Изобретение относится к соединению, в котором n составляет 2, и A представляет собой антитело, содержащее последовательности тяжелой и легкой цепей SEQ ID NO:66 и SEQ ID NO:73 соответственно. Изобретение также относится к соединению, для которого n составляет 2 или 4, и A представляет собой антитело, содержащее SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 73 или адалимумаб. Технический результат: получено новое соединение, которое является агонистом глюкокортикоидного рецептора и может применяться для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 24 ил., 22 табл., 89 пр.

Родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 62/344948, поданной 2 июня 2016 года, и предварительной заявки на патент США № 62/371134, поданной 4 августа 2016 года, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Область техники настоящего изобретения, в целом, относится к иммуноконъюгатам агониста глюкокортикоидного рецептора и способам их получения и применения, например, для лечения аутоиммунных или воспалительных заболеваний.

Предпосылки изобретения

Фактор некроза опухоли альфа (TNFa) играет центральную роль в патофизиологии некоторых нарушений у человека, и средства, связывающие TNFa, (например, адалимумаб, этанерцепт и инфликсимаб) обладают клинически утвержденной терапевтической применимостью в лечении аутоиммунных и воспалительных нарушений, таких как ревматоидный артрит, псориаз и воспалительное заболевание кишечника. Несмотря на их клинические успехи, биологические средства, связывающие TNFa, по-прежнему ограничены в максимальной эффективности, которую они могут достичь у пациентов, что требует идентификации и разработки более сильных и эффективных терапевтических средств. У пациентов, получающих лечение биологическими средствами, связывающими TNFa, также может развиваться иммуногенный ответ на терапевтическое средство, за счет чего обеспечивается ограничение их эффективности. Таким образом, терапевтические средства, связывающие TNFa, с более низкой иммуногенностью и высокой эффективностью были бы пригодны для дополнительного контроля заболевания.

Синтетические агонисты глюкокортикоидного рецептора (например, дексаметазон, преднизолон и будесонид) представляют собой сильный класс малых молекул, используемых в лечении воспалительных нарушений, но их применимость в длительном лечении заболевания ограничена из-за серьезных побочных эффектов. Было описано несколько подходов к сохранению противовоспалительной эффективности синтетических глюкокортикоидов со снижением при этом нежелательной токсичности (Rosen, J and Miner, JN Endocrine Reviews 26: 452-64 (2005)). Однако эти методики не имели большого успеха. В области терапевтических средств против аутоиммунных и воспалительных заболеваний существует потребность в разработке терапевтических средств с усиленной эффективностью и более длительным действием по сравнению с антителами к TNF и с минимальными нежелательными эффектами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает иммуноконъюгат агониста глюкокортикоидного рецептора, представленный формулами I-a и I-b, ниже, и его фармацевтически приемлемые соли, сольваты или пролекарства. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает иммуноконъюгат агониста глюкокортикоидного рецептора, представленный формулами I-a и I-b, ниже. Иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как без ограничения ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Крона у взрослых, болезнь Крона у детей, неспецифический язвенный колит, бляшковидный псориаз, гнойный гидраденит, увеит, болезнь Бехчета, спондилоартропатия или псориаз. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения ревматоидного артрита. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения ювенильного идиопатического артрита. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения псориатического артрита. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения анкилозирующего спондилоартрита. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения болезни Крона у взрослых. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения болезни Крона у детей. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения неспецифического язвенного колита. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения бляшковидного псориаза. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения гнойного гидраденита. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения увеита. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения болезни Бехчета. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения спондилоартропатии. В одном аспекте иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующиеся формулами I-a и I-b, пригодны для лечения псориаза.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает агонист глюкокортикоидного рецептора, представленный формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', ниже, (где R^7b представляет собой водород) и его фармацевтически приемлемые соли, сольваты или пролекарства. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает агонист глюкокортикоидного рецептора, представленный формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', ниже, (где R^7b представляет собой водород). Соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как без ограничения ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Крона у взрослых, болезнь Крона у детей, неспецифический язвенный колит, бляшковидный псориаз, гнойный гидраденит, увеит, болезнь Бехчета, спондилоартропатия или псориаз. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения ревматоидного артрита. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения ювенильного идиопатического артрита. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения псориатического артрита. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения анкилозирующего спондилоартрита. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения болезни Крона у взрослых. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения болезни Крона у детей. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения неспецифического язвенного колита. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения бляшковидного псориаза. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения гнойного гидраденита. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения увеита. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения болезни Бехчета. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения спондилоартропатии. В одном аспекте соединения, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', пригодны для лечения псориаза.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает соединения, представленные формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', в качестве синтетических промежуточных соединений, которые можно применять для получения иммуноконъюгатов агониста глюкокортикоидного рецептора, характеризующихся формулами I-a и I-b.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую иммуноконъюгат агониста глюкокортикоидного рецептора, представленный формулами I-a и I-b, или агонист глюкокортикоидного рецептора, представленный формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', и вспомогательное вещество и/или фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает иммуноконъюгат агониста глюкокортикоидного рецептора, представленный формулами I-a и I-b, или агонист глюкокортикоидного рецептора, представленный формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', для применения в лечении аутоиммунных заболеваний.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает применение иммуноконъюгатов агониста глюкокортикоидного рецептора, представленных формулами I-a и I-b, или агониста глюкокортикоидного рецептора, представленного формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a и IX-b или формулами VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' и IX-b'', для изготовления лекарственного препарата для лечения аутоиммунных заболеваний.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способы получения иммуноконъюгатов агониста глюкокортикоидного рецептора, представленных формулами I-a и I-b.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ/ФИГУР

На фигуре 1 показана протеолитическая стабильность ADC, содержащего стероид, и ADC, содержащего MMAE (монометилауристатин E). (см. пример 76.)

На фигуре 2 показаны кинетические показатели потери линкера лекарственного средства стероидного ADC у мышей. (см. пример 77.)

На фигуре 3 показана активность ответа на однократную терапевтическую дозу стероидного ADC, связывающего mTNFа, на мышиной модели артрита. (см. пример 85.)

На фигуре 4 показана активность стероида, связывающего человеческий TNFа, на мышиной модели huTNFa Tg CAIA артрита. (см. пример 87.)

На фигуре 5 показана хроматограмма HIC, демонстрирующая гетерогенную смесь, содержащую антитела, имеющие ноль присоединенных молекул SM-L-Q- (пик ''E0''), две присоединенные молекулы SM-L-Q- (пик ''E2''), четыре присоединенные молекулы SM-L-Q- (пик ''E4''), присоединенные фрагменты SM-L-Q- (пик ''E6'') и восемь присоединенных фрагментов SM-L-Q- (пик ''E8''), в зависимости от количества межцепочечных дисульфидных связей, которые были восстановлены. (SM представляет собой радикал глюкокортикостероида; L представляет собой линкер, и Q представляет собой гетеробифункциональную группу или гетеротрифункциональную группу или Q отсутствует.) (см. пример 74.)

На фигуре 6 показана хроматограмма SEC адалимумаба, конъюгированного с глюкокортикостероидом. (см. пример 74.)

На фигуре 7 показан линейный график, демонстрирующий необработанные данные MS адалимумаба, конъюгированного с глюкокортикостероидом. (см. пример 74.)

На фигуре 8 показан линейный график, демонстрирующий деконволютированные данные MS адалимумаба, конъюгированного с глюкокортикостероидом. Черный квадрат и кружок представляют собой ADC с сукцинимидом, гидролизованный и негидролизованный, соответственно. Относительное содержание гидролизованного и негидролизованного ADC используют для определения гидролизного превращения. (см. пример 74.)

На фигуре 9 показано, что стероидный ADC, связывающий TNF, является значительно более эффективным в снижении воспаления уха у мышей, чем сопутствующая комбинация антитела к TNF и стероида, или чем антитело к TNF отдельно. (см. пример 84.)

На фигуре 10 показано, что однократная доза стероидного ADC, связывающего TNF, является такой же эффективной в снижении отека лапы, что и ежесуточное введение дозы стероида в течение 21 суток. (см. пример 85.)

На фигуре 11 показано изменение веса животных, обработанных стероидом, антителом к TNF, ADC, связывающим TNF, или изотипическим ADC. (см. пример 85.)

На фигуре 12 показано, что однократная доза стероидного ADC, связывающего TNF, может снижать развившийся отек лапы, тогда как однократная доза антитела к TNF обладает минимальным эффектом. (см. пример 88.)

На фигуре 13 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении потери костной массы кости предплюсны, как измерено посредством компьютерной микротомографии (μCT). (Отдельные точки данных (например, круги, квадраты или треугольники) представляют собой отдельных животных.) (См. пример 88.)

На фигуре 14 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении воспаления. (Отдельные точки данных (например, круги, квадраты или треугольники) представляют собой отдельных животных.) (См. пример 88.)

На фигуре 15 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении образования паннуса. (Отдельные точки данных (например, круги, квадраты или треугольники) представляют собой отдельных животных.) (См. пример 88.)

На фигуре 16 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении эрозии кости. (Отдельные точки данных (например, круги, квадраты или треугольники) представляют собой отдельных животных.) (См. пример 88.)

На фигуре 17 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении повреждения хряща. (Отдельные точки данных (например, круги, квадраты или треугольники) представляют собой отдельных животных.) (См. пример 88.)

На фигуре 18 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении белых клеток крови в периферической крови. (Отдельные точки данных (например, круги, квадраты или ромбы) представляют собой отдельных животных.) (См. пример 88.)

На фигуре 19 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении нейтрофилов в периферической крови. (Отдельные точки данных (например, круги, квадраты или ромбы) представляют собой отдельных животных.) (См. пример 88.)

На фигуре 20 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении лимфоцитов в периферической крови. (Отдельные точки данных (например, круги, квадраты или ромбы) представляют собой отдельных животных.) (См. пример 88.)

На фигуре 21 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении моноцитов в периферической крови. (Отдельные точки данных (например, круги, квадраты или ромбы) представляют собой отдельных животных.) (См. пример 88.)

На фигуре 22 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении эозинофилов в периферической крови. (См. пример 88.)

На фигуре 23 показан эффект лечения стероидным ADC, связывающим TNF, в отношении базофилов в периферической крови. (См. пример 88.)

На фигуре 24 показана активность стероидного ADC, связывающего TNF, и стероидного ADC, связывающего CD163, в отношении индуцированного коллагеном артрита мыши. (См. пример 89.)

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе представлены иммуноконъюгаты агониста глюкокортикоидного рецептора, агонисты глюкокортикоидного рецептора и способы их получения и применения.

I. Определения

Для облегчения понимания настоящего раскрытия ниже определяется ряд терминов и фраз.

Термин ''белок, связывающий TNF-альфа'' относится к белкам, которые способны (i) к связыванию с TNF-альфа и (ii) к подавлению связывания растворимого TNF-альфа с рецепторами TNF клеточной поверхности (p55 и/или p75) и/или к лизированию клеток, экспрессирующих поверхностный TNF-альфа или рецептор TNF-альфа in vitro в присутствии комплемента. Белки, связывающие TNF-альфа, включают, например, антитела к TNF или их антигенсвязывающие фрагменты (например, адалимумаб или инфликсимаб), а также растворимые рецепторы TNF (например, этанерцепт).

Используемые в данном документе термины ''антитело'' и ''антитела'' являются терминами из уровня техники и могут быть использованы в данном документе взаимозаменяемо и относятся к молекуле с антигенсвязывающим сайтом, который специфически связывает антиген.

Термин ''антитело'' означает молекулу иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинации вышеупомянутых, через по меньшей мере один сайт распознавания антигена в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Используемый в данном документе термин ''антитело'' охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, слитые белки, содержащие антитело и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, при условии, что антитела проявляют необходимую биологическую активность. Антитело может быть любым из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) на основании идентичности их константных доменов тяжелой цепи, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Различные классы иммуноглобулинов имеют различные и хорошо известные субъединичные структуры и трехмерные конфигурации. Антитела могут быть голыми или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и т. д. Используемый в данном документе термин ''антитело'' охватывает биспецифические и мультиспецифические антитела.

Термин ''фрагмент антитела'' относится к части интактного антитела. ''Антигенсвязывающий фрагмент'' относится к части интактного антитела, которая связывается с антигеном. Антигенсвязывающий фрагмент может содержать антиген-определяющие вариабельные области интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают без ограничения фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, линейные антитела и одноцепочечные антитела. ''Антигенсвязывающий фрагмент'' может быть биспецифическим или мультиспецифическим антигенсвязывающим фрагментом.

''Блокирующее'' антитело или ''антагонистическое'' антитело является антителом, которое подавляет или снижает биологическую активность антигена, который оно связывает, такого как TNF-альфа. В некоторых вариантах осуществления блокирующие антитела или антагонистические антитела значительно или полностью подавляют биологическую активность антигена. Биологическая активность может быть снижена на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100%.

Термин ''антитело к TNF-альфа'' или ''антитело, которое связывается с TNF-альфа'' относится к антителу, которое способно связывать TNF-альфа с достаточной аффинностью так, что антитело является пригодным в качестве диагностического и/или терапевтического средства в нацеливании на TNF-альфа. Степень связывания антитела к TNF-альфа с неродственным отличным от TNF-альфа белком может составлять менее приблизительно 10% связывания антитела с TNF-альфа, как измеряется, например, посредством радиоиммуного анализа (RIA). В определенных вариантах осуществления антитело, которое связывается с TNF-альфа, характеризуется константой диссоциации (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ или ≤0,1 нМ.

''Моноклональные'' антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к гомогенной популяции антитела или антигенсвязывающего фрагмента, вовлеченной в высокоспецифическое распознавание и связывание отдельной антигенной детерминанты или эпитопа. Этим они отличается от поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные в отношении различных антигенных детерминант. Термин ''моноклональные'' антитело или его антигенсвязывающий фрагмент охватывает как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (scFv) мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена. Кроме того, ''моноклональные'' антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к таким антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые получены любыми способами, в том числе без ограничения с помощью гибридомы, фагового отбора, рекомбинантной экспрессии и трансгенных животных.

Термин ''гуманизированные'' антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к формам отличных от человеческих (например, мышиные) антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые представляют собой специфические цепи иммуноглобулина, химерные иммуноглобулины или их фрагменты, которые содержат минимальные отличные от человеческих (например, мышиные) последовательности. Как правило, гуманизированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты являются человеческими иммуноглобулинами, в которых остатки от определяющей комплементарность области (CDR) заменяются остатками из CDR отличного от человека вида (например, мыши, крысы, кролика, хомячка), которые обладают необходимой специфичностью, аффинностью и способностью (''CDR-привитые'') (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). В некоторых случаях остатки каркасной Fv-области (FR) человеческого иммуноглобулина заменяются соответствующими остатками в антителе или фрагменте от отличного от человека вида, которые обладают необходимой специфичностью, аффинностью и способностью. Гуманизированные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть дополнительно модифицированы путем замены дополнительных остатков или в каркасной Fv-области, и/или в замещенных отличных от человеческих остатках для улучшения и оптимизации специфичности, аффинности и/или способности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В целом, гуманизированные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент будут содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух или трех, вариабельных доменов, содержащих все или практически все из CDR-областей, которые соответствуют отличному от человеческого иммуноглобулину, тогда как все или практически все из FR-областей происходят из консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент также могут содержать по меньшей мере часть константной области или домена (Fc) иммуноглобулина, как правило, из человеческого иммуноглобулина. Примеры способов, используемых для создания гуманизированных антител, описаны в патенте США № 5225539; Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994), и Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996). В некоторых вариантах осуществления ''гуманизированным антителом'' является антитело с измененной поверхностью.

''Вариабельная область'' антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, либо отдельно, либо в комбинации. Каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя определяющими комплементарность областями (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в близком соседстве посредством FR и, вместе с CDR из другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антител. Существует по меньшей мере две методики определения CDR: (1) подход на основе межвидовой вариабельности последовательности (т. е. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); и (2) подход на основе кристаллографических исследований комплексов антиген-антитело (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Кроме того, комбинации этих двух подходов иногда используют в области техники для определения CDR.

Систему нумерации по Кабату обычно используют при указании на остаток в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Если явно не указано иное, системой нумерации, используемой в данном документе, является система нумерации по Кабату.

Нумерация аминокислотного положения по Кабату относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи составления антител в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). С использованием этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, что соответствует укорачиванию или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать в себя вставку одной аминокислоты (остаток 52a по Кабату) после остатка 52 в H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b, 82c и т. д. по Кабату) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Кабату может быть определена для данного антитела путем выравнивание по областям гомологии последовательности антитела со ''стандартной'' пронумерованной по Кабату последовательностью. В отличии от этого Чотиа ссылается на расположение структурных петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 по Чотиа при нумерации с использованием системы нумерации по Кабату варьирует от H32 до H34 в зависимости от длины петли (это связано с тем, что схема нумерации по Кабату помещает вставки на H35A и H35B; если не присутствует ни 35A, ни 35B, то петля заканчивается на 32; если присутствует только 35A, то петля заканчивается на 33; если присутствуют и 35A, и 35B, то петля заканчивается на 34). Гипервариабельные области AbM представляют компромисс между CDR по Кабату и структурными петлями по Чотиа и используются программным обеспечением для моделирования антител Oxford Molecular's AbM.

В некоторых аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены согласно схеме нумерации по Чотиа, которая относится к расположению структурных петель иммуноглобулина (см., например, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; и патент США № 7709226). Как правило, при использовании системы нумерации по Кабату петля CDR-H1 по Чотиа находится в аминокислотах тяжелой цепи 26-32, 33 или 34, петля CDR-H2 по Чотиа находится в аминокислотах тяжелой цепи 52-56, и петля CDR-H3 по Чотиа находится в аминокислотах тяжелой цепи 95-102, тогда как петля CDR-L1 по Чотиа находится в аминокислотах легкой цепи 24-34, петля CDR-L2 по Чотиа находится в аминокислотах легкой цепи 50-56, а петля CDR-L3 по Чотиа находится в аминокислотах легкой цепи 89-97. Конец петли CDR-H1 по Чотиа при нумерации с использованием системы нумерации по Кабату варьирует от H32 до H34 в зависимости от длины петли (это связано с тем, что схема нумерации по Кабату помещает вставки на H35A и H35B; если не присутствует ни 35A, ни 35B, то петля заканчивается на 32; если присутствует только 35A, то петля заканчивается на 33; если присутствуют и 35A, и 35B, то петля заканчивается на 34).

В некоторых аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены согласно системе нумерации IMGT, описанной в Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136, и Lefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212. Согласно схеме нумерации IMGT VH-CDR1 находится в положениях 26-35, VH-CDR2 находится в положениях 51-57, VH-CDR3 находится в положениях 93-102, VL-CDR1 находится в положениях 27-32, VL-CDR2 находится в положениях 50-52, а VL-CDR3 находится в положениях 89-97.

В некоторых аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены согласно MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745. Также см., например, Martin A. ''Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,'' в Antibody Engineering, Kontermann and Dübel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001).

В некоторых аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены согласно схеме нумерации AbM, которая относится к гипервариабельным областям AbM, которые представляют собой компромисс между CDR по Кабату и структурными петлями по Чотиа, и используются программным обеспечением для модулирования антител Oxford Molecular's AbM (Oxford Molecular Group, Inc.).

Термин ''человеческое'' антитело означает антитело, продуцируемое человеком или антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую антителу, продуцируемому человеком, полученное с использованием любой методики, известной из уровня техники. Данное определение человеческого антитела включает интактные или полноразмерные антитела, их фрагменты и/или антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид человеческой тяжелой и/или легкой цепи, такие как, например, антитело, содержащее полипептиды мышиной легкой цепи и человеческой тяжелой цепи.

Термин ''химерные'' антитела относится к антителам, в которых аминокислотная последовательность молекулы иммуноглобулина происходит из двух или более видов. Как правило, вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей соответствует вариабельной области антител, полученной от одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика и т. д.), с необходимой специфичностью, аффинностью и способностью, при этом константные области являются гомологичными последовательностям в антителах, полученных от других (обычно от человека), чтобы избежать индуцирования иммунного ответа у этого вида.

Термин ''эпитоп'' или ''антигенная детерминанта'' используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к той части антигена, которую может распознать и специфически связать определенное антитело. Если антиген представляет собой полипептид, то эпитопы могут быть образованы как из смежных аминокислот, так и из несмежных аминокислот, размещенных рядом при сворачивании белка в третичную структуру. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, как правило, сохраняются при денатурации белка, тогда как эпитопы, образованные при сворачивании в третичную структуру, как правило, исчезают при денатурации белка. Эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3 и чаще по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

''Аффинность связывания'', как правило, относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, как используется в данном документе, ''аффинность связывания'' относится к истинной аффинности связывания, которая отражает 1:1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антитела и антигена). Аффинность молекулы X в отношении ее партнера Y, как правило, может быть представлена константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена общепринятыми способами, известными из уровня техники, в том числе описанными в данном документе. Низкоаффинные антитела, как правило, связывают антиген медленно и склонны к быстрой диссоциации, тогда как высокоаффинные антитела, как правило, быстрее связывают антиген и склонны дольше сохранять связывание. Из уровня техники известен ряд способов измерения аффинности связывания, любой из которых может быть использован для целей настоящего изобретения. Далее описываются конкретные иллюстративные варианты осуществления.

''Или лучше'' при использовании в данном документе для обозначения аффинности связывания относится к более сильному связыванию между молекулой и ее партнером по связыванию. ''Или лучше'' при использовании в данном документе относится к более сильному связыванию, представленному меньшим численным значением Kd. Например, для антитела, которое имеет аффинность в отношении антигена ''0,6 нМ или лучше'', аффинность антитела в отношении антигена составляет <0,6 нМ, т. e. 0,59 нМ, 0,58 нМ, 0,57 нМ и т. д., или любое значение менее 0,6 нМ.

''Специфически связывает'', как правило, означает, что антитело связывается с эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена, и что связывание предусматривает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Согласно данному определению считается, что антитело ''специфически связывается'' с эпитопом, если оно связывается с этим эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена быстрее, чем оно связывалось бы со случайным неродственным эпитопом. Термин ''специфичность'' используют в данном документе для оценки относительной аффинности, с которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, можно предположить, что антитело ''А'' имеет более высокую специфичность в отношении данного эпитопа, чем антитело ''B'', или можно считать, что антитело ''A'' связывается с эпитопом ''С'' с более высокой специфичностью, чем оно имеет в отношении соответствующего эпитопа ''D''.

''Преимущественно связывается'' означает, что антитело специфически связывается с эпитопом быстрее, чем оно связывалось бы с родственным, подобным, гомологичным или аналогичным эпитопом. Таким образом, антитело, которое ''преимущественно связывается'' с данным эпитопом, более вероятно будет связываться с этим эпитопом, чем с родственным эпитопом, даже если такое антитело может перекрестно реагировать с родственным эпитопом.

Считается, что антитело ''конкурентно ингибирует'' связывание эталонного антитела с данным эпитопом, если антитело преимущественно связывается с этим эпитопом или перекрывающимся эпитопом до такой степени, при которой оно блокирует, до некоторой степени, связывание эталонного антитела с эпитопом. Конкурентное ингибирование может быть определено любым способом, известным из уровня техники, например, конкурентными анализами ELISA. Можно считать, что антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела с данным эпитопом по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 50%.

Фраза ''по сути, подобный'' или ''по сути, одинаковый'', как используется в данном документе, означает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (как правило, одно ассоциируется с антителом по настоящему изобретению, а другое ассоциируется с эталонным/сравнительным антителом), так что специалист в данной области техники посчитает различие между этими двумя значениями небольшим или биологически и/или статистически не значимым в контексте биологической характеристики, измеряемой указанными значениями (например, значениями Kd). Различие между указанными двумя значениями может составлять менее приблизительно 50%, менее приблизительно 40%, менее приблизительно 30%, менее приблизительно 20% или менее приблизительно 10% в функциональной зависимости от значения для эталонного/сравнительного антитела.

Полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые являются ''выделенными'', представляют собой полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку или композицию, которые имеют форму, не обнаруживаемую в природе. Выделенные полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции включают такие, которые были очищены до такой степени, что они больше не находятся в форме, в которой они обнаружены в природе. В некоторых вариантах осуществления антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые являются выделенными, являются по сути чистыми.

Как используется в данном документе, ''по сути чистый'' относится к материалу, который является по меньшей мере на 50% чистым (т. e. не содержит примесей), по меньшей мере на 90% чистым, по меньшей мере на 95% чистым, по меньшей мере на 98% чистым или по меньшей мере на 99% чистым.

Термин '' иммуноконъюгат'', ''конъюгат'', ''конъюгат антитела и лекарственного средства'' или ''ADC'', как используется в данном документе, относится к соединению или к его производному, которые соединяются с белком, таким как связывающееся с клеткой средство (например, антитело к TNF-альфа или его фрагмент), и определяются общей формулой: (SM-L-Q)_n-A, где SM=радикал, полученный от низкомолекулярного агониста глюкокортикоидного рецептора, например, глюкокортикостероида, L=линкер, Q=гетеробифункциональная группа, гетеротрифункциональная группа или отсутствует, и A=белок (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, белок, связывающий TNF, антитело к TNF-альфа или его фрагмент, растворимый рецептор или растворимый рецептор TNF), и n=1-10. Иммуноконъюгаты также могут быть определены общей формулой в обратном порядке: A-(Q-L-SM)_n. В качестве иллюстрации, следующая общая формула показывает иммуноконъюгат, имеющий дипептидный (Ala-Ala) линкер и основанную на сукцинимидтиоэфире гетеробифункциональную группу:

В настоящем раскрытии термин ''линкер'' относится к любому химическому фрагменту, способному соединять белок, например, антитело, фрагмент антитела (например, антигенсвязывающий фрагмент) или функциональный эквивалент с глюкокортикостероидом. Линкеры могут быть чувствительными к расщеплению (''расщепляемый линкер''), что обеспечивает облегчение высвобождения глюкокортикостероида. Например, такие расщепляемые линкеры могут быть чувствительны к индуцированному кислотой расщеплению, фотоиндуцированному расщеплению, индуцированному пептидазой расщеплению, индуцированному эстеразой расщеплению и расщеплению дисульфидной связи в условиях, в которых глюкокортикостероид и/или антитело остаются активными. В качестве альтернативы, линкеры могут быть по сути устойчивыми к расщеплению (''нерасщепляемый линкер'').

В настоящем раскрытии нерасщепляемые линкеры представляют собой любой химический фрагмент, способный соединять глюкокортикостероид с антителом стабильным, ковалентным способом и не попадающий под перечисленные выше категории для расщепляемых линкеров. Таким образом, нерасщепляемые линкеры являются по сути устойчивыми к индуцированному кислотой расщеплению, фотоиндуцированному расщеплению, индуцированному пептидазой расщеплению, индуцированному эстеразой расщеплению и расщеплению дисульфидной связи. Кроме того, нерасщепляемость относится к способности химической связи в линкере или примыкающей к линкеру противостоять расщеплению, индуцированному кислотой, фотолабильно-расщепляющим средством, пептидазой, эстеразой или химическим или физиологическим соединением, которое расщепляет дисульфидную связь, в условиях, в которых глюкокортикостероид и/или антитело не теряют свою активность.

Некоторые расщепляемые линкеры расщепляются пептидазами (''расщепляемые пептидазой линкеры''). Только определенные пептиды легко расщепляются внутри или снаружи клеток, см., например, Trout et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 626-629 (1982), и Umemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989). Кроме того, пептиды состоят из α-аминокислотных звеньев и пептидных связей, которые в химическом отношении являются амидными связями между карбоксилатом одной аминокислоты и аминогруппой второй аминокислоты. Другие амидные связи, такие как связь между карбоксилатом и α-аминокислотной группой лизина, не считаются пептидными связями и считаются нерасщепляемыми.

Некоторые линкеры расщепляются эстеразами (''расщепляемые эстеразой линкеры''). Только определенные сложные эфиры могут расщепляться эстеразами, присутствующими внутри или снаружи клеток. Сложные эфиры образуются путем конденсации карбоновой кислоты и спирта. Простые сложные эфиры представляют собой сложные эфиры, полученные с простыми спиртами, такими как алифатические спирты, и небольшими циклическими и небольшими ароматическими спиртами.

В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкерный компонент может содержать пептид, содержащий от одного до десяти аминокислотных остатков. В таких вариантах осуществления пептид обеспечивает расщепление линкера протеазой, за счет чего обеспечивается облегчение высвобождения глюкокортикостероида при воздействии внутриклеточных протеаз, таких как лизосомальные ферменты (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). Иллюстративные пептиды включают без ограничения дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и пентапептиды. Иллюстративные дипептиды включают без ограничения аланин-аланин (ala-ala), валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe); фенилаланин-лизин (fk или phe-lys); фенилаланин-гомолизин (phe-homolys) и N-метил-валин-цитруллин (Me-val-cit). Иллюстративные трипептиды включают без ограничения глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly).

Пептид может содержать встречающиеся в природе и/или неприродные аминокислотные остатки. Термин ''встречающаяся в природе аминокислота'' относятся к Ala, Asp, Cys, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr. ''Неприродные аминокислоты'' (т. e. аминокислоты, не встречающиеся в природе) включают в качестве неограничивающего примера гомосерин, гомоаргинин, цитруллин, фенилглицин, таурин, йодтирозин, селено-цистеин, норлейцин (''Nle''), норвалин (''Nva''), бета-аланин, L- или D-нафталанин, орнитин (''Orn'') и т. п. Пептиды могут быть сконструированы и оптимизированы для ферментативного расщепления конкретным ферментом, например, ассоциированная с опухолью протеаза, катепсин B, C и D или плазминовая протеаза.

Аминокислоты также включают D-формы природных и неприродных аминокислот. ''D-''обозначает аминокислоту, имеющую ''D'' (декстроротационную) конфигурацию в отличие от конфигурации встречающихся в природе (''L-'') аминокислот. Природные и неприродные аминокислоты могут быть приобретены коммерческим путем (Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech) или синтезированы с использованием способов, известных из уровня техники.

В настоящем раскрытии термин ''глюкокортикостероид'' относится к встречающимся в природе или синтетическим стероидным гормонам, которые взаимодействуют с глюкокортикоидными рецепторами. Неограничивающие иллюстративные глюкокортикостероиды включают

в качестве примера A-, B-, C- и D-кольца стероидного скелета, обозначенные для будесонида. Глюкокортикостероиды описываются в WO 2009/069032.

''Радикал глюкокортикостероида'' получен в результате удаления одного или нескольких атомов водорода из исходного глюкокортикостероида. Удаление атома(-ов) водорода облегчает присоединение исходного глюкокортикостероида к линкеру. В одном варианте осуществления атом водорода удаляют из любой подходящей группы -NH₂ исходного глюкокортикостероида. В другом варианте осуществления атом водорода удаляют из любой подходящей группы -OH исходного глюкокортикостероида. В другом варианте осуществления атом водорода удаляют из любой подходящей группы -SH исходного глюкокортикостероида. В другом варианте осуществления атом водорода удаляют из любой подходящей группы -N(H)- исходного глюкокортикостероида. В другом варианте осуществления атом водорода удаляют из любой подходящей группы -CH₃, -CH₂- или -CH= исходного глюкокортикостероида. В одном варианте осуществления ''радикал глюкокортикостероида'' представляет собой одновалентный радикал, полученный удалением одного атома водорода из исходного глюкокортикостероида.

В настоящем раскрытии термин ''гетеробифункциональная группа'' или термин ''гетеротрифункциональная группа'' относится к химическому фрагменту, который соединяет линкер и белок, например, антитело. Гетероби- и трифункциональные группы характеризуются как имеющие отличные реактивные группы на каждом конце химического фрагмента. Неограничивающие иллюстративные гетеробифункциональные группы включают

Неограничивающая иллюстративная гетеротрифункциональная группа представляет собой

Термин ''соотношение лекарственного средства и антитела'' или ''DAR'' относится к количеству SM (т. e. радикала, полученного из низкомолекулярного агониста глюкокортикоидного рецептора, например, глюкокортикостероида), связанных с A (т. e. белком, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, белком, связывающим TNF, антителом к TNF-альфа или его фрагментом, растворимым рецептором или растворимым рецептором TNF). Таким образом, в иммуноконъюгате, характеризующемся общей формулой (SM-L-Q)_n-A, DAR определяется переменной ''n''.

Когда речь идет о соединении, характеризующемся формулой (SM-L-Q)_n-A, представляющей отдельный иммуноконъюгат, DAR относится к количеству SM, связанных с отдельным A (например, n представляет собой целое число от 1 до 10).

Когда речь идет о соединении, характеризующемся формулой (SM-L-Q)_n-A, представляющей множество иммуноконъюгатов, DAR относится к среднему количеству SM, связанных с A (например, n представляет собой целое число или дробное число от 1 до 10). Таким образом, в качестве примера, соединение, характеризующееся формулой (SM-L-Q)_n-A, содержащее первый иммуноконъюгат с 3 SM на A и второй иммуноконъюгат с 4 SM на A, должно иметь DAR (т. e. ''n'') 3,5.

Термин ''субъект'' относится к любому животному (например, млекопитающему), в том числе без ограничения к людям, отличным от человека приматам, грызунам и т. п., которое является реципиентом конкретного лечения. Как правило, термины ''субъект'' и ''пациент'' используют в данном документе взаимозаменяемо в отношении субъекта-человека.

Термин ''фармацевтический состав'' относится к препарату, который имеет такую форму, что обеспечивает эффективную биологическую активность активного ингредиента, и который не содержит дополнительные компоненты, являющиеся неприемлемо токсичными для субъекта, которому будут вводить состав. Состав может быть стерильным.

''Эффективное количество'' иммуноконъюгата или агониста глюкокортикоидного рецептора, раскрываемого в данном документе, представляет собой количество, достаточное для осуществления конкретной установленной цели. ''Эффективное количество'' может быть определено в отношении установленной цели.

Термин ''терапевтически эффективное количество'' относится к количеству иммуноконъюгата или агониста глюкокортикоидного рецептора, эффективному для ''лечения'' заболевания или нарушения у субъекта или млекопитающего. ''Профилактически эффективное количество'' относится к количеству, эффективному для достижения необходимого профилактического результата.

Термины, такие как ''осуществление лечения'', или ''лечение'', или ''лечить'', или ''облегчение'', или ''облегчать'', относятся к терапевтическим мерам, которые излечивают, замедляют, облегчают симптомы и/или останавливают прогрессирование диагностированного патологического состояния или нарушения. Таким образом, те, кто нуждается в лечении, включают тех, у кого уже диагностировали нарушение или предполагают наличие нарушения. Профилактические или превентивные меры относятся к мерам, которые предупреждают и/или замедляют развитие целевого патологического состояния или нарушения. Таким образом, те, кто нуждается в профилактических или превентивных мерах, включают склонных к наличию нарушения и тех, у кого нарушение подлежит предупреждению.

''Полинуклеотид'' или ''нуклеиновая кислота'', используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерам из нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами, или каким-либо субстратом, который может быть включен в полимер ДНК- или РНК-полимеразой. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если присутствует, модификация нуклеотидной структуры может быть обеспечена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана компонентами, отличными от нуклеотида. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, конъюгацией с компонентом для мечения. Другие типы модификаций включают, например, ''кэпы'', замену одного или нескольких из встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, сложные фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т. д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т. д.), модификации, содержащего фрагменты боковой цепи, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, ply-L-лизин и т. д.), модификации с интеркаляторами (например, акридин, псорален и т. д.), модификации, содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т. д.), модификации, которые содержат алкилирующие средства, модификации, которые содержат модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т. д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(-ов). Кроме того, любые гидроксильные группы, как правило, присутствующие в сахарах, можно заменить, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищенными стандартными защитными группами или активированными для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или можно конъюгировать с твердой подложкой. 5'- и 3'-концевой OH можно фосфорилировать или заместить аминами или фрагментами органических блокирующих групп из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы также можно дериватизировать в стандартные защитные группы. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы рибозных или дезоксирибозных сахаров, которые, как правило, известны из уровня техники, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидорибозу, аналоги карбоциклических сахаров, альфа-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и основные нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одну или несколько фосфодиэфирных связей можно заменить на альтернативные связывающие группы. Эти альтернативные связывающие группы включают без ограничения варианты осуществления, где фосфат замещен P(O)S (''тиоат''), P(S)S (''дитиоат''), (O)NR₂ (''амидат''), P(O)R, P(O)OR', CO или CH₂ (''формацеталь''), в которых каждый R или R' независимо представляют собой H или замещенный или незамещенный алкил (C1-20), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предшествующее описание применимо ко всем полинуклеотидам, упомянутым в данном документе, включая РНК и ДНК.

Термин ''вектор'' обозначает конструкцию, способную доставлять и необязательно экспрессировать один или несколько генов или последовательностей, представляющих интерес, в клетке-хозяине. Примеры векторов включают без ограничения вирусные векторы, экспрессирующие векторы из голой ДНК или РНК, плазмидные, космидные или фаговые векторы, экспрессирующие ДНК-или РНК-векторы, связанные с катионными конденсирующими средствами, экспрессирующие ДНК- или РНК-векторы, инкапсулированные в липосомы, и определенные эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

Термины ''полипептид'', ''пептид'', и ''белок'' используют в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров из аминокислот любой длины. Полимер может являться линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и его можно прерывать не аминокислотами. Термины охватывают также аминокислотный полимер, модифицированный естественным образом или посредством воздействия; например, посредством образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгация с компонентом для мечения. В определение входят также, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты и т. д.), а также другие модификации, известные из уровня техники. Следует учитывать, что поскольку полипептиды по настоящему изобретению основаны на антителах, в определенных вариантах осуществления полипептиды могут присутствовать в форме отдельных цепей или связанных цепей.

Термины ''идентичный'' или процент ''идентичности'' в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании (с введением гэпов при необходимости) для максимального соответствия, без учета любых консервативных аминокислотных замен как части идентичности последовательности. Процент идентичности может быть измерен с использованием программного обеспечения или алгоритма сравнения последовательностей или путем визуальной проверки. Из уровня техники известны различные алгоритмы и программное обеспечения, которые могут быть использованы для получения выравниваний аминокислотных или нуклеотидных последовательностей. Одним таким неограничивающим примером алгоритма выравнивания последовательностей является алгоритм, описанный в Karlin et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268 (1990), как модифицированный в Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877 (1993), и включенный в программы NBLAST и XBLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1991)). В определенных вариантах осуществления можно использовать программу Gapped BLAST, описанную в Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, Южный Сан-Франциско, Калифорния) или Megalign (DNASTAR) являются дополнительными общедоступными программами программного обеспечения, которые могут быть использованы для выравнивания последовательностей. В определенных вариантах осуществления процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы GAP в программном обеспечении GCG (например, с использованием матрицы NWSgapdna.CMP, и штрафа за открытие гэпа, составляющего 40, 50, 60, 70 или 90, и штрафа за удлинение, составляющего 1, 2, 3, 4, 5 или 6). В определенных альтернативных вариантах осуществления программа GAP в пакете программного обеспечения GCG, который включает алгоритм Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), может быть использована для определения процента идентичности между двумя аминокислотными последовательностями (например, с использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы PAM250, и штрафа за открытие гэпа, составляющего 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штрафа за удлинение, составляющего 1, 2, 3, 4, 5). В качестве альтернативы, в определенных вариантах осуществления процент идентичности между нуклеотидными или аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Myers и Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Например, процент идентичности может быть определен с использованием программы ALIGN (версия 2.0) и с использованием PAM120 с таблицей остатков, штрафа за удлинение гэпа 12 и штрафа за внесение гэпа 4. Соответствующие параметры для максимального выравнивания с помощью конкретного программного обеспечения для выравнивания могут быть определены специалистом в данной области техники. В определенных вариантах осуществления используют параметры по умолчанию программного обеспечения для выравнивания. В определенных вариантах осуществления процент идентичности ''X'' первой аминокислотной последовательности по отношению ко второй аминокислотной последовательности вычисляют как 100 x (Y/Z), где Y представляет собой число аминокислотных остатков, оцениваемых как идентичные совпадения в выравнивании первой и второй последовательностей (при выравнивании с помощью визуальной проверки или конкретной программы для выравнивания последовательностей), а Z представляет собой общее число остатков во второй последовательности. Если длина первой последовательности превышает длину второй последовательности, то процент идентичности первой последовательности в отношении второй последовательности будет больше, чем процент идентичности второй последовательности в отношении первой последовательности.

В качестве неограничивающего примера, наличие у какого-либо конкретного полинуклеотида определенного процента идентичности последовательностей (например, идентичности по меньшей мере на 80%, идентичности по меньшей мере на 85%, идентичности по меньшей мере на 90%, а в некоторых вариантах осуществления идентичности по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) в отношении эталонной последовательности в определенных вариантах осуществления можно определить с использованием программы Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Мэдисон, Висконсин, 53711). В Bestfit используется алгоритм локальной гомологии Smith и Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)) для определения наилучшего сегмента гомологии между двух последовательностей. Если с использованием программы Bestfit или любой другой программы для выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной эталонной последовательности в соответствии с настоящим изобретением, параметры устанавливаются так, чтобы процент идентичности вычислялся по всей длине эталонной нуклеотидной последовательности, и чтобы гэпы в гомологии до 5% от общего числа нуклеотидов в эталонной последовательности были разрешены.

В некоторых вариантах осуществления две нуклеиновые кислоты или два полипептида по настоящему изобретению являются по сути идентичными, что означает, что они обладают по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, а в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, измеряемого с использованием алгоритма сравнения последовательностей или с помощью визуальной проверки. Идентичность может существовать в области последовательностей, которая составляет по меньшей мере приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 40-60 остатков в длину или любое целое значение между ними и может быть длиннее, чем 60-80 остатков, например, по меньшей мере приблизительно 90-100 остатков, а в некоторых вариантах осуществления последовательности являются по сути идентичными по всей длине сравниваемых последовательностей, таких как, например, кодирующая область нуклеотидной последовательности.

''Консервативная аминокислотная замена'' представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющие схожие боковые цепи, были определены в уровне техники, в том числе основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена фенилаланина тирозином является консервативной заменой. В некоторых вариантах осуществления консервативные замены в последовательностях полипептидов и антител по настоящему изобретению не отменяют связывание антитела, содержащего аминокислотную последовательность, с антигеном(-ами), например, TNF-альфа, с которым связывается антитело. Способы идентификации нуклеотидных и аминокислотных консервативных замен, которые не элиминируют связывание антигена, хорошо известны из уровня техники (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:,412-417 (1997)).

В настоящем раскрытии термин ''галоген'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к -Cl, -F, -Br или -I. В одном варианте осуществления галоген представляет собой -Cl или -F.

В настоящем раскрытии термин ''гидрокси'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к -OH.

В настоящем раскрытии термин ''тиол'' или термин ''сульфгидрил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к -SH.

В настоящем раскрытии термин ''алкил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к незамещенным алифатическим углеводородам с прямой или разветвленной цепью, содержащим от одного до двенадцати атомов углерода, т. е. C_1-12алкил, или указанное число атомов углерода, например, C₁алкил, такой как метил, C₂алкил, такой как этил, C₃алкил, такой как пропил или изопропил, C_1-3алкил, такой как метил, этил, пропил или изопропил, и т. д. В одном варианте осуществления алкил представляет собой C_1-10алкил. В другом варианте осуществления алкил представляет собой C_1-6алкил. В другом варианте осуществления алкил представляет собой C_1-4алкил. В другом варианте осуществления алкил представляет собой C_1-10алкил с прямой цепью. В другом варианте осуществления алкил представляет собой C_3-10алкил с разветвленной цепью. В другом варианте осуществления алкил представляет собой C_1-6алкил с прямой цепью. В другом варианте осуществления алкил представляет собой C_3-6алкил с разветвленной цепью. В другом варианте осуществления алкил представляет собой C_1-4алкил с прямой цепью. В другом варианте осуществления алкил представляет собой C_3-4алкил с разветвленной цепью. В другом варианте осуществления алкил представляет собой C_3-4алкил с прямой или разветвленной цепью. Неограничивающие иллюстративные C_1-10алкильные группы включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, трет-бутил, изобутил, 3-пентил, гексил, гептил, октил, нонил и децил. Неограничивающие иллюстративные C_1-4алкильные группы включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, трет-бутил и изобутил.

В настоящем раскрытии термин ''необязательно замещенный алкил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к алкилу, который является либо незамещенным, либо замещенным одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из нитро, гидрокси, циано, галогеналкокси, арилокси, алкилтио, сульфонамидо, алкилкарбонила, арилкарбонила, алкилсульфонила, арилсульфонила, карбокси, карбоксамидо, алкоксикарбонила, тиола, -N(H)C(=O)NH₂ и -N(H)C(=NH)NH₂, необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила. В одном варианте осуществления необязательно замещенный алкил замещен двумя заместителями. В другом варианте осуществления необязательно замещенный алкил замещен одним заместителем. В другом варианте осуществления необязательно замещенный алкил является незамещенным. Неограничивающие иллюстративные замещенные алкильные группы включают -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Ph, -CH₂(4-OH)Ph, -CH₂(имидазолил), -CH₂CH₂CO₂H, -CH₂CH₂SO₂CH₃, -CH₂CH₂COPh и -CH₂OC(=O)CH₃.

В настоящем раскрытии термин ''циклоалкил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к незамещенным насыщенным или частично ненасыщенным, например, содержащим одну или две двойные связи, циклическим алифатическим углеводородам, содержащим одно - три кольца, имеющих от трех до двенадцати атомов углерода, т. е. C_3-12циклоалкил, или указанное число атомов углерода. В одном варианте осуществления циклоалкил имеет два кольца. В другом варианте осуществления циклоалкил имеет одно кольцо. В другом варианте осуществления циклоалкил является насыщенным. В другом варианте осуществления циклоалкил является ненасыщенным. В другом варианте осуществления циклоалкил представляет собой C_3-8циклоалкил. В другом варианте осуществления циклоалкил представляет собой C_3-6циклоалкил. Термин ''циклоалкил'' подразумевает включение групп, где кольцо -CH₂- замещено -C(=O)-. Неограничивающие иллюстративные циклоалкильные группы включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, норборнил, декалин, адамантил, циклогексенил, циклопентенил и циклопентанон.

В настоящем раскрытии термин ''необязательно замещенный циклоалкил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к циклоалкилу, который является либо незамещенным, либо замещенным одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, нитро, циано, гидрокси, алкилкарбонилокси, циклоалкилкарбонилокси, амино, галогеналкила, гидроксиалкила, алкокси, галогеналкокси, арилокси, аралкилокси, алкилтио, карбоксамидо, сульфонамидо, алкилкарбонила, арилкарбонила, алкилсульфонила, арилсульфонила, карбокси, карбоксиалкила, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного циклоалкила, алкенила, алкинила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероарила, необязательно замещенного гетероцикло, алкоксиалкила, (амино)алкила, (карбоксамидо)алкила, (гетероцикло)алкила и -OC(=O)-амино. Термин ''необязательно замещенный циклоалкил'' включает циклоалкильные группы, имеющие слитый необязательно замещенный арил, например, фенил, или слитый необязательно замещенный гетероарил, например, пиридил. Необязательно замещенный циклоалкил, имеющий слитую необязательно замещенную арильную или слитую необязательно замещенную гетероарильную группу, может быть присоединен к остальной части молекулы по любому доступному атому углерода на циклоалкильном кольце. В одном варианте осуществления необязательно замещенный циклоалкил замещен двумя заместителями. В другом варианте осуществления необязательно замещенный циклоалкил замещен одним заместителем. В другом варианте осуществления необязательно замещенный циклоалкил является незамещенным.

В настоящем раскрытии термин ''арил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к незамещенным моноциклическим или бициклическим ароматическим кольцевым системам, имеющим от шести до четырнадцати атомов углерода, т. е. C_6-14арил. Неограничивающие иллюстративные арильные группы включают фенильную (сокращенно ''Ph''), нафтильную, фенантрильную, антрацильную, инденильную, азуленильную, бифенильную, бифениленильную и фторенильную группы. В одном варианте осуществления арильная группа представляет собой фенил или нафтил.

В настоящем раскрытии термин ''необязательно замещенный арил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к арилу, который является либо незамещенным, либо замещенным одним - пятью заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, нитро, циано, гидрокси, тиола, амино, алкиламино, диалкиламино, необязательно замещенного алкила, галогеналкила, гидроксиалкила, алкокси, галогеналкокси, арилокси, аралкилокси, алкилтио, карбоксамидо, сульфонамидо, алкилкарбонила, арилкарбонила, алкилсульфонила, галогеналкилсульфонила, циклоалкилсульфонила, (циклоалкил)алкилсульфонила, арилсульфонила, гетероарилсульфонила, гетероциклосульфонила, карбокси, карбоксиалкила, необязательно замещенного циклоалкила, алкенила, алкинила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероарила, необязательно замещенного гетероцикло, алкоксикарбонила, алкоксиалкила, (амино)алкила, (карбоксамидо)алкила и (гетероцикло)алкила.

В одном варианте осуществления необязательно замещенный арил представляет собой необязательно замещенный фенил. В другом варианте осуществления необязательно замещенным фенил имеет четыре заместителя. В другом варианте осуществления необязательно замещенным фенил имеет три заместителя. В другом варианте осуществления необязательно замещенным фенил имеет два заместителя. В другом варианте осуществления необязательно замещенным фенил имеет один заместитель. В другом варианте осуществления необязательно замещенный фенил является незамещенным. Неограничивающие иллюстративные замещенные арильные группы включают 2-метилфенил, 2-метоксифенил, 2-фторфенил, 2-хлорфенил, 2-бромфенил, 3-метилфенил, 3-метоксифенил, 3-фторфенил, 3-хлорфенил, 4-метилфенил, 4-этилфенил, 4-метоксифенил, 4-фторфенил, 4-хлорфенил, 2,6-дифторфенил, 2,6-дихлорфенил, 2-метил, 3-метоксифенил, 2-этил, 3-метоксифенил, 3,4-диметоксифенил, 3,5-дифторфенил 3,5-диметилфенил, 3,5-диметокси, 4-метилфенил, 2-фтор-3-хлорфенил, 3-хлор-4-фторфенил, 4-(пиридин-4-илсульфонил)фенил. Термин ''необязательно замещенный арил'' включает фенильные группы, имеющие слитую необязательно замещенную циклоалкильную или слитую необязательно замещенную гетероциклогруппу. Необязательно замещенный фенил, имеющий слитую необязательно замещенную циклоалкильную или слитую необязательно замещенную гетероциклогруппу, может быть присоединен к остальной части молекулы по любому доступному атому углерода на фенильном кольце.

В настоящем раскрытии термин ''алкенил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к алкилу, содержащему одну, две или три углерод-углерод двойные связи. В одном варианте осуществления алкенил имеет одну углерод-углерод двойную связь. В другом варианте осуществления алкенил представляет собой C_2-6алкенил. В другом варианте осуществления алкенил представляет собой C_2-4алкенил. Неограничивающие иллюстративные алкенильные группы включают этенил, пропенил, изопропенил, бутенил, втор-бутенил, пентенил и гексенил.

В настоящем раскрытии термин ''необязательно замещенный алкенил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к алкенилу, который является либо незамещенным, либо замещенным одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, нитро, циано, гидрокси, амино, алкиламино, диалкиламино, галогеналкила, гидроксиалкила, алкокси, галогеналкокси, арилокси, аралкилокси, алкилтио, карбоксамидо, сульфонамидо, алкилкарбонила, арилкарбонила, алкилсульфонила, арилсульфонила, карбокси, карбоксиалкила, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного циклоалкила, алкенила, алкинила, необязательно замещенного арила, гетероарила и необязательно замещенного гетероцикло.

В настоящем раскрытии термин ''алкинил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к алкилу, содержащему одну - три углерод-углерод тройные связи. В одном варианте осуществления алкинил имеет одну углерод-углерод тройную связь. В другом варианте осуществления алкинил представляет собой C_2-6алкинил. В другом варианте осуществления алкинил представляет собой C_2-4алкинил. Неограничивающие иллюстративные алкинильные группы включают этинильную, пропинильную, бутинильную, 2-бутинильную, пентинильную и гексинильную группы.

В настоящем раскрытии термин ''необязательно замещенным алкинил'', используемый сам по себе или как часть, относится к алкинилу, который является либо незамещенным, либо замещенным одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, нитро, циано, гидрокси, амино, алкиламино, диалкиламино, галогеналкила, гидроксиалкила, алкокси, галогеналкокси, арилокси, аралкилокси, алкилтио, карбоксамидо, сульфонамидо, алкилкарбонила, арилкарбонила, алкилсульфонила, арилсульфонила, карбокси, карбоксиалкила, необязательно замещенного алкила, циклоалкила, алкенила, алкинила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероарила и гетероцикло.

В настоящем раскрытии термин ''галогеналкил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к алкилу, замещенному одним или несколькими атомами фтора, хлора, брома и/или йода. В одном варианте осуществления алкильная группа замещена одним, двумя или тремя атомами фтора и/или хлора. В другом варианте осуществления галогеналкильная группа представляет собой C_1-4галогеналкильную группу. Неограничивающие иллюстративные галогеналкильные группы включают фторметильную, 2-фторэтильную, дифторметильную, трифторметильную, пентафторэтильную, 1,1-дифторэтильную, 2,2-дифторэтильную, 2,2,2-трифторэтильную, 3,3,3-трифторпропильную, 4,4,4-трифторбутильную и трихлорметильную группы.

В настоящем раскрытии термин ''алкокси'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к необязательно замещенному алкилу, необязательно замещенному циклоалкилу, необязательно замещенному алкенилу или необязательно замещенному алкинилу, присоединенному к концевому атому кислорода. В одном варианте осуществления алкокси представляет собой необязательно замещенный алкил, присоединенный к концевому атому кислорода. В одном варианте осуществления алкоксигруппа представляет собой C_1-6алкил, присоединенный к концевому атому кислорода. В другом варианте осуществления алкоксигруппа представляет собой C_1-4алкил, присоединенный к концевому атому кислорода. Неограничивающие иллюстративные алкоксигруппы включают метокси, этокси и трет-бутокси.

В настоящем раскрытии термин ''алкилтио'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к необязательно замещенному алкилу, присоединенному к концевому атому серы. В одном варианте осуществления алкилтиогруппа представляет собой C_1-4алкилтиогруппу. Неограничивающие иллюстративные алкилтиогруппы включают -SCH₃ и -SCH₂CH₃.

В настоящем раскрытии термин ''галогеналкокси'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к галогеналкилу, присоединенному к концевому атому кислорода. Неограничивающие иллюстративные галогеналкоксигруппы включают фторметокси, дифторметокси, трифторметокси и 2,2,2-трифторэтокси.

В настоящем раскрытии термин ''гетероарил'' относится к незамещенным моноциклическим и бициклическим ароматическим кольцевым системам, имеющим 5-14 атомов кольца, т. е. 5-14-членный гетероарил, где по меньшей мере один атом углерода одного из колец замещен гетероатомом, независимо выбранным из группы, состоящей из кислорода, азота и серы. В одном варианте осуществления гетероарил содержит 1, 2, 3 или 4 гетероатома, независимо выбранных из группы, состоящей из кислорода, азота и серы. В одном варианте осуществления гетероарил имеет три гетероатома. В другом варианте осуществления гетероарил имеет два гетероатома. В другом варианте осуществления гетероарил имеет один гетероатом. В другом варианте осуществления гетероарил представляет собой 5-10-членный гетероарил. В другом варианте осуществления гетероарил представляет собой 5- или 6-членный гетероарил. В другом варианте осуществления гетероарил имеет 5 атомов кольца, например, тиенил, 5-членный гетероарил, имеющий четыре атома углерода и одни атом серы. В другом варианте осуществления гетероарил имеет 6 атомов кольца, например, пиридил, 6-членный гетероарил, имеющий пять атомов углерода и одни атом азота. Неограничивающие иллюстративные гетероарильные группы включают тиенил, бензо[b]тиенил, нафто[2,3-b]тиенил, тиантренил, фурил, бензофурил, пиранил, изобензофуранил, бензооксазонил, хроменил, ксантенил, 2H-пирролил, пирролил, имидазолил, пиразолил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, изоиндолил, 3H-индолил, индолил, индазолил, пуринил, изохинолил, хинолил, фталазинил, нафтиридинил, циннолинил, хиназолинил, птеридинил, 4aH-карбазолил, карбазолил, β-карболинил, фенантридинил, акридинил, пиримидинил, фенантроленил, феназинил, тиазолил, изотиазолил, фенотиазолил, изоксазолил, фуразанил и феноксазинил. В одном варианте осуществления гетероарил выбран из группы, состоящей из тиенила (например, тиен-2-ил и тиен-3-ил), фурила (например, 2-фурил и 3-фурил), пирролила (например, 1H-пиррол-2-ил и 1H-пиррол-3-ил), имидазолила (например, 2H-имидазол-2-ил и 2H-имидазол-4-ил), пиразолила (например, 1H-пиразол-3-ил, 1H-пиразол-4-ил и 1H-пиразол-5-ил), пиридила (например, пиридин-2-ил, пиридин-3-ил и пиридин-4-ил), пиримидинила (например, пиримидин-2-ил, пиримидин-4-ил и пиримидин-5-ил), тиазолила (например, тиазол-2-ил, тиазол-4-ил и тиазол-5-ил), изотиазолила (например, изотиазол-3-ил, изотиазол-4-ил и изотиазол-5-ил), оксазолила (например, оксазол-2-ил, оксазол-4-ил и оксазол-5-ил), изоксазолила (например, изоксазол-3-ил, изоксазол-4-ил и изоксазол-5-ил) и индазолила (например, 1H-индазол-3-ил). Термин ''гетероарил'' также означает включение возможных N-оксидов. Неограничивающий иллюстративный N-оксид представляет собой пиридил-N-оксид.

В одном варианте осуществления гетероарил представляет собой 5- или 6-членный гетероарил. В одном варианте осуществления гетероарил представляет собой 5-членный гетероарил, т. е. гетероарил представляет собой моноциклическую ароматическую кольцевую систему, имеющую 5 атомов кольца, где по меньшей мере один атом углерода в кольце замещен гетероатомом, независимо выбранным из азота, кислорода и серы. Неограничивающие иллюстративные 5-членные гетероарильные группы включают тиенил, фурил, пирролил, оксазолил, пиразолил, имидазолил, тиазолил, изотиазолил и изоксазолил. В другом варианте осуществления гетероарил представляет собой 6-членный гетероарил, например, гетероарил представляет собой моноциклическую ароматическую кольцевую систему, имеющую 6 атомов кольца, где по меньшей мере один атом углерода в кольце замещен атомом азота. Неограничивающие иллюстративные 6-членные гетероарильные группы включают пиридил, пиразинил, пиримидинил и пиридазинил.

В настоящем раскрытии термин ''необязательно замещенный гетероарил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к гетероарилу, который является либо незамещенным, либо замещенным одним, двумя, тремя или четырьмя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, нитро, циано, гидрокси, амино, алкиламино, диалкиламино, галогеналкила, гидроксиалкила, алкокси, галогеналкокси, арилокси, аралкилокси, алкилтио, карбоксамидо, сульфонамидо, алкилкарбонила, арилкарбонила, алкилсульфонила, галогеналкилсульфонила, циклоалкилсульфонила, (циклоалкил)алкилсульфонила, арилсульфонила, гетероарилсульфонила, карбокси, карбоксиалкила, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного циклоалкила, алкенила, алкинила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероарила, необязательно замещенного гетероцикло, алкоксиалкила, (амино)алкила, (карбоксамидо)алкила и (гетероцикло)алкила. В одном варианте осуществления необязательно замещенный гетероарил имеет один заместитель. В другом варианте осуществления необязательно замещенный гетероарил является незамещенным. Любой доступный атом углерода или азота может быть замещен. Термин необязательно замещенный гетероарил включает гетероарильные группы, имеющие слитую необязательно замещенную циклоалкильную или слитую необязательно замещенную гетероциклогруппу. Необязательно замещенный гетероарил, имеющий слитую необязательно замещенную циклоалкильную или слитую необязательно замещенную гетероциклогруппу, может быть присоединен к остальной части молекулы по любому доступному атому углерода на гетероарильном кольце.

В настоящем раскрытии термин ''гетероцикло'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к незамещенным насыщенным и частично ненасыщенным, например, содержащим одну или две двойные связи, циклическим группам, содержащим одно, два или три кольца, имеющих от трех до четырнадцати членов кольца, т. е. 3-14-членный гетероцикло, где по меньшей мере один атом углерода одного из колец замещен гетероатомом. Каждый гетероатом независимо выбран из группы, состоящей из атомов кислорода, серы, в том числе сульфоксид и сульфон, и/или азота, которые могут быть окислены или кватернизованы. Термин ''гетероцикло'' включает группы, где -CH₂- кольца замещено -C(=O)-, например, циклические уреидогруппы, такие как 2-имидазолидинон, и циклические амидные группы, такие как β-лактам, γ-лактам, δ-лактам, ε-лактам и пиперазин-2-он. Термин ''гетероцикло'' также включает группы, имеющие слитые необязательно замещенные арильные группы, например, индолинил или хроман-4-ил. В одном варианте осуществления гетероциклогруппа представляет собой C_4-6гетероцикло, т. е. 4-, 5- или 6-членную циклическую группу, содержащую одно кольцо и один или два атома кислорода и/или азота. В одном варианте осуществления гетероциклогруппа представляет собой C_4-6гетероцикло, содержащий одно кольцо и один атом азота. Гетероцикло может быть необязательно связан с остальной частью молекулы через любой доступный атом углерода или азота. Неограничивающие иллюстративные гетероциклогруппы включают азетидинил, диоксанил, тетрагидропиранил, 2-оксопирролидин-3-ил, пиперазин-2-он, пиперазин-2,6-дион, 2-имидазолидинон, пиперидинил, морфолинил, пиперазинил, пирролидинил и индолинил.

В настоящем раскрытии термин ''необязательно замещенный гетероцикло'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к гетероцикло, который является либо незамещенным, либо замещенным одним, двумя, тремя или четырьмя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена, нитро, циано, гидрокси, амино, алкиламино, диалкиламино, галогеналкила, гидроксиалкила, алкокси, галогеналкокси, арилокси, аралкилокси, алкилтио, карбоксамидо, сульфонамидо, алкилкарбонила, циклоалкилкарбонила, алкоксикарбонила, CF₃C(=O)-, арилкарбонила, алкилсульфонила, арилсульфонила, карбокси, карбоксиалкила, алкила, необязательно замещенного циклоалкила, алкенила, алкинила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероарила, необязательно замещенного гетероцикло, алкоксиалкила, (амино)алкила, (карбоксамидо)алкила или (гетероцикло)алкила. Замена может происходить по любому доступному атому углерода или азота, или как по одному, так и по другому.

В настоящем раскрытии термин ''амино'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к радикалу формулы -NR^22aR^22b, где каждый R^22a и R^22b независимо выбран из группы, состоящей из водорода, необязательно замещенного алкила и аралкила, или R^22a и R^22b взяты вместе с образованием 3-8-членного необязательно замещенного гетероцикло. Неограничивающие иллюстративные аминогруппы включают -NH₂ и -N(H)(CH₃).

В настоящем раскрытии термин ''карбоксамидо'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к радикалу формулы -C(=O)NR^23aR^23b, где каждыйR^23a и R^23b независимо выбран из группы, состоящей из водорода, необязательно замещенного алкила, гидроксиалкила и необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероцикло и необязательно замещенного гетероарила, или R^23a и R^23b, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 3-8-членную необязательно замещенную гетероциклогруппу. В одном варианте осуществления каждый R^23a и R^23b независимо представляет собой водород или необязательно замещенный алкил. В одном варианте осуществления R^23a и R^23b взяты вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 3-8-членной необязательно замещенной гетероциклогруппы. Неограничивающие иллюстративные карбоксамидогруппы включают в себя -CONH₂, -CON(H)CH₃ и -CON(CH₃)₂.

В настоящем раскрытии термин ''алкоксикарбонил'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к карбонильной группе, т. е. -C(=O)-, замещенной алкокси. В одном варианте осуществления алкокси представляет собой C_1-4алкокси. Неограничивающие иллюстративные алкоксикарбонильные группы включают -C(=O)OMe, -C(=O)OEt и -C(=O)OtBu.

В настоящем раскрытии термин ''карбокси'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к радикалу формулы -CO₂H.

В настоящем раскрытии термин ''малеимид'', используемый сам по себе или как часть другой группы, относится к

В настоящем раскрытии термин ''сукцинимид'', используемый как часть расщепляемого линкера, относится к

В настоящем раскрытии термин ''гидролизованный сукцинимид'', используемый как часть расщепляемого линкера, относится к

В настоящем раскрытии термин ''амид'', используемый как часть расщепляемого линкера, относится к

В настоящем раскрытии термин ''тиомочевина'', используемый как часть расщепляемого линкера, относится к

В настоящем раскрытии термин ''тиоэфир'', используемый как часть расщепляемого линкера, относится к

В настоящем раскрытии термин ''оксим'', используемый как часть расщепляемого линкера, относится к

В настоящем раскрытии термин ''самоотщепляющаяся группа'', используемая как часть расщепляемого линкера, относится к бифункциональному химическому фрагменту, который способен ковалентно связывать два находящихся на расстоянии химических фрагмента в нормально стабильную состоящую из трех частей молекулу, может высвобождать один из находящихся на расстоянии химических фрагментов из состоящей из трех частей молекулы посредством ферментативного расщепления, и после ферментативного расщепления может спонтанно отщепляться от остальной части молекулы с высвобождением других находящихся на расстоянии химических фрагментов, например, глюкокортикостероида. В некоторых вариантах осуществления самоотщепляющаяся группа содержит п-аминобензильное звено. В некоторых таких вариантах осуществления п-аминобензиловый спирт присоединен к аминокислотному звену посредством амидной связи, и карбамат, метилкарбамат или карбонат вставлен между бензиловым спиртом и лекарственным средством (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). В некоторых вариантах осуществления самоотщепляющейся группой является п-аминобензилоксикарбонил (PAB).

В настоящем раскрытии термин ''защитная группа'' или ''PG'' относится к группе, которая блокирует, т. е. защищает, аминную функциональную группу при осуществлении реакций на других функциональных группах или частях молекулы. Специалистам в данной области техники будут известны выбор, присоединение и расщепление аминных защитных групп и то, что из уровня техники известны многие другие защитные группы, при этом применимость одной защитной группы или другой зависит от конкретной планируемой схемы синтеза. По этому вопросу доступны такие монографии, как Wuts, P. G. M.; Greene, T. W., ''Greene's Protective Groups in Organic Synthesis'', 4th Ed., J. Wiley & Sons, NY, 2007. Подходящие защитные группы включают карбобензилокси (Cbz), трет-бутилоксикарбонильную (BOC), 9-фторенилметилоксикарбонильную (FMOC) и бензильную (Bn) группу. В одном варианте осуществления защитная группа представляет собой группу BOC.

Соединения, раскрываемые в данном документе, содержат центры асимметрии и, таким образом, образуют энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные формы. Настоящее изобретение охватывает применение всех таких возможных форм, а также их рацемические и разделенные формы и их смеси. Отдельные энантиомеры могут быть разделены согласно способам, известным из уровня техники, касающемся настоящего изобретения. Если соединения, описываемые в данном документе, содержат олефиновые двойные связи или другие центры геометрической асимметрии, и если не указано иное, предполагается, что они включают как E, так и Z геометрические изомеры. Также предполагается, что все таутомеры охватываются настоящим изобретением.

Настоящее изобретение охватывает получение и применение сольватов соединений, раскрываемых в данном документе. Сольваты, как правило, существенно не меняют физиологическую активность или токсичность соединений и в силу этого могут функционировать как фармакологические эквиваленты. Термин ''сольват'', используемый в данном документе, означает комбинацию, физическую ассоциацию и/или сольватацию соединения по настоящему изобретению с молекулой растворителя, такой как, например, дисольват, моносольват или гемисольват, где соотношение молекулы растворителя и соединения по настоящему изобретению составляет приблизительно 2:1, приблизительно 1:1 или приблизительно 1:2, соответственно. Такая физическая ассоциация включает варьирующие степени ионной и ковалентной связи, в том числе водородной связи. В некоторых случаях сольват можно выделить, например, когда одна или несколько молекул растворителя включены в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. Таким образом, ''сольват'' охватывает как сольваты растворной фазы, так и выделяемые сольваты. Соединения, раскрываемые в данном документе, может быть представлены как сольватированные формы с фармацевтически приемлемым растворителем, таким как вода, метанол, этанол и т. п., и предусматривается, что настоящее изобретение включает как сольватированные, так и несольватированные формы соединений, раскрываемых в данном документе. Одним типом сольвата является гидрат. ''Гидрат'' относится к определенной подгруппе сольватов, где молекулой растворителя является вода. Сольваты, как правило, могут функционировать как фармакологические эквиваленты. Получение сольватов известно из уровня техники. См., например, M. Caira et al, J. Pharmaceut. Sci., 93(3):601-611 (2004), где описывается получение сольватов флуконазола с этилацетатом и водой. Подобное получение сольватов, гемисольватов, гидратов и т. п. описывается у E.C. van Tonder et al., AAPS Pharm. Sci. Tech., 5(1):Article 12 (2004), и A.L. Bingham et al., Chem. Commun. 603-604 (2001). Типичный неограничивающий способ получения сольвата будет предусматривать растворение соединения, раскрываемого в данном документе, в необходимом растворителе (органическом, воде или их смеси) при значениях температуры от выше 20°C до приблизительно 25°C, затем охлаждение раствора при скорости, достаточной для образования кристаллов, и выделение кристаллов известными способами, например, фильтрацией. Для подтверждения присутствия растворителя в кристалле сольвата могут быть использованы аналитические методики, такие как инфракрасная спектроскопия.

Настоящее изобретение охватывает получение и применение солей соединений, раскрываемых в данном документе, в том числе нетоксичных фармацевтически приемлемых солей. Примеры фармацевтически приемлемых солей присоединения включают неорганические и органические соли присоединения кислот и основные соли. Фармацевтически приемлемые соли включают без ограничения соли металлов, такие как соль натрия, соль калия, соль цезия и т. п.; соли щелочноземельных металлов, такие как соль кальция, соль магния и т. п.; органические соли амина, таких как триэтиламиновая соль, пиридиновая соль, пиколиновая соль, этаноламиновая соль, триэтаноламиновая соль, дициклогексиламиновая соль, N,N'-дибензилэтилендиаминовая соль и т. п.; соли неорганических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, фосфат, сульфат и т. п.; соли органических кислот, такие как цитрат, лактат, тартрат, малеат, фумарат, манделат, ацетат, дихлорацетат, трифторацетат, оксалат, формиат и т. п.; сульфонат, такой как метансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и т. п.; и соли аминокислот, такие как аргинат, аспарагинат, глутамат и т. п.

Соли присоединения кислоты могут быть образованы путем смешивания раствора конкретного раскрываемого соединения с раствором фармацевтически приемлемой нетоксичной кислоты, такой как хлористоводородная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, винная кислота, карбоновая кислота, фосфорная кислота, оксалиновая кислота, дихлоруксусная кислота или подобные. Основные соли могут быть образованы путем смешивания раствора соединения по настоящему изобретению с раствором фармацевтически приемлемого нетоксичного основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид холина, карбонат натрия и т. п.

Используемые в настоящем раскрытии и формуле изобретения формы единственного числа предусматривают использование множественного числа, если контекст четко не указывает иное.

Следует учитывать, что тогда как по всему настоящему документу одни варианты осуществления описывают фразой ''содержащий'', представлены другие аналогичные варианты осуществления, описываемые терминами ''состоящий из'' и/или ''состоящий, по сути, из''.

Термин ''и/или'', используемый во фразе, такой как ''A и/или B'', в данном документе включает как ''A и B'', ''A или B'', ''A'', так и ''B.'' Подобным образом, термин ''и/или'', используемый во фразе, такой как ''A, B и/или C'' охватывает каждый из следующих вариантов осуществления: A, B и C; A, B или C; A или C; A или B; B или C; A и C; A и B; B и C; A (отдельно); B (отдельно); и C (отдельно).

II. Белки для связи с агонистами глюкокортикоидного рецептора

Настоящее изобретение предусматривает средства-иммуноконъюгаты, содержащие агонисты глюкокортикоидного рецептора, связанные с белками, например, антителами или их антигенсвязывающими фрагментами и белками, представляющими собой растворимый рецептор. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются человеческими, гуманизированными, химерными или мышиными. В некоторых вариантах осуществления белок, например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или белок, представляющий собой растворимый рецептор, может связываться с мишенью на поверхности клетки и становиться интернализированным.

Настоящее изобретение также предусматривает иммуноконъюгаты, содержащие агонисты глюкокортикоидного рецептора, связанные с белками, связывающими TNF-альфа. В определенных вариантах осуществления белки, связывающие TNF-альфа, являются антителами или их антигенсвязывающими фрагментами. В определенных вариантах осуществления белки, связывающие TNF-альфа, являются антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, которые связываются с TNF-альфа (например, растворимым TNF-альфа и/или связанным с мембраной TNF-альфа). В определенных вариантах осуществления белки, связывающие TNF-альфа, являются белками, представляющими собой растворимый рецептор TNF, например, белками, представляющими собой растворимый рецептор TNF, слитого с константным доменом тяжелой цепи или его фрагментом, таким как Fc. В некоторых вариантах осуществления белок, связывающий TNF-альфа, например, антитело к TNF, его антигенсвязывающий фрагмент или растворимый рецептор TNF, связывается с TNF-альфа на поверхности клетки и становится интернализированным. Например, в US 2014/0294813, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, раскрываются белки, связывающие TNF-альфа, которые демонстрируют клеточную интернализацию при связывании с человеческим TNF на клеточной поверхности.

В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с человеческим и/или мышиным TNF-альфа. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с TNF-альфа известны из уровня техники.

Полноразмерная аминокислотная последовательность для связанного с мембраной человеческого TNF-альфа представляет собой

MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL (SEQ ID NO:1). Растворимый человеческий TNF-альфа содержит аминокислоты 77-233 из SEQ ID NO:1. Полноразмерная аминокислотная последовательность для связанного с мембраной мышиного TNF-альфа представляет собой

MSTESMIRDVELAEEALPQKMGGFQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLFCLLNFGVIGPQRDEKFPNGLPLISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKDTPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNLPKYLDFAESGQVYFGVIAL (SEQ ID NO:2). Растворимый мышиный TNF-альфа содержит аминокислоты 80-235 из SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с человеческим TNF-альфа. В некоторых вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим, гуманизированным или химерным.

В некоторых вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с мышиным TNF-альфа. В некоторых вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или его антигенсвязывающий фрагмент является мышиным.

В определенных вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или антигенсвязывающий фрагмент обладают одним или несколькими из следующих эффектов: нейтрализуют цитотоксичность человеческого TNF-альфа в in vitro анализе L929 с IC50 1×10^-7 M или меньше; блокируют взаимодействие TNF-альфа с рецепторами клеточной поверхности p55 и p75; и/или лизируют клетки, экспрессирующие на поверхности TNF, in vitro в присутствии комплемента.

В определенных вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или антигенсвязывающие фрагмент не связываются с TNF-бета.

Антитела к TNF и их антигенсвязывающие фрагменты включают, например, адалимумаб, инфликсимаб, цертолизумаб пегол, афелимомаб, нерелимомаб, озорализумаб, плакулумаб и голимумаб. Дополнительные антитела к TNF-альфа и антигенсвязывающие фрагменты представлены, например, в WO 2013/087912, WO 2014/152247 и WO 2015/073884, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Адалимумаб описывается в патенте США № 6258562, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Инфликсимаб описывается в патенте США № 5656272, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Цертолизумаб пегол обсуждается в WO 01/94585, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Афелимомаб (также известный как MAK195) обсуждается в Vincent, Int. J. Clin. Pract. 54: 190-193 (2000), который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Озорализумаб (также известный как ATN-103) представляет собой нанотело. Он содержит три вариабельные области тяжелой цепи, слитые посредством GlySer линкеров. Вариабельные области 1 и 3 являются идентичными, и озорализумаб не содержат тяжелую цепь. Озорализумаб обсуждается в WO 2012/131053, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Плакулумаб (также известный как CEP-37247) представляет собой доменное антитело, состоящее из димера VL-pCH1-CH2-CH3 или [V-каппа]2-Fc, и обсуждается в Gay et al., Mabs 2: 625-638 (2010), который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Голимумаб (также известный как CNTO 148) обсуждается в WO2013/087912, а последовательности представлены в GenBank DI 496971.1 и GenBank DI 496970.1, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Антитела к TNF-альфа и их антигенсвязывающие фрагменты также включают антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые конкурентно подавляют связывание адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба или голимумаба с TNF-альфа. Антитела к TNF-альфа и их антигенсвязывающие фрагменты также включают антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом TNF-альфа, что и адалимумаб, инфликсимаб, цертолизумаб пегол, афелимомаб, нерелимомаб, озорализумаб, плакулумаб или голимумаб.

В определенных вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или его антигенсвязывающий фрагмент конкурентно подавляют связывание адалимумаба с TNF-альфа. В определенных вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с тем же эпитопом TNF-альфа, что и адалимумаб. В определенных вариантах осуществления антителом к TNF-альфа или его антигенсвязывающим фрагментом является адалимумаб или его антигенсвязывающий фрагмент. В определенных вариантах осуществления антителом к TNF-альфа или его антигенсвязывающим фрагментом является адалимумаб.

В определенных вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательности адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба или голимумаба, например, определяющие комплементарность области (CDR), вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и/или вариабельный домен легкой цепи (VL). Последовательности иллюстративных антител к TNF-альфа или их антигенсвязывающих фрагментов представлены в таблицах 1-6.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности CDR вариабельной области тяжелой цепи

Антитело	VH-CDR1	VH-CDR2	VH-CDR3
Адалимумаб	DYAMH (SEQ ID NO:3) или GFTFDDYAMH (SEQ ID NO:6)	AITWNSGHIDYADSVEG (SEQ ID NO:4)	VSYLSTASS (SEQ ID NO:5) VSYLSTASSLDY (SEQ ID NO:94)
Инфликсимаб	GFIFSNHWMN (SEQ ID NO:7)	EIRSKSINSATHYAESVKG (SEQ ID NO:8)	NYYGSTYDY (SEQ ID NO:9)
Цертолизумаб пегол	DYGMN (SEQ ID NO:10) или GYVFTDYGMN (SEQ ID NO:13)	WINTYIGEPIYADSVKG (SEQ ID NO:11)	GYRSYAMDY (SEQ ID NO:12)
Афелимомаб	DYGVN (SEQ ID NO:14)	MIWGDGSTDYDSTLKS (SEQ ID NO:15)	EWHHGPVAY (SEQ ID NO:16)
Нерелимомаб	DYNVD (SEQ ID NO:17)	NINPNNGGTIYNQKFKG (SEQ ID NO:18)	SAFYNNYEYFDV (SEQ ID NO:19)
Озорализумаб	V1:DYWMY (SEQ ID NO:20) V2: SFGMS (SEQ ID NO:23) V3: DYWMY (SEQ ID NO:26)	V1: EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO:21) V2: SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:24) V3: EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO:27)	V1: SPSGFNR (SEQ ID NO:22) V2: GGSLSRSS (SEQ ID NO:25) V3: SPSGFNR (SEQ ID NO:28)
Голимумаб	GFIFSSYAMH (SEQ ID NO:29)	FMSYDGSNKKYADSVKG (SEQ ID NO:30)	DRGIAAGGNYYYYGMDV (SEQ ID NO:31)
Плакулумаб	RASQAIDSYLH (SEQ ID NO:88)	SASNLET (SEQ ID NO:89)	QQVVWRPFT (SEQ ID NO:90)

Таблица 2. Аминокислотные последовательности CDR вариабельной области легкой цепи

Антитело	VL-CDR1	VL-CDR2	VL-CDR3
Адалимумаб	RASQGIRNYLA (SEQ ID NO:32)	AASTLQS (SEQ ID NO:33)	QRYNRAPYT (SEQ ID NO:34)
Инфликсимаб	RASQFVGSSIH (SEQ ID NO:35)	YASESMS (SEQ ID NO:36)	QQSHSWPFT (SEQ ID NO:37)
Цертолизумаб пегол	KASQNVGTNVA (SEQ ID NO:38)	SASFLYS (SEQ ID NO:39)	QQYNIYPLT (SEQ ID NO:40)
Афелимомаб	KASQAVSSAVA (SEQ ID NO:41)	WASTRHT (SEQ ID NO:42)	QQHYSTPFT (SEQ ID NO:43)
Нерелимомаб	KSSQSLLYSNNQKNYLA (SEQ ID NO:44)	WASTRES (SEQ ID NO:45)	QQYYDYPWT (SEQ ID NO:46)
Озорализумаб	N/A	N/A	N/A
Голимумаб	RASQSVYSYLA (SEQ ID NO:47)	DASNRAT (SEQ ID NO:48)	QQRSNWPPFT (SEQ ID NO:49)

Таблица 3. Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи

Антитело	Аминокислота последовательность VH (SEQ ID NO)
Адалимумаб	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)
Инфликсимаб	EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:91) EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMNSLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVS(SEQ ID NO:51)
Цертолизумаб пегол	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYVFTDYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYIGEPIYADSVKGRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYRSYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:52)
Афелимомаб	QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRLSISKDNSKSQIFLKNNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:53)
Нерелимомаб	QVQLVQSGAEVVKPGSSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVKQAPGQGLQWIGNINPNNGGTIYNQKFKGKGTLTVDKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARSAFYNNYEYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:54)
Озорализумаб	V1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:55) V2: EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO:56) V3: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:57)
Голимумаб	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:58)

Таблица 4. Аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи

Антитело	Аминокислота последовательность VL (SEQ ID NO)
Адалимумаб	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:59)
Инфликсимаб	DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVK (SEQ ID NO:60)
Цертолизумаб пегол	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASFLYSGVPYRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:61)
Афелимомаб	DIVMTQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFTLTIHNLQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:62)
Нерелимомаб	DIMMTQSPSTLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLISWASTRESGVPSRFIGSGSGTEFTLTISSLQPDDVATYYCQQYYDYPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:92) DIMMTQSPSTLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLISWASTRESGVPSRFIGSGSGTEFTLTISSLQPDDVATYYCQQYYDYPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:63)
Плакулумаб	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:64)
Голимумаб	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK (SEQ ID NO:65)

Таблица 5. Аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи

Антитело	Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи (SEQ ID NO)
Адалимумаб (D2E7)	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:66)
Инфликсимаб	EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:67)
Цертолизумаб пегол	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYVFTDYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYIGEPIYADSVKGRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYRSYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCAA (SEQ ID NO:68)
Афелимомаб	QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRLSISKDNSKSQIFLKNNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAYWGQGTLVTVSAATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPGK (SEQ ID NO:69)
Озорализумаб	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSggggsgggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSggggsgggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:70)
Плакулумаб	VEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:93) RVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:71)
Голимумаб	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:72)

Таблица 6. Аминокислотные последовательности полноразмерной легкой цепи

Антитело	Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи (SEQ ID NO)
Адалимумаб (D2E7)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:73)
Инфликсимаб	DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:74)
Цертолизумаб пегол	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASFLYSGVPYRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:75)
Афелимомаб	DIVMTQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFTLTIHNLQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:76)
Плакулумаб	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:77)
Голимумаб	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:78)

Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно, или также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 91 и 60 или 54 и 92, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 91 и 60 или 54 и 92, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 91 и 60 или 54 и 92, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 96% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 96% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 91 и 60 или 54 и 92, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 97% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 97% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 91 и 60 или 54 и 92, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 91 и 60 или 54 и 92, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 91 и 60 или 54 и 92, соответственно.

Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 5 и 32-34; 7-9 и 35-37; 10 или 13, 11, 12 и 38-40; 14-16 и 41-43; 17-19 и 44-46; или 29-31 и 47-49, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 91 и 60 или 54 и 92, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 94 и 32-34; 7-9 и 35-37; или 17-19 и 44-46, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 5 и 32-34; 7-9 и 35-37; 10 или 13, 11, 12 и 38-40; 14-16 и 41-43; 17-19 и 44-46; или 29-31 и 47-49, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 91 и 60 или 54 и 92, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 94 и 32-34; 7-9 и 35-37; или 17-19 и 44-46, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 5 и 32-34; 7-9 и 35-37; 10 или 13, 11, 12 и 38-40; 14-16 и 41-43; 17-19 и 44-46; или 29-31 и 47-49, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 91 и 60 или 54 и 92, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 94 и 32-34; 7-9 и 35-37; или 17-19 и 44-46, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 5 и 32-34; 7-9 и 35-37; 10 или 13, 11, 12 и 38-40; 14-16 и 41-43; 17-19 и 44-46; или 29-31 и 47-49, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 91 и 60 или 54 и 92, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 94 и 32-34; 7-9 и 35-37; или 17-19 и 44-46, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 96% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 5 и 32-34; 7-9 и 35-37; 10 или 13, 11, 12 и 38-40; 14-16 и 41-43; 17-19 и 44-46; или 29-31 и 47-49, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 96% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 91 и 60 или 54 и 92, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 94 и 32-34; 7-9 и 35-37; или 17-19 и 44-46, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 97% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 97% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 91 и 60 или 54 и 92, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 94 и 32-34; 7-9 и 35-37; или 17-19 и 44-46, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 5 и 32-34; 7-9 и 35-37; 10 или 13, 11, 12 и 38-40; 14-16 и 41-43; 17-19 и 44-46; или 29-31 и 47-49, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 91 и 60 или 54 и 92, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 94 и 32-34; 7-9 и 35-37; или 17-19 и 44-46, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 51 и 60, 52 и 61, 53 и 62, 54 и 63 или 58 и 65, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 5 и 32-34; 7-9 и 35-37; 10 или 13, 11, 12 и 38-40; 14-16 и 41-43; 17-19 и 44-46; или 29-31 и 47-49, соответственно. Также представлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат VH и VL, характеризующиеся по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей под SEQ ID NO: 50 и 59, 91 и 60 или 54 и 92, соответственно, и содержат CDR из SEQ ID NO: 3 или 6, 4, 94 и 32-34; 7-9 и 35-37; или 17-19 и 44-46, соответственно.

В определенных вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR из SEQ ID NO: 3-5 и 32-34 или из SEQ ID NO: 6, 4, 5 и 32-34. В определенных вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR из SEQ ID NO: 3, 4, 94 и 32-34 или из SEQ ID NO: 6, 4, 94 и 32-34. В определенных вариантах осуществления антитело к TNF-альфа или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VH из SEQ ID NO:50 и/или VL из SEQ ID NO:59. В определенных вариантах осуществления антитело к TNF-альфа содержит тяжелую цепь из SEQ ID NO: 66 и/или легкую цепь из SEQ ID NO:75.

Антитело к F-альфа содержит тяжелую цепь из SEQ ID NO:74 и/или легкую цепь из SEQ ID NO:82.

В некоторых аспектах в данном документе представлены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с TNF-альфа и содержат CDR VL по Чотиа из VL адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба или голимумаба. В некоторых аспектах в данном документе представлены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с TNF-альфа и содержат CDR VH по Чотиа из VH адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба или голимумаба. В некоторых аспектах в данном документе представлены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с TNF-альфа и содержат CDR VL по Чотиа из VL адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба или голимумаба и содержат CDR VH по Чотиа из VH адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба или голимумаба. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с TNF-альфа, содержат одну или несколько CDR, в которых CDR по Чотиа и по Кабату имеют одну и ту же аминокислотную последовательность. В определенных вариантах осуществления в данном документе представлены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с TNF-альфа и содержат комбинации CDR по Кабату и CDR по Чотиа.

В конкретном варианте осуществления в данном документе представлены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с TNF-альфа и содержат CDR из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба или голимумаба, как определяется системой нумерации IMGT, например, описываемой у Lefranc M-P (1999), выше, и Lefranc M-P et al., (1999), выше).

В конкретном варианте осуществления в данном документе представлены антитела, которые специфически связываются с TNF-альфа и содержат CDR из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба или голимумаба, как определяется способом в MacCallum RM et al.

В конкретном варианте осуществления в данном документе представлены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с CD163.

Моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомных способов, таких как описываемые у Kohler и Milstein (1975) Nature 256:495. С использованием гибридомного способа иммунизируют мышь, хомячка или другого подходящего животного-хозяина для индуцирования продуцирования лимфоцитами антител, которые будут специфически связываться с иммунизирующим антигеном. Лимфоциты также могут быть иммунизированы in vitro. После иммунизация лимфоциты выделяют и сливают с подходящей миеломной клеточной линией с использованием, например, полиэтиленгликоля, с образованием гибридомных клеток, которые затем могут быть отобраны из неслитых лимфоцитов и миеломных клеток. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, которые специфически направлены в отношении выбранного антигена, как определяется посредством иммунопреципитации, иммуноблоттинга или анализа связывания in vitro (например, посредством радиоиммуного анализа (RIA); ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA)), затем могут быть размножены либо посредством культивирования in vitro с использованием стандартных способов (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986), либо in vivo в виде асцитных опухолей у животного. Затем моноклональные антитела могут быть очищены от культуральной среды или асцитной жидкости, как описывается для поликлональных антител.

В качестве альтернативы, моноклональные антитела также могут быть получены с применением способов с рекомбинантной ДНК, описываемых в патенте США № 4816567. Полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело, выделяют из зрелых B-клеток или гибридомных клеток, например, путем RT-PCR с использованием олигонуклеотидных праймеров, которые специфически амплифицируют гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, а их последовательность определяют с использованием традиционных процедур. Выделенные полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи, затем клонируют в подходящие векторы экспрессии, которые при трансфицировании в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки обезьяны COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или миеломные клетки, которые иным путем не продуцируют белок иммуноглобулина, моноклональные антитела, получают с помощью клеток-хозяев. Также рекомбинантные моноклональные антитела или их фрагменты необходимого вида могут быть выделены из библиотек фагового дисплея, экспрессирующих CDR необходимого вида, как описывается (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; и Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).

Полинуклеотид(-ы), кодирующий моноклональное антитело может быть дополнительно модифицирован рядом различных способов с использованием технологии рекомбинантной ДНК для создания альтернативных антител. В некоторых вариантах осуществления константные домены легкой и тяжелой цепей, например, мышиного моноклонального антитела, могут быть замещены 1) этими областями, например, в человеческом антителе, с образованием химерного антитела, или 2) отличным от иммуноглобулина полипептидом с образованием слитого антитела. В некоторых вариантах осуществления константные области усекают или удаляют для создания необходимого фрагмента антитела моноклонального антитела. Сайт-направленный мутагенез или мутагенез с высокой плотностью вариабельной области может быть использован для оптимизации специфичности, аффинности и т. д. моноклонального антитела.

В некоторых вариантах осуществления моноклональным антителом к TNF-альфа является гуманизированное антитело. В определенных вариантах осуществления такие антитела используют терапевтически для снижения антигенности и ответов HAMA (человеческого антитела к антителу мыши) при введении субъекту-человеку.

Способы конструирования, гуманизации или повторного изменения поверхности отличных от человеческих или человеческих антител также могут быть применены и хорошо известны из уровня техники. Гуманизированное, с повторным изменением поверхности или подобным образом сконструированное антитело может иметь один или несколько аминокислотных остатков из источника, который является отличным от человеческого, например, без ограничения мышь, крыса, кролик, отличный от человека примат или другое млекопитающее. Такие отличные от человеческих аминокислотные остатки заменяются остатками, которые часто называют ''импортными'' остатками, которые, как правило, взяты из ''импортного'' вариабельного, константного или другого домена известной человеческой последовательности.

Такие импортированные последовательности можно применять для снижения иммуногенности или снижения, усиления или модифицирования связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, времени полужизни или любых других соответствующих характеристик, известных из уровня техники. Как правило, CDR-остатки непосредственно и наиболее существенно вовлечены в воздействие на связывание TNF-альфа. Следовательно, часть или все из отличных от человеческих или человеческих последовательностей CDR сохраняются, тогда как отличные от человеческих последовательности вариабельных и константных областей могут быть заменены человеческими или другими аминокислотами.

Антителами также необязательно могут быть гуманизированные, с повторным изменением поверхности, сконструированные или человеческие антитела, сконструированные с сохранением высокой аффинности в отношении антигена, например, TNF-альфа, и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированные (или человеческие) или сконструированные антитела и антитела с повторным изменением поверхности необязательно могут быть получены в процессе анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных и сконструированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных, сконструированных и гуманизированных последовательностей. Общедоступными являются трехмерные модели иммуноглобулинов, и они хорошо известны специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные структуры трехмерной конформации выбранных последовательностей кандидатных иммуноглобулинов. Просмотр этих отображений обеспечивает анализ вероятной роли остатков в функционировании последовательности кандидатного иммуноглобулина, т. е. анализ остатков, которые воздействуют на способность кандидатного иммуноглобулина связывать его антиген, такой как TNF-альфа. Таким образом, каркасные (FR) остатки можно отбирать из консенсусной и импортированной последовательностей и комбинировать, чтобы достигнуть необходимой характеристики антитела, такой как повышенная аффинность в отношении антигена(-ов)-мишени(-ей).

Гуманизирование, повторное изменение поверхности или конструирование антител по настоящему изобретению может быть выполнено с использованием любого известного способа, такого как без ограничения описываемые у Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), патент США №№ 5639641, 5723323; 5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5766886; 5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539; 4816567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7557189; 7538195 и 7342110, каждые из которых полностью включены в данный документ посредством ссылки, в том числе цитируемые в них ссылки.

В определенных альтернативных вариантах осуществления антитело (например, антитело к TNF-альфа) представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно непосредственно получать с применением различных методик, известных из уровня техники. Могут быть созданы иммортализованные человеческие B-лимфоциты, иммунизированные in vitro или выделенные из иммунизированного индивидуума, который продуцирует антитело, направленное в отношении целевого антигена (см., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; и патент США № 5750373). Также человеческое антитело может быть выбрано из фаговой библиотеки, если эта фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела, как описывается, например, у Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, и Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Методики для создания и применения фаговых библиотек антител также описываются в патентах США №№ 5969108, 6172197, 5885793, 6521404; 6544731; 6555313; 6582915; 6593081; 6300064; 6653068; 6706484 и 7264963; и Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10,1016/j.jmb,2007,12,018 (каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте). Стратегии созревания аффинности и стратегии перестановки цепей (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783, включенная посредством ссылки во всей своей полноте) известны из уровня техники и могут быть использованы для создания высокоаффинных человеческих антител.

Гуманизированные антитела также могут быть получены у трансгенных мышей, содержащих локусы человеческого иммуноглобулина, которые способны при иммунизации продуцировать полный репертуар человеческих антител при отсутствии продуцирования эндогенного иммуноглобулина. Этот подход описывается в патентах США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016.

В определенных вариантах осуществления представлен фрагмент антитела, например, для усиления проникновения в опухоль. Известны различные методики для продуцирования фрагментов антител. Традиционно эти фрагменты получают путем протеолитического расщепления интактных антител (например, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). В определенных вариантах осуществления фрагменты антител получают рекомбинантно. Все Fab-, Fv- и scFv-фрагменты антител могут быть экспрессированы и секретированы E. coli или другими клетками-хозяевами, за счет чего обеспечивается продуцирование больших количеств этих фрагментов. Такие фрагменты антител также могут быть выделены из фаговых библиотек антител. Фрагментом антитела также могут быть линейные антитела, описываемые в патенте США № 5641870. Специалисту в данной области техники будут известны другие методики получения фрагментов антител.

Для целей настоящего изобретения следует учитывать, что модифицированные антитела могут содержать любой тип вариабельной области, которая обеспечивает ассоциацию антитела с антигеном (например, TNF-альфа). В этом отношении вариабельная область может содержать или может быть получена из любого вида млекопитающего, у которого может быть индуцирован гуморальный ответ и образованы иммуноглобулины к необходимому ассоциированному с опухолью антигену. В связи с этим вариабельная область модифицированных антител может происходить, например, от человека, мыши, отличного от человека примата (например, яванских макаков, обыкновенных макаков и т. д.) или волка. В некоторых вариантах осуществления как вариабельные, так и константные области модифицированных иммуноглобулинов являются человеческими. В других вариантах осуществления вариабельные области совместимых антител (как правило, полученных из отличного от человека источника) могут быть сконструированы или специально созданы для улучшения связывающих свойств или снижения иммуногенности молекулы. В этом отношении вариабельные области, пригодные в настоящем изобретении, могут быть гуманизированы или иным образом изменены посредством включения импортированных аминокислотных последовательностей.

В определенных вариантах осуществления вариабельные домены как тяжелых, так и легких цепей изменяют путем по меньшей мере частичной замены одной или нескольких CDR и при необходимости путем частично замены каркасной области и изменения последовательности. Хотя CDR могут быть получены из антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, из которого получены каркасные области, предполагают, что CDR будет происходить из антитела другого класса, а в определенных вариантах осуществления из антитела от другого вида. Возможно, нет необходимости заменять все CDR на полные CDR из донорской вариабельной области, чтобы перенести антигенсвязывающую способность одного вариабельного домена в другой. Скорее, может потребоваться только перенос тех остатков, которые необходимы для поддержания активности антигенсвязывающего сайта. С учетом объяснений, изложенных в патентах США №№ 5585089, 5693761 и 5693762, это будет понятно специалистам в данной области техники, либо при выполнении рутинного эксперимента, либо при испытании и тестировании ошибок для получения функционального антитела со сниженной иммуногенностью.

Белки, связывающие TNF-альфа, включают белки, представляющие собой растворимый рецептор TNF. Белком, связывающим TNF-альфа, может быть растворимый рецептор p75 TNF. Белком, связывающим TNF-альфа, может быть растворимый рецептор p55 TNF.

Растворимый рецептор TNF может связываться как с TNF-альфа, так и с TNF-бета. Растворимый рецептор TNF может связываться с TNF-альфа, но не связываться с TNF-бета.

Растворимый рецептор TNF может подавлять связывание TNF-альфа (и необязательно TNF-бета) с рецепторами TNF клеточной поверхности.

Растворимым рецептором TNF может быть этанерцепт.

Белок, связывающий TNF-альфа, например, растворимый рецептор TNF, может быть слит с константным доменом тяжелой цепи или его фрагментом, или с Fc-областью или ее фрагментом. Фрагмент константного домена тяжелой цепи или Fc-фрагмент может быть частью константного домена или Fc, которая способна связываться с Fc-рецептором. Фрагмент константного домена тяжелой цепи или Fc-фрагмент может быть частью константного домена или Fc, которая способна индуцировать клеточный лизис in vitro в присутствии комплемента. Фрагмент константного домена тяжелой цепи или Fc-фрагмент может быть частью константного домена или Fc, которая способна индуцировать ADCC.

Константный домен тяжелой цепи или его фрагмент, или Fc-область или ее фрагмент могут быть человеческим константным доменом тяжелой цепи или его фрагментом, или человеческой Fc-областью или ее фрагментом. Константный домен тяжелой цепи или его фрагмент, или Fc-область или ее фрагмент могут быть константным доменом тяжелой цепи IgG1 или его фрагментом, или Fc-областью IgG1 или ее фрагментом. Константный домен тяжелой цепи или его фрагмент, или Fc-область или ее фрагмент могут быть константным доменом тяжелой цепи человеческого IgG1 или его фрагментом, или Fc-областью человеческого IgG1 или ее фрагментом.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению, и белки, связывающие TNF-альфа, по настоящему изобретению включают антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и белки, связывающие TNF-альфа, (например, полноразмерные антитела, антигенсвязывающие фрагменты антител или белки, представляющие собой растворимый рецептор TNF), содержащие один или несколько из доменов константной области, в том числе доменов, который были изменены с обеспечением необходимых биохимических характеристик, таких как сниженное время полужизни в сыворотке крови, по сравнению с антителом, его антигенсвязывающим фрагментом или белком, связывающим TNF, содержащими нативную или неизмененную константную область, с приблизительно той же иммуногенностью. В некоторых вариантах осуществления константная область антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или белка, связывающего TNF (например, полноразмерных антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или белков, представляющих собой растворимый рецептор TNF) будет включать человеческую константную область. Модификации константной области, совместимые с настоящим изобретением, предусматривают добавление, делеции или замены одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких доменах. То есть антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или белки, связывающие TNF-альфа (например, полноразмерные антитела, антигенсвязывающие фрагменты антител или белки, представляющие собой растворимый рецептор TNF), раскрываемые в данном документе, могут содержать изменения или модификации в одном или нескольких из трех константных доменов тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) и/или в константном домене легкой цепи (CL). В некоторых вариантах осуществления предполагаются модифицированные константные области, где один или несколько доменов частично или полностью удалены. В некоторых вариантах осуществления антитела, их антигенсвязывающие фрагменты или белки, связывающие TNF-альфа (например, полноразмерные антитела, антигенсвязывающие фрагменты антител или белки, представляющие собой растворимый рецептор TNF) будут содержать конструкции с удаленными доменами или варианты, где весь домен CH2 был удален (конструкции ΔCH2). В некоторых вариантах осуществления удаленный домен константной области будет заменен коротким аминокислотным спейсером (например, 10 остатков), который обеспечивает некоторую степень молекулярной гибкости, обычно обеспечиваемую отсутствующей константной областью.

Следует отметить, что в определенных вариантах осуществления антитела, их антигенсвязывающие фрагменты или белки, связывающие TNF-альфа (например, полноразмерные антитела, антигенсвязывающие фрагменты антител или белки, представляющие собой растворимый рецептор TNF), могут быть сконструированы так, чтобы сливать домен CH3 непосредственно с шарнирной областью соответствующих антител, их антигенсвязывающих фрагментов или белков, связывающих TNF-альфа (например, полноразмерных антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или белков, представляющих собой растворимый рецептор TNF). В других конструкциях может быть желательным обеспечение пептидного спейсера между шарнирной областью и модифицированными доменами CH2 и/или CH3. Например, могут быть экспрессированы совместимые конструкции, где домен CH2 был удален, и оставшийся домен CH3 (модифицированный или немодифицированный) присоединен к шарнирной области с 5-20-аминокислотным спейсером. Такой спейсер может быть добавлен, например, для обеспечения того, что регуляторные элементы константного домена остаются свободными и доступными, или что шарнирная область остается гибкой. Однако следует отметить, что аминокислотные спейсеры в некоторых случаях могут оказываться иммуногенными и вызывать нежелательный иммунный ответ в отношении конструкции. Следовательно, в определенных вариантах осуществления любой спейсер, добавленный к конструкции будет относительно неиммуногенным или даже полностью исключен с тем, чтобы поддерживать необходимые биохимические качества антител, их антигенсвязывающих фрагментов или белков, связывающих TNF-альфа (например, полноразмерных антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или белков, представляющих собой растворимый рецептор TNF).

Будет понятно, что антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и белки, связывающие TNF-альфа (например, полноразмерные антитела, антигенсвязывающие фрагменты антител или белки, представляющие собой растворимый рецептор TNF), по настоящему изобретению могут быть обеспечены путем частичной делеции или замены нескольких или даже одной аминокислоты. Например, мутация одной аминокислоты на выбранных участках домена CH2 может быть достаточной для существенного снижения связывания Fc и за счет этого обеспечения усиления локализации опухоли. Подобным образом, может быть желательным простое удаление той части одного или нескольких доменов константной области, которая контролирует эффекторную функцию (например, связывание комплемента C1Q), подлежащую модуляции. Такие частичные делеции константных областей могут улучшать выбранные характеристики антитела (время полужизни в сыворотке крови) с сохранением при этом других желательных функций, ассоциируемых с рассматриваемым интактным доменом константной области. Более того, как указывается выше, константные области раскрываемых антител, их антигенсвязывающих фрагментов и белков, связывающих TNF-альфа (например, полноразмерных антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или белков, представляющих собой растворимый рецептор TNF), могут быть модифицированы посредством мутации или замены одной или нескольких аминокислот, которые улучшают профиль полученной в результате конструкции. В этом отношении может быть возможным нарушение активности, обеспечиваемой консервативным сайтом связывания (например, связывания Fc) с сохранением по сути конфигурации и иммуногенного профиля антител, их антигенсвязывающих фрагментов и белков, связывающих TNF-альфа (например, полноразмерных антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или белков, представляющих собой растворимый рецептор TNF). Определенные варианты осуществления могут предусматривать добавление одной или нескольких аминокислот в константную область для усиления желаемых характеристик, таких как снижение или повышение эффекторной функции или обеспечения большего присоединения агониста глюкокортикоидного рецептора. В таких вариантах осуществления может быть желательным вставка или репликация специфических последовательностей, полученных из выбранных доменов константной области.

Настоящее изобретение дополнительно охватывает варианты и эквиваленты, которые являются по сути гомологичными антителам, их антигенсвязывающим фрагментам и белкам, связывающим TNF-альфа (например, полноразмерным антителам, антигенсвязывающим фрагментам антител или белкам, представляющих собой растворимый рецептор TNF), изложенным в данном документе. Они могут содержать, например, мутации по типу консервативной замены, т. е. замены одной или нескольких аминокислот подобными аминокислотами. Например, консервативная замена относится к замене одной аминокислоты другой из того же общего класса, например, одной кислой аминокислоты другой кислой аминокислотой, одной основной аминокислоты другой основной аминокислотой или одной нейтральной аминокислоты другой нейтральной аминокислотой. То, что предполагается под консервативной аминокислотной заменой, хорошо известно из уровня техники.

Полипептиды по настоящему изобретению могут быть рекомбинантными полипептидами, натуральными полипептидами или синтетическими полипептидами антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или белка, связывающего TNF. Из уровня техники будет понятно, что некоторые аминокислотные последовательности по настоящему изобретению можно варьировать без существенного влияния на структуру или функцию белка. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно предусматривает вариации полипептидов, которые показывают существенную активность или которые включают области антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или белка, связывающего TNF-альфа. Такие мутанты включают делеции, вставки, инверсии, повторы и типы замен.

Полипептиды и аналоги могут быть дополнительно модифицированы с содержанием дополнительных химических фрагментов, которые обычно не являются частью белка. Такие дериватизированные фрагменты могут улучшать растворимость, биологическое время полужизни или абсорбцию белка. Фрагменты также могут снижать или устранять любые необходимые побочные эффекты белков и т. п. Обзор таких фрагментов можно найти в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

Выделенные полипептиды, описываемые в данном документе, могут быть получены любым подходящим способом, известным из уровня техники. Такие способы варьируют от способов прямого синтеза белков до конструирования последовательности ДНК, кодирующей выделенные полипептидные последовательности, и экспрессии этих последовательностей в подходящем трансфорированном хозяине. В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК конструируют с использованием рекомбинантной технологии путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес белок дикого типа. Необязательно последовательность может быть подвергнута мутации путем сайт-специфического мутагенеза с обеспечением ее функциональных аналогов. См., например, Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) и патент США № 4588585.

В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК, кодирующая представляющий интерес полипептид, может быть сконструирована путем химического синтеза с использованием олигонуклеотидного синтезатора. Такие олигонуклеотиды могут быть разработаны на основе аминокислотной последовательности необходимого полипептида и отбора тех кодонов, которые являются благоприятными в клетке-хозяине, в которой будет продуцироваться представляющий интерес рекомбинантный полипептид. Для синтеза выделенной полинуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес выделенный полипептид, могут быть применены стандартные способы. Например, полная аминокислотная последовательность может быть использована для конструкции обратно транслированного гена. Кроме того, может быть синтезирован олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретный выделенный полипептид. Например, может быть синтезировано несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части необходимого полипептида, а затем лигированы. Отдельные олигонуклеотиды, как правило, содержат 5' или 3' ''липкие'' концы для комплементарной сборки.

После сборки (путем синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другого способа) полинуклеотидные последовательности, кодирующие конкретный выделенный представляющий интерес полипептид, будут вставлены в вектор экспрессии и функционально связаны с последовательностью контроля экспрессии, подходящей для экспрессии белка в необходимом хозяине. Надлежащая сборка может быть подтверждена нуклеотидным секвенированием, картированием рестрикции и экспрессией биологически активного полипептида в подходящем хозяине. Как хорошо известно из уровня техники, для получения высоких уровней экспрессии трансфицированного гена в хозяине ген должен быть функционально связан с транскрипционными и трансляционными последовательностями контроля экспрессии, которые являются функциональными в выбранном хозяине экспрессии.

В определенных вариантах осуществления рекомбинантные векторы экспрессии используют для амплификации и экспрессии ДНК, кодирующей антитела, их антигенсвязывающие фрагменты или белки, связывающие TNF-альфа (например, полноразмерные антитела, антигенсвязывающие фрагменты антител или белки, представляющие собой растворимый рецептор TNF). Рекомбинантные векторы экспрессии представляют собой реплицируемые конструкции ДНК, которые имеют синтетические или полученные из cDNA фрагменты ДНК, кодирующие полипептидную цепь антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или белка, связывающего TNF (например, полноразмерных антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или белков, представляющих собой растворимый рецептор TNF), функционально связанные с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами, полученными из генов млекопитающих, микробов, вирусов или насекомых. Единица транскрипции, как правило, содержит сборку (1) генетического элемента или элементов, играющих регуляторную роль в экспрессии гена, например, транскрипционные промоторы или энхансеры, (2) структурную или кодирующую последовательность, которая транскрибируется в mRNA и транслируется в белок, и (3) подходящие последовательности инициации и терминации транксрипции и трансляции. Такие регуляторные элементы могут включать операторную последовательность для контроля транскрипции. Могут быть также включены возможность репликации в хозяине, обычно обеспечиваемая источником репликации, и селекционный ген для облегчения распознавания трансформантов. Области ДНК являются функционально связанными, если они функционально родственные друг другу. Например, ДНК для сигнального пептида (секреторный лидер) функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется как предшественник, который участвует в секреции полипептида; промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он контролирует транскрипцию последовательности; или сайт связывания с рибосомой функционально связан с кодирующей последовательностью, если он располагается так, что допускает трансляцию. Структурные элементы, предназначенные для применения в дрожжевых системах экспрессии, включают лидерную последовательность, обеспечивающую внеклеточную секрецию транслируемого белка клеткой-хозяином. В качестве альтернативы, если рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, то он может включать N-концевой метиониновый остаток. Этот остаток необязательно может быть затем отщеплен от экспрессированного рекомбинантного белка с обеспечением конечного продукта.

Выбор последовательности контроля экспрессии и вектора экспрессии будет зависеть от выбора хозяина. Можно использовать обширный ряд комбинаций хозяина/вектора экспрессии. Пригодные векторы экспрессии для эукариотических хозяев включают, например, векторы, содержащие последовательности контроля экспрессии из SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса. Пригодные векторы экспрессии для бактериальных хозяев включают известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из Escherichia coli, в том числе pCR 1, pBR322, pMB9 и их производные, плазмиды с более широким кругом хозяев, такие как M13 и филаментные фаги с однонитевой ДНК.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии антител, их антигенсвязывающих фрагментов и белков, связывающих TNF-альфа (например, полноразмерных антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или белков, представляющих собой растворимый рецептор TNF), включают прокариоты, клетки дрожжей, насекомых или высших эукариот под контролем соответствующих промоторов. Прокариоты включают грамотрицательные или грамположительные организмы, например, E. coli или бациллы. Клетки высших эукариот включают устойчивые клеточные линии, происходящие от млекопитающих. Также могут быть использованы бесклеточные системы трансляции. Соответствующих векторы клонирования и экспрессии для применения с бактериальными, грибковыми, дрожжевыми клеточными хозяевами и клеточными хозяевами млекопитающих описываются в Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985), соответствующее раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки. Дополнительная информация о способах получения белков, в том числе получения антител, может быть найдена, например, в публикации на патент США № 2008/0187954, в патентах США №№ 6413746 и 6660501 и в международной заявке на патент WO 04009823, каждые из которых тем самым включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Различные системы культур клеток млекопитающих или насекомых также успешно используются для экспрессии рекомбинантного белка. Экспрессия рекомбинантных белков может быть выполнена в клетках млекопитающих, поскольку такие белки, как правило, корректно свернуты, соответствующим образом модифицированы и полностью функциональны. Примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих включают HEK-293 и HEK-293T, линии COS-7 клеток почки обезьяны, описываемые у Gluzman (Cell 23:175, 1981), и другие клеточные линии, в том числе, например, клетки L, C127, 3T3, клеточные линии яичника китайского хомячка (CHO), HeLa и BHK. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать нетранскрибируемые элементы, такие как точка начало репликации, подходящий промотор и энхансер, связанный с геном, подлежащим экспрессии, и другие 5'- или 3'- фланкирующие нетранскрибируемые последовательности и 5' или 3' нетранслируемые последовательности, такие как необходимые сайты связывания с рибосомой, сайт полиаденилирования, сайты донора и акцептора сплайсинга и последовательности терминации транскрипции. Бакуловирусные системы для получения гетерологичных белков в клетках насекомых рассматриваются в Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

Белки, полученные с помощью трансформированного хозяина могут быть очищены любым подходящим способом. Такие стандартные способы включают хроматографию (например, ионообменную, аффинную и колоночную хроматографию с распределением по размерам), центрифугирование, дифференциальную растворимость или любую другую стандартную методику для очистки белка. Аффинные метки, такие как гексагистидин, домен связывания мальтозы, последовательность оболочки вируса гриппа и глутатион-S-трансфераза, могут быть присоединены к белку для обеспечения легкой очистки путем пропускания через соответствующую колонку для аффинной хроматографии. Выделенные белки также могут быть физически охарактеризованы с использованием таких методик как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеновская кристаллография.

Например, надосадочные жидкости из систем, которые секретируют рекомбинантный белок в культуральную среду, могут быть сначала концентрированы с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрации белка, например, ультрафильтрационная установка Amicon или Millipore Pellicon. После стадии концентрации концентрат может быть нанесен на подходящую матрицу для очистки. В качестве альтернативы, может быть использована анионообменная смола, например, матрица или субстрат, имеющие боковые диэтиламиноэтильные (DEAE) группы. Матрицы могут быть акриламидными, агарозными, декстрановыми, целлюлозными или других типов, традиционно используемых для очистки белков. В качестве альтернативы, может быть использована стадия катионного обмена. Подходящие катионные обменники включают различные нерастворимые матрицы, содержащие сульфопропильную или карбоксиметильную группы. И наконец, может быть применена одна или несколько стадий обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) с использованием гидрофобных сред для RP-HPLC, например, силикагель, имеющий боковые метильные или другие алифатические группы, для дополнительной очистки белков, связывающих TNF-альфа (например, полноразмерных антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или белков, представляющих собой растворимый рецептор TNF). Некоторые или все из вышеизложенных стадий очистки, в различных комбинациях, также могут быть использованы для обеспечения гомогенного рекомбинантного белка.

Рекомбинантный белок, полученный в бактериальной культуре, может быть выделен, например, путем начальной экстракции из клеточных осадков с последующими одной или несколькими стадиями концентрирования, высаливания, водной ионообменной или эксклюзионной хроматографии. Для стадий конечной очистки может быть использована высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC). Микробные клетки, используемые в экспрессии рекомбинантного белка, могут быть разрушены любым удобным способом, в том числе проведение цикла замораживания и оттаивания, обработка ультразвуком, механическое разрушение или применение средств для лизиса клеток.

Способы, известные из уровня техники для очистки антител, их антигенсвязывающих фрагментов и белков, связывающих TNF-альфа, также включают, например, описываемые в публикациях на патент США №№ 2008/0312425, 2008/0177048 и 2009/0187005, каждая из которых тем самым включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

III. Иммуноконъюгаты, содержащие агонисты глюкокортикоидных рецепторов

В данном документе представлены иммуноконъюгаты, содержащие агонисты глюкокортикоидных рецепторов. В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, связывается с Fc-гамма-рецептором. В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, является активным в анализе в отношении трансмембранного TNF-альфа с использованием репортера GRE (в данном контексте ''анализ в отношении трансмембранного TNF-альфа с использованием репортера GRE'' относится к анализу, применяемому в примере 79 ниже). В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, является активным в анализе с использованием клеток L929 (в данном контексте ''анализ с использованием клеток L929'' относится к анализу, применяемому в примере 82 ниже). В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, демонстрирует сниженную иммуногенность (сниженный иммунный ответ, вызывающий нейтрализацию действия лекарственного средства (ADA)) по сравнению с белком в иммуноконъюгате (например, антителом, его антигенсвязывающим фрагментом или растворимым рецептором) отдельно.

В одном варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a,

(SM-L-Q)_n-A¹ I-a,

или его фармацевтически приемлемая соль, где:

A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа;

L представляет собой линкер;

Q представляет собой гетеробифункциональную группу или гетеротрифункциональную группу или

Q отсутствует;

n составляет 1-10; и

SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида.

В одном варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a,

(SM-L-Q)_n-A¹ I-a,

или его фармацевтически приемлемая соль, где:

A¹ представляет собой антитело к фактору некроза опухолей (TNF) альфа, моноклональное антитело к TNF-альфа или адалимумаб;

L представляет собой линкер;

Q представляет собой гетеробифункциональную группу или гетеротрифункциональную группу или

Q отсутствует;

n составляет 1-10; и

SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида.

где атом серы, кислорода или азота присоединен непосредственно или опосредованно к C- или D-кольцу глюкокортикостероида, и R представляет собой C_1-4алкил. В другом варианте осуществления атом серы, кислорода или азота присоединен непосредственно или опосредованно к D-кольцу глюкокортикостероида.

II-a,

где:

R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси;

R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, -OH (или гидрокси), -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN,

, , и ;

R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси;

R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH и C_1-4алкокси;

R^3d и R^3e независимо выбраны из водорода и C_1-4алкила;

R^9a выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного циклоалкила, необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила;

R^9b выбран из группы, состоящей из водорода и алкила; или

R^9a представляет собой:

или ; и

R^9b представляет собой водород или метил;

X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- и -C≡C-; или

X отсутствует;

t равняется 1 или 2;

Z выбран из группы, состоящей из =CH-, =C(OH)- и =N-;

каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или

R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил;

R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

каждый из R^6a, R^6b, R^6c, R^6d и R^6e независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси;

R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R¹¹ выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и

представляет собой одинарную или двойную связь.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-a, где R^9a представляет собой:

II-a',

где R¹, R², R³, R^9a, R^9b и определены применительно к формуле II-a.

II-b,

где R¹, R², R³, R^9a, R^9b и определены применительно к формуле II-a.

II-b',

где R¹, R², R³, R^9a, R^9b и определены применительно к формуле II-a.

II-c,

где R¹, R², R^9a, R^9b и определены применительно к формуле II-a; и

W выбран из группы, состоящей из -O- и -S-. В другом варианте осуществления W представляет собой -O-. В другом варианте осуществления W представляет собой -S-.

II-c',

где R¹, R², R^9a, R^9b, W и определены применительно к формуле II-c.

II-d,

где R¹, R², R^9a, R^9b, W и определены применительно к формуле II-c.

II-d',

где R¹, R², R^9a, R^9b, W и определены применительно к формуле II-c.

II-e,

где:

R¹, R², W и определены применительно к формуле II-c;

R^9c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила и -C(=O)R^9e;

R^9d выбран из группы, состоящей из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного циклоалкила, необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила; и

R^9e выбран из группы, состоящей из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного циклоалкила, необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила.

II-e',

где R¹, R², W, R^9c, R^9d и определены применительно к формуле II-e.

II-f,

где:

R¹, R², R^9c, R^9d, W и определены применительно к формуле II-e.

II-f',

где R¹, R², R^9c, R^9d, W и определены применительно к формуле II-e.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-b,

(SM-L-Q)_n-A² I-b,

или его фармацевтически приемлемая соль, где:

A² представляет собой белок;

L представляет собой линкер;

Q представляет собой гетеробифункциональную группу или гетеротрифункциональную группу или

Q отсутствует;

n составляет 1-10; и

SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из:

(1) формулы II-l,

II-l;

(2) формулы II-m,

II-m;

(3) формулы II-n,

II-n;

(4) формулы II-o,

II-o;

(5) формулы II-p,

II-p, или

(6) формулы II-q,

II-q,

где:

R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси;

R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, -OH, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN,

, , и ;

R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси;

R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH и C_1-4алкокси;

R^3d и R^3e независимо выбраны из водорода и C_1-4алкила;

каждый из R^6a, R^6b, R^6c,R^6d и R^6e независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси;

X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- (включая как E-, так и Z-изомеры) и -C≡C- (где, если X представляет собой -CH₂S-, -CH₂O- или -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, то гетероатом в -CH₂S-, -CH₂O- или -N(H)C(R^8a)(R^8b)- может быть присоединен к одному из 6-членных колец, т. е. -CH₂S- является эквивалентным -SCH₂-, -CH₂O- является эквивалентным -OCH₂-, и -N(H)C(R^8a)(R^8b)- является эквивалентным -C(R^8a)(R^8b)N(H)-); или

X отсутствует, т. е. X представляет собой химическую связь;

Y² выбран из группы, состоящей из -O-, -S- и -N(R^7a)-; или

Y² отсутствует, т. е. Y² представляет собой химическую связь;

t равняется 1 или 2;

Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-;

каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или

R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил;

R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^11a и R^11b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и

представляет собой одинарную или двойную связь.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-b,

(SM-L-Q)_n-A² I-b,

где:

A² представляет собой белок;

L представляет собой линкер;

Q представляет собой гетеробифункциональную группу или гетеротрифункциональную группу или

Q отсутствует;

n составляет 1-10; и

SM представляет собой одновалентный радикал, характеризующийся любой из:

(1) формулы II-l',

II-l';

(2) формулы II-m',

II-m';

(3) формулы II-n',

II-n';

(4) формулы II-o',

II-o';

(5) формулы II-p',

II-p', или

(6) формулы II-q',

II-q',

где R¹, R², R³, , R^6a, R^6c, R^6d, R^6e, R^9f, R^11b, Y², X и Z определены применительно к формуле II-l.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-b,

(SM-L-Q)_n-A² I-b,

где:

A² представляет собой белок;

L представляет собой линкер;

Q представляет собой гетеробифункциональную группу или гетеротрифункциональную группу или

Q отсутствует;

n составляет 1-10; и

SM представляет собой одновалентный радикал, характеризующийся любой из:

(1) формулы II-l'',

II-l'';

(2) формулы II-m'',

II-m'';

(3) формулы II-n'',

II-n'';

(4) формулы II-o'',

II-o'';

(5) формулы II-p'',

II-p'', или

(6) формулы II-q'',

II-q'',

где R¹, R², R³, , R^6a, R^6c, R^6d, R^6e, R^9f, R^11b, Y² и X определены применительно к формуле II-l, и атом углерода, помеченный с помощью ''*'', соответствует либо R-изомеру, либо S-изомеру, если R² представляет собой галоген или гидроксил. В одном варианте осуществления атом углерода, помеченный с помощью ''*'', соответствует R-изомеру. В другом варианте осуществления атом углерода, помеченный с помощью ''*'', соответствует S-изомеру.

II-l,

где:

R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси;

R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, -OH, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN,

, , и ;

R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси;

R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH и C_1-4алкокси;

R^3d и R^3e независимо выбраны из водорода и C_1-4алкила;

X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- и -C≡C-; или

X отсутствует;

t равняется 1 или 2;

Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-;

каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или

R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил;

R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

каждый из R^6a, R^6c, R^6d и R^6e независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси;

Y² выбран из группы, состоящей из -O-, -S- и -N(R^7a)-; или

Y² отсутствует;

R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

представляет собой одинарную или двойную связь.

II-m,

где R¹, R², R³, , R^6a, R^6c, R^6d, R^6e, R^9f, R^11b, Y², X и Z определены применительно к формуле II-l.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или Ib, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-n,

II-n,

где R¹, R², R³, , R^6a, R^6c, R^6d, R^6e, R^9f, R^11b, Y², X и Z определены применительно к формуле II-l.

II-o,

где R¹, R², R³, , R^6a, R^6d, R^6e, R^9f, R^11b, Y², X и Z определены применительно к формуле II-l; и R^6b выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси.

II-p,

где R¹, R², R³, , R^6a, R^6b, R^6d, R^6e, R^9f, R^11b, Y², X и Z определены применительно к формуле II-o.

II-q,

где R¹, R², R³, , R^6a, R^6b, R^6d, R^6e, R^9f, R^11b, Y², X и Z определены применительно к формуле II-o.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где представляет собой двойную связь.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и фтора.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где R² выбран из группы, состоящей из водорода и фтора.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F и -OH.

R³ выбран из группы, состоящей из:

, , и ;

R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и метила;

R^3b выбран из группы, состоящей из метила, этила, изопропила, изобутила, метокси, этокси, изопропокси и изобутокси;

R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, метила, этила, -CH₂OH, метокси, этокси и изопропокси;

R^3d и R^3e независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, метила и этила.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где R⁵ и R^8a независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и метила.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где Z представляет собой =CH-.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где Z представляет собой =N-.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где R^6a, R^6d и R^6e представляют собой водород.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где Y² представляет собой -N(R^7a)-. В другом варианте осуществления R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и метила. В другом варианте осуществления R^7a представляет собой водород. В другом варианте осуществления R^7a представляет собой метил.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где:

X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -CH₂S- и -N(H)CH(R^8a)-;

t равняется 1;

R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и метила; или

R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-членный циклоалкил; и

R^8a выбран из группы, состоящей из водорода и метила. В другом варианте осуществления X представляет собой -CH₂-. В другом варианте осуществления X выбран из группы, состоящей из:

В другом варианте осуществления X представляет собой -O-. В другом варианте осуществления X представляет собой -S-. В другом варианте осуществления X представляет собой -CH₂S-. В другом варианте осуществления X представляет собой -N(H)CH₂-. В другом варианте осуществления X выбран из группы, состоящей из:

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-l, II-m или II-n или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-l', II-m', II-n', II-l'', II-m'' или II-n'', где R^6c выбран из группы, состоящей из водорода, -Cl, -OMe (или -OCH₃) и -OH.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-o', II-p', II-q', II-o'', II-p'' или II-q'', где R^6b выбран из группы, состоящей из водорода, -Cl, -OMe (или -OCH₃) и -OH.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где L представляет собой расщепляемый линкер. В другом варианте осуществления расщепляемый линкер предусматривает сукцинимид, амид, тиомочевину, простой тиоэфир, оксим или самоотщепляющуюся группу или их комбинацию. В другом варианте осуществления расщепляемый линкер предусматривает пептид. В другом варианте осуществления расщепляемый линкер предусматривает трипептид. В другом варианте осуществления расщепляемый линкер предусматривает дипептид. В другом варианте осуществления расщепляемый линкер предусматривает сложный эфир фосфорной кислоты. В другом варианте осуществления расщепляемый линкер предусматривает сложный диэфир пирофосфорной кислоты.

;

где m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом варианте осуществления Q выбран из группы, состоящей из Q-1, Q-2, Q-3 и Q-4. В другом варианте осуществления Q выбран из группы, состоящей из Q-3 и Q-4. В другом варианте осуществления m равняется 2.

LQ-1;

m равняется 2 или 3; и

R^10a и R^10b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила. В другом варианте осуществления m равняется 2. В другом варианте осуществления m равняется 1. В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-2.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-3.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-4.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-5.

LQ-6;

m равняется 2 или 3; и

LQ-7.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-8.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-9.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-10.

LQ-11;

m равняется 2 или 3; и

x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В другом варианте осуществления m равняется 2.

LQ-12;

m равняется 2 или 3; и

x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В другом варианте осуществления m равняется 2.

LQ-13; и

x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.

Соединение по любому из пп. формулы изобретения 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой:

LQ-29; и

x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.

LQ-14;

m равняется 1 или 2;

x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15; и R^10a и R^10b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила. В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-15.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-16.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-17.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-18.

LQ-19;

m равняется 1 или 2;

x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15; и R^10a и R^10b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-20.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-21.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-22.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-23.

LQ-24;

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-25.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-26.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-27.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-28.

LQ-30;

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-31.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-32.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-33.

В другом варианте осуществления -L-Q- представляет собой:

LQ-34.

Таблица I

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где n составляет 2-8. В другом варианте осуществления n составляет 1-5. В другом варианте осуществления n составляет 2-5. В другом варианте осуществления n равняется 1. В другом варианте осуществления n равняется 2. В другом варианте осуществления n равняется 3. В другом варианте осуществления n равняется 4. В другом варианте осуществления n равняется 5. В другом варианте осуществления n равняется 6. В другом варианте осуществления n равняется 7. В другом варианте осуществления n равняется 8.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a или I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, который представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице II.

Таблица II

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-a, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', или соединение, характеризующееся формулой I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-b, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, предусматривающий антигенсвязывающий фрагмент антитела к рецептору TNF, или где A² представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, предусматривающий антигенсвязывающий фрагмент антитела к рецептору TNF.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-a, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', или соединение, характеризующееся формулой I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-b, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, предусматривающий растворимый рецептор TNF, или где A² представляет собой белок, предусматривающий растворимый рецептор TNF. В другом варианте осуществления растворимый рецептор TNF представляет собой растворимый рецептор p75 TNF.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-a, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', или соединение, характеризующееся формулой I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-b, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где A¹ предусматривает константный домен тяжелой цепи или его фрагмент, или где A² предусматривает константный домен тяжелой цепи или его фрагмент. В другом варианте осуществления, константный домен тяжелой цепи или его фрагмент предусматривает константный домен, выбранный из группы, состоящей из (a) константного домена IgA; (b) константного домена IgD; (c) константного домена IgE; (d) константного домена IgG1; (e) константного домена IgG2; (f) константного домена IgG3; (g) константного домена IgG4 и (h) константного домена IgM, или представляет собой фрагмент каждого из вышеперечисленных. В другом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи предусматривает константный домен тяжелой цепи человеческого IgG1 или его фрагмент. В другом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи предусматривает Fc-домен человеческого IgG1.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-a, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', или соединение, характеризующееся формулой I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-b, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q, где A¹ предусматривает константный домен легкой цепи или его фрагмент, или где A² предусматривает константный домен легкой цепи или его фрагмент. В другом варианте осуществления константный домен легкой цепи или его фрагмент предусматривает константный домен, выбранный из группы, состоящей из (a) константного домена Ig-каппа и (b) константного домена Ig-лямбда, или представляет собой фрагмент каждого из вышеперечисленных.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-a, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', или соединение, характеризующееся формулой I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-b, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где A¹ конкурентно ингибирует связывание антитела, выбранного из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола и голимумаба, с TNF-альфа, или где A² конкурентно ингибирует связывание антитела, выбранного из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола и голимумаба с TNF-альфа.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-a, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', или соединение, характеризующееся формулой I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-b, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где A¹ связывается с тем же эпитопом TNF-альфа, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба и голимумаба, или где A² связывается с тем же эпитопом TNF-альфа, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба и голимумаба.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-a, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', или соединение, характеризующееся формулой I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-b, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где A¹ содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи соответственно под SEQ ID NO:3 или 6, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи соответственно под SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 и SEQ ID NO:34, или где A² содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи соответственно под SEQ ID NO:3 или 6, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи соответственно под SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 и SEQ ID NO:34.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-a, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-a', II-b', II-c', II-d', II-e', II-f', II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', или соединение, характеризующееся формулой I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, например соединение, характеризующееся формулой I-b, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формул II-l, II-m, II-n, II-o, II-p или II-q или любой из формул II-l', II-m', II-n', II-o', II-p', II-q', II-l'', II-m'', II-n'', II-o'', II-p'' или II-q'', где A¹ нейтрализует индуцированную человеческим TNF-альфа цитотоксичность в in vitro анализе с использованием клеток L929 при значении IC50, составляющем 1X10^-7 M или меньше, или где A² нейтрализует индуцированную человеческим TNF-альфа цитотоксичность в in vitro анализе с использованием клеток L929 при значении IC50, составляющем 1X10^-7 M или меньше.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, или соединение, характеризующееся формулой I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, которое представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице III.

Таблица III

где n составляет 1-5, и A представляет собой A¹ или A². В другом варианте осуществления A представляет собой адалимумаб.

Таблица IV

где A представляет собой A¹ или A². В другом варианте осуществления A представляет собой адалимумаб.

Таблица IV-A

где A представляет собой A¹ или A². В другом варианте осуществления A представляет собой адалимумаб.

Таблица V

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-a, или его фармацевтически приемлемая соль, или соединение, характеризующееся формулой I-b, или его фармацевтически приемлемая соль, выбранные из группы, состоящей из:

где n составляет 2-4, A представляет собой A¹ или A². В другом варианте осуществления A представляет собой адалимумаб. В другом варианте осуществления n равняется 2 или 4. В другом варианте осуществления n равняется 2. В другом варианте осуществления n равняется 4.

IV. Агонисты глюкокортикоидных рецепторов

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VII,

VII,

или его фармацевтически приемлемая соль, где:

R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси;

R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, -CH₂OS(=O)₂OH, -OH, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN,

, , и ;

R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси;

R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH, C_1-4алкокси, -CH₂(амино) и -CH₂CH₂C(=O)OR^3f;

R^3d и R^3e независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^3f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- (включая как E-, так и Z-изомеры), -C≡C-, -N(R⁵)C(=O)- и -OC(=O)- (где, если X представляет собой -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -N(R⁵)C(=O)- или -OC(=O)-, то гетероатом в -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -N(R⁵)C(=O)- или -OC(=O)- может быть присоединен к одному из 6-членных колец, т. е. -CH₂S- является эквивалентным -SCH₂-, -CH₂O- является эквивалентным -OCH₂-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)- является эквивалентным -C(R^8a)(R^8b)N(H)-), -N(R⁵)C(=O)- является эквивалентным -C(=O)N(R⁵)C=O)-, и -OC(=O)- является эквивалентным -C(=O)O-); или

X отсутствует, т. е. X представляет собой химическую связь;

t равняется 1 или 2;

Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-;

каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или

R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил;

R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

каждый из R^6a, R^6b, R^6c и R^6d независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси;

R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^7b выбран из группы, состоящей из водорода, -L-H, -L-PG,

и ; или

R^7a и R^7b, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют:

; или

R^7a и R^7b, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют нитрогруппу (-NO₂);

m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

L представляет собой линкер;

PG представляет собой защитную группу, например Boc, FMOC;

R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^11a и R^11b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C₁-₄галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и

представляет собой одинарную или двойную связь. В другом варианте осуществления R^7b представляет собой водород. В другом варианте осуществления R^7b выбран из группы, состоящей из:

, и ;

m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и

каждый из R^10a и R^10b независимо выбран из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VII',

VII',

или его фармацевтически приемлемая соль, где R¹, R², R³, , R^6a, R^6b, R^6c, R^6d, R^7a, R^7b, R^9f, R^11b, X и Z определены применительно к формуле VII.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VII'',

VII'',

или его фармацевтически приемлемая соль, где R¹, R², R³, , R^6a, R^6b, R^6c, R^6d, R^7a, R^7b, R^9f, R^11b и X определены применительно к формуле VII, и атом углерода, помеченный с помощью ''*'', соответствует либо R-изомеру, либо S-изомеру, если R² представляет собой галоген или гидроксил. В одном варианте осуществления атом углерода, помеченный с помощью ''*'', соответствует R-изомеру. В другом варианте осуществления атом углерода, помеченный с помощью ''*'', соответствует S-изомеру.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VII-A или формулой VII-B,

VII-A или VII-B,

или фармацевтически приемлемые соль или сольват каждого из них, где:

R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси;

R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, -CH₂OS(=O)₂OH,

гидрокси, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN, , , и ;

R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси;

R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH, C_1-4алкокси, -CH₂(амино) и -CH₂CH₂C(=O)OR^3f;

R^3d и R^3e независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^3f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d-, -C≡C-, -N(R⁵)C(=O)- и -OC(=O)-; или

X отсутствует;

t равняется 1 или 2;

Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-;

каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или

R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил;

R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

каждый из R^6a, R^6b и R^6c независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси;

R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^7b выбран из группы, состоящей из водорода, -L-H, -L-PG, и ; или

R^7a и R^7b, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют:

; или

R^7a и R^7b, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют нитрогруппу (-NO₂);

m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

L представляет собой линкер;

PG представляет собой защитную группу;

R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

, и ;

m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и

каждый из R^10a и R^10b независимо выбран из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VII-A' или формулой VII-B',

VII-A' или VII-B',

или фармацевтически приемлемая соль каждого из них, где R¹, R², R³, , R^6a, R^6b, R^6c, R^7a, R^7b, R^9f, R^11b, X и Z определены применительно к формуле VII-A.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VII-A'' или формулой VII-B'',

VII-A'' или VII-B'',

или фармацевтически приемлемая соль каждого из них, где R¹, R², R³, , R^6a, R^6b, R^6c, R^7a, R^7b, R^9f, R^11b и X определены применительно к формуле VII-A, и атом углерода, помеченный с помощью ''*'', соответствует либо R-изомеру, либо S-изомеру, если R² представляет собой галоген или гидроксил. В одном варианте осуществления атом углерода, помеченный с помощью ''*'', соответствует R-изомеру. В другом варианте осуществления атом углерода, помеченный с помощью ''*'', соответствует S-изомеру.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII,

VIII,

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII',

VIII',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII'',

VIII'',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII-a,

VIII-a,

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII-a',

VIII-a',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII-a'',

VIII-a'',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII-b,

VIII-b,

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII-b',

VIII-b',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII-b'',

VIII-b'',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX,

IX,

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX',

IX',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX'',

IX'',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX-a,

IX-a,

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX-a',

IX-a',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX-a'',

IX-a'',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX-b,

IX-b,

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX-b',

IX-b',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX-b'',

IX-b'',

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся любой из формул VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a или IX-b или любой из формул VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' или IX-b'', или его фармацевтически приемлемая соль, где представляет собой одинарную или двойную связь. В другом варианте осуществления представляет собой двойную связь.

R³ выбран из группы, состоящей из:

, , и ;

R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и метила;

R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, метила, этила, -CH₂OH, метокси, этокси и изопропокси;

R^3d и R^3e независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, метила и этила.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся любой из формул VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a или IX-b или любой из формул VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' или IX-b'', или его фармацевтически приемлемая соль, где R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и метила. В другом варианте осуществления R^7a представляет собой водород. В другом варианте осуществления R^7a представляет собой метил.

X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -CH₂S- и -N(H)CH(R^8a)-;

t равняется 1; и

R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и метила; или

R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-членный циклоалкил. В другом варианте осуществления X представляет собой -CH₂-. В другом варианте осуществления X выбран из группы, состоящей из:

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся любой из формул VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a или IX-b или любой из формул VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' или IX-b'', или его фармацевтически приемлемая соль, где R^7b представляет собой R^7b-1. В другом варианте осуществления R^10a и R^10b независимо представляют собой необязательно замещенный C_1-6алкил. В другом варианте осуществления R^10a и R^10b независимо представляют собой необязательно замещенный C_1-4алкил.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся любой из формул VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a или IX-b или любой из формул VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' или IX-b'', или его фармацевтически приемлемая соль, где R^7b представляет собой R^7b-2, и PG представляет собой BOC. В другом варианте осуществления R^10a и R^10b независимо представляют собой необязательно замещенный C_1-6алкил. В другом варианте осуществления R^10a и R^10b независимо представляют собой необязательно замещенный C_1-4алкил.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся любой из формул VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a или IX-b или любой из формул VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' или IX-b'', или его фармацевтически приемлемая соль, где R^7b представляет собой R^7b-3. В другом варианте осуществления m равняется 2 или 3, и каждый из R^10a и R^10b представляет собой необязательно замещенный C_1-6алкил. В другом варианте осуществления m равняется 2. В другом варианте осуществления R^10a и R^10b независимо представляют собой необязательно замещенный C_1-4алкил.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII, или его фармацевтически приемлемая соль, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице VI.

Таблица VI

Таблица VI-A

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VII-A или формулой VII-B, или его фармацевтически приемлемая соль, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице VI-B.

Таблица VI-B

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой VIII, или его фармацевтически приемлемая соль, выбранное из группы, состоящей из:

, и .

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX, или его фармацевтически приемлемая соль, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице VII.

Таблица VII

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой IX-a, или его фармацевтически приемлемая соль, выбранное из группы, состоящей из:

; и.

V. Способы получения иммуноконъюгатов и промежуточные соединения, которые применяются в синтезе

Общий синтез иммуноконъюгатов согласно настоящему изобретению описан на общей схеме 1.

Общая схема 1

На общей схеме 1 SM-N(R^7a)(R^7b) представляет собой глюкокортикостероид, содержащий группу -NH(R^7a) (где R^7a представляет собой водород или C_1-4алкил), или соединение, характеризующееся любой из формул VII, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a или IX-b или любой из формул VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' или IX-b'', или соединение, представленное в таблице 9; HS-A представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент с ограниченным количеством восстановленных межцепочечных дисульфидных связей, R' и R'' независимо представляют собой любую встречающуюся в природе боковую цепь, например метил, изопропил, и/или искусственную аминокислоту, например -CH₂CH₂CH₂N(H)C(=O)NH₂, m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6, и PG представляет собой защитную группу, например BOC. Для целей иллюстрации на общей схеме 1 демонстрируется лишь одна сульфгидрильная группа, которая является доступной для конъюгации в антителе или антигенсвязывающем фрагменте.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыт способ получения соединения, характеризующегося формулой I-c,

I-c,

или его фармацевтически приемлемой соли, где:

A представляет собой A¹ или A²;

A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа;

A² представляет собой белок;

L представляет собой линкер;

n составляет 1-10; и

SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида, например соединение, характеризующееся любой из формул II-a-q;

причем способ включает:

a) конъюгирование соединения, характеризующегося формулой X,

с белком, подавляющим активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, или белком и

b) выделение соединения, характеризующегося формулой I-c, или его фармацевтически приемлемой соли. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает осуществление гидролиза соединения, характеризующегося формулой I-c, с получением соединения, характеризующегося формулой I-d:

I-d.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыт способ получения соединения, характеризующегося формулой I-e,

I-e,

или его фармацевтически приемлемой соли, где:

A представляет собой A¹ или A²;

A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа;

A² представляет собой белок;

L представляет собой линкер;

R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

n составляет 1-10;

m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и

SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида, например соединение, характеризующееся любой из формул II-a-e или l-q;

причем способ включает:

a) конъюгирование соединения, характеризующегося формулой XI,

XI,

с белком, подавляющим активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, или белком и

b) выделение соединения, характеризующегося формулой I-e, или его фармацевтически приемлемой соли. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает осуществление гидролиза соединения, характеризующегося формулой I-e, с получением соединения, характеризующееся формулой I-f:

I-f.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыт способ получения соединения, характеризующегося формулой I-G,

I-G,

где:

A представляет собой адалимумаб; и

n составляет 1-10,

причем способ включает:

a) конъюгирование соед. № 88,

с частично восстановленным адалимумабом; и

b) выделение, например, посредством хроматографии, соединения, характеризующегося формулой I-G.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыт способ получения соединения, характеризующегося формулой I-H,

I-H,

где:

A представляет собой адалимумаб; и

n составляет 1-10,

причем способ включает осуществление гидролиза соединения, характеризующегося формулой I-G, с получением соединения формулы I-H.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыт способ получения соединения, характеризующегося формулой I-G или формулой I-H, где n составляет 1-7. В другом варианте осуществления n составляет 1-5. В другом варианте осуществления n составляет 2-4. В другом варианте осуществления n равняется 1. В другом варианте осуществления n равняется 1,5. В другом варианте осуществления n равняется 2. В другом варианте осуществления n равняется 2,5. В другом варианте осуществления n равняется 3. В другом варианте осуществления n равняется 3,5. В другом варианте осуществления n равняется 4. В другом варианте осуществления n равняется 4,5. В другом варианте осуществления n равняется 5.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-H,

I-H,

где:

A представляет собой адалимумаб; и

n составляет 1-10.

В другом варианте осуществления в данном документе раскрыто соединение, характеризующееся формулой I-H, где n составляет 1-7. В другом варианте осуществления n составляет 1-5. В другом варианте осуществления n составляет 2-4. В другом варианте осуществления n равняется 1. В другом варианте осуществления n равняется 1,5. В другом варианте осуществления n равняется 2. В другом варианте осуществления n равняется 2,5. В другом варианте осуществления n равняется 3. В другом варианте осуществления n равняется 3,5. В другом варианте осуществления n равняется 4. В другом варианте осуществления n равняется 4,5. В другом варианте осуществления n равняется 5. В другом варианте осуществления n равняется 5,5. В другом варианте осуществления n равняется 6. В другом варианте осуществления n равняется 6,5. В другом варианте осуществления n равняется 7. В другом варианте осуществления n равняется 7,5. В другом варианте осуществления n равняется 8.

В соответствии с настоящим изобретением агонисты глюкокортикоидных рецепторов могут быть связаны с антителом, его антигенсвязывающим фрагментом или белками, подавляющими активность TNF-альфа, посредством любого способа и в любом положении, которое не препятствует связыванию антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или белка, подавляющего активность TNF-альфа, с антигеном (например, TNF-альфа) или не ограничивает активность агониста глюкокортикоидных рецепторов. Способы обеспечения такой связи рассмотрены, например, в Panowski et al., mAbs 6: 34-45 (2014), Jain et al., Pharm. Res. 32: 3526-3540 (2015), Mack et al., Seminars in Oncology 41: 637-652 (2014), публикации заявки на патент США № 2008/0305044 и публикации заявки на патент США № 2011/0097322, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме.

Агонисты глюкокортикоидных рецепторов могут быть связаны с антителами, их антигенсвязывающими фрагментами или белками, подавляющими активность TNF-альфа, с помощью природной аминокислоты, например аминокислоты, которая имеет боковую цепь с нуклеофильной группой.

Например, агонист глюкокортикоидных рецепторов может быть связан с остатком лизина. Способы конъюгации с использованием лизина являются известными. Такие способы включают двухстадийный способ, в котором линкер присоединяют к антителу, его антигенсвязывающему фрагменту или белку, подавляющему активность TNF-альфа, в ходе первой химической реакции, а затем линкер вводят в реакцию с агонистом глюкокортикоидных рецепторов в ходе второй химической реакции. В другом способе предусмотрена одностадийная реакция с предварительно образованным комплексом линкер-агонист глюкокортикоидных рецепторов с образованием конъюгата, содержащего агонист глюкокортикоидных рецепторов, связанный с антителом, его антигенсвязывающим фрагментом или белком, подавляющим активность TNF-альфа.

Агонист глюкокортикоидных рецепторов также может быть связан с остатком цистеина. Способы конъюгации с использованием цистеина являются известными. Антитела к IgG1 содержат четыре межцепочечные дисульфидные связи, и конъюгация с использованием цистеина может происходить после того, как восстановление таких связей обеспечивает образование сульфгидрильных групп, доступных для конъюгации.

Агонисты глюкокортикоидных рецепторов могут быть связаны с антителом, его антигенсвязывающим фрагментом или белками, подавляющими активность TNF-альфа, посредством сайт-специфической конъюгации.

Один способ сайт-специфической конъюгации представляет собой сайт-специфическую конъюгацию с использованием цистеина. Пример данного способа описан в литературе Junutula et al., Nat. Biotechnol 26: 925-935 (2008); см. также Junutula et al., J. Immunol. Methods 332: 41-52 (2008), каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме. Посредством применения данного способа антитела, их антигенсвязывающие фрагменты или белки, подавляющие активность TNF-альфа, могут быть сконструированы с дополнительными аналогами цистеина, которые обеспечивают конъюгацию реакционно-способных тиольных групп с агонистом глюкокортикоидных рецепторов. В таких публикациях также предоставляются рекомендации касательно выбора реакционно-способных аналогов цистеина, которые не препятствуют связыванию антигена.

Другой способ сайт-специфической конъюгации предусматривает применение селеноцистеина. Селеноцистеин подобен цистеину, но содержит обладающий большей реакционной способностью атом селена вместо атома серы в цистеине. Можно использовать условия, при которых селеноцистеины селективно активируются. В источнике Hofer et al., Biochemistry 48: 12047-12057 (2009), который включен в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме, иллюстрируется данная методика.

Другой способ сайт-специфической конъюгации предусматривает применение не встречающихся в природе аминокислот, например ацетилфенилаланина (pAcPhe) или пара-азидофенилаланина (pAF). В источниках Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 56-61 (2003), Axup et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 109:16101-16106 (2012) и Kern et al., JACS 138: 1430-1445 (2016), каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме, иллюстрируется данная методика.

Другой способ сайт-специфической конъюгации предусматривает применение ферментативных подходов, например, с использованием гликотрансфераз или трансглутаминаз. Мутантные гликотрансферазы можно использовать для присоединения химически активного сахарного фрагмента к сайту гликозилирования на антителе, его антигенсвязывающем фрагменте или белке, подавляющем активность TNF-альфа. Антитела к человеческому IgG содержат сайт N-гликозилирования при остатке Asn-297 Fc-фрагмента. Гликаны, присоединенные по данному остатку, могут быть дегалактозилированы с тем, чтобы мутантная гликотрансфераза была способна к переносу к ним. В источнике Boeggeman et al., Bioconjug. Chem. 20: 1228-1236 (2009), который включен в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме, иллюстрируется данная методика. Трансглутаминазы, например, полученные с помощью Streptoverticillium mobaranse, распознают глутаминовую метку, например LLQG, которая может быть встроена в белок, подавляющий активность TNF-альфа. В источнике Jeger et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. 49: 9995-9997 (2010), который включен в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме, иллюстрируется данная методика.

Также можно использовать C-концевое присоединение посредством лигирования экспрессированного белка. Например, можно использовать интеин-опосредованное образование сложного C-концевого тиоэфира для хемоселективного лигирования с белком, подавляющим активность TNF-альфа, содержащим пептид с N-концевым цистеином. В источнике Chiang et al., J. Am. Chem. Soc. 136: 3370-3373 (2014), который включен в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме, иллюстрируется данная методика.

Также в данном документе представлены промежуточные соединения, которые применяются в синтезе, например соединения, характеризующиеся формулами X и XI, которые пригодны для получения иммуноконъюгатов.

В одном варианте осуществления промежуточное соединение, которое применяется в синтезе, раскрытое в данном документе, представляет собой соединение, характеризующееся любой из формул VII, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a или IX-b или любой из формул VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' или IX-b'', или его фармацевтически приемлемая соль, где R^7b выбран из группы, состоящей из -L-H, -L-PG,

и .

В другом варианте осуществления промежуточное соединение, которое применяется в синтезе, раскрытое в данном документе, представляет собой соединение, характеризующееся формулой VIII, или его фармацевтически приемлемую соль, которое представляет собой любое одно или несколько из соединений, представленных в таблице VIII.

Таблица VIII

где R^7b выбран из группы, состоящей из -L-H, -L-PG,

и .

В другом варианте осуществления R^7b выбран из группы, состоящей из:

; и .

В другом варианте осуществления R^7b представляет собой R^7b-4. В другом варианте осуществления R^7b представляет собой R^7b-5. В другом варианте осуществления R^7b представляет собой R^7b-6. В другом варианте осуществления R^7b представляет собой любой любую из структур из таблицы IX.

Таблица IX

В другом варианте осуществления промежуточное соединение, которое применяется в синтезе, раскрытое в данном документе, представляет собой соединение, характеризующееся формулой VIII, или его фармацевтически приемлемую соль, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице X.

Таблица X

В другом варианте осуществления промежуточное соединение, которое применяется в синтезе, раскрытое в данном документе, представляет собой соединение, характеризующееся формулой VIII, или его фармацевтически приемлемую соль, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице X-A.

Таблица X-A

В другом варианте осуществления промежуточное соединение, которое применяется в синтезе, раскрытое в данном документе, представляет собой соединение, характеризующееся формулой IX, или его фармацевтически приемлемую соль, которое представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице XI.

Таблица XI

где R^7b выбран из группы, состоящей из -L-H, -L-PG,

и .

В другом варианте осуществления R^7b выбран из группы, состоящей из:

; и .

В другом варианте осуществления R^7b представляет собой R^7b-4. В другом варианте осуществления R^7b представляет собой R^7b-5. В другом варианте осуществления R^7b представляет собой R^7b-6. В другом варианте осуществления R^7b представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице IX.

В другом варианте осуществления промежуточное соединение, которое применяется в синтезе, раскрытое в данном документе, представляет собой соединение, характеризующееся формулой IX, или его фармацевтически приемлемую соль, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице XII.

Таблица XII

VI. Способы применения и фармацевтические композиции

В данном документе представлены конъюгаты, характеризующиеся формулами I-a и I-b, и агонисты глюкокортикоидных рецепторов, характеризующиеся формулами VII, VII-A, VII-B, VIII, VIII-a, VIII-b, IX, IX-a или IX-b или любой из формул VII', VII-A', VII-B', VIII', VIII-a', VIII-b', IX', IX-a', IX-b', VII'', VII-A'', VII-B'', VIII'', VIII-a'', VIII-b'', IX'', IX-a'' или IX-b'' (где R^7b представляет собой водород), которые можно применять in vitro или in vivo. Соответственно, также в данном документе представлены композиции, например фармацевтические композиции для конкретных вариантов применения in vivo, содержащие конъюгат или агонист глюкокортикоидных рецепторов, описанные в данном документе, характеризующиеся необходимой степенью чистоты, в физиологически приемлемом носителе, вспомогательном веществе или стабилизаторе (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов при используемых дозах и концентрациях.

Композиции (например, фармацевтические композиции), подлежащие применению посредством введения in vivo, могут быть стерильными. Это легко достигается посредством фильтрации через, например, стерильные фильтрующие мембраны. Композиции (например, фармацевтические композиции), подлежащие применению посредством введения in vivo, могут содержать консервант.

Фармацевтическая композиция, содержащая агонист глюкокортикоидных рецепторов, представленный в данном документе, может быть составлена, например, в виде назального спрея, аэрозоля для ингаляций (например, для пероральной ингаляции) или в виде капсулы, таблетки или пилюли (например, для перорального введения).

Агонисты глюкокортикоидных рецепторов, представленные в данном документе (например, ADC, подавляющий активность TNF), представляют собой соединения, где среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет от приблизительно 1 до приблизительно 10. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет от приблизительно 2 до приблизительно 6. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет от приблизительно 3 до приблизительно 4. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет приблизительно 3,1. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет приблизительно 3,2. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет приблизительно 3,3. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет приблизительно 3,4. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет приблизительно 3,5. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет приблизительно 3,6. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет приблизительно 3,7. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет приблизительно 3,8. В некоторых вариантах осуществления среднее число глюкокортикостероидов на антитело (DAR) в композиции составляет приблизительно 3,9.

Агонисты глюкокортикоидных рецепторов и фармацевтические композиции, содержащие агонист глюкокортикоидных рецепторов, описанный в данном документе, могут быть пригодны в ингибировании высвобождения цитокинов (in vitro или in vivo) и/или для лечения аутоиммунных или воспалительных заболеваний. Агонисты глюкокортикоидных рецепторов и фармацевтические композиции, содержащие агонист глюкокортикоидных рецепторов, описанный в данном документе, можно применять для лечения астмы (например, бронхиальной астмы), болезни Крона (например, болезни Крона от легкой до умеренно активной, затрагивающей подвздошную кишку и/или восходящую ободочную кишку, и/или для поддержания клинической ремиссии болезни Крона от легкой до умеренно активной, затрагивающей подвздошную кишку и/или восходящую ободочную кишку, в течение не более 3 месяцев), неспецифического язвенного колита (например, для индуцирования ремиссии у пациентов с активным неспецифическим язвенным колитом от легкого до умеренного), аллергического ринита (например, назальных симптомов, связанных с сезонным аллергическим ринитом и/или хроническим аллергическим ринитом).

Предназначенная для введения пациентам-людям общая суточная доза агонистов глюкокортикоидных рецепторов, представленных в данном документе, как правило, находится в диапазоне от 0,001 мг до 5000 мг или в диапазоне от 0,01 мг до 1000 мг в зависимости от способа введения. Например, для перорального введения или внутривенного, внутримышечного, внутрисуставного или околосуставного введения может требоваться общая суточная доза, составляющая от 0,01 мг до 1000 мг или от 0,1 мг до 100 мг. Общую суточную дозу можно вводить в виде однократной дозы или разделенных доз.

Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат, представленный в данном документе, может быть составлена, например, для внутривенного введения или инфузии.

Конъюгаты и фармацевтические композиции, содержащие конъюгаты, описанные в данном документе, могут быть пригодны в лизировании клетки, экспрессирующей поверхностный TNF-альфа (in vitro или in vivo), для лечения заболеваний или состояний, характеризующихся повышенным уровнем TNF-альфа (например, повышенным уровнем TNF-альфа в синовиальной жидкости), и/или для лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания.

Фармацевтическую композицию, содержащую агонист глюкокортикоидных рецепторов или конъюгат, описанные в данном документе, применяют для лечения ревматоидного артрита (RA), ювенильного идиопатического артрита (JIA), псориатического артрита (PsA), спондилоартропатии, такой как анкилозирующий спондилоартрит (AS) или аксиальный спондилоартрит (axSpA), болезнь Крона у взрослых (CD), болезнь Крона у детей, неспецифический язвенный колит (UC), бляшковидный псориаз (Ps), гнойный гидраденит (HS), увеит, болезнь Бехчета или псориаз, включая бляшковидный псориаз.

Предназначенная для введения пациентам-людям общая суточная доза конъюгата, представленного в данном документе, как правило, находится в диапазоне, составляющем от 0,01 мкг до 100 мг на кг веса тела, и может быть дана один или несколько раз в сутки, неделю, месяц или год.

В настоящем изобретении также предусмотрены варианты осуществления (вар. осущ.) 1-209 в качестве конкретных вариантов осуществления. Формулы и таблицы, упоминаемые в данных конкретных вариантах осуществления, которые не показаны в варианте осуществления, изложены в описании выше.

Вариант осуществления (вар. осущ.) 1. Соединение, характеризующееся формулой I-a,

(SM-L-Q)_n-A¹ I-a,

или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где:

A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа; L представляет собой линкер; Q представляет собой гетеробифункциональную группу или гетеротрифункциональную группу или Q отсутствует; n составляет 1-10; и SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида.

Вар. осущ. 2. Соединение согласно вар. осущ. 1 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида.

Вар. осущ. 3. Соединение согласно вар. осущ. 2 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, выбранный из группы, состоящей из: , где атом серы, кислорода или азота присоединен непосредственно или опосредованно к C- или D-кольцу глюкокортикостероида, и R представляет собой C_1-4алкил.

Вар. осущ. 4. Соединение согласно вар. осущ. 3 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где атом серы, кислорода или азота присоединен непосредственно или опосредованно к D-кольцу глюкокортикостероида.

Вар. осущ. 5. Соединение согласно вар. осущ. 2 или вар. осущ. 3 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-a, где:

R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси; R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, гидрокси, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN, , , и ;

R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси; R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH и C_1-4алкокси; R^3d и R^3e независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

; и

R^9b представляет собой водород или метил;

X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- и -C≡C-; или X отсутствует; t равняется 1 или 2;

Z выбран из группы, состоящей из =CH-, =C(OH)- и =N-; каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил; R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; каждый из R^6a, R^6b, R^6c, R^6d и R^6e независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R¹¹ выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. 6. Соединение согласно вар. осущ. 5 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-b.

Вар. осущ. 7. Соединение согласно любому из вар. осущ. 2-4 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-c, где: R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси; R^9a выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного циклоалкила, необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила; и R^9b выбран из группы, состоящей из водорода и алкила; или R^9a представляет собой:

; и

R^9b представляет собой водород;

W выбран из группы, состоящей из -O- и -S-; X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- и -C≡C-; или X отсутствует; t равняется 1 или 2; Z выбран из группы, состоящей из =CH-, =C(OH)- и =N-; каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил; R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; каждый из R^6a, R^6b, R^6c, R^6d и R^6e независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R¹¹ выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. 8. Соединение согласно вар. осущ. 7 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-d.

Вар. осущ. 9. Соединение согласно любому из вар. осущ. 2-4 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-e, где: R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси; R^9c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила и -C(=O)R^9e; R^9d выбран из группы, состоящей из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного циклоалкила, необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила; R^9e выбран из группы, состоящей из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного циклоалкила, необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила; W выбран из группы, состоящей из -O- и -S-; и представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. 10. Соединение согласно вар. осущ. 9 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-f.

Вар. осущ. 11. Соединение согласно любому из вар. осущ. 7-10 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где W представляет собой -S-.

Вар. осущ. 12. Соединение согласно любому из вар. осущ. 7-10 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где W представляет собой -O-.

Вар. осущ. 13. Соединение, характеризующееся формулой I-b,

(SM-L-Q)_n-A² I-b,

или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где: A² представляет собой белок; L представляет собой линкер; Q представляет собой гетеробифункциональную группу или гетеротрифункциональную группу или Q отсутствует; n составляет 1-10; и SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся любой из формулы II-l, формулы II-m, формулы II-n, формулы II-o, формулы II-p или формулы II-q, где: R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси; R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, гидрокси, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN, , , и ; R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси; R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH и C_1-4алкокси; R^3d и R^3e независимо выбраны из водорода и C_1-4алкила; каждый из R^6a, R^6b, R^6c,R^6d и R^6e независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- и -C≡C-; или X отсутствует; Y² выбран из группы, состоящей из -O-, -S- и -N(R^7a)-; или Y² отсутствует; t равняется 1 или 2; Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-; каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил; R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^11a и R^11b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. 14. Соединение согласно любому из вар. осущ. 2-4 или 13 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-l, где: R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси; R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, гидрокси, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN, , , и ; R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси; R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH и C_1-4алкокси; R^3d и R^3e независимо выбраны из водорода и C_1-4алкила; X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- и -C≡C-; или X отсутствует; t равняется 1 или 2; Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-; каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил; R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; каждый из R^6a, R^6c, R^6d и R^6e независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; Y² выбран из группы, состоящей из -O-, -S- и -N(R^7a)-; или Y² отсутствует; R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^11a и R^11b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. 15. Соединение согласно вар. осущ. 14 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-m.

Вар. осущ. 16. Соединение согласно вар. осущ. 14 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-n.

Вар. осущ. 17. Соединение согласно любому из вар. осущ. 2-4 или 13 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-o, где: R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси; R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, гидрокси, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN, , , и ; R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси; R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH и C_1-4алкокси; R^3d и R^3e независимо выбраны из водорода и C_1-4алкила; X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- и -C≡C-; или X отсутствует; t равняется 1 или 2; Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-; каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил; R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; каждый из R^6a, R^6b, R^6d и R^6e независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; Y² выбран из группы, состоящей из -O-, -S- и -N(R^7a)-; или Y² отсутствует; R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^11a и R^11b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. 18. Соединение согласно вар. осущ. 17 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-p.

Вар. осущ. 19. Соединение согласно вар. осущ. 17 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-q.

Вар. осущ. 20. Соединение согласно любому из вар. осущ. 5-19 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где представляет собой двойную связь.

Вар. осущ. 21. Соединение согласно любому из вар. осущ. 5-20 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и фтора.

Вар. осущ. 22. Соединение согласно любому из вар. осущ. 5-21 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R² выбран из группы, состоящей из водорода и фтора.

Вар. осущ. 23. Соединение согласно любому из вар. осущ. 5, 6 или 13-22 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F и гидрокси.

Вар. осущ. 24. Соединение согласно любому из вар. осущ. 5, 6 или 13-22 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R³ выбран из группы, состоящей из:

, , и ;

R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и метила; R^3b выбран из группы, состоящей из метила, этила, изопропила, изобутила, метокси, этокси, изопропокси и изобутокси; R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, метила, этила, -CH₂OH, метокси, этокси и изопропокси; R^3d и R^3e независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, метила и этила.

Вар. осущ. 25. Соединение согласно любому из вар. осущ. 5-8 или 11-24 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R⁵ и R^8a независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и метила.

Вар. осущ. 26. Соединение согласно любому из вар. осущ. 5-8, 11-25 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где Z представляет собой =CH-.

Вар. осущ. 27. Соединение согласно любому из вар. осущ. 5-8 или 11-25 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где Z представляет собой =N-.

Вар. осущ. 28. Соединение согласно любому из вар. осущ. 5-8 или 11-27 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^6a, R^6d и R^6e представляют собой водород.

Вар. осущ. 29. Соединение согласно любому из вар. осущ. 13-28 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где Y² представляет собой -N(R^7a)-.

Вар. осущ. 30. Соединение согласно вар. осущ. 29 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и метила.

Вар. осущ. 31. Соединение согласно вар. осущ. 30 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7a представляет собой водород.

Вар. осущ. 32. Соединение согласно вар. осущ. 30 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7a представляет собой метил.

Вар. осущ. 33. Соединение согласно любому из вар. осущ. 5-8 или 13-32 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где: X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -CH₂S- и -N(H)CH(R^8a)-; t равняется 1; R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и метила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-членный циклоалкил; и R^8a выбран из группы, состоящей из водорода и метила.

Вар. осущ. 34. Соединение согласно вар. осущ. 33 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X представляет собой -CH₂-.

Вар. осущ. 35. Соединение согласно вар. осущ. 33 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X выбран из группы, состоящей из:

Вар. осущ. 36. Соединение согласно вар. осущ. 33 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X представляет собой -O-.

Вар. осущ. 37. Соединение согласно вар. осущ. 33 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X представляет собой -S-.

Вар. осущ. 38. Соединение согласно вар. осущ. 33 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X представляет собой -CH₂S-.

Вар. осущ. 39. Соединение согласно вар. осущ. 33 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X представляет собой -N(H)CH₂-.

Вар. осущ. 40. Соединение согласно вар. осущ. 33 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X выбран из группы, состоящей из:

Вар. осущ. 41. Соединение согласно любому из вар. осущ. 13-16 или 20-40 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^6c выбран из группы, состоящей из водорода, -Cl, -OCH₃ и гидрокси.

Вар. осущ. 42. Соединение согласно любому из вар. осущ. 13 или 17-40 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^6b выбран из группы, состоящей из водорода, -Cl, -OCH₃ и гидрокси.

Вар. осущ. 43. Соединение согласно любому из вар. осущ. 13-42 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^9f представляет собой водород.

Вар. осущ. 44. Соединение согласно любому из вар. осущ. 13-42 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^9f представляет собой метил.

Вар. осущ. 45. Соединение согласно любому из вар. осущ. 13-44 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^11a выбран из группы, состоящей из водорода и гидрокси.

Вар. осущ. 46. Соединение согласно любому из вар. осущ. 13-44 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^11b представляет собой водород.

Вар. осущ. 47. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-46 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где L представляет собой расщепляемый линкер.

Вар. осущ. 48. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где расщепляемый линкер предусматривает сукцинимид, амид, тиомочевину, простой тиоэфир, оксим или самоотщепляющуюся группу или их комбинацию.

Вар. осущ. 49. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-48 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где расщепляемый линкер предусматривает пептид.

Вар. осущ. 50. Соединение согласно вар. осущ. 49 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где расщепляемый линкер предусматривает трипептид.

Вар. осущ. 51. Соединение согласно вар. осущ. 49 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где расщепляемый линкер предусматривает дипептид.

Вар. осущ. 52. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где расщепляемый линкер предусматривает сложный эфир фосфорной кислоты.

Вар. осущ. 53. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где расщепляемый линкер предусматривает сложный диэфир пирофосфорной кислоты.

Вар. осущ. 54. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-53 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где Q отсутствует.

Вар. осущ. 55. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-53 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где Q представляет собой гетеробифункциональную группу, выбранную из группы, состоящей из Q-1, Q-2, Q-3, Q-4, Q-5 и Q-6, где m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Вар. осущ. 56. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-53 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где Q представляет собой гетеротрифункциональную группу, которая представляет собой Q-7.

Вар. осущ. 57. Соединение согласно вар. осущ. 55 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где Q выбран из группы, состоящей из Q-1, Q-2, Q-3 и Q-4.

Вар. осущ. 58. Соединение согласно вар. осущ. 57 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где Q выбран из группы, состоящей из Q-3 и Q-4.

Вар. осущ. 59. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-1; m равняется 1 или 2; и R^10a и R^10b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

Вар. осущ. 60. Соединение согласно вар. осущ. 59 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-2.

Вар. осущ. 61. Соединение согласно вар. осущ. 59 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-3.

Вар. осущ. 62. Соединение согласно вар. осущ. 59 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-4.

Вар. осущ. 63. Соединение согласно вар. осущ. 59 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-5.

Вар. осущ. 64. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-6; m равняется 1 или 2; и R^10a и R^10b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

Вар. осущ. 65. Соединение согласно вар. осущ. 64 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-7.

Вар. осущ. 66. Соединение согласно вар. осущ. 64 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-8.

Вар. осущ. 67. Соединение согласно вар. осущ. 64 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-9.

Вар. осущ. 68. Соединение согласно вар. осущ. 64 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-10.

Вар. осущ. 69. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где L представляет собой нерасщепляемый линкер.

Вар. осущ. 70. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где линкер содержит одно или несколько полиэтиленгликолевых звеньев.

Вар. осущ. 71. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-11; m равняется 1 или 2; и x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.

Вар. осущ. 72. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-12; m равняется 1 или 2; и x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.

Вар. осущ. 73. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-14; m равняется 1 или 2; x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15; и R^10a и R^10b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

Вар. осущ. 74. Соединение согласно вар. осущ. 73 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-15.

Вар. осущ. 75. Соединение согласно вар. осущ. 73 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-16.

Вар. осущ. 76. Соединение согласно вар. осущ. 73 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-17.

Вар. осущ. 77. Соединение согласно вар. осущ. 73 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-18.

Вар. осущ. 78. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-19; m равняется 1 или 2; x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15; и R^10a и R^10b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

Вар. осущ. 79. Соединение согласно вар. осущ. 78 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-20.

Вар. осущ. 80. Соединение согласно вар. осущ. 78 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-21.

Вар. осущ. 81. Соединение согласно вар. осущ. 78 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-22.

Вар. осущ. 82. Соединение согласно вар. осущ. 78 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-23.

Вар. осущ. 83. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-13; и x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.

Вар. осущ. 84. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-29; и x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.

Вар. осущ. 85. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-24; x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15; и R^10a и R^10b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

Вар. осущ. 86. Соединение согласно вар. осущ. 85 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-25.

Вар. осущ. 86A. Соединение согласно вар. осущ. 85 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-26.

Вар. осущ. 87. Соединение согласно вар. осущ. 85 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-27.

Вар. осущ. 88. Соединение согласно вар. осущ. 85 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-28.

Вар. осущ. 89. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-30; x равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15; и R^10a и R^10b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

Вар. осущ. 90. Соединение согласно вар. осущ. 89 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-31.

Вар. осущ. 91. Соединение согласно вар. осущ. 89 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-32.

Вар. осущ. 92. Соединение согласно вар. осущ. 89 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-33.

Вар. осущ. 93. Соединение согласно вар. осущ. 89 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой LQ-34.

Вар. осущ. 94. Соединение согласно любому из вар. осущ. 55, 59-68 или 71-82 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где m равняется 2.

Вар. осущ. 95. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-47 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где -L-Q- представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице I.

Вар. осущ. 96. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-95 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где n составляет 2-8.

Вар. осущ. 97. Соединение согласно вар. осущ. 96 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где n составляет 2-5.

Вар. осущ. 98. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-95 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где n равняется 2.

Вар. осущ. 99. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-95 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где n равняется 4.

Вар. осущ. 100. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1 или 47-99 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, который представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице II.

Вар. осущ. 101. Соединение согласно вар. осущ. 100 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, выбранный из группы, состоящей из:

, и .

Вар. осущ. 102. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или где A² представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Вар. осущ. 103. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, который связывается с человеческим TNF-альфа и/или мышиным TNF-альфа, или где A² представляет собой белок, который связывается с человеческим TNF-альфа и/или мышиным TNF-альфа.

Вар. осущ. 104. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, который связывается с растворимым TNF-альфа, или где A² представляет собой белок, который связывается с растворимым TNF-альфа.

Вар. осущ. 105. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, который связывается с мембраносвязанным TNF-альфа, или где A² представляет собой белок, который связывается с мембраносвязанным TNF-альфа.

Вар. осущ. 106. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, предусматривающий антитело к TNF, или где A² представляет собой белок, предусматривающий антитело к TNF.

Вар. осущ. 107. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, предусматривающий антигенсвязывающий фрагмент антитела к TNF, или где A² представляет собой белок, предусматривающий антигенсвязывающий фрагмент антитела к TNF.

Вар. осущ. 108. Соединение согласно любому из вар. осущ. 102-105 или 107 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечного Fv или scFv, связанного дисульфидной связью Fv, домена V-NAR, IgNar, интраантитела, IgGΔCH2, миниантитела, F(ab')3, тетрамерного антитела, тримерного антитела, димерного антитела, однодоменного антитела, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 или scFv-Fc.

Вар. осущ. 109. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-108 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются мышиными, химерными, гуманизированными или человеческими.

Вар. осущ. 110. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, предусматривающий растворимый рецептор TNF, или где A² представляет собой белок, предусматривающий растворимый рецептор TNF.

Вар. осущ. 111. Соединение согласно вар. осущ. 110 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где растворимый рецептор TNF представляет собой растворимый рецептор p75 TNF.

Вар. осущ. 112. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ предусматривает константный домен тяжелой цепи или его фрагмент, или где A² предусматривает константный домен тяжелой цепи или его фрагмент.

Вар. осущ. 113. Соединение согласно вар. осущ. 112 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где константный домен тяжелой цепи или его фрагмент предусматривает константный домен, выбранный из группы, состоящей из (a) константного домена IgA; (b) константного домена IgD; (c) константного домена IgE; (d) константного домена IgG1; (e) константного домена IgG2; (f) константного домена IgG3; (g) константного домена IgG4 и (h) константного домена IgM, или представляет собой фрагмент каждого из вышеперечисленных.

Вар. осущ. 114. Соединение согласно вар. осущ. 113 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где константный домен тяжелой цепи предусматривает константный домен тяжелой цепи человеческого IgG1 или его фрагмент.

Вар. осущ. 115. Соединение согласно вар. осущ. 114 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где константный домен тяжелой цепи предусматривает Fc-домен человеческого IgG1.

Вар. осущ. 116. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ предусматривает константный домен легкой цепи или его фрагмент, или где A² предусматривает константный домен легкой цепи или его фрагмент.

Вар. осущ. 117. Соединение согласно вар. осущ. 116 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где константный домен легкой цепи или его фрагмент предусматривает константный домен, выбранный из группы, состоящей из (a) константного домена Ig-каппа и (b) константного домена Ig-лямбда, или представляет собой фрагмент каждого из вышеперечисленных.

Вар. осущ. 118. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ конкурентно ингибирует связывание антитела, выбранного из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола и голимумаба с TNF-альфа, или где A² конкурентно ингибирует связывание антитела, выбранного из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола и голимумаба с TNF-альфа.

Вар. осущ. 119. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ связывается с тем же эпитопом TNF-альфа, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба и голимумаба, или где A² связывается с тем же эпитопом TNF-альфа, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба и голимумаба.

Вар. осущ. 120. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где белок, подавляющий активность TNF-альфа, или белок выбран из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба и голимумаба.

Вар. осущ. 121. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи соответственно под SEQ ID NO:3 или 6, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи соответственно под SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 и SEQ ID NO:34, или где A² содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи соответственно под SEQ ID NO:3 или 6, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи соответственно под SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 и SEQ ID NO:34.

Вар. осущ. 122. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи под SEQ ID NO:50 и последовательность вариабельной области легкой цепи под SEQ ID NO:59, или где A² содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи под SEQ ID NO:50 и последовательность вариабельной области легкой цепи под SEQ ID NO:59.

Вар. осущ. 123. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ не связывается с TNF-бета, или где A² не связывается с TNF-бета.

Вар. осущ. 124. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ связывается с TNF-бета, или где A² связывается с TNF-бета.

Вар. осущ. 125. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ нейтрализует индуцированную человеческим TNF-альфа цитотоксичность в стандартном in vitro анализе с использованием клеток L929 при значении IC50, составляющем 1X10^-7 M или меньше, или где A² нейтрализует индуцированную человеческим TNF-альфа цитотоксичность в стандартном in vitro анализе с использованием клеток L929 при значении IC50, составляющем 1X10^-7 M или меньше.

Вар. осущ. 126. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ блокирует взаимодействие TNF-альфа с рецепторами клеточной поверхности p55 и p75, или где A² блокирует взаимодействие TNF-альфа с рецепторами клеточной поверхности p55 и p75.

Вар. осущ. 127. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где A¹ лизирует in vitro экспрессирующие поверхностный TNF клетки в присутствии комплемента, или где A² лизирует in vitro экспрессирующие поверхностный TNF клетки в присутствии комплемента.

Вар. осущ. 128. Соединение согласно вар. осущ. 111 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где растворимый рецептор p75 TNF представляет собой этанерцепт.

Вар. осущ. 129. Соединение согласно вар. осущ. 102 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где антитело представляет собой адалимумаб.

Вар. осущ. 130. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101, где A¹ связывается с Fc-гамма-рецептором, или где A² связывается с Fc-гамма-рецептором.

Вар. осущ. 131. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1-101, где A¹ является активным в анализе в отношении трансмембранного TNF-альфа с использованием репортера GRE и/или анализе с использованием клеток L929, или где A² является активным в анализе по гену-репортеру GRE трансмембранного TNF-альфа и/или анализе с использованием клеток L929.

Вар. осущ. 132. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1 или 102-131, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице III, где n составляет 1-5, и A представляет собой A¹ или A².

Вар. осущ. 133. Соединение согласно вар. осущ. 132, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице IV, где A представляет собой A¹ или A².

Вар. осущ. 134. Соединение согласно любому из вар. осущ. 1 или 102-131, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице V, где n составляет 1-5, и A представляет собой A¹ или A².

Вар. осущ. 135. Соединение согласно вар. осущ. 134 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где n равняется 2 или 4.

Вар. осущ. 136. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно любому из вар. осущ. 1-135 или его фармацевтически приемлемую соль или сольват и фармацевтически приемлемый носитель.

Вар. осущ. 137. Фармацевтическая композиция, содержащая множество соединений согласно любому из вар. осущ. 1-135 или фармацевтическую соль или сольват каждого из них, где соединения в фармацевтической композиции содержат в среднем от 1 до 10 SM-L-Q на A¹ или A², т. е. n составляет 1-10, от 2 до 6 SM-L-Q на A¹ или A², от 3 до 4 SM-L-Q на A¹ или A², приблизительно 2 SM-L-Q на A¹ или A², приблизительно 3 SM-L-Q на A¹ или A² или приблизительно 4 SM-L-Q на A¹ или A².

Вар. осущ. 138. Способ лизирования клетки, экспрессирующей поверхностный TNF-альфа, включающий приведение клетки в контакт с соединением согласно любому из вар. осущ. 1-135 или фармацевтической композицией согласно вар. осущ. 136 или 137.

Вар. осущ. 139. Способ лечения аутоиммунного заболевания у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту соединения согласно любому из вар. осущ. 1-135 или фармацевтической композиции согласно вар. осущ. 136 или 137.

Вар. осущ. 140. Способ согласно вар. осущ. 139, где указанное аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Крона у взрослых, болезнь Крона у детей, неспецифический язвенный колит, бляшковидный псориаз, гнойный гидраденит, увеит, болезнь Бехчета, спондилоартропатию или псориаз.

Вар. осущ. 141. Способ лечения заболевания или нарушения, характеризующегося повышенным уровнем TNF-альфа в синовиальной жидкости, у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту соединения согласно любому из вар. осущ. 1-135 или фармацевтической композиции согласно вар. осущ. 136 или 137.

Вар. осущ. 142. Соединение, характеризующееся формулой VII, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где: R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси; R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, гидрокси, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN, , , и ; R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси; R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH и C_1-4алкокси; R^3d и R^3e независимо выбраны из водорода и C_1-4алкила; X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- и -C≡C-; или X отсутствует; t равняется 1 или 2; Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-; каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил; R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; каждый из R^6a, R^6b, R^6c и R^6d независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, v галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^7b выбран из группы, состоящей из водорода, -L-H, -L-PG, и ; m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6; L представляет собой линкер; PG представляет собой защитную группу; R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^11a и R^11b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C₁-₄галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. 143. Соединение согласно вар. осущ. 142 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b выбран из группы, состоящей из R^7b-1, R^7b-2 и R^7b-3; m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и каждый из R^10a и R^10b независимо выбран из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

Вар. осущ. 144. Соединение согласно вар. осущ. 142 или 143, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, характеризующееся формулой VIII.

Вар. осущ. 145. Соединение согласно вар. осущ. 144, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, характеризующееся формулой VIII-a.

Вар. осущ. 146. Соединение согласно вар. осущ. 144, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, характеризующееся формулой VIII-b.

Вар. осущ. 147. Соединение согласно вар. осущ. 142 или 143, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, характеризующееся формулой IX.

Вар. осущ. 148. Соединение согласно вар. осущ. 147, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, характеризующееся формулой IX-a.

Вар. осущ. 149. Соединение согласно вар. осущ. 147, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, характеризующееся формулой IX-b.

Вар. осущ. 150. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-149 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где представляет собой двойную связь.

Вар. осущ. 151. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-150 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и фтора.

Вар. осущ. 152. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-151 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R² выбран из группы, состоящей из водорода и фтора.

Вар. осущ. 153. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-152 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F и гидрокси.

Вар. осущ. 154. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-152 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R³ выбран из группы, состоящей из:

, , и ;

Вар. осущ. 155. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-154 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R⁵ и R^8a независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и метила.

Вар. осущ. 156. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-155 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где Z представляет собой =CH-.

Вар. осущ. 157. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-155 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где Z представляет собой =N-.

Вар. осущ. 158. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-155 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и метила.

Вар. осущ. 159. Соединение согласно вар. осущ. 158 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7a представляет собой водород.

Вар. осущ. 160. Соединение согласно вар. осущ. 158 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7a представляет собой метил.

Вар. осущ. 161. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-160 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где:

X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -CH₂S- и -N(H)CH(R^8a)-; t равняется 1; и R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и метила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-членный циклоалкил.

Вар. осущ. 162. Соединение согласно вар. осущ. 161 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X представляет собой -CH₂-.

Вар. осущ. 163. Соединение согласно вар. осущ. 161 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X выбран из группы, состоящей из:

Вар. осущ. 164. Соединение согласно вар. осущ. 161 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X представляет собой -O-.

Вар. осущ. 165. Соединение согласно вар. осущ. 161 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X представляет собой -S-.

Вар. осущ. 166. Соединение согласно вар. осущ. 161 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X представляет собой -CH₂S-.

Вар. осущ. 167. Соединение согласно вар. осущ. 161 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X представляет собой -N(H)CH₂-.

Вар. осущ. 168. Соединение согласно вар. осущ. 161 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где X выбран из группы, состоящей из:

Вар. осущ. 169. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-168 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^11b представляет собой водород.

Вар. осущ. 170. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-169 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой водород.

Вар. осущ. 171. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-170 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^6b выбран из группы, состоящей из водорода, -Cl, -OCH₃ и гидрокси.

Вар. осущ. 172. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-171 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^9f представляет собой водород.

Вар. осущ. 173. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-171 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^9f представляет собой метил.

Вар. осущ. 174. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-173 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^11a выбран из группы, состоящей из водорода и гидрокси.

Вар. осущ. 175. Соединение согласно любому из вар. осущ. 142-174 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^11b представляет собой водород.

Вар. осущ. 176. Соединение согласно любому из вар. осущ. 143-175 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-1.

Вар. осущ. 177. Соединение согласно вар. осущ. 176 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^10a и R^10b независимо представляют собой необязательно замещенный C_1-6алкил.

Вар. осущ. 178. Соединение согласно любому из вар. осущ. 143-175 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-2, и PG представляет собой BOC.

Вар. осущ. 179. Соединение согласно вар. осущ. 178 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^10a и R^10b независимо представляют собой необязательно замещенный C_1-6алкил.

Вар. осущ. 180. Соединение согласно любому из вар. осущ. 143-175 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-3.

Вар. осущ. 181. Соединение согласно вар. осущ. 180 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где m равняется 1 или 2, и каждый из R^10a и R^10b представляет собой необязательно замещенный C_1-6алкил.

Вар. осущ. 182. Соединение согласно вар. осущ. 142, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любое одно или несколько из соединений, представленных в таблице VI.

Вар. осущ. 183. Соединение согласно вар. осущ. 182, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, выбранное из группы, состоящей из:

, и .

Вар. осущ. 184. Соединение согласно вар. осущ. 142, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любую одну или несколько химических структур, представленных в таблице VIII, где R^7b выбран из группы, состоящей из R^7b-4, R^7b-5 и R^7b-6.

Вар. осущ. 185. Соединение согласно вар. осущ. 184 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-4.

Вар. осущ. 186. Соединение согласно вар. осущ. 184 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-5.

Вар. осущ. 187. Соединение согласно вар. осущ. 184 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-6.

Вар. осущ. 188. Соединение согласно вар. осущ. 142, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любую одну или несколько химических структур, представленных в таблице VIII,

где R^7b представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице IX.

Вар. осущ. 189. Соединение согласно вар. осущ. 142, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице X.

Вар. осущ. 190. Соединение согласно вар. осущ. 142, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице VII.

Вар. осущ. 191. Соединение согласно вар. осущ. 190, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, выбранное из группы, состоящей из:

, и .

Вар. осущ. 192. Соединение согласно вар. осущ. 142, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице XI,

где R^7b выбран из группы, состоящей из R^7b-4, R^7b-5 и R^7b-6.

Вар. осущ. 193. Соединение согласно вар. осущ. 192 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-4.

Вар. осущ. 194. Соединение согласно вар. осущ. 192 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-5.

Вар. осущ. 195. Соединение согласно вар. осущ. 192 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-6.

Вар. осущ. 196. Соединение согласно вар. осущ. 142, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице XI,

где R^7b представляет собой любую из структур, представленных в таблице IX.

Вар. осущ. 197. Соединение согласно вар. осущ. 142, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице XII.

Вар. осущ. 198. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно любому из вар. осущ. 142-197 или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой водород, и фармацевтически приемлемый носитель.

Вар. осущ. 199. Способ лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания у пациента, нуждающегося в этом, причем способ включает введение указанному пациенту соединения согласно любому из вар. осущ. 142-197 или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата, где R^7b представляет собой водород, или фармацевтической композиции согласно вар. осущ. 198.

Вар. осущ. 200. Способ согласно вар. осущ. 199, где указанное аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Крона у взрослых, болезнь Крона у детей, неспецифический язвенный колит, бляшковидный псориаз, или гнойный гидраденит.

Вар. осущ. 201. Способ получения соединения, характеризующегося формулой I-c, или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата, где: A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа; L представляет собой линкер; n составляет 1-10; и SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида, причем способ включает: a) конъюгирование соединения, характеризующегося формулой X, с белком, подавляющим активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа; и b) выделение соединения, характеризующегося формулой I-c или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата.

Вар. осущ. 202. Способ согласно вар. осущ. 201, дополнительно включающий осуществление гидролиза соединения, характеризующегося формулой Ic, с получением соединения, характеризующегося формулой I-d.

Вар. осущ. 203. Способ получения соединения, характеризующегося формулой I-e, или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата, где: A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа; L представляет собой линкер; R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; n составляет 1-10; m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида, причем способ включает: a) конъюгирование соединения, характеризующегося формулой XI, с белком, подавляющим активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа; и b) выделение соединения, характеризующегося формулой I-e или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата.

Вар. осущ. 204. Способ согласно вар. осущ. 203, дополнительно включающий осуществление гидролиза соединения, характеризующегося формулой I-e, с получением соединения, характеризующегося формулой I-f.

Вар. осущ. 205. Соединение согласно вар. осущ. 182, которое представляет собой:

или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.

Вар. осущ. 206. Соединение согласно вар. осущ. 182, которое представляет собой:

или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.

Вар. осущ. 207. Соединение согласно вар. осущ. 182, которое представляет собой:

или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.

Вар. осущ. 208. Соединение согласно вар. осущ. 189, которое представляет собой:

или его фармацевтически приемлемые соль или сольват.

Вар. осущ. 209. Соединение согласно вар. осущ. 132, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любую из химических структур, представленных в таблице IV, где A представляет собой A¹ или A².

В настоящем изобретении также предусмотрены вар. осущ. I-XXXIII в качестве конкретных вариантов осуществления. Формулы и таблицы, упоминаемые в данных конкретных вариантах осуществления, которые не показаны в вар. осущ. I-XXXII, изложены в описании выше.

Вар. осущ. I. Соединение, характеризующееся формулой I-a,

(SM-L-Q)_n-A¹ I-a,

где: A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа; L представляет собой линкер; Q представляет собой гетеробифункциональную группу или гетеротрифункциональную группу или Q отсутствует; n составляет 1-10; и SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида.

Вар. осущ. II. Соединение, характеризующееся формулой I-b,

(SM-L-Q)_n-A² I-b,

где A² представляет собой белок; L представляет собой линкер; Q представляет собой гетеробифункциональную группу или гетеротрифункциональную группу или Q отсутствует; n составляет 1-10; и SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-m или формулой II-p; R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси; R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, гидрокси, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN, , , и ; R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси; R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH и C_1-4алкокси; R^3d и R^3e независимо выбраны из водорода и C_1-4алкила; каждый из R^6a, R^6b, R^6c,R^6d и R^6e независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- и -C≡C-; или X отсутствует; Y² выбран из группы, состоящей из -O-, -S- и -N(R^7a)-; или Y² отсутствует; t равняется 1 или 2; Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-; каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил; R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^11a и R^11b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. III. Соединение согласно вар. осущ. I или II, где SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида, характеризующийся формулой II-m; R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси; R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, гидрокси, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN, , , и ; R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси; R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH и C_1-4алкокси; R^3d и R^3e независимо выбраны из водорода и C_1-4алкила; каждый из R^6a, R^6c,R^6d и R^6e независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d- и -C≡C-; или X отсутствует; Y² выбран из группы, состоящей из -O-, -S- и -N(R^7a)-; или Y² отсутствует; t равняется 1 или 2; Z представляет собой =CH-; каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил; R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^11b выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C_1-4галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. IV. Соединение согласно вар. осущ. II или III, где представляет собой двойную связь; R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и фтора; R² выбран из группы, состоящей из водорода и фтора; R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F и

; R^3d и R^3e независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, метила и этила; R^6a, R^6c, R^6d и R^6e представляют собой водород; X выбран из группы, состоящей из -CH₂-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -CH₂S- и -N(H)CH₂-; Y² представляет собой -N(H)-; Z представляет собой =CH-; R^9f представляет собой водород; и R^11b представляет собой водород.

Вар. осущ. V. Соединение согласно любому из вар. осущ. I-IV, где L представляет собой линкер, предусматривающий дипептид.

Вар. осущ. VI. Соединение согласно любому из вар. осущ. I-V, где Q представляет собой гетеробифункциональную группу, выбранную из группы, состоящей из Q-3 и Q-4, и m равняется 1, 2, 3 или 4.

Вар. осущ. VII. Соединение согласно любому из вар. осущ. I-VII, где -L-Q- представляет собой LQ-7; m равняется 2 или 3; и R^10a и R^10b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила.

Вар. осущ. VIII. Соединение согласно любому из вар. осущ. I-VII, где n составляет 2-5.

Вар. осущ. IX. Соединение согласно вар. осущ. I или II, где SM представляет собой одновалентный радикал на основе глюкокортикостероида, который представляет собой любое из соединений, представленных в таблице II.

Вар. осущ. X. Соединение согласно любому из вар. осущ. I или III-IX, где A¹ представляет собой (i) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с человеческим TNF-альфа, или (ii) растворимый рецептор TNF.

Вар. осущ. XI. Соединение согласно любому из вар. осущ. I или III-X, где A¹ выбран из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба и голимумаба.

Вар. осущ. XII. Соединение согласно вар. осущ. I, которое представляет собой любое одно или несколько из соединений, представленных в таблице III, где n составляет 1-5; A представляет собой A¹; и A¹ выбран из группы, состоящей из адалимумаба, инфликсимаба, цертолизумаба пегола, афелимомаба, нерелимомаба, озорализумаба, плакулумаба и голимумаба.

Вар. осущ. XIII. Соединение согласно вар. осущ. II, которое представляет собой любое одно или несколько из соединений, представленных в таблице III, где n составляет 1-5; A представляет собой A²; и A² выбран из группы, состоящей из антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или белка, представляющего собой растворимый рецептор.

Вар. осущ. XIV. Соединение, выбранное из группы, состоящей из:

где n составляет 1-5, и A представляет собой антитело, содержащее последовательности тяжелой и легкой цепей соответственно под SEQ ID NO:66 и SEQ ID NO:73.

Вар. осущ. XV. Соединение согласно вар. осущ. XIV, выбранное из группы, состоящей из:

Структура	n
	4
	2
	4
	2
	4
	2

Вар. осущ. XVI. Соединение согласно вар. осущ. XIV, где соединение представляет собой:

Структура	n
	4

Вар. осущ. XVII. Соединение согласно вар. осущ. XIV, где соединение представляет собой:

Структура	n
	2

Вар. осущ. XVIII. Соединение согласно вар. осущ. XIV, где соединение представляет собой:

Структура	n
	4

Вар. осущ. XIX. Соединение согласно вар. осущ. XIV, где соединение представляет собой:

Структура	n
	2

Вар. осущ. XX. Соединение согласно вар. осущ. XIV, где соединение представляет собой:

Структура	n
	4

Вар. осущ. XXI. Соединение согласно вар. осущ. XIV, где соединение представляет собой:

Структура	n
	2

Вар. осущ. XXII. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно любому из вар. осущ. I-XXI и фармацевтически приемлемый носитель.

Вар. осущ. XXIII. Способ лечения аутоиммунного заболевания у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту соединения согласно любому из вар. осущ. I-XXI или фармацевтической композиции согласно вар. осущ. XXII, где необязательно указанное аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Крона у взрослых, болезнь Крона у детей, неспецифический язвенный колит, бляшковидный псориаз, гнойный гидраденит, увеит, болезнь Бехчета, спондилоартропатию или псориаз.

Вар. осущ. XXIV. Соединение, характеризующееся формулой VII, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена; R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси; R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, -CH₂OS(=O)₂OH, гидрокси, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN, , , и ; R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси; R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH, C_1-4алкокси, -CH₂(амино) и -CH₂CH₂C(=O)OR^3f; R^3d и R^3e независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^3f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; X выбран из группы, состоящей из -(CR^4aR^4b)_t-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR⁵-, -CH₂S-, -CH₂O-, -N(H)C(R^8a)(R^8b)-, -CR^4c=CR^4d-, -C≡C-, -N(R⁵)C(=O)- и -OC(=O)-; или X отсутствует; t равняется 1 или 2; Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-; каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил; R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; каждый из R^6a, R^6b, R^6c и R^6d независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^7b выбран из группы, состоящей из водорода, -L-H, -L-PG, и ; или R^7a и R^7b, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют: ; или R^7a и R^7b, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют нитрогруппу (-NO₂); m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6; L представляет собой линкер; PG представляет собой защитную группу; R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; R^11a и R^11b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, C_1-4алкила, C₁-₄галогеналкила, циано, гидрокси, тиола, амино, алкилтио и алкокси; и представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. XXV. Соединение, характеризующееся формулой VII-A или формулой VII-B,

VII-A или VII-B,

или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где:

R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и галогена;

R² выбран из группы, состоящей из водорода, галогена и гидрокси;

R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂SH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F, -SCH₂CF₃, -CH₂OS(=O)₂OH, гидрокси, -OCH₂CN, -OCH₂Cl, -OCH₂F, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -SCH₂CN, , , и ;

R^3a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^3b выбран из группы, состоящей из C_1-4алкила и C_1-4алкокси;

R^3c выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4алкила, -CH₂OH, C_1-4алкокси, -CH₂(амино) и -CH₂CH₂C(=O)OR^3f;

R^3d и R^3e независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

X отсутствует;

t равняется 1 или 2;

Z выбран из группы, состоящей из =CR^11a- и =N-;

каждые R^4a и R^4b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; или

R^4a и R^4b, взятые вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют 3-6-членный циклоалкил;

R^4c и R^4d независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R⁵ выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^7b выбран из группы, состоящей из водорода, -L-H, -L-PG, и ; или

R^7a и R^7b, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют:

;

m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

L представляет собой линкер;

PG представляет собой защитную группу;

R^9f выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

R^8a и R^8b независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила;

представляет собой одинарную или двойную связь.

Вар. осущ. XXVI. Соединение согласно вар. осущ. XXIV или XXV или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b выбран из группы, состоящей из R^7b-1, R^7b-2 и R^7b-3; m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и каждый из R^10a и R^10b независимо выбран из группы, состоящей из водорода и необязательно замещенного C_1-6алкила.

Вар. осущ. XXVII. Соединение согласно вар. осущ. XXIV или XXVI, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, характеризующееся формулой VIII-a.

Вар. осущ. XXVIII. Соединение согласно любому из вар. осущ. XXIV-XXVII или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где представляет собой двойную связь; R¹ выбран из группы, состоящей из водорода и фтора; R² выбран из группы, состоящей из водорода и фтора; R³ выбран из группы, состоящей из -CH₂OH, -CH₂Cl, -SCH₂Cl, -SCH₂F и ; R^3d и R^3e независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, метила и этила; Z представляет собой =CH-; R^6a, R^6b, R^6c и R^6d представляют собой водород; R^7a представляет собой водород; X выбран из группы, состоящей из -CH₂-, -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -CH₂S- и -N(H)CH₂-; R^9f представляет собой водород; и R^11b представляет собой водород.

Вар. осущ. XXIX. Соединение согласно любому из вар. осущ. XXIV-XXVIII или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой водород.

Вар. осущ. XXX. Соединение согласно любому из вар. осущ. XXIV-XXVIII или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-1.

Вар. осущ. XXXI. Соединение согласно любому из вар. осущ. XXIV-XXVIII или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-2, и PG представляет собой BOC.

Вар. осущ. XXXII. Соединение согласно любому из вар. осущ. XXIV-XXVIII или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, где R^7b представляет собой R^7b-3.

Вар. осущ. XXXIII. Соединение согласно вар. осущ. XXIX, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любое одно или несколько из соединений, представленных в таблице VI.

Вар. осущ. XXXIV. Соединение согласно вар. осущ. XXIX, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любое из соединений, представленных в таблице VII.

Вар. осущ. XXXV. Соединение согласно вар. осущ. XXXIII, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой:

Вар. осущ. XXXVI. Соединение согласно вар. осущ. XXIV, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любое одно или несколько из соединений, представленных в таблице VIII, где R^7b выбран из группы, состоящей из R^7b-4, R^7b-5 и R^7b-6.

Вар. осущ. XXXVII. Соединение согласно вар. осущ. XXIV, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой любое одно или несколько из соединений, представленных в таблице X.

Вар. осущ. XXXVIII. Соединение согласно вар. осущ. XXXVII, или его фармацевтически приемлемые соль или сольват, которое представляет собой:

Вар. осущ. XXXIX. Способ получения соединения, характеризующегося формулой I-e,

I-e,

или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата, где A представляет собой A¹ или A²; A¹ представляет собой белок, подавляющий активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа; A² представляет собой белок; L представляет собой линкер; R^7a выбран из группы, состоящей из водорода и C_1-4алкила; n составляет 1-10; m равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида,

причем способ включает:

a) конъюгирование соединения, характеризующегося формулой XI,

XI,

с белком, подавляющим активность фактора некроза опухолей (TNF) альфа, или белком и

b) выделение соединения, характеризующегося формулой I-e, или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата.

Вар. осущ. XL. Способ согласно вар. осущ. XXXIV, дополнительно включающий осуществление гидролиза соединения, характеризующегося формулой I-e, с получением соединения, характеризующегося формулой I-f,

I-f,

или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата.

Вар. осущ. XLI. Соединение, которое представляет собой:

где A представляет собой адалимумаб.

Вар. осущ. XLII. Композиция, содержащая соединение согласно вар. осущ. XLI.

Варианты осуществления настоящего изобретения могут быть дополнительно определены посредством ссылки на следующие неограничивающие примеры, которые подробно описывают получение определенных антител по настоящему изобретению и способы применения антител по настоящему изобретению. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что без отступления от объема настоящего изобретения на практике может быть реализовано множество модификаций, как материалов, так и способов.

Примеры

Понятно, что описанные в данном документе примеры и варианты осуществления предназначены только для иллюстративных целей, и с учетом этого специалисты в данной области смогут предположить различные модификации или изменения, которые будут находиться в пределах сущности и сферы действия данного изобретения.

Аналитические способы синтеза соединений и определение характеристик

Аналитические данные включены в процедуры, приведенные ниже, в иллюстрации общих процедур или в таблицы из примеров. Если не указано иное, то все данные ¹H и ¹³C ЯМР получали на приборе Varian Mercury Plus, 400 MГц или Bruker AVIII, 300 MГц; химические сдвиги указаны в частях на миллион (ppm). Аналитические данные HPLC либо подробно описаны в экспериментальной части, либо упомянуты в таблице условий LC/MS и HPLC, с применением способа, предусмотренного в Таблица 7.

Таблица 7: Перечень способов LC/MS и GC/MS

Способ	Условия
a	Градиент составлял 10-100% B за 3,4 мин. с удерживанием при 100% B в течение 0,45 мин., 100-10% B за 0,01 мин., и затем удерживали при 10% B в течение 0,65 мин. (расход 0,8 мл/мин.). Подвижная фаза A представляла собой 0,0375% трифторуксусной кислоты в воде, подвижная фаза B представляла собой 0,018% TFA в MeCN. Колонка, применяемая для хроматографии, представляла собой колонку Luna-C18, 2,0×50 мм, Рhenomenex (частицы по 5 мкм). Способы детектирования представляют собой детектирование с помощью диодной матрицы (DAD) и испарительного детектора светорассеяния (ELSD), а также положительную электрораспылительную ионизацию (MS).
b	Градиент составлял 1-90% B за 3,4 мин., 90-100% B за 0,45 мин., 100-1% B за 0,01 мин., и затем удерживали при 1% B в течение 0,65 мин. (расход 0,8 мл/мин.). Подвижная фаза A представляла собой 0,0375% CF₃CO₂H в воде, подвижная фаза B представляла собой 0,018% CF₃CO₂H в CH₃CN. Колонка, применяемая для хроматографии, представляла собой колонку Luna-C18, 2,0×50 мм, Рhenomenex (частицы по 5 мкм). Способы детектирования представляют собой детектирование с помощью диодной матрицы (DAD) и испарительного детектора светорассеяния (ELSD), а также положительную электрораспылительную ионизацию (MS).
c	Градиент составлял 10-100% B за 3,4 мин. с удерживанием при 100% B в течение 0,45 мин., 100-10% B за 0,01 мин., и затем удерживали при 10% B в течение 0,65 мин. (расход 0,8 мл/мин.). Подвижная фаза A представляла собой 0,0375% CF₃CO₂H в воде, подвижная фаза B представляла собой 0,018% CF₃CO₂H в CH₃CN. Колонка, применяемая для хроматографии, представляла собой колонку Luna-C18, 2,0×50 мм, Рhenomenex (частицы по 5 мкм). Способы детектирования представляют собой детектирование с помощью диодной матрицы (DAD) и испарительного детектора светорассеяния (ELSD), а также положительную электрораспылительную ионизацию (MS).
d	Градиент составлял 5% B за 0,2 мин., и достигал 95% B в течение 1,7 мин., затем с удерживанием при 95% B в течение 1,3 мин., обратно до 5% B в течение 0,01 мин. (расход 2,3 мл/мин.). Подвижная фаза A представляла собой 0,01% TFA в воде, и подвижная фаза B представляла собой 0,01% TFA в MeCN степени чистоты для HPLC. Колонка, применяемая для хроматографии, представляла собой колонку XBridge C18 (4,6×50 мм, частицы по 3,5 мкм). Способы детектирования представляют собой детектирование с помощью диодной матрицы (DAD) и испарительного детектора светорассеяния (ELSD), а также положительную/отрицательную электрораспылительную ионизацию.
e	Градиент составлял от 5% B до 95% В за 1,5 мин., затем с удерживанием при 95% B в течение 1,5 мин., обратно до 5% B за 0,01 мин. (расход 2,3 мл/мин.). Подвижная фаза A представляла собой 10 мM NH₄HCO₃ в воде, и подвижная фаза B представляла собой MeCN степени чистоты для HPLC. Колонка, применяемая для хроматографии, представляла собой колонку XBridge C18 (4,6×50 мм, частицы по 3,5 мкм). Способы детектирования представляют собой детектирование с помощью диодной матрицы (DAD) и испарительного детектора светорассеяния (ELSD), а также положительную/отрицательную электрораспылительную ионизацию.
f	Подвижная фаза: A: вода (0,01% TFA); B: MeCN (0,01% TFA). Градиент: повышение B от 5% до 95% B за 1,2 мин., 95% B в течение 1,3 мин., обратно до 5% B за 0,01 мин. при расходе 2,0 мл/мин. Колонка: SunFire C18 (4,6×50 мм, 3,5 мкм). Температура колонки: 50°C Детектирование: УФ (214, 254 нм) и MS (ESI, положит. режим, 110-1000 а. е. м.)
g	Градиент составлял 5% B в течение 0,1 мин. и достигал 95% B за 1,0 мин., затем с удерживанием при 95% B в течение 0,9 мин., понижался обратно до 5% B за 0,01 мин. (расход 3,0 мл/мин.). Подвижная фаза A представляла собой 0,05% TFA в воде, и подвижная фаза B представляла собой 0,05% TFA в MeCN степени чистоты для HPLC. Колонка, применяемая для хроматографии, представляла собой колонку для быстрого разделения Zorbax SB-C18 Rapid Resolution HT (4,6×30 мм, частицы по 1,8 мкм). Способы детектирования представляют собой детектирование с помощью диодной матрицы (DAD) и испарительного детектора светорассеяния (ELSD), а также положительную/отрицательную электрораспылительную ионизацию.
h	Подвижная фаза: A: вода (0,1% TFA); B: MeCN (0,1% TFA). Градиент: повышение от 5% B до 95% B за 1,3 мин., 95% B в течение 1,5 мин., обратно до 5% B за 0,01 мин. при расходе 2 мл/мин. Колонка: Sunfire C18 (4,6×50 мм, 3,5 мкм). Температура колонки: 50°C
i	Подвижная фаза: A: вода (0,01% TFA); B: MeCN (0,01% TFA). Градиент: 5% B в течение 0,2 мин., повышение до 95% B за 1,5 мин., 95% B в течение 1,5 мин., обратно до 5% B за 0,01 мин., при расходе 2 мл/мин. Колонка: Sunfire (50×4,6 мм, 3,5 мкм). Температура колонки: 50°C
j	Подвижная фаза: A: вода (0,05% TFA); B: MeCN (0,05% TFA). Градиент: повышение от 5% до 100% B за 1,3 мин. при расходе 2 мл/мин. Колонка: SunFire C18 (4,6×50 мм, 3,5 мкм). Детектирование: УФ (214, 254 нм) и MS (ESI, положит. режим, 110-1000 а. е. м.). Температура колонки: 50°C
k	Подвижная фаза: A: вода (10 мМ NH₄HCO₃); B: MeCN Градиент: повышение от 5% до 95% B за 1,5 мин. при расходе 1,8 мл/мин. Колонка: XBridge C18 (4,6×50 мм, 3,5 мкм). Температура колонки: 50°C
l	Подвижная фаза: A: вода (10 мМ NH₄HCO₃); B: MeCN Градиент: повышение от 10% до 95% B за 1,5 мин. при расходе 1,8 мл/мин. Колонка: Xbridge C18(2) (4,6×50 мм, 3,5 мкм). Температура колонки: 50 °C Детектирование: УФ (214, 254 нм) и MS (ESI, положит. режим, 103-800 а. е. м.).
m	Подвижная фаза: A: Вода (0,01% TFA), B: MeCN (0,01% TFA). повышение B от 5% до 95% B за 1,2 мин., 95% B в течение 1,3 мин., обратно до 5% B за 0,01 мин. Расход: 2,0 мл/мин. Колонка: SunFire C18, 4,6*50мм, 3,5мкм. Температура колонки: 50°C. Детектирование: УФ (214, 4 нм) и MS (ESI, положит. режим, 110-1000 а. е. м.).
n	Градиент составлял 10-100% B за 3,4 мин. с удерживанием при 100% B за 0,45 мин., 100-10% B за 0,01 мин., и затем удерживали при 10% B в течение 0,65 мин. (0,8 мл/мин. расход). Подвижная фаза A представляла собой 0,0375% TFA в воде. Подвижная фаза B представляла собой 0,018% TFA в CH₃CN. Колонка, применяемая для хроматографии, представляла собой колонку Luna-C18, Phenomenex (2,0×50 мм, частицы по 5 мкм). Способы детектирования представляют собой детектирование с помощью диодной матрицы (DAD) и испарительного детектора светорассеяния (ELSD), а также положительную электрораспылительную ионизацию (MS).
o	Применяли градиент 5-100% MeCN (A) и 10 мМ аммония ацетат в воде (B) при расходе 1,5 мл/мин. (0-0,05 мин. 5% A, 0,05-1,2 мин. 5-100% A, 1,2-1,4 мин. 100% A, 1,4-1,5 мин. 100-5% A, послестартовая отсрочка 0,25 мин.).
q	2-соединенные C8 5 мкм 100Å колонки Waters Sunfire (каждая 30 мм × 75 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 10 мМ аммония ацетата в воде (B) при расходе 50 мл/мин. (0-0,5 мин. 5% A, 0,5-8,5 мин. линейный градиент от X до Y% A, 8,7-10,7 мин. 100% A, 10,7-11 мин. линейный градиент 100-05% A). Линейный градиент указан в процедуре синтеза соединения.
r	Применяли градиент 5-100% MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 1,5 мл/мин. (0-0,05 мин. 5% A, 0,05-1,2 мин. 5-100% A, 1,2-1,4 мин. 100% A, 1,4-1,5 мин. 100-5% A, послестартовая отсрочка 0,25 мин.).
s	Аналитическую UPLC-MS проводили на системах масс-спектрометра Waters SQD и Acquity UPLC, работающих под контролем программного обеспечения MassLynx 4.1 и Openlynx 4.1. Масс-спектрометр SQD эксплуатировали при условиях положительной ионизации APCI. Применяли колонку Waters BEH C8, 1,7 мкм (2,1 мм × 30 мм) при температуре 55°C. Применяли градиент 10-100% ацетонитрила (A) и 10 мМ аммония ацетата в воде (B) при расходе 1,0 мл/мин. (0-0,1 мин. 10% A, 0,1-1,1 мин. 10-100% A, 1,1-1,3 мин. 100% A, 1,3-1,4 мин. 100-10% A).

Аббревиатуры, применяемые в примерах, являются следующими

APCI	Химическая ионизация при атмосферном давлении	HIC	Хроматография гидрофобного взаимодействия
Bn	Бензил	HPLC	Высокоэффективная жидкостная хроматография
BOC	Трет-бутилоксикарбонил	IBX	2-Йодоксибензойная кислота
BSA	Альбумин бычьей сыворотки	MeCN	ацетонитрил
Cbz	Карбобензилокси	MeOH	Метанол
CuCN	Цианид меди	MgSO₄	Сульфат магния
D₂O	Дейтерированная вода	мин.	минута(ы)
DAD	диодная матрица	MP-NaCNBH₃	Цианоборогидрид натрия на твердой подложке
DCM	Дихлорметан	MTBE	Диметил-метил-трет-бутиловый эфир
DIAD	Диизопропил азодикарбоксилат	NaCN	Цианид натрия
DIPEA	N,N-диизопропилэтиламин	NaHCO₃	Гидрокарбонат натрия
DMA	Диметилацетамид	NaHSO₃	Гидросульфат натрия
DMF	Диметилформамид	Na₂SO₄	Сульфат натрия
DMSO	Диметилсульфоксид	ЯМР	Ядерный магнитный резонанс
EIC	Хроматограмма по выделенному иону	Pd₂dba₃	Трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0)
ELSD	Испарительный детектор светорассеяния	PBST	Фосфатно-солевой буферный раствор с Tween 20
экв.	Эквивалент	PE	Петролейный эфир
Et₂O	Диэтиловый эфир	PPh₃	Трифенилфосфин
EtOAc	Этилацетат
FMOC	9-Флуоренилметилоксикарбонил	RP	Обращенная фаза
H	час(ы)	R_t	Время удерживания
H₂SO₄	Серная кислота	TBAF	Тетрабутиламмония фторид
HATU	1-[Бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксида гексафторфосфат	TBS-Cl	Трет-бутилхлордиметилсилан
HCl	Хлористоводородная кислота	TFA	Трифторуксусная кислота
HEPES	4-(2-Гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота	TLC	Тонкослойная хроматография

Пример 1. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-аминофенокси)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез трет-бутил(4-(4-формилфенокси)фенил)карбамата

К раствору трет-бутил(4-гидроксифенил)карбамата (10 г, 47,8 ммоль) и 4-фторбензальдегида (11,86 г, 96 ммоль) в N,N-диметилформамиде (100 мл) добавляли карбонат калия (39,6 г, 287 ммоль). Смесь перемешивали при 90°C в течение 5 часов. Подготавливали, как описано выше, один дополнительный флакон. Две реакционные смеси полностью объединяли и разбавляли с помощью DCM (300 мл), затем экстрагировали водой (3 X 100 мл). Органический слой промывали солевым раствором (100 мл) и высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (элюировали с помощью PE: EtOAc=от 30:1 до 5:1) с получением целевого соединения (20 г, 63,8 ммоль, выход 66,7%) в виде твердого вещества желтого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, DMSO-d₆) δ 9,91 (s, 1H), 9,45 (s, 1H), 7,90 (d, J=8,6 Гц, 2H), 7,54 (d, J=8,8 Гц, 2H), 7,11-7,02 (m, 4H), 1,48 (s, 9H).

Стадия 2. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-аминофенокси)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Обеспечивали перемешивание суспензии (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-дифтор-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (4,5 г, 10,91 ммоль) и сульфата магния (6,57 г, 54,6 ммоль) в MeCN (100 мл) при 20°C в течение 1 часа. Одной порцией добавляли раствор трет-бутил(4-(4-формилфенокси)фенил)карбамата (3,42 г, 10,91 ммоль) в MeCN (100 мл). Добавляли по каплям с помощью шприца трифторметансульфоновую кислоту (4,84 мл, 54,6 ммоль), поддерживая при этом внутреннюю температуру 25°C с применением ледяной бани. По завершении добавления смесь перемешивали при 20°C в течение 2 часов. Подготавливали, как описано выше, три дополнительных флакона. Все четыре реакционные смеси объединяли и фильтровали, фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением остатка, который очищали посредством Prep-HPLC с получением целевого соединения (7,5 г, 12,34 ммоль, выход 28,8%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ a, Таблица 7) R_t=2,21 мин; MS масса/заряд=608,3 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400МГц, DMSO-d₆) δ 7,36 (d, J=8,6 Гц, 2H), 7,27 (d, J=10,1 Гц, 1H), 6,85 (d, J=8,6 Гц, 2H), 6,75 (d, J=8,6 Гц, 2H), 6,58 (d, J=8,6 Гц, 2H), 6,29 (dd, J=1,3, 10,1 Гц, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,76-5,65 (m, 1H), 5,62-5,57 (m, 1H), 5,54 (d, J=3,1 Гц, 1H), 5,44 (s, 1H), 5,12 (t, J=5,8 Гц, 1H), 5,00 (s, 2H), 4,94 (d, J=4,9 Гц, 1H), 4,53 (dd, J=6,4, 19,4 Гц, 1H), 4,26-4,14 (m, 2H), 2,72-2,58 (m, 1H), 2,34-2,17 (m, 2H), 2,04 (d, J=13,7 Гц, 1H), 1,77-1,62 (m, 3H), 1,49 (s, 3H), 0,86 (s, 3H). Способ Prep-HPLC: прибор система полупрепаративной HPLC Gilson 281, подвижная фаза: A: CF₃CO₂H/H₂O=0,075% об./об.; B: CH₃OH; колонка: Luna C18, 250*50 мм*10 мкм, Phenomenex; расход: 80 мл/мин.; длина волны монитора: 220 & 254 нм.

Время	0,0	20,0	20,1	20,2	30,2	30,3	31,5
B%	28	58	58	100	100	28	28

Пример 2. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез 4-(бромметил)бензальдегида

Диизобутилалюминия гидрид (153 мл, 153 ммоль, 1 M в толуоле) добавляли по каплям к имеющему температуру 0°C раствору 4-(бромметил)бензонитрила (20 г, 102 ммоль) в толуоле (400 мл) в течение 1 часа. Подготавливали, как описано выше, два дополнительных флакона. Все три реакционные смеси объединяли. К смешанному раствору добавляли 10% водную HCl (1,5 л). Смесь экстрагировали DCM (3 X 500 мл). Органический слой высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью PE/EtOAc=10/1) с получением целевого соединения (50 г, выход 82%) в виде твердого вещества белого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, хлороформ-d) δ 10,02 (s, 1H), 7,91-7,82 (m, 2H), 7,56 (d, J=7,9 Гц, 2H), 4,55-4,45 (m, 2H).

Стадия 2. Синтез 3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)анилина

К раствору 3-броманилина (40 г, 233 ммоль) в 1,4-диоксане (480 мл) добавляли 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2'-би(1,3,2-диоксаборолан) (94 г, 372 ммоль), ацетат калия (45,6 г, 465 ммоль), 2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропил-1,1'-бифенил (X-phos) (8,07 г, 13,95 ммоль), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (8,52 г, 9,30 ммоль). Затем смесь нагревали при 80°C в течение 4 часов в атмосфере азота. Подготавливали, как описано выше, другой дополнительный флакон. Две реакционные смеси объединяли, концентрировали и остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью PE/EtOAc=10/1) с получением целевого соединения (60 г, выход 55,4%) в виде твердого вещества светло-желтого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, хлороформ-d) δ 7,23-7,13 (m, 3H), 6,80 (d, J=7,5 Гц, 1H), 3,82-3,38 (m, 2H), 1,34 (s, 12H).

Стадия 3. Синтез трет-бутил(3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)карбамата

3-(4,4,5,5-Тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)анилин (30 г, 137 ммоль) и ди-трет-бутилдикарбонат (38,9 г, 178 ммоль) смешивали в толуоле (600 мл) при 100°C в течение 24 часов. Подготавливали, как описано выше, другой дополнительный флакон. Две реакционные смеси объединяли. Смесь коричневого цвета выпаривали, растворяли в EtOAc (1,5 л), промывали 0,1 н. HCl (3 X 2 л) и солевым раствором (3 л), высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (50 г, выход 57%) в виде твердого вещества красного цвета. ¹H ЯМР (400МГц, хлороформ-d) δ 7,63 (br. s., 2H), 7,48 (d, J=7,1 Гц, 1H), 7,37-7,28 (m, 1H), 1,52 (s, 9H), 1,34 (s, 12H).

Стадия 4. Синтез трет-бутил(3-(4-формилбензил)фенил)карбамата

Смесь 4-(бромметил)бензальдегида (24,94 г, 125 ммоль), комплекса 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцендихлорпалладия(II) с DCM (13,75 г, 18,80 ммоль), трет-бутил(3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)карбамата (20 г, 62,7 ммоль) и карбоната калия (43,3 г, 313 ммоль) в тетрагидрофуране (400 мл) нагревали до 80°C в течение 12 часов. Подготавливали, как описано выше, другой дополнительный флакон. Две реакционные смеси объединяли. Реакционную смесь разбавляли водой (500 мл). Водный слой экстрагировали EtOАc (3 × 500 мл). Органический слой высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью PE/EtOAc=10/1) с получением указанного в заголовке соединения (15 г, выход 38,4%) в виде твердого вещества белого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, хлороформ-d) δ 9,95 (s, 1H), 7,78 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,33 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,27-7,13 (m, 3H), 6,82 (d, J=7,1 Гц, 1H), 6,47 (br. s., 1H), 4,00 (s, 2H), 1,48 (s, 9H).

Стадия 5. Синтез (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-дифтор-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она

(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10,10-тетраметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он (20 г, 44,2 ммоль) суспендировали в 40% водной HBF₄ (440 мл) и смесь перемешивали при 25°C в течение 48 часов. После завершения реакции добавляли 2 л H₂O и собирали твердое вещество посредством фильтрации с получением твердого вещества белого цвета. Данное твердое вещество промывали с помощью H₂O (1 L) и затем MeOH (200 мл) с получением указанного в заголовке соединения (11 г, выход 60,3%) в виде твердого вещества белого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, DMSO-d6) δ 7,25 (d, J=10,1 Гц, 1H), 6,28 (d, J=10,1 Гц, 1H), 6,10 (s, 1H), 5,73-5,50 (m, 1H), 5,39 (br. s., 1H), 4,85-4,60 (m, 2H), 4,50 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,20-4,04 (m, 2H), 2,46-2,06 (m, 6H), 1,87-1,75 (m, 1H), 1,56-1,30 (m, 6H), 0,83 (s, 3H).

Стадия 6. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Обеспечивали перемешивание суспензии (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-дифтор-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (4,4 г, 10,67 ммоль) и сульфата магния (6,42 г, 53,3 ммоль) в MeCN (100 мл) при 20°C в течение 1 часа. Одной порцией добавляли раствор трет-бутил(3-(4-формилбензил)фенил)карбамата (3,65 г, 11,74 ммоль) в MeCN (100 мл). Добавляли по каплям трифторметансульфоновую кислоту (9,01 мл, 53,3 ммоль), поддерживая при этом внутреннюю температуру ниже 25°C с применением ледяной бани. По завершении добавления смесь перемешивали при 20°C в течение 2 часов. Подготавливали, как описано выше, три дополнительных флакона. Все четыре реакционные смеси объединяли. Смешанный раствор концентрировали и остаток очищали посредством Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения (4,5 г, выход 14,2%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ b, Таблица 7) R_t=2,65 мин; MS масса/заряд=606,2 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400МГц, DMSO-d6) δ 7,44-7,17 (m, 5H), 6,89 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,44-6,25 (m, 4H), 6,13 (br. s., 1H), 5,79-5,52 (m, 2H), 5,44 (s, 1H), 5,17-4,89 (m, 3H), 4,51 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,25-4,05 (m, 2H), 3,73 (s, 2H), 3,17 (br. s., 1H), 2,75-2,55 (m, 1H), 2,36-1,97 (m, 3H), 1,76-1,64 (m, 3H), 1,59-1,39 (m, 4H), 0,94-0,78 (m, 3H). Способ Prep-HPLC: прибор система полупрепаративной HPLC Gilson 281; подвижная фаза: A: муравьиная кислота/H₂O=0,01% об./об.; B: CH3CN; колонка: Luna C18, 150*25, 5 микрон; расход: 25 мл/мин.; длина волны монитора: 220 и 254 нм.

Время	0,0	10,5	10,6	10,7	13,7	13,8	15,0
B%	15	35	35	100	100	10	10

Пример 2A. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она (соед. № 41)

Стадия 1. Синтез 4-(бромметил)бензальдегида

К раствору 4-(бромметил)бензонитрила (50 г, 255 ммоль) в толуоле (1 л) добавляли по каплям диизобутилалюминия гидрид (383 мл, 383 ммоль, 1 М в толуоле) при 0°C. Смесь перемешивали в течение 1 часа. Подготавливали, как описано выше, два дополнительных флакона. Все три реакционные смеси объединяли. Добавляли 10% водную HCl (1,5 л) и затем экстрагировали с помощью DCM (3 X 1,5 л). Органический слой высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью петролейного эфира/этилацетата=10/1) с получением указанного в заголовке соединения (120 г, 82%) в виде твердого вещества белого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, CDCl₃) δ 10,01 (s, 1H), 7,86 (d, J=8,4 Гц, 2H), 7,55 (d, J=7,9 Гц, 2H), 4,51 (s, 2H).

Стадия 2. Синтез 3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)анилина

К раствору 3-броманилина (80 г, 465 ммоль) в 1,4-диоксане (960 мл) добавляли 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2'-би(1,3,2-диоксаборолан) (177 г, 698 ммоль), ацетат калия (91 г, 930 ммоль), 2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропил-1,1'-бифенил (13,45 г, 23,25 ммоль) и трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (17,03 г, 18,60 ммоль). Смесь нагревали при 80°C в течение 4 часов в атмосфере азота. Подготавливали, как описано выше, два дополнительных флакона. Три реакционные смеси объединяли, концентрировали и остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью петролейного эфира/этилацетата=10/1) с получением указанного в заголовке соединения (150 г, 46,6%) в виде твердого вещества светло-желтого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, CDCl₃) δ 7,23-7,13 (m, 3H), 6,80 (d, J=7,5 Гц, 1H), 3,82-3,38 (m, 2H), 1,34 (s, 12H).

Стадия 3. Синтез трет-бутил(3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)карбамата

3-(4,4,5,5-Тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)анилин (50 г, 228 ммоль) и ди-трет-бутилдикарбонат (64,8 г, 297 ммоль) смешивали в толуоле (500 мл) и смесь перемешивали при 100°C в течение 24 часов. Подготавливали, как описано выше, два дополнительных флакона. Три реакционные смеси объединяли. Смесь коричневого цвета концентрировали и остаток промывали с помощью PE с получением указанного в заголовке соединения (120 г, 49,5%) в виде твердого вещества белого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, CDCl₃) δ 7,62 (s, 2H), 7,48 (d, J=7,5 Гц, 1H), 7,35-7,29 (m, 1H), 6,46 (br. s., 1H), 1,52 (s, 9H), 1,34 (s, 12H).

Стадия 4. Синтез трет-бутил(3-(4-формилбензил)фенил)карбамата

Смесь 4-(бромметил)бензальдегида (29,9 г, 150 ммоль), 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцендихлорпалладия(II) (20,63 г, 28,2 ммоль), трет-бутил(3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)карбамата (30 г, 94 ммоль) и карбоната калия (64,9 г, 470 ммоль) в THF (600 мл) нагревали до 80°C в течение 12 часов. Подготавливали, как описано выше, три дополнительных флакона. Все четыре реакционные смеси объединяли. Реакционную смесь разбавляли водой (1 л). Водный слой экстрагировали EtOАc (3 X 800 мл). Органический слой высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью PE/EtOAc=10/1) с получением указанного в заголовке соединения (35,5 г, 27,3%) в виде твердого вещества белого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, CDCl₃) δ 9,97 (s, 1H), 7,80 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,35 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,26 (s, 2H), 7,24-7,13 (m, 2H), 6,84 (d, J=7,1 Гц, 1H), 6,43 (br. s., 1H), 4,02 (s, 2H), 1,50 (s, 9H).

Стадия 5. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

К раствору (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (6 г, 15,94 ммоль) и трет-бутил(3-(4-формилбензил)фенил)карбамата (4,96 г, 15,94 ммоль) в MeCN (50 мл) добавляли по каплям перхлорную кислоту (4,79 мл, 80 ммоль), поддерживая при этом внутреннюю температуру ниже 25°C с применением ледяной бани. По завершении добавления смесь перемешивали при 20°C в течение 2 часов. Подготавливали, как описано выше, три дополнительных флакона. Все четыре реакционные смеси объединяли. Реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором NaHCO₃ (500 мл) и экстрагировали дихлорметаном (3 X 800 мл). Органическую фазу концентрировали и остаток очищали посредством Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения (10 г, 27,0%) в виде твердого вещества желтого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, DMSO-d₆) δ 7,36 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,31 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,20 (d, J=7,9 Гц, 2H), 6,89 (t, J=7,9 Гц, 1H), 6,39-6,28 (m, 3H), 6,16 (dd, J=1,5, 9,9 Гц, 1H), 5,93 (s, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,08 (t, J=5,7 Гц, 1H), 4,98-4,87 (m, 3H), 4,78 (d, J=3,1 Гц, 1H), 4,49 (dd, J=6,2, 19,4 Гц, 1H), 4,29 (br. s., 1H), 4,17 (dd, J=5,5, 19,6 Гц, 1H), 3,74 (s, 2H), 2,61-2,53 (m, 1H), 2,36-2,26 (m, 1H), 2,11 (d, J=11,0 Гц, 1H), 2,07 (s, 1H), 2,02 (d, J=12,8 Гц, 1H), 1,83-1,54 (m, 5H), 1,39 (s, 3H), 1,16-0,96 (m, 2H), 0,85 (s, 3H). LCMS: t_R=2,365 мин, чистота 98%, масса/заряд=570,2 (M+H)⁺ LC/MS (Таблица 7, способ a)

Способ Prep-HPLC: прибор система полупрепаративной HPLC Gilson 281, подвижная фаза: A: CF₃COOH/H₂O=0,075% об./об.; B: CH₃CN, колонка: Luna(2) C18, 250*50 10 u, Phenomenex; расход: 80 мл/мин., длина волны монитора: 220&254 нм, время B%, 0,0 28, 20,0 45, 20,1 45, 20,2 100, 30,2 100, 0,3 28, 31,5 28.

Пример 2B.

Синтез (2R,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-6b-фтор-2,7-дигидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Трифторметансульфоновую кислоту (1,34 мл, 15,11 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру -10°C суспензии (6R,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-9-фтор-6,11,16,17-тетрагидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (1,55 г, 3,78 ммоль), трет-бутил(3-(4-формилбензил)фенил)карбамата (из примера 2, стадии 4) (1,176 г, 3,78 ммоль) и MgSO₄ (2,273 г, 18,89 ммоль) в MeCN (15,1 мл). Через 20 мин. реакцию гасили посредством добавления насыщенного водного раствора NaHCO₃ (15 мл), после чего добавляли воду (60 мл) и EtOAc (100 мл). Органический слой последовательно промывали водой (60 мл), солевым раствором (60 мл), высушивали (Na₂SO₄) и удаляли растворитель при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 40 г) с градиентом элюирования 40-100% EtOAc/гептаны получали указанное в заголовке соединение в виде пены (880 мг, 1,458 ммоль, выход 39%) с чистотой 90%. Продукт можно дополнительно очистить посредством HPLC с обращенной фазой на колонке Waters XBridge™ RP18, 5 микрон (30×100 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1 мМ NH₄CO₃ в воде (B) при расходе 40 мл/мин. (0-5,0 мин. 5% A, 5,0-19,0 мин. линейный градиент 15-55% A). LC-MS (Способ r, Таблица 7) Rt=0,72 мин, масса/заряд=604,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d₆) δ 7,37-7,31 (m, 2H), 7,28 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,24-7,19 (m, 2H), 6,93-6,85 (m, 1H), 6,36 (d, J=2,1 Гц, 2H), 6,35 (p, J=1,1 Гц, 1H), 6,23 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,10 (d, J=1,9 Гц, 1H), 5,45 (s, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,10 (s, 1H), 4,96-4,91 (m, 3H), 4,51 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,38 (s, 1H), 4,28-4,16 (m, 2H), 3,74 (s, 2H), 2,76-2,60 (m, 1H), 2,20 (td, J=12,5, 6,3 Гц, 1H), 2,08 (s, 2H), 1,86 (d, J=11,8 Гц, 1H), 1,75-1,58 (m, 7H), 0,89 (s, 3H).

Пример 3. Синтез (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)тио)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез трет-бутил(3-меркаптофенил)карбамата

К смеси перхлората цинка (0,422 г, 1,598 ммоль) и 3-аминобензолтиола (10 г, 80 ммоль) добавляли по каплям ди-трет-бутилдикарбонат (22,66 г, 104 ммоль). Раствор перемешивали при 25°C в течение 12 часов. Подготавливали, как описано выше, три дополнительных флакона. Четыре реакционные смеси объединяли. Смесь растворяли в EtOAc (200 мл) и промывали водой (500 мл). Органический слой высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью PE/EtOAc=5/1) с получением целевого соединения (50 г, выход 69,4%) в виде твердого вещества белого цвета. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 7,45 (br. s., 1H), 7,16-7,09 (m, 1H), 7,06-7,01 (m, 1H), 6,92 (d, J=7,4 Гц, 1H), 6,55 (br. s., 1H), 3,46 (s, 1H), 1,52 (s, 9H).

Стадия 2. Синтез трет-бутил(3-((4-формилфенил)тио)фенил)карбамата

К раствору трет-бутил(3-((4-формилфенил)тио)фенил)карбамата (10 г, 44,4 ммоль) в DMF (300 мл) добавляли трифенилфосфин (11,64 г, 44,4 ммоль) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (11,47 г, 89 ммоль) при 25°C. Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 30 минут в атмосфере N₂. К смеси добавляли 4-фторбензальдегид (8,26 г, 66,6 ммоль) при 100°C и смесь перемешивали при 100°C в течение 12 часов. Подготавливали, как описано выше, четыре дополнительных флакона. Пять реакционных смесей объединяли. Смесь разбавляли водой (2 л) и экстрагировали с помощью EtOAc (3 × 1 л). Органический слой высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью PE/EtOAc=10/1) с получением целевого соединения (55 г, выход 75%) в виде желтого масла. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,90 (s, 1H), 7,71 (d, J=8,4 Гц, 2H), 7,58 (s, 1H), 7,48-7,41 (m, 1H), 7,33 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,25 (d, J=8,4 Гц, 2H), 7,17 (d, J=7,9 Гц, 1H), 6,72 (br. s., 1H), 1,50 (s, 9H).45 (br. s., 1H), 7,16-7,09 (m, 1H), 7,06-7,01 (m, 1H), 6,92 (d, J=7,4 Гц, 1H), 6,55 (br. s., 1H), 3,46 (s, 1H), 1,52 (s, 9H).

Стадия 3. Синтез натрий(4-((3-((трет-бутоксикарбонил)амино)фенил)тио)фенил)(гидрокси)метансульфоната

К раствору альдегида (15 г, 45,5 ммоль) в CH₃CN (30 мл) добавляли раствор метабисульфита натрия (11,25 г, 59,2 ммоль) в воде (90 мл) при 25°C. Смесь перемешивали при 25°C в течение 48 часов. Подготавливали, как описано выше, другой дополнительный флакон. Две реакционные смеси объединяли. Раствор фильтровали и твердое вещество промывали водой (150 мл), CH₃CN (150 мл) и высушивали при пониженном давлении с получением целевого соединения (32 г, выход 81%) в виде твердого вещества белого цвета. ¹H ЯМР (400МГц, DMSO-d6) δ 9,45 (br. s., 1H), 7,54-7,49 (m, 1H), 7,47-7,35 (m, 3H), 7,33-7,17 (m, 3H), 6,85 (d, J=7,9 Гц, 1H), 5,97 (d, J=4,9 Гц, 1H), 4,98 (d, J=4,9 Гц, 1H), 1,45 (s, 9H).

Стадия 4. Синтез (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)тио)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

К раствору (8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-9-фтор-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (6 г, 15,21 ммоль) и натрий(4-((3-((трет-бутоксикарбонил)амино)фенил)тио)фенил)(гидрокси)метансульфоната (4,74 г, 15,21 ммоль) в THF (50 мл) добавляли по каплям перхлорную кислоту (4,58 мл, 76 ммоль), поддерживая при этом внутреннюю температуру ниже 25°C с применением ледяной бани. По завершении добавления смесь перемешивали при 20°C в течение 2 часов. Подготавливали, как описано выше, три дополнительных флакона. Все четыре реакционные смеси объединяли. Реакционную смесь гасили насыщ. водным раствором NaHCO₃ (500 мл) и экстрагировали с помощью DCM (3 X 800 мл). Органическую фазу концентрировали и остаток очищали посредством Prep-HPLC с получением целевого соединения (9,5 г, 25,8%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ b, Таблица 7) R_t=2,68 мин, масса/заряд=588,1 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400МГц, DMSO-d6) δ 7,37-7,26 (m, 3H), 7,21 (d, J=7,9 Гц, 2H), 6,89 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,43-6,30 (m, 3H), 6,23 (d, J=10,1 Гц, 1H), 6,04 (s, 1H), 5,75 (s, 1H), 5,44 (s, 2H), 5,09 (t, J=5,7 Гц, 1H), 4,93 (br. s., 3H), 4,50 (dd, J=6,2, 19,4 Гц, 1H), 4,28-4,09 (m, 2H), 3,74 (s, 2H), 2,73-2,54 (m, 2H), 2,35 (d, J=13,2 Гц, 1H), 2,25-2,12 (m, 1H), 2,05 (d, J=15,0 Гц, 1H), 1,92-1,77 (m, 1H), 1,74-1,58 (m, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,45-1,30 (m, 1H), 0,87 (s, 3H). cпособ Prep-HPLC: прибор система полупрепаративной HPLC Gilson 281; подвижная фаза: A: CF₃CO₂H/H₂O=0,075% об./об.; B: CH₃CN; колонка: Luna C18, 250 x *50 мм*10 микрон, Phenomenex; расход: 80 мл/мин.; длина волны монитора: 220 и 254 нм.

Время	0,0	20,0	20,1	20,2	30,2	30,3	31,5
B%	10	42	42	100	100	10	10

Пример 4. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)тио)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

К раствору (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (6 г, 15,94 ммоль) и натрий(4-((3-((трет-бутоксикарбонил)амино)фенил)тио)фенил)(гидрокси)метансульфоната (4,96 г, 15,94 ммоль) в MeCN (50 мл) добавляли по каплям перхлорную кислоту (4,79 мл, 80 ммоль), поддерживая при этом внутреннюю температуру ниже 25°C с применением ледяной бани. По завершении добавления смесь перемешивали при 20°C в течение 2 часов. Подготавливали, как описано выше, три дополнительных флакона. Все четыре реакционные смеси объединяли. Реакционную смесь гасили насыщ. водным раствором NaHCO₃ (500 мл) и экстрагировали с помощью DCM (3 X 800 мл). Органическую фазу концентрировали и остаток очищали посредством Prep-HPLC с получением целевого соединения (10 г, 27,0%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ b, Таблица 7) R_t=2,36 мин, масса/заряд=570,2 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400МГц, DMSO-d6) δ 7,36 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,31 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,20 (d, J=7,9 Гц, 2H), 6,89 (t, J=7,9 Гц, 1H), 6,39-6,28 (m, 3H), 6,16 (dd, J=1,5, 9,9 Гц, 1H), 5,93 (s, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,08 (t, J=5,7 Гц, 1H), 4,98-4,87 (m, 3H), 4,78 (d, J=3,1 Гц, 1H), 4,49 (dd, J=6,2, 19,4 Гц, 1H), 4,29 (br. s., 1H), 4,17 (dd, J=5,5, 19,6 Гц, 1H), 3,74 (s, 2H), 2,61-2,53 (m, 1H), 2,36-2,26 (m, 1H), 2,11 (d, J=11,0 Гц, 1H), 2,07 (s, 1H), 2,02 (d, J=12,8 Гц, 1H), 1,83-1,54 (m, 5H), 1,39 (s, 3H), 1,16-0,96 (m, 2H), 0,85 (s, 3H). Способ Prep-HPLC: прибор система полупрепаративной HPLC Gilson 281; подвижная фаза: A: CF₃CO₂H/H₂O=0,075% об./об.; B: CH₃CN; колонка: Luna C18, 250*50 мм*10 микрон, Phenomenex; расход: 80 мл/мин.; длина волны монитора: 220 и 254 нм.

Время	0,0	20,0	20,1	20,2	30,2	30,3	31,5
B%	28	45	45	100	100	28	28

Пример 5. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)тио)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

К раствору стероида (10 г, 24,25 ммоль) в CH₃CN (200 мл) добавляли сульфат магния (10,21 г, 85 ммоль) при 25°C. Смесь перемешивали при 25°C в течение 4 часов. Затем к вышеуказанному раствору добавляли натрий(4-((3-((трет-бутоксикарбонил)амино)фенил)тио)фенил)(гидрокси)метансульфонат (10,51 г, 24,25 ммоль) и трифторметансульфоновую кислоту (20,48 мл, 121 ммоль) при 0°C. Полученную смесь перемешивали при 25°C в течение 1 часа. Подготавливали, как описано выше, два дополнительных флакона. Три реакционные смеси объединяли. Смесь разбавляли 1 н. NaOH (300 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (3 × 600 мл). Органический слой концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток растворяли в EtOAc (60 мл) и добавляли 2-бутанон (180 мл). После перемешивания в течение 30 минут собирали твердое вещество с помощью фильтрации и очищали посредством Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения (8,4 г, выход 17,52%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ c, Таблица 7) R_t=2,66 мин; MS масса/заряд=624,1 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400МГц, DMSO-d6) δ 7,39 (d, J=8,4 Гц, 2H), 7,25 (d, J=8,4 Гц, 3H), 7,03 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,61 (s, 1H), 6,53 (t, J=8,2 Гц, 2H), 6,29 (dd, J=1,5, 9,9 Гц, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,76-5,49 (m, 2H), 5,46 (s, 1H), 4,96 (d, J=4,9 Гц, 1H), 4,52 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,21 (d, J=19,4 Гц, 2H), 2,74-2,53 (m, 2H), 2,34-2,13 (m, 2H), 2,09-1,96 (m, 1H), 1,79-1,62 (m, 3H), 1,57-1,43 (m, 4H), 0,86 (s, 3H). Способ Prep-HPLC: прибор LC-8A, Shimadzu для препаративной HPLC; колонка: Luna C18, 250*50 мм*10 микрон, Phenomenex; подвижная фаза: A для H₂O (0,09% CF₃CO₂H) и B для CH₃CN; градиент: B от 22% до 52% за 20 мин.; расход: 80 мл/мин.; длина волны: 220&254 нм.

Пример 6. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-амино-4-гидроксибензил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Трифлатную кислоту (0,2 мл, 2,183 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C взвеси (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (0,164 г, 0,437 ммоль), трет-бутил(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-5-(4-формилбензил)фенил)карбамата (0,193 г, 0,437 ммоль) и MgSO₄ (0,189 г, 1,572 ммоль) в MeCN (1,8 мл). Через 40 мин. реакционную смесь разбавляли EtOAc (15 мл) и затем промывали последовательно насыщенным водным раствором NaHCO₃ (10 мл x 2) и насыщенным водно-солевым раствором (5 мл). Органическую фазу высушивали (Na₂SO₄) и удаляли растворитель при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 12 г) с градиентом элюирования 0-10% MeOH/DCM получали указанное в заголовке соединение (163 мг, 0,278 ммоль, выход 64%) в виде воскообразного твердого вещества. Порцию данного материала (прибл. 48,9 мг) дополнительно очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250 X 50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 90 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-20 мин. линейный градиент 15-70% A, удерживание 2 мин.). Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении для удаления летучих растворителей и полученный раствор замораживали и лиофилизировали с получением твердого вещества грязно-белого цвета (11,9 мг). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,75 мин, масса/заряд=586,26 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 10,27 (s, 1H), 9,04 (s, 2H), 7,34 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,28 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,18 (d, J=8,0 Гц, 2H), 6,94 (dd, J=8,1, 2,1 Гц, 1H), 6,90 (d, J=2,1 Гц, 1H), 6,82 (d, J=8,2 Гц, 1H), 6,17-6,07 (m, 1H), 5,90 (d, J=1,6 Гц, 1H), 5,37 (s, 1H), 4,89 (d, J=4,9 Гц, 1H), 4,75 (s, 1H), 4,46 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,26 (q, J=3,3 Гц, 1H), 4,14 (d, J=19,5 Гц, 1H), 3,80 (s, 2H), 2,58-2,46 (m, 1H), 2,36-1,92 (m, 3H), 1,76-1,56 (m, 4H), 1,36 (s, 3H), 1,10-0,90 (m, 2H), 0,83 (s, 3H).

Пример 7. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)-3-гидроксифенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Стадия 1. Синтез 4-((3-бромфенил)(гидрокси)метил)-3-метоксибензонитрила

Комплекс изопропилмагния хлорида с хлоридом лития (1,3 М в THF, 8,34 мл, 10,85 ммоль) добавляли по каплям к имеющему температуру 0-5°C раствору 4-бром-3-метоксибензонитрила (2 г, 9,43 ммоль) в THF (21 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч., после чего добавляли по каплям раствор 3-бромбензальдегида (1,979 г, 10,38 ммоль) в THF (10,5 мл), поддерживая температуру <10°C. Обеспечивали медленное нагревание реакционной смеси до комнатной температуры в течение ночи. Реакцию гасили насыщенным водным раствором NH₄Cl (25 мл) и экстрагировали с помощью MTBE (50 мл X 3). Объединенные органические вещества промывали солевым раствором (20 мл), высушивали (Na₂SO₄) и удаляли растворители при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (80 г диоксида кремния) с градиентом элюирования 0-10% MTBE/гептаны получали указанное в заголовке соединение (1,77 г, 5,56 ммоль, выход 59%) в виде бежевой вязкой жидкости/масла. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,86 мин; MS (ESI-) масса/заряд=315,7 [M-H⁺]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 7,67 (d, J=7,8 Гц, 1H), 7,47 (t, J=1,8 Гц, 1H), 7,43 (dd, J=7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,41 (d, J=1,4 Гц, 1H), 7,40-7,36 (m, 1H), 7,28 (dt, J=7,8, 1,5 Гц, 1H), 7,23 (d, J=7,8 Гц, 1H), 6,10 (d, J=4,4 Гц, 1H), 5,94 (d, J=4,1 Гц, 1H), 3,80 (s, 3H).

Стадия 2. Синтез 4-(3-бромбензил)-3-метоксибензонитрила

К раствору йодида натрия (5,00 г, 33,4 ммоль) в MeCN (18,5 мл) комнатной температуры добавляли хлортриметилсилан (3,63 г, 33,4 ммоль), что приводило к немедленному осаждению твердого вещества белого цвета. Затем добавляли раствор 4-((3-бромфенил)(гидрокси)метил)-3-метоксибензонитрила (1,77 г, 5,56 ммоль) в MeCN (18,5 мл), после чего реакционную смесь нагревали до 55°C в течение 60 мин. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь разделяли между MTBE (50 мл) и водой (50 мл). После разделения слои водной фазы экстрагировали с помощью MTBE (50 мл X 2). Объединенные органические вещества промывали последовательно 1 M водным раствором Na₂S₂O₃ (50 мл X 2), после этого насыщенным водно-солевым раствором (30 мл), высушивали (Na₂SO₄) и удаляли растворители при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 80 г) с градиентом элюирования 5-40% MTBE/гептаны получали указанное в заголовке соединение (1,58 г, 5,23 ммоль, выход 94%) в виде твердого вещества грязно-белого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=1,02 мин; MS масса/заряд=не проявился. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 7,42 (d, J=1,5 Гц, 1H), 7,39-7,30 (m, 4H), 7,22 (td, J=7,6, 0,6 Гц, 1H), 7,18 (dt, J=7,7, 1,4 Гц, 1H), 3,94 (s, 2H), 3,82 (s, 3H).

Стадия 3. Синтез 4-(3-бромбензил)-3-метоксибензальдегида

Диизобутилалюминия гидрид (4,9 мл, 1,0 M раствор в гексанах, 4,9 ммоль) добавляли по каплям в течение 5 мин. к имеющему температуру 0°C раствору 4-(3-бромбензил)-3-метоксибензонитрила (0,99 г, 3,28 ммоль) в толуоле (16 мл), поддерживая температуру < 6°C. Через 10 мин. реакцию гасили путем осторожного добавления 1 н. водного раствора HCl (100 мл) при 0°C. Затем ее экстрагировали с помощью DCM (50 мл X 4), промывали насыщенным водно-солевым раствором (30 мл) и удаляли растворитель при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 40 г) с градиентом элюирования 0-40% MTBE/гептаны получали указанное в заголовке соединение (780 мг, 2,56 ммоль, выход 78%) в виде бесцветного масла. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,95 мин, MS (DCI+) масса/заряд=303,9, 305,9 (M⁺). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,93 (s, 1H), 7,47 (dd, J=7,5, 1,5 Гц, 1H), 7,44 (d, J=1,5 Гц, 1H), 7,42-7,33 (m, 3H), 7,25-7,17 (m, 2H), 3,96 (s, 2H), 3,85 (s, 3H).

Стадия 4. Синтез 4-(3-бромбензил)-3-гидроксибензальдегида

Трибромид бора (1,0 M в метиленхлориде, 6,4 мл, 6,4 ммоль) добавляли по каплям к имеющему температуру 0-3°C раствору 4-(3-бромбензил)-3-метоксибензальдегида (0,78 г, 2,56 ммоль) в DCM (7,8 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин.; затем перемешивали в течение 90 мин. при комнатной температуре. При пониженном давлении удаляли растворитель и полученное темное масло обрабатывали с помощью MeOH (20 мл) и воды (15 мл), в результате чего получали неоднородную смесь. Добавляли MeCN до получения однородного раствора (прибл. 10 мл) и раствор перемешивали в течение ночи. При пониженном давлении удаляли летучие растворители и полученную водную суспензию экстрагировали с помощью DCM (25 мл X 3). Объединенные органические вещества промывали солевым раствором (20 мл), высушивали над Na₂SO₄ и удаляли растворитель при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 40 г) с градиентом элюирования 10-50% MTBE/гептаны получали 4-(3-бромбензил)-3-гидроксибензальдегид (660 мг, 2,267 ммоль, выход 89%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,85 мин; MS (DCI+) масса/заряд=307,98, 309,97 [M+NH₄⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 10,07 (s, 1H), 9,83 (s, 1H), 7,39 (q, J=1,3 Гц, 1H), 7,33 (ddt, J=6,5, 4,4, 2,0 Гц, 1H), 7,30 (d, J=0,9 Гц, 2H), 7,25 (s, 1H), 7,25-7,15 (m, 2H), 3,92 (s, 2H).

Стадия 5. Синтез 4-(3-бромбензил)-3-((трет-бутилдиметилсилил)окси)бензальдегида

Имидазол (0,231 г, 3,40 ммоль) и трет-бутилдиметилхлорсилан (0,410 г, 2,72 ммоль) добавляли к имеющей комнатную температуру суспензии 4-(3-бромбензил)-3-гидроксибензальдегида (0,660 г, 2,267 ммоль) в DCM (7,6 мл) и перемешивали в течение 3 ч. Добавляли MeOH (0,5 мл) и перемешивание продолжали в течение 10 мин., после чего реакционную смесь разбавляли с помощью DCM (100 мл), промывали последовательно водой (25 мл), 1 н. водным раствором HCl (25 мл) и насыщенным водно-солевым раствором (20 мл). Органическую фазу высушивали (Na₂SO₄) и удаляли растворитель при пониженном давлении с получением сиропа. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 40 г) с градиентом элюирования 0-10% MTBE/гептаны получали целевое соединение (820 мг, 2,023 ммоль, выход 89%) в виде бесцветного масла. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=1,18 мин, MS (DCI+) масса/заряд=422,07, 424,09 [M+NH₄⁺]. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 9,94 (s, 1H), 7,50 (dd, J=7,7, 1,6 Гц, 1H), 7,42-7,36 (m, 2H), 7,36-7,32 (m, 2H), 7,25 (t, J=7,8 Гц, 1H), 7,17 (ddd, J=7,7, 1,7, 1,0 Гц, 1H), 4,01 (s, 2H), 0,92 (s, 9H), 0,26 (s, 6H).

Стадия 6. Синтез трет-бутил(3-(4-формил-2-гидроксибензил)фенил)карбамата

Через смесь 4-(3-бромбензил)-3-((трет-бутилдиметилсилил)окси)бензальдегида (0,820 г, 2,023 ммоль), трет-бутилкарбамата (0,3027 г, 2,58 ммоль), Cs₂CO₃ (1,006 г, 3,09 ммоль) в п-диоксане (16 мл) барботировали азот в течение 30 мин. Добавляли предкатализатор 2-го поколения XPhos (0,0937 г, 0,119 ммоль) и продолжали барботирование в течение 5 мин., после чего реакционную смесь нагревали до 100°C в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, обрабатывали 1 н. водным раствором HCl (25 мл) и экстрагировали с помощью MTBE (25 мл x 3). Объединенные органические вещества промывали солевым раствором (30 мл), высушивали над Na₂SO₄ и удаляли растворитель при пониженном давлении. Остаток повторно растворяли в THF (16 мл, 0,125 M) и обрабатывали TBAF/SiO₂ (1,0-1,5 ммоль/г, 4,1338 г, 4,13-6,2 ммоль) в течение 45 мин., после чего удаляли растворитель при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 40 г) с градиентом элюирования 0-75% MTBE/гептаны получали трет-бутил(3-(4-формил-2-гидроксибензил)фенил)карбамат (380 мг, 1,161 ммоль, выход 57%), который выделяли в виде липкой пены. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,85 мин; MS (DCI+) масса/заряд=345,0 [M+NH₄⁺]. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 10,04 (s, 1H), 9,86 (s, 1H), 9,25 (s, 1H), 7,37 (s, 1H), 7,34-7,28 (m, 2H), 7,27-7,20 (m, 2H), 7,14 (t, J=7,8 Гц, 1H), 6,82 (dt, J=7,7, 1,2 Гц, 1H), 3,89 (s, 2H), 1,45 (s, 9H).

Стадия 7. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)-3-гидроксифенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Трифлатную кислоту (0,060 мл, 0,680 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C взвеси (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-дифтор-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (0,056 г, 0,136 ммоль), трет-бутил(3-(4-формил-2-гидроксибензил)фенил)карбамата (0,049 г, 0,150 ммоль) и MgSO₄ (0,049 г, 0,408 ммоль) в MeCN (1,5 мл), поддерживая температуру реакционной смеси < 5°C. Через 30 мин. реакционную смесь разбавляли EtOAc (15 мл) и промывали последовательно насыщенным водным раствором NaHCO₃ (5 мл X 2) и затем насыщенным водно-солевым раствором (3 мл). Органическую фазу высушивали (Na₂SO₄) и удаляли растворитель при пониженном давлении. Проводили очистку посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250×30 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% муравьиной кислоты в воде (B) при расходе 60 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-20,0 мин. линейный градиент 15-80% A, удерживание 5 мин.). Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении для удаления летучих растворителей, а затем лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде белого аморфного твердого вещества (6,7 мг). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,70 мин; MS масса/заряд=622,39 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 9,51 (s, 1H), 7,25 (d, J=10,2 Гц, 1H), 6,96 (d, J=7,7 Гц, 1H), 6,89-6,81 (m, 2H), 6,75 (d, J=7,7 Гц, 1H), 6,37-6,24 (m, 4H), 6,11 (s, 1H), 5,63 (ddd, J=49,2, 11,2, 6,4 Гц, 1H), 5,50 (d, J=4,3 Гц, 1H), 5,30 (s, 1H), 5,07 (s, 1H), 4,91 (d, J=4,8 Гц, 1H), 4,85 (s, 2H), 4,47 (d, J=19,3 Гц, 1H), 4,21 4,14 (m, 2H), 3,70-3,60 (m, 2H), 2,69-2,50 (m, 1H), 2,26 (s, 1H), 2,31-2,16 (m, 1H), 2,07-1,94 (m, 1H), 1,68 (q, J=10,2, 8,9 Гц, 2H), 1,64 1,50 (m, 1H), 1,48 (s, 3H), 0,84 (s, 3H).

Пример 8. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)-3-гидроксифенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Трифлатную кислоту (0,35 мл, 3,83 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C взвеси (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (0,296 г, 0,786 ммоль), трет-бутил(3-(4-формил-2-гидроксибензил)фенил)карбамата (0,251 г, 0,767 ммоль) и MgSO₄ (0,332 г, 2,76 ммоль) в MeCN (3,0 мл), поддерживая температуру реакционной смеси < 5°C. Через 40 мин. реакционную смесь разбавляли EtOAc (15 мл) и промывали последовательно насыщенным водным раствором NaHCO₃ (10 мл X 2) и затем насыщенным водно-солевым раствором (5 мл). Органический слой высушивали над Na₂SO₄ и удаляли растворитель при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 12 г) с градиентом элюирования 0-10% MeOH/DCM получали указанное в заголовке соединение (238,4 мг, 0,407 ммоль, выход 53%) в виде твердого вещества белого цвета. Порцию данного материала (прибл. 79,1 мг) дополнительно очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250 X 30 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 60 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-20 мин. линейный градиент 15-60% A, удерживание 2 мин.). Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении для удаления летучих растворителей и полученный раствор замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества грязно-белого цвета (43,4 мг). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,73 мин; MS масса/заряд=586,2 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 9,61 (s, 1H), 7,30 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,27-7,20 (m, 1H), 7,04 (dd, J=7,7, 2,9 Гц, 2H), 6,95-6,91 (m, 2H), 6,90 (d, J=1,6 Гц, 1H), 6,79 (dd, J=7,7, 1,6 Гц, 1H), 6,15 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,92 (d, J=1,6 Гц, 1H), 5,29 (s, 1H), 4,88 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,79 (s, 1H), 4,45 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,28 (q, J=3,3 Гц, 1H), 4,15 (d, J=19,4 Гц, 1H), 3,82 (s, 2H), 2,59-2,49 (m, 1H), 2,30 (dt, J=13,0, 3,8 Гц, 1H), 2,16-2,05 (m, 1H), 2,07-1,98 (m, 1H), 1,75 (d, J=3,0 Гц, 2H), 1,73-1,54 (m, 3H), 1,38 (s, 3H), 1,05 (qd, J=12,9, 4,8 Гц, 1H), 0,97 (dd, J=11,2, 3,6 Гц, 1H), 0,84 (s, 3H).

Пример 9. Синтез (S)-N-(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-2-((S)-2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)пропанамидо)пропанамида

Стадия 1. Синтез (9H-флуорен-9-ил)метил ((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата

HATU (1,3 г, 3,41 ммоль) и 2,6-лутидин (0,4 мл, 3,43 ммоль) добавляли к имеющей комнатную температуру суспензии (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (1,0327 г, 1,705 ммоль) и (S)-2-((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)пропановой кислоты (0,782 г, 2,046 ммоль) в THF (11,5 мл). Через 3 часа при комнатной температуре реакционную смесь разбавляли EtOAc (16 мл), затем промывали последовательно 1 н. водным раствором HCl (4 мл x 3) и насыщенным водно-солевым раствором (4 мл). Purification by chromatography (silica, 40 g) eluting with a gradient of 75-100% EtOAc/heptanes gave the title compound (0.926 g, 0.955 ммol, 56% yield). LC-MS (Способ r, Таблица 7) Rt=1,01 мин, m/z=970.18 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 9,85 (d, J=5,6 Гц, 1H), 8,08 (d, J=7,3 Гц, 1H), 7,89 (dd, J=7,5, 1,0 Гц, 2H), 7,76-7,69 (m, 2H), 7,55 (d, J=7,4 Гц, 1H), 7,49-7,16 (m, 13H), 6,94-6,88 (m, 1H), 6,30 (ddd, J=10,1, 3,7, 1,9 Гц, 1H), 6,14 (dt, J=2,6, 1,2 Гц, 1H), 5,74-5,55 (m, 1H), 5,53 (dt, J=5,0, 2,5 Гц, 1H), 5,12 (t, J=6,0 Гц, 1H), 4,95 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,52 (dd, J=19,4, 6,2 Гц, 1H), 4,38 (p, J=7,0 Гц, 1H), 4,32-4,16 (m, 5H), 4,09 (p, J=6,9 Гц, 1H), 3,88 (d, J=10,9 Гц, 2H), 2,65-2,60 (m, 1H), 2,33-2,20 (m, 1H), 2,05 (d, J=13,5 Гц, 1H), 1,77-1,63 (m, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,28 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,23 (d, J=7,1 Гц, 4H), 0,88 (d, J=12,6 Гц, 3H).

Стадия 2. Синтез (S)-2-амино-N-((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)пропанамида

К имеющему комнатную температуру раствору (9H-флуорен-9-ил)метил((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата (1,18 г, 1,216 ммоль) в THF (6,0 мл) добавляли диэтиламин (0,5 мл, 4,79 ммоль). Через 2 ч. добавляли MTBE (10 мл), что приводило к немедленному осаждению твердого вещества желтого цвета. Данную взвесь перемешивали в течение 90 мин., фильтровали и промывали с помощью MTBE (5 мл x 3) с получением желтого твердого вещества (802,7 мг). Данный материал дополнительно очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250×50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% муравьиной кислоты в воде (B) при расходе 90 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-20,0 мин. линейный градиент 15-75% A, удерживание 2 мин., 22,0-22,5 мин. линейный градиент 75-95%, удерживание в течение 4 мин.). Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении до сухого состояния и затем высушивали в течение ночи в вакуумной печи при 50°C. LC-MS (способ r, Таблица 7) R_t=0,76 мин., масса/заряд=748,5 [M+H⁺]. ¹H ЯМР указывает на то, что указанное в заголовке соединение находится в смеси примерно 1:1 с (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-2-((S)-2-аминопропанамидо)пропанамидо)бензил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-карбоновой кислотой (всего 0,170 г, 0,115 моль и выход каждого соединения 10%). ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d₆) δ 10,00 (d, J=3,3 Гц, 2H), 8,42 (d, J=34,2 Гц, 2H), 8,30 (s, 1H), 7,48-7,37 (m, 3H), 7,38-7,29 (m, 5H), 7,31-7,15 (m, 8H), 6,92 (d, J=7,6 Гц, 2H), 6,28 (ddd, J=10,3, 6,6, 1,9 Гц, 3H), 6,12 (d, J=3,7 Гц, 3H), 5,77-5,53 (m, 3H), 5,45 (d, J=7,7 Гц, 3H), 5,04-4,99 (m, 1H), 4,94 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,50 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,40 (s, 3H), 4,23-4,12 (m, 2H), 3,54 (dq, J=17,6, 6,9 Гц, 1H), 2,71-2,56 (m, 1H), 2,30-2,15 (m, 1H), 2,03 (d, J=14,2 Гц, 2H), 1,94 (d, J=14,3 Гц, 1H), 1,84 (d, J=14,1 Гц, 1H), 1,76-1,59 (m, 7H), 1,49 (d, J=2,6 Гц, 8H), 1,39-1,10 (m, 13H), 1,00 (s, 4H), 0,86 (s, 3H).

Стадия 3. Синтез (S)-N-(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-2-((S)-2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)пропанамидо)пропанамида

К имеющему комнатную температуру раствору (S)-2-амино-N-((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)пропанамида (0,170 г, 0,227 ммоль) и N-сукцинимидил-3-малеимидопропионата (0,0691 г, 0,260 ммоль) в DMF (2,5 мл) добавляли диизопропилэтиламин (0,1 мл, 0,573 ммоль). Через 30 мин. pH реакционной смеси регулировали до показателя 4-5 путем добавления по каплям 7% раствора TFA в воде (1,2 мл). Неочищенную смесь очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250×50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 90 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-20 мин. линейный градиент 15-85% A, удерживание 2 мин.). Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении для удаления летучих растворителей и полученный раствор замораживали и лиофилизировали с получением твердого вещества белого цвета (85,2 мг, 0,0473 ммоль, выход 21%). LC-MS (Способ R, Таблица 7) R_t=0,82 мин, масса/заряд=899,92 [M+H⁺]. Данные ¹H ЯМР соответствовали смеси 1:1 указанного в заголовке соединения (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)пропанамидо)пропанамидо)бензил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-додекагидро-8bH-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-карбоновой кислоты (см. пример 10 для альтернативного получения указанного в заголовке соединения, которое позволяет избежать данной смеси).. MS-анализ подтверждает, что данный материал представляет собой смесь из двух соединений с массой/зарядом=899,1 [M+H⁺] и массой/зарядом=885,0 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 9,71 (s, 2H), 8,16 (d, J=7,1 Гц, 2H), 8,03 (d, J=7,3 Гц, 2H), 7,49-7,29 (m, 9H), 7,30-7,13 (m, 9H), 6,96 (s, 3H), 6,92-6,85 (m, 2H), 6,27 (dt, J=10,1, 1,9 Гц, 2H), 6,11 (d, J=2,3 Гц, 2H), 5,74-5,53 (m, 2H), 5,46 (d, J=23,9 Гц, 4H), 4,93 (d, J=5,0 Гц, 1H), 4,32 (p, J=7,1 Гц, 2H), 4,27-4,13 (m, 3H), 4,17 (s, 3H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 4H), 2,69-2,53 (m, 2H), 2,38 (t, J=7,3 Гц, 4H), 2,28 (s, 3H), 2,22 (s, 1H), 2,08-1,98 (m, 1H), 1,98-1,90 (m, 1H), 1,83-1,68 (m, 2H), 1,69 (s, 2H), 1,66 (s, 2H), 1,48 (d, J=3,7 Гц, 8H), 1,25 (d, J=7,0 Гц, 6H), 1,15 (d, J=7,1 Гц, 6H), 0,99 (s, 3H), 0,84 (s, 3H).

Пример 10. Синтез (S)-N-(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-2-((S)-2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)пропанамидо)пропанамида

Стадия 1. Синтез трет-бутил((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S, 8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата

HATU (610 мг, 1,605 ммоль) и 2,6-лутидин (0,3 мл, 2,58 ммоль) добавляли к имеющей комнатную температуру смеси (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (648,1 мг, 1,070 ммоль) и (S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропанамидо)пропановой кислоты (334 мг, 1,284 ммоль) в THF (11,5 мл). Через 9 часов реакционную смесь разбавляли EtOAc (16 мл), затем промывали 1 н. водным раствором HCl (4 мл x 3), после этого насыщенным водно-солевым раствором (4 мл). При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 40 г) с градиентом элюирования 0-10% MeOH/DCM получали указанное в заголовке соединение в виде желтой пены (773,7 мг, 0,912 ммоль, выход 85%). LC-MS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,92 мин, масса/заряд=848,53 [M+H⁺].

Стадия 2. Синтез (S)-2-амино-N-((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)пропанамида

К имеющему комнатную температуру раствору трет-бутил((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата (0,7683 г, 0,906 ммоль) в DCM (6,0 мл) добавляли по каплям TFA (1,97 мл, 25,6 ммоль). Через 50 мин. удаляли растворитель при пониженном давлении с получением сиропа коричневого цвета. Остаток растворяли в DMSO:MeOH 1:1 (12 мл) и очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250×50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 90 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-20 мин. линейный градиент 15-75% A, удерживание 2 мин., 22,0-22,5 мин. линейный градиент 75-95% A, удерживание 4 мин.). Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении до сухого состояния и остаток высушивали в течение ночи в вакуумной печи при 50°C с получением указанного в заголовке соединения (230 мг, 0,308 ммоль, выход 34%). LC-MS (Способ r, Таблица 7) основной изомер ацеталя R_t=0.73 мин, m/z=748,78 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 10,01 (s, 1H), 8,62 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,04 (d, J=5,4 Гц, 3H), 7,46-7,31 (m, 4H), 7,31-7,13 (m, 4H), 6,91 (d, J=7,6 Гц, 1H), 6,27 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,11 (s, 1H), 5,76-5,47 (m, 2H), 5,43 (s, 1H), 4,93 (d, J=4,6 Гц, 1H), 4,49 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,42 (q, J=7,1 Гц, 1H), 4,23-4,13 (m, 2H), 2,72-2,54 (m, 1H), 2,33-2,16 (m, 2H), 2,02 (dt, J=13,6, 3,6 Гц, 1H), 1,69 (h, J=5,9, 5,1 Гц, 3H), 1,48 (s, 4H), 1,33 (d, J=7,0 Гц, 3H), 1,30 (d, J=7,1 Гц, 3H), 0,85 (s, 3H).

К имеющему комнатную температуру раствору (S)-2-амино-N-((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)пропанамида (0,220 г, 0,294 ммоль) и N-сукцинимидил-3-малеимидопропионата (0,086 г, 0,324 ммоль) в DMF (2,8 мл) добавляли диизопропилэтиламин (0,1 мл, 0,573 ммоль). Через 30 мин. pH реакционной смеси регулировали до показателя 4-5 путем добавления по каплям 7% раствора TFA в воде (1,0 мл). Неочищенную смесь очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250×50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 90 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-20 мин. линейный градиент 15-85% A, удерживание 2 мин.). Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении для удаления летучих растворителей и полученный раствор замораживали и лиофилизировали с получением твердого вещества белого цвета (175,2 мг, 0,195 ммоль, выход 66%). LC-MS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,82 мин, масса/заряд=899,87 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 9,70 (s, 1H), 8,14 (d, J=7,0 Гц, 1H), 8,01 (d, J=7,2 Гц, 1H), 7,47-7,35 (m, 2H), 7,32 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,26-7,10 (m, 4H), 6,95 (s, 1H), 6,87 (dt, J=7,6, 1,3 Гц, 1H), 6,26 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,09 (d, J=2,0 Гц, 1H), 5,72-5,51 (m, 1H), 5,48 (s, 1H), 5,41 (s, 1H), 4,91 (d, J=4,9 Гц, 1H), 4,47 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,30 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,25-4,11 (m, 3H), 3,85 (s, 2H), 3,57 (t, J=7,3 Гц, 2H), 2,71-2,48 (m, 1H), 2,36 (dd, J=8,0, 6,7 Гц, 2H), 2,23 (ddt, J=25,1, 12,2, 6,6 Гц, 2H), 2,01 (dt, J=13,7, 3,7 Гц, 1H), 1,75-1,57 (m, 3H), 1,48 (p, J=11,9 Гц, 1H), 1,46 (s, 3H), 1,24 (d, J=7,2 Гц, 3H), 1,13 (d, J=7,2 Гц, 3H), 0,83 (s, 3H).

Пример 11. Синтез (S)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-3-(1H-имидазол-4-ил)пропанамида

Стадия 1. Синтез (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(1H-имидазол-5-ил)пропановой кислоты, 2 хлористоводородной кислоты

К раствору (S)-2-амино-3-(1H-имидазол-5-ил)пропановой кислоты (1,55 г, 9,99 ммоль) в воде (40 мл) и 1,4-диоксане (10 мл) при 0°C добавляли NaOH (10 мл, 19,98 ммоль) и BOC-ангидрид (2,319 мл, 9,99 ммоль). Полученную смесь перемешивали при 23°C в течение 4 ч. Затем смесь подкисляли раствором HCl до pH 5 и промывали с помощью EtOAc (3 X 30 мл). Далее неорганический слой сублимировали с получением указанного в заголовке соединения (включая NaCl)) (4,449 г, 9,90 ммоль, выход 99%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 1,22 мин, масса/заряд 256,2 (M+1)⁺.

Стадия 2. Синтез трет-бутил((S)-1-(((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S, 8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-(1H-имидазол-5-ил)-1-оксопропан-2-ил)карбамата

К раствору (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(1H-имидазол-5-ил)пропановой кислоты, 2хлористоводородной кислоты (170 мг, 0,197 ммоль), (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(1H-имидазол-5-ил)пропановой кислоты, 2 хлористоводородной кислоты (443 мг, 0,986 ммоль) в THF (20 мл) при 0°C добавляли DIPEA (0,345 мл, 1,973 ммоль) и HATU (90 мг, 0,237 ммоль), DMAP (31,3 мг, 0,256 ммоль) и полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 10 мин., и обеспечивали постепенное нагревание до 25°C в течение 16 ч. После этого смесь концентрировали с получением остатка, который очищали с помощью DCM/MeOH (10:1) и силикагеля с получением указанного в заголовке соединения (194 мг, 0,138 ммоль, выход 69,9%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 1,72 мин, масса/заряд 985,3 (M+1)⁺; ¹H ЯМР: (400 МГц, DMSO-d6) δ ppm: 0,82-0,89 (m, 10H), 1,12-1,18 (m, 9H), 1,23 (s, 9H), 1,68-1,71 (m, 2H), 2,20-2,33 (m, 2H), 3,86-3,88 (m, 2H), 4,18-4,29 (m, 4H), 4,36-4,39 (m, 1H), 4,49-4,54 (m, 1H), 4,94 (d, J= 4,4 Гц, 1H), 5,13 (bs, 1H), 5,45 (s, 1H), 5,57-5,74 (m, 2H), 6,12(s, 1H), 6,29 (d, J= 10,0 Гц, 1H), 6,91 (d, J= 8,0 Гц, 1H), 7,01 (d, J= 8,0 Гц, 1H), 7,10-7,25 (m, 4H), 7,29-7,37 (m, 3H), 7,44-7,49 (m, 2H), 8,06 (d, J= 6,0 Гц, 1H).

Стадия 3. Синтез (S)-2-амино-N-((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS, 10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-3-(1H-имидазол-5-ил)пропанамида, 3трифторуксусной кислоты

К раствору трет-бутил((S)-1-(((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-(1H-имидазол-5-ил)-1-оксопропан-2-ил)карбамата (120 мг, 0,122 ммоль) в DCM (3 мл) добавляли TFA (0,6 мл, 7,79 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 20°C в течение 1 часа. После этого смесь разбавляли с помощью DCM, концентрировали под вакуумом при температуре приблизительно 25°C с получением указанного в заголовке соединения (149 мг, 0,103 ммоль, выход 84,90%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 1,64 мин, масса/заряд 885,3 (M+1)⁺.

Стадия 4. Синтез (S)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-3-(1H-имидазол-4-ил)пропанамида

DIPEA (0,106 мл, 0,607 ммоль) добавляли к раствору (S)-2-амино-N-((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-3-(1H-имидазол-5-ил)пропанамида, 3трифторуксусной кислоты (149 мг, 0,121 ммоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (48,5 мг, 0,182 ммоль) в DMF (2 мл) при 0°C, а затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь очищали посредством Prep-HPLC (подвижная фаза: A=0,05% TFA в воде, B=MeCN; расход: 2 мл/мин.) с получением указанного в заголовке соединения (11,4 мг, 9,02 ммоль, выход 7,43%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ m, Таблица 7) RT= 1,62 мин, масса/заряд 1058,3 (M+Na)⁺; ¹H ЯМР: (400 МГц, DMSO-d) δ ppm: 0,86 (s, 3H), 1,24-1,29 (m, 9H), 1,46-1,54 (m, 3H), 1,68-1,76 (m, 2H), 1,98-2,06 (m, 2H), 2,20-2,33 (m, 2H), 2,40-2,44 (m, 2H), 2,60-2,68 (m, 1H), 2,88-2,94 (m, 1H), 3,00-3,05 (m, 1H), 3,57 (t, J= 7,4 Гц, 2H), 3,89 (s, 2H), 4,18-4,39 (m, 4H), 4,49-4,60 (m, 2H), 4,95 (d, J= 4,8 Гц, 1H), 5,46 (s, 1H), 5,54-5,74 (m, 2H), 6,13 (s, 1H), 6,30 (d, J= 10,4 Гц, 1H), 6,92 (d, J= 7,6 Гц, 1H), 7,00 (s, 2H), 7,20-7,28 (m, 4H), 7,35-7,46 (m, 5H), 8,16 (d, J= 6,4 Гц, 1H), 8,23 (d, J= 7,2 Гц, 1H), 8,31 (d, J= 8,4 Гц, 1H), 8,96 (s, 1H), 9,89 (s, 1H).

Пример 12. Синтез (S)-5-(((S)-1-((4-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-4-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-5-оксопентановой кислоты (соед. № 81)

Стадия 1. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-8b-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)ацетил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

К перемешиваемому раствору (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (62,4 мг, 0,1 ммоль) и имидазола (34,0 мг, 0,500 ммоль) в DCM добавляли TBS-Cl (45,2 мг, 0,300 ммоль) при 0°C. После этого перемешивание продолжали в течение 30 мин. при той же температуре, далее обеспечивали нагревание смеси до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOAc (10 мл), промывали водой (2×10 мл) и солевым раствором (1×10 мл), высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток очищали посредством колонки (EA:PE= 1:10-1:1) с получением продукта, представляющего собой (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-8b-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)ацетил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-он (50 мг, 0,068 ммоль, выход 67,8%). LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 2,144 мин, масса/заряд 738 (M+H).

Стадия 2. Синтез трет-бутил((S)-1-((4-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)ацетил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата

К перемешиваемому раствору (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-8b-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)ацетил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (0,148 г, 0,2 ммоль) и (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропановой кислоты (0,076 г, 0,400 ммоль) в DCM (3 мл) добавляли пиридин (0,162 мл, 2,000 ммоль), после чего добавляли по каплям POCl₃ (0,075 мл, 0,800 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при температуре окружающей среды, затем концентрировали in vacuo и остаток очищали посредством колонки (EA:PE=1:10-9:1) с получением трет-бутил((S)-1-((4-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)ацетил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата (0,073 г, 0,080 ммоль, выход 40%) в виде полутвердого вещества. LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 2,156 мин, масса/заряд 909 (M+H).

Стадия 3. Синтез (S)-2-амино-N-(4-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)пропанамида

К перемешиваемому раствору трет-бутил((S)-1-((4-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)ацетил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата (0,091 г, 0,1 ммоль) в метиленхлориде (1 мл) добавляли TFA (1 мл, 12,98 ммоль) и раствор перемешивали в течение 2 часов при температуре окружающей среды, затем концентрировали in vacuo с получением продукта, представляющего собой (S)-2-амино-N-(4-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)пропанамид (7,21 г, 10,38 ммоль, выход 80%). LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 1,653 мин, масса/заряд 695 (M+H).

Стадия 4. Синтез (S)-5-(трет-бутокси)-2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-5-оксопентановой кислоты

К перемешиваемому раствору (S)-2-амино-5-(трет-бутокси)-5-оксопентановой кислоты (406 мг, 2 ммоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (532 мг, 2,000 ммоль) в диметилформамиде (2 мл) добавляли DIPEA (0,524 мл, 3,00 ммоль). После этого перемешивание продолжали в течение 2 ч. при комнатной температуре, реакционную смесь разбавляли EtOAc (10 мл), промывали водой (2 X 10 мл) и солевым раствором (1×10 мл), высушивали над Na₂SO₄,

фильтровали и концентрировали in vacuo и остаток очищали посредством колонки (MeOH/DCM=0:10-1:10) с получением указанного в заголовке соединения (209 мг, 0,590 ммоль, выход 29,5%) в виде желтого масла. LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 1,490 мин, масса/заряд 377 (M+Na).

Стадия 5. Синтез (S)-трет-бутил-5-(((S)-1-((4-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS, 8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-4-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-5-оксопентанoата

Раствор (S)-2-амино-N-(4-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b, 11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)пропанамида (40 мг, 0,058 ммоль), (S)-5-(трет-бутокси)-2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-5-оксопентановой кислоты (30,6 мг, 0,086 ммоль), HATU (32,8 мг, 0,086 ммоль) и DIPEA (0,030 мл, 0,173 ммоль) в диметилформамиде (2 мл) перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и разбавляли EtOAc (10 мл), промывали водой (2 X 10 мл) и солевым раствором (1×10 мл), высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (MeOH/DCM=0:10;1:10) с получением указанного в заголовке соединения (30 мг, 0,029 ммоль, выход 50,5%). LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 2,051 мин, масса/заряд 1031 (M+H).

Стадия 6. Синтез (S)-5-(((S)-1-((4-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-4-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-5-оксопентановой кислоты

К перемешиваемому раствору (S)-трет-бутил-5-(((S)-1-((4-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R, 11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-4-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-5-оксопентанoата (10,31 мг, 0,01 ммоль) в DCM (0,5 мл) добавляли TFA (0,5 мл, 6,49 ммоль). После этого перемешивание продолжали в течение 2 ч., реакционную смесь концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (6,83 мг, 7,00 мкмоль, выход 70%). LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 1,875 мин, масса/заряд 975 (M+H).

Пример 13. Синтез N-(4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенокси)фенил)-1-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-додекаоксанонатриаконтан-39-амида

Стадия 1. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-аминофенокси)фенил)-8b-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)ацетил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

К перемешиваемому раствору (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-аминофенокси)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (290 мг, 0,477 ммоль) и имидазола (162 мг, 2,386 ммоль) в CH₂Cl₂ (10 мл) добавляли TBS-Cl (216 мг, 1,432 ммоль) при 0°C. После этого перемешивание продолжали в течение 30 мин. при той же температуре, далее обеспечивали нагревание смеси до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOAc (10 мл), промывали водой (2×10 мл) и солевым раствором (1×10 мл), высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток очищали посредством колонки (EA:PE= 1:10-9:1) с получением указанного в заголовке соединения (300 мг, 0,416 ммоль, выход 87%). LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 1,812 мин, масса/заряд 722 (M+H).

Стадия 2. Синтез трет-бутил(39-((4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)ацетил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенокси)фенил)амино)-39-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-додекаоксанонатриаконтил)карбамата

К перемешиваемому раствору (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-аминофенокси)фенил)-8b-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)ацетил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (144 мг, 0,2 ммоль) и 2,2-диметил-4-оксо-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-тридекаокса-5-азатетратетраконтан-44-овой кислоты (144 мг, 0,200 ммоль) в CH₂Cl₂ (3 мл) добавляли пиридин (0,162 мл, 2,000 ммоль), после чего добавляли по каплям POCl₃ (0,037 мл, 0,400 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при температуре окружающей среды, затем концентрировали in vacuo и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (MeOD:DCM=0:10-1:10) с получением указанного в заголовке соединения (120 мг, 0,084 ммоль, выход 42,2%) в виде полутвердого вещества. LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 2,065 мин, масса/заряд 1422 (M+H-100).

Стадия 3. Синтез 1-амино-N-(4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенокси)фенил)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-додекаоксанонатриаконтан-39-амида

К перемешиваемому раствору трет-бутил(39-((4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS, 12bS)-8b-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)ацетил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенокси)фенил)амино)-39-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24, 27,30,33,36-додекаоксанонатриаконтил)карбамата (190 мг, 0,134 ммоль) в метиленхлориде (0,5 мл) добавляли TFA (0,1 мл, 1,298 ммоль) и раствор перемешивали в течение 2 часов при температуре окружающей среды, затем концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (100 мг, 0,083 ммоль, выход 62,0%). LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 1,521 мин, масса/заряд 1208 (M+H).

Стадия 4. Синтез N-(4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенокси)фенил)-1-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-додекаоксанонатриаконтан-39-амида

К раствору 1-амино-N-(4-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенокси)фенил)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-додекаоксанонатриаконтан-39-амида (0,024 г, 0,02 ммоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (7,99 мг, 0,030 ммоль) в N,N-диметилформамиде (1 мл) добавляли DIPEA (6,99 мкл, 0,040 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOAc (10 мл) и промывали водой (2×10 мл), солевым раствором (1×10 мл), высушивали над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (MeOH/DCM=0:100-10:100) с получением указанного в заголовке соединения (0,011 г, 8,20 мкмоль, выход 41%). LCMS (Способ m, Таблица 7) R_t= 1,679 мин, масса/заряд 1359 (M+H).

Пример 14. Синтез 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-6-оксогексанoата (соед. № 78)

Раствор (S)-2-амино-N-((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)пропанамида (0,060 г, 0,080 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (0,14 мл, 0,802 ммоль) в DMSO (1 мл) добавляли по каплям к имеющему комнатную температуру раствору бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)адипата (0,273 г, 0,802 ммоль) в DMSO (3,5 мл). Через 60 мин. реакцию гасили посредством добавления 7 вес. % раствора TFA в воде с доведением pH реакционной смеси до показателя 4-5. Неочищенную реакционную смесь очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 5 микрон, Phenomenex (колонка 250×21 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% муравьиной кислоты в воде (B) при расходе 30 мл/мин. (0-1,0 мин. 15% A, 1,0-11 мин. линейный градиент 15-80% A, удерживание 1 мин.). Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении для удаления летучих растворителей и полученный раствор замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета (21,2 мг, 0,022 ммоль, выход 27%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,80 мин, масса/заряд=1005,1 [M+MeOH+H⁺]. ¹H ЯМР (DMSO) δ 0,84 (s, 3H), 1,17 (d, J=7,1Гц, 3H), 1,25 (d, J=7,1Гц, 3H), 1,48 (s, 4H), 1,57 (q, J=6,2Гц, 4H), 1,68 (dq, J=13,7, 6,3Гц, 3H), 1,99-2,06 (m, 1H), 2,09-2,18 (m, 2H), 2,18-2,36 (m, 2H), 2,55-2,72 (m, 3H), 2,78 (s, 4H), 3,87 (s, 2H), 4,14-4,22 (m, 2H), 4,26 (p, J=7,1Гц, 1H), 4,33 (p, J=7,1Гц, 1H), 4,49 (d, J=19,4Гц, 1H), 4,93 (d, J=5,1Гц, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,49 (d, J=5,4Гц, 1H), 5,54-5,75 (m, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,28 (dd, J=10,2, 2,0Гц, 1H), 6,89 (d, J=7,6Гц, 1H), 7,17 (t, J=7,9Гц, 1H), 7,23 (t, J=9,7Гц, 3H), 7,34 (d, J=7,8Гц, 2H), 7,39 (s, 1H), 7,44 (d, J=8,1Гц, 1H), 7,99 (d, J=7,2Гц, 1H), 8,02 (d, J=7,3Гц, 1H), 9,77 (s, 1H); MS (ESI-) масса/заряд=971.

Пример 15. Синтез трет-бутил((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамата

HATU (106 мг, 0,280 ммоль) и 2,6-лутидин (0,1 мл, 0,859 ммоль) добавляли к имеющей комнатную температуру суспензии (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (113 мг, 0,187 ммоль) и (трет-бутоксикарбонил)-L-валил-L-аланина (53,8 мг, 0,187 ммоль) в THF (1,25 мл). Через 8 ч. реакционную смесь разбавляли EtOAc (16 мл), затем промывали последовательно 1 M водным раствором HCl (4 мл x 3), насыщенным водным раствором NaHCO₃ (4 мл) и затем насыщенным водно-солевым раствором (4 мл). Растворитель удаляли при пониженном давлении и продукт очищали посредством хроматографии (12 г диоксида кремния) с градиентом элюирования 0-10% MeOH/DCM с получением указанного в заголовке соединения (148,6 мг, 0,170 ммоль, выход 91%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,94 мин, масса/заряд=875,9 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 9,85 (s, 1H), 7,99 (d, J=7,1 Гц, 1H), 7,43 (dd, J=8,0, 1,7 Гц, 1H), 7,36-7,31 (m, 3H), 7,27-7,15 (m, 5H), 6,89 (d, J=7,5 Гц, 1H), 6,67 (d, J=8,8 Гц, 1H), 6,27 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,11 (s, 1H), 5,73-5,52 (m, 1H), 5,50 (dd, J=4,5, 1,7 Гц, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,07 (t, J=5,9 Гц, 1H), 4,93 (d, J=4,8 Гц, 1H), 4,49 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,37 (t, J=7,0 Гц, 1H), 4,25-4,12 (m, 2H), 3,87 (s, 2H), 3,80 (t, J=7,7 Гц, 1H), 2,73-2,53 (m, 1H), 2,23 (ddd, J=18,7, 11,9, 6,0 Гц, 2H), 2,08-1,99 (m, 1H), 1,93 (q, J=7,0 Гц, 1H), 1,77-1,59 (m, 3H), 1,48 (s, 3H), 1,35 (s, 9H), 1,25 (d, J=7,0 Гц, 3H), 0,89-0,74 (m, 9H).

Пример 16. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10-триметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она и (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10-триметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Стадия 1. Синтез 1-(4-((4-бромфенил)тио)фенил)этанона

К перемешиваемому раствору 4-бромбензолтиола (3,1 г, 16,40 ммоль) и K₂CO₃ (2,72 г, 19,67 ммоль) в DMF (45 мл) добавляли 1-(4-фторфенил)этанон (2,19 мл, 18,04 ммоль), после чего реакционную смесь нагревали до 100°C в течение 20 мин. Реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды, разбавляли водой (50 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (3 X 50 мл). Объединенные органические вещества высушивали (MgSO₄) и удаляли растворители при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 120 г) с градиентом элюирования 0-60% EtOAc/гептаны получали указанное в заголовке соединение (3,24 г, 10,55 ммоль, выход 64%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,95 мин; масса/заряд=307,0 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 7,87 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7,62 (d, J=8,6 Гц, 2H), 7,38 (d, J=8,6 Гц, 2H), 7,28 (d, J=8,7 Гц, 2H), 2,50 (s, 3H).

Стадия 2. Синтез трет-бутил(4-((4-ацетилфенил)тио)фенил)карбамата

Через смесь 1-(4-((4-бромфенил)тио)фенил)этанона (3,24 г, 10,55 ммоль), трет-бутилкарбамата (1,483 г, 12,66 ммоль), Cs₂CO₃ (5,15 г, 15,82 ммоль) и дициклогексил(2',4',6'-триизопропил-[1,1'-бифенил]-2-ил)фосфина (0,503 г, 1,055 ммоль) в 1,4-диоксане барботировали азот в течение 30 мин. Колбу вакуумировали и обратно заполняли N₂ (3X). Добавляли Pd₂dba₃ (0,290 г, 0,316 ммоль), реакционную смесь вакуумировали и колбу обратно заполняли N₂ (3X). Реакционную смесь нагревали до 100°C в течение 18 ч. Реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды, обрабатывали водой (75 мл), затем экстрагировали с помощью EtOAc (3 X 50 мл), высушивали (MgSO₄) и удаляли растворители при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 120 г) с градиентом элюирования 0-60% EtOAc/гептаны получали указанное в заголовке соединение (2,0 г, 5,82 ммоль, выход 55%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,96 мин; масса/заряд=344,0 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 9,62 (s, 1H), 7,82 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7,58 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7,43 (d, J=6,7 Гц, 2H), 7,11 (d, J=8,7 Гц, 2H), 2,49 (s, 3H), 1,47 (s, 9H).

Стадия 3. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10-триметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она и (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10-триметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Трифлатную кислоту (0,431 мл, 4,85 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C взвеси (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-дифтор-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (0,400 г, 0,970 ммоль), трет-бутил(4-((4-ацетилфенил)тио)фенил)карбамата (0,366 г, 1,067 ммоль) и MgSO₄ (0,350 г, 2,91 ммоль) в MeCN (4,0 мл). Через 30 мин. реакционную смесь разбавляли EtOAc (25 мл), промывали последовательно насыщенным водным раствором NaHCO₃ (20 мл), насыщенным водно-солевым раствором (25 мл), высушивали (MgSO₄), а затем удаляли растворитель при пониженном давлении с получением желтой пены. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 40 г) с градиентом элюирования 0-10% MeOH/DCM получали продукт в виде смеси изомеров кеталя (460 мг, 0,721 ммоль, выход 74%). Порцию данного материала очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250 X 50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 90 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-18 мин. линейный градиент 15-75% A, затем удерживание 5 мин.). Объединенные фракции концентрировали для удаления летучих растворителей при пониженном давлении и полученные растворы замораживали и лиофилизировали с получением изомеров кеталя в виде твердых веществ желтого цвета. Минорный изомер кеталя: (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10-триметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-он. Порошок желтого цвета (10,0 мг). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,80 мин; масса/заряд=638,2 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d₆) δ 7,33 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7,23 (dd, J=10,1, 1,5 Гц, 1H), 7,19-7,12 (m, 2H), 6,96 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,76-6,63 (m, 2H), 6,29 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,10 (s, 1H), 5,66-5,45 (m, 2H), 5,14 (d, J=5,8 Гц, 1H), 4,65 (d, J=19,3 Гц, 1H), 4,22-4,07 (m, 2H), 2,48-2,35 (m, 1H), 2,14-2,04 (m, 1H), 2,02-1,91 (m, 1H), 1,77-1,64 (m, 2H), 1,63-1,56 (m, 1H), 1,50 (dd, J=13,2, 6,3 Гц, 1H), 1,44 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 1,14-0,98 (m, 1H), 0,80 (s, 3H). Основной изомер кеталя: (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10-триметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-он. Порошок желтого цвета (18,1 мг). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,85 мин; масса/заряд=638,2 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d₆) δ 7,28 (d, J=10,2 Гц, 1H), 7,20 (dd, J=8,4, 7,2 Гц, 4H), 6,95 (d, J=8,4 Гц, 2H), 6,73 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,31 (d, J=12,0 Гц, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,75-5,57 (m, 1H), 5,53 (s, 1H), 5,00 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,22 (d, J=7,2 Гц, 1H), 4,06-3,80 (m, 4H), 2,72-2,55 (m, 1H), 2,39-2,27 (m, 1H), 2,17-2,02 (m, 2H), 1,79-1,56 (m, 3H), 1,50 (d, J=12,4 Гц, 6H), 0,73 (s, 3H).

Пример 17. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10-триметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она и (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10-триметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Трифлатную кислоту (0,24 мл, 2,66 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C взвеси (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (0,200 г, 0,531 ммоль), трет-бутил(4-((4-ацетилфенил)тио)фенил)карбамата (0,201 г, 0,584 ммоль) и MgSO₄ (0,192 г, 1,59 ммоль) в MeCN (2,0 мл). Через 30 мин. реакционную смесь разбавляли EtOAc (15 мл), промывали последовательно насыщенным водным раствором NaHCO₃ (10 мл), а затем насыщенным водно-солевым раствором (10 мл), высушивали (MgSO₄) и удаляли растворитель при пониженном давлении с получением пены желтого цвета. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 24 г) с градиентом элюирования 0-10% MeOH/DCM получали продукт в виде смеси изомеров кеталя (198 мг, 0,329 ммоль, выход 62%). Порцию данного материала очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250 X 50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 90 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-18 мин. линейный градиент 15-75% A, затем удерживание 5 мин.). Объединенные фракции концентрировали для удаления летучих растворителей при пониженном давлении и полученный раствор замораживали и лиофилизировали с получением обоих изомеров кеталя в виде твердых веществ белого цвета. Основной изомер кеталя: (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10-триметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-он. Порошок белого цвета (14,6 мг). LCMS (Способ r; Таблица 7) R_t=0,83 мин; масса/заряд=602,1 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 7,30 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,22-7,12 (m, 4H), 6,91 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,68 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,16 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,91 (s, 1H), 4,93 (d, J=4,6 Гц, 1H), 4,74 (brs, 2H), 4,30 (d, J=2,9 Гц, 1H), 4,02-3,79 (m, 4H), 2,53 (dt, J=14,7, 7,6 Гц, 1H), 2,30 (d, J=14,8 Гц, 1H), 2,16-1,95 (m, 2H), 1,85 (d, J=3,6 Гц, 1H), 1,78-1,67 (m, 2H), 1,55 (td, J=15,2, 13,3, 7,7 Гц, 2H), 1,50 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,13-0,97 (m, 2H), 0,70 (s, 3H). Минорный изомер кеталя: (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)тио)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a,10-триметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-он. Порошок белого цвета (12,0 мг). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,80 мин; масса/заряд=602,1[M+H⁺]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 7,32 (d, J=6,8 Гц, 2H), 7,25 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,13 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,95 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,66 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,13 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,87 (s, 1H), 5,09 (d, J=6,1 Гц, 1H), 4,71 (brs, 1H), 4,62 (d, J=19,3 Гц, 1H), 4,22 (d, J=2,9 Гц, 1H), 4,11 (d, J=19,2 Гц, 2H), 2,47-2,37 (m, 1H), 2,25-2,07 (m, 1H), 1,94 (qd, J=11,3, 3,8 Гц, 1H), 1,87-1,75 (m, 1H), 1,70 (s, 2H), 1,59-1,44 (m, 2H), 1,32 (d, J=5,1 Гц, 6H), 1,18-1,03 (m, 1H), 0,78 (s, 3H), 0,61 (dd, J=11,2, 3,5 Гц, 1H), 0,50 (qd, J=12,9, 4,8 Гц, 1H).

Пример 18. Синтез 2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-аминофенокси)-3-гидроксифенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Стадия 1. Синтез 3-метокси-4-(4-нитрофенокси)бензальдегида

Ванилин (2,5 г, 16,43 ммоль), 4-фторнитробензол (2,61 мл, 24,65 ммоль) и карбонат калия (4,54 г, 32,9 ммоль) растворяли в DMF (15 мл) и перемешивали при 80°C в течение ночи. После охлаждения смесь обрабатывали водой и экстрагировали с помощью EtOAc (x2). Объединенные органические слои промывали водой и солевым раствором, высушивали (Na2SO4) и концентрировали. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 120 г) с градиентом элюирования 0-40% EtOAc в гептанах получали указанное в заголовке соединение в виде твердого вещества светло-желтого цвета (3,37 г, 75%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,88 мин; масса/заряд не проявился. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 10,00 (s, 1H), 8,26-8,17 (m, 2H), 7,72-7,60 (m, 2H), 7,42 (d, J=8,1 Гц, 1H), 7,12-7,03 (m, 2H), 3,82 (s, 3H).

Стадия 2. Синтез 3-гидрокси-4-(4-нитрофенокси)бензальдегида

Трибромборан (110 мл, 110 ммоль) добавляли к имеющему температуру -78°C раствору 3-метокси-4-(4-нитрофенокси)бензальдегида (6,02 г, 22,03 ммоль) в DCM (100 мл). Реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение 1 ч., затем перемешивали при 0°C в течение 5 часов. Смесь смешивали со льдом и экстрагировали с помощью DCM. Объединенные органические слои промывали водой и солевым раствором, высушивали (Na2SO4) и концентрировали. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 120 г) с градиентом элюирования 0-30% EtOAc в гептанах получали указанное в заголовке соединение в виде масла пурпурного цвета (5,55 г, выход 97%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,80 мин; масса/заряд не проявился. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 10,24 (s, 1H), 8,22-8,14 (m, 2H), 7,36 (s, 1H), 7,30 (d, J=2,1 Гц, 1H), 7,15-7,07 (m, 2H), 7,02-6,96 (m, 2H).

Стадия 3. Синтез 4-(4-аминофенокси)-3-гидроксибензальдегида

Хлорид двухвалентного олова (18,29 г, 96 ммоль) добавляли к раствору добавленного 3-гидрокси-4-(4-нитрофенокси)бензальдегида (5 г, 19,29 ммоль), хлорида двухвалентного олова (18,29 г, 96 ммоль) в этаноле (60 мл), который нагревали до 80°C в течение 2 ч. Смесь охлаждали и осторожно смешивали со льдом и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, затем несколько раз экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали (Na2SO4), фильтровали через Celite^® и фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желтого цвета (1,18 г, выход 27%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,48 мин; масса/заряд=не проявился. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,90-9,87 (m, 1H), 10,90-9,26 (m, 2H), 8,66-8,56 (m, 1H), 7,66-7,61 (m, 1H), 7,50-7,46 (m, 1H), 7,46-7,38 (m, 2H), 7,38-7,29 (m, 4H), 7,16-6,99 (m, 6H); MS(ESI-) масса/заряд=227,9 (M-H).

Стадия 4. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(4-аминофенокси)-3-гидроксифенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

К имеющему комнатную температуру раствору 4-(4-аминофенокси)-3-гидроксибензальдегида (0,611 г, 2,67 ммоль) и (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-дифтор-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (1 г, 2,425 ммоль) в THF (70 мл) добавляли перхлорную кислоту (2,64 мл, 24,25 ммоль). Через 16 часов реакционную смесь обрабатывали водой и дважды экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором тиосульфата натрия, затем насыщенным водно-солевым раствором, высушивали (Na2SO4) и удаляли растворитель при пониженном давлении. Этот материал очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 5 микрон, Phenomenex (колонка 250×21 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 30 мл/мин. (0,0-1,0 мин. 15% A, 1,0-10 мин. линейный градиент до 65% A, удерживание 1 мин.). Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении для удаления летучих растворителей и полученный раствор замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке продукта в виде твердого вещества желтого цвета (338,9 мг, выход 23%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,72 мин; MS (ESI+) 624,2 (M+H); ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,88 (s, 2H), 7,28 (dd, 1H), 7,27-7,22 (m, 2H), 7,07 (d, 1H), 7,00 (d, 1H), 6,96-6,88 (m, 3H), 6,30 (dd, 1H), 6,18-6,08 (m, 1H), 5,78-5,67 (m, 1H), 5,65-5,52 (m, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,00-4,95 (m, 1H), 4,53 (d, 1H), 4,27-4,18 (m, 2H), 2,79-2,57 (m, 1H), 2,36-2,28 (m, 1H), 2,24 (td, 1H), 2,13-2,01 (m, 1H), 1,80-1,66 (m, 3H), 1,65-1,52 (m, 1H), 1,51 (s, 3H), 0,88 (s, 3H).

Пример 19. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)сульфонил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Стадия 1. Синтез 4-((4-бромфенил)тио)бензонитрила

Карбонат калия (4,39 г, 31,7 ммоль) добавляли к раствору 4-бромбензолтиола (5,0 г, 26,4 ммоль) и 4-фторбензонитрила (3,20 г, 26,4 ммоль) в DMF (50 мл), который нагревали до 120°C в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждали до 0°C, добавляли воду (100 мл) и смесь экстрагировали с помощью EtOAc (3 X 50 мл). Объединенные органические вещества высушивали (MgSO₄) и удаляли растворитель при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (80 г диоксида кремния) с градиентом элюирования 0-60% EtOAc/гептаны получали указанное в заголовке соединение (6,82 г, 23,5 ммоль, выход 89%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t =0,95 мин; масса/заряд=291,2 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 7,72 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7,65 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7,43 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7,26 (d, J=8,7 Гц, 2H).

Стадия 2. Синтез трет-бутил(4-((4-цианофенил)тио)фенил)карбамата

Через смесь 4-((4-бромфенил)тио)бензонитрила (6,0 г, 20,68 ммоль), трет-бутилкарбамата (2,91 г, 24,81 ммоль), диизопропил(2',4',5'-триизопропил-[1,1'-бифенил]-2-ил)фосфина (0,820 г, 2,068 ммоль) и Cs₂CO₃(10,11 г, 31,0 ммоль) в 1,4-диоксане (207 мл) барботировали азот в течение 30 мин. Колбу вакуумировали и обратно заполняли N₂ (3X). Добавляли Pd₂dba₃(0,568 г, 0,620 ммоль), реакционную смесь вакуумировали и обратно заполняли N₂ (3X раза). Реакционную смесь нагревали до 100°C в течение 28 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, после чего ее обрабатывали водой (200 мл), экстрагировали с помощью EtOAc (3 X 75 мл), высушивали (MgSO₄) и удаляли растворители при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 120 г) с градиентом элюирования 0-30% EtOAc/гептаны получали указанное в заголовке соединение (3,20 г, 9,80 ммоль, выход 47%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=1,0 мин; масса/заряд=344,1 [M+NH₄⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,67 (s, 1H), 7,69 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7,61 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7,47 (d, J=8,7 Гц, 2H), 7,14 (d, J=8,6 Гц, 2H), 1,49 (s, 9H).

Стадия 3. Синтез трет-бутил(4-((4-цианофенил)сульфонил)фенил)карбамата

Порциями добавляли 3-хлорпероксибензойную кислоту (639 мг, 3,71 ммоль) к имеющему комнатную температуру раствору трет-бутил(4-((4-цианофенил)тио)фенил)карбамата (480 мг, 1,471 ммоль) в CH₂Cl₂ (15 мл). Через 30 мин. реакционную смесь разделяли между водой (20 мл) и EtOAc (10 мл). Слои разделяли и водную фазу экстрагировали с помощью EtOAc (2 X 25 мл). Объединенные органические вещества промывали насыщенным водно-солевым раствором (50 мл), высушивали над MgSO₄ и удаляли растворители при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 40 г) с градиентом элюирования 0-60% EtOAc/гептаны получали указанное в заголовке соединение (372 мг, 1,04 ммоль, выход 71%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,86 мин; масса/заряд=376,0 [M+NH₄⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,92 (s, 1H), 8,06 (s, 4H), 7,87 (d, J=8,9 Гц, 2H), 7,66 (d, J=9,0 Гц, 2H), 1,45 (s, 9H).

Стадия 4. Синтез трет-бутил(4-((4-формилфенил)сульфонил)фенил)карбамата

Диизобутилалюминия гидрид (6,53 мл, 1,0 M в толуоле, 6,53 ммоль) добавляли по каплям в течение 5 минут к имеющему температуру 0°C раствору трет-бутил(4-((4-цианофенил)сульфонил)фенил)карбамата (0,780 г, 2,176 ммоль) в THF (20 мл). Через 30 мин. добавляли диизобутилалюминия гидрид (1,0 M в толуоле) (2,176 мл, 2,176 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 0°C дополнительно 1 ч. Реакцию гасили при 0°C путем медленного добавления 1 н. водного раствора HCl (120 мл) и экстрагировали водную фазу с помощью EtOAc (2 X 75 мл). Объединенные органические вещества промывали насыщенным водно-солевым раствором (50 мл), высушивали над MgSO₄ и удаляли растворители при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 80 г) с градиентом элюирования 0-10% CH₂Cl₂/MeOH получали указанное в заголовке соединение (0,275 г, 0,761 ммоль, выход 35%) в виде масла желтого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,83 мин; масса/заряд=359,9 [M-H^-]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 10,04 (s, 1H), 9,89 (s, 1H), 8,18-7,97 (m, 4H), 7,85 (d, J=8,9 Гц, 2H), 7,64 (d, J=8,9 Гц, 2H), 1,43 (s, 9H).

Стадия 5. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((4-аминофенил)сульфонил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

Трифлатную кислоту (0,12 мл, 1,328 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C взвеси (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (0,100 г, 0,266 ммоль), трет-бутил(4-((4-формилфенил)сульфонил)фенил)карбамата (0,106 г, 0,292 ммоль) и MgSO₄ (0,096 г, 0,797 ммоль) в MeCN (1,0 мл). Через 30 минут реакционную смесь разбавляли EtOAc (15 мл), затем промывали насыщенным водным раствором NaHCO₃ (10 мл), после этого насыщенным водно-солевым раствором (10 мл), и высушивали (MgSO₄). При удалении растворителя при пониженном давлении получали пену светло-желтого цвета, которую очищали посредством хроматографии (диоксид кремния, 24 г) с градиентом элюирования 0-10% CH₂Cl₂/MeOH с получением бесцветного вещества в стеклообразном состоянии. Изомеры ацеталя разделяли посредством препаративной HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250×30 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 60 мл/мин. (0-3,0 мин. 15% A, 3,0-18 мин. линейный градиент 15-80% A, затем удерживание 5 мин.). Объединенные фракции концентрировали для удаления летучих растворителей при пониженном давлении и полученный раствор замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета (8,0 мг, выход 18%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,76 мин; MS масса/заряд=620,0 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 7,81 (d, J=8,4 Гц, 2H), 7,61 (d, J=8,4 Гц, 2H), 7,49 (d, J=8,8 Гц, 2H), 7,27 (d, J=10,0 Гц, 1H), 6,56 (d, J=8,8 Гц, 2H), 6,12 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,89 (s, 1H), 5,47 (s, 1H), 4,91 (d, J=4,6 Гц, 1H), 4,73 (s, 1H), 4,48 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,24 (s, 1H), 4,13 (d, J=19,5 Гц, 1H), 2,51 (s, 2H), 2,32-2,22 (m, 1H), 2,13-2,01 (m, 1H), 2,02-1,88 (m, 1H), 1,78-1,56 (m, 5H), 1,35 (s, 3H), 1,11-0,96 (m, 2H), 0,82 (s, 3H).

Пример 20. N-(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-3-(2-(2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)этокси)этокси)пропанамид

Стадия 1. Синтез трет-бутил(2-(2-(3-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S, 8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-3-оксопропокси)этокси)этил)карбамата

К имеющему комнатную температуру раствору 2,2-диметил-4-оксо-3,8,11-триокса-5-азатетрадекан-14-овой кислоты (0,100 г, 0,361 ммоль), (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (0,199 г, 0,328 ммоль) и 2,6-диметилпиридина (0,12 мл, 0,983 ммоль) в THF (2,0 мл) добавляли HATU (0,125 г, 0,328 ммоль). Через 24 часа удаляли растворители при пониженном давлении и реакционную смесь очищали посредством хроматографии (диоксид кремния, 24 г) с градиентом элюирования 0-10% MeOH/CH₂Cl₂с получением указанного в заголовке соединения в виде пены светло-желтого цвета (226 мг, 0,261 ммоль, выход 80%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,91 мин, масса/заряд=865,5 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 0,86 (s, 3H), 1,36 (s, 9H), 1,50 (s, 4H), 1,71 (ddt, J=17,9, 13,3, 5,8 Гц, 3H), 1,94-2,14 (m, 2H), 2,18-2,39 (m, 1H), 2,55-2,74 (m, 1H), 3,03 (q, J=6,0 Гц, 2H), 3,48 (hept, J=3,1, 2,7 Гц, 4H), 3,66 (t, J=6,3 Гц, 2H), 3,88 (s, 2H), 4,13-4,26 (m, 2H), 4,51 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,94 (d, J=5,1 Гц, 1H), 5,45 (s, 1H), 5,52 (dd, J=4,3, 1,7 Гц, 1H), 5,65 (dddd, J=48,5, 11,4, 6,7, 2,0 Гц, 1H), 6,13 (d, J=2,1 Гц, 1H), 6,73 (t, J=5,8 Гц, 1H), 6,80-6,97 (m, 1H), 7,18 (t, J=7,8 Гц, 1H), 7,25 (td, J=9,1, 8,2, 1,6 Гц, 3H), 7,32-7,39 (m, 3H), 7,45 (dd, J=8,4, 2,0 Гц, 1H), 7,63 (d, J=7,8 Гц, 1H), 8,11-8,85 (m, 1H), 9,83 (s, 1H).

Стадия 2. 3-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-N-(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)пропанамид

К имеющему комнатную температуру раствору трет-бутил(2-(2-(3-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-3-оксопропокси)этокси)этил)карбамата (226 мг, 0,261 ммоль) в CH₂Cl₂ (3,0 мл) добавляли TFA (1,0 мл, 12,98 ммоль). Через 45 мин. летучие вещества удаляли под вакуумом и неочищенный продукт переносили на следующую стадию без дополнительной очистки, обеспечивая выход 100%. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,80 мин, масса/заряд=765,4 [M+H+].

Стадия 3. Синтез N-(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-3-(2-(2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)этокси)этокси)пропанамида

К имеющему комнатную температуру раствору 3-(2-(2-аминоэтокси)этокси)-N-(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)пропанамида (0,226 г, 0,295 ммоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (0,087 г, 0,325 ммоль) в DMF (2,0 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,155 мл, 0,88 ммоль). Через 45 мин. неочищенную реакционную смесь очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250×50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% муравьиной кислоты в воде (B) при расходе 80 мл/мин. (0-5,0 мин. 18% A, 5,0-25,0 мин. линейный градиент 15-80% A, удерживание 5 мин.). Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении для удаления летучих растворителей и полученный раствор замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета (48 мг, 0,052 ммоль, выход 18%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,84 мин, масса/заряд=916,4 [M+H⁺].¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 0,84 (s, 3H), 1,48 (s, 4H), 1,59-1,76 (m, 3H), 2,03 (d, J=13,9 Гц, 1H), 2,17-2,38 (m, 4H), 2,54-2,72 (m, 1H), 3,11 (q, J=5,8 Гц, 2H), 3,31-3,35 (m, 4H), 3,42-3,51 (m, 4H), 3,57 (dd, J=7,8, 6,8 Гц, 2H), 3,64 (t, J=6,3 Гц, 2H), 3,86 (s, 2H), 4,10-4,25 (m, 2H), 4,49 (dd, J=19,5, 6,0 Гц, 1H), 4,93 (d, J=5,1 Гц, 1H), 5,07 (t, J=5,9 Гц, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,51 (s, 1H), 5,53-5,74 (m, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,28 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,88 (d, J=7,5 Гц, 1H), 6,97 (s, 2H), 7,16 (t, J=7,8 Гц, 1H), 7,20-7,28 (m, 3H), 7,30-7,39 (m, 3H), 7,38-7,48 (m, 1H), 7,96 (t, J=5,6 Гц, 1H), 9,81 (s, 1H).

Пример 21. N-(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-1-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-амид

Получали посредством такой же процедуры, как и в примере 20. Твердое вещество белого цвета (17 мг, 0,017 ммоль, выход 9%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,82 мин, масса/заряд=1026 [M+Na⁺]. ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 0,85 (s, 3H), 1,22 (s, 8H), 1,49 (s, 3H), 1,61-1,77 (m, 2H), 2,03 (d, J=13,9 Гц, 1H), 2,12-2,40 (m, 3H), 2,55-2,66 (m, 1H), 3,12 (q, J=5,8 Гц, 2H), 3,33 (s, 1H), 3,41-3,51 (m, 11H), 3,58 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,65 (t, J=6,3 Гц, 2H), 3,87 (s, 2H), 4,18 (d, J=14,1 Гц, 2H), 4,42-4,61 (m, 1H), 4,93 (d, J=5,2 Гц, 1H), 5,07 (s, 1H), 5,44 (s, 1H), 5,50 (s, 1H), 5,6-5,7 (m, 1H), 6,28 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,88 (d, J=7,8 Гц, 1H), 6,98 (s, 2H), 7,17 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,24 (t, J=9,8 Гц, 3H), 7,32-7,38 (m, 3H), 7,43 (d, J=8,3 Гц, 1H), 7,98 (s, 1H), 9,81 (s, 1H).

Пример 22. N-(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-1-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-амид

Получали посредством такой же процедуры, как и в примере 20. Твердое вещество белого цвета (23,2 мг, 0,021 ммоль, выход 22%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,83 мин, масса/заряд=1092,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 0,84 (s, 3H), 1,48 (s, 4H), 1,58-1,76 (m, 3H), 2,02 (dt, J=14,0, 3,6 Гц, 1H), 2,17-2,37 (m, 4H), 2,62 (dtd, J=24,1, 11,9, 4,4 Гц, 1H), 3,12 (q, J=5,8 Гц, 2H), 3,40-3,52 (m, 23H), 3,57 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,64 (t, J=6,3 Гц, 2H), 3,86 (s, 2H), 4,10-4,25 (m, 2H), 4,49 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,92 (d, J=5,0 Гц, 1H), 5,08 (s, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,49-5,73 (m, 2H), 6,11 (s, 1H), 6,27 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,87 (d, J=7,6 Гц, 1H), 6,97 (s, 2H), 7,16 (t, J=7,8 Гц, 1H), 7,23 (dd, J=13,9, 9,0 Гц, 3H), 7,30-7,38 (m, 3H), 7,43 (d, J=8,1 Гц, 1H), 7,98 (t, J=5,6 Гц, 1H), 9,81 (s, 1H).

Пример 23. N-(3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-1-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-додекаоксанонатриаконтан-39-амид

Получали посредством такой же процедуры, как и в примере 20. Выделяли в виде бесцветного вещества в стеклообразном состоянии (20 мг, 0,015 ммоль, выход 18%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,85 мин, масса/заряд=1356,4 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 0,84 (s, 3H), 1,48 (s, 4H), 1,67 (d, J=14,3 Гц, 3H), 2,03 (d, J=14,0 Гц, 1H), 2,30 (q, J=9,8, 8,5 Гц, 4H), 2,65 (s, 1H), 3,13 (q, J=5,8 Гц, 2H), 3,34 (t, J=6,2 Гц, 2H), 3,39-3,54 (m, 46H), 3,57 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,64 (t, J=6,2 Гц, 2H), 3,86 (s, 2H), 4,18 (d, J=14,6 Гц, 2H), 4,49 (d, J=19,2 Гц, 1H), 4,93 (d, J=4,8 Гц, 1H), 5,07 (s, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,50 (s, 1H), 5,62 (d, J=41,1 Гц, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,20-6,36 (m, 1H), 6,87 (d, J=7,5 Гц, 1H), 6,98 (s, 2H), 7,16 (t, J=7,8 Гц, 1H), 7,23 (t, J=9,0 Гц, 3H), 7,34 (d, J=8,4 Гц, 3H), 7,43 (d, J=8,4 Гц, 1H), 7,97 (s, 1H), 9,80 (s, 1H).

Пример 24. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамид

Во флакон объемом 4 мл добавляли 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропановую кислоту (43,5 мг, 0,26 ммоль) с последующим добавлением HATU (148 мг, 0,39 ммоль), растворенного в DMA (1,0 мл), после этого добавляли чистый N,N-диизопропилэтиламин (67 мкл, 0,39 ммоль). Затем добавляли раствор (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)тио)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (80,83 мг, 0,13 ммоль)(80,83 мг, 0,13 ммоль), растворенного в DMA (0,5 мл). Реакционную смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь проверяли с помощью LC/MS и очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ q, линейный градиент 45-75%) с получением указанного в заголовке соединения. LCMS (Способ s, Таблица 7) R_t=0,78 мин; MS масса/заряд=775,3 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C) δ 7,61-7,57 (m, 1H), 7,49-7,44 (m, 1H), 7,43-7,37 (m, 2H), 7,34-7,22 (m, 4H), 7,06-7,02 (m, 1H), 6,92 (s, 2H), 6,29 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,14-6,09 (m, 1H), 5,72-5,52 (m, 1H), 5,46 (s, 1H), 4,98-4,93 (m, 1H), 4,52 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,26-4,14 (m, 2H), 3,73-3,71 (m, 2H), 3,69-3,65 (m, 2H), 2,73-2,55 (m, 1H), 2,35-2,26 (m, 1H), 2,25-2,12 (m, 1H), 2,03-1,95 (m, 1H), 1,79-1,62 (m, 3H), 1,55-1,39 (m, 4H), 0,85 (s, 3H).

Пример 25. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамид

Получали, как описано в примере 24, из 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексановой кислоты. Очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ s, линейный градиент 50-80%). LCMS (Способ c, Таблица 7) R_t=0,82 мин; MS масса/заряд=817,3 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C) δ 7,68-7,65 (m, 1H), 7,53-7,49 (m, 1H), 7,42-7,38 (m, 2H), 7,33-7,24 (m, 4H), 7,04-7,01 (m, 1H), 6,91 (s, 2H), 6,29 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,14-6,10 (m, 1H), 5,72-5,53 (m, 1H), 5,46 (s, 1H), 4,96-4,92 (m, 1H), 4,51 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,24-4,15 (m, 2H), 3,38 (t, J=7,0 Гц, 2H), 2,70-2,54 (m, 1H), 2,35-2,11 (m, 5H), 2,03-1,96 (m, 1H), 1,76-1,61 (m, 3H), 1,59-1,41 (m, 8H), 1,24-1,13 (m, 2H), 0,85 (s, 3H).

Пример 26. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)бензамид

Получали, как описано в примере 24, из 4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)бензойной кислоты. Очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ s, линейный градиент 50-80%). LCMS (Способ c, Таблица 7) R_t=0,83 мин; MS масса/заряд=823,2 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C) δ 8,02-7,97 (m, 2H), 7,88-7,85 (m, 1H), 7,77-7,73 (m, 1H), 7,52-7,47 (m, 2H), 7,44-7,36 (m, 3H), 7,35-7,30 (m, 2H), 7,29-7,23 (m, 1H), 7,15 (s, 2H), 7,14-7,10 (m, 1H), 6,29 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,15-6,09 (m, 1H), 5,71-5,54 (m, 1H), 5,47 (s, 1H), 4,97-4,94 (m, 1H), 4,52 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,24-4,14 (m, 2H), 2,70-2,57 (m, 1H), 2,37-2,27 (m, 1H), 2,24-2,12 (m, 1H), 2,03-1,97 (m, 1H), 1,75-1,64 (m, 3H), 1,54-1,42 (m, 4H), 0,85 (s, 3H).

Пример 27. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)метил)циклогексанкарбоксамид

Получали, как описано в примере 24, из 4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоновой кислоты. Очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ q, линейный градиент 50-80%). LCMS (Способ s, Таблица 7) R_t=0,85 мин; MS масса/заряд=843,3 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C) δ 7,68 (t, J=2,0 Гц, 1H), 7,54-7,49 (m, 1H), 7,42-7,37 (m, 2H), 7,35-7,22 (m, 4H), 7,04-7,01 (m, 1H), 6,95 (s, 2H), 6,29 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,71-5,53 (m, 1H), 5,46 (s, 1H), 4,99-4,93 (m, 1H), 4,51 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,25-4,15 (m, 2H), 3,26 (d, J=7,0 Гц, 2H), 2,73-2,58 (m, 1H), 2,35-2,14 (m, 3H), 2,03-1,96 (m, 1H), 1,83-1,62 (m, 7H), 1,59-1,40 (m, 5H), 1,37-1,24 (m, 2H), 0,98-0,87 (m, 2H), 0,85 (s, 3H).

Пример 28. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-1-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-амид

Получали, как описано в примере 24, из 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-оксо-7,10,13,16-тетраокса-4-азанонадекан-19-овой кислоты. Очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ s, линейный градиент 45-75%). LCMS (Способ c, Таблица 7) R_t=0,76 мин; MS масса/заряд=1022,4 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C) δ 7,70-7,66 (m, 1H), 7,55-7,50 (m, 1H), 7,43-7,37 (m, 2H), 7,34-7,23 (m, 4H), 7,06-7,01 (m, 1H), 6,92 (s, 2H), 6,29 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,14-6,11 (m, 1H), 5,72-5,53 (m, 1H), 5,46 (s, 1H), 5,00-4,92 (m, 1H), 4,51 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,26-4,15 (m, 2H), 3,66 (t, J=6,1 Гц, 2H), 3,59 (t, J=7,2 Гц, 2H), 3,51-3,40 (m, 11H), 3,33 (t, J=5,8 Гц, 2H), 3,12 (t, J=5,8 Гц, 2H), 2,70-2,58 (m, 1H), 2,51-2,47 (m, 3H), 2,36-2,25 (m, 3H), 2,24-2,13 (m, 1H), 2,04-1,97 (m, 1H), 1,75-1,65 (m, 3H), 1,56-1,42 (m, 4H), 0,85 (s, 3H).

Пример 29. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-амид

Получали, как описано в примере 24, из 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-овой кислоты. Очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ s, линейный градиент 45-75%). LCMS (Способ c, Таблица 7) R_t=0,80 мин; MS масса/заряд=951,3 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C) δ 7,69-7,66 (m, 1H), 7,54-7,49 (m, 1H), 7,42-7,37 (m, 2H), 7,35-7,24 (m, 4H), 7,06-7,01 (m, 1H), 6,93 (s, 2H), 6,29 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,17-6,10 (m, 1H), 5,71-5,55 (m, 1H), 5,46 (s, 1H), 4,98-4,93 (m, 1H), 4,51 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,24-4,16 (m, 2H), 3,66 (t, J=6,1 Гц, 2H), 3,56-3,51 (m, 2H), 3,50-3,36 (m, 14H), 2,71-2,60 (m, 1H), 2,51-2,48 (m, 2H), 2,33-2,27 (m, 1H), 2,18 (q, J=10,5 Гц, 1H), 2,03-1,94 (m, 1H), 1,74-1,66 (m, 3H), 1,56-1,44 (m, 4H), 0,85 (s, 3H).

Пример 30. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-амид

Получали, как описано в примере 24, из 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-овой кислоты. Очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ q, линейный градиент 10-100%). LCMS (Способ s, Таблица 7) R_t=0,80 мин; MS масса/заряд не ионизовалось ; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C) δ 7,69-7,66 (m, 1H), 7,55-7,50 (m, 1H), 7,44-7,37 (m, 2H), 7,34-7,24 (m, 4H), 7,06-7,01 (m, 1H), 6,94 (s, 2H), 6,29 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,69-5,55 (m, 1H), 5,46 (s, 1H), 4,97-4,93 (m, 1H), 4,51 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,23-4,16 (m, 2H), 3,66 (t, J=6,1 Гц, 2H), 3,56-3,38 (m, 22H), 2,70-2,63 (m, 1H), 2,54-2,53 (m, 2H), 2,51-2,48 (m, 2H), 2,33-2,26 (m, 1H), 2,18 (q, J=10,3 Гц, 1H), 2,03-1,97 (m, 1H), 1,73-1,65 (m, 3H), 1,55-1,44 (m, 4H), 0,85 (s, 3H).

Пример 31. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-3-(2-(2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этокси)этокси)этокси)пропанамид

Получали, как описано в примере 24, из 3-(2-(2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этокси)этокси)этокси)пропановой кислоты. Очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ q, линейный градиент 45-75%). LCMS (Способ s, Таблица 7) R_t=0,80 мин; MS масса/заряд=908,1 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C) δ 7,69-7,66 (m, 1H), 7,54-7,51 (m, 1H), 7,42-7,38 (m, 2H), 7,34-7,24 (m, 4H), 7,06-7,02 (m, 1H), 6,93 (s, 2H), 6,29 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,68-5,55 (m, 1H), 5,46 (s, 1H), 4,98-4,94 (m, 1H), 4,51 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,24-4,16 (m, 2H), 3,64 (t, J=6,1 Гц, 2H), 3,55-3,50 (m, 2H), 3,47-3,37 (m, 9H), 2,69-2,66 (m, 1H), 2,54-2,53 (m, 1H), 2,50-2,47 (m, 2H), 2,32-2,25 (m, 1H), 2,21-2,14 (m, 1H), 2,03-1,97 (m, 1H), 1,74-1,65 (m, 3H), 1,54-1,43 (m, 4H), 0,85 (s, 3H).

Пример 32. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-3-(2-(2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)этокси)этокси)пропанамид

Получали, как описано в примере 24, из 3-(2-(2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)этокси)этокси)пропановой кислоты. Очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ q, линейный градиент 45-75%). LCMS (Способ s, Таблица 7) R_t=0,76 мин; MS масса/заряд=934,4 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C) δ 7,69-7,66 (m, 1H), 7,54-7,49 (m, 1H), 7,42-7,38 (m, 2H), 7,34-7,23 (m, 4H), 7,05-7,01 (m, 1H), 6,91 (s, 2H), 6,29 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,68-5,56 (m, 1H), 5,46 (s, 1H), 4,97-4,93 (m, 1H), 4,51 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,24-4,15 (m, 2H), 3,66 (t, J=6,2 Гц, 2H), 3,58 (t, J=7,2 Гц, 2H), 3,51-3,43 (m, 4H), 3,33 (t, J=5,8 Гц, 2H), 3,10 (t, J=5,7 Гц, 2H), 2,63-2,58(m,1H), 2,55-2,53 (m, 1H), 2,50-2,49 (m, 2H), 2,32-2,27 (m, 2H), 2,18 (q, J=10,3 Гц, 1H), 2,03-1,97 (m, 1H), 1,73-1,63 (m, 3H), 1,54-1,42 (m, 4H), 0,85 (s, 3H).

Пример 33. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамид

Получали, как описано в примере 24, из 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)уксусной кислоты. Очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ s, линейный градиент 45-75%). LCMS (Способ c, Таблица 7) R_t=0,95 мин; MS масса/заряд=761,7 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C) δ 7,65-7,61 (m, 1H), 7,52-7,47 (m, 1H), 7,44-7,39 (m, 2H), 7,36 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,33-7,25 (m, 3H), 7,11-7,08 (m, 1H), 7,07 (s, 2H), 6,32 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,15 (s, 1H), 5,72-5,55 (m, 1H), 5,47 (s, 1H), 5,00-4,92 (m, 1H), 4,53 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,30-4,17 (m, 4H), 2,72-2,61 (m, 1H), 2,38-2,28 (m, 1H), 2,19 (q, J=10,3 Гц, 1H), 2,05-1,98 (m, 1H), 1,78-1,64 (m, 3H), 1,60-1,42 (m, 4H), 0,87 (s, 3H).

Пример 34. N-(3-((4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)фенил)тио)фенил)-3-(2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этокси)этокси)пропанамид

Получали, как описано в примере 24, из 3-(2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этокси)этокси)пропановой кислоты. Очищали посредством HPLC с обращенной фазой (способ q, линейный градиент 40-75%). LCMS (Способ c, Таблица 7) R_t=0,95 мин; MS масса/заряд=863,9 (M+H)⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6/D₂O, Температура=27 °C)δ 7,71-7,66 (m, 1H), 7,55-7,51 (m, 1H), 7,44-7,38 (m, 2H), 7,36-7,25 (m, 4H), 7,08-7,03 (m, 1H), 6,91 (s, 2H), 6,31 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,14 (s, 1H), 5,72-5,55 (m, 1H), 5,47 (s, 1H), 4,98-4,94 (m, 1H), 4,53 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,27-4,14 (m, 2H), 3,63 (t, J=6,1 Гц, 2H), 3,53-3,43 (m, 8H), 2,72-2,61 (m, 1H), 2,48 (t, J=6,2 Гц, 2H), 2,35-2,24 (m, 1H), 2,20 (q, J=10,4 Гц, 1H), 2,05-1,96 (m, 1H), 1,76-1,65 (m, 3H), 1,57-1,41 (m, 4H), 0,87 (s, 3H).

Пример 34A. Синтез 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)пропанамида

Стадия 1. Синтез (S)-2-амино-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)пропанамида

К имеющему температуру 0°C раствору (S)-2-((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)пропановой кислоты (765 мг, 2,00 ммоль), (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (600 мг, 1,053 ммоль) в DCM (6 мл) и DMF (12 мл) добавляли HATU (601 мг, 1,580 ммоль) и 2,6-лутидин (0,37 мл, 3,16 ммоль). Через 30 мин. смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. К реакционной смеси добавляли диэтиламин (2,18 мл, 21,06 ммоль) и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 3 ч., после чего удаляли летучие растворители при пониженном давлении. Остаток растворяли в DMSO:MeOH 1:1 (12 мл) и очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250×50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 90 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-20 мин. линейный градиент 15-85% A, удерживание 5 мин.). Объединенные фракции продукта лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества грязно-белого цвета (447 мг, 0,628 ммоль, выход 60%). LC-MS (способ r, Таблица 7) Rt=0,78 мин., масса/заряд=711,9 [M+H]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d₆) δ 10,03 (s, 1H), 8,63 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,07 (d, J=5,4 Гц, 3H), 7,44-7,38 (m, 2H), 7,38-7,34 (m, 2H), 7,29 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,23-7,16 (m, 3H), 6,90 (dt, J=7,7, 1,3 Гц, 1H), 6,14 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,90 (t, J=1,6 Гц, 1H), 5,38 (s, 1H), 4,90 (d, J=5,3 Гц, 1H), 4,52-4,37 (m, 2H), 4,27 (q, J=3,3 Гц, 1H), 4,16 (d, J=19,4 Гц, 1H), 3,87 (s, 2H), 2,58-2,49 (m, 1H), 2,28 (ddd, J=13,4, 4,5, 2,1 Гц, 1H), 2,09 (dtd, J=17,0, 10,6, 5,0 Гц, 1H), 2,00 (dd, J=12,2, 5,7 Гц, 1H), 1,78-1,54 (m, 5H), 1,37 (s, 3H), 1,35 (s, 3H), 1,30 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,01 (ddd, J=22,1, 11,9, 4,2 Гц, 2H), 0,84 (s, 3H).

Стадия 2. Синтез 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)пропанамида

К имеющему комнатную температуру раствору N-сукцинимидил-3-малеимидопропионата (250 мг, 0,938 ммоль) и (S)-2-амино-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)пропанамида (445 мг, 0,625 ммоль) в DMF (12 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,33 мл, 1,875 ммоль). Через 30 мин. при комнатной температуре удаляли летучие растворители при пониженном давлении. Остаток разбавляли с помощью DMSO:MeOH 1:1 (12 мл) и очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке C18(2), 10 микрон, Phenomenex (колонка 250×50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 90 мл/мин. (0-5,0 мин. 25% A, 5,0-20 мин. линейный градиент 25-90% A, удерживание 5 мин.). Объединенные фракции продукта лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества грязно-белого цвета (295,1 мг, 0,342 ммоль, выход 55%). LC-MS (Способ r, Таблица 7) Rt=0.85 мин, m/z=863.4 [M+H]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d₆) δ 9,71 (s, 1H), 8,17 (d, J=7,0 Гц, 1H), 8,03 (d, J=7,3 Гц, 1H), 7,43 (dd, J=7,8, 1,1 Гц, 2H), 7,38-7,32 (m, 2H), 7,29 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,22-7,15 (m, 3H), 6,96 (s, 2H), 6,88 (dt, J=7,8, 1,3 Гц, 1H), 6,13 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,90 (t, J=1,6 Гц, 1H), 5,37 (s, 1H), 4,90 (d, J=5,4 Гц, 1H), 4,48 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,32 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,27 (q, J=3,3 Гц, 1H), 4,21 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,16 (d, J=19,4 Гц, 1H), 3,87 (s, 2H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 2,57-2,49 (m, 1H), 2,38 (dd, J=8,0, 6,6 Гц, 2H), 2,32-2,24 (m, 1H), 2,15-2,04 (m, 1H), 2,04-1,95 (m, 1H), 1,80-1,54 (m, 5H), 1,37 (s, 3H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,15 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,02 (ddd, J=21,2, 12,1, 4,2 Гц, 2H), 0,84 (s, 3H).

Пример 35

Нижеуказанные соединения получали с применением способов, описанных выше.

Соед. №	Структура
70
71
72
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
89
90
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
Соед. №	Данные LC-MS	Данные ¹H ЯМР
70	Способ a LC-MS, Таблица 7 R_t=1,28 мин; масса/заряд=894,0 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,79-0,87 (m, 10H), 0,95-1,13 (m, 1H), 1,29 (d, J=7,1Гц, 3H), 1,38 (s, 3H), 1,57-1,76 (m, 2H), 1,76 (s, 2H), 1,90-2,01 (m, 2H), 2,05 (s, 2H), 2,28 (s, 2H), 2,43 (dd, J=14,4, 7,0Гц, 2H), 3,58 (p, J=6,8Гц, 2H), 4,11 (dd, J=8,4, 6,7Гц, 1H), 4,16 (d, J=19,4Гц, 1H), 4,28 (s, 1H), 4,36 (q, J=6,7Гц, 1H), 4,49 (d, J=19,4Гц, 1H), 4,75 (s, 1H), 4,90 (d, J=5,1Гц, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,90 (s, 1H), 6,14 (dd, J=10,1, 1,9Гц, 1H), 6,89-7,02 (m, 6H), 7,29 (d, J=10,1Гц, 1H), 7,42 (d, J=8,7Гц, 2H), 7,56-7,63 (m, 2H), 7,98 (d, J=8,4Гц, 1H), 8,13 (d, J=6,9Гц, 1H), 9,86 (s, 1H)
71	Способ r, Таблица 7 R_t=0,79 мин; масса/заряд=900,91 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,85 (s, 3H), 1,16 (d, J=7,1Гц, 3H), 1,29 (d, J=7,1Гц, 3H), 1,48 (s, 3H), 1,53 (d, J=12,6Гц, 1H), 1,60-1,77 (m, 3H), 1,98-2,09 (m, 1H), 2,24 (dd, J=21,2, 8,6Гц, 2H), 2,39 (dd, J=8,0, 6,5Гц, 2H), 2,53-2,72 (m, 1H), 3,59 (dd, J=8,1, 6,5Гц, 2H), 4,13-4,27 (m, 2H), 4,34 (p, J=7,1Гц, 1H), 4,51 (dd, J=19,5, 6,4Гц, 1H), 4,93 (d, J=5,0Гц, 1H), 5,07 (t, J=6,0Гц, 1H), 5,45 (s, 1H), 5,50 (dd, J=4,5, 1,7Гц, 1H), 5,53-5,75 (m, 1H), 6,07-6,12 (m, 1H), 6,27 (dd, J=10,2, 1,9Гц, 1H), 6,92-7,00 (m, 6H), 7,24 (dd, J=10,2, 1,4Гц, 1H), 7,36-7,43 (m, 2H), 7,58-7,66 (m, 2H), 8,08 (d, J=7,3Гц, 1H), 8,18 (d, J=7,0Гц, 1H), 9,83 (s, 1H)
72	Способ m LC-MS, Таблица 7 R_t=1,71 мин; масса/заряд=917 [M+H⁺]	¹H ЯМР (MeOH-d₄) δ: 1,00 (s, 3H), 1,37 (dd, J=12,2, 7,1 Гц, 3H), 1,48 (t, J=7,2 Гц, 3H), 1,59 (s, 4H), 1,69 (dd, J=27,0, 13,1 Гц, 2H), 1,79 (dd, J=13,7, 5,8 Гц, 2H), 2,26 (d, J=13,6 Гц, 1H), 2,38 (d, J=8,0 Гц, 3H), 2,56 (td, J=12,5, 11,2, 6,8 Гц, 3H), 2,60-2,81 (m, 1H), 3,80 (dt, J=12,7, 6,8 Гц, 2H), 4,24 (dd, J=11,9, 7,0 Гц, 1H), 4,32 (s, 2H), 4,43-4,51 (m, 1H), 4,64 (d, J=19,4 Гц, 1H), 5,07 (d, J=4,6 Гц, 1H), 5,47 (s, 1H), 5,57 (d, J=42,9 Гц, 1H), 6,27-6,38 (m, 3H), 6,73 (d, J=3,0 Гц, 2H), 7,16-7,25 (m, 2H), 7,36 (dt, J=16,7, 8,0 Гц, 6H), 7,70 (dd, J=22,7, 8,4 Гц, 2H)
72	Способ m LC-MS, Таблица 7 R_t=1,88 мин; масса/заряд=975 [M+H⁺]	¹H ЯМР (MeOH-d₄) δ: 1,00 (s, 3H), 1,49 (d, J=7,2 Гц, 3H), 1,59 (s, 3H), 1,60-1,89 (m, 3H), 2,04 (d, J=52,2 Гц, 1H), 2,27 (d, J=13,5 Гц, 1H), 2,31-2,52 (m, 4H), 2,58 (t, J=6,7 Гц, 2H), 3,81 (t, J=6,7 Гц, 2H), 4,34 (d, J=19,7 Гц, 3H), 4,42-4,53 (m, 1H), 4,64 (d, J=19,4 Гц, 1H), 5,07 (d, J=4,6 Гц, 1H), 5,47 (s, 1H), 5,58 (d, J=40,9 Гц, 1H), 6,25-6,47 (m, 2H), 6,76 (s, 2H), 7,20 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,28-7,44 (m, 5H), 7,67 (d, J=8,5 Гц, 2H)
73	Способ a LC-MS, Таблица 7 R_t=2,08 мин; масса/заряд=931,30 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,16 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,27 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,48 (s, 4H), 1,59-1,77 (m, 3H), 1,96-2,08 (m, 1H), 2,13-2,33 (m, 2H), 2,39 (dd, J=7,9, 6,7 Гц, 2H), 2,52 (s, 1H), 2,53-2,72 (m, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,08-4,26 (m, 5H), 4,32 (p, J=7,0 Гц, 1H), 4,50 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,93 (d, J=5,0 Гц, 1H), 5,44 (s, 1H), 5,45-5,51 (m, 1H), 5,63 (dt, J=48,4, 9,3 Гц, 1H), 6,11 (d, J=2,1 Гц, 1H), 6,28 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,93-7,02 (m, 3H), 7,19 (t, J=8,0 Гц, 1H), 7,24 (dd, J=10,1, 1,4 Гц, 1H), 7,30-7,44 (m, 5H), 7,65 (t, J=1,9 Гц, 1H), 8,05 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,16 (d, J=7,0 Гц, 1H), 9,77 (s, 1H)
74	Способ r, Таблица 7 R_t=0,82 мин; масса/заряд=918,60 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,15 (d, J=7,1Гц, 3H), 1,26 (d, J=7,2Гц, 4H), 1,48 (s, 4H), 1,59-1,79 (m, 3H), 1,94-2,10 (m, 1H), 2,10-2,31 (m, 2H), 2,37 (t, J=7,3Гц, 2H), 2,51-2,77 (m, 1H), 3,58 (t, J=7,3Гц, 2H), 4,10-4,25 (m, 3H), 4,31 (p, J=7,1Гц, 1H), 4,51 (d, J=19,4Гц, 1H), 4,94 (d, J=5,0Гц, 1H), 5,45 (s, 1H), 5,50 (s, 1H), 5,62 (dt, J=48,6, 9,4Гц, 1H), 6,10 (s, 1H), 6,27 (dd, J=10,1, 1,9Гц, 1H), 6,96 (s, 2H), 7,02 (dd, J=7,3, 1,7Гц, 1H), 7,20-7,34 (m, 4H), 7,40 (d, J=8,3Гц, 2H), 7,58 (dd, J=7,9, 2,1Гц, 1H), 7,69 (d, J=2,1Гц, 1H), 8,07 (d, J=7,2Гц, 1H), 8,16 (d, J=7,0Гц, 1H), 9,89 (s, 1H)
75	Способ r, Таблица 7 R_t=0,82 мин; масса/заряд=899,87 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,83 (s, 3H), 1,13 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,24 (d, J=7,2 Гц, 3H), 1,46 (s, 4H), 1,57-1,77 (m, 3H), 2,01 (dt, J=13,9, 3,7 Гц, 1H), 2,13-2,32 (m, 2H), 2,36 (dd, J=8,0, 6,7 Гц, 2H), 2,51-2,73 (m, 1H), 3,56 (d, J=7,3 Гц, 2H), 3,85 (s, 2H), 4,10-4,25 (m, 3H), 4,30 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,47 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,91 (d, J=4,9 Гц, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,48 (s, 1H), 5,51-5,71 (m, 1H), 6,09 (d, J=2,0 Гц, 1H), 6,26 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,87 (dt, J=7,6, 1,3 Гц, 1H), 6,95 (s, 2H), 7,16 (t, J=7,8 Гц, 1H), 7,18-7,27 (m, 3H), 7,32 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,39 (d, J=1,9 Гц, 1H), 7,43 (dd, J=8,5, 1,9 Гц, 1H), 8,01 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,14 (d, J=7,0 Гц, 1H), 9,70 (s, 1H)
76	Способ r, Таблица 7 R_t=1,00 мин; масса/заряд=не проявился	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,88 (d, J=7,4 Гц, 3H), 1,19 (dt, J=33,9, 7,1 Гц, 11H), 1,35-1,63 (m, 10H), 1,61-1,85 (m, 2H), 2,06 (q, J=7,4 Гц, 3H), 2,16-2,35 (m, 1H), 2,38 (t, J=7,3 Гц, 1H), 3,87 (d, J=8,1 Гц, 2H), 4,10-4,42 (m, 3H), 4,67-5,15 (m, 2H), 5,51-5,73 (m, 3H), 6,11 (s, 1H), 6,28 (dd, J=10,1, 2,1 Гц, 1H), 6,89 (d, J=7,3 Гц, 1H), 6,92-7,02 (m, 3H), 7,13-7,29 (m, 5H), 7,30-7,41 (m, 2H), 7,42-7,57 (m, 1H), 7,88-8,34 (m, 2H), 9,74 (s, 1H)
77	Способ m, Таблица 7 R_t=1,62 мин; масса/заряд=10583 [M+Na⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,86 (s, 3H), 1,26 (dd, J=15,9, 6,5 Гц, 9H), 1,50 (s, 4H), 1,70 (t, J=8,4 Гц, 3H), 1,90-2,10 (m, 2H), 2,14-2,35 (m, 1H), 2,35-2,45 (m, 1H), 2,54-2,77 (m, 1H), 2,96 (ddd, J=47,6, 15,3, 6,6 Гц, 2H), 3,57 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,89 (s, 2H), 4,20 (d, J=19,0 Гц, 1H), 4,32 (dt, J=27,9, 7,0 Гц, 2H), 4,45-4,64 (m, 2H), 4,94 (d, J=4,7 Гц, 1H), 5,07 (d, J=39,6 Гц, 1H), 5,45 (s, 1H), 5,49-5,79 (m, 2H), 6,12 (s, 1H), 6,29 (dd, J=10,2, 1,8 Гц, 1H), 6,92 (d, J=7,6 Гц, 1H), 6,99 (s, 2H), 7,20 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,25 (t, J=8,6 Гц, 3H), 7,33-7,42 (m, 4H), 7,45 (d, J=8,1 Гц, 1H), 8,31 (d, J=8,0 Гц, 1H), 8,95 (s, 1H), 9,88 (s, 1H), 14,10 (s, 2H)
78	Способ r, Таблица 7 R_t=0,80 мин; масса/заряд=1005,1 [M+MeOH+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,17 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,25 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,48 (s, 4H), 1,57 (q, J=6,2 Гц, 4H), 1,68 (dq, J=13,7, 6,3, 5,6 Гц, 3H), 1,99-2,06 (m, 1H), 2,09-2,18 (m, 2H), 2,18-2,36 (m, 2H), 2,55-2,72 (m, 3H), 2,78 (s, 4H), 3,87 (s, 2H), 4,14-4,22 (m, 2H), 4,26 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,33 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,49 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,93 (d, J=5,1 Гц, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,49 (d, J=5,4 Гц, 1H), 5,54-5,75 (m, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,28 (dd, J=10,2, 2,0 Гц, 1H), 6,89 (d, J=7,6 Гц, 1H), 7,17 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,23 (t, J=9,7 Гц, 3H), 7,34 (d, J=7,8 Гц, 2H), 7,39 (s, 1H), 7,44 (d, J=8,1 Гц, 1H), 7,99 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,02 (d, JJ=7,3 Гц, 1H), 9,77 (s, 1H)
79	Способ r, Таблица 7 R_t=0,80 мин; масса/заряд=901,81 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,85 (s, 3H), 1,14 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,48 (s, 4H), 1,61-1,80 (m, 3H), 2,04 (d, J=13,1 Гц, 1H), 2,25 (ddd, J=18,6, 14,9, 8,4 Гц, 2H), 2,37 (dd, J=8,0, 6,5 Гц, 2H), 2,53-2,74 (m, 1H), 3,57 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,09-4,24 (m, 2H), 4,30 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,52 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,94 (d, J=5,0 Гц, 1H), 5,08 (t, J=5,9 Гц, 1H), 5,46 (s, 1H), 5,48-5,53 (m, 1H), 5,63 (dt, J=48,9, 9,1 Гц, 1H), 6,10 (s, 1H), 6,27 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,69 (ddd, J=7,9, 2,6, 1,1 Гц, 1H), 6,96 (s, 2H), 6,98-7,06 (m, 2H), 7,22-7,32 (m, 2H), 7,32-7,40 (m, 2H), 7,39-7,51 (m, 2H), 8,06 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,15 (d, J=7,0 Гц, 1H), 9,87 (s, 1H)
80	Способ m, Таблица 7 R_t=1,64 мин; масса/заряд=899 [M+H⁺]	¹H ЯМР (MeOH-d₄) δ: 1,00 (s, 3H), 1,36 (dd, J=11,5, 7,1 Гц, 4H), 1,46 (t, J=6,9 Гц, 3H), 1,53-1,76 (m, 5H), 1,75-1,89 (m, 2H), 2,28 (d, J=13,8 Гц, 1H), 2,33-2,48 (m, 1H), 2,48-2,62 (m, 2H), 2,61-2,84 (m, 1H), 3,72-3,88 (m, 2H), 3,95 (s, 2H), 4,18-4,40 (m, 3H), 4,46 (q, J=6,9 Гц, 1H), 4,65 (d, J=19,4 Гц, 1H), 5,07 (d, J=4,6 Гц, 1H), 5,43-5,69 (m, 2H), 6,30-6,39 (m, 2H), 6,69 (s, 2H), 7,14 (dd, J=8,2, 5,6 Гц, 2H), 7,23 (dd, J=7,9, 3,4 Гц, 3H), 7,34 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,38 (d, J=7,8 Гц, 2H), 7,51 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,55 (d, J=8,2 Гц, 1H), 8,55 (s, 1H)
81	Способ m, Таблица 7 R_t=1,526 мин; масса/заряд=957 [M+H⁺]	¹H ЯМР (MeOH-d₄) δ: 0,88 (s, 3H), 1,21 (d, J=11,6 Гц, 3H), 1,35 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,48 (s, 3H), 1,57 (dd, J=25,8, 13,5 Гц, 2H), 1,68 (dd, J=13,4, 5,5 Гц, 2H), 1,83 (dd, J=14,4, 7,5 Гц, 1H), 1,88-2,05 (m, 1H), 2,12-2,21 (m, 1H), 2,30 (q, J=12,7, 10,3 Гц, 3H), 2,44 (t, J=6,7 Гц, 2H), 2,49-2,73 (m, 1H), 3,68 (t, J=6,7 Гц, 2H), 3,82 (s, 2H), 4,11-4,28 (m, 3H), 4,34 (q, J=7,1 Гц, 1H), 4,53 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,95 (d, J=4,6 Гц, 1H), 5,30-5,59 (m, 2H), 6,23 (dd, J=13,2, 3,0 Гц, 2H), 6,60 (s, 2H), 7,02 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,10 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,24 (dd, J=15,1, 8,9 Гц, 3H), 7,37 (d, J=8,2 Гц, 2H)
82	Способ r, Таблица 7 R_t=0,77 мин; 913,27 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 0,96 (s, 2H), 1,01-1,19 (m, 4H), 1,19-1,35 (m, 2H), 1,48 (s, 3H), 1,67 (d, J=14,3 Гц, 2H), 2,03 (d, J=19,7 Гц, 1H), 2,13-2,42 (m, 5H), 2,64 (d, J=8,4 Гц, 2H), 3,08 (s, 3H), 3,38-3,61 (m, 1H), 3,93 (s, 2H), 4,17 (d, J=18,9 Гц, 3H), 4,49 (d, J=19,3 Гц, 1H), 4,92 (d, J=4,8 Гц, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,49 (s, 1H), 5,53-5,77 (m, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,28 (dd, J=10,2, 1,8 Гц, 1H), 6,96 (d, J=6,1 Гц, 1H), 7,10-7,41 (m, 8H), 7,83-8,20 (m, 1H)
83	Способ r, Таблица 7 R_t=0,88 мин; масса/заряд=943,52 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 0,93 (dd, J=23,5, 6,9 Гц, 3H), 1,04-1,16 (m, 3H), 1,48 (s, 4H), 1,60-1,76 (m, 3H), 2,03 (d, J=20,7 Гц, 1H), 2,17-2,26 (m, 1H), 2,24-2,40 (m, 2H), 2,55-2,72 (m, 2H), 2,96 (d, J=13,0 Гц, 3H), 3,55 (t, J=7,3 Гц, 1H), 3,72 (d, J=57,6 Гц, 3H), 3,93 (d, J=4,7 Гц, 2H), 4,10-4,28 (m, 4H), 4,49 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,93 (d, J=5,0 Гц, 1H), 5,44 (d, J=2,9 Гц, 1H), 5,50 (d, J=4,2 Гц, 1H), 5,63 (dt, J=48,7, 9,8 Гц, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,28 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,82 (t, J=7,1 Гц, 1H), 6,93-7,00 (m, 1H), 7,02-7,07 (m, 1H), 7,19 (d, J=7,9 Гц, 1H), 7,24 (d, J=10,0 Гц, 1H), 7,29-7,41 (m, 4H), 7,93 (d, J=7,1 Гц, 1H)
84	Способ r, Таблица 7 R_t=0,82 мин; масса/заряд=929,45 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,83 (s, 3H), 1,17 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,25 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,46 (s, 4H), 1,58-1,77 (m, 3H), 2,01 (dt, J=13,8, 4,1 Гц, 1H), 2,23 (dtd, J=25,2, 12,3, 10,9, 5,8 Гц, 2H), 2,31-2,40 (m, 2H), 2,49-2,73 (m, 1H), 3,56 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,74 (s, 3H), 3,84 (s, 2H), 4,11-4,20 (m, 2H), 4,27 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,39 (p, J=7,2 Гц, 1H), 4,47 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,91 (d, J=4,8 Гц, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,42-5,50 (m, 1H), 5,50-5,78 (m, 1H), 6,09 (s, 1H), 6,26 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,70 (dd, J=8,3, 1,8 Гц, 1H), 6,89 (d, J=1,8 Гц, 1H), 6,95 (s, 2H), 7,23 (d, J=8,5 Гц, 3H), 7,31 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,87 (d, J=8,2 Гц, 1H), 8,14 (d, J=7,5 Гц, 1H), 8,23 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,81 (s, 1H)
85	Способ r, Таблица 7 R_t=0,73 мин; масса/заряд=897,3 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,16 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,27 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,39 (qd, J=13,1, 5,2 Гц, 1H), 1,48 (s, 3H), 1,55-1,72 (m, 3H), 1,78-1,90 (m, 1H), 2,03 (d, J=25,4 Гц, 1H), 2,13 (td, J=12,2, 6,8 Гц, 1H), 2,29-2,41 (m, 3H), 2,48 (p, J=1,9 Гц, 1H), 2,58-2,69 (m, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,09-4,26 (m, 3H), 4,29-4,44 (m, 3H), 4,47 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,82-4,91 (m, 1H), 5,32 (s, 1H), 5,41 (s, 1H), 6,02 (d, J=1,7 Гц, 1H), 6,22 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,47 (d, J=8,7 Гц, 1H), 6,97 (s, 2H), 7,18-7,21 (m, 2H), 7,23 (t, J=6,2 Гц, 1H), 7,27 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,33 (dd, J=8,7, 2,3 Гц, 1H), 7,44-7,57 (m, 2H), 7,95 (d, J=2,3 Гц, 1H), 8,04 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,10-8,23 (m, 2H), 9,73 (s, 1H)
86	Способ r, Таблица 7 R_t=0,73 мин; масса/заряд=911,46 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,83 (s, 3H), 1,15 (d, J=7,2 Гц, 3H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,36 (d, J=6,7 Гц, 4H), 1,48 (s, 3H), 1,63 (t, J=11,1 Гц, 3H), 1,74-1,90 (m, 1H), 1,93-2,19 (m, 2H), 2,26-2,41 (m, 3H), 2,48 (p, J=1,8 Гц, 1H), 2,58-2,70 (m, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,09-4,27 (m, 3H), 4,33 (p, J=7,2 Гц, 1H), 4,46 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,85 (d, J=4,1 Гц, 1H), 4,93 (t, J=6,9 Гц, 1H), 5,04 (s, 1H), 5,30 (s, 1H), 5,40 (dd, J=4,5, 1,7 Гц, 1H), 6,02 (s, 1H), 6,21 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,48 (s, 1H), 6,97 (s, 2H), 7,26 (t, J=9,3 Гц, 3H), 7,32 (d, J=8,0 Гц, 1H), 7,48 (d, J=8,3 Гц, 2H), 7,90 (d, J=2,2 Гц, 1H), 8,03 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,16 (d, J=7,0 Гц, 1H), 9,71 (s, 1H)
87	Способ r, Таблица 7 R_t=0,72 мин; масса/заряд=911,64 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,83 (s, 3H), 1,15 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,27 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,35 (d, J=6,8 Гц, 4H), 1,48 (s, 3H), 1,55-1,70 (m, 3H), 1,77-1,88 (m, 1H), 1,99 (d, J=13,5 Гц, 1H), 2,12 (td, J=12,3, 6,6 Гц, 1H), 2,28-2,40 (m, 3H), 2,48 (p, J=1,8 Гц, 1H), 2,56-2,69 (m, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,06-4,28 (m, 3H), 4,33 (p, J=7,2 Гц, 1H), 4,45 (dd, J=19,4, 6,4 Гц, 1H), 4,85 (d, J=4,9 Гц, 1H), 4,93 (t, J=7,2 Гц, 1H), 5,03 (t, J=6,0 Гц, 1H), 5,28 (s, 1H), 5,40 (dd, J=4,4, 1,9 Гц, 1H), 6,02 (d, J=2,1 Гц, 1H), 6,22 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,43 (d, J=8,6 Гц, 1H), 6,97 (s, 2H), 7,16 (d, J=7,8 Гц, 1H), 7,20-7,33 (m, 4H), 7,44-7,49 (m, 2H), 7,90 (d, J=2,3 Гц, 1H), 8,03 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,17 (d, J=7,1 Гц, 1H), 9,71 (s, 1H)
88	Способ r, Таблица 7 R_t=0,87 мин; масса/заряд=863,32 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,02 (ddd, J=21,3, 12,1, 4,2 Гц, 2H), 1,15 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,53-1,81 (m, 4H), 2,00 (dd, J=12,2, 5,5 Гц, 1H), 2,04-2,15 (m, 1H), 2,23-2,33 (m, 1H), 2,38 (dd, J=8,0, 6,6 Гц, 2H), 2,51 (d, J=18,2 Гц, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,87 (s, 2H), 4,16 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,21 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,27 (q, J=3,3 Гц, 1H), 4,32 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,48 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,72 (s, 2H), 4,90 (d, J=5,4 Гц, 1H), 5,37 (s, 1H), 5,90 (t, J=1,6 Гц, 1H), 6,13 (dd, J=10,1, 1,8 Гц, 1H), 6,88 (dt, J=7,9, 1,3 Гц, 1H), 6,96 (s, 2H), 7,14-7,22 (m, 3H), 7,29 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,33-7,38 (m, 2H), 7,43 (dd, J=7,8, 1,1 Гц, 2H), 8,03 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,17 (d, J=7,0 Гц, 1H), 9,71 (s, 1H)
89	Способ m, Таблица 7 R_t=1,99 мин; масса/заряд=863 [M+H⁺]	¹H ЯМР (MeOH-d₄) δ: 1,01 (d, J=8,5 Гц, 3H), 1,10-1,30 (m, 2H), 1,34 (dd, J=10,5, 7,1 Гц, 3H), 1,45 (dd, J=7,2, 3,6 Гц, 3H), 1,52 (s, 3H), 1,80 (t, J=13,0 Гц, 1H), 1,90 (p, J=8,3, 7,3 Гц, 1H), 2,04 (d, J=12,4 Гц, 1H), 2,12-2,32 (m, 2H), 2,42 (d, J=11,2 Гц, 1H), 2,46-2,58 (m, 2H), 2,60-2,78 (m, 1H), 3,68-3,84 (m, 2H), 3,96 (d, J=6,0 Гц, 2H), 4,12 (d, J=19,3 Гц, 1H), 4,16-4,27 (m, 1H), 4,27-4,38 (m, 1H), 4,43 (d, J=6,2 Гц, 2H), 5,40 (d, J=6,3 Гц, 1H), 6,05 (s, 1H), 6,12 (d, J=4,4 Гц, 1H), 6,28 (dd, J=9,9, 1,8 Гц, 1H), 6,75 (d, J=3,3 Гц, 2H), 6,96 (d, J=7,7 Гц, 1H), 7,15-7,30 (m, 5H), 7,43 (d, J=18,7 Гц, 3H), 7,56 (d, J=8,2 Гц, 3H)
90	Способ r, Таблица 7 R_t=0,91 мин; масса/заряд=891,36 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,79 (d, J=6,8 Гц, 3H), 0,82 (d, J=6,8 Гц, 3H), 0,84 (s, 2H), 0,95-1,12 (m, 2H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,38 (d, J=4,7 Гц, 3H), 1,54-1,77 (m, 4H), 1,91 (h, J=6,8 Гц, 1H), 1,96-2,05 (m, 1H), 2,04-2,17 (m, 1H), 2,23-2,34 (m, 1H), 2,37-2,47 (m, 2H), 2,49-2,58 (m, 1H), 3,51-3,67 (m, 2H), 3,87 (s, 2H), 4,11 (s, 1H), 4,16 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,27 (q, J=3,4 Гц, 1H), 4,32 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,48 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,73 (s, 1H), 4,90 (d, J=5,3 Гц, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,90 (d, J=1,6 Гц, 1H), 6,13 (dt, J=10,1, 1,8 Гц, 1H), 6,88 (dt, J=7,7, 1,3 Гц, 1H), 6,96 (s, 2H), 7,18 (dd, J=16,7, 8,1 Гц, 3H), 7,29 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,32-7,40 (m, 3H), 7,43 (ddd, J=8,1, 2,2, 1,0 Гц, 1H), 7,99 (d, J=8,4 Гц, 1H), 8,10 (d, J=7,0 Гц, 1H), 9,74 (s, 1H)
99	Способ r, Таблица 7 R_t=0,85 мин; масса/заряд=881,46 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,83 (s, 3H), 1,13 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,24 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,35 (qd, J=13,3, 12,8, 5,1 Гц, 1H), 1,46 (s, 3H), 1,63 (q, J=9,7, 8,5 Гц, 3H), 1,73-1,88 (m, 1H), 2,01 (dt, J=13,7, 3,5 Гц, 1H), 2,14 (td, J=11,8, 7,2 Гц, 1H), 2,26-2,40 (m, 3H), 2,48-2,69 (m, 2H), 3,57 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,85 (s, 2H), 4,17 (ddd, J=17,5, 11,7, 6,2 Гц, 3H), 4,30 (p, J=7,2 Гц, 1H), 4,47 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,83-4,95 (m, 1H), 5,40 (s, 2H), 5,99 (d, J=1,6 Гц, 1H), 6,20 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,87 (d, J=7,5 Гц, 1H), 6,95 (s, 2H), 7,16 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,20 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,25 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,31 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,38 (d, J=1,9 Гц, 1H), 7,43 (dd, J=8,0, 2,0 Гц, 1H), 8,01 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,14 (d, J=7,1 Гц, 1H), 9,70 (s, 1H)
100	Способ r, Таблица 7 R_t=0,87 мин; масса/заряд=933,0[M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,93 (s, 3H), 1,15 (d, J=7,2 Гц, 3H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,48 (s, 4H), 1,73 (dd, J=25,4, 11,3 Гц, 3H), 2,00 (d, J=14,1 Гц, 1H), 2,12-2,26 (m, 1H), 2,27 (s, 1H), 2,37 (q, J=8,3, 7,8 Гц, 2H), 2,65 (d, J=33,3 Гц, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,88 (s, 2H), 4,14-4,27 (m, 2H), 4,32 (t, J=7,2 Гц, 1H), 4,92 (d, J=3,5 Гц, 1H), 5,50 (s, 1H), 5,55 (s, 1H), 5,54-5,72 (m, 1H), 5,79-6,04 (m, 2H), 6,11 (s, 1H), 6,28 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,90 (d, J=7,7 Гц, 1H), 6,97 (s, 2H), 7,18 (t, J=7,8 Гц, 1H), 7,24 (t, J=9,5 Гц, 3H), 7,34 (d, J=7,8 Гц, 2H), 7,40 (s, 1H), 7,46 (d, J=8,2 Гц, 1H), 8,03 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,16 (d, J=7,1 Гц, 1H), 9,72 (s, 1H)
101	Способ r, Таблица 7 R_t=0,84 мин; масса/заряд=885,41 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,99 (s, 3H), 1,15 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,25 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,49 (s, 4H), 1,60-1,75 (m, 2H), 1,79 (d, J=14,0 Гц, 1H), 1,94 (dt, J=14,4, 3,5 Гц, 1H), 2,20 (q, J=10,4 Гц, 1H), 2,24-2,33 (m, 1H), 2,38 (dd, J=8,0, 6,5 Гц, 2H), 2,62 (dtd, J=30,0, 12,0, 11,5, 4,1 Гц, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,87 (s, 2H), 4,16 (d, J=9,1 Гц, 1H), 4,21 (p, J=7,2 Гц, 1H), 4,32 (p, J=7,2 Гц, 1H), 5,00 (t, J=2,9 Гц, 1H), 5,40-5,47 (m, 1H), 5,48 (s, 1H), 5,54-5,72 (m, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,27 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,89 (d, J=7,6 Гц, 1H), 6,96 (s, 2H), 7,17 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,21 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,24 (dd, J=10,3, 1,5 Гц, 1H), 7,32 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,39 (t, J=1,9 Гц, 1H), 7,46 (dd, J=8,1, 2,1 Гц, 1H), 8,04 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,16 (d, J=7,1 Гц, 1H), 9,73 (s, 1H)
102	Способ r, Таблица 7 R_t=0,77 мин; масса/заряд=917,22 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,85 (s, 3H), 1,16 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,28 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,48 (s, 3H), 1,56 (p, J=12,4, 12,0 Гц, 1H), 1,62-1,76 (m, 3H), 1,98-2,10 (m, 1H), 2,22 (td, J=12,3, 6,6 Гц, 1H), 2,24-2,33 (m, 1H), 2,38 (td, J=7,0, 1,0 Гц, 2H), 2,54-2,72 (m, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,15-4,25 (m, 3H), 4,33 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,50 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,93 (d, J=5,0 Гц, 1H), 5,36 (s, 1H), 5,50 (s, 1H), 5,55-5,73 (m, 1H), 6,11 (q, J=1,5 Гц, 1H), 6,27 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,78-6,83 (m, 2H), 6,84 (d, J=1,8 Гц, 2H), 6,97 (s, 2H), 7,01 (d, J=1,6 Гц, 1H), 7,25 (dd, J=10,1, 1,5 Гц, 1H), 7,45-7,61 (m, 2H), 8,04 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,17 (d, J=7,0 Гц, 1H), 9,73 (s, 1H)
103	Способ r, Таблица 7 R_t=0,84 мин; масса/заряд=935,4 [M+Na⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,15 (d, J=7,3 Гц, 3H), 1,25 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,48 (s, 3H), 1,51 (d, J=7,3 Гц, 4H), 1,67 (d, J=14,2 Гц, 2H), 2,02 (d, J=13,7 Гц, 1H), 2,13-2,34 (m, 2H), 2,38 (t, J=7,3 Гц, 2H), 2,65 (s, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,08 (d, J=7,1 Гц, 1H), 4,12-4,24 (m, 2H), 4,32 (t, J=7,2 Гц, 1H), 4,48 (dd, J=19,6, 6,3 Гц, 1H), 4,92 (d, J=4,8 Гц, 1H), 5,07 (t, J=5,8 Гц, 1H), 5,72-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,49 (s, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,28 (d, J=9,9 Гц, 1H), 6,88-6,95 (m, 1H), 6,97 (s, 2H), 7,17 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,25 (d, J=8,1 Гц, 3H), 7,33 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,45 (d, J=12,0 Гц, 2H), 8,03 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,16 (d, J=6,9 Гц, 1H), 9,71 (s, 1H)
104	Способ r, Таблица 7 R_t=0,84 мин; масса/заряд=935,4 [M+Na⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,85 (s, 3H), 1,16 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,49 (s, 3H), 1,52 (d, J=7,3 Гц, 3H), 1,69 (t, J=12,7 Гц, 3H), 2,04 (d, J=13,9 Гц, 1H), 2,18-2,33 (m, 2H), 2,33-2,42 (m, 2H), 2,56-2,74 (m, 1H), 3,60 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,09 (q, J=7,2 Гц, 1H), 4,20 (tq, J=13,0, 6,3, 5,6 Гц, 3H), 4,32 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,49 (dd, J=19,5, 6,3 Гц, 1H), 4,93 (d, J=5,1 Гц, 1H), 5,08 (t, J=6,0 Гц, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,51 (d, J=4,2 Гц, 1H), 5,64 (dt, J=48,9, 8,9 Гц, 1H), 6,12 (s, 1H), 6,29 (dd, J=10,0, 1,9 Гц, 1H), 6,93 (d, J=7,6 Гц, 1H), 6,97 (s, 2H), 7,18 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,23-7,29 (m, 3H), 7,34 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,44 (d, J=2,1 Гц, 1H), 7,44-7,49 (m, 1H), 8,03 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,17 (d, J=7,1 Гц, 1H), 9,72 (s, 1H)
105	Способ r, Таблица 7 R_t=0,80 мин; масса/заряд=913,75 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,15 (d, J=7,2 Гц, 3H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,44-1,58 (m, 7H), 1,67 (d, J=13,8 Гц, 2H), 2,03 (d, J=14,0 Гц, 1H), 2,18-2,34 (m, 2H), 2,38 (t, J=7,3 Гц, 2H), 2,50-2,72 (m, 1H), 3,58 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,07 (p, J=7,3 Гц, 1H), 4,11-4,26 (m, 2H), 4,33 (d, J=7,2 Гц, 1H), 4,48 (d, J=19,3 Гц, 1H), 4,92 (d, J=4,8 Гц, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,45-5,53 (m, 1H), 5,62 (dd, J=48,5, 9,8 Гц, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,28 (d, J=10,0 Гц, 1H), 6,97 (s, 2H), 7,11-7,20 (m, 2H), 7,20-7,29 (m, 3H), 7,32 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,47 (d, J=8,3 Гц, 2H), 8,03 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,16 (d, J=7,0 Гц, 1H), 9,71 (s, 1H)
106	Способ r, Таблица 7 R_t= 0,84 мин; масса/заряд=913,46 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,15 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,48 (s, 3H), 1,48-1,54 (m, 4H), 1,60-1,75 (m, 2H), 2,03 (dt, J=13,8, 3,6 Гц, 1H), 2,08-2,18 (m, 1H), 2,18-2,25 (m, 1H), 2,25-2,32 (m, 1H), 2,38 (dd, J=8,1, 6,4 Гц, 2H), 2,54-2,72 (m, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,06 (dq, J=14,9, 7,0 Гц, 1H), 4,11-4,28 (m, 3H), 4,33 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,48 (d, J=19,6 Гц, 1H), 4,92 (d, J=5,0 Гц, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,45-5,54 (m, 1H), 5,54-5,73 (m, 1H), 6,12 (d, J=2,2 Гц, 1H), 6,26-6,33 (m, 1H), 6,97 (d, J=1,3 Гц, 2H), 7,10-7,18 (m, 3H), 7,20-7,28 (m, 3H), 7,29-7,36 (m, 2H), 7,47 (dd, J=8,6, 4,4 Гц, 2H), 8,04 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,17 (d, J=7,1 Гц, 1H), 9,71 (d, J=2,9 Гц, 1H)
107	Способ r, Таблица 7 R_t= 0,88 мин; масса/заряд=895,30 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 0,94-1,11 (m, 2H), 1,16 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,27 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,51-1,82 (m, 5H), 1,94-2,03 (m, 1H), 2,08 (d, J=19,3 Гц, 1H), 2,30 (t, J=8,2 Гц, 1H), 2,38 (t, J=7,3 Гц, 2H), 2,48-2,59 (m, 1H), 3,60 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,11-4,25 (m, 4H), 4,27 (d, J=3,6 Гц, 1H), 4,32 (p, J=7,2 Гц, 1H), 4,48 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,90 (d, J=5,0 Гц, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,91 (d, J=1,6 Гц, 1H), 6,14 (dd, J=10,1, 1,8 Гц, 1H), 6,97 (s, 2H), 6,94-7,01 (m, 1H), 7,19 (t, J=8,0 Гц, 1H), 7,25-7,37 (m, 2H), 7,37 (s, 4H), 7,66 (t, J=1,9 Гц, 1H), 8,10 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,20 (d, J=6,9 Гц, 1H), 9,80 (s, 1H)
108	Способ r, Таблица 7 R_t= 0,83 мин; масса/заряд=913,0[M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,85 (s, 3H), 1,16 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,27 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,37 (qd, J=12,8, 5,2 Гц, 1H), 1,48 (s, 3H), 1,57-1,71 (m, 3H), 1,83 (dt, J=11,7, 5,4 Гц, 1H), 2,03 (dt, J=13,8, 3,6 Гц, 1H), 2,14 (td, J=12,1, 6,8 Гц, 1H), 2,30-2,36 (m, 1H), 2,38 (t, J=7,3 Гц, 2H), 2,42-2,57 (m, 1H), 2,63 (td, J=13,3, 5,8 Гц, 1H), 3,59 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,13-4,26 (m, 5H), 4,32 (p, J=7,2 Гц, 1H), 4,49 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,91 (d, J=4,7 Гц, 1H), 5,42 (s, 2H), 6,02 (s, 1H), 6,21 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,98 (dd, J=7,9, 1,8 Гц, 1H), 7,19 (t, J=8,0 Гц, 1H), 7,27 (d, J=10,2 Гц, 1H), 7,29-7,44 (m, 5H), 7,61-7,70 (m, 1H), 8,07 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,18 (d, J=7,0 Гц, 1H), 9,79 (s, 1H)
109	Способ r, Таблица 7 R_t=0,80 мин; масса/заряд=915,54 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,85 (s, 3H), 1,19 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,28 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,49 (s, 4H), 1,61-1,78 (m, 3H), 2,04 (d, J=13,7 Гц, 1H), 2,22 (dd, J=12,3, 6,3 Гц, 1H), 2,26-2,32 (m, 1H), 2,37 (td, J=7,0, 2,0 Гц, 2H), 2,55-2,73 (m, 1H), 3,58 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,78 (s, 2H), 4,18 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,29 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,39 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,50 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,93 (d, J=5,2 Гц, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,51 (dd, J=4,5, 1,7 Гц, 1H), 5,54-5,75 (m, 1H), 6,12 (s, 1H), 6,29 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,72-6,78 (m, 2H), 6,98 (s, 2H), 7,19 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,25 (dd, J=10,1, 1,5 Гц, 1H), 7,29-7,37 (m, 2H), 7,76 (d, J=1,8 Гц, 1H), 8,18 (d, J=7,5 Гц, 1H), 8,30 (d, J=7,1 Гц, 1H), 8,92 (s, 1H), 9,72 (s, 1H)
110	Способ r, Таблица 7 R_t=0,84 мин; масса/заряд=899,0 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,83 (s, 3H), 1,13 (d, J=7,2 Гц, 3H), 1,25 (d, J=7,2 Гц, 3H), 1,36 (qd, J=12,7, 5,4 Гц, 1H), 1,46 (s, 3H), 1,55-1,72 (m, 3H), 1,75-1,87 (m, 1H), 1,93-2,05 (m, 1H), 2,05-2,18 (m, 1H), 2,25-2,40 (m, 3H), 2,47 (p, J=1,9 Гц, 1H), 2,53-2,69 (m, 1H), 3,56 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,09-4,23 (m, 3H), 4,29 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,49 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,87-4,95 (m, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,99 (d, J=1,7 Гц, 1H), 6,19 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,95 (s, 2H), 7,00 (dt, J=7,8, 1,3 Гц, 1H), 7,21-7,33 (m, 4H), 7,33-7,41 (m, 2H), 7,56 (ddd, J=8,2, 2,1, 1,0 Гц, 1H), 7,67 (t, J=2,0 Гц, 1H), 8,05 (d, J=7,1 Гц, 1H), 8,14 (d, J=7,0 Гц, 1H), 9,87 (s, 1H)
111	Способ r, Таблица 7 R_t=0,86 мин; масса/заряд=881,38 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,04 (ddd, J=14,7, 11,7, 4,1 Гц, 2H), 1,14 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,54-1,85 (m, 4H), 1,93-2,03 (m, 1H), 2,09 (d, J=11,6 Гц, 1H), 2,23-2,33 (m, 1H), 2,36 (q, J=6,4, 5,5 Гц, 2H), 2,50 (d, J=9,7 Гц, 1H), 3,57 (t, J=7,3 Гц, 2H), 4,12-4,24 (m, 2H), 4,24-4,34 (m, 2H), 4,48 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,76 (s, 1H), 4,90 (d, J=5,1 Гц, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,89 (s, 1H), 6,14 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,97 (s, 2H), 7,03 (d, J=7,7 Гц, 1H), 7,22-7,35 (m, 4H), 7,42 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,57 (dd, J=8,2, 2,0 Гц, 1H), 7,71 (d, J=2,0 Гц, 1H), 8,09 (d, J=7,1 Гц, 1H), 8,17 (d, J=6,9 Гц, 1H), 9,89 (s, 1H)
112	Способ r, Таблица 7 R_t=0,85 мин; масса/заряд=879,30 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,02 (ddd, J=21,5, 11,7, 4,1 Гц, 2H), 1,18 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,27 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,54-1,81 (m, 5H), 1,95-2,03 (m, 1H), 2,09 (dd, J=11,1, 4,0 Гц, 1H), 2,29 (d, J=12,8 Гц, 1H), 2,36 (td, J=7,1, 2,0 Гц, 2H), 2,49-2,59 (m, 1H), 3,57 (d, J=7,3 Гц, 2H), 3,77 (s, 2H), 4,15 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,23-4,34 (m, 2H), 4,38 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,47 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,74 (s, 1H), 4,89 (d, J=5,3 Гц, 1H), 5,37 (s, 1H), 5,90 (t, J=1,6 Гц, 1H), 6,13 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,73 (d, J=1,8 Гц, 2H), 6,97 (s, 2H), 7,17 (d, 2H), 7,28 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,31-7,36 (m, 2H), 7,76 (d, J=1,5 Гц, 1H), 8,17 (d, J=7,6 Гц, 1H), 8,29 (d, J=7,1 Гц, 1H), 8,90 (s, 1H), 9,72 (s, 1H)
113	Способ r, Таблица 7 R_t=0,80 мин; масса/заряд=880,26 [M+H⁺]	¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ: 0,84 (s, 3H), 1,04 (ddd, J=34,7, 11,8, 4,1 Гц, 2H), 1,14 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,25 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,38 (s, 3H), 1,54-1,81 (m, 4H), 1,95-2,04 (m, 1H), 2,10 (tt, J=10,9, 5,9 Гц, 1H), 2,25-2,33 (m, 1H), 2,37 (dd, J=8,0, 6,5 Гц, 2H), 2,49-2,59 (m, 1H), 3,58 (t, J=7,3 Гц, 2H), 3,78 (s, 2H), 4,15 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,21 (p, J=7,1 Гц, 1H), 4,25-4,36 (m, 2H), 4,45 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,76 (s, 1H), 4,87 (d, J=5,3 Гц, 1H), 5,27 (s, 1H), 5,92 (t, J=1,6 Гц, 1H), 6,14 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,77 (dd, J=7,7, 1,6 Гц, 1H), 6,84-6,91 (m, 2H), 6,97 (s, 2H), 6,99 (d, J=7,7 Гц, 1H), 7,11-7,17 (m, 1H), 7,30 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,39-7,45 (m, 2H), 8,03 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,16 (d, J=7,2 Гц, 1H), 9,55 (s, 1H), 9,72 (s, 1H)

Пример 36. Синтез N-(3-аминофенил)-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензамида

Стадия 1. Синтез 4-формилбензоилхлорида

К имеющему температуру 0°C раствору 4-формилбензойной кислоты (15,01 г, 100 ммоль) в THF (100 мл) добавляли по каплям оксалилхлорид (17,51 мл, 200 ммоль) с последующим добавлением по каплям N,N-диметилформамида (0,387 мл, 5,00 ммоль). Обеспечивали нагревание смеси до комнатной температуры и затем перемешивали дополнительно 2 ч. Смесь концентрировали in vacuo с получением 4-формилбензоилхлорида (16,86 г, 100 ммоль, выход 100%), который применяли без дополнительной очистки.

Стадия 2. Синтез трет-бутил(3-(4-формилбензамидо)фенил)карбамата

К имеющему температуру 0°C раствору 4-формилбензоилхлорида (16,86 г, 100 ммоль) в THF (100 мл) добавляли по каплям триэтиламин (63,4 мл, 455 ммоль) с последующим добавлением трет-бутил(3-аминофенил)карбамата (18,93 г, 91 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 2 ч. смесь разбавляли EtOAc (200 мл), промывали водой (2×100 мл) и солевым раствором (100 мл), высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали in vacuo. Остаток растирали в порошок в 20 мл EtOAc/PE (1:1) и собирали полученный осадок с получением трет-бутил(3-(4-формилбензамидо)фенил)карбамата (27,8 г, 82 ммоль, выход 90%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ e Таблица 7) R_t=2,00 мин; MS масса/заряд=285 [M-_t-Bu].

Стадия 3. Синтез N-(3-аминофенил)-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензамида

К перемешиваемому раствору (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (9,42 г, 25,02 ммоль), трет-бутил(3-(4-формилбензамидо)фенил)карбамата (8,515 г, 25,02 ммоль), полученного способом, аналогичным таковому из примера 2, стадии 5, и MgSO₄ (12,04 г, 100 ммоль) в MeCN(250 мл) добавляли по каплям трифторметансульфоновую кислоту (11,11 мл, 125 ммоль) при 0°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 2 часов, а затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали дополнительно 16 ч. Смесь фильтровали и промывали с помощью THF и концентрировали фильтрат in vacuo. Остаток растворяли в THF (100 мл) и затем нейтрализовали с помощью 1 M водного раствора NaOH до pH=8. Смесь экстрагировали с помощью EtOAc (200 мл), промывали водой (2×100 мл) и солевым раствором (100 мл), высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали in vacuo. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния) с элюированием 5% MeOH/DCM получали неочищенный продукт, который дополнительно очищали посредством HPLC с обращенной фазой на Sunfire C18, 10 микрон (колонка 250×19 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,05% TFA в воде (B) при расходе 30 мл/мин. (0-10,0 мин. линейный градиент 22-32%, удерживание 5 мин.). Объединенные фракции замораживали и лиофилизировали с получением N-(3-аминофенил)-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензамида (1,972 г, 3,29 ммоль, выход 13%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=1,37 мин; MS масса/заряд=599 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, Метанол-d₄) δ 8,01-7,92 (m, 3H), 7,64 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,55-7,40 (m, 3H), 7,05 (d, J=7,8 Гц, 1H), 6,27 (dd, J=10,2, 1,8 Гц, 1H), 6,03 (s, 1H), 5,60 (s, 1H), 5,13 (d, J=4,1 Гц, 1H), 4,68 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,45 (d, J=3,3 Гц, 1H), 4,37 (d, J=19,4 Гц, 1H), 2,68 (dt, J=14,5, 7,0 Гц, 1H), 2,41 (dd, J=13,7, 10,2 Гц, 1H), 2,29 (d, J=10,5 Гц, 1H), 2,18 (d, J=12,8 Гц, 1H), 1,99 (dd, J=13,8, 3,5 Гц, 1H), 1,94-1,80 (m, 2H), 1,82-1,69 (m, 2H), 1,52 (s, 3H), 1,14 (m, J=16,8, 8,0 Гц, 2H), 1,02 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: N-(3-аминофенил)-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензамид (112 мг, 0,176 ммоль, выход 0,9%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ e, Таблица 7) R_t=1,53 мин; MS масса/заряд=599 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, MeOH-d₄) δ 7,90 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,48 (dd, J=8,1, 3,5 Гц, 3H), 7,15 (d, J=2,2 Гц, 1H), 7,09 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,96 (d, J=8,1 Гц, 1H), 6,59-6,51 (m, 1H), 6,28 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,25 (s, 1H), 6,05 (s, 1H), 5,51-5,37 (m, 1H), 4,45 (s, 1H), 4,30 (d, J=19,2 Гц, 1H), 4,14 (d, J=19,2 Гц, 1H), 2,70 (t, J=13,6 Гц, 1H), 2,43 (d, J=13,3 Гц, 1H), 2,22 (dd, J=23,3, 12,5 Гц, 2H), 2,07 (d, J=13,5 Гц, 1H), 1,93 (q, J=5,1, 3,5 Гц, 2H), 1,80 (d, J=14,0 Гц, 2H), 1,53 (d, J=1,7 Гц, 3H), 1,21 (dd, J=41,7, 12,1 Гц, 2H), 1,03 (s, 3H).

Пример 37. Синтез N-(3-аминофенил)-4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензамида

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 36 выше. Основной изомер ацеталя: N-(3-аминофенил)-4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензамид. LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=1,35 мин; MS масса/заряд=617 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 10,29 (d, J=7,4 Гц, 1H), 8,00-7,93 (m, 2H), 7,73 (s, 1H), 7,59 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,43 (s, 0H), 7,38 (s, 1H), 7,29 (dd, J=10,0, 5,3 Гц, 2H), 6,81 (s, 1H), 6,24 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,05 (d, J=1,6 Гц, 1H), 5,62 (s, 1H), 5,49 (s, 1H), 5,03-4,96 (m, 1H), 4,58 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,23 (d, J=19,6 Гц, 1H), 2,73-2,52 (m, 1H), 2,40-2,32 (m, 1H), 2,25-2,12 (m, 1H), 2,11-2,02 (m, 1H), 1,92-1,84 (m, 1H), 1,76-1,67 (m, 3H), 1,51 (s, 3H), 1,40 (tt, J=14,3, 7,1 Гц, 1H), 0,90 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: N-(3-аминофенил)-4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензамид. LCMS (Способ B, Таблица 7) R_t=1,45 мин; MS масса/заряд=617 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ ppm: 8,06 (s, 1H), 7,95 (d, J=8,4 Гц, 2H), 7,54-7,41 (m, 5H), 7,09 (d, J=6,8 Гц, 1H), 6,34 (d, J=10 Гц, 1H), 6,28 (s, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,49 (d, J=6,4 Гц, 1H), 4,34-4,13 (m, 3H), 2,79-2,24 (m, 5H), 1,74-1,63 (m, 2H), 1,60 (s, 3H), 1,04 (s, 3H).

Пример 38. Синтез N-(3-аминофенил)-4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензамида

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 36 выше. Основной изомер ацеталя: N-(3-аминофенил)-4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензамид. LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=1,376 мин, MS масса/заряд=635 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, MeOH-d₄) δ 7,96 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,88 (d, J=2,1 Гц, 1H), 7,64 (dd, J=8,3, 1,5 Гц, 2H), 7,48-7,42 (m, 1H), 7,39 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,34 (d, J=10,0 Гц, 1H), 6,98 (dt, J=7,7, 1,6 Гц, 1H), 6,41-6,26 (m, 2H), 5,71-5,45 (m, 2H), 5,14 (d, J=4,1 Гц, 1H), 4,69 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,44-4,28 (m, 2H), 2,73 (dt, J=25,9, 12,1 Гц, 1H), 2,41 (td, J=11,7, 6,9 Гц, 2H), 2,29 (dt, J=14,0, 3,6 Гц, 1H), 1,91-1,67 (m, 4H), 1,60 (s, 4H), 1,02 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: N-(3-аминофенил)-4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензамид. LCMS (Способ e, Таблица 7) R_t= 1,506 мин, MS масса/заряд=635 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, MeOH-d₄) δ 7,90 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,49 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,35 (d, J=10,0 Гц, 1H), 7,16 (d, J=2,2 Гц, 1H), 7,09 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,96 (d, J=8,2 Гц, 1H), 6,65-6,48 (m, 1H), 6,41-6,27 (m, 3H), 5,76-5,39 (m, 2H), 4,42-4,22 (m, 2H), 4,15 (d, J=19,4 Гц, 1H), 2,66 (dd, J=27,8, 13,4 Гц, 1H), 2,47-2,24 (m, 3H), 2,08-1,85 (m, 2H), 1,75 (t, J=14,9 Гц, 2H), 1,61 (s, 3H), 1,03 (s, 3H).

Пример 39. Синтез 3-аминофенил-4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензоата

Стадия 1. Синтез трет-бутил(3-гидроксифенил)карбамата

К раствору 3-аминофенола (10 г, 92 ммоль) в THF (450 мл) добавляли Boc-ангидрид (23,40 мл, 101 ммоль). Смесь нагревали при 85°C в течение 16 ч., контролировали с помощью LCMS. После этого смесь концентрировали с получением остатка, который растворяли в EtOAc (150 мл) и промывали водой (100 мл), насыщенным NaHCO₃(100 мл) и солевым раствором (100 мл), высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали in vacuo. Неочищенный материал промывали с помощью PE (50 мл x 2) с получением указанного в заголовке соединения (16,5 г, 76 ммоль, выход 82%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ g, Таблица 7) R_t= 1,66 мин, MS масса/заряд=232,1 [M+Na+].

Стадия 2. Синтез 3-((трет-бутоксикарбонил)амино)фенил-4-формилбензоата

К раствору трет-бутил(3-гидроксифенил)карбамата (5 г, 23,90 ммоль) в DCM (60 мл) при 0°C добавляли 4-формилбензойную кислоту (3,59 г, 23,90 ммоль), N, N'-дициклогексилкарбодиимид (7,40 г, 35,8 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (0,584 г, 4,78 ммоль). Полученную смесь перемешивали при данной температуре в течение 10 мин. в атмосфере аргона. Затем смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивание продолжали в течение 16 ч. Смесь охлаждали в ледяной бане. Побочный продукт, представляющий собой N, N'-дициклогексилмочевину, отфильтровывали в виде осадка и прозрачный фильтрат концентрировали под вакуумом. Неочищенный материал очищали посредством хроматографии на силикагеле с элюированием DCM/EtOAc (100%~30:1) с получением указанного в заголовке соединения (7,0 г, 18,54 ммоль, выход 78%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=2,17 мин, MS масса/заряд=364,0 [M+Na⁺].

Стадия 3. Синтез 3-аминофенил-4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензоата

К перемешиваемому раствору (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-дифтор-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (стадия 5, пример 2) (7,248 г, 17,58 ммоль) и 3-((трет-бутоксикарбонил)амино)фенил-4-формилбензоата (6 г, 17,58 ммоль) в безводном MeCN (40 мл) и THF (40 мл) при 0°C в атмосфере азота добавляли по каплям трифторметансульфоновую кислоту (7,8 мл, 87,9 ммоль). Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч., затем выливали в ледяную воду (30 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (2×45 мл). Объединенные органические слои промывали охлажденной водой (2×30 мл), солевым раствором (30 мл), насыщенным NaHCO₃ (30 мл) и дополнительно водой (30 мл), концентрировали in vacuo с получением твердого вещества желтого цвета. Неочищенный материал очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (200-300 меш) с элюированием DCM/МмeOH (100%~40:1) и затем дополнительно очищали посредством препаративной HPLC с получением указанного в заголовке соединения (основной изомер ацеталя) (2,166 г, 3,32 ммоль, выход 19%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,54 мин ; MS масса/заряд=636,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 8,13 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,66 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,27 (dd, J=10,1, 1,4 Гц, 1H), 7,06 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,48 (dd, J=8,3, 2,1 Гц, 1H), 6,40 (t, J=2,2 Гц, 1H), 6,34 (dd, J=7,8, 2,2 Гц, 1H), 6,30 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,82-5,47 (m, 3H), 5,31 (s, 2H), 5,15 (t, J=5,9 Гц, 1H), 5,03 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,60 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,33-4,12 (m, 2H), 2,66 (ddd, J=26,2, 13,7, 9,3 Гц, 1H), 2,31 (d, J=10,9 Гц, 1H), 2,21 (td, J=12,4, 6,3 Гц, 1H), 2,12-1,98 (m, 1H), 1,84-1,64 (m, 3H), 1,50 (s, 4H), 0,89 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя 3-аминофенил-4-((2S,6aS, 6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-2, 6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a, 8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензоат также выделяли (1,073 г, 1,676 ммоль, выход 10%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,58мин; MS масса/заряд=636,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 8,13-8,06 (m, 2H), 7,51 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,28 (dd, J=10,1, 1,4 Гц, 1H), 7,06 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,52-6,44 (m, 1H), 6,43-6,28 (m, 4H), 6,14 (s, 1H), 5,80-5,48 (m, 2H), 5,39 (d, J=6,8 Гц, 1H), 5,31 (s, 2H), 5,04 (t, J=6,1 Гц, 1H), 4,26-4,15 (m, 2H), 4,05 (dd, J=19,2, 5,9 Гц, 1H), 2,67-2,51 (m, 1H), 2,29 (d, J=6,9 Гц, 1H), 2,27-2,14 (m, 1H), 2,11 (d, J=13,5 Гц, 1H), 1,96-1,59 (m, 4H), 1,51 (s, 3H), 0,90 (s, 3H).

Пример 40. Синтез 3-аминофенил-4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензоата

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 39 выше. Основной изомер ацеталя: 3-аминофенил-4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензоат. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,54 мин; MS масса/заряд=618,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, MeOH-d₄) δ 8,19 (dd, J=7,8, 1,9 Гц, 2H), 7,67 (d, J=8,0 Гц, 2H), 7,41 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,35 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,97-6,84 (m, 3H), 6,32 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,63 (s, 1H), 5,13 (d, J=5,0 Гц, 1H), 4,69 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,43-4,30 (m, 2H), 2,76 (td, J=13,6, 5,8 Гц, 1H), 2,70-2,54 (m, 1H), 2,43 (d, J=13,6 Гц, 1H), 2,31 (ddd, J=14,9, 11,6, 4,5 Гц, 2H), 2,01-1,92 (m, 1H), 1,89-1,69 (m, 3H), 1,62 (s, 4H), 1,03 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: 3-аминофенил-4-((6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензоат. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,58 мин; MS масса/заряд=618,2 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 8,10 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,52 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,30 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,16 (dd, J=9,8, 6,0 Гц, 1H), 6,64 (d, J=8,2 Гц, 1H), 6,61-6,51 (m, 2H), 6,31-6,19 (m, 2H), 6,05 (s, 1H), 5,47 (s, 1H), 5,38 (d, J=6,7 Гц, 1H), 4,19 (d, J=18,7 Гц, 2H), 4,04 (d, J=19,2 Гц, 1H), 2,66 (td, J=13,9, 6,3 Гц, 1H), 2,48-2,33 (m, 1H), 2,17-2,05 (m, 2H), 1,87 (dt, J=13,8, 7,0 Гц, 2H), 1,84-1,69 (m, 2H), 1,51 (s, 4H), 0,90 (s, 3H).

Пример 41. Синтез 3-аминофенил-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензоата

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 39 выше. Основной изомер ацеталя: 3-аминофенил-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензоат. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,86 мин; MS масса/заряд=599,8 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, MeOH-d₄) δ 8,14 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,64 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,44 (d, J=10,0 Гц, 1H), 7,14 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,63 (dd, J=8,1, 2,2 Гц, 1H), 6,54 (q, J=2,6 Гц, 1H), 6,48 (dd, J=8,1, 2,2 Гц, 1H), 6,24 (dd, J=10,0, 2,0 Гц, 1H), 6,00 (s, 1H), 5,59 (s, 1H), 5,13 (d, J=4,4 Гц, 1H), 4,69 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,43 (q, J=3,3 Гц, 1H), 4,37 (d, J=19,4 Гц, 1H), 2,66 (td, J=13,4, 5,3 Гц, 1H), 2,38 (dd, J=13,7, 4,1 Гц, 1H), 2,32-2,19 (m, 1H), 2,14 (d, J=12,7 Гц, 1H), 2,06-1,93 (m, 1H), 1,94-1,85 (m, 1H), 1,89-1,68 (m, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,22-1,01 (m, 2H), 1,02 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: 3-аминофенил-4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензоат. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,89 мин; MS масса/заряд=599,8 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, MeOH-d₄) δ 8,22-8,11 (m, 2H), 7,53 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,49 (d, J=10,0 Гц, 1H), 7,14 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,63 (dd, J=8,1, 2,1 Гц, 1H), 6,55 (t, J=2,2 Гц, 1H), 6,53-6,45 (m, 1H), 6,33-6,24 (m, 2H), 6,05 (t, J=1,6 Гц, 1H), 5,46 (t, J=3,8 Гц, 1H), 4,46 (q, J=3,3 Гц, 1H), 4,30 (d, J=19,2 Гц, 1H), 4,15 (d, J=19,2 Гц, 1H), 2,70 (td, J=13,5, 5,4 Гц, 1H), 2,48-2,38 (m, 1H), 2,23 (ddd, J=24,3, 12,6, 6,6 Гц, 2H), 2,12-2,03 (m, 1H), 2,02-1,89 (m, 2H), 1,89-1,77 (m, 2H), 1,53 (s, 3H), 1,26 (tt, J=12,4, 6,3 Гц, 1H), 1,17 (dd, J=11,1, 3,6 Гц, 1H), 1,03 (s, 3H).

Пример 42. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенокси)метил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез трет-бутил-(3-((4-формилбензил)окси)фенил)карбамата

К раствору 4-(бромметил)бензальдегида (34,4 г, 173 ммоль) в диметилформамиде (200 мл) последовательно добавляли K₂CO₃ (47,8 г, 346 ммоль) и трет-бутил (3-гидроксифенил)карбамат (36,2 г, 173 ммоль). Суспензию желтого цвета затем нагревали при 80°C на масляной бане в течение 2 ч. Реакцию гасили с помощью воды (200 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (2×200 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (100 мл), высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали посредством хроматографии (силикагель; петролейный эфир до 80:20 PE/EtOAc; градиент элюирования) с получением трет-бутил-(3-((4-формилбензил)окси)фенил)карбамата (47,27 г, 144 ммоль, выход 83%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ h Таблица 7) R_t=1,92 мин; MS масса/заряд=272 [M-t-Bu+H⁺].

Стадия 2. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенокси)метил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Трифторметансульфоновую кислоту (17,76 мл, 200 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C перемешиваемой суспензии (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17- (2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (15,06 г, 40 ммоль) и трет-бутил (3-((4-формилбензил)окси)фенил)карбамата (13,75 г, 42,0 ммоль), и MgSO₄ (19,26 г, 160 ммоль) в MeCN (400 мл). Реакционную смесь затем нагревали до 20°C и перемешивали в течение дополнительных 2 ч. Смесь фильтровали и промывали с помощью THF и фильтрат концентрировали in vacuo. Остаток растворяли в THF (100 мл), нейтрализовали с помощью 1 M водного NaOH до pH 8, разбавляли с помощью EtOAc (200 мл), промывали водой (2×200 мл) и солевым растворов (200 мл), высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали in vacuo. Остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (MeOH:DCM=1:20). Полученный материал дополнительно очищали посредством препаративной HPLC на Sunfire C18 10 микрон (250×19 мМ колонка). Применяли градиент MeCN (A) и 0,05% TFA в воде (B), при расходе 30 мл/мин. (0-10,0 мин. линейный градиент 22-32% A, удерживание 5 мин.) с получением указанного в заголовке соединения (7,338 г, 12,15 ммоль, выход 30%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ i, Таблица 7) R_t=1,47 мин; MS масса/заряд=586 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, MeOD-d₄) δ 7,502-7,446 (m, 5H), 7,389-7,349 (m, 1H), 7,009, 6,988 (dd, J1=2 Гц, J2=8,4 Гц, 1H), 6,890-6,859 (m, 2H), 6,275, 6,250 (dd, J1=1,2 Гц, J2=8,8 Гц, 1H), 6,027 (s, 1H), 5,501 (s, 1H), 5,147 (s, 2H), 5,107, 5,078 (dd, J1=6,8 Гц, J2=11,6 Гц, 1H), 4,672 (d, J=19,6 Гц, 1H), 4,436 (s, 1H), 4,370 (d, J=19,2 Гц, 1H), 2,706-2,671 (m, 1H), 2,652-2,265 (m, 3H), 2,002-1,700 (m, 5H), 1,512 (s, 3H), 1,151-1,112 (m, 1H), 1,054-1,009 (m, 4H).

Минорный изомер ацеталя: (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенокси)метил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он, минорный изомер ацеталя также выделяли (354 мг, 0,604 ммоль, выход 2%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ i, Таблица 7) R_t=1,51 мин; MS масса/заряд=586 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,416 (d, J=8 Гц, 2H), 7,332-7,276 (m, 3H), 6,879 (t, J=8 Гц, 1H), 6,185-6,115 (m, 5H), 5,948 (s, 1H), 5,319 (d, J=6,8 Гц, 1H), 5,041-5,014 (m, 3H), 4,980 (s, 2H), 4,791 (d, J=3,2 Гц, 1H), 4,302-4,239 (m, 2H), 4,056, 4,008 (dd, J1=6 Гц, J2=19,6 Гц, 1H), 2,552-2,540 (m, 1H), 2,337-2,304 (m, 1H), 2,075-2,005 (m, 2H), 1,884-1,736 (m, 5H), 1,395 (s, 3H), 1,219-1,045 (m, 2H), 0,892 (s, 3H).

Пример 43. Синтез (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенокси)метил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 42 выше. Основной изомер ацеталя: (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенокси)метил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ i, Таблица 7) R_t=1,74 мин; MS масса/заряд=604 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,48-7,49 (m, 4H), 7,44-7,33 (m, 2H), 7,02 (dd, J=8,3, 1,9 Гц, 1H), 6,96-6,84 (m, 2H), 6,32 (dd, J=10,1, 1,8 Гц, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,52 (s, 1H), 5,16 (s, 2H), 5,08 (d, J=4,9 Гц, 1H), 4,65 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,46-4,27 (m, 2H), 2,84-2,50 (m, 2H), 2,45-2,27 (m, 3H), 2,01-1,90 (m, 1H), 1,80-1,70 (m, 3H), 1,62 (s, 3H), 1,55 (dd, J=12,8, 4,8 Гц, 1H), 1,02 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенокси)метил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ i, Таблица 7) R_t=1,77 мин; MS масса/заряд=604 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 7,42 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,36-7,25 (m, 3H), 7,01 (t, J=8,1 Гц, 1H), 6,43-6,30 (m, 3H), 6,24 (dd, J=10,1, 1,5 Гц, 1H), 6,12 (s, 1H), 6,04 (s, 1H), 5,47 (s, 1H), 5,35 (d, J=7,1 Гц, 1H), 5,02 (s, 2H), 4,31-4,14 (m, 2H), 4,04 (d, J=19,2 Гц, 1H), 2,72-2,58 (m, 1H), 2,18-1,98 (m, 2H), 1,85 (d, J=6,9 Гц, 2H), 1,77-1,63 (m, 2H), 1,58-1,40 (m, 4H), 0,90 (s, 3H).

Пример 44. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенокси)метил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 42 выше. Основной изомер ацеталя: (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенокси)метил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=1,45 мин; MS масса/заряд=622 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 7,44 (s, 4H), 7,27 (d, J=10,1 Гц, 1H), 6,87 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,30 (dd, J=10,1, 1,5 Гц, 1H), 6,24-6,04 (m, 4H), 5,81-5,39 (m, 3H), 5,13 (t, J=5,9 Гц, 1H), 5,09-4,91 (m, 5H), 4,55 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,32-4,09 (m, 2H), 3,60 (t, J=6,3 Гц, 2H), 2,81-2,55 (m, 1H), 2,40-2,14 (m, 2H), 2,06 (d, J=13,6 Гц, 1H), 1,85-1,63 (m, 6H), 1,58-1,43 (m, 4H), 0,88 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенокси)метил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=1,49 мин; MS масса/заряд=622 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 7,41 (d, J=8,1 Гц, 3H), 7,35-7,20 (m, 3H), 6,88 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,31 (dd, J=10,1, 1,6 Гц, 1H), 6,16 (dd, J=13,9, 5,0 Гц, 6H), 5,77-5,45 (m, 2H), 5,36 (d, J=7,1 Гц, 1H), 4,35-4,13 (m, 2H), 4,05 (dd, J=18,9, 4,9 Гц, 1H), 2,70-2,53 (m, 1H), 2,29 (s, 1H), 2,24-2,13 (m, 1H), 2,12-2,04 (m, 1H), 1,96-1,81 (m, 1H), 1,81-1,63 (m, 3H), 1,50 (s, 4H), 0,89 (s, 3H).

Пример 45. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминобензил)окси)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез трет-бутил-(3-(гидроксиметил)фенил)карбамата

К раствору (3-аминофенил)метанола (88,5 г, 719 ммоль) в THF (80 мл) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (184 мл, 790 ммоль). Смесь перемешивали при 25°C в течение ночи. Смесь затем концентрировали до сухого состояния и остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью EtOAc/гексаны=1:9, об./об.) с получением указанного в заголовке соединения (161,1 г, 722 ммоль, выход 100%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ j, Таблица 7) R_t=1,77 мин; MS масса/заряд=246 [M+Na⁺]. Стадия 2. Синтез трет-бутил-(3-(бромметил)фенил)карбамата

К раствору трет-бутил-(3-(гидроксиметил)фенил)карбамата (120 г, 484 ммоль) в THF (50 мл) при -20°C добавляли трифенилфосфин (254 г, 967 ммоль) после чего добавляли N-бромсукцинимид (103 г, 580 ммоль). После перемешивания в течение 3 ч. растворитель удаляли in vacuo и остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью гексан:EtOAc=100:1) с получением указанного в заголовке соединения (125 г, 437 ммоль, 90% выход) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ j, Таблица 7) R_t=2,10 мин; MS масса/заряд=230, 232 [M-t-Bu+H⁺].

Стадия 3. Синтез трет-бутил-(3-((4-формилфенокси)метил)фенил)карбамата

Смесь 4-гидроксибензальдегида (25,6 г, 210 ммоль) и карбоната калия (29,0 г, 210 ммоль) в диметилформамиде (300 мл) перемешивали в течение 15 мин. Затем добавляли трет-бутил (3-(бромметил)фенил)карбамат (60 г, 210 ммоль). Смесь нагревали до 60°C и перемешивали в течение 2 часов при данной температуре. Смесь выливали в 50 мл воды и экстрагировали с помощью EtOAc (3×50 мл). Объединенные органические слои промывали водой (1×100 мл) и солевым раствором (1×100 мл), концентрировали в вакууме. Неочищенный материал очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью дихлорметан/метанол=500:1) с получением указанного в заголовке соединения (72 г, 209 ммоль, выход 100%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ j, Таблица 7) R_t=2,08 мин; MS масса/заряд=272 [M-t-Bu+H⁺].

Стадия 4. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминобензил)окси)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Трифторметансульфоновую кислоту (12,38 мл, 139 ммоль) добавляли по каплям к смеси сульфата магния (13,43 г, 112 ммоль), трет-бутил (3-((4-формилфенокси)метил)фенил)карбамата (10,96 г, 33,5 ммоль) и (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11, 16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10, 13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (10,5 г, 27,9 ммоль) в MeCN (150 мл) при 0°C. Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 часов при данной температуре. Смесь фильтровали и фильтрат выливали в 500 мл насыщенного раствора натрия бикарбоната, экстрагировали с помощью EtOAc (250 мл). Органический слой промывали солевым раствором (200 мл) и водой (200 мл), концентрировали in vacuo. Неочищенный материал очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью DCM-MeOH=50:1, об./об.), и полученный продукт дополнительно очищали посредством Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения (6,04 г, 10,31 ммоль, выход 37%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ k, Таблица 7) R_t=1,91 мин; MS масса/заряд=586 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,35 (dd, J=19,6, 9,4 Гц, 3H), 7,09-6,89 (m, 3H), 6,61-6,33 (m, 3H), 6,18 (dd, J=10,1, 1,7 Гц, 1H), 5,95 (s, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,16-5,01 (m, 3H), 5,02-4,85 (m, 3H), 4,80 (d, J=3,0 Гц, 1H), 4,50 (dd, J=19,5, 6,3 Гц, 1H), 4,31 (s, 1H), 4,18 (dd, J=19,4, 5,5 Гц, 1H), 2,33 (d, J=10,5 Гц, 1H), 2,17-1,98 (m, 2H), 1,90-1,53 (m, 5H), 1,40 (s, 3H), 1,13-0,96 (m, 2H), 0,87 (s, 3H).

Пример 46. Синтез (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминобензил)окси)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 45 выше. LCMS (Способ k, Таблица 7) R_t=1,89 мин; MS масса/заряд=604 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,32 (dd, J=17,3, 9,4 Гц, 3H), 7,10-6,94 (m, 3H), 6,65-6,35 (m, 3H), 6,25 (dd, J=10,1, 1,7 Гц, 1H), 6,05 (s, 1H), 5,58-5,32 (m, 2H), 5,22-5,03 (m, 3H), 5,01-4,86 (m, 3H), 4,52 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,20 (dd, J=19,4, 5,5 Гц, 2H), 2,78-2,56 (m, 1H), 2,44-2,31 (m, 1H), 2,19 (td, J=12,0, 6,8 Гц, 1H), 2,06 (d, J=13,7 Гц, 1H), 1,95-1,81 (m, 1H), 1,68 (dd, J=15,4, 9,7 Гц, 3H), 1,57-1,30 (m, 4H), 0,88 (s, 3H).

Пример 47. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминобензил)окси)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 45 выше. LCMS (Способ C, Таблица 7) R_t=1,45 мин; MS масса/заряд=622 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,57-7,29 (m, 6H), 7,24 (d, J=7,7 Гц, 1H), 7,02 (d, J=8,6 Гц, 2H), 6,45-6,23 (m, 2H), 5,69-5,49 (m, 1H), 5,46 (s, 1H), 5,16 (s, 2H), 5,06 (d, J=3,7 Гц, 1H), 4,64 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,43-4,15 (m, 2H), 2,89-2,56 (m, 1H), 2,52-2,32 (m, 2H), 2,28 (d, J=13,8 Гц, 1H), 1,87-1,62 (m, 4H), 1,60 (s, 3H), 1,00 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминобензил)окси)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ C, Таблица 7) R_t=1,48 мин; MS масса/заряд=622 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 7,41-7,13 (m, 3H), 7,08-6,90 (m, 3H), 6,61 (s, 1H), 6,52 (dd, J=17,3, 7,5 Гц, 2H), 6,31 (d, J=10,2 Гц, 1H), 6,11 (d, J=18,4 Гц, 2H), 5,79-5,56 (m, 1H), 5,53 (d, J=3,3 Гц, 1H), 5,34 (d, J=7,2 Гц, 1H), 5,18-5,00 (m, 3H), 4,93 (s, 2H), 4,28 (dd, J=19,1, 6,2 Гц, 1H), 4,19 (d, J=5,9 Гц, 1H), 4,05 (dd, J=19,1, 5,9 Гц, 1H), 3,60 (t, J=6,2 Гц, 3H), 2,72-2,51 (m, 1H), 2,29 (s, 1H), 2,22-2,11 (m, 1H), 2,06 (d, J=13,4 Гц, 1H), 1,93-1,80 (m, 1H), 1,80-1,60 (m, 6H), 1,50 (s, 3H), 1,36 (s, 1H), 0,89 (s, 3H).

Пример 48. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)этинил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез трет-бутил-(3-этинилфенил)карбамата

Ди-трет-бутилдикарбонат (123 мл, 531 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору 3-этиниланилина (56,6 г, 483 ммоль) в THF (300 мл). Смесь нагревали до температуры возврата флегмы в течение ночи. Смесь затем охлаждали до температуры окружающей среды и поглощали с помощью этилацетата (500 мл) и последовательно промывали с помощью 1 н. водной HCl (200 мл), насыщенного водного Na₂CO₃ (200 мл) и солевого раствора (200 мл). Органический слой высушивали над Na₂SO₄, концентрировали in vacuo и очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью 15% EtOAc/PE) с получением трет-бутил-(3-этинилфенил)карбамата (94 г, 435 ммоль, 90% выход). LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=1,80 мин; MS масса/заряд=162 [M-t-Bu+H⁺].

Стадия 2. Синтез трет-бутил-(3-((4-формилфенил)этинил)фенил)карбамата

В 500 мл круглодонной колбе растворяли 4-йодбензальдегид (30,2 г, 130 ммоль), хлорид бис(трифенилфосфин)палладия(II) (4,56 г, 6,50 ммоль), йодид меди(I) (2,476 г, 13,00 ммоль) и трифенилфосфин (3,41 г, 13,00 ммоль) в THF (200 мл) и триэтиламин (181 мл, 1300 ммоль) с последующим добавлением трет-бутил-(3-этинилфенил)карбамата (28,2 г, 130 ммоль). Смесь перемешивали при 75°C в атмосфере азота в течение 16 ч. После завершения реакции летучие растворители полностью удаляли. Неочищенный материал очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (элюировали с помощью PE/CH₂Cl₂=1:3) с получением трет-бутил-(3-((4-формилфенил)этинил)фенил)карбамата (35,5 г, 111 ммоль, выход 85%) в виде грязно-белого твердого вещества. LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=2,08 мин; MS масса/заряд=322 [M+H⁺].

Стадия 3. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)этинил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Трифторметансульфоновую кислоту (4,44 мл, 50,0 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C суспензии (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16, 17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (3,76 г, 10,00 ммоль), трет-бутил-(3-((4-формилфенил)этинил)фенил)карбамата (3,21 г, 10 ммоль) и MgSO₄ (4,81 г, 40,0 ммоль) в MeCN (100 мл). Смесь перемешивали в течение дополнительных 2 ч. Смесь фильтровали и промывали с помощью THF. Фильтрат концентрировали in vacuo. Остаток растворяли в THF (50 мл), нейтрализовали с помощью 1 M водного NaOH водного раствора до pH=8, экстрагировали с помощью EtOAc (200 мл), промывали водой (2×100 мл) и солевым раствором (100 мл), высушивали над (Na₂SO₄ и концентрировали in vacuo. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель, элюировали с помощью MeOH: DCM=1:40) с получением 2,5 г неочищенного продукта, который дополнительно очищали посредством Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения (1,449 г, 2,500 ммоль, выход 25%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ l, Таблица 7) R_t=1,86 мин; MS масса/заряд=580 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,65-7,41 (m, 4H), 7,32 (d, J=9,9 Гц, 2H), 7,05 (dd, J=9,8, 5,7 Гц, 1H), 6,85-6,49 (m, 4H), 6,29-6,05 (m, 1H), 6,01-5,83 (m, 1H), 5,63-5,40 (m, 1H), 5,26 (s, 2H), 5,12 (t, J=5,8 Гц, 1H), 4,96 (d, J=4,3 Гц, 1H), 4,82 (d, J=3,0 Гц, 1H), 4,63-4,41 (m, 1H), 4,37-4,08 (m, 2H), 2,40-1,91 (m, 5H), 1,87-1,52 (m, 6H), 1,40 (s, 4H), 1,14-0,95 (m, 2H), 0,88 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя, (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)этинил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-он, также выделяли (85 мг, 0,147 ммоль, выход 1,5%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ i, Таблица 7) R_t=1,93 мин ; MS масса/заряд=580 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,51 (d, J=7,6 Гц, 2H), 7,42-7,21 (m, 3H), 7,05 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,83-6,45 (m, 3H), 6,29-6,07 (m, 2H), 5,95 (s, 1H), 5,47-5,14 (m, 3H), 4,82 (s, 1H), 4,38-4,14 (m, 2H), 4,03 (d, J=19,3 Гц, 1H), 2,33 (d, J=10,3 Гц, 2H), 2,15-1,96 (m, 1H), 1,93-1,68 (m, 5H), 1,40 (s, 3H), 1,33-0,97 (m, 3H), 0,89 (s, 3H).

Пример 49. Синтез (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)этинил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 48 выше. Основной изомер ацеталя: (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)этинил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=1,57 мин ; MS масса/заряд=598 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,55 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,46 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,30 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,05 (t, J=7,8 Гц, 1H), 6,71 (s, 1H), 6,66 (d, J=7,5 Гц, 1H), 6,60 (d, J=7,8 Гц, 1H), 6,24 (d, J=8,9 Гц, 1H), 6,04 (s, 1H), 5,51 (d, J=15,2 Гц, 2H), 5,26 (s, 2H), 4,97 (d, J=4,4 Гц, 1H), 4,55 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,22 (d, J=19,5 Гц, 2H), 2,74-2,56 (m, 1H), 2,36 (d, J=9,7 Гц, 1H), 2,24-2,10 (m, 1H), 2,06 (d, J=14,5 Гц, 1H), 1,92-1,78 (m, 1H), 1,78-1,58 (m, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,45-1,31 (m, 1H), 0,88 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)этинил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=1,61 мин; MS масса/заряд=598 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,51 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,39-7,22 (m, 3H), 7,05 (t, J=7,8 Гц, 1H), 6,72 (s, 1H), 6,67 (d, J=7,6 Гц, 1H), 6,60 (d, J=8,1 Гц, 1H), 6,24 (d, J=10,1 Гц, 1H), 6,18 (s, 1H), 6,05 (s, 1H), 5,49 (s, 1H), 5,35 (d, J=6,9 Гц, 1H), 5,26 (s, 2H), 4,19 (d, J=18,9 Гц, 2H), 4,04 (d, J=19,1 Гц, 1H), 2,75-2,55 (m, 1H), 2,37 (d, J=10,2 Гц, 1H), 2,09 (d, J=7,1 Гц, 2H), 1,84 (d, J=6,5 Гц, 2H), 1,78-1,62 (m, 2H), 1,50 (s, 4H), 0,89 (s, 3H).

Пример 50. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)этинил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 48 выше. Основной изомер ацеталя: (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)этинил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=1,57 мин ; MS масса/заряд=616 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,55 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,47 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,27 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,05 (t, J=7,8 Гц, 1H), 6,71 (s, 1H), 6,66 (d, J=7,6 Гц, 1H), 6,60 (d, J=8,1 Гц, 1H), 6,30 (dd, J=10,1, 1,4 Гц, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,80-5,58 (m, 1H), 5,55 (d, J=7,1 Гц, 2H), 5,26 (s, 2H), 5,14 (t, J=5,9 Гц, 1H), 4,99 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,56 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,23 (dd, J=19,5, 5,4 Гц, 2H), 2,79-2,56 (m, 1H), 2,31 (s, 1H), 2,26-2,14 (m, 1H), 2,12-1,99 (m, 1H), 1,83-1,62 (m, 3H), 1,61-1,40 (m, 4H), 0,88 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)этинил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ f, Таблица 7) R_t=1,61 мин; MS масса/заряд=616 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,52 (d, J=8,3 Гц, 2H), 7,33 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,28 (d, J=10,0 Гц, 1H), 7,05 (t, J=7,8 Гц, 1H), 6,73 (s, 1H), 6,68 (d, J=7,5 Гц, 1H), 6,61 (d, J=8,1 Гц, 1H), 6,32 (dd, J=10,1, 1,7 Гц, 1H), 6,21 (s, 1H), 6,15 (s, 1H), 5,78-5,58 (m, 1H), 5,55 (d, J=2,7 Гц, 1H), 5,36 (t, J=7,9 Гц, 1H), 5,27 (s, 2H), 5,08 (t, J=5,8 Гц, 1H), 4,33-4,12 (m, 2H), 4,06 (dd, J=19,1, 5,0 Гц, 1H), 2,72-2,53 (m, 1H), 2,29 (s, 1H), 2,23-2,02 (m, 2H), 1,92-1,82 (m, 1H), 1,82-1,61 (m, 3H), 1,51 (s, 4H), 0,90 (s, 3H).

Пример 51. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((E)-3-аминостирил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез трет-бутил-(E)-(3-(2-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)винил)фенил)карбамата

4,4,5,5-Тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (16,70 мл, 115 ммоль) и карбонилхлоргидридотрис(трифенилфосфин)рутений(II) (2,63 г, 2,76 ммоль) добавляли к продутому азотом раствору трет-бутил-(3-этинилфенил)карбамата (10 г, 46,0 ммоль) в толуоле (150 мл). Смесь нагревали при 50°C в течение 16 ч, после чего ее концентрировали при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния) с элюированием с помощью PE/EtOAc (100%~10:1) получали указанное в заголовке соединение (13,25 г, 36,8 ммоль, выход 80%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ d Таблица 7) R_t=2,19 мин; MS масса/заряд=290,1 [M-_tBu]⁺. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 1,33 (s, 12H), 1,54 (s, 9H), 6,17 (d, J= 18,4 Гц, 1H), 6,49 (bs, 1H), 7,18 (d, J= 7,6 Гц, 1H), 7,26-7,29 (m, 1H), 7,35-7,40 (m, 2H), 7,47 (s, 1H).

Стадия 2. Синтез трет-бутил-(E)-(3-(4-формилстирил)фенил)карбамата

К раствору трет-бутил-(E)-(3-(2-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)винил)фенил)карбамата (6 г, 17,38 ммоль) и 4-бромбензальдегида (3,38 г, 18,25 ммоль) в THF (85 мл) при 20°C в атмосфере N₂ добавляли K₂CO₃ (4,80 г, 34,8 ммоль) и Pd(Ph₃P)₄ (1,607 г, 1,390 ммоль). Смесь перемешивали при 80°C в течение 32 ч. Смесь концентрировали с получением остатка, который растворяли с помощью EtOAc (50 мл) и фильтровали. Фильтрат концентрировали. Остаток очищали на силикагеле с помощью колоночной хроматографии на силикагеле PE/EtOAc (10:1~6:1) с получением продукта, который дополнительно промывали с помощью PE (10 мл) с получением указанного в заголовке соединения (3,43 г, 10,49 ммоль, выход 60%) в виде твердого вещества зеленого цвета. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=2,08 мин; MS масса/заряд=324,1 [M+H⁺].

Стадия 3. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((E)-3-аминостирил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Трифторметансульфоновую кислоту (5,38 мл, 60,6 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C перемешиваемой суспензии (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-дифтор-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (пример 2, стадия 5) (5,0 г, 12,12 ммоль) и (E)-трет-бутил-(3-(4-формилстирил)фенил)карбамата (4,612 г, 12,12 ммоль) в безводном MeCN (30 мл) и THF (30 мл) в атмосфере азота. Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч., затем выливали в ледяную воду (30 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (2×50 мл). Объединенные органические слои промывали охлажденной водой (30 мл), солевым раствором (30 мл), насыщенным NaHCO₃(30 мл) и снова водой (30 мл), и концентрировали in vacuo с получением твердого вещества желтого цвета. Неочищенный материал очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (200-300 меш) с элюированием DCM/MeOH (100%~40:1) и затем дополнительный очищенный посредством Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения (1,45 г, 2,328 ммоль, выход 19%). LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,47мин; MS масса/заряд=618,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,61 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,43 (d, J=8,3 Гц, 2H), 7,28 (d, J=10,9 Гц, 1H), 7,15 (d, J=16,4 Гц, 1H), 7,03 (dd, J=15,5, 7,6 Гц, 2H), 6,75 (dd, J=8,0, 4,7 Гц, 2H), 6,50 (dd, J=7,9, 1,3 Гц, 1H), 6,31 (dd, J=10,1, 1,8 Гц, 1H), 6,15 (s, 1H), 5,79-5,46 (m, 3H), 5,13 (dd, J=14,7, 8,7 Гц, 3H), 4,97 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,55 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,23 (dd, J=19,4, 5,5 Гц, 2H), 2,73-2,56 (m, 1H), 2,40-2,21 (m, 2H), 2,15-2,02 (m, 1H), 1,82-1,64 (m, 3H), 1,61-1,44 (m, 4H), 0,88 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя, (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((E)-3-аминостирил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он (0,30 г, 0,456 ммоль, выход 4%), также выделяли в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,51 мин; MS масса/заряд=618,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO- d₆) δ 7,57 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,27 (d, J=7,9 Гц, 3H), 7,18-6,97 (m, 3H), 6,75 (d, J=7,8 Гц, 2H), 6,50 (d, J=7,4 Гц, 1H), 6,31 (dd, J=10,2, 1,6 Гц, 1H), 6,15 (d, J=10,3 Гц, 2H), 5,78-5,67 (m, 1H), 5,63-5,49 (m, 2H), 5,37 (d, J=7,0 Гц, 1H), 5,07 (dd, J=12,0, 5,8 Гц, 3H), 4,33-4,15 (m, 2H), 4,06 (dd, J=19,2, 5,7 Гц, 1H), 2,69-2,54 (m, 1H), 2,36-2,08 (m, 3H), 1,94-1,60 (m, 4H), 1,50 (s, 3H), 0,90 (s, 3H).

Пример 52. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((E)-3-аминостирил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 51 выше. Основной изомер ацеталя: (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((E)-3-аминостирил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,48 мин; MS масса/заряд=582,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 0,88 (s, 3H), 1,00-1,09 (m, 2H), 1,40 (s, 3H), 1,63-1,79 (m, 5H), 2,04-2,15 (m, 2H), 2,32-2,34 (m, 1H), 2,55-2,60 (m, 1H), 4,20 (dd, J= 20,2 Гц, 5,0 Гц, 1H), 4,31 (s, 1H), 4,54 (dd, J= 19,2 Гц, 6,0 Гц, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,94-4,95 (m, 1H), 5,10-5,14 (m, 3H), 5,46 (s, 1H), 5,95 (s, 1H), 6,18 (d, J= 10,0 Гц, 1H), 6,50 (d, J= 7,6 Гц, 1H), 6,73-6,76 (m, 2H), 7,00-7,14 (m, 3H), 7,32 (d, J= 10,0 Гц, 1H), 7,45 (d, J= 8,4 Гц, 2H), 7,59 (d, J= 8,0 Гц, 2H).

Минорный изомер ацеталя: (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((E)-3-аминостирил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,52 мин; MS масса/заряд=582,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 0,89 (s, 3H), 1,05-1,31 (m, 3H), 1,40 (s, 3H), 1,74-1,89 (m, 5H), 2,05-2,07 (m, 2H), 2,31-2,34 (m, 1H), 2,54-2,59 (m, 1H), 4,00-4,06 (m, 1H), 4,23-4,31 (m, 2H), 4,80 (s, 1H), 5,05-5,09 (m, 3H), 5,31-5,32 (m, 1H), 5,95 (s, 1H), 6,12 (s, 1H), 6,18 (d, J= 9,6 Гц, 1H), 6,49-6,50 (m, 1H), 6,74-6,76 (m, 2H), 7,00-7,14 (m, 3H), 7,26 (d, J= 7,6 Гц, 2H), 7,32 (d, J= 10,0 Гц, 1H), 7,57 (d, J= 7,6 Гц, 2H).

Пример 53. Синтез (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((E)-3-аминостирил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 51 выше. Основной изомер ацеталя: (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((E)-3-аминостирил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,45 мин; MS масса/заряд=600,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,61 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,42 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,30 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,15 (d, J=16,4 Гц, 1H), 7,03 (dd, J=15,6, 7,6 Гц, 2H), 6,79-6,70 (m, 2H), 6,50 (d, J=7,7 Гц, 1H), 6,25 (dd, J=10,1, 1,4 Гц, 1H), 6,06 (s, 1H), 5,54-5,43 (m, 2H), 5,13 (t, J=6,0 Гц, 3H), 4,95 (d, J=4,5 Гц, 1H), 4,55 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,22 (dd, J=19,3, 5,4 Гц, 2H), 2,62 (m, 2H), 2,42-2,02 (m, 3H), 1,92-1,80 (m, 1H), 1,77-1,61 (m, 3H), 1,51 (s, 3H), 1,47-1,32 (m, 1H), 0,89 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя: (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((E)-3-аминостирил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он.

LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,48 мин; MS масса/заряд=600,3 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,57 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,28 (dd, J=12,2, 9,3 Гц, 3H), 7,18-6,97 (m, 3H), 6,75 (d, J=7,7 Гц, 2H), 6,50 (d, J=7,3 Гц, 1H), 6,25 (dd, J=10,1, 1,2 Гц, 1H), 6,13 (s, 1H), 6,05 (s, 1H), 5,46 (d, J=2,8 Гц, 1H), 5,35 (d, J=6,9 Гц, 1H), 5,06 (dd, J=14,0, 7,9 Гц, 3H), 4,24 (dd, J=19,3, 6,3 Гц, 2H), 4,05 (dd, J=19,1, 5,8 Гц, 1H), 2,73-2,58 (m, 1H), 2,47-2,30 (m, 2H), 2,09 (d, J=10,1 Гц, 2H), 1,85 (d, J=6,5 Гц, 2H), 1,78-1,65 (m, 2H), 1,50 (s, 4H), 0,90 (s, 3H).

Пример 54. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминофенэтил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез трет-бутил-(E)-(3-(4-(гидроксиметил)стирил)фенил)карбамата

NaBH₄ (0,936 г, 24,74 ммоль) добавляли к имеющему температуру 0°C раствору (E)-трет-бутил-(3-(4-формилстирил)фенил)карбамата) стадия 2, пример 51) (4,0 г, 12,37 ммоль) в MeOH (60 мл) и THF (60 мл), и перемешивали при 0°C в течение 1 ч. Смесь гасили насыщенным водным концентрированным NH₄Cl (20 мл) с получением остатка, который разделяли между EtOAc (100 мл) и водой (100 мл). Органический слой концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством хроматографии на силикагеле с элюированием DCM/EtOAc (10:1~5:1) с получением указанного в заголовке соединения (3,23 г, 7,08 ммоль, выход 57%) в виде твердого вещества красного цвета. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,98 мин; MS масса/заряд=348,1 [M+Na+].

Стадия 2. Синтез трет-бутил-(3-(4-(гидроксиметил)фенэтил)фенил)карбамата

Суспензию Pd/C (0,657 г, 0,618 ммоль) и (E)-трет-бутил-(3-(4-(гидроксиметил)стирил)фенил)карбамата (чистого) 7 (3,35 г, 10,29 ммоль) в EtOAc (50 мл) и THF (50 мл) обрабатывали с помощью баллона с водородом и перемешивали при 0°C в течение 1,5 ч, контролировали с помощью LCMS. Смесь фильтровали. Дополнительное количество Pd/C (0,657 г, 0,618 ммоль) добавляли к фильтрату. Смесь перемешивали в течение дополнительного 1 ч в атмосфере водорода и контролировали с помощью LCMS. Смесь фильтровали и промывали с помощью EtOAc (15 мл). Фильтрат концентрировали с получением остатка, который очищали посредством хроматографии на силикагеле с элюированием PE/EtOAc (10:1~2:1) с получением указанного в заголовке соединения (1,2 г, 3,49 ммоль, выход 34%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=2,0 мин; MS масса/заряд=350,0 [M+Na⁺].

Стадия 3. Синтез трет-бутил-(3-(4-формилфенэтил)фенил)карбамата

Суспензию MnO₂ (9,24 г, 106 ммоль) и трет-бутил-(3-(4-(гидроксиметил)фенэтил) фенил)карбамата (2,9 г, 8,86 ммоль) в DCM (40 мл) обрабатывали с помощью баллона с азотом и перемешивали при 30°C в течение 2 ч., контролировали с помощью LCMS. Дополнительное количество MnO₂ (0,8 г, 9,2 ммоль) добавляли к вышеуказанной смеси, перемешивали при 30°C в течение дополнительного 1 ч. Смесь фильтровали и промывали с помощью DCM (20 мл). Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (2,9 г, 8,58 ммоль, выход 97%) в виде твердого вещества желтого цвета. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=2,14 мин; MS масса/заряд=226,0 [M-Boc]⁺. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 9,90 (s, 1H), 7,71 (d, J=7,8 Гц, 2H), 7,25 (s, 2H), 7,19-6,97 (m, 3H), 6,73 (d, J=7,3 Гц, 1H), 6,48 (s, 1H), 2,98-2,87 (m, 2H), 2,86-2,78 (m, 2H), 1,44 (s, 9H).

Стадия 4. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминофенэтил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Трифторметансульфоновую кислоту (5,61 мл, 64,2 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C перемешиваемой суспензии трет-бутил-(3-(4-формилфенэтил)фенил)карбамата (4,18 г, 12,85 ммоль) и (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-дифтор-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (5,3 г, 12,85 ммоль) в безводном MeCN (30 мл) и в атмосфере THF (30 мл). Полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч., затем выливали в ледяную воду (20 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (2×25 мл). Объединенные органические слои промывали охлажденной водой (20 мл), солевым раствором (10 мл), насыщенным водным NaHCO₃(20 мл) и водой (20 мл), концентрировали in vacuo с получением твердого вещества желтого цвета. Неочищенный материал очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (200-300 меш) с элюированием с помощью дихлорметана/метанола (100%~40:1) с получением продукта, который дополнительно очищали посредством Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения (2,21 г, 3,57 ммоль, выход 28%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,75 мин; MS масса/заряд=619,8 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,34 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,27 (t, J=8,0 Гц, 3H), 6,89 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,43 (s, 1H), 6,36 (d, J=7,9 Гц, 2H), 6,31 (dd, J=10,2, 1,8 Гц, 1H), 6,14 (s, 1H), 5,75-5,56 (m, 1H), 5,54 (d, J=2,9 Гц, 1H), 5,46 (s, 1H), 5,12 (t, J=6,0 Гц, 1H), 4,95 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,92 (s, 2H), 4,53 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,21 (dd, J=19,4, 5,6 Гц, 2H), 2,83-2,79 (m, 2H), 2,73-2,57 (m, 3H), 2,275-2,25 (m, 2H), 2,08-2,04 (m, 1H), 1,79-1,62 (m, 3H), 1,67-1,50 (m, 4H), 0,87 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя, (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминофенэтил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он (0,45 г, 0,667 ммоль, выход 5%), также выделяли в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,79 мин; MS масса/заряд=619,8 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,33-7,17 (m, 5H), 6,89 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,46-6,27 (m, 4H), 6,12 (d, J=8,8 Гц, 2H), 5,75-5,55 (m, 1H), 5,53 (s, 1H), 5,34 (d, J=7,1 Гц, 1H), 5,06 (t, J=5,9 Гц, 1H), 4,92 (s, 2H), 4,31-4,15 (m, 2H), 4,05 (dd, J=19,2, 5,6 Гц, 1H), 2,83-2,79 (m, 2H), 2,72-2,54 (m, 3H), 2,29 (s, 1H), 2,21-2,13 (m, 1H), 2,09-2,05 (m, 1H), 1,93-1,81 (m, 1H), 1,79-1,60 (m, 3H), 1,50 (s, 3H), 0,88 (s, 3H).

Пример 55. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминофенэтил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 54 выше. Основной изомер ацеталя: LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,74 мин ; MS масса/заряд=583,8 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,34 (dd, J=16,7, 9,1 Гц, 3H), 7,24 (d, J=8,0 Гц, 2H), 6,89 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,42 (s, 1H), 6,36 (dd, J=7,7, 1,6 Гц, 2H), 6,17 (dd, J=10,1, 1,7 Гц, 1H), 5,95 (s, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,11 (t, J=5,9 Гц, 1H), 4,93 (d, J=5,4 Гц, 3H), 4,81 (d, J=3,0 Гц, 1H), 4,52 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,30 (s, 1H), 4,19 (dd, J=19,5, 5,6 Гц, 1H), 2,87-2,77 (m, 2H), 2,73-2,64 (m, 2H), 2,62-2,52 (m, 1H), 2,32 (d, J=11,0 Гц, 1H), 2,18-1,98 (m, 2H), 1,83-1,58 (m, 5H), 1,40 (s, 3H), 1,24-0,97 (m, 2H), 0,87 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя, (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминофенэтил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он: LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,77 мин; MS масса/заряд=583,9 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,32 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,19 (q, J=8,2 Гц, 4H), 6,89 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,44-6,29 (m, 3H), 6,17 (dd, J=10,1, 1,8 Гц, 1H), 6,07 (s, 1H), 5,95 (s, 1H), 5,29 (d, J=6,9 Гц, 1H), 5,03 (t, J=6,1 Гц, 1H), 4,92 (s, 2H), 4,78 (d, J=3,1 Гц, 1H), 4,34-4,19 (m, 2H), 4,02 (dd, J=19,2, 5,9 Гц, 1H), 2,81 (dd, J=9,5, 6,1 Гц, 2H), 2,68 (dd, J=9,6, 6,0 Гц, 2H), 2,61-2,52 (m, 1H), 2,32 (d, J=10,4 Гц, 1H), 2,03 (d, J=7,8 Гц, 2H), 1,91-1,67 (m, 5H), 1,39 (s, 3H), 1,27-1,01 (m, 2H), 0,89 (s, 3H).

Пример 56. Синтез (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминофенэтил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 54 выше. Основной изомер ацеталя: LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,74 мин ; MS масса/заряд=601,9 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,32 (t, J=7,2 Гц, 2H), 7,26 (t, J=8,0 Гц, 2H), 6,89 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,43 (s, 1H), 6,36 (d, J=7,7 Гц, 2H), 6,24 (dd, J=10,1, 1,7 Гц, 1H), 6,05 (s, 1H), 5,45 (s, 2H), 5,10 (t, J=5,9 Гц, 1H), 4,97-4,85 (m, 3H), 4,52 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,20 (dd, J=19,2, 5,6 Гц, 2H), 2,85-2,76 (m, 2H), 2,72-2,54 (m, 3H), 2,36 (d, J=10,4 Гц, 1H), 2,20-2,18 (m, 1H), 2,04 (s, 1H), 1,91-1,80 (m, 1H), 1,73-1,61 (m, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,40-1,38 (m, 1H), 0,87 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя, (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминофенэтил)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он: LCMS (Способ d, Таблица 7) R_t=1,77 мин; MS масса/заряд=601,9 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,35-7,13 (m, 5H), 6,89 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,41 (s, 1H), 6,36 (d, J=7,6 Гц, 2H), 6,24 (dd, J=10,1, 1,7 Гц, 1H), 6,06 (d, J=13,8 Гц, 2H), 5,44 (d, J=2,6 Гц, 1H), 5,33 (d, J=7,0 Гц, 1H), 5,04 (t, J=6,0 Гц, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,27-4,21 (m, 2H), 4,04 (dd, J=19,2, 5,9 Гц, 1H), 2,85-2,76 (m, 2H), 2,70-2,66 (m, 3H), 2,37-2,35 (m, 2H), 2,07-2,06 (m, 2H), 1,84 (d, J=7,1 Гц, 2H), 1,71 (t, J=10,3 Гц, 2H), 1,50 (s, 4H), 0,90 (s, 3H).

Пример 57. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)амино)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез трет-бутил-(3-((4-формилфенил)амино)фенил)карбамата

Смесь трет-бутил-(3-аминофенил)карбамата (31,2 г, 150 ммоль), 4-бромбензальдегида (33,3 г, 180 ммоль), Pd(OAc)₂ (1,684 г, 7,50 ммоль), BINAP ((RS)2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафтил) (9,34 г, 15,00 ммоль), Cs₂CO₃ (98 г, 300 ммоль) нагревали с обратным холодильником в толуоле (300 мл) в атмосфере азота в течение 16 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь разделяли между водой и EtOAc. Органический слой концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле с элюированием PE:EtOAc (5:1) с получением указанного в заголовке соединения (32,8 г, 105 ммоль, выход 70%) в виде желтого масла. LCMS (Способ j, Таблица 7) R_t=1,94 мин; MS масса/заряд=313 [M+H+].

Стадия 2. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)амино)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Трифторметансульфоновую кислоту (14,21 мл, 160 ммоль) добавляли по каплям к имеющей температуру 0°C перемешиваемой суспензии (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)- 10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (12,05 г, 32,0 ммоль) и трет-бутил-(3-((4-формилфенил)амино)фенил)карбамата (10 г, 32,0 ммоль) в THF (50,00 мл) и MeCN (50 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при такой же температуре. Смесь разбавляли с помощью EtOAc (200 мл), промывали водой (100 мл), раствором насыщенного NaHCO₃ (1×100 мл) и солевым раствором (1×100 мл), высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали in vacuo. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (MeOH:DCM=1:40), и полученный материал очищали дополнительно посредством Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения (1,729 г, 3,03 ммоль, выход 10%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ k, Таблица 7) R_t=1,50 мин; MS масса/заряд=571[M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 8,01 (s, 1H), 7,33 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,27 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7,00 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,87 (t, J=7,9 Гц, 1H), 6,36 (s, 1H), 5,94 (s, 1H), 5,32 (s, 1H), 5,10 (s, 1H), 5,02-4,87 (m, 3H), 4,80 (d, J=2,8 Гц, 1H), 4,51 (d, J=16,4 Гц, 1H), 4,31 (s, 1H), 4,20 (d, J=17,8 Гц, 1H), 2,62-2,52 (m, 1H), 2,32 (d, J=11,0 Гц, 1H), 2,20-1,98 (m, 2H), 1,86-1,69 (m, 4H), 1,69-1,55 (m, 1H), 1,41 (s, 3H), 1,18-0,97 (m, 2H), 0,87 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)амино)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он (78 мг, 0,137 ммоль, выход 0,4%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ k, Таблица 7) R_t=1,53 мин; MS масса/заряд=571[M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 8,00 (s, 1H), 7,32 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,07 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,96 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,87 (t, J=7,9 Гц, 1H), 6,35 (s, 1H), 6,24 (d, J=7,9 Гц, 1H), 6,17 (d, J=10,0 Гц, 1H), 6,10 (d, J=7,9 Гц, 1H), 6,00 (s, 1H), 5,95 (s, 1H), 5,27 (d, J=7,0 Гц, 1H), 5,02 (t, J=5,9 Гц, 1H), 4,97 (s, 2H), 4,78 (d, J=2,7 Гц, 1H), 4,30 (s, 2H), 4,03 (dd, J=19,1, 5,8 Гц, 1H), 2,65-2,52 (m, 1H), 2,32 (d, J=10,2 Гц, 1H), 2,14-1,95 (m, 2H), 1,89-1,63 (m, 5H), 1,39 (s, 3H), 1,28-1,11 (m, 1H), 1,05 (d, J=10,7 Гц, 1H), 0,89 (s, 3H).

Пример 58. Синтез (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)амино)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 57 выше. Основной изомер ацеталя: LCMS (Способ k, Таблица 7) R_t=1,49 мин ; MS масса/заряд=589 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 8,02 (s, 1H), 7,30 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,23 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,99 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,87 (t, J=7,9 Гц, 1H), 6,36 (s, 1H), 6,31-6,16 (m, 2H), 6,10 (d, J=7,8 Гц, 1H), 6,04 (s, 1H), 5,45 (d, J=2,6 Гц, 1H), 5,35 (s, 1H), 5,11 (t, J=5,9 Гц, 1H), 4,97 (s, 2H), 4,91 (d, J=4,6 Гц, 1H), 4,51 (dd, J=19,5, 6,3 Гц, 1H), 4,20 (dd, J=19,2, 5,5 Гц, 2H), 2,74-2,58 (m, 1H), 2,36 (d, J=10,2 Гц, 1H), 2,27-2,13 (m, 1H), 2,06 (d, J=9,5 Гц, 2H), 1,93-1,78 (m, 1H), 1,78-1,57 (m, 3H), 1,51 (s, 3H), 1,42 (dd, J=12,4, 4,5 Гц, 1H), 0,87 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя, (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)амино)фенил)-6b-фтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он: LCMS (Способ k, Таблица 7) R_t=1,50 мин ; MS масса/заряд=589 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 8,01 (s, 1H), 7,29 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,08 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,97 (d, J=8,5 Гц, 2H), 6,87 (t, J=7,9 Гц, 1H), 6,35 (s, 1H), 6,24 (d, J=8,6 Гц, 2H), 6,10 (d, J=7,7 Гц, 1H), 6,02 (d, J=18,4 Гц, 2H), 5,44 (s, 1H), 5,30 (d, J=7,1 Гц, 1H), 4,97 (s, 3H), 4,30 (d, J=19,1 Гц, 1H), 4,19 (d, J=9,2 Гц, 1H), 4,05 (d, J=19,1 Гц, 1H), 2,78-2,56 (m, 1H), 2,36 (d, J=13,3 Гц, 1H), 2,06 (d, J=10,7 Гц, 2H), 1,83 (dd, J=16,3, 10,0 Гц, 2H), 1,76-1,61 (m, 2H), 1,50 (s, 4H), 0,89 (s, 3H).

Пример 59. Синтез (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)амино)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Синтезировали с применением такой же процедуры, как и в примере 57 выше. Основной изомер ацеталя: LCMS (Способ l, Таблица 7) R_t=1,62 мин ; MS масса/заряд=607 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 8,02 (s, 1H), 7,25 (dd, J=18,2, 9,4 Гц, 3H), 6,99 (d, J=8,6 Гц, 2H), 6,87 (t, J=7,9 Гц, 1H), 6,36 (t, J=1,9 Гц, 1H), 6,30 (dd, J=10,1, 1,8 Гц, 1H), 6,25-6,19 (m, 1H), 6,14 (s, 1H), 6,09 (dd, J=7,9, 1,3 Гц, 1H), 5,77-5,55 (m, 1H), 5,53 (d, J=2,8 Гц, 1H), 5,35 (s, 1H), 5,11 (t, J=6,0 Гц, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,92 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,51 (dd, J=19,5, 6,4 Гц, 1H), 4,21 (dd, J=19,3, 5,6 Гц, 2H), 2,76-2,53 (m, 1H), 2,28 (dd, J=12,6, 5,9 Гц, 2H), 2,06 (d, J=12,0 Гц, 3H), 1,70 (dt, J=20,2, 6,0 Гц, 3H), 1,60-1,40 (m, 4H), 0,86 (s, 3H).

Минорный изомер ацеталя, (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминофенил)амино)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он: LCMS (Способ l, Таблица 7) R_t=1,65 мин ; MS масса/заряд=607 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 8,01 (s, 1H), 7,27 (d, J=9,8 Гц, 1H), 7,09 (d, J=7,9 Гц, 2H), 6,97 (d, J=8,0 Гц, 2H), 6,88 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,41-6,19 (m, 3H), 6,20-6,07 (m, 2H), 6,03 (s, 1H), 5,65 (d, J=46,4 Гц, 1H), 5,52 (s, 1H), 5,32 (d, J=6,8 Гц, 1H), 5,06 (s, 1H), 4,97 (s, 2H), 4,32 (dd, J=19,1, 5,3 Гц, 1H), 4,19 (s, 1H), 4,06 (dd, J=18,7, 4,8 Гц, 1H), 2,59 (d, J=13,8 Гц, 1H), 2,29 (s, 1H), 2,17 (d, J=7,2 Гц, 1H), 2,07 (s, 1H), 1,87 (d, J=6,7 Гц, 1H), 1,69 (dd, J=23,7, 12,4 Гц, 3H), 1,50 (s, 4H), 0,89 (s, 3H).

Пример 60. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминобензил)тио)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез 4-((3-нитробензил)тио)бензальдегида

К раствору (3-нитрофенил)метантиола (35 г, 282 ммоль) и 4-фторбензальдегида (52,5 г, 310 ммоль) в сухом диметилсульфоксиде (220 мл) добавляли карбонат калия (78 г, 564 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 100°C в течение 4 часов. Подготавливали, как описано выше, один дополнительный флакон. Две реакционные смеси объединяли и разбавляли водой (2 л) и затем экстрагировали с помощью EtOAc (3 × 600 мл). Объединенный органический слой высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали с получением остатка, который очищали посредством колоночной хроматографии (элюировали с помощью PE/EtOAc=от 20/1 до 5/1) с получением указанного в заголовке соединения (62 г, выход 80%) в виде твердого вещества светло-коричневого цвета. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 4,54 (s, 2 H) 7,51 (d, J=8,33 Гц, 2 H) 7,59 (s, 1 H) 7,77 (d, J=8,33 Гц, 2 H) 7,87 (d, J=7,89 Гц, 1 H) 8,05-8,10 (m, 1 H) 8,30 (s, 1 H) 9,87 (s, 1 H).

Стадия 2: Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-10-(4-((3-нитробензил)тио)фенил)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Трифторметансульфоновую кислоту (21,23 мл, 239 ммоль) добавляли по каплям к имеющему температуру раствору 0°C (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (9 г, 23,91 ммоль) и 4-((3-нитробензил)тио)бензальдегида (7,19 г, 26,3 ммоль) в MeCN (500 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°C. Подготавливали два дополнительных флакона, как описано выше. Все три реакционные смеси объединяли и выливали в воду (2 л). Полученную смесь экстрагировали с помощью EtOAc (3 × 500 мл). Объединенный органический слой высушивали над Na₂SO₄ и концентрировали с получением остатка, который очищали посредством Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения (5,57 г, выход 16%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ n Таблица 7): R_t=3,20 мин; масса/заряд=632,0 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 0,84 (s, 3 H) 0,93-1,08 (m, 2 H) 1,37 (s, 3 H) 1,52-1,76 (m, 5 H) 1,94-2,15 (m, 2 H) 2,29 (br d, J=11,91 Гц, 1 H) 2,50-2,58 (m, 1 H) 4,15 (dd, J=19,40, 5,51 Гц, 1 H) 4,27 (br d, J=2,87 Гц, 1 H) 4,39 (s, 2 H) 4,48 (dd, J=19,40, 6,39 Гц, 1 H) 4,77 (d, J=3,09 Гц, 1 H) 4,89 (d, J=4,63 Гц, 1 H) 5,07 (t, J=5,95 Гц, 1 H) 5,38 (s, 1 H) 5,91 (s, 1 H) 6,15 (dd, J=10,14, 1,76 Гц, 1 H) 7,25-7,38 (m, 5 H) 7,55 (t, J=7,94 Гц, 1 H) 7,79 (d, J=7,72 Гц, 1 H) 8,04 (dd, J=8,16, 1,54 Гц, 1 H) 8,19 (d, J=1,76 Гц, 1 H)

Минорный изомер ацеталя, (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-10-(4-((3-нитробензил)тио)фенил)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он (0,34 г, выход 1%) также получали в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ n, Таблица 7): R_t=3,28 мин; MS масса/заряд=631,8 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 0,86 (s, 3 H) 0,98-1,05 (m, 1 H) 1,10-1,21 (m, 1 H) 1,37 (s, 3 H) 1,66-1,88 (m, 5 H) 1,94-2,08 (m, 2 H) 2,29 (br dd, J=13,23, 2,87 Гц, 1 H) 2,50-2,56 (m, 1 H) 3,99 (dd, J=19,18, 5,95 Гц, 1 H) 4,20 (dd, J=19,07, 6,28 Гц, 1 H) 4,27 (br s, 1 H) 4,39 (s, 2 H) 4,77 (d, J=3,09 Гц, 1 H) 4,99 (s, 1 H) 5,26 (d, J=6,84 Гц, 1 H) 5,92 (s, 1 H) 6,04 (s, 1 H) 6,15 (dd, J=10,03, 1,87 Гц, 1 H) 7,16 (d, J=8,38 Гц, 2 H) 7,26-7,34 (m, 3 H) 7,55 (t, J=7,94 Гц, 1 H) 7,75 (d, J=7,72 Гц, 1 H) 8,05 (dd, J=8,16, 1,54 Гц, 1 H) 8,21 (t, J=1,76 Гц, 1 H).

Стадия 3. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-аминобензил)тио)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Смесь (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-10-(4-((3-нитробензил)тио)фенил)-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она (138 мг, 0,22 ммоль), цинка (214 мг, 3,28 ммоль) и уксусной кислоты (0,4 мл, 6,99 ммоль) в EtOAc (2 мл) перемешивали при 40°C в течение 2 часов. LCMS показала частичное превращение в желаемый продукт на основе анилина. Добавляли большее количество цинка (71 мг, 1,09 ммл) и перемешивали при 40°C в течение дополнительных 2 часов. Раствор охлаждали до комнатной температуры и разделяли между насыщенным водным NaHCO₃ и EtOAc (3x). Объединенные органические слои высушивали над Na₂SO₄ и очищали с помощью хроматографии (силикагель) с элюированием 0-5% MeOH в DCM с получением указанного в заголовке соединения (64 мг, 0,106 ммоль, выход 49%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,77 мин; MS масса/заряд=601,9 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,35 (d, J=8,5 Гц, 2H), 7,32-7,24 (m, 3H), 6,89 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,56 (q, J=2,3 Гц, 1H), 6,47 (d, J=7,4 Гц, 1H), 6,40 (ddd, J=7,6, 2,6, 1,4 Гц, 1H), 6,15 (dd, J=10,1, 1,8 Гц, 1H), 5,95-5,89 (m, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,03 (d, J=14,0 Гц, 3H), 4,90 (d, J=4,8 Гц, 1H), 4,77 (d, J=3,5 Гц, 1H), 4,54-4,44 (m, 1H), 4,28 (s, 1H), 4,16 (d, J=20,6 Гц, 1H), 4,06 (d, J=2,3 Гц, 2H), 2,59-2,50 (m, 1H), 2,30 (d, J=11,5 Гц, 1H), 2,14-2,03 (m, 1H), 1,97 (s, 2H), 1,88-1,67 (m, 4H), 1,63 (td, J=11,9, 10,4, 5,1 Гц, 1H), 1,37 (d, J=1,9 Гц, 3H), 1,10-0,92 (m, 2H), 0,84 (s, 3H).

Пример 61. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-аминопиридин-4-ил)метил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

Стадия 1. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(бромметил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она

4-(Бромметил)бензальдегид (0,539 г, 2,71 ммоль) добавляли к имеющей температуру 0°C суспензии (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-тригидрокси-17-(2-гидроксиацетил)-10,13-диметил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3H-циклопента[a]фенантрен-3-она (1,0738 г, 2,85 ммоль), 4-(бромметил)бензальдегида (0,539 г, 2,71 ммоль) и MgSO₄ (1,33 г, 11,05 ммоль) в MeCN (18 мл). Трифторметансульфоновую кислоту (2,0 г, 13,5 ммоль) добавляли способом по каплям так, чтобы поддерживать температуру менее 7°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 мин., после чего ее гасили добавлением насыщенного водного NaHCO₃ (20 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (60 мл). Объединенные органические вещества промывали солевым раствором (10 мл) и удаляли растворитель при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 40 г) с градиентом элюирования 0-5% MeOH/DCM получали указанное в заголовке соединение (1,59 г, 2,85 ммоль, выход 100%) в виде пены грязно-белого цвета (9:1 смесь диастереомеров ацеталя. Определение характеристик представлено для основного изомера ацеталя: LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=1,04 мин; MS масса/заряд=557,2, 559,2 [M+H]. 1H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) d 7,44 (s, 4H), 7,30 (dd, J=10,1, 2,2 Гц, 1H), 6,15 (ddd, J=10,1, 4,8, 1,9 Гц, 1H), 5,91 (t, J=1,7 Гц, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,07 (s, 1H), 4,93 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,77 (dd, J=3,6, 0,9 Гц, 1H), 4,67 (s, 2H), 4,51 (dd, J=19,4, 4,1 Гц, 1H), 4,31 4,26 (m, 1H), 4,17 (d, J=19,5 Гц, 1H), 2,58 2,49 (m, 1H), 2,30 (dd, J=12,9, 4,7 Гц, 1H), 2,16 2,05 (m, 1H), 1,99 (d, J=23,9 Гц, 1H), 1,89 1,71 (m, 2H), 1,75 1,65 (m, 1H), 1,67 1,57 (m, 1H), 1,38 (s, 3H), 1,11 0,91 (m, 2H), 0,85 (s, 3H).

Стадия 2. Синтез (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-аминопиридин-4-ил)метил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-она

В 20 мл флакон загружали (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(бромметил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-он (0,100 г, 0,179 ммоль), 4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридин-2-амин (0,039 г, 0,179 ммоль) и K₂CO₃ (0,099 г, 0,718 ммоль) в дегазированном растворе диоксан (2,0 мл)/вода (0,200 мл). Суспензию вакуумировали и обратно заполняли сухим N₂ (3X). Pd(dppf)Cl₂ (0,012 г, 0,016 ммоль) добавляли и флакон затем снова вакуумировали и обратно заполняли сухим N2. Реакционную смесь нагревали до 90°C. После 1,5 часов исходный материал расходовался. Обеспечивали охлаждение реакционной смеси до комнатной температуры, разбавляли EtOAc (20 мл) и промывали водой (25 мл), затем солевой раствор (25 мл) высушивали над MgSO₄ и удаляли растворитель при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 40 г) с градиентом элюирования 0-10% MeOH/CH₂Cl₂ получали твердое вещество светло-бежевого цвета. Проводили дополнительную очистку посредством препаративной HPLC с обращенной фазой на колонке Phenomenex C18(2), 10 микрон (250×50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 80 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-20 мин. линейный градиент 15-85% A, удерживание 20-25 мин). Объединенные фракции замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения (27 мг, 0,047 ммоль, выход 26%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,90 мин; MS масса/заряд=571,3 [M+H⁺]. 1H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 7,93 (s, 2H), 7,82 (d, J=6,6 Гц, 1H), 7,44 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,39-7,22 (m, 3H), 6,73 (d, J=8,1 Гц, 1H), 6,69 (s, 1H), 6,24-6,09 (m, 1H), 5,93 (s, 1H), 5,44 (s, 1H), 4,94 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,50 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,30 (s, 1H), 4,19 (d, J=19,4 Гц, 1H), 3,99 (s, 2H), 2,61-2,51 (m, 1H), 2,35-2,27 (m, 1H), 2,19-2,08 (m, 1H), 2,08-1,99 (m, 1H), 1,82-1,59 (m, 5H), 1,40 (s, 3H), 1,02 (ddd, J=27,9, 11,7, 3,2 Гц, 2H), 0,87 (s, 3H).

В следующих примерах проводили синтез с применением такой же, процедуры, как и в примере 61 (выше).

Таблица 8.

Пример	Структура и название	LCMS и ¹H ЯМР
62	(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-аминопиридин-3-ил)метил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он	LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t =0,87 мин; MS масса/заряд=571,4 [M+H]. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 7,84 (d, J=2,1 Гц, 2H), 7,75 (dd, J=9,1, 2,1 Гц, 1H), 7,44-7,37 (m, 2H), 7,31 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,26 (d, J=8,2 Гц, 2H), 6,90 (d, J=9,0 Гц, 1H), 6,17 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,93 (t, J=1,6 Гц, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,10 (s, 1H), 4,92 (d, J=4,9 Гц, 1H), 4,80 (d, J=3,4 Гц, 1H), 4,50 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,29 (s, 1H), 4,17 (d, J=19,5 Гц, 1H), 3,84 (s, 2H), 2,61-2,52 (m, 2H), 2,31 (d, J=12,3 Гц, 1H), 2,13 (d, J=10,9 Гц, 1H), 2,08-1,98 (m, 1H), 1,81-1,58 (m, 5H), 1,40 (s, 3H), 1,00 (ddd, J=32,4, 11,7, 4,1 Гц, 2H), 0,86 (s, 3H).
63	(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((5-аминопиридин-3-ил)метил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он	LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,87 мин; MS масса/заряд=571,4 [M+H]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 7,88 (s, 1H), 7,81 (d, J=2,2 Гц, 1H), 7,36 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,32-7,18 (m, 3H), 6,10 (dd, J=10,1, 1,8 Гц, 1H), 5,87 (s, 1H), 5,36 (s, 1H), 4,86 (d, J=4,8 Гц, 1H), 4,74 (s, 1H), 4,43 (d, J=19,5 Гц, 1H), 4,23 (s, 1H), 4,11 (d, J=19,4 Гц, 1H), 3,93 (s, 2H), 2,54-2,45 (m, 1H), 2,31-2,17 (m, 1H), 2,14-1,90 (m, 2H), 1,76-1,50 (m, 5H), 1,33 (s, 3H), 1,05-0,85 (m, 2H), 0,80 (s, 3H)
64	(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-аминопиридин-3-ил)метил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он	LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,86 мин; MS масса/заряд=571,3 [M+H]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 7,89 (s, 2H), 7,82 (d, J=6,2 Гц, 1H), 7,58 (d, J=6,1 Гц, 1H), 7,36 (d, J=8,1 Гц, 2H), 7,23 (dd, J=20,2, 9,1 Гц, 3H), 6,85-6,71 (m, 1H), 6,10 (d, J=11,9 Гц, 1H), 5,86 (s, 1H), 5,36 (s, 1H), 4,87 (d, J=5,0 Гц, 1H), 4,75 (s, 1H), 4,44 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,23 (s, 1H), 4,12 (d, J=19,4 Гц, 1H), 3,87 (s, 2H), 2,55-2,45 (m, 1H), 2,24 (d, J=11,0 Гц, 1H), 2,05 (d, J=22,0 Гц, 1H), 2,01-1,91 (m, 1H), 1,77-1,49 (m, 5H), 1,33 (s, 3H), 1,04-0,87 (m, 2H), 0,80 (s, 3H).
65	(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((2-аминопиридин-4-ил)метил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он	LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,85 мин; MS масса/заряд=607,4 [M+H]. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 7,80 (d, J=6,5 Гц, 1H), 7,59 (s, 2H), 7,41 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,31 (d, J=7,9 Гц, 2H), 7,27 (d, J=10,8 Гц, 1H), 6,69 (d, J=6,8 Гц, 1H), 6,64 (s, 1H), 6,30 (dd, J=10,2, 1,9 Гц, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,55 (d, J=5,8 Гц, 1H), 5,49 (s, 1H), 5,13 (s, 1H), 4,96 (d, J=4,5 Гц, 1H), 4,26-4,13 (m, 2H), 3,95 (s, 2H), 2,62-2,53 (m, 1H), 2,35-2,28 (m, 1H), 2,28-2,18 (m, 1H), 2,09-1,99 (m, 1H), 1,77-1,66 (m, 3H), 1,50 (s, 4H), 0,87 (s, 3H).
66	(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((6-аминопиридин-3-ил)метил)фенил)-2,6b-дифтор-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-4H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4-он	LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,85 мин ; MS масса/заряд=607,4 [M+H]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 7,76 (s, 1H), 7,65 (d, J=9,5 Гц, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,31 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,25-7,15 (m, 3H), 6,79 (d, J=9,2 Гц, 1H), 6,23 (d, J=10,2 Гц, 1H), 6,06 (s, 1H), 5,69-5,49 (m, 1H), 5,46 (d, J=4,0 Гц, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,03 (s, 1H), 4,88 (d, J=4,2 Гц, 1H), 4,44 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,21-4,05 (m, 2H), 3,76 (s, 2H), 2,67-2,51 (m, 1H), 2,32-2,09 (m, 2H), 1,96 (d, J=13,1 Гц, 1H), 1,71-1,57 (m, 3H), 1,50-1,35 (m, 4H), 0,80 (s, 3H).

Пример 67.

Синтез 1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-1H-пиррол-2,5-диона

Стадия 1. Синтез (Z)-4-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-4-оксобут-2-енoвая кислоты

Малеиновый ангидрид (46,5 мг, 0,474 ммоль) добавляли к имеющему комнатную температуру раствору (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-аминобензил)фенил)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-декагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-4(2H)-она (239 мг, 0,420 ммоль) в THF (3,0 мл). Через 75 мин. растворитель удаляли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде пены грязно-белого цвета. Данный продукт применяли без дополнительной очистки на следующей стадии (достигали 100% выхода). LCMS (Способ o, Таблица 7) R_t=0,86 мин; MS масса/заряд=668,5 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 12,99 (s, 1H), 10,29 (s, 1H), 7,45 7,38 (m, 2H), 7,38 7,31 (m, 2H), 7,27 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,24 7,15 (m, 3H), 6,92 (dt, J=7,8, 1,3 Гц, 1H), 6,38 (d, J=12,1 Гц, 1H), 6,25 (d, J=12,0 Гц, 1H), 6,12 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,89 (d, J=1,5 Гц, 1H), 5,36 (s, 1H), 5,03 (s, 1H), 4,88 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,73 (d, J=3,3 Гц, 1H), 4,46 (d, J=19,4 Гц, 1H), 4,26 (p, J=3,2 Гц, 1H), 4,14 (d, J=19,4 Гц, 1H), 3,87 (s, 2H), 2,52 (dd, J=13,6, 5,3 Гц, 1H), 2,32 2,23 (m, 1H), 2,07 (tt, J=10,8, 6,2 Гц, 1H), 2,02 1,94 (m, 1H), 1,84 1,51 (m, 5H), 1,36 (s, 3H), 1,09 0,93 (m, 2H), 0,82 (s, 3H).

Стадия 2. Синтез 1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-1H-пиррол-2,5-диона

Бис(триметилсилил)амин (HMDS) (63,4 мкл, 0,306 ммоль) добавляли к раствору бромида цинка (75,0 мг, 0,333 ммоль) и (Z)-4-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-4-оксобут-2-енoвой кислоты (171 мг, 0,256 ммоль) в тетрагидрофуране (2,0 мл). Смесь нагревали до 50°C в течение 2,5 ч. LCMS показала неполное превращение, таким образом добавляли другую аликвоту бис(триметилсилил)амина (HMDS) (63,4 мкл, 0,306 ммоль). Реакцию завершали после дополнительных 90 мин. при 50°C. Смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли EtOAc (20 мл), затем промывали последовательно 1 н. водной HCl (2×10 мл), насыщенным водным NaHCO₃ (10 мл), солевым раствором (10 мл), высушивали над Na₂SO₄ и удаляли растворитель при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния, 12 г) с градиентом элюирования 0-10% MeOH/DCM получали указанное в заголовке соединение (82,6 мг, 0,127 ммоль, 50% выход) в виде твердого вещества грязно-белого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=1,02 мин; MS масса/заряд=650,5 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 7,27 (dt, J=7,8, 3,7 Гц, 3H), 7,19 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,17 7,06 (m, 4H), 7,06 7,01 (m, 3H), 6,04 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,81 (t, J=1,5 Гц, 1H), 5,64 (s, 1H), 5,29 (s, 1H), 4,95 (t, J=5,9 Гц, 1H), 4,80 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,65 (d, J=3,2 Гц, 1H), 4,38 (dd, J=19,4, 6,4 Гц, 1H), 4,18 (t, J=3,4 Гц, 1H), 4,06 (dd, J=19,5, 5,7 Гц, 1H), 3,86 (s, 2H), 2,45 (dd, J=13,5, 5,4 Гц, 1H), 2,30 2,11 (m, 1H), 2,11 1,81 (m, 1H), 1,76 1,44 (m, 4H), 1,28 (s, 3H), 1,02 0,83 (m, 2H), 0,75 (s, 3H).

Пример 68. Синтез 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)бензил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтилдигидрофосфата

Дифосфорил хлорид (158 мг, 0,609 ммоль) добавляли по каплям к имеющему температуру -51°C раствору 1-(3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)-1H-пиррол-2,5-диону (82 мг, 0,126 ммоль) в тетрагидрофуране (0,5 мл). Реакционную смесь медленно нагревали до -10°C в течение часа, затем гасили с помощью воды при -5°C. Смесь обрабатывали насыщенным водным раствором NaHCO₃ с получением раствора с pH 8. При обработке EtOAc (5 мл) получали жидкую эмульсию. Доведение pH до 1 посредством добавления 1 н. водной HCl улучшало образование эмульсии. Экстрагировали с помощью EtOAc (4×5 мл), затем промывали объединенные органические вещества солевым раствором (5 мл), высушивали (Na₂SO₄) и удаляли растворитель при пониженном давлении. Этот продукт очищали посредством HPLC с обращенной фазой на колонке Phenomenex C18(2), 10 микрон (250×50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 90 мл/мин. (0-5,0 мин. 15% A, 5,0-20,0 мин. линейный градиент 15-95% A). Объединенные фракции замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения (3,6 мг, 4,93 ммоль, выход 4%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,95 мин; MS масса/заряд=730,5 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 7,38 (dt, J=7,8, 3,7 Гц, 3H), 7,31 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,29 7,26 (m, 2H), 7,25 7,22 (m, 1H), 7,19 (t, J=1,9 Гц, 1H), 7,17 7,12 (m, 3H), 6,16 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,93 (t, J=1,6 Гц, 1H), 5,48 (s, 1H), 4,96 4,86 (m, 2H), 4,84 (s, 1H), 4,56 (dd, J=18,1, 8,1 Гц, 1H), 4,30 (q, J=3,3 Гц, 1H), 3,97 (s, 2H), 2,59 2,52 (m, 1H), 2,31 (d, J=12,0 Гц, 1H), 2,17 2,07 (m, 1H), 2,05 1,98 (m, 1H), 1,85 1,56 (m, 5H), 1,39 (s, 3H), 1,03 (ddd, J=18,5, 11,8, 4,1 Гц, 2H), 0,88 (s, 3H).

Пример 69. Синтез 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((S)-2-((S)-2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо)пропанамидо)пропанамидо)фенокси)метил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтилдигидрофосфата

Стадия 1. Синтез трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-((4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((ди-трет-бутоксифосфорил)окси)ацетил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)окси)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата

Ди-трет-бутил-N,N-диэтилфосфорамидит (0,226 мл, 0,811 ммоль) добавляли к имеющему комнатную температуру раствору трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-((4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)окси)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата (463 мг, 0,559 ммоль) и 1H-тетразола (0,45 M в MeCN, 4,97 мл, 2,237 ммоль) в диметилацетамиде (2 мл). Дополнительное количество ди-трет-бутил-N,N-диэтилфосфорамидита (0,2 мл) загружали после 4,5 часов и перемешивание продолжали в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до 0°C, после чего добавляли по каплям 30% раствор пероксида водорода в воде (0,17 мл, 1,67 ммоль). Окисление фосфата завершали в течение 1,5. Реакционную смесь охлаждали до 0°C и реакцию гасили посредством добавления 1M водн. раствора Na₂S₂O₃ (8 мл). Смесь экстрагировали с помощью EtOAc (2×30 мл), объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над Na₂SO₄ и растворитель удаляли при пониженном давлении. При очистке посредством хроматографии (диоксид кремния) с применением 100% EtOAc в качестве элюента получали указанное в заголовке соединение (366 мг, 0,359 ммоль, выход 64%) в виде твердого вещества белого цвета. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=1,08 мин; MS масса/заряд=1020,5 [M+H+].

Стадия 2. Синтез 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((S)-2-((S)-2-аминопропанамидо)пропанамидо)фенокси)метил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтил дигидрофосфата

TFA (0,95 мл) добавляли к имеющему комнатную температуру раствору трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-((4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((ди-трет-бутоксифосфорил)окси)ацетил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)окси)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата (364 мг, 0,357 ммоль) в DCM (2 мл). Реакцию завершали в течение 2 ч., после чего растворитель удаляли при пониженном давлении. Указанное в заголовке соединение получали в виде пенообразного твердого вещества светло-желтого цвета и применяли без дополнительной очистки. LCMS (Способ r, Таблица 7) основной изомер ацеталя: R_t=0,77 мин; MS масса/заряд=808,3 [M+H⁺], минорный изомер ацеталя: R_t=0,79 мин; MS масса/заряд=808,3 [M+H⁺].

Стадия 3. Синтез 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((S)-2-((S)-2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо)пропанамидо)пропанамидо)фенокси)метил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтилдигидрофосфата

N,N-диизопропилэтиламин (0,37 мл, 2,12 ммоль) и сложный эфир малеимидоуксусной кислоты и N-гидроксисукцинимида (89 мг, 0,353 ммоль) последовательно добавляли к имеющему комнатную температуру раствору 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-((3-((S)-2-((S)-2-аминопропанамидо)пропанамидо)фенокси)метил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтил дигидрофосфата (285 мг, 0,353 ммоль) в диметилформамиде (1,5 мл) и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли с помощью DMSO и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой HPLC на колонке Phenomenex C18(2), 10 микрон (250×50 мм). Применяли градиент MeCN (A) и 0,1% TFA в воде (B) при расходе 30 мл/мин. (0-3,0 мин. 15% A, 3,0-19,0 мин. линейный градиент 15-60% A, затем 19,0-23,0 мин. линейный градиент до 85% A). Объединенные фракции концентрировали для удаления летучих растворителей при пониженном давлении, и полученный раствор замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения (93 мг, 0,098 ммоль, выход 28%) в виде твердого вещества белого цвета. Основной изомер ацеталя: LCMS (Способ r, Таблица 7) Rt=0,83 мин; MS масса/заряд=945,4 [M+H+]. 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,78 (s, 1H), 8,39 (d, J=7,2 Гц, 1H), 8,13 (d, J=7,2 Гц, 1H), 7,49-7,37 (m, 4H), 7,33 (t, J=2,2 Гц, 1H), 7,28 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,14 (t, J=8,1 Гц, 1H), 7,10-7,05 (m, 1H), 7,03 (s, 2H), 6,64 (dd, J=8,0, 2,4 Гц, 1H), 6,13 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,89 (d, J=1,5 Гц, 1H), 5,50 (s, 1H), 5,04 (s, 2H), 4,96-4,85 (m, 2H), 4,81 (s, 1H), 4,55 (dd, J=18,1, 8,2 Гц, 1H), 4,38-4,21 (m, 3H), 4,13-3,98 (m, 2H), 2,53 (dd, J=13,2, 5,2 Гц, 1H), 2,28 (d, J=16,1 Гц, 1H), 2,09 (d, J=11,2 Гц, 1H), 2,08-1,95 (m, 1H), 1,70 (dddd, J=29,9, 25,9, 14,4, 6,4 Гц, 5H), 1,36 (s, 3H), 1,26 (d, J=7,0 Гц, 3H), 1,18 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,02 (ddd, J=14,7, 11,6, 4,0 Гц, 2H), 0,86 (s, 3H).

Пример 70. Синтез 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-2-((S)-2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо)пропанамидо)пропанамидо)бензил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтил-2-(диметиламино)ацетат-2,2,2-трифторацетата

Стадия 1. Синтез 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропанамидо)пропанамидо)бензил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтил-2-(диметиламино)ацетат-2,2,2-трифторацетата

К раствору трет-бутил-((2S)-1-(((2S)-1-((3-(4-((6aR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата (полученного таким же способом, как и в примере 10, стадия 1) (78 мг, 0,096 ммоль), 2-(диметиламино)уксусной кислоты (10,9 мг, 0,106 ммоль) и 2,6-диметилпиридина (0,022 мл, 0,192 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (2,0 мл) добавляли HATU (43,8 мг, 0,115 ммоль), и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 45 минут. Неочищенный продукт очищали посредством C18 HPLC с элюированием с помощью градиента растворителя 5-95% MeCN в 0,1 M водном TFA. Фракции, содержащие чистый продукт, концентрировали посредством лиофилизации с получением указанного в заголовке соединения (82 мг, выход 89%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,80 мин, MS масса/заряд=898,2 [M+H+].

Стадия 2. Синтез 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-2-((S)-2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо)пропанамидо)пропанамидо)бензил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтил-2-(диметиламино)ацетат-2,2,2-трифторацетата

Раствор 2-((6aR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропанамидо)пропанамидо)бензил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтил-2-(диметиламино)ацетата (82 мг, 0,074 ммоль) в DCM (4 мл) и TFA (1 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут и затем концентрировали in vacuo. К раствору данного соединения в безводном N,N-диметилформамиде (1 мл) добавляли основание Хунига (0,20 мл, 1,15 ммоль) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетат (27,8 мг, 0,11 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут и добавляли TFA (0,106 мл, 1,376 ммоль). Неочищенный продукт очищали посредством C18 HPLC с элюированием с помощью градиента растворителя 5-95% MeCN в 0,1 M водном TFA. Фракции, содержащие чистый продукт, концентрировали посредством лиофилизации с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества (46 мг, 0,0439 ммоль, выход 59%). LCMS (Способ r, Таблица 7) основной изомер ацеталя R_t=0,82 мин, MS масса/заряд=934 [M+H⁺]; минорный изомер ацеталя R_t= =0,81 мин, MS масса/заряд=934 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (501 МГц, DMSO-d₆) δ 10,12 (s, 2H), 9,75 (s, 1H), 8,40 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,11 (d, J=7,1 Гц, 1H), 7,45-7,42 (m, 1H), 7,38 (dd, J=8,2, 2,0 Гц, 2H), 7,31 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,22 (d, J=8,2 Гц, 2H), 7,17 (t, J=7,8 Гц, 1H), 7,06 (s, 1H), 6,89 (d, J=7,7 Гц, 1H), 6,50 (s, 1H), 6,15 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,93-5,90 (m, 1H), 5,52 (s, 1H), 5,30 (d, J=17,7 Гц, 1H), 5,00 (d, J=17,7 Гц, 1H), 4,86 (t, J=5,0 Гц, 2H), 4,36-4,25 (m, 4H), 4,12-4,02 (m, 2H), 3,87 (s, 1H), 2,82 (s, 3H), 2,56-2,51 (m, 1H), 2,50 (s, 0H), 2,50 (d, J=1,8 Гц, 0H), 2,33-2,26 (m, 2H), 2,15-2,06 (m, 2H), 2,04-1,97 (m, 2H), 1,84-1,80 (m, 1H), 1,77-1,60 (m, 4H), 1,37 (s, 3H), 1,26 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,19 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,10-0,98 (m, 3H), 0,89 (s, 3H).

Пример 71.

Синтез 4-(2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-2-((S)-2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо)пропанамидо)пропанамидо)бензил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтокси)-4-оксобутановой кислоты

Стадия 1. Синтез 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропанамидо)пропанамидо)бензил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтил-трет-бутилсукцината

Указанное в заголовке соединение получали с применением способа, описанного для примера 70, с замещением 4-(трет-бутокси)-4-оксобутановой кислоты на 2-(диметиламино)уксусную кислоту. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=1,03 мин; MS масса/заряд=968 [M+H+].

Стадия 2. Синтез 4-(2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-2-((S)-2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо)пропанамидо)пропанамидо)бензил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтокси)-4-оксобутановой кислоты

Указанное в заголовке соединение получали с применением способа, описанного на стадии 2, пример 69. Его выделяли в виде бесцветного твердого вещества (49 мг, 43%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,88 мин; MS масса/заряд=948,9 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 12,23 (s, 1H), 9,74 (s, 1H), 8,37 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,09 (d, J=7,2 Гц, 1H), 7,42-7,33 (m, 3H), 7,31-7,25 (m, 1H), 7,17 (dd, J=20,7, 7,9 Гц, 3H), 6,90-6,84 (m, 1H), 6,15-6,09 (m, 1H), 5,90-5,87 (m, 1H), 5,48 (s, 1H), 5,07 (d, J=17,7 Гц, 1H), 4,86-4,79 (m, 2H), 4,37-4,23 (m, 3H), 4,12-3,98 (m, 2H), 3,85 (s, 2H), 2,65-2,58 (m, 2H), 2,52-2,47 (m, 2H), 2,32-2,24 (m, 2H), 2,09 (d, J=10,8 Гц, 2H), 2,02-1,94 (m, 2H), 1,85-1,56 (m, 6H), 1,36 (s, 3H), 1,24 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,17 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,10-0,95 (m, 3H), 0,85 (s, 3H).

Пример 72.

Синтез 2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-2-((S)-2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо)пропанамидо)пропанамидо)бензил)фенил)-7-гидрокси-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-8b-ил)-2-оксоэтилгидросульфата

К раствору трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-гидрокси-8b-(2-гидроксиацетил)-6a,8a-диметил-4-оксо-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-додекагидро-1H-нафто[2',1':4,5]индено[1,2-d][1,3]диоксол-10-ил)бензил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамата, полученного таким же способом, как и в примере 10, стадия 1 (53 мг, 0,065 ммоль), в MeCN (2 мл) добавляли комплекс триоксида пиридина и серы (42 мг, 0,26 ммоль). Смесь затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Неочищенный продукт очищали посредством C18 HPLC с элюированием с помощью градиента растворителя 5-95% MeCN в 0,1 M водном TFA. Фракции, содержащие чистый продукт, концентрировали посредством лиофилизации с получением указанного в заголовке соединения. LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,83 мин; MS масса/заряд=892,0 [M+H+].

Указанное в заголовке соединение получали с применением способа, описанного на стадии 2, пример 69. Его выделяли в виде бесцветного твердого вещества (27 мг, выход 28%). LCMS (Способ r, Таблица 7) R_t=0,77 мин; MS масса/заряд=928,9 [M+H⁺]. ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 9,75 (s, 1H), 8,37 (d, J=7,3 Гц, 1H), 8,10 (d, J=7,2 Гц, 1H), 7,44 (d, J=8,3 Гц, 1H), 7,40-7,32 (m, 2H), 7,33-7,29 (m, 1H), 7,27 (d, J=10,1 Гц, 1H), 7,23-7,12 (m, 3H), 7,04 (s, 1H), 6,93-6,83 (m, 2H), 6,12 (dd, J=10,1, 1,9 Гц, 1H), 5,91-5,86 (m, 1H), 5,42 (s, 1H), 4,87 (d, J=5,1 Гц, 1H), 4,84 (s, 1H), 4,74 (d, J=18,3 Гц, 1H), 4,45 (d, J=18,3 Гц, 1H), 4,36-4,24 (m, 3H), 4,11-3,99 (m, 2H), 3,86 (s, 2H), 2,58-2,48 (m, 1H), 2,32-2,22 (m, 1H), 2,08 (d, J=11,1 Гц, 1H), 1,98 (s, 1H), 1,77 (s, 2H), 1,75-1,56 (m, 4H), 1,36 (s, 3H), 1,24 (d, J=7,1 Гц, 3H), 1,17 (d, J=7,0 Гц, 3H), 1,10-0,95 (m, 2H), 0,83 (s, 3H).

Пример 73. Протоколы конъюгации

Общий протокол конъюгации цистеина

Приблизительно 10 мг/мл раствора необходимого антитела получали в PBS буфере, pH 7,4, а также 10 мМ TCEP растворе в PBS (разрушающего сшивающие связи средства, кат. 77720). Антитела (hIgG1 к hTNF (D2E7) или mIgG2a к mTNF (8C11; McRae BL et al. J Crohns Colitis 10 (1): 69-76 (2016)) затем частично восстанавливали посредством добавления примерно двух молярных экв. 10 мМ TCEP, быстро смешивали и инкубировали в течение 60 мин. при 37°C. Затем добавляли DMSO к частично восстановленным антителам в достаточном количестве до 15% общего DMSO. Для конъюгаций затем добавляли 8 молярных экв. 10 мМ раствора D-L-малеимида (где SM представляет собой радикал на основе глюкокортикостероида и L представляет собой линкер) и инкубировали в течение 30 мин. при комнатной температуре. Избыточное количество комбинации и DMSO затем удаляли с применением обессоливающих колонок NAP-5 (GE Healthcare, № по кат. 17-0853-02) предварительно уравновешенных PBS буфером, pH 7,4. Обессоленные образцы затем анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) и пониженной масс-спектрометрии.

Гидролиз тиосукцинимида

Гидролиз тиосукцинимидного кольца ADC согласно настоящему изобретению осуществляли посредством инкубирования ADC при повышенном значении pH. Вкратце, получали 0,7 M раствор аргинина, pH 9,0, и добавляли к каждому ADC в PBS буфере с доведением до общей концентрации аргинина до 50 мМ (pH ~ 8,9). Материал затем инкубировали при 25°C в течение 72 часов. Гидролиз сукцинимидного кольца затем подтверждался посредством пониженной масс-спектрометрии, после которой гидролиз прекращали с помощью добавления раствора 0,1 M уксусной кислоты до 12,5 мМ общего содержания уксусной кислоты (pH ~ 7,1).

Общий протокол конъюгации с лизином

Сначала получали примерно 10 мг/мл раствор необходимого антитела в PBS буфере, pH 7,4. Восемь молярных экв. D-L-N-гидроксисукцинимида (где SM представляет собой радикал глюкокортикостероида, а L представляет собой линкер) затем добавляли к антителу и инкубировали при 23°C не более 24 часов в присутствии 15% DMSO. Затем конъюгированные образцы обессоливали для удаления избытка комбинации и DMSO с использованием обессоливающих колонок NAP-5 (GE Healthcare, № по кат. 17-0853-02), уравновешенных PBS буфером, pH 7,4. Обессоленные образцы затем анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) и пониженной масс-спектрометрии.

Аналитические процедуры для ADC

Хроматография гидрофобного взаимодействия. ADC профилировали с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) для определения степени конъюгации и для вычисления приблизительных соотношений лекарственного средства и лекарственного средства на основе антитела (DAR). Вкратце, 100 мкг ADC загружали в систему Ultimate 3000 Dual LC (Thermo Scientific), оснащенную 4,6 X 35 мм колонкой бутил-NPR (Tosoh Bioscience, № по кат. 14947). ADC загружали в колонку, уравновешенную в 100% буфере A и элюировали с использованием линейного градиента от 100% буфера A до 100% буфера B за 12 минут при 0,8 мл/мин., при этом буфер A представлял собой 25 мM фосфата натрия, 1,5 M сульфата аммония, pH 7,25, а буфер B представлял собой 25 мM фосфата натрия, 20% изопропанола, pH 7,25. DAR определяли посредством умножения суммы относительной площади каждого пика на загрузку соответствующего им лекарственного средства и деления взвешенной суммы на 100.

Эксклюзионная хроматография. Распределения размеров ADC профилировали с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) с использованием системы Ultimate 3000 Dual LC (Thermo Scientific), оснащенной 7,8 X 300 мм колонкой TSK-gel 3000SW_XL (Tosoh Bioscience, № по кат. 08541). 20 мкг каждого из ADC загружали в колонку и элюировали за 17 мин. с использованием изократического градиента при 1 мл/мин. 100 мM сульфата натрия, 100 мM фосфата натрия, pH 6,8, при 0,8 мл/мин.

Пример 74. Получение адалимумаба, конъюгированного с глюкокортикостероидом с получением ADC

Получали ADC адалимумаб MP-ala-ala стероид, имеющее среднее DAR 3,5, путем двухстадийного химического процесса: дисульфидное восстановление адалимумаба с последующим алкилированием (конъюгацией) с малеимидопропил-аланин-аланин-стероидным соед. № 88.

На первой стадии ограниченное число межцепочечных дисульфидных связей адалимумаба восстанавливалось с помощью трис(2-карбоксиэтил)фосфина (''TCEP'') (≥1,8 эквив.). Частично восстановленный адалимумаб затем конъюгировали с соед. № 88 (≥5 эквив.) в DMSO.

На фигуре 5, которая демонстрирует хроматографическое разрешение полученного в результате препарата ADC, при этом ADC представляет собой гетерогенную смесь, содержащую антитела, имеющие ноль присоединенных молекул линкера лекарственного средства (пик ''E0''), две присоединенные молекулы линкера лекарственного средства (пик ''E2''), четыре присоединенные молекулы линкера лекарственного средства (пик ''E4''), шесть присоединенных молекул линкера лекарственного средства (пик ''E6'') и восемь присоединенных молекул линкера лекарственного средства (пик ''E8''), в зависимости от числа восстановленных межцепочечных дисульфидных связей. Способы хроматографического разделения и выделения гомогенных пиков E2 и E4 описываются в Hamblett et al., Clin Cancer Res 2004;10:7063-7070. Условия HIC, используемые на фигуре 5, были следующими.

Колонка представляла собой TOSOH Tskgel бутил-NPR, 4,6 мм x 3,5 см, 2,5 микрон, а температура колонки составляла 30°C. Длина волны составляла 280 нм, время хроматографирования составляло 22 минуты, объем введения составлял 40 мкл, скорость потока составляла 0,5 мл/минута. Подвижная фаза A: 25 мM Na₂HPO_4, pH 7,0, и 1,5 M (NH₄)₂SO₄, подвижная фаза B: 25 мM Na₂HPO_4, pH 7,0/IPA =75/25. Профиль градиента

Время (минуты)	Подвижная фаза A	Подвижная фаза B
0	90	10
2	85	15
18	5	95
18,1	90	10
22	90	10

Способы хроматографического разделения и выделения гомогенных пиков E2 и E4 описываются в Hamblett et al., Clin Cancer Res 2004;10:7063-7070. Вкратце, после гидролиза и доведения до pH <7,4 смесь с широким распределением обрабатывали 3 M сульфатом аммония/50 мM фосфатным буфером для доведения общей концентрации раствора сульфата аммония до приблизительно 0,8 M. Готовили предварительно упакованную колонку для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) (смола бутилсефарозы HP) путем дезинфекции 0,5 н. раствором NaOH (4 CV), ополаскивания водой для инъекции (WFI, 0,5 CV) и уравновешивания 0,8 M сульфатом аммония/25 мM фосфатным буфером (4 CV). Раствор с широким распределением/забуференный сульфатом аммония раствор загружали в колонку HIC (приблизительная загрузка, 30 мг белка на мл смолы) с последующим промыванием 0,8 M сульфатом аммония/25 мM фосфатным буфером (2,5 CV). Элюирование продукта было следующим: 0,72 M сульфат аммония/25 мM фосфатный буфер (3 CV), неконъюгированное mAb; 0,56 M сульфат аммония/25 мM фосфатный буфер (4,5 CV), DAR2 ADC; 0,32 M сульфат аммония/25 мM фосфатный буфер (6,5 CV), DAR4 ADC. Затем фракции продукта DAR 2 и DAR4 отдельно концентрировали до приблизительно 30 мг/мл путем ультрафильтрации (Millipore Ultracel, пороговое значение 30 кДа) с последующей диафильтрацией в WFI (8 CV).

Сукцинимид очищенного конъюгата E4 гидролизировали с обеспечением стабилизированного присоединения путем доведения pH раствора продукта до≥9 с использованием аргининового буфера. Раствор содержали при температуре окружающей среды в течение≥2 дней, на протяжении которых определяемый анализом LC-MS гидролиз был завершен на >90%. См. фигуру 6 для части хроматограммы LC-MS. Условия SEC, используемые на фигуре 6, были следующими.

Колонка представляла собой TOSOH TSK-gel G3000SW_xL, 5 микрон, 250 Å, 7,8×300 мм, колонка имела температуру окружающей среды, длина волны составляла 214 нм, время хроматографирования составляло 55 минут, объем введения составлял 10 мкл, скорость потока составляла 0,25 мл/минута, температура автоматического пробоотборника составляла 4°C. Подвижная фаза: 100 мM Na₂HPO₄ и 100 мM Na₂SO₄, pH 6,8/IPA=90/10.

Необработанные (фигура 7) и деконволютированные (фигура 8) данные MS для адалимумаба, конъюгированного с MP-ala-ala-стероидным соед. № 88. Черный квадрат и кружок представляют собой ADC с сукцинимидом, гидролизованный и негидролизованный, соответственно. Относительное содержание гидролизованного и негидролизованного ADC используют для определения гидролизного превращения.

Гидролиз

Гидролиз сукцинимидного кольца после конъюгации проводили с боратным буфером при pH 8,0, pH 8,5 и pH 9,0 и аргининовым буфером при pH 8,0 и pH 9,0 для исследования скорости гидролиза кольца. Результаты показаны в таблице 9 ниже.

Таблица 9. Гидролиз сукцинимидного кольца

Соед. №	Гидролиз после 1 дня/% (pH)	Гидролиз после 2 дней/% (pH)	Гидролиз после 3 дней/% (pH)
Борат (8,0)	Борат (8,5)	Борат (9,0)	Арг. (8,0)	Арг. (9,0)	Борат (8,0)	Борат (8,5)	Борат (9,0)	Арг. (8,0)	Арг. (9,0)	Борат (8,0)	Борат (8,5)	Борат (9,0)	Арг. (8,0)	Арг. (9,0)
121	28	37,6	49,7	24,5	63,4	42,6	55,9	71,8	33,8	84,4	56	72,1	85,4	46,5	100
122	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
123	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
124	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
125	38,2	49,8	64,5	29,8	75,7	56,4	71,5	88,6	42,2	100	73,6	86,2	100	58	100
126	30,5	37,7	50,3	23,5	59,3	44,5	57,1	72,2	33,4	82,4	58,7	74,9	90,3	45,8	100
127	32,2	40,8	53,9	24,6	63	46,4	60,1	75,1	33,7	84,7	61,2	77	90,3	48,5	100
128	28,6	35,6	48,4	20,7	56,9	40,8	53,6	69,9	30,1	82,5	54,9	71,5	88,9	42,6	100
129	39,1	49,6	65,7	30	76,6	57,5	71,9	88,4	42,1	100	73,9	100	100	58,7	100
130	84,3	100	100	74,4	100	100	100	100	94,2	100	100	100	100	100	100
131	28,6	35,2	49,5	23,9	55,4	40,9	51,4	67,7	29,8	79,2	53,4	68,1	85,6	41,7	100

Пример 75. Активность низкомолекулярных стероидов in vitro

Анализ связывания глюкокортикоидного рецептора

Малые молекулы тестировали в отношении связывания глюкокортикоидного рецептора (GR) с использованием набора для анализа глюкокортикоидного рецептора Polarscreen™, Red (ThermoFisher A 15898) согласно протоколу производителя. Вкратце, соединения последовательно разбавляли с помощью DMSO, затем переносили в буфер из аналитического набора при разбавлении 1:10. Соединения дополнительно разбавляли 1:5 буфером из аналитического набора и 10 мкл переносили в 384-луночный низкообъемный планшет с черными стенками (Corning 4514). 5 мкл исходного раствора 4X Fluormone GS Red и 5 мкл полноразмерного исходного раствора 4x GR добавляли в каждую лунку, содержащую тестируемое соединение, и планшеты инкубировали защищенными от света при комнатной температуре в течение 4 часов. Измеряли флуоресцентную поляризацию (mP) для каждого планшета с использованием планшет-ридера EnVision Multilabel (Perkinelmer, № 2104-0010) и данные анализировали с использованием построения четырехпараметрической кривой для получения значений EC50. Результаты показаны в таблице 10 ниже.

Клеточный анализ минералокортикоидного рецептора

Малые молекулы тестировали в отношении агонистической активности в отношении минералокортикоидных рецепторов (MR) с использованием клеточной линии PathHunter^® NHRPRO CHO-K1 MR (DiscoveRx, № по кат. 93-0451C2) согласно протоколу производителя. Вкратце, 20000 клеток/лунка в культуральной среде высевали в 96-луночный планшет с половинным объемом лунок (Costar, № по кат. 3885) в течение ночи при 37^oC. Среду удаляли и заменяли последовательно разбавленными малыми молекулами в аналитической среде (30 мкл; конечный 0,3% DMSO). Планшеты инкубировали в течение ночи при 37^oC. Среду удаляли, заменяли реагентом для выявления (DiscoveRx, № по кат. 93-0001; 12 мкл/лунка) и инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение 60 минут. Измеряли люминесценцию для каждого планшета с использованием планшет-ридера EnVision Multilabel (Perkinelmer, № 2104-0010) и данные анализировали с использованием построения четырехпараметрической кривой для получения значений EC50. Результаты показаны в таблице 10 ниже.

Анализ связывания прогестеронового рецептора

Малые молекулы тестировали в отношении связывания прогестеронового рецептора (PR) с использованием модификации анализа LanthaScreen^® TR-FRET Progesterone Receptor Coactivator Assay (Thermofisher, № по кат. A15903), при этом меченный флуоресцеином коактиваторный пептид заменяли Fluormone AL-Red (Thermofisher, № по кат. PV4294) для улучшения сигнала при анализе. Вкратце, соединения последовательно разбавляли с помощью DMSO, затем переносили в аналитический буфер (Thermofisher, № по кат. PV4301+5 мM DTT) при разбавлении 1:10. 10 мкл соединения переносили в 96-луночный черный планшет с половинной площадью лунок (Corning, № по кат. 3694) в двух повторностях. Добавляли 5 мкл белка PR-LBD (4 нM исходный раствор в аналитическом буфере; Thermofisher, № по кат. P2899) в каждую лунку. Кроме того, в каждую лунку также добавляли 5 мкл полученной смеси Fluormone AL-Red (12 нM) и меченного тербием моноклонального антитела (mAb) к GST (20 нM; Thermofisher, № по кат.PV3550) в аналитическом буфере. Планшеты инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение 2 часов, а затем измеряли коэффициент эмиссии TR-FRET с использованием планшет-ридера EnVision Multilabel (Perkinelmer, № 2104-0010). Данные анализировали с использованием построения четырехпараметрической кривой для получения значений EC50. Результаты показаны в таблице 10 ниже.

Анализ связывания андрогенного рецептора

Малые молекулы тестировали в отношении связывания андрогенного рецептора (AR) с использованием модификация анализа LanthaScreen® TR-FRET Androgen Receptor Coactivator Assay (Thermofisher, № по кат. A15878), при этом меченный флуоресцеином коактиваторный пептид заменяли Fluormone AL-Red (Thermofisher, № по кат. PV4294) для улучшения сигнала при анализе. Вкратце, соединения последовательно разбавляли с помощью DMSO, затем переносили в аналитический буфер (Thermofisher, № по кат. PV4295+5 мM DTT) при разбавлении 1:10. 10 мкл соединения переносили в 96-луночный черный планшет с половинной площадью лунок (Corning, № по кат. 3694) в двух повторностях. Добавляли 5 мкл белка AR-LBD (5 нM исходный раствор в аналитическом буфере; Thermofisher, № по кат. 3009) в каждую лунку. Кроме того, в каждую лунку также добавляли 5 мкл полученного исходного раствора Fluormone AL-Red (20 нM) и меченного тербием моноклонального антитела (mAb) к GST (30 нM; Thermofisher, № по кат. PV3550) в аналитическом буфере. Планшеты инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение 6 часов, затем измеряли коэффициент эмиссии TR-FRET с использованием планшет-ридера EnVision Multilabel (Perkinelmer, № 2104-0010). Данные анализировали с использованием построения четырехпараметрической кривой для получения значений EC50. Результаты показаны в таблице 10 ниже.

Анализ по репортеру GRE

Исходные клетки K562 GRE (pGL4,36[luc2P/MMTV/Hygro]), описываемые в примере 78, высевали в 96-луночные белые планшеты для обработки культуры тканей (Costar: 3917) при 50000 клеток на лунку в 50 мкл аналитической среды (RPMI, 1% CSFBS, 1% L-глутамин, 1% Na пируват и 1% MEAA). Низкомолекулярные соединения агониста GR последовательно разбавляли при исходной концентрации 100 мкМ и последовательно разбавляли в 4 раза с помощью 100% DMSO. Низкомолекулярные соединения далее разбавляли аналитической средой путем переноса 2 мкл последовательно разбавленных соединений в 248 мкл аналитической среды в планшет для вторичного разбавления (разбавление 1:125). Затем клетки обрабатывали с помощью 25 мкл разбавленного 1:125 соединения агониста GR для конечной исходной концентрации 266,7 нМ (1:3) или средой отдельно и инкубировали в течение 24 часов при 37°, 5% CO₂. После 24-часовой инкубации клетки обрабатывали с помощью 75 мкл Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega-E2920) в течение 10 минут и анализировали в отношении люминесценции с использованием TopCount или MicroBeta2 (PerkinElmer).

Анализ связывания эстрогенного рецептора

Малые молекулы тестировали в отношении связывания эстрогенного рецептора (ER) альфа с использованием модификации анализа LanthaScreen® TR-FRET Estrogen Receptor Alpha Coactivator Assay (Thermofisher, № по кат. A15885), при этом меченный флуоресцеином коактиваторный пептид заменяли Fluormone ES2 Green (Thermofisher, № по кат. PV6045) для улучшения сигнала при анализе. Вкратце, соединения последовательно разбавляли с помощью DMSO, затем переносили в аналитический буфер (Thermofisher, № по кат. PV4295+5 мM DTT) при разбавлении 1:10. 10 мкл соединения переносили в 96-луночный черный планшет с половинной площадью лунок (Corning, № по кат. 3694) в двух повторностях. Добавляли 5 мкл белка ER-LBD (5 нM исходный раствор в аналитическом буфере; Thermofisher, № по кат. 4542) в каждую лунку. Кроме того, в каждую лунку также добавляли 5 мкл полученного исходного раствора Fluormone ES2 Green (12 нM) и меченного тербием моноклонального антитела (mAb) к GST (8 нM; Thermofisher, № по кат. PV3550) в аналитическом буфере. Планшеты инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение 4 часов, а затем измеряли коэффициент эмиссии TR-FRET с использованием планшет-ридера EnVision Multilabel (Perkinelmer, № 2104-0010). Данные анализировали с использованием построения четырехпараметрической кривой для получения значений EC50. Результаты показаны в таблице 10 ниже.

Таблица 10. Активность in vitro

Соед. №	Химическая структура	IC₅₀ связывания GR (мкM)	EC₅₀ репортера GRE (мкM)	EC₅₀ MR (агонист) (мкM)	IC₅₀ связывания PR (мкM)	IC₅₀ связывания ER (мкM)	IC₅₀ связывания AR (мкM)
2 (TFA)		0,0066	NT	NT	NT	NT	NT
3		0,0036	0,0002	0,0846	0,0026	30++	>30
4 (TFA)		0,0095	0,0003	0,836 0,957	0,0198	>30	3,99
5		0,0120	0,0184	NT	NT	NT	NT
6 (TFA)		0,0641	0,0396	NT	NT	NT	NT
7		0,0155	0,0005	0,515 0,300	0,0157	>30	>30
8		0,0201	0,0151	NT	NT	NT	NT
9		0,0094	0,0001	2,61	0,0116	30++	>30
10		0,0156	0,0001	0,305	0,0105	5,13	>30
11		0,0139	0,0185	NT	NT	NT	NT
12		0,0247	0,0161	NT	NT	NT	NT
13		0,0157	0,0009	10,1 >30	0,0154	>30	>30
14		0,0255	0,0001	0,119	0,0222	2,71	>30
15		0,0149	0,0006	0,141	0,0165	3,77	>30
16		0,0537	0,0188	NT	NT	NT	NT
17		0,0278	0,0656	NT	NT	NT	NT
18		0,0437	0,0299	NT	NT	NT	NT
19 (TFA)		0,0101	0,0152	NT	NT	NT	NT
20		0,0194	0,0002	0,521	0,0186	0,814	>30
20 (TFA)		0,0086	0,0003	1,64 1,64	0,0171	30++	>30
21		0,0094	0,0002	0,149 4,42	0,0073	>30	>30
22		0,0283	0,0075	NT	NT	NT	NT
22 (TFA)		0,0082	0,0233	NT	NT	NT	NT
23		0,0108	0,0051	NT	NT	NT	NT
24 (TFA)		0,0138	0,0023	1,06	0,0089	30++	>30
25		0,0216	0,0002	3,09	0,0133	30++	>30
26		0,0256	0,0167	NT	NT	NT	NT
27		0,0102	NТ	NT	NT	NT	NT
28		0,0146	0,0419	NT	NT	NT	NT
29		0,0132	0,0011	NT	NT	NT	NT
30		0,0177	0,0078	NT	NT	NT	NT
31		0,0107	0,0003	NT	NT	NT	NT
32		0,0074	0,0001	3,56	0,013	30++	>30
33		0,0169	0,0306	NT	NT	NT	NT
34		0,0122	0,0034	NT	NT	NT	NT
35		0,0034	0,0214	NT	NT	NT	NT
35 (TFA)		0,0067	0,0178	0,407 0,407+	0,256	30++	>30
36 (TFA)		0,0034	0,0002	0,129 >30	0,052	>30	>30
37		0,0131	0,1320	2,12 5,05	1,09	>30	>30
38		0,0128	0,266++	0,876 1,47	1,19	>30	9,28
39		0,0156	0,0322	0,422	0,137	30++	>30
40		0,0111	0,0007	>30 >30	0,106	>30	>30
41		0,0028	0,0014	30++	0,076	30++	>30
42		0,0124	0,0004	10,1	0,0873	9,75	>30
45 (TFA)		0,0661	0,0013	30++ >10	0,08	6,48	>14,42
46 (TFA)		0,0267	0,0541	30++	2,13	30++	>30
47		0,0065	0,0042	3,86	0,171	>30	NT
48		0,0118	0,0871	>30	0,108	>30	NT
49		0,0056	0,0183	>30	2,7	>30	NT
50		0,0080	0,0009	10,1 0,751	0,0345	30++	>30
51 (TFA)		0,0042	0,0006	4,98	0,0136	30++	>30
52		NT	NT	NT	NT	NT	NT
53		0,0065	0,0009	NT	NT	NT	NT
54		0,0095	0,0003	0,269 6,23	0,0527	>30	>30
55 (TFA)		0,0114	0,0004	10,5 >30	0,0933	>30	>30
57		0,0063	0,0015	10,1	0,0914	30++	>30
58		0,0078	0,0013	0,830	0,0341	5,98	NT
59		0,0127	0,0004	0,179	0,0134	>30	NT
60		0,0121	0,0017	>30	0,0699	>30	NT
61		0,0302	0,0191	>30	0,839	>30	NT
62		0,0210	0,0030	0,475	0,0248	>30	NT
63		0,0038	0,0067	>30	0,447	>30	NT
64		0,0116	0,0214	30++	0,121	>30	NT
65		NT	NT	NT	NT	NT	NT
66		NT	NT	NT	NT	NT	NT
67		0,00749	0,00313	30++	0,181	30++	NT
68		NT	NT	NT	NT	NT	NT
69		0,012	0,00244	30++	0,0096	30++	NT
70		0,0198	0,00932	NT	NT	NT	NT

++ указывает на то, что сообщенные данные представляют собой среднее значение нескольких точек данных, и сообщенные данные следует понимать как «больше, чем» сообщенные данные.

«NT» означает «не тестировали».

Пример 76. Стабильность иммуноконъюгатов к TNF-альфа

Матричная стабильность

Стероидные ADC к TNFα тестировали в отношении их восприимчивости к преждевременному высвобождению нагрузки малой молекулы при физиологических условиях. В данных экспериментах ADC разбавляли в плазме крови (человека, обезьяны, мыши или крысы) или в буфере в двух повторностях и инкубировали в течение 6 дней при 37^oC, 5% CO₂. Каждый образец блокировали в момент времени 0 минут и в различные моменты времени на протяжении 6-дневного периода. Затем образцы анализировали с использованием LC/MS/MS и сравнивали со стандартными кривыми в отношении соответствующей малой молекулы. Рассчитывали % максимального высвобождение нагрузки малой молекулы с течением времени. Результаты приведены в таблице 11 ниже.

Таблица 11. Стабильность стероидных ADC к TNFα

	Матричная стабильность (% максимального высвобождения SM)
Соед. №	PBS буфер	Плазма крови человека	Плазма крови яванского макака	Плазма крови мыши
136	0,00864	8,34E-04	0,0165	0,0327
137	0	0	0	0
138	0,00954	0,00471	0,00444	0,0215
139	0	0	0	0
142	0,00306	0	0,00766	0,0564
144	0	0	0	0
145	0,00451	0	0	0
146	0,031	0,016	0,0306	0,0744
147	0	0	0	0,00565
148	4,51E-04	0,0032	0,0188	0,0162
149	0	0	0	0,00648
150	0,00809	0	0,0153	0,074
152	0,00513	0	5,42E-04	0,0392
153	0	4,01E-04	0	0,132
154	0,00E+00	0	0	0
155	0	0	0	0
156	0	0	0	0,152
157	0,0134	0,00559	0	0,026

Эти результаты показывают, что стероидные ADC к TNFα являются стабильными в буфере и плазме крови нескольких видов, и что наблюдается минимальное высвобождение малой молекулы.

Протеолитическая стабильность

Восприимчивость стероидных ADC к высвобождению их нагрузки посредством обработки протеазой сравнивали с ADC, созданным с использованием линкера лекарственного средства vcmcMMAE, конъюгированного с антителом к мышиному CD-19. ADC (среднее DAR 4) инкубировали либо с катепсином B, либо с протеиназой K и высвобождение нагрузки анализировали с помощью LC-MS в различные моменты времени (0, 1, 4, 7 и 24 часа).

Результаты показаны на фигуре 1 и демонстрируют, что стероидные ADC являются устойчивыми к экзогенному опосредованному катепсином высвобождению нагрузки из ADC. Это контрастирует с известным ADC с линкером нагрузки (mcvcMMAE), где MMAE высвобождается в значительных количествах при обработке катепсином. Эти данные указывают на то, что стероидные ADC являются намного менее восприимчивыми к преждевременному высвобождению нагрузки, которое является результатом активности катепсина в кровотоке, чем известные ADC. Действительно, высвобождение стероида наблюдается только с протеиназой K, серинпротеазой, которая демонстрирует широкую специфичность расщепления. Это указывает на то, что часть антитела в стероидном ADC должна быть значительно катаболизирована до расщепления стероидного линкера, и что высвобождение нагрузки может быть ограничено средой, в которой может происходить расщепление остова антитела в ADC, такой как лизосома.

Расщепление катепсином B

Получали 0,2 мг/мл исходный раствор катепсина B (Sigma) в буфере (25 мM Tris, 50 мM NaCl и 5% глицерина). Для получения 10 мкг/мл рабочего раствора катепсина B 5 мкл исходного раствора 0,2 мг/мл катепсина B смешивали с 95 мкл активационного буфера (50 мM ацетат натрия, pH 5, 1 мM EDTA и 5 мM DTT) и инкубировали при 37°C в течение 15 минут. Для расщепления ADC 20 мкл 100 мкг/мл ADC и 20 мкл рабочего раствора катепсина B смешивали с 160 мкл буфера для разбавления (50 мM ацетат натрия, 1 мM EDTA). Образец инкубировали при 37°C со встряхиванием и удаляли 40-мл аликвоты через 0, 1, 4, 7 и 24 часа. В каждую аликвоту добавляли 160 мкл блокирующего раствора (0,1% муравьиная кислота; 1:1 MeOH:MeCN; 100 нМ карбутамид) и высвобожденную малую молекулу выявляли с помощью LC-MS/MS, как описывалось ранее.

Расщепление протеиназой K

Получали 5 мг/мл исходного раствора протеиназы K (Sigma) в деионизированной (DI) воде. Получали 0,25 мг/мл рабочий раствор протеиназы K путем смешивания 50 мкл 5 мг/мл протеиназы K с 950 мкл буфера для разбавления (1x HBSS и 1 мM EDTA). Для расщепления ADC 20 мкл 100 мкг/мл ADC и 40 мкл рабочего раствора протеиназы K смешивали с 140 мкл буфера для разбавления. Образец инкубировали при 37°C со встряхиванием и удаляли 40-мл аликвоты через 0, 1, 4, 7 и 24 часа. В каждую аликвоту добавляли 160 мкл блокирующего раствора (0,1% муравьиная кислота; 1:1 MeOH:MeCN; 100 нМ карбутамид) и высвобожденную малую молекулу выявляли с помощью LC-MS/MS, как описывалось ранее.

Пример 77. Стабильность иммуноконъюгатов к TNF-альфа in vivo

Оценивали восприимчивость стероидного ADC к потере линкера лекарственного средства у мышей. MP-Ala-Ala-стероид конъюгировали с человеческим mAb IgG1 (среднее DAR 4) и инкубировали при pH 9 для катализа раскрывающего кольцо гидролиза для тиосукцинимидного кольца. После нейтрализации стероидный ADC инъецировали мышам и контролировали кинетические показатели потери линкера лекарственного средства в течение 7 дней с помощью LC-MS.

В этих экспериментах ADC, составленный в фосфато-солевом буферном растворе вводили внутривенно 15 самцам мышей DBA/1 при 5 мг/кг. Трех мышей умерщвляли через 1 час, 24 часа, 72 часа, 168 часов и 240 часов после введения дозы. Цельную кровь с EDTA собирали и получали сыворотку крови для in vivo анализа DAR с помощью масс-спектрометрии.

Предварительное разбавление образцов сыворотки крови

Образцы сыворотки разбавляли в сыворотке крови лошади (Life technologies, 16050-122) на основании общих концентраций антител ADC, измеренных с помощью анализа связывания общего антитела с лигандом. Разбавления были основаны на оценках конечной концентрации в диапазоне 10-30 мкг/мл, что подходит для верхнего предела связывающей способности магнитных микроносителей.

Иммуноаффинная и аффинная очистка

В пробирку LoBind с белком (Eppendorf North America) добавляли 350 мкл сыворотки крови лошади к 100 мкл каждого предварительно разбавленного образца ADC сыворотки крови до общего объема 450 мкл, а затем добавляли 4 мкг биотин-антитело к человеческому Fc (2 мкл биотин-антитело к человеческому Fc при 2 мг/мл растворе). Образцы инкубировали в течение 2 часов (ч.) при комнатной температуре со встряхиванием при 900 об./мин. на орбитальном шейкере. Для каждого образца сыворотки крови 50 мкл взвеси покрытых стрептавидином магнитных микроносителей (Pierce, № по кат. 88817) уравновешивали с помощью 0,1% Tween в PBS буфере (PBST) в пробирке LoBind. Фосфатно-солевой буферный раствор с буфером Tween 20 (PBST) удаляли пипеткой после оттягивания магнитных микроносителей к стенке пробирки LoBind путем помещения пробирки LoBind на магнитную подставку. Образцы сыворотки крови после 2 часов инкубации с реагентом захвата антитела к человеческому антигену переносили в пробирки LoBind, содержащие уравновешенные магнитные микроносители, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при 900 об./мин. на орбитальном шейкере. Сыворотку крови удаляли после инкубации с магнитным микроносителем и магнитный микроноситель тщательно промывали посредством 500 мкл PBST (3 раза), а затем 500 мкл 5% MeOH в воде MilliQ (3 раза). Связанные с магнитным микроносителем ADC высвобождали путем инкубации магнитных микроносителей с 100 мкл 0,5% муравьиной кислоты в 50% MeOH/вода MilliQ в течение 15 минут.

Восстановление очищенного ADC

Высвобожденный ADC восстанавливали путем добавления 10 мкл восстанавливающего реактива (10 мM TCEP, свежеприготовленного из порошка, приобретенного у Thermo Scientific, с 10 мM EDTA в 2 M, pH 7,5, буфер Tris) в 100 мкл образца и инкубировали при 37°C в течение 30 минут.

LC/MS анализ

Восстановленные образцы (10 мкл) вводили в систему Agilent 6550 QTof LC/MS посредством автоматического пробоотборника с контролируемой температурой (5°C) CTC. Элюирование образцов выполняли на колонке Waters C-4, 3,5 мкм, 300 Å, 2,1×50 мм в.д. для HPLC. Подвижные фазы представляли собой: A: 0,1% муравьиная кислота в воде, и B: 0,1% муравьиная кислота в MeCN; скорость потока составляла 0,45 мл/мин.; а ячейку колонки поддерживали при 40°C.

Градиент HPLC был следующим:

Время (мин.)	%A	%B
0	95	5
0,6	95	5
1,1	10	90
2,2	10	90
2,4	95	5
3,5	95	5

Выполняли анализ MS высокого разрешения для восстановленного ADC на квадрупольном времяпролетном Agilent 6550 (Agilent Technology, Санта-Клара, Калифорния), оснащенном источником ионизации электрораспылением Dual Agilent Jet Stream (ESI), функционирующим в режиме определения положительных ионов. Масс-спектрометр работал в режиме расширенного динамического диапазона (2 ГГц) с диапазоном MS до 3200 масса/заряд. Первичный источник ESI использовали для анализа LC/MS, а вторичный зонд ESI использовали для введения калибровочного раствора при 922009798 масса/заряд для достижения калибровки MS в режиме реального времени. Масс-спектрометр ежедневно откалибровывали. Типичные массовые ошибки аналитов по сравнению с теоретическими массами составляли менее ±5 частей на миллион в ежедневных операциях. Данные MS обрабатывали с использованием MassHunter Qual Browser Build 5.0.

Спектральная деконволюция MS

Способ максимальной энтропии в пакете программного обеспечения MassHunter Bioconfirm использовали для деконволюции масс-спектров множественных заряженных ионов для получения нейтральных молекулярно-массовых спектров. Интенсивность деконволютированных пиков использовали для расчета DAR.

Вычисления значения DAR из деконволютированного спектра MS

Значения DAR рассчитывали с использованием деконволютированной пиковой интенсивности MS на основании следующих уравнений.

Значение DAR из легкой цепи (LC): LC DAR=(2 × пиковая интенсивность LC^)⁄((пиковая интенсивность LC+пиковая интенсивность LC^)),

LC и LC^ представляют собой легкие цепи с ноль и одним линкером лекарственного средства, соответственно.

Значение DAR из тяжелой цепи (HC):

HC DAR=2 × (пиковая интенсивность HC^+2 × пиковая интенсивность HC^^+3 × пиковая интенсивность HC^^^)/(пиковая интенсивность HC+пиковая интенсивность HC^+пиковая интенсивность HC^^+пиковая интенсивность HC^^^),

HC, HC^, HC^^ и HC^^^ представляют собой тяжелые цепи с ноль, одним, двумя и тремя линкерами лекарственного средства, соответственно.

Общее DAR=LC DAR+HC DAR.

Результаты

Результаты показаны на фигуре 2. Данный пример показывает, что наблюдается минимальная потеря линкера лекарственного средства из стероидного ADC за 7 дней.

Пример 78. Создание клеточных линий ''человеческий и мышиный трансмембранный TNF-альфа GRE репортер''

Для создания исходной клеточной линии клетки K562 высевали в 6-луночную чашку (Costar: 3516) с 2 мл полной питательной среды (RPMI, 10% FBS, 1% L-глутамин, 1% Na пируват и 1% MEM NEAA) при 500000 клеток на лунку в течение 24 часов при 37°, 5% CО₂. На следующий день 1,5 мкг pGL4,36[Luc2P/MMTV/Hygro] (Promega: E316), 1,5 мкг pGl4,75[hRLuc/CMV] (Promega: E639A) и 3 мкл реагента PLUS (Invitrogen: 10964-021) разбавляли в 244 мкл Opti-MEM (Gibco: 31985-070) и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Вектор pGL4,36[luc2P/MMTV/Hygro] содержит MMTV LTR (длинный концевой повтор мышиного вируса опухоли молочной железы), который управляет транскрипцией репортерного гена люциферазы luc2P в ответ на активацию нескольких ядерных рецепторов, таких как глюкокортикоидный рецептор и андрогенный рецептор. Вектор pGL4,75[hRluc/CMV] кодирует репортерный ген люциферазы hRluc (Renilla reniformis) и предназначен для высокого уровня экспрессии и уменьшения аномальной транскрипции.

После инкубации разбавленный раствор ДНК предварительно инкубировали с 1:1 раствором липофектамина LTX (Invitrogen: 94756) (13,2 мкл+256,8 мкл Opti-MEM) и инкубировали при комнатной температуре в течение 25 минут c образованием комплексов ДНК-липофектамин LTX. После инкубации 500 мкл комплексов ДНК-липофектамин добавляли непосредственно в содержащую клетки лунку. Клетки K562 трансфицировали в течение 24 часов при 37°, 5% CO₂. После инкубации клетки промывали посредством 3 мл PBS и отбирали с помощью полной питательной среды, содержащей 125 мкг/мл гигромицина B (Invitrogen: 10687-010) в течение двух недель. Получали клетки ''K562 pGL4,36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4,75[hRLuc/CMV]''.

Для создания клеточной линии ''мышиный трансмембранный TNF-альфа GRE репортер'' исходные клетки K562 pGL4,36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4,75[hRLuc/CMV] высевали в 6-луночную чашку (Costar: 3516) с 2 мл полной питательной среды (RPMI, 10% FBS, 1% L-глутамин, 1% Na пируват и 1% MEM NEAA) при 500000 клеток на лунку в течение 24 часов при 37°, 5% CО₂. На следующий день 3 мкг mFL_TNFa ДНК (Origene: MC208048), которая кодирует немеченый мышиный TNF, и 3 мкл реагента PLUS (Invitrogen: 10964-021) разбавляли в 244 мкл Opti-MEM (Gibco: 31985-070) и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации разбавленный раствор ДНК предварительно инкубировали с 1:1 раствором липофектамина LTX (Invitrogen: 94756) (13,2 мкл+256,8 мкл Opti-MEM) и инкубировали при комнатной температуре в течение 25 минут с образованием комплексов ДНК-липофектамин LTX. После инкубации 500 мкл комплексов ДНК-липофектамин добавляли непосредственно в содержащую клетки лунку. Исходные клетки K562 pGL4,36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4,75[hRLuc/CMV] трансфицировали в течение 24 часов при 37°, 5% CО₂. После инкубации клетки промывали посредством 3 мл PBS и отбирали с помощью полной питательной среды, содержащей 125 мкг/мл гигромицина B (Invitrogen: 10687-010) и 250 мкг/мл G418 (Gibco: 10131-027) в течение двух недель. Получали клетки ''K562 мышиный FL-TNFa GRE (pGL4,36[luc2P/MMTV/Hygro])''.

Для создания клеточной линии ''человеческий трансмембранный TNF-альфа GRE репортер'' исходные клетки K562 pGL4,36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4,75[hRLuc/CMV] трансфицировали плазмидной конструкцией hTNF delta 1-12 C-Myc pcDNA3,1(-). Эта плазмида представляет собой pcDNA 3.1 (Thermofisher, № по кат. V79020), кодирующую устойчивый к TACE трансмембранный TNF (т. е. SEQ ID NO:1 без аминокислот 77-88). (См. Perez C et al. Cell 63 (2): 251-8 (1990), где обсуждается устойчивый к TACE трансмембранный TNF.) Затем эти клеточные линии использовали в анализах по репортеру TNF-альфа, описываемых в следующих примерах

Пример 79. Активность иммуноконъюгатов к TNF-альфа в анализах в отношении трансмембранного TNF-альфа с использованием репортера GRE

Исходные клетки K562 GRE (pGL4,36[luc2P/MMTV/Hygro]) и клетки K562 mFL-TNF-a или hTNF delta 1-12 GRE (pGL4,36[luc2P/MMTV/Hygro]) высевали в 96-луночные белые планшеты для обработки культуры тканей (Costar: 3917) при 50000 клеток на лунку в 50 мкл аналитической среды (RPMI, 1% CSFBS, 1% L-глутамин, 1% Na пируват и 1% MEAA). Клетки обрабатывали посредством 25 мкл 3x последовательно разбавленных конъюгатов лекарственного средства с антителом к мышиному или человеческому TNF-a в аналитической среде, стероидном соединении или среде отдельно и инкубировали в течение 48 часов при 37°, 5% CO₂. После 48-часовой инкубации клетки обрабатывали с помощью 75 мкл Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega-E2920) в течение 10 минут и анализировали в отношении люминесценции с использованием TopCount (PerkinElmer). Данные анализировали с использованием построения четырехпараметрической кривой для получения значений EC50. % максимальной активации нормализовали до 100 мM дексаметазона, который считали максимальной активацией. Результаты использования клеточной линии мышиного TNF-альфа показаны в таблице 12 ниже, а результаты использования клеточной линии человеческого TNF-альфа показаны в таблице 13 ниже. В таблице 12 ниже A относится к 8C11. В таблице 13 ниже A относится к адалимумабу (SEQ ID NO: 66 и 73). Процент (%) мономера определяли с помощью SEC, как описывалось ранее (см. аналитические процедуры для ADC).

Таблица 12. In vitro активность конъюгатов лекарственного средства с антителом к мышиному TNFa в анализе по репортеру в мышином трансмембранном TNFa GRE (A относится к антителу к мышиному TNFa 8C11)

Соед. №	Структура	n	% мономера	EC50 mTNFa GRE (мкг/мл)	mTNFa GRE (% max)	EC₅₀ K562 GRE (мкг/мл)	K562 GRE (% max)
134		4,5	91,4	0,00519	118	1,61	74
135		4,4	95,4	1,27	106	36,3	68
136		2	99,9	0,0108	95	9,3	46
137		4	99,9	0,0105	114	5,27	93
138		2	98,02	0,0297	108	28,7	53
139		4	96,6	0,0239	92	15,2	61
140		2	98,8	0,179	112	50	23
141		4	98	0,144	96	>50	43
142		2	99,1	0,0515	96	>50	57
143		2	97,7	0,0795	82	>50	24
144		4	94,25	0,0406	116	14,7	74
145		4	98	0,0393	95	24,7	36
146		2	98,5	0,0399	118	27,5	73
147		4	97,6	0,0259	113	7,89	80
148		2	97,8	0,0384	120	23,6	77
149		4	91,8	0,0314	113	10,7	78
150		2	98	0,02092	102	10,99	84
151		4	90,1	0,0098	104	2,85	87
152		2	98,3	0,0247	96	3,44	70
153		4	93,8	0,0185	75	2,77	94
154		2	96,6	2,00E-04	104	12,1	91
155		4	96	0,0171	94	2,8	79
156		2	98,2	0,039	107	15,8	73
157		4	92,5	0,0198	115	3,63	83
158		2	99,4	>50	0,05	>50	0,2
159		4	98,4	>50	0,075	>50	0,7
160		2	98,2	0,0242	91	>50	63
161		4	95,8	0,0203	94	16,9	77
162		4	95	0,0072	119	12,4	88
163		2	97,7	>50	6	>50	0,4
164		4	97,8	>50	24	>50	0,8
165		2	96,3	0,0179	93,6	>50	94
166		2	98	0,0136	107	14,6	75
167		4	94,4	0,0108	97	11,4	73
168		2	97,9	0,146	81	50	71
169		4	92,25	0,0551	117	18,4	88
170		2	99,5	0,463	18,4	>50	0,5
171		4	97,6	0,276	35	>50	5
172		4	94,6	0,0319	89	2,9	64
173		1,3	98	0,0959	78	>50	35
174		2	98	0,0607	143	4,23	14
175		4	93,4	0,0464	92	>50	55
176		4	97,4	0,0262	113	41,4	60
177		4	95,6	0,00998	105	7,94	66
178		4	88,3	8,00E-04	93	3,88	48
179		2	97,7	0,0249	89	11,7	84
180		4	96,8	0,0118	84	2,75	78
181		4	95,3	0,0593	83,8	50	35
182		4	97,6	>50	8	>50	4
183		4	94,7	0,0144	87	12	49
184		2	98,9	0,0525	75	46,7	36
185		4	96,6	0,0294	64	5,02	76
186		4	97,5	0,0479	143	>50	31
187		4	91,8	0,0185	103	>50	73
188		4	94	0,0107	126	>50	43
189		4	99,9	0,0215	149	>50	59
190		4	99,9	0,0112	109	>50	90
191		3,7	88,6	0,0692	122	14,4	90
192		4,1	74,4	0,0225	98	1,23	99
193		3,9	68	0,149	124	6,4	104
194		3,9	67,7	0,0517	95,3	5,01	85
195		3,5	92,2	0,123	156	23,6	75
196		3,5	92,9	0,0331	96	24,2	63
197		3,6	94,1	0,0626	143	39,3	60
198		3,6	93	0,0614	96	12,7	91
199		3,5	93	0,0654	93	23,3	73
200		3,8	90,1	0,0114	114	4,76	92
207		4
208		4	99,3	0,0154	123	50,0	98,7
209		3,84	99,5	0,16	116	50,0	70,0
210		4	100	0,154	129	50,0	61,7
211		4	99,4	0,0341	130	18,7	91,7
212		3,99	99,2	0,00633	101	1,9	348
213		4,08	99,2	0,0267	140	27,6	146
214		3,8	99,2	0,362	248	50,0	97,1
215		3,8	99,3	0,0166	126	1,93	103
216		3,74	99,4	0,351	108	50,0	27,9
217		3,7	98,8	0,0147	101	18,3	97,2
218		3,7	98,9	0,023	96,0	22,9	102
219		4,03	99,1	0,0371	140	50,0	91,2
220		1,7	99,5	0,00329	97,7	9,96	112
221		3,6	99	0,011	131	4,28	112
222		3,8	99	0,114	102	43,4	86,6

Таблица 13. In vitro активность конъюгатов лекарственного средства с антителом к человеческому TNFa в анализе по репортеру в человеческом трансмембранном TNFa GRE (A относится к антителу к человеческому TNFa - адалимумабу (SEQ ID NO: 66 и 73)

Соед. №	Структура	n	% мономера	EC₅₀ hTNFa GRE (мкг/мл)	hTNFa GRE (% max)	EC₅₀ K562 GRE (мкг/мл)	K562 GRE (% max)
201		4	97,6	0,0179	100	43	66
202		2	99,1	0,0318	121	>50	51
203		4	98,2	0,0482	118	>50	35
204		2	99,4	0,0767	103	>50	21
205		4	96,9	0,0035	97	17,5	103
206		2	99,4	0,0082	101	>50	97

Пример 80. Активность различных иммуноконъюгатов к человеческому TNF-альфа в анализах в отношении трансмембранного TNF-альфа с использованием репортера GRE

Получение иммуноконъюгатов к человеческому TNF-альфа

Все белки были конъюгированы с соед. № 99 с использованием условий, указанных в соответствии с общим протоколом цистеиновой конъюгации в примере 36. Если указано в таблице 14 ниже, добавление цистеина (подчеркнуто) осуществляли в последовательности антитела к TNF для обеспечения конъюгации.

Таблица 14. Аминокислотные последовательности антител к человеческому TNF-альфа, используемые в иммуноконъюгатах

Антитело	Последовательность (SEQ ID NO)
Инфликсимаб HC	SEQ ID NO:67
Инфликсимаб LC	SEQ ID NO:74
Голимумаб HC	SEQ ID NO:72
Голимумаб LC	SEQ ID NO:78
Этанерцепт	LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:79)
HC ABT-122	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGSFGGYGIGWVRQAPGQGLEWMGGITPFFGFADYAQKFQGRVTITADESTTTAYMELSGLTSDDTAVYYCARDPNEFWNGYYSTHDFDSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:80)
LC ABT-122	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRGGSGGGGSGEIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQDIGSELHWYQQKPDQPPKLLIKYASHSTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINGLEAEDAGTYYCHQTDSLPYTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:81)
Цертолизумаб пегол HC	SEQ ID NO:68
Цертолизумаб пегол LC	SEQ ID NO:75
Цертолизумаб пегол HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYVFTDYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYIGEPIYADSVKGRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYRSYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCAAHHHHHH (SEQ ID NO:82)
Цертолизумаб пегол LC	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASFLYSGVPYRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:83)
Адалимумаб Fab HC	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCAAHHHHHH (SEQ ID NO:84)
Адалимумаб Fab LC	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:85)
Аффитело¹	GVDNKFNKENIAAMTEITRLPNLNPYQRAAFIWSLSDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKC (SEQ ID NO:86)
Озорализумаб, нанотело	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGSEQKLISEEDLCHHHHHH (SEQ ID NO:87)

¹ Kronqvist J et al. Protein Engineering, Design & Selection 21 (4):247-255 (2008)

Активность иммуноконъюгатов к человеческому TNF-альфа в анализе по репортеру GRE

Иммуноконъюгаты антител к человеческому TNF-альфа (также называемые ADC к человеческому TNF-альфа или стероидные ADC к hTNF-альфа) тестировали в отношении активности исходной клеточной линии K562 GRE (pGL4,36[luc2P/MMTV/hydgro]) и клеточной линии K562 hTNF delta 1-12 GRE (pGL4,36[luc2P/MMTV/hydgro]) в условиях, описываемых в примере 79. Результаты, представленные в таблице 15, указывают на то, что все тестируемые стероидные ADC к hTNF-альфа демонстрируют мощную антиген-зависимую активность, отличающуюся от их активности в исходной клеточной линии.

Таблица 15. In vitro активность ADC к человеческому TNF-альфа в анализе по репортеру в человеческом трансмембранном TNFa GRE (концентрации ADC нормализовали для MW и DAR)


Соед. №	A¹	SEQ ID	n	% мономера	EC50 hTNFa GRE (нМ)	hTNFa GRE (% max)	EC50 K562 GRE (нM)	K562 GRE (% max)
233	Инфликсимаб	67/74	3,3	99,99	1,3	122	374	55,3
234	Голимумаб	72/78	4,9	99	3,3	144	1633	67,5
235	Этанерцепт	79	2,3	87,6	0,6	105,5	164	104
236	ABT-122	80/81	4,1	99,98	1,02	116,9	608	61,3
237	Цертолизумаб пегол	68/75	2	95,9	0,44	97	1111	39
238	Цертолизумаб пегол	82/83	1	ND	0,4	95	266	60
239	Адалимумаб Fab	84/85	1	ND	1	118	190	137
240	Аффитело	86	1	100	9,1	98	26	84
241	Озорализумаб (нанотело)	87	1	98	0,5	131	875	99

Связывание иммуноконъюгатов к человеческому TNF-альфа с человеческим TNF-альфа

Кинетические показатели связывания стероидных ADC к h TNF-альфа с тримером рекомбинантного растворимого TNFα определяли по измерениям поверхностного плазмонного резонанса, выполненным на устройстве Biacore T200 (GE Healthcare) при 25°C с использованием либо захвата антитела к человеческому Fc/антитела к человеческому F(ab')₂ (использовали для всех ADC, за исключением ADC с аффителом и озорализумабом), либо подхода прямого опосредованного NHS/EDC сочетания с амином (использовали только для ADC с озорализумабом). Приблизительно 10000 RU поликлонального антитела козы к человеческому Fc IgG (Thermo Fisher Scientific Inc., № по кат. 31125) или поликлонального антитела козы к человеческому F(ab')₂ (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., № по кат. 109-006-006) разбавляли до 5 мкг/мл в 10 мM ацетата натрия (pH 4,5) и иммобилизировали на биосенсорном чипе CM5 с использованием стандартного набора для сочетания с амином согласно инструкциям и процедурам производителя. Непрореагировавшие фрагменты на поверхности биосенсора блокировали посредством 1 M этаноламина. Для подхода прямого сочетания с амином приблизительно 750 RU стероидного конъюгата с озорализумабом непосредственно иммобилизировали на чипе CM5. Приготовление чипа и измерения кинетических показателей связывания выполняли в аналитическом буфере HBS-EP+ (10 мM Hepes, pH 7,4, 150 мM NaCl, 3 мM EDTA, 0,05% Tween 20). Для измерений кинетических показателей связывания в формате захвата каждый цикл анализа состоял из следующих стадий: 1) захват тестируемого ADC на тестируемой поверхности при концентрации 0,5 мкг/мл и при скорости потока 5 мкл/мин. в течение 60 с; 2) введение аналита (человеческого TNFα или только буфера) как на эталонную, так и на и тестируемую поверхность в течение 300 с при 50 мкл/мин., после чего контролировали диссоциацию в течение 600 секунд при 50 мкл/мин.; 3) восстановление поверхности захвата с помощью введений 10 мM глицин-HCl, pH 1,5, или 100 мM HCl (для непосредственно соединенного ADC) как на эталонную, так и на тестируемую поверхность. Для измерений кинетических показателей связывания в формате прямого сочетания с амином выполняли только стадию 2) и стадию 3). В ходе анализа все измерения сверяли с пустой поверхностью отдельно (т. e. без захваченного тестируемого антитела или иммобилизированного нанотела) и использовали введение буфера отдельно для двойного сравнения с эталоном. Введения TNFα варьировали по концентрации от 50 нМ до 0,39 нМ при сериях 2-кратных разбавлений, соответственно. Данные обрабатывали и глобально подгоняли к модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения Biacore T200 Evaluation для определения кинетических констант скорости связывания k_a (M^-1с^-1) и k_d (с^-1) и равновесной константы диссоциации K_D (M). Проводили два независимых эксперимента. Представленные данные в таблице 16 представляют собой средние значения из этих экспериментов.

Таблица 16. Значения аффинности связывания стероидных ADC к hTNF-альфа с человеческим TNF-альфа (ND=не определяли)

Соед. №	ADC к TNF	k _a (1/Mс)	k _d (1/с)	K _D (M)
233	Инфликсимаб	9,90E+05	3,10E-04	3,10E-10
234	Голимумаб	9,70E+05	2,40E-04	2,50E-10
235	Этанерцепт	6,30E+06	9,80E-05	1,60E-11
236	ABT-122	4,00E+05	6,90E-05	1,80E-10
237	Цертолизумаб пегол	2,30E+06	1,70E-04	7,30E-11
238	Цертолизумаб пегол	2,70E+06	1,60E-04	6,00E-11
239	Адалимумаб Fab	1,50E+06	1,80E-04	1,30E-10
240	Аффитело	ND	ND	ND
241	Озорализумаб (нанотело)	1,30E+06	7,00E-05	5,20E-11

Пример 81. Активность стероидных ADC к hTNF-альфа в анализе стимулируемого липополисахаридом высвобождения цитокина в человеческих PBMC

Первичные человеческие одноядерные клетки периферической крови (PBMC) приобретали у Biological Specialty Corporation (№ по кат. 214-00-10), промывали в 50 мл PBS, повторно суспендировали в FBS с 5% DMSO, разделяли на аликвоты и криоконсервировали в жидком азоте до применения. PBMC размораживали, повторно суспендировали в RPMI, дополненной 2% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином, и высевали в планшет для клеточных анализов (Costar, № 3799). Клетки инкубировали с варьирующей концентрацией стероидных ADC к hTNF-альфа при 37°C и 5% CO₂ в течение 4 часов. Затем клетки стимулировали посредством 100 нг/мл LPS в течение ночи. На следующий день планшет центрифугировали в течение пяти минут при 1000 об./мин. и 100 мкл надосадочной жидкости среды непосредственно переносили в дополнительный 96-луночный планшет и анализировали в отношении концентрации IL-6 (MSD, № K151AKB) и IL-1 бета (MSD, № K151AGB). Данные ответа на дозу наносили на сигмоидальную кривую с использованием нелинейной регрессии и рассчитывали значения IC50 с помощью GraphPad 5.0 (GraphPad Software, Inc.). Результаты, представленные в таблице 17, показывают, что стероидные ADC к hTNF-альфа обладают мощной активностью в подавлении высвобождения провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-1-бета из активированных первичных иммунных клеток.

Таблица 17. In vitro активность ADC к человеческому TNF-альфа в анализе стимулируемого LPS высвобождения цитокина в человеческих PBMC (n=2)

Соед. №	IC50 высвобождения цитокина (нг/мл)
IL-6	IL-1-бета
203	14,3 ± 3,5	3,6 ± 1,2
201	86,8 ± 69,6	25,5 ± 21,3
205	42,4 ± 27,9	22 ± 18

Пример 82. Активность иммуноконъюгата к TNF-альфа в анализе TNFa-индуцированной цитотоксичности в клетках L929

L929 представляет собой линию мышиных анеуплоидных клеток фибросаркомы, которые сенсибилизировали предварительной обработкой актиномицином D. Обработка с помощью TNFa инициирует апоптоз и последующую гибель клеток. Клетки L929 в фазе логарифмического роста собирали с использованием трипсина 0,05%, дважды промывали с помощью D-PBS и подсчитывали на CEDEX. Клетки повторно суспендировали при 1E6 клеток/мл в аналитической среде, содержащей 4 мкг/мл актиномицина D и добавляли по 50 мкл во все лунки. Стероидный ADC к мышиному TNF-альфа (антитело к мышиному TNF-альфа 8C11, конъюгированное с соед. 71; также называемое стероидным ADC к mTNF-альфа) и mAb к мышиному TNF (8C11) разбавляли до 4× концентрации в аналитической среде и осуществляли последовательные разбавления 1:3. Мышиный TNFα разбавляли до 4x концентрации 600 пг/мл. Стероидный ADC к mTNF и mAb к mTNF (125 мкл) добавляли в mTNFα (125 мкл) по схеме разбавлений 1:2 и обеспечивали инкубацию в течение 1 часа при комнатной температуре с осторожным встряхиванием. Смесь антитело/mTNFα (или ADC/mTNFα) добавляли в лунки при 50 мкл/лунка в трех повторностях. Планшеты инкубировали в течение 20 часов при 37°C, 5% CO₂. Для количественного определения жизнеспособности 10 мкл реагента WST-1 (Roche, № по кат. 11644807001) добавляли в лунки. Планшеты инкубировали в условиях анализа в течение 3,5 часа, центрифугировали при 500 ×g и 75 мкл надосадочной жидкости переносили в планшет для ELISA (Costar, № по кат. 3369). Планшеты считывали при OD 420-600 нм с использованием планшет-ридера ELISA Spectromax 190. Данные анализировали и рассчитывали значения IC₅₀ с использованием критерия сигмоидальной зависимости ответа от дозы (изменяемый наклон) по GraphPad Prism 5.

Стероидный ADC к mTNF-альфа обладал сопоставимой нейтрализирующей эффективностью (IC₅₀ 1,9 нM) с неконъюгированным mAb к mTNF-альфа (IC₅₀ 1,5 нM).

Иммуноконъюгаты к человеческому TNF-альфа тестировали в отношении нейтрализирующей активности в условиях, описываемых выше. Результаты показаны в таблице 18 и указывают на то, что тестируемые иммуноконъюгаты к человеческому TNF-альфа демонстрируют эффективную нейтрализацию человеческого TNF-альфа.

Таблица 18. Эффективности нейтрализации стероидных ADC к hTNF-альфа индуцированной человеческим TNF-альфа цитотоксичности в отношении клеток L929 (ND=не определяли)

Соединение	Антитело к TNF	SEQ ID	ADC DAR	% мономера	IC50 (нМ)
233	Инфликсимаб	67/74	3,3	99,99	ND
234	Голимумаб	72/78	4,9	99	0,050
235	Этанерцепт	79	2,3	87,6	0,002
236	ABT-122	80/81	4,1	99,98	0,074
237	Цертолизумаб пегол	68/75	2	95,9	0,046
238	Цертолизумаб пегол	82/83	1	ND	0,085
239	Адалимумаб Fab	84/85	1	ND	0,6
240	Аффитело	86	1	100	ND
241	Озорализумаб (нанотело)	87	1	98	0,018

Пример 83. Связывание стероидного ADC к mTNF-альфа с мышиными рецепторами Fc-гамма

Основанное на SPR (поверхностном плазмонном резонансе) устройство Biacore T200 (GE Healthcare) использовали для оценки связывания стероидного ADC к mTNF-альфа (8C11 к mTNF, конъюгированного с соед. 71) и mAb к mTNF-альфа с рекомбинантными мышиными FcgR (все от R&D Systems). FcgR непосредственно иммобилизировали на поверхности проточных кювет двух, трех и/или четырех из чипов Biacore CM5 типа S для достижения плотностей ~1000-2000 RU (резонансных единиц). Пустую модифицированную поверхность проточной кюветы, по одной из каждого чипа Biacore, использовали как эталонную поверхность. Каждый эксперимент состоял из фаз ассоциации и диссоциации. Фаза ассоциации заключалась в титровании исходного mAb и ADC во всех проточных кюветах при скорости потока 50 мкл/мин. и концентрациях 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 и 0 нМ для FcgRIIB и FcgRIII, а также 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56 и 0 нМ для рецепторов I и IV. Фаза диссоциации заключалась в непрерывном потоке подвижного буфера (HBS-EP+, pH 7,4, GE Healthcare) при скорости потока 50 мкл/мин. Каждую из фаз ассоциации и диссоциации контролировали в течение 5 мин. (рецепторы I и IV) или 1 мин. (рецепторы II и III). Поверхности чипа восстанавливали посредством 5-с импульса 100 мM HCl при скорости потока 100 мкл/мин. после каждого цикла связывания. Использовали программное обеспечение Biacore Evaluation для подгонки необработанных данных к моделям связывания 1:1 (FcgRI и IV) или Steady State (рецепторы IIB и III). Результаты представлены в таблице 19. k_a представляет собой константу скорости ассоциации (1/Mс); k_d представляет собой константу скорости диссоциации (1/с); K_D представляет собой равновесную константу диссоциации (M).

Таблица 19. Значения аффинности связывания иммуноконъюгата к TNF-альфа с мышиными рецепторами Fc-гамма

	muFcgRI	muFcgRIIb	muFcgRIII	muFcgRIV
k_a (1/Mс)	k_d (1/с)	K_D (M)	K_D (M)	K_D (M)	k_a (1/Mс)	k_d (1/с)	K_D (M)
mAb к mTNF	7,4E+05	1,6E-02	2,1E-08	3,7E-06	3,1E-06	1,2E+ 05	5,3E-03	4,6E-08
ADC к mTNF	3,2E+05	8,7E-03	2,8E-08	5,9E-06	3,3E-06	8,4E+ 04	4,6E-03	5,5E-08

Пример 84. Активность стероидных ADC к mTNF-альфа на модели контактной гиперчувствительности

Стероидные ADC к mTNF-альфа оценивали на модели острой контактной гиперчувствительности, при этом вызывали острое воспаление кожи с использованием ответа гиперчувствительности замедленного типа (DTH) (с помощью T-клеток) путем нанесения сенсибилизирующего средства (флуоресцеин изотиоцианата (FITC)). Эффективность стероидных ADC к mTNF-альфа измеряли с помощью способности уменьшать отек уха. Стероидные биомаркеры кортикостерон и N-терминальный пропептид проколлагена 1 типа (P1NP) включали как считывания для оценки предполагаемого воздействия обработки стероидным ADC к mTNF-альфа на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую (HPA) ось и ремоделирование кости, соответственно.

Отек уха

В день 0 мышей подвергали общей анестезии и им брили животы. С использованием пипеточного микродозатора мышей сенсибилизировали путем накожного нанесения 400 мкл раствора FITC (1,5% раствор в 1:1 ацетон:DBP) на живот. Через 6 дней мышам вводили дозу среды-носителя или терапевтического средства за 1 час до ушной провокационной пробы с FITC. Для ушной провокационной пробы мышей подвергали общей анестезии и проводили провокационную пробу с 20 мкл FITC, наносимыми на правое ухо. Через 24 часа после провокационной пробы мышей подвергали общей анестезии и толщину их ушей измеряли с помощью кронциркуля. Рассчитывали разницу между ушами с провокационной пробой и без провокационной пробы. Через 72 часа после ушной провокационной пробы мышам вводили инъекцией ACTH при 1 мг/кг веса тела IP и окончательно спускали кровь через 30 мин. после ACTH. Плазму крови собирали и анализировали P1NP, кортикостерон, свободный стероид и уровни крупных молекул.

Количественная оценка высвобожденного свободного стероида и эндогенного кортикостерона

Получали калибровочную кривую для стероида в плазме крови мыши с конечными концентрациями от 0,03 нМ до 0,1 мкM при 8 различных уровнях концентрации. Получали калибровочную кривую для кортикостерона по варьирующим от 0,3 нМ до 1 мкM концентрациям конечного кортикостерона в 70 мг/мл растворе альбумина в сыворотке крови крупного рогатого скота в PBS буфере. Добавляли раствор 160 мкл MeCN с 0,1% муравьиной кислоты в 40 мкл исследуемых образцов плазмы крови или калибровочных стандартов. Надосадочные жидкости разбавляли дистиллированной водой и 30 мкл раствора конечного образца вводили в LC/MS анализе.

Количественную оценку высвобожденного свободного стероида и кортикостерона проводили на тройном квадрупольном масс-спектрометре AB Sciex 5500, соединенном с системой Shimadzu AC20 HPLC, сопряженной с источником ионизации электрораспылением, работающим в положительном режиме. Колонку Waters XBridge BEH C18, 2,1×30 мм, 3,5 мкм использовали для хроматографического разделения. Подвижная фаза A представляла собой 0,1% муравьиную кислоту в воде Milli Q HPLC, а подвижная фаза B представляла собой 0,1% муравьиную кислоту в MeCN. Линейный градиент от 2% подвижной фазы B до 98% подвижной фазы B применяли от 0,6 до 1,2 минуты. Общее время хроматографирования составляло 2,6 мин. при скорости потока 0,8 мл/мин. Масс-спектрометр работал в положительном MRM режиме при температуре источника 700°C.

Количественная оценка P1NP в плазме крови

Количественную оценку P1NP в плазме крови проводили на платформе LC/MS на основании расщепления белка трипсином. Образцы плазмы крови частично осаждали и полностью восстанавливали путем добавления смеси MeCN/0,1 M бикарбонат аммония/DTT. Надосадочную жидкость собирали и алкилировали путем добавления йодуксусной кислоты. Алкилированные белки расщепляли трипсином и полученные в результате триптические пептиды анализировали с помощью LC/MS. Создавали калибровочную кривую с использованием синтетического триптического пептида, добавленного в сыворотку крови лошади (неинтерферирующую суррогатную матрицу). Стабильный изотопный меченый фланкирующий пептид (удлинение из 3-6 аминокислот на обоих концах триптического пептида) использовали в качестве внутреннего стандарта, добавляемого в смесь для осаждения белка MeCN/DTT для нормализации как эффективности расщепления, так и введения LC/MS.

Колонку Columnex Chromenta BB-C18, 2,1×150 мм, 5 мкм использовали для хроматографического разделения. Подвижная фаза A представляла собой 0,1% муравьиную кислоту в воде Milli Q HPLC, а подвижная фаза B представляла собой 0,1% муравьиную кислоту в MeCN. Линейный градиент от 2% подвижной фазы B до 65% подвижной фазы B применяли от 0,6 до 3 мин. Общее время хроматографирования составляло 8 мин. при скорости потока 0,45 мл/мин. Использовали масс-спектрометр AB Sciex 4000Qtrap в положительном MRM режиме для количественного определения пептидов P1NP при температуре источника 700°C.

Количественная оценка общего ADC в плазме крови

Концентрации общего антитела (ADC и остова mAb) измеряли с помощью анализа связывания с лигандом с использованием платформы Mesoscale Discovery (MSD). Меченный биотином мышиный TNF использовали как реагент захвата для стероидных ADC к mTNF-альфа, а конъюгированное с Sulfo-TAG детекторное антитело козы к мышиному антигену использовали для выявления. Калибровочную кривую создавали с помощью последовательного разбавления молекулы ADC в матрице совместимости и QC образцы использовали для оценки анализа.

Результаты

Результаты показаны в таблице 20 ниже.

Таблица 20. Сравнение активности стероидного ADC к mTNF-альфа в отношении отека уха и стероидных биомаркеров на модели CHS воспаления

ADC	Отек уха (% подавления при 10 мг/кг веса тела)	SEM	P1NP (% подавления при 10 мг/кг веса тела)	SEM	Кортикостерон (% подавления при 10 мг/кг веса тела)	SEM
Соед. № 151	87,8	3,5	32,3	3,9	71,5	5,6
Соед. № 145	87,8	3,4	19,2	6,3	15,1	9,9
Соед. № 169	90,2	2,2	38,3	2,8	60,1	4,7
Соед. № 167	86,1	2,4	26,1	6,9	48,3	5,1
Соед. № 162	76,3	2,7	25,9	6,5	50,4	5,5
Соед. № 161	64,4	4,6	1,4	7,2	37,1	4,1
Соед. № 172	79,8	3,9	14,6	4,9	6,3	6,8
Соед. № 176	81,4	3,9	20,0	7,9	15,0	9,4
Соед. № 177	94,3	1,2	27,0	6,0	17,1	9,0
Соед. № 180	80,8	2,1	45,7	6,0	39,9	3,8
Соед. № 149	92,4	2,3	52,8	2,8	74,4	3,7
Соед. № 175	66,5	4,7	12,1	4,5	49,3	3,5
Соед. № 207	87,3	3,6	44,0	5,4	54,6	5,2
Соед. № 178	94,4	1,8	58,0	2,4	73,8	4,7
Соед. № 181	78,8	4,6	-13,2	7,2	29,4	8,0
Соед. № 182	60,1	5,6	-15,1	11,5	3,4	4,8
Соед. № 185	85,0	4,0	51,6	7,0	43,9	9,6
Соед. № 186	70,5	3,9	1,5	9,4	19,1	3,9

Эти результаты демонстрируют, что стероидные ADC к mTNF-альфа могут обеспечивать эффективный ответ, эквивалентный обработке низкомолекулярным стероидом с избавлением от нежелательных эффектов в отношении кортикостерона и P1NP.

Проводили дополнительное исследование контактной гиперчувствительности (CHS) для определения того, необходима ли конъюгация стероидной нагрузки с mAb к TNF для повышения эффективности Мышам один раз вводили дозу i.p. согласно протоколу, описываемому выше, либо со средой-носителем, mAb к mTNF-альфа (10 мг/кг веса тела), стероидным ADC к mTNF-альфа (10 мг/кг веса тела) (соед. № 139), либо со смесью mAb к mTNF-альфа, вводимой дозой совместно (конкурентно доставляемой в одной инъекции i.p.) с эквивалентным количеством низкомолекулярного стероида в соответствии со стехиометрией ADC. Для дозы 10 мг/кг веса тела стероидного ADC к mTNF-альфа с DAR 4 это рассчитывали как 4 мкг низкомолекулярного стероида (соед. № 42). Результаты, показанные на фигуре 9, демонстрируют, что обработка стероидным ADC к mTNF-альфа обладает существенно повышенной эффективностью в отношении снижения воспаления уха по сравнению с комбинацией mAb к mTNF-альфа и низкомолекулярным стероидом или с mAb к mTNF-альфа отдельно.

Пример 85. Активность стероидных ADC к mTNF-альфа при индуцированном коллагеном артрите

Способность стероидного ADC к mTNF-альфа (соед. № 137) облегчать заболевание оценивали на модели индуцированного коллагеном артрита (CIA).

В данных экспериментах самцов мышей DBA/1J получали из Jackson Labs (Bar Harbor, ME). Использовали мышей возрастом 6-12 недель. Всех животных содержали при постоянной температуре и влажности при 12-часовом цикле свет/темнота и кормили Rodent Chow (Lab Diet 5010 PharmaServ, Фремингхем, Массачусетс) и давали воду ad libitum. AbbVie имеет аккредитацию AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care), все процедуры были одобрены Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) и контролировались обслуживающим ветеринаром. Контролировали вес тела и состояние и животных умерщвляли, если наблюдалась потеря веса >20%.

Самцов мышей DBA/J иммунизировали внутрикожно (i.d.) в основание хвоста посредством 100 мкл эмульсии, содержащей 100 мкг бычьего коллагена II типа (MD Biosciences), растворенного в 0,1 н. уксусной кислоте, и 200 мкг инактивированной нагреванием Mycobacterium tuberculosis H37Ra (полный адъювант Фрейнда, Difco, Лоренс, Канзас). Через двадцать один день после иммунизации коллагеном мышей стимулировали IP посредством 1 мг зимозана A (Sigma, Сент-Луис, Миссури) в PBS. После стимулирования мышей обследовали 3-5 раз в неделю в отношении артрита. Ягодичные части задних лап оценивали в отношении отека лапы с использованием пружинных кронциркулей Dyer (Dyer 310-115)

Мышей регистрировали от дня 24 до дня 28 по первым клиническим признакам заболевания и распределяли на группы с артритом эквивалентной тяжести. Раннюю терапевтическую обработку начинали на момент регистрации.

Животным вводили одну дозу перорально (p. o.) со стероидом (соед. № 3) (10 мг/кг веса тела) в среде-носителе 0,5% HPMC/0,02% Tween 80 [об./] или интраперитонеально (i.p.) с mAb к mTNF-альфа (10 мг/кг веса тела) (8C11) или стероидным ADC к mTNF-альфа (10 мг/кг веса тела) (соед. № 137) в 0,9% солевом растворе. Кровь собирали для воздействия на антитела путем разрезания хвоста через 24 и 72 часа после введения дозы. Лапы собирали в конечный момент времени для гистопатологии. Кровь собирали в конечный момент времени путем пункции сердца для общего анализа крови (Sysmex XT-2000iV). Статистическую значимость определяли с помощью ANOVA.

Результаты показаны на фигуре 3 и демонстрируют, что однократная доза стероидного ADC к mTNF-альфа может проявлять длительную продолжительность действия путем облегчения отека лапы в течение ~6 недель по сравнению с mAb к mTNF-альфа или низкомолекулярным стероидом отдельно.

В отдельном исследовании, предназначенном для изучения нацеленной на TNF функциональной группы стероидного ADC к mTNF-альфа, животным вводили одну дозу i.p. с mAb к mTNF-альфа (10 мг/кг веса тела) или стероидным ADC к mTNF-альфа (10 мг/кг веса тела) (соед. № 145) или с изотипом стероидного ADC (10 мг/кг веса тела) (соед. № 224),

который распознает овальбумин яичного белка курицы, антиген, не экспрессируемый у мышей. Оба ADC имели эквивалентную нагрузку лекарственного средства. Низкомолекулярный стероид (3 мг/кг веса тела) вводил дозой перорально один раз в сутки (q.d). Результаты показаны на фигуре 10 и демонстрируют, что однократная доза стероидного ADC к mTNF-альфа обладает эффективностью, эквивалентной таковой низкомолекулярного стероида, вводимого дозой ежесуточно в течение периода 21 сутки. Однократная доза нецелевого изотипа стероида ADC обладает только лишь частичной эффективностью, подобно mAb к mTNF отдельно, в той же временной рамке. Процентные соотношения означают % подавления по сравнению со средой-носителем. Оценка веса тела животных на протяжении всего этого исследования (фигура 11) показала потерю веса во всех группах с обработкой, за исключением группы с обработкой стероидным ADC к mTNF-альфа. Напротив, мыши, обработанные стероидным ADC к mTNF-альфа, демонстрировали нормальное увеличение веса в течение 21-суточного исследования.

Пример 86. Активность различных стероидных ADC к mTNF-альфа при индуцированном коллагеном артрите

Несколько стероидных ADC к mTNF-альфа с различными стероидными нагрузками или отношениями лекарственное средство:антитело (DAR) тестировали в отношении эффективности на мышиной модели артрита. Исследования проводили согласно процедуре, описанной в примере 85. Результаты показаны в таблице 21 ниже.

Таблица 21. Эффективность стероидных ADC к mTNF-альфа на модели артрита

Соед. №	DAR (n)	% подавления отека лапы по сравнению со средой-носителем (AUC_0-21d) (при 10 мг/кг веса тела)	SEM
136	2	75	3,7
137	4	91	6,5
139	4	93	2,9
143	2	96	3,3
145	4	95	4
151	4	101	2,5
172	4	74	9,3
176	4	85	8,3
177	4	99	4,2

Пример 87. Активность иммуноконъюгатов к hTNF-альфа на модели индуцированного антителом к коллагену артрита у трансгенных мышей Tg1278TNF с нокаутом человеческого TNF

Эффективность ADC к человеческому TNF-альфа оценивали на модели артрита у мыши с трансгеном человеческого TNFa.

Модель индуцированного антителом к коллагену артрита (CAIA) (Moore, AR J Transl Med 12:285 (2014)) получали с использованием трансгенных мышей Tg1278TNF с нокаутом человеческого TNF, как описывалось ранее (Moore A et al. J Transl Med 12 (1): 285 (2014)). Восемь мг коктейля моноклональных антител, которые нацелены на различные эпитопы коллагена II типа (ArthritoMab™) вводили мышам интраперитонеально (i.p.) в день 0. В день 3 мышам вводили инъекцию i.p. 10 мкг LPS для стимулирования патологии заболевания. У животных оценивали артритный показатель ежедневно начиная с дня 3 по день 14 исследования. Использовали по восемь самцов мышей на группу и тестируемые изделия или среду-носитель PBS вводили i.p. дважды в неделю в течение двух недель.

Результаты показаны на фигуре 4 и демонстрируют, что ADC к человеческому TNF-альфа могут существенно снижать показатель заболевания по сравнению с mAb к человеческому TNF-альфа (адалимумабом).

Пример 88. Активность стероидных ADC к mTNF-альфа в отношении пикового воспаления

Эксперимент с CIA мыши проводили для установления эффективности стероидного ADC к mTNF-альфа на животных с пиковым воспалением. Для позднего введения терапевтической дозы мышей включали в исследование при первых клинических признаках заболевания и вводили дозу через 6 дней после включения. Группу животных умерщвляли в день 7 заболевания для обеспечения исходного уровня для артритных изменений с помощью компьютерной микротомографии (μCT) и гистологического анализа на момент введения дозы всем другим группам. Всем животным вводили дозу один раз в день 6 либо с носителем (0,9% солевой раствор), с mAb к mTNF-альфа (10 мг/кг веса тела) (8C11), либо со стероидным ADC к mTNF-альфа (10 мг/кг веса тела) (соед. № 145) и умерщвляли в день 21. Собирали задние лапы с артритом и осуществляли анализ μCT. Те же лапы затем использовали для гистологической оценки. В конце эксперимента собирали цельную кровь путем пункции сердца для выполнения общего анализа крови (CBC).

Компьютерная микротомография (μCT)

Ягодичные части задних лап оставляли интактными по большеберцовой кости/малоберцовой кости и фиксировали в 10% формалине. Лапы сканировали с помощью μCT (Scanco Medical AG, Micro-CT40) при 55 кВп при 145 мкA с установкой высокой разрешающей способности (1000 проекций/180° при 2048×2048 пиксельном преобразовании) с использованием Isotropic Voxel и времени интеграции 300 миллисекунд. Цилиндрический контур был вручную нарисован вокруг представляющей интерес области от большеберцово-таранного сустава и распространялся на таранную кость на 100 срезов (1,8 мм). Оценку выполняли с помощью программного обеспечения Scanco с использованием 0,8 сигма-гаусса с верхним порогом 1000 и нижним порогом 320.

Гистологическое оценивание

Ягодичные части задних лап от обработанных мышей фиксировали погружением в 10% нейтральный забуференный формалин и частично декальцифицировали в растворе Calrite в течение 48 часов для обеспечения подрезания латерального и внутреннего краев кости предплюсны. Затем лапы помещали обратно в Calrite на ~48 часов для полной декальцификации. Образцы рутинно обрабатывали, заливали парафином в сагиттальной плоскости, нарезали срезы по 5 микрон и окрашивали гематоксилином и эозином. Срезы оценивали с помощью микроскопии в отношении наличия воспаления/образования паннуса, инфильтрации нейтрофилов, эрозии кости и поражения хряща с использованием шкалы 0-4: 0=отсутствует, 1=слабое 2=умеренное, 3=заметное, 4=тяжелое.

Результаты, представленные на фигуре 12, демонстрируют что однократная доза стероидного ADC к mTNF-альфа может обращать установленное заболевание и снижать отек лапы почти до исходного уровня. Напротив, однократная доза mAb к mTNF-альфа обладали минимальным эффектом в отношении воспаления.

Эффект обработки в отношении потери кости предплюсны, измеряемой с помощью μCT, показан на фигуре 13. Результаты демонстрируют, что однократная доза стероидного ADC к mTNF-альфа, вводимого при пике воспаления, способна существенно подавлять опосредованную заболеванием эрозию кости сустава по сравнению с mAb к mTNF-альфа отдельно.

Результаты гистологического оценивания суставов обработанных CIA мышей показаны на фигурах 14-17. Они демонстрируют, что однократная доза стероидного ADC к mTNF-альфа, вводимого при пиковом заболевании, приводила в результате к существенному снижению воспаления, образования паннуса, эрозии кости и поражения хряща к дню 21 относительно совпадающих по возрасту обработанных контролем в виде среды-носителя (p<0,001), и уровни заболевания были эквиваленты уровням, наблюдаемым у контролей на исходном уровне (среда-носитель d6). В двух из шести оцениваемых лапах не выявляли заболевание в кости предплюсны/межфаланговых суставах обработанных стероидным ADC к mTNF-альфа животных в день 21 по сравнению с 100% заболеваемостью у мышей в день 6 - исходный уровень (до обработки) и день 21 у обработанных средой-носителем мышей.

Напротив, однократная доза mAb к mTNF-альфа при пиковом заболевании не подавляла воспаление, эрозию кости, образование паннуса или разрушение хряща относительно совпадающих по возрасту обработанных средой-носителем контролей в d21. Уровни заболевание были более тяжелыми, чем у контролей на исходном уровне, и наблюдалась слабая тенденция к облегчению воспаления.

Анализировали цельную кровь для оценки изменений в подгруппах клеток периферической крови при обработке. Результаты, показанные на фигуре 18-23, демонстрируют, что увеличение некоторых популяций клеток периферической крови, наблюдаемое у больных животных, может быть устранено однократной дозой стероидного ADC к mTNF-альфа. Статистически значимые восстановления общих белых клеток крови, нейтрофилов и моноцитов наблюдали при обработке стероидным ADC к mTNF-альфа.

Пример 89. Сравнение стероидных ADC к mTNF-альфа и ADC к CD163

Для демонстрации усиленной терапевтической эффективности иммуноконъюгата к TNF при лечении воспалительного заболевания сравнивали его активность с активностью ADC, нацеленного на гемоглобиновый скэвенджер-рецептор CD163, подходом с глюкокортикоидным иммуноконъюгатом, описываемым в литературе, направленным на противовоспалительную функциональность (международная заявка согласно PCT WO2011039510A2, Graversen NJH, et al.; Graversen JH et al., Mol. Ther. 20 (8): 1550-8 (2012)).

Создание клеточной линии '' мышиный CD163 GRE репортер ''

Создавали исходную клеточную линию, подобную описываемой в примере 78, но с клетками CHO-K1 вместо клеток K562. Затем полученную в результате исходную клеточную линию CHO pGL4,36[Luc2P/MMTV/Hygro]_PGL4,75[hRLuc/CMV] трансфицировали плазмидой, которая кодирует мышиный CD163 (Origene, № по кат. MR216798), в условиях, описываемых в примере 78. Полученную в результате клеточную линию CHO mCD163 GRE (pGL4,36[luc2P/MMTV/Hygro]) использовали для тестирования in vitro активности как иммуноконъюгатов к mTNF-альфа, так и иммуноконъюгатов к мышиному CD163 (также называемых иммуноконъюгатами к mCD163 или стероидном ADC к mCD163).

Получение иммуноконъюгата к мышиному CD163

Создавали химерное крысиное антитело к мышиному CD163 mIgG2a/k из последовательностей VH и VL для клона 3E10B10, как описывалось (SEQ ID NO: 87/88 из международной заявки согласно PCT WO 2011/039510A2). Данное антитело конъюгировали с соед. № 99 с использованием условий, указанных под общим протоколом конъюгации с цистеином в примере 36, с получением соотношения лекарственное средство:антитело (DAR) 4.

Активность иммуноконъюгата к мышиному CD163 в анализе по репортеру в мышином CD163 GRE

Иммуноконъюгат к мышиному CD163 тестировали в отношении активности в отношении клеточной линии CHO mCD163 GRE (pGL4,36[luc2P/MMTV/Hygro]) в условиях, описываемых в примере 79. Стероидный ADC к mTNF-альфа (соед. № 145) включали в качестве отрицательного контроля. Результаты в таблице 22 демонстрируют, что иммуноконъюгат к мышиному CD163 (соед. № 223)

демонстрирует антиген-зависимую активность, отличающуюся от таковой стероидного ADC к mTNF-альфа в отношении клеточной линии ''мышиный CD163 GRE''.

Таблица 22

Соед. №	DAR	% мономера	EC50 mCD163 GRE (мкг/мл)	mCD163 GRE (% max)	EC50 CHO GRE (мкг/мл)	CHO GRE (% max)
223	4	93	0,2	92	>50	55
145	4	97	>20	70	>50	39

Активность иммуноконъюгата к мышиному CD163 в отношении индуцированного коллагеном артрита у мыши

Способность стероидного иммуноконъюгата к мышиному CD163 влиять на отек лапы оценивали на модели индуцированного коллагеном артрита (CIA) RA. Контрольный стероидный ADC к mTNF-альфа (соед. 139) с тем же лекарственным средством-линкером и DAR, что и у стероидного ADC к mCD163, также оценивали в том же исследовании, и исходные mAb для обоих ADC также включали как группы с обработкой. Эксперимент проводили согласно процедуре, описанной в примере 85. Результаты показаны на фигуре 24 и демонстрируют, что хотя стероидный ADC к mCD163 изначально снижает отек лапы в первые несколько дней после обработки однократной дозой, этот эффект является временным. Для сравнения, однократная доза стероидного ADC к mTNF-альфа является достаточной для полного подавления воспаления на протяжении исследования

Следует принимать во внимание, что раздел Подробное описание, а не разделы Краткое описание и Реферат, предназначен для использования для интерпретации формулы изобретения. В разделах Краткое описание и Реферат изложены один или несколько, но не все, иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения, предусматриваемые автором(-ами) настоящего изобретения, и, таким образом, они не предназначены для ограничения настоящего раскрытия и прилагаемой формулы изобретения каким-либо образом.

Настоящее изобретение описано выше с помощью функциональных структурных элементов, иллюстрирующих реализацию указанных функций и их взаимосвязи. Границы этих функциональных структурных элементов были произвольно определены в данном документе для удобства описания. Могут быть определены альтернативные границы при условии, что указанные функции и их взаимосвязи будут надлежащим образом выполнены.

Вышеприведенное описание конкретных вариантов осуществления полностью раскрывает общий характер настоящего изобретение так, что специалисты смогут, применяя информацию из уровня техники, легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие конкретные варианты осуществления без неоправданных экспериментов без отступления от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, такие адаптации и модификации предназначены для того, чтобы быть в пределах значения и диапазона эквивалентов раскрытых вариантов осуществления на основании представленных в данном документе идей и указаний. Следует учитывать, что фразеология или терминология в данном документе предназначена для описания, а не ограничения, так что терминология или фразеология настоящего описания должна интерпретироваться квалифицированным специалистом в свете идей и указаний.

Широта и объем настоящего раскрытия не должны ограничиваться каким-либо из вышеописанных иллюстративных вариантов осуществления, но должны определяться только в соответствии со следующими пунктами формулы изобретения и их эквивалентами.

1. Соединение:

где n составляет 2, и A представляет собой антитело, содержащее последовательности тяжелой и легкой цепей SEQ ID NO:66 и SEQ ID NO:73 соответственно.

2. Соединение:

где n составляет 2 или 4, и A представляет собой антитело, содержащее SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 73 или адалимумаб.

3. Соединение по п. 2, где n составляет 4.

4. Соединение по п. 2, где n составляет 2.

5. Соединение по п. 2 или 3, где A представляет собой адалимумаб.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено анти-hIL-2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновая кислота, рекомбинантный вектор, способ получения анти-hIL-2 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Антитела к человеческому интерлейкину-2 и их применение // 2745451

Антитела против il-33, композиции, способы и их применение // 2740309

Изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с IL-33, а также к плазмиде для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, к вектору экспрессии, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, к клетке-хозяину для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, к фармацевтической композиции и к способу лечения.

Антитела против il-33, композиции, способы и их применение // 2740309

Способы получения двуцепочечных белков в бактериях // 2739500

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен способ получения иммуномобилизующего моноклонального Т-клеточного рецептора против рака (ImmTAC).

Гуманизированное нейтрализующее антитело к интерферону-бета человека // 2737466

Изобретение относится к области биохимии, в частности к гуманизированному нейтрализующему моноклонаљному антителу, селективно связывающему интерферон-бета человека и способному нейтрализовать его биологическую активность, а также к изолированному фрагменту ДНК, кодирующему участок легкой цепи, и изолированному фрагменту ДНК, кодирующему участок тяжелой цепи.

Гуманизированное нейтрализующее антитело к интерферону-бета человека // 2737466

Новая форма il33, мутировавшие формы il33, антитела, анализы и способы их применения // 2736299

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое(ый) специфически связывается с белком IL-33 в восстановленной форме, к способу их получения, а также к их применению для лечения или предупреждения воспалительного состояния.

Новая форма il33, мутировавшие формы il33, антитела, анализы и способы их применения // 2736299

Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr // 2734432

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент против GITR, нуклеиновая кислота, экспрессионный вектор, способ получения клетки-хозяина, клетка-хозяин.

Цитотоксическая и противовирусная активность 3-ацилоксиметил-3-оксо-1-циано-2,3-секо-2-нор-тритерпеноидов // 2682669

Изобретение относится к А-секотритерпеноиду 18αН-олеананового типа. Технический результат: получено новое соединение, ингибирующее репродукцию ВИЧ-1 и вирусов герпеса простого I и II типа и обладающее одновременно вирулицидными свойствами.