Способ прогнозирования риска возникновения тромботических осложнений у пациентов с сердечно-сосудистой патологией

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии. Предложен способ прогнозирования риска возникновения тромботических осложнений у пациентов с сердечно-сосудистой патологией. В периферической крови пациента определяют полиморфизмы генов eNOS:G894T и AGTR2:1675. При сочетании гомозиготы TT или гетерозиготы GT гена eNOS rs1799983 и гомозиготы АА или гетерозиготы GА гена AGTR2 rs1403543 прогнозируют высокий риск возникновения тромбозов. Изобретение обеспечивает повышение точности и объективности прогнозирования риска возникновения тромботических осложнений у пациентов с сердечно-сосудистой патологией. 7 ил., 4 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области кардиологии и, в частности, к лечению ишемической болезни сердца, профилактике тромботических осложнений.

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всем мире: ни по какой другой причине ежегодно не умирает столько людей, сколько от ССЗ. (ВОЗ, 17.05.2017 г.), (Искаков Е.Б. Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний // Искаков Евгений Борисович (2017). Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний. Медицина и экология, 2017; 2: 19-28).

Полиморфизм гена eNOS может служить причиной эндотелиальной дисфункции, которая приводит к развитию ИБС, а рецептор АТ2 является частью ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, участвующей в регуляции кровообращения и сосудистого тонуса и также обладает широким спектром функций, с привлечением механизмов увеличения продукции оксида азота (Хохлов А.Л. Полиморфизм генов eNOS И AGTR2 как фактор риска развития ишемической болезни сердца // Проблемы стандартизации в здравоохранении 2015; 9-10: 46-50).

Наряду с модифицируемыми факторами риска существуют и такие, на которые повлиять невозможно: пол, генетические особенности. Поэтому одной из актуальных проблем является поиск генетических основ развития сердечно-сосудистых заболеваний. К таким генам можно отнести: ген eNOS, вырабатывающий регулятор сосудистой стенки - оксид азота; ген рецептора ангиотензина II 2 типа (AGTR2), являющийся элементом ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, участвующей в регуляции кровообращения и сосудистого тонуса. В клинических рекомендациях подчеркивается особая роль генов, регулирующих эндотелиальную функцию, так как их структурные изменения могут служить патофизиологической основой развития ишемической болезни сердца.

Известно, что ген эндотелиальной NO-синтазы кодирует фермент (Поздняков, Н.О. Полиморфизм гена eNOS: распространенность и связь с заболеваниями / Н.О. Поздняков, А.Л. Хохлов // Фарматека. - 2015. - №13. - С. 21-24), ответственный за синтез в сосудистой стенке оксида азота -важнейшего вазодилатотора, антиагреганта, антимитогена и антиоксиданта (Белоус, А. С.Оценка коррекции морфологических изменений при моделировании эндотелиальной дисфункции сверхмалыми дозами антител к eNOS на 28-дневной модели L-NAME индуцированного дефицита оксида азота / А.С.Белоус // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2014. - №11-1 (182), том 26. - С. 127-130.; Паршина, С.С. Биологические эффекты оксида азота в развитии кардиоваскулярной патологии как основа применения терагерцовой терапии / С.С. Паршина, Т.Н. Афанасьева, В.Д. Тупикин // БМИК. - 2012. - №6. - С. 446-452).

Подавление или снижение активности eNOS, а также проявление полиморфных вариантов данного гена (GT, ТТ), приводит к снижению уровня экспрессии NO-синтазы и недостатку оксида азота, что проявляется дисфункцией эндотелия, ведущей к развитию атерогенеза и атеротромбоза. В связи с этим, функциональные варианты гена eNOS влияют на индивидуальную предрасположенность к атеросклерозу (Бебякова, Н.А. Анализ влияния полиморфизма 894g>t гена nos 3 на продукцию вазоактивных эндотелиальных факторов / Н.А. Бебякова, А.А. Куба, О.М. Феликсова, А.В. Хромова // Современная медицина: актуальные вопросы и перспективы развития. - 2015. - Выпуск II. - С. 74-77).

В гене NOS3 в 4-ом интроне, полиморфизм промоторной области гена - 786Т>С и структурная замена в 7 экзоне 894G>T. Этот вариант полиморфизма гена eNOS 894G>T важен тем, что Т-аллель приводит к снижению активности eNOS (Hinz, J. The eNOS 894G/T gene polymorphism and its influence on early and long-term mortality after on-pump cardiac surgery / J. Hinz // Journal of Cardiothoracic Surgery. - 2013. - №8. - P. 199.) и уменьшению уровня NO (Mackawy, АМН. Association of the endothelial nitric oxide synthase gene G894T polymorphism with the risk of diabetic nephropathy in Qassim region, Saudi Arabia-A pilot study / AM.H. Mackawy, A.A Khan, ME-S Badawy // Meta Gene. - 2014. - №2. - P. 392-402; Gu, Z. Promoter polymorphism T-786C;, 894GAT at exon 7 of endothelial nitric oxide synthase gene are associated with risk of osteoporosis in Sichuan region male residents / Z. Gu, Y. Zhang, G. Qiu // Int J Clin Exp Pathol. - 2015. - №8(11). - P. 15270-4; Liu, D. Association between the - 786T>C lpolymorphism in the promoter region of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and risk of coronary artery disease: a systematic review and meta-analysis / D. Liu, Z. Jiang, L. Dai [et al.] // Gene. - 2014. - №545(1). - P. 175-83).

Известно, что в развитии эссенциальной AT ведущую роль отводят полиморфизму следующих генов: REN (ген ренина), АСЕ (ген ангиотензинпревращающего фермента), AGT (ген ангиотензиногена), AGTR1 (ген рецептора 1-го типа к ангиотензину II), AGTR2 (ген рецептора 2-го типа к ангиотензину II), BKR2 (ген брадикининового рецептора 2 типа), ADRB1 (ген β1-адренорецептора), ADRB2 (ген β2-адренорецептора), MTHFR (ген 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы), NOS3 (ген NO-синтазы 3 типа). Продукты этих генов обеспечивают различные этапы одной метаболической цепи.

В последние годы интерес многих исследователей сосредоточился на функции 2-го типа рецепторов к АТП, которые представлены практически во всех тканях, в особенности в эндотелии сосудов. Ген рецептора 2-го типа к ангиотензину II (AGTR2) располагается на длинном плече Х-хромосомы в локусе Xq22-q23, содержит 3 экзона. Ген AGTR2 экспрессируется главным образом под контролем эстрогенов. Подобно AGTR1, AGTR2 также участвует в ангиотензин II опосредованных реакциях, но, являясь его антагонистом, контролирует преимущественно вазодилатирующие функции. Описано 5 полиморфных вариантов гена AGTR2. Наиболее изученным является полиморфизм 3123 OA, сцепленный с вариантом +1675G>A в интроне 1, влияющим на начало транскрипции. Показана ассоциация 3123А варианта с АГ у взрослых женщин и у мальчиков, больных АГ, то есть варианты гомо- (АА) и гетерозиготы (GA) ассоциируются с развитием АГ (О.В. Шевченко Генетические основы патогенеза эссенциальной артериальной гипертензии (обзор) / О.В. Шевченко, А.А. свистунов, В.Б. Бородулин, А.В. Рута, Е.Н. Бычков // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2011. - Том 7 - №1. - С. 83-87).

Целью предлагаемого способа прогнозирования риска возникновения тромботических осложнений у пациентов с сердечно-сосудистой патологией является повышение точности и объективности.

Поставленная цель достигается тем, что пациентам с сердечнососудистой патологией в переферической крови определяют полиморфизм генов eNOS rs 1799983 и AGTR2 rs 1403543. И если выявляют сочетание полиморфизмов генов eNOS rs 1799983 и AGTR2 rs 1403543 в виде гомо- и/или гетерозигот прогнозируют высокий риск возникновения тромботических осложнений.

Новизна предлагаемого способа заключается в том, что прогнозирование тромботических осложнений проводят с учетом частоты встречаемости полиморфизмов генов eNOS rs 1799983 и AGTR2 rs 1403543, ответственных за развитие данной патологии.

Технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого нами способа, не выявлены, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ осуществляются следующим образом.

Сначала выполняют забор периферической крови у пациента. Затем из крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выделяют ДНК больного. Для получения ДНК из анализируемого материала используют комплект реагентов для выделения (компании «Синтол»). Для оценки количества выделенной ДНК используют комплект реагентов для ПЦР-амплификации геномной ДНК человека в режиме реального времени (КВМ) производства компании «Синтол».

Далее с помощью комплекса реактивов, предназначенных для использования с амплификаторами детектирующими (компании «Синтол».) определяют полиморфизм генов eNOS rs 1799983 и AGTR2 rs 1403543.

После этого выполняют интерпретацию полученных результатов. При сочетании полиморфизмов генов eNOS rs1799983 и AGTR2 rs 1403543 в виде гомо- и/или гетерозигот прогнозируют высокий риск возникновения тромбозов.

Клинические исследования способа проведены на 200 пациентах с различными формами сердечно-сосудистой патологии: инфаркт миокарда, нестабильная и стабильная формы стенокардии с сопутствующими состояниями: ОНМК, атеросклероз брахиоцефальных сосудов, сосудов ног, венозные тромбозы.

Для определения возможных ассоциаций генов eNOS и AGTR2 с группой риска, все группы пациентов были разделены на 3 подгруппы в соответствии с аллельными вариантами GG, GA, АА для анализа гена AGTR2; и в соответствии с аллельными вариантами GG, GT, ТТ для анализа гена eNOS. Частота встречаемости аллелей гена eNOS в первой подгруппе пациентов, очень высокого риска составляет: GG - 8 (22,2%), GT - 23 (63,9%), ТТ - 5 (13,9%), во второй, высокого риска - GG - 34 (39,5%), GT - 50 (58,2%), ТТ - 2 (2,3%), в третьей - низкого и среднего риска - GG - 52 (66,7%), GT - 24 (30,8%), ТТ - 2 (2,5%) (табл. 1.1).

Подсчет выполнен методом хи-квадрат, с использованием корреляционного анализа (табл. 1.2).

Минимальное предполагаемое число равно 1,62.

Частота встречаемости аллелей гена AGTR2 в первой подгруппе пациентов составляет: GG - 12 (33,3%), GA - 6 (16,7%), АА - 18 (50%), во второй - GG - 26 (30,2%), GA - 21 (24,4%), АА - 39 (45,3%), в третьей - GG - 46 (59%), GA - 17 (21,8%), АА - 15 (19,2%) (табл. 2.1, 2.2)

Подсчет выполнен методом хи-квадрат, с использованием корреляционного анализа (табл. 2.2).

Минимальное предполагаемое число равно 7,92.

Выявлена прямая корреляционная связь групп риска с генами eNOS (0,639, р<0,0001) и AGTR2 (0,270, р<0,0001), как гомо-, так и гетерозиготой, на котором отмечено процентное соотношение полиморфного гомозиготного гена по группам риска (аллельного варианта ТТ гена eNOS rs 1799983 и АА гена AGTR2 rs1403543), (см. фиг. №1), на котором отмечено процентное соотношение полиморфного гетерозиготного гена по группам риска (аллельного варианта GT гена eNOS rs 1799983 и GA гена AGTR2 rs1403543) (см. фиг. .№2). Статистическая обработка проведена методом хи-квадрат (р<0,005).

Таким образом, у пациентов с сердечно-сосудистой патологией возникновение тромботических осложнений коррелирует с полиморфизмом генов eNOS rs 1799983 и AGTR2 rs1403543.

При проведении сопряженного анализа через хи-квадрат доказано, что сочетание полиморфизма генов eNOS rs 1799983 и AGTR2 rs 1403543 в виде гомо- и/или гетерозиготы является предиктором возникновения тромботических осложнений (фиг. 1-7).

На фиг. 1 показано соотношение полиморфного гомозиготного гена с группами риска (ТТ гена eNOS rs1799983 и АА гена AGTR2 rs1403543).

На фиг. 2 показано соотношение полиморфного гетерозиготного гена с группами риска (GT гена eNOS rs 1799983 и GA гена AGTR2 rs1403543).

На фиг. 3 показано соотношение полиморфного гомозиготного гена (ТТ гена eNOS rs 1799983) и гетерозиготного (GA гена AGTR2 rs 1403543) с группами риска.

На фиг. 4 показано соотношение полиморфного гетерозиготного гена (GT гена eNOS rs1799983) и гомозиготного (АА гена AGTR2 rs1403543) с группами риска.

На фиг. 5 показано соотношение нормальных генов (GG гена eNOS rs1799983) и (GG гена AGTR2 rs1403543) с группами риска.

На фиг. 6 показано соотношение нормального гена eNOS (GG гена eNOS rs1799983) с гомо и гетерозиготой AGTR2 (GA, АА гена AGTR2 rs1403543).

На фиг. 7 показано соотношение нормального гена AGTR2 (GG гена AGTR2 rs1403543) с гомо- и гетерозиготой eNOS (ТТ, GT гена eNOS rs1799983).

Примечание: *р<0,005. Статистическая обработка проведена методом хи-квадрат.

Приводим клинические примеры применения предлагаемого способа. Первый и третий примеры - с крайней степенью отклонений (соответствуют фиг. 1 и фиг. 5 соответственно), второй пример соответствует промежуточным вариантам полиморфизма генов (фиг. 2, 3, 4, 6, 7).

Пример №1. Больной М., 64 года поступил в кардиологическое отделение первичного сосудистого центра с диагнозом острый коронарный синдром, далее развился Q-образующий инфаркт миокарда. Диагноз: ИБС: острый Q-образующий инфаркт миокарда. Атеросклероз аорты, клапанов, брахиоцефальных артерий со стенозами до 60%. Гипертоническая болезнь 3 стадии стратификационный риск 4. НК II по Killip.Фибрилляция предсердий пароксизмальная форма. ХСН 2а ФК 3. Состояние после перенесенного ОНМК. Атеросклероз сосудов ног.

При проведении генетического тестирования выявлено носительство полиморфизма гена eNOS rs1799983 в виде гомозиготы ТТ и AGTR2 rs 1403543 в виде гомозиготы АА, которое свидетельствует о высоком риске возникновения тромботических осложнений.

Это было подтверждено тем, что через год у пациента развился повторный Q-образующий инфаркт миокарда и при проведении коронароангиографии выявлены множественные атеросклеротические поражения (бляшки).

Пример №2. Больной Г., 55 лет поступил в кардиологическое отделение острый коронарный синдром, перешедшем в нестабильную стенокардию с исходом в стенокардию высокого функционального класса - 3 ФК. В анамнезе имеется перенесенная ТЭЛА, посттромботическая болезнь вен ног (ПТБ), атеросклероз БЦА. Диагноз ИБС: нестабильная стенокардия с исходом в стенокардию напряжения 3 ФК. Атеросклероз аорты, клапанов, брахиоцефальных артерий со стенозами до 30%. Гипертоническая болезнь 3 стадии стратификационный риск 4. НК I по Killip. ХСН 2 ФК 2. Состояние после перенесенной ТЭЛА. ПТБ ног.

При проведении генетического тестирования выявлено носительство полиморфизма гена eNOS rs1799983 в виде гетерозиготы GT и AGTR2 rs 1403543 в виде гетерозиготы GA, что свидетельствует о высоком риске возникновения тромботических осложнений.

Это было подтверждено прогрессированием атеросклероза на фоне адекватной терапии: развитием острого инфаркта миокарда через 1 год 8 месяцев, увеличением атеросклеротических бляшек до 40%.

Пример №3. Больная Ф., 74 года поступила в кардиологическое отделение с острым коронарным синдромом, перешедшим в стенокардию невысокого функционального класса - 2ФК. Так же имеет место фибрилляция предсердий постоянная форма. В анамнезе атеросклероз брахиоцефальных артерий. Диагноз: ИБС: нестабильная стенокардия с исходом в стенокардию напряжения 2 ФК. Атеросклероз аорты, клапанов, брахиоцефальных артерий. Фибрилляция предсердий постоянная форма. Распространенный остеохондроз позвоночника, торакалгия.

При проведении генетического тестирования выявлено носительство полиморфизма гена eNOS - гомозиготы GG, гена AGTR2 в виде гомозиготы GG, которое свидетельствует о низком риске возникновения тромботических осложнений при сердечно-сосудистой патологии. Это было подтверждено длительным периодом наблюдения: у пациентки в течение 5 лет наблюдения не было значимого прогрессирования атеросклероза по данным УЗАС БЦА, не было прогрессирования функционального класса стенокардии и развития других сердечно-сосудистых осложнений.

Предлагаемый способ прогнозирования риска возникновения тромботических осложнений у пациентов с сердечно-сосудистой патологией применялся в ОГБУЗ «Окружная больница Костромского округа №1», НУЗ «Дорожная клиническая больница на ст. Ярославль ОАО «РЖД».

Способ прогнозирования риска возникновения тромботических осложнений у пациентов с сердечно-сосудистой патологией, включающий определение полиморфизмов генов в периферической крови пациента, отличающийся тем, что в периферической крови пациента определяют полиморфизмы генов eNOS:G894T и AGTR2:1675 и при сочетании гомозиготы TT или гетерозиготы GT гена eNOS rs1799983 и гомозиготы АА или гетерозиготы GА гена AGTR2 rs1403543 прогнозируют высокий риск возникновения тромбозов.