Однореакторный способ получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая однореакторный способ получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство, где промежуточный продукт конъюгата антитело-лекарственное средство представляет собой Py-MAA-Val-Cit-PAB-D или MC-Val-Cit-PAB-D, применение вышеуказанного способа в получении противоопухолевого лекарственного препарата и применение вышеуказанного способа в получении конъюгата антитело-лекарственное средство. В одном из вариантов реализации способ включает в себя реакцию Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH или MC-Val-Cit-PAB-OH с бис(4-нитрофенил)карбонатом (NPC) в присутствии органического основания с дальнейшим дополнительным добавлением органического основания и добавлением в реакционную систему 1-гидроксибензотриазола и лекарственной части D. Изобретение расширяет арсенал способов получения промежуточных продуктов конъюгата антитело-лекарственное средство. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 6 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области конъюгатов антитело-лекарственное средство, в частности к однореакторному способу получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство (т.е. линкерная часть-лекарственная часть конъюгата).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) представляет собой класс противоопухолевых лекарственных средств, включающий три части: часть антитела, линкерная часть и лекарственная часть, в котором часть антитела и лекарственная часть связаны линкерной частью. Механизмом действия является доставка лекарственного средства посредством способности нацеливания антитела на клетки-мишени (такие как опухолевые клетки) и затем высвобождение лекарственного средства для уничтожения опухолевых клеток.

В настоящее время наиболее частым способом синтеза конъюгатов антитело-лекарственное средство является ковалентное связывание линкерной части и лекарственной части в жидкой фазе для получения конъюгата линкера-лекарственного средства, и затем проведение тиолового или аминосвязывания с антителом для получения конъюгата антитело-лекарственное средство. В Китайской патентной публикации No. CN107427591A описан общий способ синтеза конъюгатов линкер-лекарственное средство (см. стр. 34 и страницы 47-48 спецификации) (как показано на фиг. 1). Вышеуказанный общий способ синтеза включает: на первой стадии, растворение линкера, содержащего свободную группу бензилового спирта, в соответствующем растворителе, добавление бис(4-нитрофенил)карбоната и диизопропилэтиламина к реакционной системе, и после нескольких часов реакции, экстракцию и очистку промежуточного продукта; и на второй стадии, растворение вышеуказанного промежуточного продукта и лекарственной части, содержащей свободные аминогруппы, в соответствующем растворителе, добавление 1-гидроксибензотриазола и пиридина, и после нескольких часов реакции, удаление растворителя при пониженном давлении для получения конъюгата линкера-лекарственного средства.

В вышеуказанной двухстадийной реакционной системе промежуточные продукты необходимо экстрагировать и очищать, что повлияет на выход конечной реакции. Кроме того, вышеупомянутый способ получения имеет неизбежный дефект мультисистемной реакции во время получения, то есть, необходимость концентрирования, промывки и фильтрации реакционной жидкости на множестве стадий, удаление жидких органических отходов и упаковки и хранения промежуточных продуктов на первой стадии, что не только увеличивает стоимость получения для потребителя, труд, оборудование, место проведения и др., а также создает больше жидких отходов, увеличивая общую стоимость продукции и время продукции.

В публикации Китайской патентной заявки No. CN107921030A также описано множество линкеров, способных ковалентно связываться с антителом посредством связывания мостиком. В нем описан промежуточный продукт конъюгата антитело-лекарственное средство (Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE)(где, Py представляет собой 1,3,5-триакрилоилгексагидро-1,3,5-триазин, CAS 959-52-4, доступный от Bailingwei Technology Co., Ltd. и Nanjing Kangmanlin Chemical Industry Co., Ltd.).

Кроме того, в патентной публикации также описан способ получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство (Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD), в котором лекарственным средством является MMAD (Деметилдоластатин 10):

В указанном способе Val-Cit-PAB и лекарственная часть (MMAD) сначала связываются вместе для получения конъюгата Val-Cit-PAB-MMAD, и затем продукт, полученный после очистки, реагирует с Py-MAA для получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD. В указанном способе также используют мультисистемный синтез. Кроме того, так как лекарственная часть (такая как MMAD/MMAE или MMAF, и др.) связанная в конъюгат антитело-лекарственное средство, участвует в реакции связывания на ранней стадии реакции (MMAD добавляют к реакционной системе в качестве реагента при образовании Val-Cit-PAB-MMAD), скорее, чем на последней стадии, потребление лекарственной части (такой как MMAD/MMAE или MMAF, и др.) используемой в вышеуказанном процессе, является огромным, и так как лекарственные части (такие как MMAD/MMAE или MMAF, и др.), связанные в конъюгате антитело-лекарственное средство, обычно являются относительно дорогими, стоимость продукции существенно увеличивается.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

С целью решения вышеуказанных проблем настоящее изобретение обеспечивает “однореакторный способ” получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство (т.е., конъюгата линкер-лекарственное средство).

Специфически настоящее изобретение обеспечивает способ получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство, включающего линкерную часть и лекарственную часть, где промежуточным продуктом конъюгата антитело-лекарственное средство является Py-MAA-Val-Cit-PAB-D или MC-Val-Cit-PAB-D, где Py-MAA-Val-Cit-PAB или MC-Val-Cit-PAB в промежуточном продукте является линкерной частью и D в промежуточном продукте представляет собой связанную лекарственную часть, включающую свободные аминогруппы, где способ включает следующий путь реакции:

или

где способ получения представляет собой однореакторный процесс, в котором две стадии проводят в одной системе.

Кроме того, способ, включает реакцию Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH или MC-Val-Cit-PAB-OH с бис(4-нитрофенил)карбонатом (NPC) в присутствии органического основания, и после завершения реакции дополнительное добавление органического основания и затем 1-гидроксибензотриазола и лекарственной части D в ту же реакционную систему непосредственно для последующей реакции.

Кроме того, лекарственной частью D является ауристатиновое цитотоксическое средство, антрамициновое цитотоксическое средство, антрациклиновое цитотоксическое средство или пуромициновое цитотоксическое средство или аналоги камптотецина.

Кроме того, ауристатиновым цитотоксическим средством является MMAE, MMAF, MMAD или их производные; антрамициновым цитотоксическим средством является антрамицин или его производные; антрациклиновым цитотоксическим средством являются даунорубицин, досорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон или их производные; пуромициновым цитотоксическим средством является пуромицин или его производные; и аналогом камптотецина является DX8951 (Эксатекан) или его производные.

Кроме того, Py-MAA-Val-Cit-PAB-D или MC-Val-Cit-PAB-D имеют структуру как показано в следующих формулах (1-22):

Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE

Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAF

Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD

Py-MAA-Val-Cit-PAB-антрамицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-даунорубицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-доксорубицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-эпирубицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-идарубицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-митоксантрон

Py-MAA-Val-Cit-PAB-пуромицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951

MC-Val-Cit-PAB-MMAE

MC-Val-Cit-PAB-MMAF

MC-Val-Cit-PAB-MMAD

MC-Val-Cit-PAB-антрамицин

MC-Val-Cit-PAB-даунорубицин

MC-Val-Cit-PAB-доксорубицин

MC-Val-Cit-PAB-эпирубицин

MC-Val-Cit-PAB-идарубицин

MC-Val-Cit-PAB-митоксантрон

MC-Val-Cit-PAB-пуромицин

MC-Val-Cit-PAB-DX8951

Кроме того, органическое основание 1 и органическое основание 2 каждое являются независимо одним или более из N, N-диизопропилэтиламина, триэтиламина и пиридина; предпочтительно, органическое основание 1 и органическое основание 2 каждое независимо является одним или двумя из N, N-диизопропилэтиламина и пиридина.

Кроме того, триазоловый катализатор представляет собой один или более из 1-гидроксибензотриазола, 1-гидрокси-7-азобензотриазола, этилового эфира 1-гидрокси-1H-1,2,3-триазол-4-карбоновой кислоты и предпочтительно 1-гидроксибензотриазола.

Кроме того, температура вышеуказанной реакции составляет около 15-35°C, и кроме того, температура реакции может составлять 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35°C.

Применение способа, описанного в любом из вышеуказанного в получении противоопухолевого лекарственного препарата.

Применение способа, описанного в любом из вышеуказанного, в получении конъюгата антитело-лекарственное средство.

По сравнению с традиционной двухстадийной реакционной системой, “однореакторный процесс” получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство, обеспечиваемый настоящим изобретением, является простым в осуществлении и не нуждается в таких стадиях, как концентрирование, промывка и фильтрация реакционной жидкости промежуточного продукта, удаление жидких органических отходов, и упаковка и хранение промежуточных продуктов. После завершения первой стадии реакции, следующую реакцию проводят непосредственно в той же системе, и полная реакционная система включает только один процесс сепарации и очистки, не только экономя затраты для потребителя, трудовые затраты, оборудование, помещение, исходные материалы и др., но также существенно уменьшая продукцию жидких отходов, уменьшая стоимость продукции и улучшая эффективность продукции. Кроме того, во время процесса реакции, связанную часть лекарственного средства добавляют на конечной стадии реакции, что эффективно уменьшает потребление лекарственной части (такой как MMAD, MMAE или MMAF, DX8951, и др.). Следовательно, “однореакторный процесс” получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство, обеспечиваемый настоящим изобретением, является более подходящим для масштабной продукции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показан способ получения конъюгата линкер-лекарственное средство, описанный на странице 34 и страницах 47-48 спецификации Китайской Патентной Публикации No. CN107427591A.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

СОКРАЩЕНИЯ

Если не указано иначе все сокращения, используемые в настоящем изобретении, имеют такие же значения, как понимает обычный специалист в области техники. Как используется в настоящем изобретении обычно используемые аббревиатуры и их определения являются следующими:

АББРЕВИАТУРА	ОПРЕДЕЛЕНИЕ
MC	Малеимидокапроил
Py	1,3,5-триакрилоилгексагидро-1,3,5-триазинил
MC-Val-Cit-PAB	Малеимидокапроил-валин-цитруллин-п-амино-бензилоксикарбонил
Py-MAA-Val-Cit-PAB	1,3,5-триакрилоилгексагидро-1,3,5-триазинил-меркаптоуксусная кислота-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил
NPC	бис(4-нитрофенил)карбонат
DIPEA	N, N-диизопропилэтиламин
HoBt	1-гидроксибензотриазол
DMF	N, N-диметилформамид
MMAE
MMAD
MMAF
NPC (бис(4-нитрофенил)карбонат)	бис(4-нитрофенил)карбонат)
Антрамицин
Даунорубицин
Доксорубицин
Эпирубицин
Идарубицин
Митоксантрон
Пуромицин
DX8951 (Экзатекан)

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не указано иначе, все технические термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, как понимает обычный специалист в области техники.

Термин "конъюгат антитело-лекарственное средство", как используется в настоящем описании, относится к соединению, в котором антитело/функциональный фрагмент антитела, линкер и лекарственная часть связаны вместе посредством химической реакции и его структура обычно состоит из трех частей: антитело или лиганд антитела, лекарственная часть и линкер, который связывает антитело или лиганд антитела и лекарственное средство. В настоящее время получение конъюгатов антитело-лекарственное средство обычно включает две стадии: на первой стадии линкер и лекарственная часть химически реагируют с образованием конъюгата "линкер-лекарственное средство", и на второй стадии, линкерная часть конъюгата "линкер-лекарственное средство" связывается с антителом/функциональным фрагментом антитела посредством сульфгидрильной группы или аминогруппы. Термин "промежуточный продукт конъюгата антитело-лекарственное средство", используемый в настоящем описании, относится к вышеупомянутому конъюгату "линкер-лекарственное средство". Кроме того, "промежуточный продукт конъюгата антитело-лекарственное средство", упомянутый в настоящем изобретении, обычно относится к тем конъюгатам "линкер-лекарственное средство", которые связываются вместе посредством связи "-CO-NH-", образованной обменом эфира амина между линкером и лекарственным средством.

Термины "линкер" и "линкерная часть", используемые в настоящем описании, относятся к части конъюгата антитело-лекарственное средство и могут быть отщепляемыми или неотщепляемыми. Отщепляемый линкер (т.е. разрушаемый линкер или биоразлагаемый линкер) может быть разрушен в или на клетке-мишени, таким образом высвобождая лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер по изобретению выбирают из отщепляемых линкеров, таких как линкеры на основе дисульфида (которые селективно отщепляются в опухолевых клетках с более высокими сульфгидрильными группами), пептидные линкеры (которые отщепляются ферментами в опухолевых клетках), и гидразоновые линкеры. В других вариантах осуществления изобретения линкеры по настоящему изобретению выбирают из неотщепляемых линкеров (т.е. неразрушаемых линкеров), таких как тиоэфирные линкеры. В еще дополнительных вариантах осуществления изобретения линкеры по настоящему изобретению представляют собой комбинацию отщепляемых линкеров и неразрушаемого линкера.

Термины "лекарственное средство" и "лекарственная часть", используемые в настоящем описании, обычно относятся к любому соединению, имеющему желаемую биологическую активность и содержащему реакционноспособную функциональную группу с целью получения конъюгатов по настоящему изобретению. Желаемая биологическая активность включает диагностику, излечение, облегчение, лечение, профилактику заболеваний у людей или других животных. Так как новые лекарственные средства непрерывно обнаруживаются и разрабатываются, такие новые лекарственные средства также должны быть охвачены лекарственными средствами, описанными в настоящем изобретении. Специфически, лекарственные средства включают, без ограничения, цитотоксические лекарственные средства, факторы дифференцировки клеток, факторы питания стволовых клеток, стероидные лекарственные средства, лекарственные средства для лечения аутоиммунных заболеваний, противовоспалительные лекарственные средства или лекарственные средства для лечения инфекционных заболеваний. Точнее, лекарственные средства включают, без ограничения, ингибиторы тубулина или средства, повреждающие ДНК и РНК.

Примеры

Технические решения настоящего изобретения будут далее описаны подробно в сочетании со специфическими вариантами осуществления изобретения ниже. Необходимо отметить, что следующие примеры предназначены только для иллюстрации технической концепции и характеристик настоящего изобретения и их целью является обеспечить для специалиста в области техники понимание содержания настоящего изобретения и соответствующего его использования, но не ограничить защитные рамки настоящего изобретения. Все эквивалентные изменения или модификации, сделанные в соответствии с общей тенденцией настоящего изобретения, охватываются защитными рамками настоящего изобретения.

Общий способ получения: Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH:

(1) Получение Py-MAA

Соединение Py (1,87 г, 7,51 ммоль) и Et₃N (104 мкл, 0,75 ммоль) растворяли в безводном CH₂Cl₂ (40 мл), и раствор тиогликолевой кислоты (103,9 мкл, 1,50 ммоль) в CH₂Cl₂ (40 мл) добавляли по каплям. После добавления систему нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. После завершения реакции растворитель удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали колоночной хроматографией для получения белого твердого вещества Py-MAA (1,87 г).

(2) Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH

Соединение Py-MAA (10,00 г, 29,33 ммоль) помещали в тетрагидрофуран (200 мл), и добавляли N’N-карбонилдиимидазол (7,13 г, 44,00 ммоль) и Val-Cit-PAB-OH (13,34 г, 35,20 ммоль) и затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Добавляли петролейный эфир (200 мл) и смесь перемешивали в течение 0,5 часов, и затем фильтровали для получения белого твердого вещества. Белое твердое вещество очищали посредством препаративной высокожидкостной хроматографии и полученную жидкость ротационно выпаривали при пониженном давлении для получения Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH (6,67 г, белый твердый порошок).

Пример 1 Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE

(1) Получение посредством “однореакторного процесса”

Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH (1,8 г, 1,0 экв) и DMF (40 мл) добавляли в трехгорлую круглодонную колбу последовательно, и после перемешивания для растворения добавляли NPC (882 мг, 1,1 экв) и DIPEA (336 мг, 1,0 экв) и смесь перемешивали при 24±2°C в течение 24 часов. Затем DIPEA (672 мг, 2,0 экв), пиридин (2,3 мл), HoBt (351 мг, 1,0 экв) и MMAE (1,7 г, 0,9 экв) добавляли в реакционный раствор последовательно, и реакцию продолжали при 24±2°C в течение 48 часов. Продукт Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE (1,9 г) получали после очистки препаративной жидкостной хроматографией, с чистотой 99,84%, и выходом 51,3% [формула расчета: выход=полученное количество Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE ÷ использованное количество (Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH÷702,8×1446,8)×100%].

(2) Получение посредством "двухстадийного процесса"

Стадия 1: Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната

DMF (40 мл) и Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH (1,8 г, 1,0 экв.) добавляли в реакционную колбу и после перемешивания для растворения добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (NPC, 882 мг, 1,1 экв.) и DIPEA (336 мг, 1,0 экв.) и реакцию проводили при 24±2°C в течение 24 часов. К реакционному раствору добавляли этилацетат (мл) и петролейный эфир (мл) по каплям в течение 20 мин. После капельного добавления смесь непрерывно перемешивали в течение 10 мин и фильтровали, затем промывали три раза этилацетатом и петролейным эфиром соответственно; и сушили в центрифуге для получения Py-MAA-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната (1,6 г), выход 72,1%, чистота: 86%.

Стадия 2: Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE

Py-MAA-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбонат (1,5 г), 1-гидроксибензотриазол (HoBt, 234 мг, 1,0 экв.), DMF (30 мл), MMAE (1,1 г, 0,9 экв.), пиридин (1,5 мл) и DIPEA (447 мг, 2,0 экв) добавляли в реакционную колбу и реакцию проводили при 24±2°C в течение 48 часов и затем сушили в центрифуге. Затем проводили препаративную ВЭЖХ для получения Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE (1,3 г), выход 52%, чистота: 99%.

Известно, что конечный выход Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE, полученного однореакторным способом, составляет 51,3%, и конечный выход Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE, полученного двухстадийным способом, составляет 37,49%, с тем же количеством основных исходных материалов. После сравнения конечный выход Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE, полученного однореакторным способом оказывается существенно выше, чем таковой Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE, полученного двухстадийным способом.

Пример 2 Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD

(1) Получение “однореакторным способом”

DMF (4 мл) и Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH (200 мг, 1,0 экв.) добавляли в реакционную колбу и после перемешивания для растворения добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (NPC, 95 мг, 1,1 экв.) и DIPEA (36 мг, 1,0 экв.) и реакцию проводили при 24±2°C в течение 24 часов. 1-гидроксибензотриазол (HoBt, 38 мг, 1,0 экв.), MMAD (197 мг, 0,9 экв.), пиридин (248 мкл) и DIPEA (73 мг, 2,0 экв) добавляли в реакционную колбу и реакцию проводили при 24±2°C в течение 48 часов. Смесь сушили в центрифуге и препаративную ВЭЖХ проводили для получения Py-MAA-Val-Cit-PAB- MMAD (208 мг), выход: 48,7%, чистота: 99%.

(2) Получение "двухстадийным способом"

Стадия 1: Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната

DMF (4 мл) и Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH (200 мг, 1,0 экв.) добавляли в реакционную колбу и после перемешивания для растворения добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (NPC, 95 мг, 1,1 экв.) и DIPEA (36 мг, 1,0 экв.), и реакцию проводили при 24±2°C в течение 24 часов. К реакционному раствору добавляли этилацетат (6 мл) и петролейный эфир (12 мл) добавляли по каплям в течение 20 мин. После капельного добавления смесь непрерывно перемешивали в течение 10 мин и фильтровали, затем промывали три раза этилацетатом и петролейным эфиром соответственно; и сушили в центрифуге для получения Py-MAA-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната (170 мг), выход: 68.8%, чистота: 86%.

Стадия 2: Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD

Py-MAA-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбонат (170 мг), 1-гидроксибензотриазол (HoBt, 27 мг, 1,0 экв.), DMF (4 мл), MMAD (139 мг, 0,9 экв.), пиридин (174 мкл) и DIPEA (52 мг, 2,0 экв) добавляли в реакционную колбу и реакцию проводили при 24±2°C в течение 48 часов и затем сушили в центрифуге. Препаративную ВЭЖХ проводили для получения Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD (139 мг), выход: 47,3%, чистота: 99%.

Известно, что конечный выход Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD, полученного однореакторным способом, составляет 48,7%, и конечный выход Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD, полученного двухстадийным способом составляет 32,54%, с одинаковым количеством основных исходных материалов. После сравнения конечный выход Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD, полученного однореакторным способом оказался существенно выше, чем таковой Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD, полученного двухстадийным способом.

Пример 3 Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951

(1) Получение "однореакторным способом"

DMF (4 мл) и Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH (200 мг, 1,0 экв.) добавляли в реакционную колбу и после перемешивания для растворения, добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (NPC, 95 мг, 1,1 экв.) и DIPEA (36 мг, 1,0 экв.) и реакцию проводили при 24±2°C в течение 24 часов. Добавляли 1-гидроксибензотриазол (HoBt, 38 мг, 1,0 экв.), DX8951 (136 мг, 0,9 экв.), пиридин (248 мкл) и DIPEA (110 мг, 3,0 экв.) и реакцию продолжали при 24±2°C в течение 48 часов. Смесь сушили в центрифуге и препаративную ВЭЖХ проводили для получения Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951 (123 мг), выход: 37,1%, чистота: 97%.

(2) Получение "двухстадийным способом"

Стадия 1: Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната

DMF (4 мл) и Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH (200 мг, 1,0 экв.) добавляли в реакционную колбу, и после перемешивания для растворения, добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (NPC, 95 мг, 1,1 экв.) и DIPEA (36 мг, 1,0 экв.) и реакцию проводили при 24±2°C в течение 24 часов. К реакционному раствору добавляли этилацетат (6 мл) и петролейный эфир (12 мл) добавляли по каплям в течение 20 мин. После капельного добавления смесь непрерывно перемешивали в течение 10 мин и фильтровали, затем промывали три раза этилацетатом и петролейным эфиром, соответственно; и сушили в центрифуге для получения Py-MAA-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната (176 мг), выход: 71,3%, чистота: 86%.

Стадия 2: Получение Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951

Py-MAA-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбонат (170 мг), 1-гидроксибензотриазол (HoBt, 27 мг, 1,0 экв.), DMF (4 мл), DX8951 (96 мг, 0,9 экв.), пиридин (174 мкл) и DIPEA (78 мг, 3,0 экв) добавляли в реакционную колбу и реакцию проводили при 24±2°C в течение 48 часов и затем сушили в центрифуге. Препаративную ВЭЖХ проводили для получения Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951 (76 мг), выход: 33,3%, чистота: 97%.

Известно, что конечный выход Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951, полученного однореакторным способом, составляет 37,1%, и конечный выход Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951, полученного двухстадийным способом, составляет 23,74%, с тем же количеством основных исходных материалов. После сравнения конечный выход Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951, полученного однореакторным способом, оказался существенно выше, чем таковой Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951, полученного двухстадийным способом.

Пример 4 Получение Mc-Val-Cit-PAB-MMAD

(1) Получение "однореакторным способом"

DMF (4 мл) и MC-Val-Cit-PAB-OH (200 мг, 1,0 экв.) добавляли в реакционную колбу и после перемешивания для растворения добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (NPC, 116 мг, 1,1 экв.) и DIPEA (45 мг, 1,0 экв.) и реакцию проводили при 24±2°C в течение 18 часов. 1-гидроксибензотриазол (HoBt, 47 мг, 1,0 экв.), MMAD (242 мг, 0,9 экв.), пиридин (304 мкл) и DIPEA (90 мг, 2,0 экв) добавляли, и реакцию продолжали при 24±2°C в течение 48 часов. Смесь сушили в центрифуге и препаративную ВЭЖХ проводили для получения MC-Val-Cit-PAB-MMAD (228 мг), выход: 47,7%, чистота: 99%.

(2) Получение "двухстадийным способом"

Стадия 1: Получение MC-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната

DMF (4 мл) и MC-Val-Cit-PAB-OH (200 мг, 1,0 экв.) добавляли в реакционную колбу и после перемешивания для растворения добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (NPC, 116 мг, 1,1 экв.) и DIPEA (45 мг, 1,0 экв.). Реакцию проводили при 24±2°C в течение 18 часов. Добавляли эЭтилацетат (6 мл) и петролейный эфир (12 мл) добавляли по каплям в течение 20 мин. После капельного добавления смесь непрерывно перемешивали в течение 10 мин и фильтровали, затем промывали три раза этилацетатом и петролейным эфиром соответственно; и сушили в центрифуге для получения MC-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната (177 мг), выход: 68,6%, чистота: 90%.

Стадия 2: Получение MC-Val-Cit-PAB-MMAD

MC-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбонат (170 мг), полученный на первой стадии, 1-гидроксибензотриазол (HoBt, 31 мг, 1,0 экв), DMF (4 мл), MMAD (160 мг, 0,9 экв.), пиридин (200 мкл) и DIPEA (59 мг, 2.0 экв) добавляли в реакционную колбу, и реакцию проводили при 24±2°C в течение 48 часов и затем сушили в центрифуге. Препаративную ВЭЖХ проводили для получения MC-Val-Cit-PAB-MMAD (156 мг), выход: 49,4%, чистота: 99%.

Известно, что конечный выход MC-Val-Cit-PAB-MMAD, полученного однореакторным способом, составляет 47,7%, и конечный выход MC-Val-Cit-PAB-MMAD, полученного двухстадийным способом, составляет 33,88%, с тем же количеством основных исходных материалов. После сравнения конечный выход MC-Val-Cit-PAB-MMAD, полученного однореакторным способом, оказался существенно больше, чем таковой MC-Val-Cit-PAB-MMAD, полученного двухстадийным способом.

Пример 5 Получение Mc-Val-Cit-PAB-DX8951

(1) Получение "однореакторным способом"

DMF (4 мл) и MC-Val-Cit-PAB-OH (200 мг, 1,0 экв.) добавляли в реакционную колбу и после перемешивания для растворения добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (NPC, 116 мг, 1,1 экв.) и DIPEA (45 мг, 1,0 экв.) и реакцию проводили при 24±2°C в течение 18 часов. 1-гидроксибензотриазол (HoBt, 47 мг, 1,0 экв.), DMF (4 мл), DX8951 (167 мг, 0,9 экв.), пиридин (304 мкл) и DIPEA (135 мг, 3,0 экв) добавляли и реакцию проводили при 24±2°C в течение 48 часов. Смесь сушили в центрифуге, и препаративную ВЭЖХ проводили для получения MC-Val-Cit-PAB-DX8951 (139 мг), выход: 38,4%, чистота: 97%.

(2) Получение "двухстадийным способом

Стадия 1: Получение MC-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната

DMF (4 мл) и MC-Val-Cit-PAB-OH (200 мг, 1,0 экв.) добавляли в реакционную колбу и после перемешивания для растворения добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (NPC, 116 мг, 1,1 экв.) и DIPEA (45 мг, 1,0 экв.). Реакцию проводили при 24±2°C в течение 18 часов. Этилацетат (6 мл) добавляли и петролейный эфир (12 мл) добавляли по каплям в течение 20 мин. После капельного добавления смесь непрерывно перемешивали в течение 10 мин и фильтровали, затем промывали три раза этилацетатом и петролейным эфиром, соответственно; и сушили в центрифуге для получения MC-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната (174 мг), выход: 67,4%, чистота: 90%.

Стадия 2: Получение MC-Val-Cit-PAB-DX8951

MC-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбонат (170 мг), 1-гидроксибензотриазол (HoBt, 31 мг, 1,0 экв.), DMF (4 мл), DX8951 (110 мг, 0,9 экв.), пиридин (200 мкл) и DIPEA (89 мг, 3,0 экв) добавляли в реакционную колбу и реакцию проводили при 24±2°C в течение 48 часов и затем сушили в центрифуге. Препаративную ВЭЖХ проводили для получения MC-Val-Cit-PAB-DX8951 (85 мг), выход: 35,6%, чистота: 97%.

Известно, что конечный выход MC-Val-Cit-PAB-DX8951, полученного однореакторным способом, составляет 38,4%, и конечный выход MC-Val-Cit-PAB-DX8951, полученного двухстадийным способом, составляет 23,99%, с тем же количеством основных исходных материалов. После сравнения конечный выход MC-Val-Cit-PAB-DX8951, полученного однореакторным способом, оказался существенно больше, чем таковой MC-Val-Cit-PAB-DX8951, полученного двухстадийным способом.

Пример 6 Получение Mc-Val-Cit-PAB-MMAE

(1) Получение "однореакторным способом"

MC-Val-Cit-PAB-OH (CAS No.: 159857-80-4) (200 мг, 1,0 экв) и DMF (4 мл) добавляли в трехгорлую круглодонную колбу последовательно и после перемешивания при комнатной температуре для растворения добавляли NPC (117 мг, 1,1 экв) и DIPEA (45 мг, 1,0 экв) и смесь перемешивали при 24±2°C в течение 18 часов. Затем DIPEA (90 мг, 2,0 экв), пиридин (0,3 мл, V пиридин/VDIPEA=2,5), HoBt (47 мг, 1,0 экв) и MMAE (251 мг, 1,0 экв) добавляли к вышеуказанному реакционному раствору последовательно и реакцию продолжали при 24±2°C в течение 48 часов. Продукт MC-Val-Cit-PAB-MMAE (214 мг) получали после очистки препаративной жидкостной хроматографией с чистотой 99,45%, и выходом 46,5% [расчетная формула: выход=полученное количество MC-Val-Cit-PAB-MMAE ÷ (используемое количество MC-Val-Cit-PAB-OH ÷572,7×1316,6)×100%].

(2) Получение "двухстадийным способом"

Стадия 1: Получение MC-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната

MC-Val-Cit-PAB-OH (200 мг, 1,0 экв) и DMF (4 мл) добавляли в трехгорлую круглодонную колбу последовательно и после перемешивания при комнатной температуре для растворения добавляли NPC (117 мг, 1,1 экв) и DIPEA (45 мг, 1,0 экв) и реакцию проводили при 24±2°C в течение 18 часов. Добавляли этилацетат (12 мл) и петролейный эфир (18 мл). Смесь перемешивали, фильтровали и сушили в центрифуге для получения сырого продукта. Сырой продукт добавляли к уксусной кислоте (2 мл) и метанолу (0,3 мл), и после перемешивания для растворения добавляли по каплям очищенную воду (6 мл) и смесь фильтровали. Полученное твердое вещество сушили в центрифуге для получения MC-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбоната (185 мг), выход: 71,8%, чистота: 97%.

Стадия 2: Получение MC-Val-Cit-PAB-MMAE

MC-Val-Cit-PAB-(4-нитрофенил)карбонат (185 мг), DIPEA (64 мг, 2,0 экв), пиридин (0,2 мл, V пиридин/VDIPEA=2,5), HoBt (34 мг, 1,0 экв) и MMAE (180 мг, 1,0 экв) добавляли в реакционную колбу последовательно, и реакцию проводили при 24±2°C в течение 48 часов. Препаративную ВЭЖХ проводили для получения продукта MC-Val-Cit-PAB-MMAE (115 мг), выход 34,8%, чистота 99%.

Известно, что конечный выход MC-Val-Cit-PAB-MMAE, полученного однореакторным способом, составляет 46,5%, и конечный выход MC-Val-Cit-PAB-MMAE, полученного двухстадийным способом, составляет 24,99%, с тем же количеством основных исходных материалов. После сравнения конечный выход MC-Val-Cit-PAB-MMAE, полученного одностадийным способом, оказался существенно больше такового MC-Val-Cit-PAB-MMAE, полученного двухстадийным способом.

Таблица 1 Сравнение конечных выходов "однореакторного способа" и "двухстадийного способа"
продукт	Общие выходы "однореакторного способа"	Общие выходы "двухстадийного способа "	Абсолютное увеличение выхода	Относительное увеличение выхода
Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE	51,30%	37,49%	13,81%	36,84%
Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD	48,70%	32,54%	16,16%	49,66%
Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951	37,10%	23,74%	13,36%	56,28%
Mc-Val-Cit-PAB-MMAD	47,70%	33,88%	13,82%	40,79%
Mc-Val-Cit-PAB-DX8951	38,40%	23,99%	14,41%	60,07%
Mc-Val-Cit-PAB-MMAE	46,50%	24,99%	21,51%	86,07%

Обратите внимание:

Абсолютное увеличение выхода=Общие выходы "однореакторного способа" - Общие выходы "двухстадийного способа"

Относительное увеличение выхода = (Общие выходы "однореакторного способа" - Общие выходы "двухстадийного способа)/Общие выходы "двухстадийного способа";

Посредством сравнения общих выходов "однореакторного способа" и общих выходов "двухстадийного способа" для Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE, Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD, Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951, Mc-Val-Cit-PAB-MMAD, Mc-Val-Cit-PAB-DX8951, и Mc-Val-Cit-PAB-MMAE обнаружено, что конечный выход "однореакторного способа", обеспечиваемого настоящим изобретением, существенно улучшается относительно такового существующего "двухстадийного способа". Так как лекарственные средства (такие как MMAE, DX8951) и сходные материалы являются очень дорогими, способ по настоящему изобретению существенно снизит стоимость продукции лекарственных средств. Следовательно, при сравнении с "двухстадийным способом" предшествующей области техники "однореакторный способ" по настоящему изобретению имеет значительный прогресс и неожиданные технические эффекты.

Кроме того, однореакторный способ получения, обеспечиваемый настоящим изобретением, нуждается только в реакциях в одной и той же реакционной системе, тогда как способ традиционного получения требует проведения реакции в двух реакционных системах (то есть, Py-MAA-Val-Cit-PAB-PNP экстрагируют и затем помещают в другую реакцию), что требует использования органических реагентов (этилацетат и петролейный эфир и др.) и оборудования (для концентрирования) и новый реакционный сосуд (для следующей реакции), несомненно дополняя количество работы для процесса синтеза. Применение дополнительных органических реагентов и рециклизирующих операций не только требует больше рабочей силы, но также оказывает определенное влияние на окружающую среду. Следовательно, однореакторный способ получения, обеспечиваемый настоящим изобретением, является более подходящим для крупномасштабной продукции.

Настоящее изобретение было проиллюстрировано различными специфическими примерами. Однако специалист в области техники понимает, что настоящее изобретение не ограничено различными специфическими вариантами осуществления изобретения. Специалист в области техники может осуществлять различные модификации или изменения настоящего изобретения и различные технические характеристики, упомянутые по тексту, могут быть скомбинированы друг с другом без отклонения от рамок и тенденции настоящего изобретения. Такие изменения и модификации находятся в рамках настоящего изобретения.

1. Способ получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство, включающего линкерную часть и лекарственную часть, где промежуточный продукт конъюгата антитело-лекарственное средство представляет собой Py-MAA-Val-Cit-PAB-D или MC-Val-Cit-PAB-D, где Py-MAA-Val-Cit-PAB или MC-Val-Cit-PAB в промежуточном продукте представляет собой линкерную часть и D в промежуточном продукте представляет собой лекарственную часть, включающую свободные аминокислоты, где способ включает следующий путь реакции:

или

где способ получения представляет собой однореакторный процесс, в котором две стадии проводят в одной системе.

2. Способ по п. 1, включающий реакцию Py-MAA-Val-Cit-PAB-OH или MC-Val-Cit-PAB-OH с бис(4-нитрофенил)карбонатом (NPC) в присутствии органического основания, и после завершения вышеуказанной реакции дополнительное добавление органического основания и затем добавление в реакционную систему 1-гидроксибензотриазола и лекарственной части D для дальнейшей реакции.

3. Способ по п. 1 или 2, где лекарственная часть D представляет собой ауристатиновое цитотоксическое средство, антрамициновое цитотоксическое средство, антрациклиновое цитотоксическое средство или пуромициновое цитотоксическое средство или аналоги камптотецина.

4. Способ по п. 3, где ауристатиновое цитотоксическое средство представляет собой MMAE, MMAF, MMAD или их производные; антрамициновое цитотоксическое средство представляет собой антрамицин или его производное; антрациклиновое цитотоксическое средство представляет собой даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон или их производные; пуромициновое цитотоксическое средство представляет собой пуромицин или его производное; и аналогом камптотецина является DX8951 или его производное.

5. Способ по п. 4, где Py-MAA-Val-Cit-PAB-D или MC-Val-Cit-PAB-D имеет структуру, как показано в следующих формулах (1-22):

Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE

Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAF

Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAD

Py-MAA-Val-Cit-PAB-антрамицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-даунорубицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-доксорубицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-эпирубицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-идарубицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-митоксантрон

Py-MAA-Val-Cit-PAB-пуромицин

Py-MAA-Val-Cit-PAB-DX8951

MC-Val-Cit-PAB-MMAE

MC-Val-Cit-PAB-MMAF

MC-Val-Cit-PAB-MMAD

MC-Val-Cit-PAB-антрамицин

MC-Val-Cit-PAB-даунорубицин

MC-Val-Cit-PAB-доксорубицин

MC-Val-Cit-PAB-эпирубицин

MC-Val-Cit-PAB-идарубицин

MC-Val-Cit-PAB-митоксантрон

MC-Val-Cit-PAB-пуромицин

MC-Val-Cit-PAB-DX8951.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где органическое основание 1 и органическое основание 2 - каждое независимо представляет собой один или более из N, N-диизопропилэтиламина, триэтиламина и пиридина; предпочтительно органическое основание 1 и органическое основание 2 - каждое независимо представляет собой один или два из N, N-диизопропилэтиламина и пиридина.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где триазоловый катализатор представляет собой один или более из 1-гидроксибензотриазола, 1-гидрокси-7-азобензотриазола, этилового эфира 1-гидрокси-1H-1,2,3-триазол-4-карбоновой кислоты и предпочтительно 1-гидроксибензотриазола.

8. Применение способа по любому из пп. 1-7 в получении противоопухолевого лекарственного препарата.

9. Применение способа по любому из пп. 1-7 в получении конъюгата антитело-лекарственное средство.