Система crispr-cas для выявления гена антибиотикоустойчивости blavim-2 (металло-бета-лактамаза класс b vim-2) pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к молекуле направляющей РНК системы CRISPR/CAS. Также раскрыт рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, сформированный из РНК-направлясмой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae и по меньшей мере одной из вышеуказанных направляющих РНК. Изобретение также относится к набору, содержащему вышеуказанную молекулу или вышеуказанный комплекс. Изобретение обеспечивает выявление единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 13 ил., 5 табл., 5 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa.

Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa после проведения специфической амплификации фрагмента ДНК гена blaVIM-2. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CR1SPR технологий для борьбы с распространением антибиотикоустойчивых бактериальных патогенов.

Уровень техники

Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.

В 2018 году было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Casl2 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную, а также двухцепочечную ДНК. Такое свойство Casl2 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии.

Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR транс репортер). Впервые DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека (HPV). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12а, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте HPV, флуоресцентную репортерную молекулу. Технология DETECTR используется для обнаружения целевой ДНК-мишени после предварительной амплификации (Chen JS, Ma Ε, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna J A. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27;360(6387):436-439).

He менее важным приложением системы CRISPR/CAS является идентификация бактериальных патогенов и детекция специфических бактериальных генов. Так, например, с помощью платформы SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing - Специфичное Высокочувствительное Ферментативное Репортерное Разблокирование) удалось корректно генотипировать ряд штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa при низкой перекрестной реактивности. Кроме того, платформа SHERLOCK использована для дифференциации клинических изолятов Klebsiella pneumoniae с двумя различными генами антибиотикоустойчивости, что открывает значительные перспективы к созданию мультиплексных систем для одновременной идентификации бактериальных патогенов и выявления у них генов антибиотикоустойчивости.

В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/CAS.

В ходе изучения уровня техники приняты во внимание научные статьи, описывающие разработку и получение направляющих РНК для выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов с помощью технологии CRISPR/CAS (Miiller, V., Rajer, F., Frykholm, K., Nyberg, L.K., Quaderi, S., Fritzsche, J., Kristiansson, E., Ambjornsson, Т., Sandegren, L., Westerlund, F., 2016. Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping. Sci. Rep.6. https://doi.org/10.1038/srep37938; Quan, J., Langelier, C, Kuchta, Α., Batson, J., Teyssier, N., Lyden, Α., Caldera, S., McGeever, Α., Dimitrov, В., King, R., Wilheim, J,, Murphy, Μ., Ares, L.P., Travisano, K.A., Sit, R., Amato, R., Mumbengegwi, D.R., Smith, J.L., Bennett, Α., Gosling, R., Mourani, P.M., Calfee, C.S., Neff, N.F., Chow, E.D., Kim, P.S., Greenhouse, В., DeRisi, J.L., Crawford, E.D., 2019. FLASH: a next-generation CRISPR diagnostic for multiplexed detection of antimicrobial resistance sequences. Nucleic Acids Res. 47, e83. https://doi.org/10.1093/nar/gkz418).

Ближайшим аналогом изобретения является решение, опубликованное в статье https://doi.org/10.1038/srep37938 (Miiller, V., Rajer, F., Frykholm, K., Nyberg, L.K., Quaderi, S., Fritzsche, J., Kristiansson, E., Ambjornsson, Т., Sandegren, L., Westerlund, F., 2016. Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping. Sci. Rep. 6. https://doi.org/10.1038/srep37938), представляющее собой анализ, основанный на оптическом картировании ДНК отдельных плазмид, несущих гены антибиотикоустойчивости, бактериальных изолятов в наножидкостных каналах, который предоставляет подробную информацию об этих плазмидах, в том числе о наличии/отсутствии в них генов антибиотикоустойчивости. Описанный анализ позволяет идентифицировать гены антибиотикоустойчивости с использованием CRISPR/CAS9 и направляющих РНК, специфических к генам антибиотикоустойчивости (blaCTX-М группа 1, blaCTX-М группа 9, blaNDM и blaKPC). В ходе анализа рибонуклеопротеиновый комплекс CRISPR/CAS9 линеаризует кольцевые плазм иды в районе гена антибиотикоустойчивости, полученные линейные молекулы ДНК идентифицируется с помощью оптического картирования ДНК.

Предложенный анализ только в перспективе сможет быть применен к образцам с низкой концентрацией ДНК - предложенный способ, описывает проведение анализа с образцами, содержащими около 10 копий плазмидных ДНК, несущих гены антибиотикоустойчивости (60 нг ДНК, плазмидной ДНК размером 67 т.п.н. - 220 т.п.н.), что является его существенным недостатком. Также недостатками описанного решения является необходимость использования дорогостоящего высокотехнологичного оборудования (специализированные нанофлюидные биочипы, инвертированный флуоресцентный микроскоп с увеличением не менее 100х), а также необходимость проведения сложного анализа полученных данных с применением специализированного программного обеспечения.

Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa in vitro.

Раскрытие сущности.

Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология, основанная на CRISPR/CAS, является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.

Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:

- высокая чувствительность;

- возможность проведения диагностики у постели больного;

- возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;

- скорость и простота анализа;

- сниженная стоимость анализа;

- отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;

- отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.

Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в биологических образцах.

Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl2 с белками Casl2, например, LbCpfl из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa до единичных копий ДНК в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 1-5×10⁵ до 2-3×10² копий/мл.

Технический результат достигается за счет:

- разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1-5, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

- применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpfl из Lachnospiraceae, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (изобретение по патент РФ №2707542, дата приоритета 28.03.2019, опубликовано 27.11.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR/CAS, пригодных для детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях (единичные копии).

- разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, для предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

- оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

- определения условий проведения ультрачувствительной детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa и установления последовательности стадий метода.

Предложена молекула направляющей РНК системы CRISPR/CAS, которая способна связываться с целевыми высоко консервативными участками гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Нуклеотидная последовательность раскрытой в настоящей заявке направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1-5.

Молекула направляющей РНК содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae.

Молекула направляющей РНК обеспечивает выявление единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:

- SEQ ID NO: 1;

- SEQ ID NO: 2;

- SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 4;

- SEQ ID NO: 5;

- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80% - 99, 99%,

- или комплементарной любой из них,

- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях. Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы системы CRISPR/CAS LbCpfl из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях (единичные копии).

Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpfl из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК.

Предложенный рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS (далее - РПК) пригоден для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-5, объединенную с белком системы CRISPR/CAS (LbCpfl из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.

Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, с инструкцией по применению.

Набор для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, может содержать рибонуклеопротеиновый комплекс и инструкцию по применению.

При этом, по меньшей мере, одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/CAS (LbCpfl из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.

Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высоко консервативных фрагментов гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7.

Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативному участку гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:

- SEQ ID NO: 6;

- SEQ ID NO: 7;

- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80% - 99,99%,

- или комплементарной любой из них,

- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.

Предложенная технология позволяет определить единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих Pseudomonas aeruginosa. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Краткое описание чертежей.

Фиг. 1. Визуализация фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п. о. (размером 411 и.о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:

1 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 1 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;

2 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,1 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;

3 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,01 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;

4 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,001 нг модельной матрицы pGEM-T-bla VIM-2;

5 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,0001 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;

6 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,00001 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;

7 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;

Μ - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).

Фиг. 2. Визуализация ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к гену антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-5 обозначены:

1 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 №93;

2 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 №95;

3 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 №207;

4 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 №285;

5 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 №366;

Μ - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).

Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №93 и белок LbCpfl.

Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №95 и белок LbCpfl.

Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №207 и белок LbCpfl.

Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №285 и белок LbCpfl.

Фиг. 7. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №366 и белок LbCpfl.

Фиг. 8. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 №93, sgRNA blaVIM-2 №95, sgRNA blaVIM-2 №207, sgRNA blaVIM-2 №285 и sgRNA blaVIM-2 №366.

Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2№93.

Фиг. 10. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2№95.

Фиг. 11. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №207.

Фиг. 12. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2№285.

Фиг. 13. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2№366.

Примеры осуществления изобретения

ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНЕ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК

Для подбора последовательностей-мишеней в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa для создания направляющих РНК использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Составлен перечень участков в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1).

Направляющие РНК, специфически узнающие высоко консервативный участок антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-5.

ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ

Подготовку материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa проводят методом предварительной амплификации. В качестве модельной матрицы гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa биологического образца используют плазмидную ДНК pGEM-T-blaVIM-2, содержащую в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о. (размером 411 п.о.).

Предварительную амплификацию участка, соответствующего фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о., проводят с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ ID NO: 6-7, приведенных в Таблице 2.

ПЦР-продукт, кодирующий фрагмент антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов For blaVIM-2 и Rev blaVIM-2 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента blaVIM-2 составляет 411 пар нуклеотидов.

Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продукта, фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о.:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;

2. 40 циклов амплификации: 95°С - 15 сек, 55°С - 45 сек, 72°С - 30 сек;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.

В ходе подготовки материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa методом предварительной амплификации проводят титрование модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2 путем приготовления серийных разведений (Таблица 3).

Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные фрагменты гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1).

Подготовленный описанным способом материал используют для экспериментов по выявлению гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 №93, sgRNA blaVIM-2 №95, sgRNA blaVIM-2 №207, sgRNA blaVIM-2 №285 и sgRNA blaVIM-2 №366, без предварительной очистки.

ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Для получения направляющих РНК для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 4.

Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов:

1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 4), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым высоко консервативным участком гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpfl из Lachnospiraceae;

2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa;

3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa;

4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №93, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-93-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 №93, составляет 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №95, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-95-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 №95, составляет 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №207, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-207-Rev (ГенТерра, Россия).

Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 №207, составляет 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №285, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-285-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 №285, составляет 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №366, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и sgRNA-366-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 №366, составляет 62 пары нуклеотидов.

Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;

2. 35 циклов амплификации: 95°С - 15 сек, 55°С - 45 сек, 72°С - 30 сек;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.

ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 2).

Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, проводят с использованием коммерчески доступною набора ISOLATE II PGR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, используют в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.

Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, осуществляется методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 тМ и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.

Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR/CAS LbCpf1 из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014; 546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).

Непосредственно перед объединением с CAS-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов CAS-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.

Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг CAS-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре.

Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫ

Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеоиротеиновых комплексов CRISPR/CAS, полученных способом, описанным в Примере 3.

Для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:

- 10×буфер (100 mM TrisHCl рН 8,0, 1 Μ NaCl);

- 50 mM MgCT₂ (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);

250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 №93, sgRNA blaVIM-2 №95, sgRNA blaVIM-2 №207, sgRNA blaVIM-2 №285 и sgRNA blaVIM-2 №366);

- 20 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);

- Мишень (предварительно амплифицированный фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa);

- вода mQ.

Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор ДТПрайм 5 (ДНК-Технология, Россия) и задают следующие параметры реакции:

30-60 циклов:

37°С-35 сек,

37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.

В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, сформированных на основе LbCpfl из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной матрицы - плазмидной ДНК pGEM-T-blaVIM-2, содержащей в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о. размером 411 п.о. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS обладают способностью выявлять единичные копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 №93, sgRNA blaVIM-2 №95, sgRNA blaVIM-2 №207, sgRNA blaVIM-2 №285 и sgRNA blaVIM-2 №366 и белок LbCpfl, на Фиг. 3, Фиг. 4, Фиг. 5, Фиг. 6 и Фиг. 7 соответственно. Отметим, что уже на 30-ом цикле анализа (30 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,5 копий/реакция) гена blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум втрое.

В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе модельной матрицы, с использованием различных направляющих РНК. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS, сформированные на основе LbCpfl из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: sgRNA blaVIM-2 №207>sgRNA blaVIM-2 №93>sgRNA blaVIM-2 №366>sgRNA blaVIM-2 №285>sgRNA blaVIM-2 №95 (Фиг. 8).

ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ

Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт. ), содержащих Pseudomonas aeruginosa, несущую ген антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (ранее подтверждено микробиологическими методами и методом секвенирования следующего поколения).

Для обнаружения единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS была проведена предварительная амплификация фрагментов этого гена. Для проведения предварительной амплификации были подготовлены серийные (согласно Таблице 3) разведения препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, США) согласно инструкции производителя.

ПЦР-продукты, кодирующие фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации.

Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, полученных способом, описанным в Примере 3.

Обнаружение единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS проводят способом, описанным в Примере 4.

В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS обладают способностью выявлять единичные копии (1,5 копий/реакция) гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов. При этом уже на 2-15 цикле (2-15 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) втрое, а к 5-26 циклу (5-26 минут) анализа - более чем в 5 раз (широкий диапазон и разница в циклах обусловлены различиями использованных в анализе направляющих РНК, Таблица 5).

Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных мишеней blaVTM-2 Pseudomonas aeruginosa (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 №93, sgRNA blaVIM-2 №95, sgRNA blaVIM-2 №207, sgRNA blaVIM-2 №285 и sgRNA blaVIM-2 №366 и белок LbCpfl, на Фиг. 9, Фиг. 10, Фиг. 11, Фиг. 12 и Фиг. 13 соответственно.

Эффективность выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием различных направляющих РНК в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, сформированных на основе LbCpfl из Lachnospiraceae, можно представить в следующем порядке по убыванию: sgRNA blaVIM-2 №207>sgRNA blaVIM-2 №93>sgRNA blaVIM-2 №285>sgRNA blaVIM-2 №366>sgRNA blaVIM-2 №95 (Таблица 5).

Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в клинических образцах после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS.

1. Молекула направляющей РНК системы CRISPR/CAS, которая способна связываться с целевыми высококонсервативными участками гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa, где нуклеотидная последовательность направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.

2. Молекула направляющей РНК по п. 1, отличающаяся тем, что содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae.

3. Молекула направляющей РНК по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что обеспечивает выявление единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

4. Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae и по меньшей мере одной из направляющих РНК по любому из пп. 1-3.

5. Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS по п. 4, пригодный для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.

6. Набор для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащий:

(i) (а) молекулу направляющей РНК системы CRISPR/CAS по любому из пп. 1-3 и направляемую ДНК-эндонуклеазу LbCpf1 из Lachnospiraceae; или

(i) (b) рибонуклеопротеиновый комплекс по любому из пп. 4, 5; и

(ii) инструкцию по применению.

7. Набор для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащий:

(i) (а) молекулу направляющей РНК системы CRISPR/CAS по любому из пп. 1-3 и направляемую ДНК-эндонуклеазу LbCpf1 из Lachnospiraceae; или

(i) (b) рибонуклеопротеиновый комплекс по любому из пп. 4, 5; и

(ii) один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, и

(iii) инструкцию по применению.