количества моль МЭЖК на 3 Количество ТАГ вычисляют как сумму глицерильных и жирных ацильных фрагментов, с использованием формулы: %, масс. масла=100 x ((41 x общее количество моль МЭЖК/3)+(общее количество г МЭЖК - (15 x общее количество моль МЭЖК)))/грамм сухой массы листа, где 41 и 15 представляют собой молекулярную массу глицерильного фрагмента и метильной группы, соответственно.

Пример 2. Увеличение содержания липида в вегетативных частях Nicotiana benthamiana

Генетическую конструкцию pJP3502 применяют для получения стабильно трансформированных растений Nicotiana benthamiana с помощью протокола опосредованной Agrobacterium трансформации, как описано в WO2013/096993 для Nicotiana tabacum. Отбирают трансгенные растения с резистентностью к канамицину и выращивают в теплице до состояния зрелости. Образцы листьев собирают на стадии завязывания семян и лиофилизируют. Определяют общее содержание жирных кислот (ОЖК) (% от сухой массы) и состав общего липида в образцах после экстракции в соответствии с Bligh и Dyer (1959), а также содержание и состав фракции триацилглицеридов (ТАГ). Данные приведены в Таблице 2 и Таблице 3. Образец листа с наиболее высоким содержанием масла получен от трансгенного растения №16, содержание ОЖК в котором составило 33% масс. Данный образец содержал 22,5% масс. ТАГ (в пересчете на сухую массу).

Наблюдается выраженная корреляция между изменением состава жирных кислот и содержанием ОЖК или ТАГ. Уровень олеиновой кислоты (C18:1n-9), повышает с увеличением содержания ОЖК и ТАГ, таким образом, что она является преобладающей жирной кислотой в листьях с высоким содержанием ТАГ, например, содержащих 66,8% ОЖК и 66,9% жирных кислот ТАГ в листьях с наиболее высоким содержанием ТАГ. Подобные корреляции наблюдаются для других жирных кислот, например, уровни АЛК снижаются до 4,9% ОЖК и 3,9% ТАГ в листьях с наиболее высоким содержанием ТАГ. Кроме того, наблюдается выраженная корреляция между уровнями C16:3 и содержанием как ОЖК, так и ТАГ, причем содержание C16:3 существенно снижается в образцах с высоким содержанием ОЖК и ТАГ.

Два растения из числа растений с высоким содержанием масла, №14 и №16, были дополнительно проанализированы в ходе фазы старения листьев, когда листья начали желтеть (Таблица 4 и Таблица 5). Несмотря на то, что изменение общего содержания жирных кислот было незначительным в образце с наиболее высокими показателями (32,9% против 33%), количество ТАГ повысилось до 32,6%. В указанных образцах липиды листьев практически полностью состояли из ТАГ.

Таблица 2. Состав и количество общих жирных кислот (ОЖК) (% от сухой массы) в листьях растений Nicotiana benthamiana, стабильно трансформированных T-ДНК из конструкции pJP3502. Образцы дополнительно содержат 0,1-0,3% C14:0 и 0,0-0,7% C20:1

Образец C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:1d11 C18:2 C18:3n3 C20:0 C22:0 C24:0 % ОЖК
Контроль 1 24,9 0,9 6,9 4,2 11,7 0,0 2,6 46,4 0,8 0,6 0,8 0,6
2 23,9 0,9 12,0 4,8 13,4 0,0 2,8 39,1 0,9 0,6 1,3 0,6
3 24,1 0,9 10,4 4,7 10,5 0,0 2,8 43,7 0,9 0,6 1,2 0,5
4 24,0 0,9 10,0 4,7 13,7 0,0 2,9 40,8 0,9 0,6 1,2 0,7
Трансгенные 7 18,6 0,2 2,3 4,2 35,8 0,3 4,7 28,0 2,3 1,5 1,3 2,4
8 16,3 0,6 0,7 4,9 62,9 0,7 4,1 6,6 1,4 0,7 0,6 21,8
11 25,9 1,2 2,8 3,2 47,3 0,8 3,1 13,3 1,3 0,7 0,1 14,7
12 24,7 1,1 1,6 3,2 46,0 1,1 3,1 16,8 1,1 0,6 0,2 3,8
13 20,3 0,6 21,1 4,7 15,0 0,0 2,9 33,4 1,2 0,0 0,6 1,2
14 15,6 0,5 0,6 5,1 64,4 0,6 2,7 6,5 1,8 0,9 0,7 21,3
15 17,7 0,4 0,2 5,6 60,7 0,4 2,7 7,5 2,2 1,2 0,9 21,0
16 15,3 0,6 0,6 5,8 66,8 0,6 1,7 4,9 1,7 0,8 0,7 33,0
17 25,5 0,0 7,4 4,2 8,6 0,0 3,7 48,8 0,7 0,0 0,9 1,4
18 27,0 0,6 5,7 2,5 6,7 2,0 5,1 48,7 0,5 0,4 0,6 2,6
19 21,1 0,8 2,1 5,2 35,9 1,0 10,0 20,8 1,5 0,9 0,2 4,3
20 15,4 1,8 4,6 3,4 10,5 0,0 5,6 56,4 0,8 0,5 0,8 2,3
21 16,3 0,7 6,6 3,6 10,2 0,0 10,1 49,7 1,4 0,8 0,7 1,6

Таблица 3. Состав жирных кислот и количество ТАГ (% от сухой массы) в листьях растений Nicotiana benthamiana, стабильно трансформированных T-ДНК из конструкции pJP3502. Образцы дополнительно содержат 0,1-0,3% C14:0 и 0,0-0,7% C20:1

Образец C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:1d11 C18:2 C18:3n3 C20:0 C22:0 C24:0 % ТАГ
Контроль 1 57,7 0,0 0,0 6,6 7,4 0,0 0,0 28,3 0,0 0,0 0,0 0,1
2 61,7 0,0 1,8 8,1 7,5 0,0 1,9 19,0 0,0 0,0 0,0 0,1
3 69,9 0,0 0,0 8,7 6,0 0,0 0,0 15,5 0,0 0,0 0,0 0,1
4 59,2 0,0 1,1 7,6 8,8 0,0 2,1 18,2 1,3 0,0 1,7 0,2
Трансгенные 7 26,7 0,2 1,0 6,1 38,1 0,4 3,8 16,8 3,6 2,1 0,2 2,5
8 17,3 0,7 0,2 5,3 64,4 0,8 2,9 5,1 1,5 0,7 0,6 15,4
11 28,9 1,5 0,2 3,4 49,9 1,0 2,6 9,3 1,3 0,7 0,8 9,7
12 27,0 1,4 0,3 3,4 51,4 1,4 2,6 9,6 1,2 0,6 0,7 5,2
13 39,7 1,3 4,0 5,5 17,2 0,0 2,4 27,9 1,0 0,0 0,6 0,6
14 16,2 0,6 0,2 5,3 65,1 0,6 2,8 5,2 1,8 0,9 0,7 19,6
15 18,4 0,4 0,1 5,9 61,0 0,4 2,9 5,8 2,3 1,3 1,0 14,9
16 15,9 0,7 0,2 5,9 66,9 0,7 2,1 3,9 1,7 0,8 0,7 22,5
17 29,8 0,0 0,0 4,2 13,5 0,0 5,1 47,4 0,0 0,0 0,0 0,4
18 40,2 5,9 0,0 3,2 10,8 2,0 5,6 32,4 0,0 0,0 0,0 0,6
19 24,6 1,0 0,7 6,8 43,6 1,1 9,4 8,7 1,9 1,0 0,8 3,7
20 23,1 0,0 1,1 6,0 18,6 0,0 7,6 41,5 2,1 0,0 0,0 0,6
21 28,1 0,0 2,5 6,2 19,9 0,0 11,5 27,7 2,7 1,3 0,0 0,7

Таблица 4. Состав и количество (% от сухой массы) общих жирных кислот (ОЖК) в листьях растений Nicotiana benthamiana, стабильно трансформированных T-ДНК из конструкции pJP3502, на стадии желтого листа. Образцы дополнительно содержат 0,1-0,3% C14:0 и 0,0-0,7% C20:1

Образец C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:1d11 C18:2 C18:3n3 C20:0 22:0 C24:0 % ОЖК
Контроль 1 24,9 0,9 6,9 4,2 11,7 0,0 2,6 46,4 0,8 0,6 0,8 0,6
Трансгенные 14 17,2 0,5 0,7 6,0 64,7 0,6 0,1 6,8 2,1 0,0 0,6 29,0
16 17,4 0,6 0,8 7,0 64,7 0,7 0,1 5,5 1,9 0,0 0,6 32,9

Таблица 5. Состав жирных кислот и количество (% от сухой массы) ТАГ в листьях растений Nicotiana benthamiana, стабильно трансформированных T-ДНК из конструкции pJP3502. Образцы дополнительно содержат 0,1-0,3% C14:0 и 0,0-0,7% C20:1

Образец C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:1d11 C18:2 C18:3n3 C20:0 22:0 C24:0 % ТАГ
Контроль 1 38,1 0,0 0,0 7,0 10,6 0,0 2,9 40,3 1,1 0,0 0,0 0,1
Трансгенные 14 16,9 0,5 0,2 5,5 62,8 0,6 3,0 6,5 1,9 0,9 0,6 27,7
16 17,3 0,7 0,2 6,4 63,3 0,6 2,2 5,5 1,8 0,8 0,6 32,6

Пример 3. Повышение содержания липидов в вегетативных частях растения Nicotiana tabacum

Конструкцию pJP3502 ранее применяли для трансформации Nicotiana tabacum (WO2013/096993). Семя, полученное от гомозиготного растения T1, трансформированного T-ДНК из pJP3502 и содержащее высокий уровень ОЖК и ТАГ, собирают и высевают с целью получения нового поколения растений-потомков T2, однородно гомозиготных по трансгенам. Горшки размещают в теплице таким образом, что зрелые листья растений частично перекрываются в форме типичного купола («купол парашюта»), как это происходило бы при выращивании в поле, или максимально контактируют с прямым солнечным светом (форма без купола). Образцы листьев получают от каждого полностью выросшего растения на стадии завязывания семян и лиофилизируют. Содержание жирных кислот определяют для фракции ТАГ (Таблица 6) после экстракции общих липидов из образцов в соответствии с Bligh и Dyer (1959). Уровни ТАГ в ткани зрелых листьев растений без купола обычно выше, чем в растениях с куполом, с максимально зарегистрированным содержанием ТАГ в листьях 20,6% от сухой массы листа.

Таблица 6. Содержание ТАГ (% от сухой массы) в ткани зрелых листьев трансгенных растений-потомков T2 (Линия 49), трансформированных T-ДНК pJP3502, по сравнению с диким типом (дт).

Растение Условия выращивания Содержание ТАГ Растение Условия выращивания Содержание ТАГ
дт 1 Купол 0,0 дт 4 Без купола 0,0
дт 2 Купол 0,1 дт 5 Без купола 0,0
дт 3 Купол 0,1 49,6 Без купола 5,1
49,1 Купол 6,4 49,7 Без купола 5,6
49,2 Купол 3,6 49,8 Без купола 14,7
49,3 Купол 3,7 49,9 Без купола 6,3
49,4 Купол 1,9 49,10 Без купола 6,7
49,5 Купол 2,2 49,11 Без купола 19,5
49,12 Без купола 16,4
49,13 Без купола 20,6
49,14 Без купола 15,7
49,15 Без купола 15,1
49,16 Без купола 6,3
49,17 Без купола 18,6

Пример 4. Повышение содержания масла в вегетативных частях однодольных растений

Химерные конструкции ДНК разработаны таким образом, чтобы повысить содержание масла в однодольных растениях, например, растении C4 S. bicolor (сорго), путем экспрессии комбинации генов, кодирующих WRI1, LEC1 Z. mays (номер доступа AAK95562; SEQ ID NO: 155), DGAT и олеозина в трансгенных растениях. Несколько пар конструкций для биолистической сотрансформации разработаны и получены путем лигирования-клонирования рестрикционного фермента, как указано ниже.

Генетическая конструкция pOIL136 представляет собой бинарный вектор, содержащий три кассеты экспрессии однодольных, а именно ген селекционного маркера, кодирующий фосфинотрицин ацетилтрансферазу (ФАТ) для селекции растения, вторую кассету для экспрессии DGAT и третью для экспрессии олеозина. Вначале получают pJP136 амплификацией промотора гена актина из Oryza sativa (McElroy с соавт., 1990) и инсерции его в качестве фрагмента тупого-ClaI в pORE04 (Coutu с соавт., 2007) с получением pOIL094. Далее получают pOIL095 путем инсерции версии гена олеозина Sesamum indicum, кодон-оптимизированного для экспрессии в однодольных, в pOIL094 на сайте KpnI. pOIL093 получают клонированием версии кодон-оптимизированного для экспрессии в однодольных гена DGAT2a Umbelopsis ramanniana (Lardizabal с соавт., 2008) в качестве фрагмента SmaI-KpnI в вектор, уже содержащий промотор гена убихитина Zea mays. Далее получают pOIL134 клонированием кассеты экспрессии NotI DGAT2a из pOIL093 в pOIL095 на сайтах NotI. pOIL141 получают инсерцией гена селекционного маркера, кодирующего ФАТ в качестве фрагмента BamHI-SacI в вектор, содержащий промотор убихитина Z. mays. В конце получают pOIL136 клонированием кассеты экспрессии убихитина Z. mays::ФАТ в качестве фрагмента тупого-AscI в ZraI-AscI pOIL096. Генетическая конструкция pOIL136, таким образом, содержит следующие кассеты экспрессии: промотор актина O. sativa::олеозин S. indicum, промотор убихитина Z. mays::DGAT2a U. ramanniana и промотор убихитина Z. mays::ФАТ.

Подобный вектор pOIL197, содержащий NPTII вместо ФАТ, конструируют субклонированием кассеты убихитина Z. mays::NPTII из pUKN в качестве фрагмента HindIII-SmaI в сайты AscI (тупые) и HindIII pJP3343. Далее полученный вектор, pOIL196, расщепляют с помощью HindIII (тупые) и AgeI. Полученный фрагмент размером 3358 пар оснований клонируют в сайты ZraI-AgeI pOIL134 с получением pOIL197.

Разработан и получен набор конструкций, содержащих гены, которые кодируют WRI1 Z. mays (ZmWRI) или факторы транскрипции LEC1 (ZmLEC1) под контролем различных промоторов, для биолистической сотрансформации в комбинации с pOIL136, с целью оценки влияния активности промотора и специфичности в отношении клетки на функционирование WRI1 или LEC1, или обоих в случае комбинации, при экспрессии в вегетативных тканях растения C4, такого как сорго. Указанный отдельный набор конструкций не содержит гена селекционного маркера, за исключением pOIL333, который содержит NPTII в качестве селекционного маркера. Различные исследуемые промоторы были такими, как указано ниже. Промотор гена убихитина Z. Mays (pZmUbi) представляет собой активный конститутивный промотор однодольных, в то время как о расширенном промотор CaMV 35S (e35S), содержащем двойной участок энхансера, сообщалось, что он приводит к более низким уровням экспрессии трансгена (обзор в Girijashankar и Swathisree, 2009). Тогда как промотор гена фосфоенолпируваткарбоксилазы (pZmPEPC) Z. mays активен в мезофильных клетках листа (Matsuoka и Minami, 1989), месте фотосинтеза в видах растений C4, промотор гена маленькой субъединицы Z. mays Rubisco (pZmSSU) является специфичным для слоя клеток обкладки сосудистых пучков (Nomura с соавт., 2000; Lebrun с соавт., 1987), т.е. клеток, в которых имеет место фиксация углерода в растениях C4.

Экспрессия гена Z. mays, кодирующего SEE1 цистеинпротеазу (номер доступа AJ494982) идентифицирована, как сходная с экспрессией специфичного для старения промотора SAG12 A. thaliana в ходе развития растения. Таким образом, промотор размером 1970 пар оснований из гена SEE1 (SEQ ID NO: 216) был дополнительно выбран для контроля экспрессии генов, кодирующих факторы транскрипции WRI1 и LEC1 Z. mays. Далее, промоторы из гена, кодирующего белок «цинкового пальца» AlSAP Aeluropus littoralis (Ben Saad с соавт., 2011; номер доступа DQ885219; SEQ ID NO: 217) и промотор из чувствительного к сахарозе гена ArRolC A. rhizogenes (Yokoyama с соавт., 1994; номер доступа DQ160187; SEQ ID NO: 218) дополнительно выбраны для экспрессии ZmWRI1 в ткани стебля. Таким образом, каждый из этих промоторов индивидуально присоединяют в направлении против хода транскрипции к участкам, кодирующим ZmWRI1 или ZmLEC1, как указано ниже.

Промежуточный вектор, pOIL100, вначале получают клонированием последовательности, кодирующей WRI1 Z. mays, и участка терминатора транскрипции/полиаденилирования, фланкированных сайтами AscI-NcоI, в такие же сайты в бинарном векторе pJP3343. Различные версии конструкций для экспрессии WRI1 основаны на данном векторе и получены клонированием различных промоторов в pOIL100. pOIL101 получают клонированием фрагмента XhoI-Sal, содержащего промотор e35S с удвоенным участком энхансера, в сайт XhoI pOIL100. pOIL102 получают клонированием фрагмента HindIII-AvrII, содержащего промотор гена убихитина Z. mays, в сайты HindIII-XbaI pOIL100. pOIL103 получают клонированием фрагмента HindIII-NcoI, содержащего промотор гена PEPC Z. mays, в сайты HindIII-NcoI pOIL100. pOIL104 получают клонированием фрагмента HindIII-AvrII, содержащего промотор гена SSU Z. mays, в сайты HindIII-AvrII pOIL100.

Синтезирован синтетический фрагмент, содержащий участок промотора SEE1 Z. mays, фланкированный уникальными сайтами HindIII-XhoI. Данный фрагмент клонируют в направлении против хода транскрипции по отношению к участку, кодирующему белок WRI1 Z. mays, используя сайты HindIII-XhoI в pOIL100. Результирующий вектор обозначен pOIL329. Синтезирован содержащий синтетический фрагмент участок промотора AlSAP A. littoralis, фланкированный уникальными сайтами XhoI-XbaI. Данный фрагмент клонируют в направлении против хода транскрипции по отношению к участку, кодирующему WRI1 Z. mays, используя сайты XbaI-Xho I в pOIL100. Результирующий вектор обозначен pOIL330. Синтезирован содержащий синтетический фрагмент участок промотора ArRolC A. rhizogenes, фланкированный уникальными сайтами PspOMI-XhoI. Данный фрагмент клонируют в направлении против хода транскрипции по отношению к участку, кодирующему WRI1 Z. mays, используя сайты PspOMI-XhoI в pOIL100. Результирующий вектор обозначен pOIL335. В конце, бинарный вектор (pOIL333), содержащий кассету экспрессии SEE1 Z. mays::ZmLEC1, получают в три стадии. Вначале, вектор экспрессии 35S::GUS конструируют амплификацией участка, кодирующего GUS, с фланкирующими праймерами, содержащими сайты AvrII и KpnI. Далее полученный фрагмент клонируют в сайты SpeI-KpnI pJP3343. Результирующий вектор обозначен pTV111. Затем, участок 35S промотора pTV111 заменяют промотором SEE1Z. mays. На этой стадии последовательность SEE1 Z. mays амплифицируют с применением фланкирующих праймеров, содержащих уникальные сайты HindIII и XhoI. Результирующий фрагмент разрезают соответствующими рестрикционными ферментами и субклонируют в сайты SalI-HindIII pTV111. Результирующий вектор обозначен pOIL332. Далее последовательность, кодирующую ZmLEC1 амплифицируют с применением фланкирующих праймеров, содержащих сайты NotI и EcoRV. Полученный фрагмент субклонируют в соответствующие сайты pOIL332 с получением pOIL333.

Готовят ДНК для биолистической трансформации, расщепляя скелеты векторов pOIL101, pOIL102, pOIL103, pOIL104, pOIL197, pOIL329, pOIL330, pOIL333 и pOIL335 рестрикционными ферментами, с последующим выделением на геле. Затем ДНК pOIL197 смешивают с ДНК pOIL101, pOIL102, pOIL103, pOIL104, pOIL329, pOIL330, pOIL333 или pOIL335 и осуществляют трансформацию эксплантов S. bicolor посредством биолистически опосредованной трансформации. В качестве альтернативы, трансформацию с помощью конструкций для экспрессии таких же комбинаций генов осуществляют по отдельности или в форме сотрансформации путем опосредованной Agrobacterium трансформации (Gurel с соавт., 2009; Wu с соавт., 2014).

Трансгенные растения регенерируют и отбирают резистентные к антибиотикам. В случае, если двумя конструкциями сотрансформируют одно и то же событие, наблюдается повышенное содержание масла в тканях трансгенных растений, не относящихся к семенам.

Химерные конструкции ДНК для опосредованной Agrobacterium трансформации применяются для трансформации Zea mays (кукуруза), как описано Gould с соавт., (1991). Вкратце, экспланты верхушек побегов культивируют с трансгенной Agrobacterium в течение двух дней перед перемещением на соленую среду МС, содержащую канамицин и карбенициллин. После нескольких кругов субкультуривирования, самопроизвольно формируются трансформированные побеги и корни, и экспланты переносят в грунт. Кроме того, конструкции применяются для трансформации Hordeum vulgare (ячмень) и Avena sativa (овес) с применением способов трансформации, известных для указанных видов. Вкратце, в случае ячменя применяют культуры Agrobacterium для трансформации клеток в незрелых эмбрионах ячменя (сорт Golden Promise) в соответствии с опубликованными способами (Tingay с соавт., 1997; Bartlett с соавт., 2008) с некоторыми модификациями в том, что эмбрионы длиной от 1,5 до 2,5 мм выделяют из незрелых зерновок и удаляют эмбриональные оси. Полученные экспланты культивируют в течение 2-3 дней с трансгенной Agrobacterium, а затем культивируют в темноте в течение 4-6 недель на средах, содержащих тиментин и гигромицин для генерации эмбриогенного каллюса, после чего переносят в переходные среды в условиях слабой освещенности на две недели. Затем каллюсы переносят в регенерационные среды, чтобы позволить регенерацию побегов и корней, перед переносом регенерировавших ростков в грунт. Трансформированные растения получают и выращивают до стадии зрелости в теплице.

Пример 5. Повышение содержания масла в двудольных растениях

Содержание масла в двудольных растениях вида Trifolium repens (клевер), бобовых, обычно применяемых в качестве пастбищной культуры, повышается при экспрессии комбинации генов WRI1, DGAT и олеозина в вегетативных частях. Конструкцию pJP3502 применяют для трансформации T. repens путем опосредованной Agrobacterium трансформации (Larkin с соавт., 1996). Вкратце, генетическую конструкцию pJP3502 вводят в A. tumefaciens посредством стандартной процедуры электропорации. Бинарный вектор дополнительно содержит ген селекционного маркера 35S:NptII в пределах T-ДНК. Трансформированные клетки Agrobacterium выращивают на твердых средах ЛБ с добавлением канамицина (50 мг/л) и рифампицина (25 мг/л) и инкубируют при 28°C в течение двух дней. Единичную колонию используют для инициации свежей культуры. После 48 часов энергичного культивирования, клетки Agrobacterium применяют для обработки семядоль T. repens (сорт. Haifa), вырезанных из набухшего семени, как описано Larkin с соавт. (1996). После совместного культивирования в течение трех дней экспланты обрабатывают 25 мг/л канамицина, чтобы отобрать трансформированные побеги, а затем переносят в среду для корнеобразования для формирования корней, перед переносом в грунт.

Шесть трансформированных растений, содержащих T-ДНК из pJP3502, были получены и перенесены в грунт в теплице. Повышенное содержание масла наблюдалось в ткани некоторых из растений, не относящейся к семенам, причем одно растение продемонстрировало повышение уровней ТАГ в листьях более чем в 4 раза. Такие растения пригодны в качестве корма для животных, например, путем выращивания растений на пастбищах, что обеспечивает питание с повышенным содержанием энергии на единицу массы (плотность энергии) и приводит к повышению темпов прироста у животных.

Дополнительно, конструкцию pJP3502 применяют для трансформации других бобовых растений, таких как люцерна посевная (Medicago sativa) и люцерна усеченная (Medicago truncatula), по способу Wright с соавт. (2006), с получением трансгенных растений с повышенным содержанием ТАГ в вегетативных частях. Были получены три предполагаемых трансгенных растения M. truncatula. Трансгенные растения пригодны в качестве пастбищной культуры или в качестве сена или силоса как источника питания для животных, таких как крупный рогатый скот, овцы и лошади, обеспечивая повышенную плотность энергии в корме.

С целью повышения содержания масла в семенах бобовых, синтезирован фрагмент ДНК, содержащий комбинацию двух химерных генов, а именно (a) первого химерного гена, кодирующего WRI1 A. thaliana, экспрессируемый промотором запасаемого белка фазеолина бета-типа Phaseolus vulgaris и 5' НТУ плюс (b) второго химерного гена, кодирующего DGAT1 A. thaliana, экспрессируемый промотором вициллина Pisum sativum и 5' НТУ. Фрагмент ДНК вставляют в бинарный вектор pORE04, содержащий химерный ген, кодирующий олеозин, для получения конструкции T-ДНК, содержащей три химерных гена и ген селекционного маркера (Фиг. 2), которую применяют для трансформации Lupinus angustifolius, другого бобового растения, способом, который описан Pigeaire с соавт. (1997). Вкратце, экспланты верхушек побегов L. angustifolius культивируют с трансгенной Agrobacterium перед тщательным увлажнением раствором канамицина (20 мг/мл) и переносом на регенерирующую среду, не содержащую канамицина. Множественные пазушные побеги, развивающиеся из верхушек побегов, вырезают помещают на среду, содержащую 50 мг/л канамицина, и выжившие побеги переносят на свежую среду, содержащую 50 мг/л канамицина. Затем здоровые побеги переносят в грунт. Гены на T-ДНК экспрессируются в клетках трансформированных растений, повышая содержание масла в вегетативных тканях и семенах. Дополнительно применяют специфичный для семени промотор, управляющий геном WRI1, с целью повышения содержания масла в трансгенных семенах Lupinus.

Кроме того, конструкцию применяют для трансформации Glycine max, как описано Zhang с соавт. (1999), с получением трансгенных растений сои с повышенным содержанием ТАГ в семенах. Были получены трансгенные растения, что продемонстрировано ПЦР на ДНК, полученной из образцов растений. Растения выращивали до стадии зрелости и собирали урожай семян. Ожидается, что, по данным неразрушающего ЯМР, содержание масла в семенах будет повышено.

Вторая генетическая конструкция для повышения содержания масла в семенах люпина и сои сконструирована путем синтеза инсерции ДНК, содержащей три кассеты экспрессии генов, а именно первой, содержащей промотор β-конглицинина Glycine max, экспрессирующий DGAT2A Umbelopsis ramanniana, второй, содержащей промотор KTi3 Glycine max, экспрессирующий WRI1 A. thaliana, и третьей, содержащей промотор β-конглицинина Glycine max, экспрессирующий MGAT2 Mus musculus. Фрагмент SbfI-PstI данной инсерции клонируют в бинарный вектор pORE04 на сайте PstI, с получением pJP3569. Версию без гена MGAT2 получают, клонируя фрагмент SbfI-SwaI меньшего размера в pORE04 на сайтах EcoRV-PstI, с получением pJP3570, Кроме того, получены версии, содержащие только ген WRI1 и только ген DGAT2A. Указанные бинарные векторы применяют для трансформации Glycine max с получением трансгенного семени. Содержание масла в семени первичных трансформантов анализируют неразрушающим ЯМР перед посевом, чтобы получить семя T2.

Версия pJP3569, пригодная для трансформации люпина, получена ПЦР амплификацией кассет экспрессии WRI1 и DGAT2A в единичном ампликоне, адаптированном с помощью рестрикционных сайтов NotI. Фрагмент NotI клонируют в pJP3416 на сайте PspOMI с получением бинарного вектора pJP3678, содержащего ген селекционного маркера ФАТ.

Пример 6. Эксперименты для повышения содержания масла в вегетативных частях рапса

Два бинарных вектора экспрессии применяют для трансформации B. napus (сорт Оскар) с целью изучения влияния на аккумуляцию ТАГ в семени и/или вегетативных тканях. Вначале конструируют плазмиды pJP3414 путем инсерции последовательности, кодирующей кодон-оптимизированный белок WRI1 A. thaliana, в бинарный вектор 35S-pORE04, который содержит пустую кассету экспрессии 35S. Таким образом, T-ДНК pJP3414 содержит кодон-оптимизированную версию фактора транскрипции WRI1 A. thaliana под контролем конститутивного промотора 35S. Ткань листа 11 независимо трансформированных саженцев B. napus T0, трансформированных pJP3414, как описано в Примере 1, каждый образец, которой содержит повышенные уровни ТАГ, сравнивают с растениями, трансформированными пустым вектором (pORE04). Однако, ни в одном из случаев уровень ТАГ не превышал 1%. Максимальные уровни были обнаружены в линии 31, которая содержала до 0,58% ТАГ, в пересчете на сухую массу. Содержание масла в трансгенном семени T1 не было существенно повышенным, по сравнению с семенами дикого типа (Оскар) и трансформированными пустым контрольным вектором. Семена T1 трех линий, демонстрирующих самые высокие уровни ТАГ в ткани листа, регенерированы на среде МС, содержащей 3% сахарозы. Не наблюдалось разницы в прорастании через 5 и 8 дней, по сравнению с нетрансформированным контролем (Оскар).

В попытке дополнительного повышения уровней ТАГ в вегетативных тканях B. napus, применяют второй вектор, pJP3502 (Vanhercke с соавт., 2014), для трансформации B. napus (сорт Оскар). Уровни ТАГ количественно определяют в образцах трансгенных листьев, полученных перед цветением. Однако, содержание ТАГ дополнительно не повышается, и состав жирных кислот не отличается от нетрансформированных контрольных растений в такой же стадии роста.

Результаты экспериментов с B. napus, описанных в данном Примере, которые обеспечивают содержание ТАГ в листьях менее чем 1%, абсолютно противоречат приведенным в Примерах 2 и 3 для видов Nicotiana, которые обеспечивают около 20-30% ТАГ. Авторы изобретения тщательно изучали эти результаты в поиске объяснения разницы между видами. Идентифицировано несколько отличий между видами. Одно из отличий, которое изобретатели приняли как обеспечивающее существенную разницу, состояло в принадлежности Brassica napus к так называемым видам 16:3, тогда как вид Nicotiana относится к так называемым видам 18:3. Это связано с относительным вкладом так называемых прокариотных и эукариотных путей в синтез липида в пластидах (Фиг. 1), и, таким образом, по мнению авторов изобретения, с количеством ДАГ, доступным для синтеза ТАГ. Это навело авторов изобретения на идею о том, что модель с модификацией соотношения синтеза жирных кислот через эукариотный путь относительно прокариотного пути, например, уменьшение аккумуляцию 16:3 относительно 18:3, изменила бы уровень ТАГ, который аккумулируется в растительных клетках или фотосинтезирующих микробных клетках. Они ожидали, что модификация, которая изменит баланс в пользу эукариотного пути, будет обеспечивать преимущество с точки зрения уровней аккумуляции ТАГ, особенно в так называемых растениях 16:3. Вкратце, для превращения клеток ʺ16:3ʺ в более сходные с клетками ʺ18:3ʺ.

Авторами изобретения выдвинута гипотеза о том, что присутствие C18:1-АПБ в пластиде, которое ингибирует АККазу по механизм обратной связи, могло бы быть более выражено в растениях 16:3 за счет синтеза и удерживания жирных кислот в пластиде по прокариотному пути. И наоборот, ими выдвинута гипотеза о том, что растения C18:3 способны к аккумуляции более высоких уровней ТАГ в вегетативных тканях за счет повышенного экспорта C18:1 из пластид для снабжения эукариотного пути. Как показано в Примерах 2-4 настоящего документа, это наблюдалось в таких видах, как N. tabacum и N. benthamiana, в которых присутствует более высокое соотношение пластидных липидов C18:3/C16:3 относительно таких видов, как B. napus, которые содержат низкие уровни C18:3 в пластидных липидах. Данная модель, согласно гипотезе авторов изобретения, объяснила бы, почему стабильная трансформация генами экспрессии WRI+DGAT+олеозина из вектора pJP3502 как в N. tabacum, так и в N. benthamiana приводила к высоким уровням аккумуляции ТАГ и обширным изменениям в составе жирных кислот. И наоборот, трансформация таким же вектором B. napus приводила только к незначительному повышению аккумуляции ТАГ и небольшому изменению состава жирных кислот. Данную модель исследовали, как описано ниже.

Пример 7. Модификация пластидной экспрессии GPAT

Повышенная экспрессия пластидной GPAT в растительных клетках

Целый ряд экспериментов выполнялся для проверки гипотезы о том, что присутствие высокоактивного прокариотного пути 16:3 в растении (т.е. так называемом растении 16:3) обеспечивало бы значительно более низкие уровни ТАГ в вегетативных тканях при введении комбинации генов на pJP3502, относительно растений 18:3. Такие эксперименты описаны в следующих Примерах. Вначале, авторы изобретения оценивали, может ли повышенная экспрессия пластидной GPAT воспрепятствовать высокому уровню аккумуляции ТАГ в трансгенном N. benthamiana, увеличивая поток в прокариотном пути.

Кодирующий участок для экспрессии пластидной GPAT Arabidopsis thaliana, ATS1 (Nishida с соавт., 1993), амплифицируют методом ОТ-ПЦР из общей РНК A. thaliana и клонируют в качестве фрагмента EcoRI-PstI в бинарный вектор экспрессии pJP3343 под контролем промотора 35S, с получением конститутивного вектора экспрессии pOIL098. Влияние повышенной экспрессии пластидной GPAT на генетическом фоне высокого содержания масла в листьях определяли путем инфильтрации ткани листа с высоким содержанием масла химерным вектором pOIL098. Ткань листа с высоким содержанием масла генерируют совместной инфильтрацией бинарными векторами экспрессии WRI1 и DGAT (Пример 1) или инфильтрацией pOIL098 листьев растения Nicotiana, стабильно трансформированного T-ДНК из pJP3502 или другого вектора высокого содержания масла. Ожидается, что содержание масла будет снижено в инфильтрованных пятнах на листьях, соэкспрессирующих ген, кодирующий ATS1. Это определяют методом анализа ОЖК и ТАГ как доли от сухой массы образца. Дополнительно, это определяют путем наблюдения за инкорпорацией меченного ацетата в жирные кислоты, продуцированные микросомами или листовыми лизатами, полученными из инфильтрованных пятен на листьях.

Аккумуляция масла в Arabidopsis thaliana с мутантной пластидной GPAT

Мутант ats1 A. thaliana содержит разрушительную мутацию в гене, кодирующем пластидную GPAT, которая снижает активность пластидной GPAT до уровня только 3,8% от дикого типа (Kunst с соавт., 1988). Уровни аккумуляции ТАГ за пределами семян, по меньшей мере в листьях, стеблях и корнях, как в материнской A. thaliana, так и растении с мутантной ats1 оценивают и сравнивают. T-ДНК конструкции pJP3502 для повышенной экспрессии комбинации генов, кодирующих WRI1, DGAT и олеозин, вводят путем трансформации в растения обоих генотипов. Комбинация генов в T-ДНК pJP3502 повышает синтез жирных кислот в обоих типах генетического фона растений. Однако, ожидается, что в присутствии мутантного ats1 аккумуляция ТАГ в среднем будет существенно выше, чем в трансгенных растениях, полученных от генотипа дикого типа (материнский), за счет снижения активности пластидной GPAT и таким образом уменьшения потока жирных кислот в пластидный прокариотный путь. Соотношение C16:3 и C18:3 жирных кислот существенно снижается в листьях с мутантным ats1, как трансформированных, так и нетрансформированных.

Сайленсинг гена, кодирующего пластидную GPAT в растительных клетках

В дополнение к генетической модификации растения введением мутации в ген, кодирующий пластидную GPAT, поток жирных кислот через прокариотный путь 16:3 может быть уменьшен и, таким образом, повышено содержание масла в вегетативных частях путем сайленсинга пластидной GPAT. Это демонстрируется получением трансгенной кассеты, содержащей конститутивный или специфичный для листьев промотор, экспрессирующий шпилечную РНК, соответствующую участку гена, кодирующего пластидную GPAT выбранного вида. В качестве примера, кассету экспрессии шпилечной РНКи получают с использованием фрагмента SalI-EcoRV последовательности кДНК пластидной GPAT A. thaliana размером 581 пара оснований (NM_179407, SEQ ID NO: 177). Кроме того, участок любого гена, кодирующего пластидную GPAT, последовательность которого в высокой степени идентична нуклеотидной последовательности NM_179407, можно применять для конструирования гена с целью экспрессии шпилечной РНК для сайленсинга эндогенного гена пластидной GPAT. Конструкция шпРНКи, содержащая фрагмент пластидной GPAT N. benthamiana размером 732 пары оснований (SEQ ID NO: 219), фланкированный уникальными сайтами SmaI и KasI, разработана с целью стабильной трансформации N. tabacum. Синтезированный фрагмент пластидной GPAT N. benthamiana субклонируют в сайты SmaI-KasI pJP3303, с получением pOIL113. Ожидается, что уменьшение удерживания жирных кислот в пластидах будет приводить к повышению аккумуляции ТАГ, особенно при объединении с компонентом ʺPushʺ, таким как повышенная экспрессия фактора транскрипции, такого как WRI1, или компонентом ʺPullʺ, таким как DGAT или PDAT и/или сниженная активность SDP1 или ТГД.

Инактивация гена, кодирующего пластидную GPAT или, более того, любого гена может быть достигнута с применением способов ККППРП/Cas9. Например, инактивация гена, кодирующего пластидную GPAT A. thaliana (номер доступа NM_179407) может осуществляться разрушением гена, опосредованным ККППРП/Cas9/короткой направляющей РНК (крРНК), с последующим мутагенезом посредством восстановления ДНК негомологичным соединением концов (НГСК). Перед направленным расщеплением ДНК, Cas9 стимулирует разделение цепей ДНК и позволяет КНРНК гибридизоваться со специфической последовательностью длиной 20 нуклеотидов гена-мишени. Это помещает ДНК-мишень в активный сайт Cas9 в надлежащей ориентации относительно сайта связывания с PAM (тандемные гуанозиновые нуклеотиды). Такое расположение позволяет отдельным нуклеазным доменам Cas9 независимо расщеплять каждую цепь последовательности ДНК-мишени в точке, отстоящей на 3 нуклеотида в направлении против хода транскрипции относительно сайта PAM. Далее происходит восстановление двухцепочечного разрыва ДНК путем подверженного ошибкам НГСК, в ходе которого происходят делеции или инсерции нескольких нуклеотидов, что приводит к инактивации гена пластидной GPAT. Последовательности кнРНК, нацеленные на ген GPAT A. thaliana, идентифицированы и отобраны с применением веб-инструмента CRISPRP (Xie с соавт., 2014). Последовательность-мишень длиной 20 нуклеотидов может быть любой последовательностью длиной 20 нуклеотидов в пределах гена-мишени, в том числе в пределах не кодирующих участков гена, таких как промотор или интрон, при условии, что она является специфической последовательностью в пределах генома. Последовательность может быть вставлена в бинарный вектор, содержащий кассету экспрессии ККППРП/Cas9/кнРНК и селекционный маркер канамицина для растений (Jiang с соавт., 2013) и трансформирована в растительные клетки путем опосредованного Agrobacterium превращения. Можно осуществить скрининг трансгенных растений T1 на предмет мутаций в гене пластидной GPAT методом ПЦР амплификации и секвенирования ДНК.

Пример 8. Повышение экспрессии тиоэстеразы в растительных клетках

Синтез жирных кислот de novo происходит в пластидах эукариотных клеток, где жирные кислоты синтезируются при связывании с ацилпереносящим белком в форме конъюгатов ацил-АПБ. После удлинения цепи до ацильных групп C16:0 и C18:0, а затем введения кратной связи в C18:1 во время связывания с АПБ, жирные кислоты отщепляются от АПБ тиоэстеразами и входят в эукариотный путь посредством экспорта из пластид и транспорта в ЭР, где они принимают участие в биогенезе мембран и запасных липидов. В хлоропластах процесс экспорта включает две стадии: во-первых, ацильные цепи высвобождаются в форме свободных жирных кислот по действием ферментов тиоэстераз (тиоэстераза жирного ацила; ТЖА), во-вторых, введение в реакцию с КоА с образованием эфиров ацил-КоА, что катализируется длинноцепочечными ацил-КоА синтетазами (ДЦАС). A. thaliana содержит 3 тиоэстеразы жирного ацила, которые могут отличаться на основании их специфичности в отношении ацильной цепи. FATA1 и FATA2 преимущественно гидролизуют ненасыщенные ацил-АПБ, в то время как насыщенные цепи ацил-АПБ обычно расщепляются FATB.

С целью изучения влияния соэкспрессии тиоэстеразы и генов, кодирующих полипептиды WRI1 и/или DGAT, на содержание общих жирных кислот, содержание ТАГ и состав жирных кислот получают химерные гены для каждой из трех тиоэстераз A. thaliana путем инсерции кодирующих участков в бинарный вектор экспрессии pJP3343 для временной экспрессии в клетках листьев N. benthamiana промотором 35S. Кодирующие белок участки FATA1 A. thaliana (номер доступа NP_189147.1, SEQ ID NO: 202) и FATA2 (номер доступа NP_193041.1, SEQ ID NO: 203) амплифицируют из кДНК стручков с применением праймеров, содержащих сайты EcoRI и PstI, и далее клонируют в pJP3343 с применением таких же рестрикционных сайтов. Полученные векторы экспрессии обозначены pOIL079 и pOIL080, соответственно. Кодирующий белок участок гена FATB A. thaliana (номер доступа NP_172327.1, SEQ ID NO: 204) амплифицируют с применением праймеров, содержащих фланкированные сайты NotI и SacI, и клонируют в соответствующие рестрикционные сайты pJP3343, с получением pOIL081. Конструкциями pOIL079, pOIL080 и pOIL081 инфильтруют ткань листа N. benthamiana, отдельно или в комбинации с конструкциями, содержащими гены. фактора транскрипции WRI1 A. thaliana (AtWRI1) (pJP3414) и/или DGAT1 ацилтрансферазы (AtDGAT1) (pJP3352). Для сравнения, химерные гены, кодирующие FatB1 Cocos nucifera (CnFATB1) (pJP3630), FatB2 C. nucifera (CnFATB2) (pJP3629) вводят в ткань листа N. benthamiana параллельно с тиоэстеразами Arabidopsis, чтобы сравнить влияние полипептидов FatB, обладающих специфичностью в отношении СЦЖК, с тиоэстеразами Arabidopsis, не обладающими специфичностью в отношении СЦЖК. Все эксперименты с инфильтрацией включают химерный ген для экспрессии супрессора сайленсинга p19, как описано в Примере 1. Отрицательный контроль инфильтруют только T-ДНК p19.

Наблюдалось синергетическое влияние для экспрессии тиоэстеразы и повышенной экспрессии WRI1 и/или DGAT на уровни ТАГ в листьях N. benthamiana. Экспрессия генов тиоэстеразы без генов WRI1 или DGAT существенно повышает уровни ТАГ свыше низкого уровня в отрицательном контроле (только p19). Например, экспрессия тиоэстеразы FATB2 кокоса приводила к повышению уровней ТАГ в листьях в 8,2 раза, по сравнению с отрицательным контролем. Соэкспрессия фактора транскрипции WRI1 A. thaliana с каждой из тиоэстераз дополнительно повышала уровни ТАГ, по сравнению с контролем AtWRI1. Соэкспрессия каждой из тиоэстераз CnFATB1 и CnFATB2 кокоса с WRI1 приводила к более высоким уровням ТАГ, чем каждой из трех тиоэстераз A. thaliana с WRI1. Интересно, что противоположное наблюдалось, если ацилтрансфераза DGAT1 A. thaliana соэкспрессировалась в комбинации с тиоэстеразой и WRI1. Это наводит на мысль о лучшей специфичности в отношении ацильной цепи тиоэстераз A. thaliana и ацилтрансферазы DGAT1 A. thaliana, что приводит к увеличенному потоку ацильных цепей от ацил-АПБ в ТАГ. Кроме того, не-СЦЖК тиоэстеразы были значительно более эффективны с точки зрения увеличения процента олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот в листьях. Соэкспрессия AtWRI1, AtDGAT1 и AtFATA2 приводила к наиболее высокому уровню ТАГ в листьях, обеспечивая уровень, который более чем в 1,6 раза превышал наблюдаемый при соэкспрессии AtWRI1 и AtDGAT1 без тиоэстеразы. Указанные эксперименты подтвердили синергетическое повышение синтезе и аккумуляции масла, при соэкспрессии WRI1 и DGAT, а также продемонстрировали дальнейшее синергетическое увеличение при добавлении тиоэстеразы к комбинации.

Три различных бинарных вектора экспрессии сконструированы для оценки влияния соэкспрессии генов, кодирующих WRI1, DGAT1 и FATA, на уровни ТАГ и состав жирных кислот в листьях стабильно трансформированного N. tabacum. Вектор pOIL121 содержит ген SSU::AtWRI1 для экспрессии AtWRI1 промотором SSU, гена 35S::AtDGAT1 для экспрессии AtDGAT промотором 35S и гена enTCUP2::AtFATA2 для экспрессии AtFATA2 промотором enTCUP2, который является конститутивным промотором. Указанные генетические конструкции получают из pOIL38, вначале расщепляя ДНК с помощью NotI для удаления гена, кодирующего олеозин S. indicum. Кодирующий белок участок гена FATA2 A. thaliana амплифицируют и фланкируют сайтами NotI с применением ДНК pOIL80 в качестве шаблона. Далее этот фрагмент вставляют в сайт NotI pOIL38. Затем pOIL121 служит материнским вектором для pOIL122, который содержит дополнительную кассету шпилечной РНК enTCUP2::SDP1 для опосредованного РНКи сайленсинга эндогенного гена SDP1 в трансгенных растениях. Чтобы этого достичь, полноразмерную кассету шпильки SDP1 N. benthamiana выделяют из pOIL51 (Пример 11) в виде фрагмента SfoI-SmaI и клонируют в сайт SfoI pOIL121, с получением pOIL122 (Фиг. 3). Третий вектор, pOIL123, содержащий гены SSU::WRI1 и 35S::DGAT1 и ген шпилечной РНК enTCUP2::SDP1 получают подобным образом, клонируя кассету шпилечной РНК enTCUP2::SDP1 в виде фрагмента SfoI-SmaI в сайт SfoI pOIL36.

Вкратце, векторы содержали комбинации генов:

pOIL121: SSU::AtWRI1, 35S::AtDGAT1, enTCUP2::AtFATA2.

pOIL122: SSU::AtWRI1, 35S::AtDGAT1, enTCUP2::AtFATA2, enTCUP2::шпилька SDP1.

pOIL123: SSU::AtWRI1, 35S::AtDGAT1, enTCUP2::шпилька SDP1.

Каждую из трех конструкций применяют для получения трансформированных растений N. tabacum (сорт Wi38) путем опосредованной Agrobacterium трансформации. Каждое из соэкспрессии тиоэстеразы FATA2 A. thaliana или сайленсинга эндогенной липазы ТАГ SDP1 в комбинации с экспрессией AtWRI1 и AtDGAT1 приводило к дальнейшему повышению уровней ТАГ, по сравнению с экспрессией AtWRI1 и AtDGAT1 в отсутствие как гена тиоэстеразы, так и гена сайленсинга SDP1. Наиболее высокий выход ТАГ получают с применением pOIL122 посредством сочетанного действия всех четырех химерных генов.

Необходимо отметить, что N. benthamiana является растением 18:3. Такие же конструкции pOIL079, pOIL080 и pOIL081 применяются для трансформации A. thaliana, растения 16:3.

Авторами изобретения была задумана модель, повышающая пластидный экспорт жирных кислот, например, снижения аккумуляции ацил-АПБ в пластидах путем повышения активности тиоэстеразы жирного ацила, таким образом, повышая биосинтеза жирных кислот в результате снижения ингибирования ацетил-КоА карбоксилазы (АККазы) по механизму обратной связи (Andre с соавт., 2012; Moreno-Perez с соавт., 2012). Повышенная экспрессия тиоэстеразы повышает экспорт ацильных цепей из пластид в ЭР, таким образом, предлагая эффективную связь между так называемыми «Push» и «Pull» стратегиями метаболического конструирования.

Пример 9. Выработка среднецепочечных жирных кислот в вегетативных растительных клетках

Eccleston с соавт. (1996) изучали аккумуляцию C12:0 и C14:0 жирных кислот как в семенах, так и в листьях трансгенных растений Brassica napus, трансформированных конститутивно экспрессирующимся геном, кодирующим тиоэстеразу California Bay Laurel 12:0-АПБ (Umbellularia californica). В указанном исследовании сообщалось об аккумуляции значительных уровней C12:0 в зрелых семенах B. napus, но только очень низкие уровни C12:0 наблюдались в ткани листа, несмотря на высокие уровни экспрессии и активности тиоэстеразы 12:0-АПБ. Такие же результаты были получены при трансформации гена в A. thaliana (Voelker с соавт., 1992). Данное исследование было расширено соэкспрессией LPAAT Cocos nucifera и тиоэстеразы Umbellularia californica, что приводило к повышению аккумуляции общей C12:0, в также к увеличению фракции трилаурина в семенах B. napus (Knutzon с соавт., 1999). Таким образом, уровень техники указывает на то, что синтез среднецепочечных жирных кислот (СЦЖК) в вегетативных растительных клетках был проблематичным.

Для оценки влияния введения тиоэстераз, обладающих специфичностью в отношении СЦЖК, в комбинации с другими генами, описанными в настоящем документе, химерные ДНК для экспрессии несколько различных тиоэстераз синтезированы и введены в растительные клетки, отдельно или в комбинациях. Кодирующие белок участки для тиоэстераз из организмов, которые доказанно вырабатывают СЦЖК (Jing с соавт., 2011), синтезируют и вставляют в виде фрагментов EcoRI в бинарный вектор pJP3343, который содержит кассету экспрессии промотора 35S (Vanhercke с соавт., 2013). Тиоэстеразы были следующими: тиоэстераза Cinnamomum camphora14:0-АПБ (обозначена как Cinca-TE) (Yuan с соавт., 1995; номер доступа Q39473.1; SEQ ID NO: 193), ацил-АПБ тиоэстераза FatB1 Cocos nucifera (Cocnu-TE1;номер доступа AEM72519.1 SEQ ID NO: 194), ацил-АПБ тиоэстераза FatB2 Cocos nucifera (Cocnu-TE2; номер доступа AEM72520.1; SEQ ID NO: 195), ацил-АПБ тиоэстераза FatB3 Cocos nucifera (Cocnu-TE3; номер доступа AEM72521.1; SEQ ID NO: 196), ацил-(АПБ) тиоэстераза типа B Cuphea lanceolata (Cupla-TE) (Topfer с соавт., 1995; номер доступа CAB60830.1; SEQ ID NO: 197), Cuphea viscosissima FatB1 (Cupvi-TE; номер доступа AEM72522.1; SEQ ID NO: 198) и 12:0-АПБ тиоэстераза Umbellularia californicа (Umbca-TE) (Voelker с соавт., 1992; номер доступа Q41635.1; SEQ ID NO: 199). Все указанные тиоэстеразы принадлежат к классу FATB и обладают специфичность в отношении СЦЖК. Дополнительно были клонированы кодирующие белок участки для LPAAT C. nucifera (Cocnu-LPAAT, тип СЦЖК) (Knutzon с соавт., 1995; номер доступа Q42670.1; SEQ ID NO: 200) и пластидной LPAAT1 A. thaliana (Arath-PLPAAT; номер доступа AEE85783.1; SEQ ID NO: 201). Ранее было показано, что Cocnu-LPAAT повышает инкорпорацию СЦЖК в положении sn-2 ТАГ в семенах (Knutzon с соавт., 1995), тогда как пластидную LPAAT A. thaliana (Arath-PLPAAT) (Kim с соавт., 2004) применяли в качестве контрольной LPAAT, чтобы определить влияние любой специфичности в отношении СЦЖК, которой Cocnu-LPAAT может обладать. Первая LPAAT использует ацил-КоА в качестве одного субстрата и в своем природном окружении функционирует в ЭР, тогда как последняя ПLPAAT использует ацил-АПБ в качестве субстрата и функционирует в пластиде.

Гены тиоэстеразы вводят в листья Nicotiana benthamiana путем опосредованной Agrobacterium инфильтрации, как описано в Примере 1, наряду с геном для соэкспрессии супрессора сайленсинга p19 и Cocnu-LPAAT или Arath-ПLPAAT, чтобы определить, могут ли СЦЖК вырабатываться в листовой ткани N. benthamiana. Инфильтрованные зоны листьев собирают и лиофилизируют в течение пяти дней после инфильтрации со смесями Agrobacterium, после чего определяют общее содержание и состав жирных кислот методом ГХ, как описано в Примере 1 (Таблица 7). Для данных, приведенных в Таблице 7, ошибка представляет стандартное отклонение для трех инфильтраций. Инфильтрованные зоны контрольных листьев содержали только следовые (< 0,1%) или нулевые уровни C12:0 и C14:0 жирных кислот, тогда как C16:0 присутствовала в количестве 14,9%±0,6 в ОЖК общих липидов листа. Уровни C12:0 значительно повышались только при экспрессии Cocnu-TE3 (1,2%±0,1) и Umbca-TE (1,6%±0,1). Экспрессия каждой из изучаемых тиоэстераз приводила к аккумуляции C14:0 в листьях N. benthamiana, причем Cinca-TE давала наиболее высокий уровень, 11,3%±1,0, Кроме того, экспрессия каждой из тиоэстераз, за исключением Umbca-TE, приводит к повышенным уровням C16:0. Наиболее высокий уровень аккумуляции C16:0 (35,4%±4,7) наблюдается при экспрессии Cocnu-TE1. Выраженный некроз инфильтрованных зон наблюдался в листьях при экспрессии только генов FATB, который, похоже, коррелирует с уровнем выработки СЦЖК. Авторы изобретения считают, что некроз, вероятно, возникает за счет уровней свободных жирных кислот (СЖК) выше оптимальных, а также за счет обширной аккумуляции СЦЖК скорее в фосфолипидных пулах липида, чем в ТАГ.

Таблица 7. Состав общих жирных кислот листа (% от общих жирных кислот листа) для выбранных жирных кислот в листьях Nicotiana benthamiana, инфильтрованных различными тиоэстеразами (ТЭ) и LPAAT. Результаты сгруппированы по соинфильтрованому гену (единичные гены (кроме p19, присутствующего во всех образцах), Arath-LPAAT+различные ТЭ, Cocnu-LPAAT+различные ТЭ). «Контроль» означает неинфильтрованный лист N. benthamiana, тогда как «только p19» содержит только ген супрессора сайленсинга. 16:3 представляет собой 16:3Δ7,10,13; 18:3 представляет собой 18:3Δ9,12,15. Гены идентифицированы, как определено в тексте.

12:0 14:0 16:0 16:3 18:3
Контроль 0,2±0 0,1±0 14,0±0,2 8,1±0,1 57,2±0
только p19 0,2±0 0,1±0 14,9±0,6 7,0±0,8 53,1±0,7
Тесты для одинарного гена Cinca-TE 0,4±0 11,3±1,0 21,9±0,7 5,0±0,2 38,5±1,0
Cocnu-TE1 0,2±0 6,3±0,6 35,4±4,7 4,2±1,4 29,9±5,5
Cocnu-TE2 0,2±0 7,1±0,3 31,9±2,2 4,7±0,5 32,9±2,8
Cocnu-TE3 1,2±0,1 7,2±1,3 19,6±1,6 5,7±0,5 44,8±2,9
Cupla-TE 0,2±0 1,1±0,2 21,8±2,9 6,0±0,6 48,2±3,1
Cupvi-TE 0,2±0 0,6±0,1 17,3±1,3 6,4±0,4 52,9±2,1
Umbca-TE 1,6±0,1 1,1±0,2 14,4±0,8 6,5±0,3 52,7±0,1
Arath-LPAAT 0,2±0 0,4±0,5 17,4±1,0 6,2±0,3 51,4±1,3
Cocnu-LPAAT 0,1±0,1 0,1±0 15,1±1,5 6,7±0,5 52,2±4,2
+Arath-LPAAT Cinca-TE 0,2±0 7,8±0,1 24,6±0,4 5,3±0,2 39,2±1,5
Cocnu-TE1 0,2±0 4,6±1,3 35,3±1,4 4,4±0,7 32,7±2,0
Cocnu-TE2 0,2±0 6,1±0,4 32,5±1,8 4,7±0,1 34,1±0,6
Cocnu-TE3 0,9±0,2 8,5±0,4 21,4±1,9 5,6±0,2 41,7±0,6
Cupla-TE 0,2±0 1,0±0,1 23,4±2,7 5,9±0,5 47,3±1,2
Cupvi-TE 0,2±0 0,6±0 19,0±0,2 6,3±0,1 51,4±1,0
Umbca-TE 1,2±0,2 1,1±0,1 15,4±0,2 6,5±0,2 52,3±1,3
+Cocnu-LPAAT Cinca-TE 0,7±0,2 14,9±1,6 23,0±3,7 4,8±1,4 35,4±3,3
Cocnu-TE1 0,2±0 5,4±0,9 40,2±2,8 3,3±0 27,8±1,1
Cocnu-TE2 0,2±0 6,6±1,0 38,3±1,1 3,7±0,2 28,2±1,1
Cocnu-TE3 2,0±0,3 10,9±1,0 24,4±1,8 4,9±0,5 37,7±0,9
Cupla-TE 0,5±0,1 1,6±0,3 22,2±0,6 6,0±0,3 46,9±2,0
Cupvi-TE 0,5±0 1,1±0 19,6±0,8 6,0±0,2 49,8±0,3
Umbca-TE 3,3±0,5 1,2±0,1 13,9±0,4 6,4±0,2 51,3±1,7

Соинфильтрация химерным геном для экспрессии Arath-PLPAAT с тиоэстеразами демонстрирует тенденцию к снижению аккумуляции как C12:0, так и C14:0, по сравнению с отсутствием LPAAT, при небольшом повышении аккумуляции C16:0. И наоборот, соинфильтрация генами для экспрессии Cocnu-LPAAT или Umbca-TE повышает аккумуляцию C12:0 до 3,3%±0,5, тогда как обнаруженная аккумуляция C14:0 в образце Cinca-TE+Cocnu-LPAAT составляет 14,9%±1,6. Самые высокие уровни C16:0 наблюдались после соэкспрессии Cocnu-TE1 и Cocnu-LPAAT (40,2%±2,8). Добавление LPAAT к каждой зоне инокуляции снижает степень некроза листовой ткани. Неожиданно было обнаружено, что C8:0 и C10:0 жирные кислоты также вырабатывались в растительных клетках в экспериментах с временной экспрессией. Аккумуляция C8:0 и C10:0 не наблюдается при экспрессии только тиоэстеразы. Однако, если экспрессия тиоэстеразы сочетается с соэкспрессией CuphoFatB с CnLPAAT и AtWRI1, обнаруживается присутствие C8:0 в концентрации 0,27 ± 0,09% от общего содержания жирных кислот в растительных клетках. Кроме того, в случае соэкспрессии CuplaFatB с CnLPAAT и AtWRI1, было обнаружено присутствие C10:0 в 0,54 ± 0,16% от общего содержания жирных кислот.

Полученные результаты указывают на то, что специфичность тиоэстераз в отношении ацила, о которой сообщалось ранее, наблюдаемая при экспрессии в семени, по существу сохранялась в листьях N. benthamiana, и указанная система экспрессии была валидной системой для оценки специфичности в отношении ацила. Добавление пластидной ПLPAAT A. thaliana не повышает аккумуляции СЦЖК, хотя иприводит к несколько повышенной аккумуляции C16:0 в клетках A. thaliana. И наоборот, LPAAT C. nucifera повышает аккумуляцию в листьях N. benthamiana, жирных кислот C12:0, C14:0 и C16:0, которые найдены в масле C. nucifera (Laureles с соавт., 2002). Это указывает на то, что природная LPAAT N. benthamiana не экспрессируется с высокими уровнями в листовой ткани или не обладает высокой активностью в отношении субстратов C12:0, C14:0 и C16:0.

Выработка среднецепочечных жирных кислот в вегетативных растительных клетках, аккумулирующих высокие уровни ТАГ

Авторами изобретения ранее была достигнута выработка 15% ТАГ в листьях N. tabacum путем координированной экспрессии химерных генов, кодирующих WRI1 A. thaliana, DGAT1 A. thaliana и олеозин S. indicum (Vanhercke с соавт., 2014). Для оценки возможности достижения или повышения аккумуляция СЦЖК, которая наблюдалась после экспрессии тиоэстераз в комбинации с LPAAT, в растительных клетках, вырабатывающих высокие уровни ТАГ (Vanhercke с соавт., 2013), указанные гены соэкспресируют. Осуществляют инфильтрацию комбинациями C12:0, C14:0 и C16:0 тиоэстеразы/LPAAT с наилучшими результатами (Cocnu-LPAAT плюс тиоэстераза Umbca-TE, Cinca-TE и Cocnu-TE2, соответственно), с предварительно описанными комбинациями Arath-WRI1+DGAT и без них (Vanhercke с соавт., 2013). Данные проиллюстрированы на Фиг. 4.

Аккумуляция соответствующих СЦЖК (C12:0 для Umbca-TE, C14:0 для Cinca-TE и C16:0 для Cocnu-TE2) является систематической и значительно повышается, в основном при добавлении Arath-WRI1 к комбинациям: C12:0 составляет 9,5%±0,9 от общих жирных кислот листа в образцах Umbca-TE+Cocnu-LPAAT+Arath-WRI1, уровень C14:0 составляет 18,5%±2,6 в образцах Cinca-TE+Cocnu-LPAAT+Arath-WRI1, и уровень C16:0 составляет 38,3%±3,0 в образцах Cocnu-TE2+Cocnu-LPAAT+Arath-WRI1. Обнаружено, что инфильтрация тиоэстеразой плюс Arath-WRI1 оказывает существенно более выраженное влияние на C12:0 в присутствии Umbca-TE, на C14:0 в присутствии Cinca-TE и на C16:0 в присутствии Cocnu-TE2, по сравнению с инфильтрацией тиоэстеразой плюс Cocnu-LPAAT в отсутствие WRI1 (Фиг. 5). Добавление Cocnu-LPAAT к смесям тиоэстераза плюс Arath-WRI1 оказывало влияние на состав жирных кислот, с относительно небольшим повышением C12:0 и C14:0, наблюдаемом в наборах Umbca-TE и Cinca-TE, и небольшим снижением C16:0 в наборе Cocnu-TE2. Максимальные зарегистрированные уровни составляли: 8,8%±1,1 C12:0 в общих жирных кислотах листа, наблюдаемые в образцах Umbca-TE+Arath-WRI1+Cocnu-LPAAT, 14,1%±3,5 C14:0 в образцах Cinca-TE+Arath-WRI1+Cocnu-LPAAT и 48,6%±3,7 C16:0 в образцах Cocnu-TE2+Arath-WRI1.

Интересно, что единственной тиоэстеразой, для которой Arath-WRI1 не повышает настолько сильно аккумуляцию СЦЖК, является Cocnu-TE2, хотя аккумуляция по-прежнему значительно возрастает. Добавление только указанного гена приводит к повышению аккумуляции C16:0 с 16,0%±0,4 до 37,3%±0,6, тогда как дальнейшее добавление Arath-WRI1 увеличивает данный показатель только на 48,6%±1,7. Это может происходить благодаря промежуточным соединениям C12:0 и C14:0, относительно недолго существующим в ходе пластидного синтеза жирных кислот, по сравнению с C16:0.

Другие эффекты, которые были отмечены, включают повышение уровней C16:0 и C18:1Δ9 и снижение уровня C18:3Δ9,12,15 в присутствии Arath-WRI1. Дальнейшее добавление Cinca-TE и Cocnu-TE2 все еще дополнительно снижает уровни C18:3Δ9,12,15. В противоположность этому, дополнительное количество C12:0 вырабатывается после добавления Arath-WRI1 к Umbca-TE, по-видимому, скорее за счет C16:0, чем дополнительного количества C18:3Δ9,12,15 (Фиг. 5).

Дополнительно, подмножество образцов было проанализировано методом ЖХ-МС, с целью лучшего понимания аккумуляции СЦЖК. Пластидные галактолипиды моногалактозилдиацилглицерин (MGDG) и дигалактозилдиацилглицерин (ДГДГ) содержат только низкие уровни C12:0 и C14:0 и сниженные уровни C16:0, по сравнению с инфильтрацией контрольным p19. Основным видом C12:0-содержащих MGDG в образцах Umbca-TE является 30:3, указывая на то, что одна C18:3 и одна C12:0 были солокализованы на моногалактозильном скелете. Другим основным видом C12:0-содержащих MGDG является 28:0, указывая на то, что второй жирной кислотой является C16:0. Основными видами C14:0-содержащих MGDG в образцах Cinca-TE являются 28:0 и 30:0, указывая на то, что значительная доля C14:0 в MGDG принадлежит ди-C14:0 или C16:0. C12:0-содержащие и C14:0-содержащие MGDG не были обнаружены в контрольной выборке p19. И наоборот, C16:0-содержащие виды MGDG демонстрируют тенденцию к снижению в образцах Cocnu-TE2. Все основные виды MGDG в образцах дикого типа (C16:3-содержащий 34:6, C18:3-содержащий 34:6 и C18:3-содержащий 36:6) демонстрируют тенденцию к снижению при экспрессии трансгенов. Указанное снижение является наиболее выраженным в присутствии комбинации WRI+DGAT.

Только следовые уровни C12:0-содержащих видов ДГДГ наблюдаются в образцах Umbca-TE. Основными C14:0-содержащими видами, наблюдаемыми в образцах Cinca-TE, являются 28:0 и 30:0, оба из которых отсутствуют в контроле. Кроме того, указанные виды наблюдаются с повышенными уровнями в образцах Cocnu-TE2, но только со следовыми уровнями в образцах Umbca-TE. Все основные виды ДГДГ в образцах дикого типа (C16:0-содержащий 34:3, C18:3-содержащий 34:3 и C18:3-содержащий 36:6) демонстрируют тенденцию к снижению при экспрессии трансгенов. Указанное снижение является наиболее выраженным в присутствии WRI.

Подобным образом, содержание видов ТАГ в общем значительно повышено во всех образцах, содержащих WRI+DGAT, как было описано ранее (Vanherckeetal.,2013) (Vanhercke с соавт., 2013). Обнаружено, что виды C12:0 являются преобладающими в высоком образце Umbca-TE ТАГ, виды C14:0 в образце Cinca-TE с высоким содержанием ТАГ, и виды C16:0 в высоком образце Cocnu-TE2 ТАГ. Анализ фракции ТАГ методом ЖХ-МС демонстрирует, что C12:0-содержащий 36:0 является преобладающим видом ТАГ, в два раза превышая уровень видов ТАГ, содержащих C18:3, во всех образцах Umbca-TE, содержащих фактор транскрипции WRI. Кроме того, C14:0-содержащий 42:0, является преобладающим видом ТАГ в образцах Cinca-TE, сотрансформированных LPAAT, DGAT, WRI или WRI+DGAT, хотя ответ значительно более выражен в случае образцов, содержащих WRI. Содержание нескольких C16:0-содержащих видов ТАГ значительно повышено как в образцах Cinca-TE с высоким содержанием ТАГ (например, 44:0 и 50:3), так и в образцах Cocnu-TE2 (например, 46:0, 48:0, 50:2 и 50:3). Повторимся, наиболее выраженное повышение уровня C16:0 наблюдается в присутствии WRI.

Стабильная трансформация для выработки СЦЖК в вегетативных тканях

Получена серия генетических конструкций в бинарном векторе, с целью стабильной трансформации растений, например, табака комбинациями генов для выработки СЦЖК в вегетативных тканях, чтобы идентифицировать оптимальные комбинации генов. Указанные конструкции содержат ген для экспрессии WRI1 под контролем промотора SSU (см. Пример 8, pOIL121) или специфичного для старения промотора SAG12, ген, кодирующий DGAT масличной пальмы (ниже), ген, кодирующий LPAAT кокоса (CocnuLPAAT, см. выше) под контролем промотора enTCUP, и несколько генов, экспрессирующих различные тиоэстеразы жирного ацила (FATB), экспрессируемые промотором 35S или промотора SAG12. Они описаны ниже.

Клонирование гена, кодирующего DGAT Elaeis guineensis (масличная пальма)

Для начальной оценки различных ферментов DGAT, в том числе характерных ферментов DGAT1, DGAT2 и DGAT3, последовательности-кандидаты DGAT масличной пальмы были идентифицированы на основе опубликованной транскриптомы (Dussert с соавт., 2013) и кодон-оптимизированы для экспрессии в Nicotiana tabacum. Далее кодирующие белок участки по отдельности клонируют в бинарные векторы экспрессии под контролем промотора 35S для оценки в экспериментах с временной экспрессией в листьях N. benthamiana, как описано в Примере 1. Изученные комбинации гена являются такими, как указано ниже:

1 P19 (отрицательный контроль)

2 P19+CnLPAAT+WRI1

3 P19+CnLPAAT+AtWRI1+AtDGAT1

4 P19+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT1

5 P19+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT2

6 P19+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT3

7 P19+CincaFatB

8 P19+CincaFatB+CnLPAAT+WRI1

9 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+AtDGAT1

10 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT1

11 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT2

12 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT3

Результаты для уровней ОЖК и ТАГ, а также уровней общих СЦЖК в ОЖК или ТАГ проиллюстрированы на Фиг. 6. По сравнению с AtDGAT1, экспрессия EgDGAT1 приводит к более выраженной аккумуляции общих жирных кислот и повышенных уровней ТАГ. Общее содержание СЦЖК в общем содержании жирных кислот снижается при экспрессии EgDGAT1, по сравнению с AtDGAT1, но уровни СЦЖК, присутствующих в ТАГ, остаются такими же (Фиг. 6).

Подготовка генетических конструкций

Генетические конструкции для стабильной трансформации (Таблица 8) собирают посредством последовательной инсерции кассет генов с применением совместимых сайтов рестрикционных ферментов. Четыре генных конструкции (Таблица 8), каждая из которых содержит ген, кодирующий DGAT1 масличной пальмы (EgDGAT1), который экспрессируется промотором 35S, ген, кодирующий LPAAT C. nucifera (CnLFAAT), который экспрессируется из конститутивного промотора enTCUP2, и ген, кодирующий AtWRI1, который экспрессируется промотором SSU или промотора SAG12, в дополнение к одной из серий генов, кодирующих ферменты FATB.

Кроме того, пять генных конструкций содержат ген для экспрессии шпилечной РНК с целью снижения экспрессии эндогенного гена, кодирующего ацил-активизирующий фермент (ААФ). Шпилька сконструирована на основе сходства последовательности с идентифицированным AAE15 Arabidopsis lyrata (EFH44575.1) и геномом N. benthamiana. Показано, что ААФ принимают участие в повторной активации СЦЖК, и, таким образом, дальнейшем удлинении. Предполагалось, что сайленсинг ААФ может повысить аккумуляцию СЦЖК. Кассету шпильки конструируют в векторе pKANNIBAL, а затем субклонируют в вектор экспрессии pWBVec2 (Wang с соавт., 2004), с экспрессией шпильки под контролем промотора 35S.

Таблица 8. Краткое описание собранных генетических конструкций.

Конструкция Комбинация генов
Конструкции с одинарным геном pKR1 35S::UmbcaFATB
pKR2 35S::CincaFATB
pKR3 35S::CocnuFATB2
pOIL115 SAG12::CincaFATB
pOIL116 SAG12::UmbcaFATB
pOIL117 SAG12::CocnuFATB2
Компоненты конструкции pOIL300 35S::EgDGAT1
pOIL301 Конструкция enTCUP::CnLPAAT в конструкции FATBrmediaFATB
pOIL302 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT
pOIL303 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1
pOIL304 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1
Конструкции с четырьмя генами pOIL305 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+35S::UmbcaFATB
pOIL306 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+35S::CincaFATB
pOIL307 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+35S::CocnuFATB2
pOIL308 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+SAG12::UmbcaFATB
pOIL309 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+SAG12::CincaFATB
pOIL310 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+SAG12::CocnuFATB2
pOIL311 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+35S::UmbcaFATB
pOIL312 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+35S::CincaFATB
pOIL313 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+35S::CocnuFATB2
pOIL314 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+SAG12::UmbcaFATB
pOIL315 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+SAG12::CincaFATB
pOIL316 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+SAG12::CocnuFATB2
Конструкции с пятью генами pOIL317 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+35S::UmbcaFATB+35S::hpNbAAE
pOIL318 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+35S::CincaFATB+35S::hpNbAAE
pOIL319 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+35S::CocnuFATB2+35S::hpNbAAE
pOIL320 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+SAG12::UmbcaFATB+35S::hpNbAAE
pOIL321 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+SAG12::CincaFATB+35S::hpNbAAE
pOIL322 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SSU:AtWRI1+SAG12::CocnuFATB2+35S::hpNbAAE
pOIL323 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+35S::UmbcaFATB+35S::hpNbAAE
pOIL324 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+35S::CincaFATB+35S::hpNbAAE
pOIL325 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+35S::CocnuFATB2+35S::hpNbAAE
pOIL326 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+SAG12::UmbcaFATB+35S::hpNbAAE
pOIL327 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+SAG12::CincaFATB+35S::hpNbAAE
pOIL328 35S::EgDGAT1+enTCUP::CnLPAAT+SAG12:AtWRI1+SAG12::CocnuFATB2+35S::hpNbAAE

Указанные генетические конструкции применяют для получения трансформированных растений табака сортов Висконсин 38 и линии с высоким содержанием масла, трансформированной T-ДНК из pJP3502. Наблюдается, что растения, трансформированные конструкциями с одним геном FATB, экспрессирующимся промотором 35S, были существенно меньше, чем трансформированные соответствующей конструкцией FATB, экспрессирующейся промотором SAG12 или, конструкциями с четырьмя генами. Считалось, что меньший размер растений вызван синтезом СЦЖК, которые не инкорпорировались эффективно в ТАГ.

Обсуждение

В настоящем исследовании обнаружено, что выработка C12:0 в листовых клетках составляет только около 1,6% от общего содержания жирных кислот после экспрессии только Umbca-TE (Таблица 7). Добавление гена для экспрессии Arath-WRI оказывает более выраженное влияние на аккумуляцию C12:0 и C14:0 в листовой ткани, чем добавление LPAAT кокоса (Фиг. 4 и 5). Это показывает, что WRI1 в комбинации с тиоэстеразой значительно повышает аккумуляцию СЦЖК в листовых клетках, действуя синергетически. Важно отметить, что обнаружена аккумуляция большей части C12:0, C14:0 и C16:0 в листьях в форме ТАГ, липида, который не аккумулируется со значительными уровнями в листьях дикого типа. Данные эксперименты продемонстрировали, что клетки в вегетативных частях растений могут быть модифицированы таким образом, чтобы вырабатывать СЦЖК, особенно C12:0 и C14:0, в ТАГ с высокими уровнями. Дополнительно, уровни C16:0 были значительно повышены.

Пример 10, Влияние различных полипептидов фактора транскрипции на аккумуляцию ТАГ

В экспериментах с WRI1 и DGAT, о которых сообщалось ранее (Vanhercke с соавт., 2013), применяли синтетический ген, кодирующий AtWR I1 A. thaliana (номер доступа AAP80382.1), и синтетический ген, кодирующий AtDGAT1, также из A. thaliana (номер доступа AAF19262; SEQ ID NO: 1). Для сравнения других полипептидов WRI с AtWRI1 на предмет их способности объединяться с DGAT для повышения содержания масла, другие последовательности, кодирующие WRI, были идентифицированы и использованы при генерации конструкций для экспрессии в листьях N. benthamiana. Нуклеотидные последовательности, кодирующие факторы транскрипции A. thaliana WRI3 (номер доступа AAM91814.1, SEQ ID NO: 205) и WRI4 (номер доступа NP_178088.2, SEQ ID NO: 206) (To с соавт., 2012), синтезированы и вставлены в виде фрагментов EcoRI в pJP3343 под контролем промотора 35S. Результирующие бинарные векторы экспрессии обозначены pOIL027 и pOIL028, соответственно. Кодирующую последовательность для WRI1 (AsWRI1, SEQ ID NO: 207) овса (Avena sativa) амплифицируют методом ПЦР из вектора, предложенного проф. Sten Stymne (Шведский университет сельскохозяйственных наук), с применением фланкирующих праймеров, содержащих дополнительные сайты EcoRI. Амплифицированный фрагмент вставляют в pJP3343 с получением pOIL055. Последовательность-кандидат WRI1 из S. bicolor (номер доступа XP_002450194.1, SEQ ID NO: 208) идентифицирована поиском BLASTp на сервере Национального центра биотехнологической информации (НЦБИ) с применением аминокислотной последовательности WRI1 Zea mays (номер доступа NP_001137064.1, SEQ ID NO: 209) в качестве запроса. Кодирующий белок участок гена WRI1S. bicolor (SbWRI1) синтезирован и вставлен в виде фрагмента EcoRI в pJP3343, с получением pOIL056. Ген-кандидат, кодирующий WRI1, идентифицирован из транскриптомы китайского сального дерева (Triadica sebifera; TsWRI1, SEQ ID NO: 210) (Uday с соавт., подана)