Способ обнаружения trichinella

Изобретение относится к способу обнаружения Trichinella в образце экстрактов тканей. Способ предусматривает отбор образца исследуемого материала, его механическое измельчение, центрифугирование или фильтрацию с получением экстракта с последующим проведением иммунного анализа, включающего иммунную реакцию между антигеном и антителом для обнаружения антигена Trichinella. В качестве образца используют образцы тканей млекопитающего, предпочтительно свиней. Способ осуществляют при условии, что размер 90% частиц в образце имеет диаметр менее 300 мкм, а температура экстракции составляет предпочтительно 40°С. Иммунный анализ проводят, например, с помощью анализа ELISA. Изобретение позволяет повысить точность обнаружения Trichinella в образце тканей млекопитающего. 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 3 пр.

 

Данное изобретение относится к способу обнаружения Trichinella в образцах экстрактов тканей, к применению системы обнаружения по изобретению для обнаружения Trichinella, а также к набору, включающему (a) носитель обнаружения, который содержит первое антитело к одному или нескольким антигенам Trichinella, и (b)(i) второе антитело к одному или нескольким антигенам Trichinella, при этом второе антитело связано с сигнальной молекулой, или (b)(ii) один или несколько антигенов Trichinella, которые связаны с сигнальной молекулой, при этом антигены из (b)(ii) таким образом образованы, что они вызывают связывание антигенов из (а) с первыми антителами путем конкурентного вытеснения.

Trichinella spiralis (T. spiralis) представляет собой нематоду рода Trichinella и может вызывать серьезные заболевания у людей. Так называемый трихинеллез возникает из-за потребления сырого или недостаточно нагретого мяса, зараженного трихинеллами. Симптомами этого заболевания являются первоначально тошнота, диарея и боль в мышцах. По мере прогрессирования заболевания среди прочего появляются симптомы паралича, отеки лица, в частности париорбитальные, конъюнктивит, головная боль, сыпь на коже и миокардит [1]. Как правило, паразит передается через мясо различных млекопитающих, таких как, например домашние свиньи, лошади, медведи, кабаны или грызуны. Известно 11 различных видов рода Trichinella, которые можно разделить на две группы: виты типа T. spiralis, которые в мышечных клетках в организме хозяина образуют коллагеновую капсулу, в которую они постоянно включены, и виды, которые не образуют никаких капсул, такие как T. pseudospiralis [2].

T. spiralis обитает независимо от климата по всему миру за редким исключением. В Европейском союзе (EU) редко встречаются случаи трихинеллеза у домашних свиней, которые происходят из коммерческого разведения и откорма, однако у диких животных, таких как кабаны, лисы и куницы или свиньи частного разведения, распространенность значительно выше. В Китае распространенность трихинеллеза у свиней в целом составляет до 4%. Между 1964 и 2002 годами наблюдалось более 500 вспышек и более чем 25000 заболевших человек [3].

Жизненный цикл T. spiralis общеизвестен. После перорального приема инфицированных T. spiralis продуктов питания личинки высвобождаются примерно через 24 ч в тонком кишечнике из-за повреждения коллагеновых капсул пищеварительными жидкостями. Через четыре линьки личинка превращается во взрослую форму и происходит половое созревание самок. Через 5-10 дней рождаются новые личинки (NBL - новорожденные личинки), которые распространяются через кровь и лимфатическую систему. Через 6-12 дней личинки проникают в поперечно-полосатые мышцы (ML-мышечные личинки) и через 4-6 недель начинается образование капсул, при этом капсула со временем становится все более кальцинированной. В течение от нескольких лет до десятилетий происходит обмен веществ с тканями [4].

Чтобы выжить долгие годы в мышцах хозяина, T. spiralis изменяет иммунную систему хозяина с помощью многочисленных белков, которые секретируются в окружающие ткани. Так называемые экскреторные и секреторные белки (E/S-белки) выделяются преимущественно из стихосом, которые состоят из примерно 50 крупных железистых клеток - стихоцитов, и находятся в стенке пищевода.

Исследование мяса на трихинеллез, ранее называемое трихинеллоскопия, представляет собой исследование мяса пригодных для продуктов питания животных на наличие T. spiralis после убоя. Это исследование является частью официальных исследований убойных животных и мяса у подлежащих экспертизе убойных животных, и было введено, поскольку в середине 19-го века произошло несколько эпидемий. Таким образом, уже в 1866 году в королевстве Пруссия была введена обязательная трихинеллоскопия. Если должно быть разрешено потребление мяса людьми, то все животные в пределах EU, которые могут быть носителями T. spiralis такие как, например, домашние свиньи, лошади, медведи или кабаны, должны быть исследованы (EG номер 2015/1375).

Стоимость исследования мяса на трихинеллез составляет от 0,12 € до 3,70 € за свинью, в зависимости от размера скотобойни и связанным с этим количеством убойных животных [5].

Серология при исследовании мяса на трихинеллез не имеет смысла, так как сероконверсия при дозе инфицирования 20000 личинок происходит через 3-4 недели, а 100 личинок через 5-7 недель [6].

Существуют различные системы обнаружения для обнаружения T. spiralis в тканях, которые согласно предписаниям EU (EG номер 2015/1375) допустимы и применяются на скотобойнях или в лабораториях. Наряду с механическим способом искусственного пищеварения с помощью лабораторного блендера Stomacher 3500, автоматическим процессом пищеварения групповых проб до 35 г с помощью смесителя Trichomatic-35® и проверкой с помощью искусственного пищеварения с помощью комплектов PrioCHECK® Trichinella AAD, существуют еще два других способа, а именно способ магнитного перемешивания для искусственного пищеварения для групповых проб и способ "выделения на фильтре" обнаружения личинок с помощью теста латексной агглютинации (Trichin-L-Antigen-Test-Kit от Bio-Rad). В связи с этим следует отметить, что наиболее часто выполняемым и в то же время эталонным способом является способ магнитного перемешивания для искусственного пищеварения. Новейшим способом является способ магнитного перемешивания для искусственного пищеварения групповых проб с последующей технологией "выделения на фильтре" и обнаружение личинок с помощью теста латексной агглютинации.

Способ магнитного перемешивания для искусственного пищеварения групповых проб достаточно известен специалистам [7]. Этот способ имеет множество недостатков, таких как изменяющееся качество применяемых пепсинов, чувствительность к температуре и продолжительности (пищеварение должно происходить 30 минут при температуре от 46°C до 48°C), большая продолжительность (процесс пищеварения, стадия седиментации, очистка оборудования и микроскопа), ручная обработка данных специально подготовленным персоналом, сложные и опасные для проведения отдельные стадии, например, обработка соляной кислотой, сложная обработка данных (например, пищеварительная жидкость может быть недостаточно хорошо очищена, и личинки могут быть пропущены из-за сильного помутнения) и риск заражения через плохо очищенное оборудование.

Также технология "выделения на фильтре" и последующее обнаружение личинок с помощью теста латексной агглютинации имеют многочисленные недостатки. Например, данный способ также имеет описанные выше недостатки в отношении пищеварения, так как процесс пищеварения идентичен. Кроме того, химические продукты, такие как моющие средства, могут существенно повлиять на чувствительность теста. Кроме того, есть много оборудования, которое необходимо тщательно очистить, что делает риск заражения довольно высоким.

Поэтому существует потребность в способе, который позволяет проводить просто, быстро, экономично и надежно обнаружение Trichinella в тканях животных, в частности в мышечных тканях.

Способ, применение и комплект, которые позволяют проводить быстрое, экономичное и надежное обнаружение Trichinella в тканях, описаны ниже и являются объектами данного изобретения.

Изобретатели данного изобретения неожиданно обнаружили, что с помощью (механического) измельчения инфицированных Trichinella тканей, обнаружение Trichinella можно проводить с помощью иммунного анализа. Такой анализ позволяет обнаружить≤7 нг антигена Trichinella на мл экстракта тканей или менее. В частности было обнаружено, что как только в образце экстракта тканей 90% содержащихся в нем частиц имеют диаметр 300 мкм или менее (D90≤300 мкм), можно эффективно обнаружить Trichinella.

Поэтому в первом аспекте данное изобретение относится к способу обнаружения Trichinella в образцах экстрактов тканей, при этом в образцах экстрактов тканей 90% частиц имеют диаметр 300 мкм или менее (D90≤300 мкм). При этом предпочтительно Trichinella обнаруживают путем обнаружения антигена Trichinella, предпочтительно специфического антигена Trichinella в образцах экстрактов тканей с помощью иммунного анализа.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения образец экстрактов тканей представляет собой образец ткани млекопитающего, предпочтительно образец ткани свиньи.

В предпочтительном варианте осуществления в образцах экстрактов тканей 90% частиц имеют диаметр 100 мкм или менее (D90≤100 мкм), предпочтительно 20 мкм или менее (D90≤20 мкм).

В другом предпочтительном варианте осуществления образцы экстрактов тканей представляют собой мышечную ткань.

В предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению при получении образцов экстрактов тканей (a) температура не превышает 45°C, предпочтительно 40°C, и/или (b) не происходит никакого ферментного и/или химического разложения ткани.

Кроме того, способ в предпочтительном варианте осуществления (a) не включает стадию микроскопии; (b) предусматривает применение в рамках санитарного осмотра мяса и/или (c) имеет предел обнаружения≤7 нг антигена на мл экстракта тканей.

В другом предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению проводят с помощью иммунного анализа, более предпочтительно с помощью ELISA (иммуноферментного анализа), лайн-блоттинга, вестерн-блоттинга, анализа гранул, Lateral-Flow (анализа в боковом потоке), анализа на вертикальном фильтре или 3D-иммунофильтрационного анализа.

В предпочтительном варианте осуществления Trichinella представляет собой Trichinella spiralis.

Во втором аспекте данное изобретение относится к применению системы обнаружения для обнаружения Trichinella, предпочтительно в рамках санитарного осмотра мяса, при этом система обнаружения включает (a) носитель обнаружения, который содержит первое антитело к одному или нескольким антигенам Trichinella, и (b)(i) второе антитело к одному или нескольким антигенам Trichinella, при этом второе антитело связано с сигнальной молекулой, или (b)(ii) один или несколько антигенов Trichinella, которые связаны с сигнальными молекулами, при этом антигены из (b)(ii) образованы таким образом, что они вызывают связывание антигенов (а) с первыми антителами путем конкурентного вытеснения.

В третьем аспекте данное изобретение относится к комплекту, включающему (a) носитель обнаружения, который включает первое антитело к одному и/или нескольким антигенам Trichinella, и (b)(i) второе антитело к одному и/или нескольким антигенам Trichinella, при этом второе антитело связано с сигнальной молекулой, или (b)(ii) один или несколько антигенов Trichinella, которые связаны с сигнальной молекулой, при этом антигены (b)(ii) образованы таким образом, что они вызывают связывание антигенов (а) с первыми антителами путем конкурентного вытеснения.

Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления комплект включает описание способа по изобретению для обнаружения Trichinella.

Как описано выше, первый аспект данного изобретения относится к способу обнаружения Trichinella в образцах экстрактов тканей, при этом в образцах экстрактов тканей 90% частица имеют диаметр 300 мкм или менее (D90≤300 мкм).

Выражения "обнаружение" или "детектирование", равнозначные в данной работе, описывают качественное или количественное определение Trichinella. Качественное определение означает, что определяют только присутствие или отсутствие Trichinella. Количественное определение означает определение относительного или абсолютного количества Trichinella в образце.

Выражения "Trichinella" или "Trichinen", равнозначные в данной работе, относятся к роду нематод (штамм Nematoda) с паразитическим образом жизни. Млекопитающие, а значит, и люди, и птицы служат промежуточными и конечными хозяевами. Главным переносчиком на человека являются зараженные свиньи или, соответственно, их сырое, например, потребляемое в виде фарша, или недостаточно приготовленное мясо. Таксономически трихинеллы классифицируются как указано ниже: тип: нематода (Nematoda); класс: аденофорея (Adenophorea); подкласс: эноплея (Enoplea); отряд: Trichocephalida; семейство: Trichinellidae; вид: Trichinella. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения Trichinella выбирают из группы, состоящей из Trichinella spiralis, Trichinella nativa, Trichinella britovi, Trichinella murrelli, Trichinella T6, Trichinella T7, Trichinella nelsoni, Trichinella T8, Trichinella T9, Trichinella pseudospiralis, Trichinella papuae и Trichinella zimbabwensis. В другом предпочтительном вариант осуществления Trichinella представляет собой вид организма, который в мышечной клетке организма хозяина образует коллагеновую капсулу и постоянно заключен в нее. В еще более предпочтительном варианте осуществления Trichinella представляет собой Trichinella spiralis. Trichinella spiralis представляет собой нематоду и в средней Европе является важнейшим представителем трихинелл. Она обитает по всему миру, однако в тропических областях не имеет большого значения. T spiralis вызывает клиническую картину трихинеллеза.

Выражение "образец экстракта тканей", как оно употребляется в данной работе, обозначает смесь из различных веществ биологического происхождения. В случае материала биологического происхождения речь может идти об эпителиальной ткани (клеточные слои, которые покрывают все внутренние и внешние поверхности), соединительной ткани и опорной ткани (ткань, которая служит для структурного соединения и заполняет промежутки), специализированной ткани (такой как, например, кровь, свободные клетки, и т.д.), мышечной ткани (клетки, которые благодаря сократительным волокнам специализируются на активном движении), нервной ткани (клетки, из которых образованы мозг, спинной мозг и периферические нервы) и тканевой жидкости, такой как, например, лимфа. Далее предпочтительной тканью является мышечная ткань. Мышечная ткань может представлять собой гладкую мускулатуру, сердечную мускулатуру и/или скелетную мускулатуру. В другом предпочтительном варианте осуществления образец отбирается из диафрагмы, языка или межреберных мышц объекта исследования. Предпочтительно в случае ткани речь идет о твердой ткани.

Образец экстракта тканей может быть как гетерогенным или гомогенным. Гетерогенный образец экстракта тканей содержит ткани различных типов. Гомогенный образец экстракта тканей содержит исключительно одну ткань. Гомогенный образец экстракта тканей является предпочтительным. В альтернативном варианте осуществления образец представляет собой объединенный образец, то есть материал образца происходит от разных особей. Или образец происходит исключительно от одной особи.

Экстракт можно получать из фрагментов тканей или из жизнеспособных клеток. Их измельчают и смешивают с водным раствором, таким как, например, буферный раствор, H₂O, клеточная среда и смеси указанных веществ. Предпочтительно процесс получения не включает культивирования клеток.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения образец экстрактов тканей представляют собой образец млекопитающего. В другом предпочтительном варианте осуществления образец происходит от свиней, лошадей, медведей, кошек, собак, грызунов или людей. Еще более предпочтительно образец происходит от домашних свиней (Sus scrofa domesticus), кабанов (Sus scrofa), карликовых свиней (Sus salvanius), бородатых свиней (Sus barbatus), палаванских бородатых свиней (Sus ahoenobarbus), аннамских бородавчатых свиней (Sus bucculentus), висайских бородавчатых свиней (Sus cebifrons), сулавесийских бородавчатых свиней (Sus celebensis), миндорских бородавчатых свиней (Sus oliveri), филиппинских бородавчатых свиней (Sus philippensis), яванских бородавчатых свиней (Sus verrucosus) или бавеанских бородавчатых свиней (Sus blouchi).

Выражение "диаметр частиц", в контексте данного изобретения, обозначает измерение объемов или длин исследуемых частиц в экстракте ткани. Исследуемые частицы могут иметь приблизительно круглую или продолговатую волокнообразную структуру. В предпочтительном варианте осуществления в образце экстрактов тканей 90% частиц имеют диаметр от 300 мкм или менее (D90≤300 мкм), 290 мкм или менее (D90≤290 мкм), 280 мкм или менее (D90≤280 мкм), 270 мкм или менее (D90≤270 мкм), 260 мкм или менее (D90≤260 мкм), 250 мкм или менее (D90≤250 мкм), 240 мкм или менее (D90≤240 мкм), 230 мкм или менее (D90≤230 мкм), 220 мкм или менее (D90≤220 мкм), 210 мкм или менее (D90≤210 мкм), 200 мкм или менее (D90≤200 мкм), 190 мкм или менее (D90≤190 мкм), 180 мкм или менее (D90≤180 мкм), 170 мкм или менее (D90≤170 мкм), 160 мкм или менее (D90≤160 мкм), 150 мкм или менее (D90≤150 мкм), 140 мкм или менее (D90≤140 мкм), 130 мкм или менее (D90≤130 мкм), 120 мкм или менее (D90≤120 мкм), 110 мкм или менее (D90≤110 мкм), 100 мкм или менее (D90≤100 мкм), 95 мкм или менее (D90≤95 мкм), 90 мкм или менее (D90≤90 мкм), 85 мкм или менее (D90≤85 мкм), 80 мкм или менее (D90≤80 мкм), 75 мкм или менее (D90≤75 мкм), 70 мкм или менее (D90≤70 мкм), 65 мкм или менее (D90≤65 мкм), 60 мкм или менее (D90≤60 мкм), 55 мкм или менее (D90≤55 мкм), 50 мкм или менее (D90≤50 мкм), 45 мкм или менее (D90≤45 мкм), 40 мкм или менее (D90≤40 мкм), 35 мкм или менее (D90≤35 мкм), 30 мкм или менее (D90≤30 мкм), 25 мкм или менее (D90≤25 мкм), 20 мкм или менее (D90≤20 мкм), 17 мкм или менее (D90≤17 мкм), 15 мкм или менее (D90≤15 мкм), 13 мкм или менее (D90≤13 мкм), 10 мкм или менее (D90≤10 мкм), 8 мкм или менее (D90≤8 мкм) или 6 мкм или менее (D90≤6 мкм).

Измерение диаметра частиц можно проводить с помощью прибора, который использует динамичную обработку изображений (например, Camsizer®XT от фирмы Retsch), или прибора, который основан на функциональном принципе статического лазерного рассеивания (например, LA-960 от фирмы HORIBA). Размер частиц может быть измерен в x_{c min} и определяется согласно DIN 66141 следующим образом: самый меньший диаметр частиц из измерений максимального диаметра в пределах проекции частицы (англ.яз: particle diameter which is the shortest chord of the measured set of maximum chords of a particle projection) [10]. Альтернативно размер частиц можно определять с помощью диаметра Ферета (x_Fe). Диаметр Ферета является мерой величины объекта вдоль определенного направления. В общем, его определяют как расстояние между двумя параллельными плоскостями, которые ограничивают объект перпендикулярно к данному направлению. Поэтому его называют также калибр-диаметр, по аналогии с измерением величины объекта с помощью штангенциркуля. При анализе размеров частиц, например, в микроскопии, где диаметр Ферета применяется к проекциям трехмерных (3D) объектов на 2D-плоскость, его определяют как расстояние между двумя параллельными тангенциальными линиями вместо двух плоскостей. Для выпуклых частиц средний диаметр Ферета (среднее значение по всем направлениям) равен диаметру круга с такой же длиной окружности. Максимальный диаметр Ферета является самым длинным диаметром Ферета в пределах измеренных диаметров Ферета. Минимальный диаметр Ферета является самым маленьким диаметром Ферета в пределах измеренных диаметров Ферета.

Альтернативно диаметр относится к среднему диаметру, при этом сумма измерений диаметров всех измеренных измеримых частиц делится на общее число измеренных частиц. В другом альтернативном варианте осуществления в качестве диаметра, если он применяется в отношении величины частиц, можно применять показатель «D50», что обозначает, что 50% всех измеренных частиц имеют диаметр частиц, который меньше определенного среднего значения диаметра частиц, и 50% всех измеренных частиц имеют диаметр, который больше определенного среднего значения диаметра частиц.

В предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению при получении образца экстракта ткани (a) температура не превышает 100°C, 90°C, 80°C, 70°C 60°C, 55°C, 50°C, 45°C, 44°C, 43°C, 42°C, 41°C, 40°C, 39°C или 38°C и/или (b) не происходит никакого ферментного и/или химического разложения тканей.

Выражение "получение образца экстракта ткани", как оно употребляется в данной работе, относится к многоступенчатой операции, где образец ткани берется из исследуемого организма, этот образец ткани (механически) измельчается, и измельченный образец ткани обрабатывается фильтрацией и/или центрифугированием. Затем можно провести обнаружение антигена способом по изобретению.

Предпочтительно измельчение образца ткани происходит чисто механически, то есть, например, не происходит никакого ферментного и/или химического расщепления ткани. Механическое измельчение может происходить посредством нарезания, разрывания или раздавливания, однако предпочтительно происходит с помощью нарезания (например, с помощью ножевой мельницы). При измельчении образца ткани также происходит измельчение находящихся в образце ткани личинок Trichinella. Измельченные личинки Trichinella после измельчения имеют размер, который соответствует измельченной ткани.

В предпочтительном варианте осуществления выражение "никакого ферментного расщепления", как оно употребляется в данной работе, означает, что для измельчения образца ткани не применяется никаких ферментов. В частности для измельчения образца ткани не применяют никаких протеаз (например, пепсина), липаз, амилаз, кутиназ, целлюлаз или гемицеллюлаз.

В предпочтительном варианте осуществления выражение "никакого химического расщепления", как оно употребляется в данной работе, означает, что для измельчения образца ткани не применяют никаких химических веществ, таких как кислоты, основания, окислители и т.д.

Кроме того, способ в предпочтительном варианте осуществление (a) не включает стадий микроскопии; (b) предусматривает применение в рамках санитарного осмотра мяса и/или (c) имеет предел обнаружения <20 нг, <15 нг, <10 нг, <9 нг, <8 нг, <7 нг, <6 нг, <5 нг, <4 нг, <3 нг, <2 нг, <1 нг, <0,5 нг, <0,25 нг, <0,1 нг, <0,05 нг, <0,01 нг, <0,005 нг или <0,001 нг антигена на мл экстракта ткани.

Выражение "без стадии микроскопии", как оно употребляется в данной работе, относится к оценке способа обнаружения Trichinella, при этом для оценки предлагаемого способа не требуется ни микроскоп, ни микроскопическая оценка, в частности, ручная микроскопическая оценка.

Выражение «санитарный осмотр мяса» или также "исследование убойного скота и исследование мяса", как оно употребляется в данной работе, относится к процедуре, которая гарантирует, что мясо определенных видов животных в качестве пищи попадает в обращение только в том случае, если оно было оценено как пригодное для употребления для людей. Это исследование является неотъемлемой частью мер по обеспечению гигиены мяса. Обследование обычно проводится официальными ветеринарами или контролерами мяса (экспертиза мяса) в два этапа, а именно исследование животного, и исследование мяса.

В предпочтительном варианте осуществления выражение "предел обнаружения", как оно употребляется в данной работе, указывает наименьшее количество вещества (антигена), которое можно отличить от отсутствия этого вещества с определенной вероятностью. Кроме того, выражение "предел обнаружения" может относиться к концентрации антигена в растворе, где измеренное значение больше, чем связанная с ним неопределенность. Предел обнаружения можно произвольно определить как 3 стандартных отклонения (SD) отдаленных от нулевой концентрации.

В других предпочтительных вариантах осуществления способ по изобретению проводят с помощью иммунного анализа, более предпочтительно с помощью ELISA, лайн-блоттинга, вестерн-блоттинга, анализа гранул, анализа в боковом потоке, анализа на вертикальном фильтре или 3D-иммунофильтрационного анализа.

В предпочтительном варианте осуществления выражение "иммунный анализ", как оно употребляется в данной работе, относится к обнаружению или количественной оценке анализируемого вещества, такого как указный антиген Trichinella, включающему иммунную реакцию между антителом и антигеном. В рамках данного изобретения обнаруживаемое или количественно оцениваемое анализируемое вещество может включать пептид, посттрансляциональный модифицированный пептид, предпочтительно гликопротеин, сахар, липид, нуклеиновую кислоту и/или другую молекулу Trichinella.

В предпочтительном варианте осуществления выражение "ELISA", как оно употребляется в данной работе, обозначает иммуноферментный анализ и относится к основанному на антителах способу обнаружения (анализу). ELISA принадлежит к группе способов иммунного анализа, основанных на ферментативной окрашиваемой реакции и относится, таким образом, к способу ферментативной иммунной адсорбции (EIA). Предпочтительный вариант осуществления включает прямой ELISA, непрямой ELISA, прямой сэндвич-ELISA, промежуточный ELISA, непрямой сэндвич-ELISA и конкурентный ELISA. Специалистам известны упомянутые и другие формы и производные ELISA.

В предпочтительном варианте осуществления выражение "анализ в боковом потоке", как оно употребляется в данной работе, (англ. яз. "seitlicher Flusstest") относится к биохимическому способу качественного обнаружения материалов/веществ/антигенов с антителами. Анализ в боковом потоке представляет собой комбинацию тонкослойной хроматографии и иммунного окрашивания. Анализ в боковом потоке может применяться в виде тест-полосок.

В предпочтительном варианте осуществления выражение "анализ на вертикальном фильтре", как оно употребляется в данной работе, относится к исследованию, в котором исследуемые лиганды/антигены контактируют с мембраной, на которой фиксированы улавливающие антитела. Затем происходит промывка для удаления слабо связанных молекул и обнаружение связанных лигандов. Различие между анализом в боковом потоке и анализом на вертикальном фильтре заключается в продольном и вертикальном потоке исследуемой жидкости. Технология вертикального потока имеет несколько преимуществ по сравнению с анализом в боковом потоке, например, более короткое время анализа.

В предпочтительном варианте осуществления выражение "3D-иммунофильтрационный анализ", как оно употребляется в данной работе, относится к иммунологическому ускоренному тесту в потоковом формате, который основан на том же биохимическом функциональном принципе распознавания анализируемого вещества структурами рецепторов, как анализ в боковом потоке. Различие состоит в том, что добавление образца/антигена, конъюгата и дополнительного промывного раствора происходит последовательно на трехмерное пористое формованное тело, в зафиксированный уловитель. При этом все растворы и их компоненты, такие как анализируемые вещества/антигены и реагенты обнаружения текут в глубине формованного тела. При использовании эффекта накопления можно повысить предел обнаружения.

В предпочтительном варианте осуществления выражение "лайн-блоттинг" относится к тест-полоскам, на которые нанесен по меньшей мере один антиген на определенном месте посредством печати. Изготовление таких тест-полосок описано в состоянии техники. Если в образце имеются антитела, то их комплекс с антигенами можно обнаружить колориметрически. Оценка происходит визуально или измерением интенсивности появляющихся полос. Тест-полоска может содержать положительный контроль в форме полосы, которая появляется, если полоска была инкубирована сывороткой, независимо от того, содержит ли она анализируемое вещество.

В предпочтительном варианте осуществления выражение "анализ гранул" относится к тесту, в котором в качестве носителя применяют гранулы, предпочтительно магнитные гранулы, на которых зафиксирован реагент для обнаружения, предпочтительно антитела к антигенам трихинеллы. Обнаружение комплекса антитело-антиген может происходить с помощью хемилюминесценции, предпочтительно с помощью второго антитела, которое несет определяемую с помощью хемилюминесценции сигнальную молекулу. Гранулы предпочтительно являются химически инертными и включают инертные углеводы.

В предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает следующие стадии:

(a) подготовка носителя обнаружения, который содержит первое антитело к одному и/или нескольким антигенам Trichinella;

(b) приведение в контакт носителя обнаружения с образцом;

(c)(i) приведение в контакт носителя обнаружения и при необходимости связанного с ним образца материала со вторым антителом к одному и/или нескольким антигены Trichinella, при этом второе антитело связано с сигнальной молекулой и при этом наличие сигнала сигнальной молекулы показывает наличие Trichinella в образце; или

(c)(ii) приведение в контакт носителя обнаружения и при необходимости связанного с ним образца материала с одним или несколькими антигенами Trichinella, при этом антигены из (c)(ii) связаны с сигнальной молекулой и образованы таким образом, что они вызывают связывание антигенов (а) с первыми антителами путем конкурентного вытеснения, при этом наличие сигнала сигнальной молекулы показывает наличие Trichinella в образце.

В другом предпочтительном варианте осуществления проводят стадии промывки после стадий приведения в контакт (b), (c)(i) и (c)(ii).

Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления способа, применения и комплекта сигнальные молекулы наблюдают с применением аналитических способов, таких как флуорометрия, измерение хемилюминесценции, измерение радиоактивности, измерение электронного магнитного резонанса, ультрафиолет-видимая абсорбционная спектроскопия, масс-спектрометрия, ядерно-резонансные, магнитно-резонансные и электрохимические способы измерения.

Пригодные антигены Trichinella известны из уровня техники. Предпочтительно в случае антигенов речь идет о тивелозе.

В предпочтительном варианте осуществления первое и второе антитела направлены против различных эпитопов одних и тех же антигенов.

В другом предпочтительном варианте осуществления первое и/или второе антитело выбирают из группы, состоящей из антител, которые направлены против (необязательно связанной с протеином субстрата) посттрансляциональной модификации, предпочтительно включающей тивелозу молекулы, антител, которые направлены против экскреторного-секреторного (E/S)-антигена Trichinella, и антител, которые получают с применением лизатов Trichinella spiralis.

Выражение "антитело", как оно употребляется в данной работе, относится к белкам из класса глобулинов, которые образуются в позвоночных животных как реакция на определенные вещества, так называемые антигены. Антитела являются компонентами иммунной системы. Антитела производятся из класса белых клеток крови, B-лимфоцитов. Они различаются по классам, а именно: иммуноглобулины A, иммуноглобулины D, иммуноглобулины Е, иммуноглобулины G, иммуноглобулины M, иммуноглобулины W и иммуноглобулины Y. В предпочтительном варианте осуществления первое и/или второе антитела представляют собой иммуноглобулин G.

В предпочтительном варианте осуществления применяемое антитело выбирают из группы, состоящей из антител, включающих VH последовательность согласно SEQ ID NO:1 и VL последовательность согласно SEQ ID NO:2, антител, включающих VH последовательность согласно SEQ ID NO:3 и VL последовательность согласно SEQ ID NO:4, антител 18H1(IgG2a), которые связывают тивелозу и описаны в [11], и их вариантов.

Выражение «варианты», как оно употребляется в данной работе, относится к антителам и VH- и VL последовательностям, которые по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% или по меньшей мере на 99% обладают гомологией относительно контрольных антител или контрольной последовательности. Предпочтительно применяют только такие варианты, которые имеют биологическую активность. Выражение «Биологическая активность», как оно употребляется в данной работе, означает в частности то, что соответствующие пептиды по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% имеют специфическую связывающую активность их контрольных антител или контрольных последовательностей. Можно применять функциональные фрагменты или производные антител или их вариантов, например, Fab, F(ab'), Fr, ScTv и dAb или аптамеры с соответствующей связывающей активностью.

В предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению измельчение образца экстрактов тканей происходит исключительно механически. То есть в данном варианте осуществления не происходит никаких стадий измельчения, которые осуществляются химически и/или ферментативно с помощью извне добавленных молекул или соединений. В другом предпочтительном варианте осуществления в способе не добавляется внешних дополнительных химических и/или ферментативных молекул в таком количестве, что протеолитическая активность возрастает более, чем в четыре раза, более чем в три раза или более чем в два раза по сравнению с протеолитической фоновой активностью.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению в образцах экстрактов тканей по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% всех сопряжений протеаз не расщепляются. Эти протеазы обладают гидролитической активностью по отношению к пептидным связям и принадлежат к EC-классу 3.4. В другом предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению в образцах экстрактов тканей по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% сопряжений пепсина, химозина, катепсина E, папаина, катепсина K, каспазы, кальпейна, циталидоглутамической пептидазы, термолизина, коллагеназы, карбоксипептидазы А и Б, химотрипсина, плазмина, тромбина, трипсина, гранзима и/или калликреина не расщепляются.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению в образцах экстрактов тканей по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% сопряжений пепсина, химозина, химотрипсина и/или трипсина не расщепляется. В частности в образце экстрактов тканей по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% сопряжений пепсина не расщепляется.

Сопряжения упомянутых пептидов достаточно известны в уровне техники, например, описаны на сайте https://web.expasy.org/peptide_cutter/peptidecutter_enzymes.html#Peps, и включены в виде ссылки в описание.

Определение идентичности/гомологии последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот происходит с помощью сравнения последовательностей. Это сравнение последовательностей основано на известном и обычно применяемом в уровне техники BLAST-алгоритме (см. [12] и [13]) и происходит принципиально таким образом, что подобные последовательности нуклеотидов или аминокислот в последовательностях нуклеиновых кислот или аминокислот расположены друг за другом. Табличное сравнение взаиморасположений соответствующих положений обозначают как выравнивание. Кроме того в состоянии техники доступен алгоритм FASTA. Сравнение последовательностей (выравнивание), в частности множественное сравнение последовательностей, осуществляют с помощью компьютерных программ. Часто применяют, например, типы программ Clustal (см. например, [14]), T-Coffee (см. например, [15]) или программы, которые основаны на указанных программах и, соответственно, алгоритмах. Кроме того, возможно сравнение последовательностей (выравнивание) с помощью компьютерной программы Vector NTI® программный комплект 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) с заявленными стандартными параметрами, у которой модуль AlignX для сравнения последовательностей основан на ClustalW.

Такое сравнение позволяет оценить сходство сравниваемых последовательностей друг с другом. Оно указывается обычно в процентах идентичности, что означает содержание идентичных нуклеотидов или остатков аминокислот в тех же или в основном соответствующих положениях. Кроме того, принятое понятие гомологии относится к последовательностям аминокислот со стабилизированным обменом аминокислот, принимая во внимание аминокислоты со сходной химической активностью, так как внутри белков они выполняют в большинстве случаев сходные химические действия. Поэтому сходство сравниваемых последовательностей может быть указано также как процент гомологии или процент сходства. Указания об идентичности и/или гомологии могут встречаться во всем полипептиде или гене или только в отдельных областях. Поэтому гомологичные или идентичные области различных последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот определяются соответствиями в последовательностях. Такие области часто имеют идентичные функции. Они могут быть малы и включать только немного нуклеотидов или аминокислот. Часто такие маленькие области для общей активности протеина выполняют существенные функции. Поэтому может иметь смысл получать соответствия последовательностей только в отдельных, возможно маленьких областях. Однако если не указано иначе указания идентичности или гомологии относятся в данной заявке ко всей длине указанных последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот.

Выражение "образованы таким образом, что вызывают связывание антигенов с антителами путем конкурентного вытеснения", как оно употребляется в данной работе, относится к антигенам, которые конкурируют с уже связанными антигенами за соединение с данным антителом. Конкурентные антигены имеют структурное сходство друг с другом и поэтому данные антигены можно обозначить как структурные аналоги. Вытесняющий антиген может обладать более высоким сродством к антителу, чем вытесненный антиген и/или вытесняющий антиген имеется в наличии в более высокой концентрации, чем вытесненный антиген.

Выражение "Антиген", как оно употребляется в данной работе, относится предпочтительно к веществу, с которыми антитела и определенные рецепторы лимфоцитов могут специфически связываться. Антигены могут представлять собой белки, а также гликопротеины, углеводы, липиды или другие вещества. В данном случае антигены представляют собой предпочтительно белки или посттрансляциональные модифицированные белки.

Во втором аспекте данное изобретение относится к применению системы обнаружения для обнаружения Trichinella, предпочтительно для санитарного осмотра мяса, при этом система обнаружения включает (a) носитель обнаружения, который содержит первое антитело к одному и/или нескольким антигенам Trichinella, и (b)(i) второе антитело к одному и/или нескольким антигенам Trichinella, при этом второе антитело связано с сигнальной молекулой, или (b)(ii) один или несколько антигенов Trichinella, которые связаны с сигнальной молекулой, при этом антигены aus (b)(ii) образованы таким образом, что они вызывают связывание антигенов (а) с первыми антителами путем конкурентного вытеснения.

Выражение "система обнаружения", как оно употребляется в данной работе, включает предпочтительно (a) носитель обнаружения как здесь определено и (b) связанный с сигнальной молекулой антиген или антитело. Компоненты из (a) и (b) действуют вместе синергически таким образом, что при добавлении исследуемого антигена образуется комплекс из всех участвующих молекул, который при наличии сигнала позволяет произвести обнаружение исследуемого антигена в образце.

Выражение "носитель обнаружения", как оно употребляется в данной работе, относится предпочтительно к веществу, с которым антитело связано с одним и/или несколькими антигенам Trichinella. Носитель может быть твердым объектом, таким как предметное стекло, 6-луночный-, 12-луночный-, 96-луночный- или 384-луночный-планшет, мембрана, предпочтительно нитроцеллюлозная мембрана, фильтрующий материал, гранулы, предпочтительно магнитные гранулы или материал для тонкослойной хроматографии. Альтернативно носитель обнаружения также может представлять собой шарики/гранулы, при этом диаметр таких гранул предпочтительно меньше 1000 мкм, 800 мкм, 600 мкм, 400 мкм, 200 мкм, 100 мкм, 90 мкм, 80 мкм, 70 мкм, 60 мкм, 50 мкм, 40 мкм, 30 мкм, 20 мкм, 10 мкм или 5 мкм. Носитель обнаружения может предпочтительно включать полимер, стекло, металл или комбинацию из них.

В третьем аспекте данное изобретение относится к комплекту, включающему (a) носитель обнаружения, первое антитело к одному и/или нескольким антигенам Trichinella, и (b)(i) второе антитело к одному и/или нескольким антигенам Trichinella, при этом второе антитело связано с сигнальной молекулой, или (b)(ii) один или несколько антигенов Trichinella, которые связаны с сигнальной молекулой, при этом антигены из (b)(ii) образованы таким образом, что они вызывают связывание антигенов (а) с первыми антителами путем конкурентного вытеснения.

Выражение "комплект", как оно употребляется в данной работе, относится предпочтительно к упаковке, которая снабжена емкостью (например, бутылкой, панелью, пробиркой, кюветой и т.д.), которая содержит специфический материал, в данном случае в частности определенный выше носитель обнаружения и связанный с сигнальной молекулой антиген или антитело. Предпочтительно к комплекту прилагается руководство по применению упомянутых выше материалов. Руководство по применению может быть написано на бумаге или другом средстве или быть напечатанным, или может предоставляться в форме электронного средства, такого как магнитная лента, читаемый на компьютере диск или лента или CD-диск. Предпочтительно комплект содержит положительный контроль, предпочтительно с определяемым антигеном и/или образец для калибровки или получения калибровочной кривой.

В предпочтительном варианте осуществления комплект также включает описание способа по изобретению для обнаружения Trichinella.

На Фиг. 1 показаны E/S-белки капсулированной личинки Trichinella spiralis. E/S-белки выделяются из личинки в капсулу и окружающие ткани. Благодаря измельчению ткани белки в материале образца высвобождаются.

На Фиг. 2 показана схема инкубации Trichinella Antigen-Capture ELISA. 1) Зафиксированный на пластине для микротитрования Anti-Trichinella-AK C9, 2) Образец (Trichinella-антиген), 3) Биотинилированный обнаружение-AK B7, связанный с стрептавидином с PolyHRP80.

На Фиг. 3 показано определение размеров частиц измельченной c помощью ножевой мельницы GM200 от Retsch свинины. 100×1 г мышечной ткани диафрагмы измельчались с 200 мл PBS в GM200 при 10000 об/мин 6 или 9 минут. Размер частиц представлен относительно Q3[%] (объемных процентов). Измеряли примерно 60 миллионов частиц. A) Определение размеров частиц с помощью Camsizer®XT. n=3. B) Определение размера частиц с помощью HORIBA LA-960. n=1.

На Фиг. 4 показан снимок отдельной частицы мяса во время измерения на Camsizer®XT. Форма чаще всего не круглая, а продолговатая, похожая на волокно, так что ширина снижает соотношение длин.

На Фиг. 5 показано испытание антител Anti-[TRISP][B7] и Anti-[TRISP][C9] для обнаружения Trichinella. A)-D) T. spiralis-IIFT (непрямой иммунофлуоресцентный анализ): AK B7 и AK C9 инкубированы с концентрацией 2 мкг/мл. A)+B) инкубация с AK B7: AK показывает как в случае инкапсулированной личинки Trichinella в поперечном разрезе, так и в случае мышечной личинки отчетливую реакцию; C)+D) инкубация с AK C9: AK, как B7, показывает как в случае инкапсулированной личинки Trichinella в поперечном разрезе, так и в случае мышечной личинки отчетливую реакцию; E) вестерн-блоттинг: нанесено 5 мкг T. spiralis лизата и инкубация происходила с AK B7 и AK C9 (конц. 0,4 мкг/мл).

На Фиг. 6 показана проверка специфичности антител Anti-TRISP[B7] и Anti-TRISP[C9] с помощью вестерн-блоттинга. Следы 1) Trypanosoma cruzi, 2) Ascaris suum, 3) Strongyloides ratti, 4) Toxocara cati, 5) Toxoplasma gondii, 6) Salmonella typhimurium, 7) Salmonella cholerasuis Stamm A, 8) Salmonella cholerasuis штам B, 9) Salmonella typhisuis, 10) Trichuris suis, 11) Trichinella spiralis. Нанесение: по 5 мкг лизата. Инкубация с AK B7 (конц. 0,4 мкг/мл, 2 ч).

На Фиг. 7 показаны результаты T. spiralis Antigen-Capture ELISA. A) предел обнаружения T. spiralis Antigen-Capture ELISA. Нанесение в различных концентрациях E/S-антигене к O.D. B) T. spiralis Antigen-Capture ELISA с E/S-антигеном, положительный и отрицательный экстракт тканей как образцы материала. В положительном образце экстракта тканей находились примерно 100 инкапсулированных личинок Trichinella. Пунктирная линия: граница обнаружения.

На Фиг. 8 показаны результаты T. spiralis Antigen-Capture ELISA с положительным и отрицательным экстрактом тканей в качестве материала образца. В положительном экстракте тканей находилось примерно 100 инкапсулированных личинок Trichinella. Измельчение материала образов происходило 3, 6 и 9 мин. Пунктирная линия: граница обнаружения n=3.

На Фиг. 9 показана схема инкубации вручную инкубированной Trichinella при хемилюминесценнтном иммунном анализе. 1) На магнитных гранулах зафиксированы Anti-Trichinella-уловитель-AK 18H1, 2) Образец (антиген Trichinella), 3) биотинилированное Anti-Trichinella-Обнаружение-AK B7, 4) экстравидин/акридин-реагент.

Фиг. 10 показана схема обработки прибора хемилюминесцентного анализа для автоматического хемилюминесцентного иммунного анализа трихинеллы. Магнитный стержень транспортирует с зафиксированным Anti-Trichinella-AK 18H1 гранулы последовательно в заполненные различными реагентами реакционные сосуды. Образец и триггер B добавляются автоматически.

На Фиг. 11 показаны результаты автоматизированного хемилюминесцентного иммунного анализа трихинеллы. Размер частиц измельченной свинины после 2, 3, 5 и 7 мин. Измеренных анализатором размеров частиц LA-960 фирмы HORIBA. Кроме образца мяса - отрицательного и снабженного 6, 13 и 30 личинками трихинеллы, от 2 до 7 мин. измельчали. Образующийся экстракт тканей инкубировали автоматизированным CLIA. Результаты указаны в относительных световых единицах (RLU).

Последовательности:

В данном изобретении раскрывают различные последовательности пептидов, в частности

SEQ ID NO:1 (Anti-[TRISP][B7] VH):

AVTLDESGGGLQTPRGGLSLVCKASGYTFSSHNMAWVRQAPGKGLEFVAGISNTGSFTLYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKHAGVGLYSIDAWGHGTEVIVSS

SEQ ID NO:2 (Anti-[TRISP][B7] VL):

ALTQPSSVSANLGGTVKITCSGGTSDYGWYQQKAPGSAPVTLIYDNTNRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVQAEDEAVYFCGSADRTYAGVFGAGTTLTVL

SEQ ID NO:3 (ANTI-[TRISP][C9] VH):

AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSISSYSMQWVRQAPGKGLEWVAGIYYDGNTWYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLRLNNLRAEDTATYFCAKYAGGYSIDAWGHGTEVIVSS

SEQ ID NO:4 (ANTI-[TRISP][C9] VL):

ALTQPSSVSANPGETVKITCSGSSGSYGWYQQKSPGSGPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSASGSTATLTITGVQAEDEAVYFCGGYDSSTYVGIFGAGTTLTVL

SEQ ID NO:5 (ANTI-[TRISP][18H1] VH):

QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGLSLTSNSVGWIRQPPGKGLEWMGIIWSNGGTDYNSAIKSRLSISRDTSKSQVFLKMHSLQTEDTAMYFCARGPYYGSYRLGYFDYWGQGVMVTVSS

SEQ ID NO:6 (ANTI-[TRISP][18H1] VL):

DVVMTQSPSSLAVSAGETVTLNCQSSQSLLYSGTQNNYLAWYQQKPGQSPKLLISWASTRQSGVPLRFIGSGSGTDFTLTITSVQAEDLAIYYCQQFYDTPLTFGSGTKLEIK

Далее данное изобретение иллюстрируется неограничительными примерами, из которых можно узнать о дополнительных признаках, вариантах осуществления, аспектах и преимуществах данного изобретения.

Пример 1: Материалы и Методы

Материалы

Материал	Название	Номер продукта	Производитель
Приборы	Автоматический хемилюминесцентный анализатор SuperFlex		PerkinElmer
	Biometra WT 15 042-400 шейкер		Biometra
	Centro XS³ LB 960 микропланшетный люминометр		Berthold Technologies
	GM 200 Zubehör: емкость для измельчения нержавеющая сталь	03 045 0050	Retsch
	GM 200 Zubehör: нож с волнообразной заточкой	02 446 0057	Retsch
	HydroFlex™ Промыватель микропланшетов, магнитные гранулы		Tecan
	Инкубатор WTB		BINDER
	Ножевая мельница GRINDOMIX GM 200	20 253 0001	Retsch
	MTS 2/4 цифровой микропланшетный шейкер	3208001	IKA
	Novex Mini Cell		Invitrogen
	Фотометр: Sunrise™		Tecan
	Power Pac HV		Bio-Rad
	Настольна центрифуга: Biofuge Fresco		Heraeus
	Промыватель Columbus		Tecan
	XCell SureLock™ Mini-Cell система для электрофореза		ThermoFisher Scientific
	Центрифуга Avanti® J-E (Ротор: JA-10)		Beckman Coulter
Наклонный роликовый смеситель		IKA
Применяемые материалы	iD PAGE Gel, 4-20%	ID-PA4201-015	Eurogentec
	Dynabeads™ M-280 активированные тозилом	14203	ThermoFisher Scientific
	планшеты для микротитрования LockWell Maxisorb	446475-EUR	ThermoFisher Scientific
	Мембрана из нитроцеллюлозы	11306	Sartorius
	Nunc™ F96 MicroWell™ Планшеты из полистирола, белые	136101	ThermoFisher Scientific
	Емкости для реагентов (SuperFlex)		PerkinElmer
Защитный колпачок для магнитного стержня(SuperFlex)		PerkinElmer
Среды Растворы и буферные растворы	Раствор сульфата аммония (3 M)		Sigma-Aldrich
	Буферный раствор для разбавления антител		EUROIMMUN
	Блокирующий буферный раствор ELISA		EUROIMMUN
	хромоген/субстрат раствор ELISA TMB/H2O2	ZE 1200-0112 T	EUROIMMUN
	ферментный конъюгат щелочная-фосфатаза-маркированный Anti-Human-IgG (Ziege)	AE 142 1030	EUROIMMUN
	экстравидин/акридин-реагент		EUROIMMUN
	буферный раствор для покрытия гранул		EUROIMMUN
	PBS	ZF 1100-1000 T	EUROIMMUN
	PBS+0,05% твин-20 (PBST)	ZF 1110-0102 T	EUROIMMUN
	StabilCoat® Plus	SC01	Surmodics
	останавливающий раствор ELISA (0,5 M серная кислота)	ZE 1210-0112 T	EUROIMMUN
	Раствор для субстрата блоттинг нитроголубойтетразолиумхлорид/5-бром-4-хлор-3-тндолилфосфат (NBT/BCIP)	ZW 1020-0130 T	EUROIMMUN
	Триггер A для CLIA		EUROIMMUN
	Триггер B для CLIA		EUROIMMUN
	трис-буферный раствор (1 M)	#1218	Gerbu Biotechnik
	Промывной буферный раствор Blot	ZW 1100-1005 T	EUROIMMUN
	Промывной буферный раствор ELISA	ZE 1120-1000 T	EUROIMMUN
Промывной буферный раствор Plus Blot	ZW 1110-1005	EUROIMMUN
Готовые растворы и комплекты	Color Prestained Protein Standard, Broad Range (11-245 kDa)	P7712S	New England BioLabs
	NuPAGE® LDS Sample Buffer (4X)		ThermoFisher Scientific
NuPAGE™ MOPS SDS Running Buffer (20X)	NP0001	ThermoFisher Scientific
Антигены	Ascaris suum		Prof. Dr. Christina Strube, Tierärztliche Hochschule Hannover, DE
	Salmonella typhimurium		Prof. Dr. Michael Hensel Mikrobiologie Universität Osnabrück
	Salmonella Cholerasuis штамм A
	Salmonella Cholerasuis штамм B
	Salmonella Typhisuis
	Strongyloides ratti		EUROIMMUN
	Toxocara cati		EUROIMMUN
	Toxoplasma gondii	BA110VS	Virion/Serion
	Trichinella spiralis E/S-Antigen		EUROIMMUN
	Trichinella spiralis Lysat		EUROIMMUN
	Trichuris suis		Prof. Dr. Eva Liebau Molecular Physiology Universität Münster
Trypanosoma cruzi		Virion/Serion
Антитела	Anti-[TRISP][B7]		EUROIMMUN
	Anti-[TRISP][C9]		EUROIMMUN
Anti-[TRISP][18H1]		EUROIMMUN/ Prof. Dr. Judith Appleton, Cornell University, Ithaca, USA
Прочие материалы	EZ-Link™ NHS-PEG12-биотин	21312	ThermoFisher Scientific
	IIFT Trichinella spiralis "инкапсулированные личинки"		EUROIMMUN
	IIFT Trichinella spiralis "мышечные личинки"		EUROIMMUN
	Образцы мяса свиньи, снабженные различным количеством Trichinella-мышечных личинок		Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)
	мясо свиньи ствол диафрагмы		Fleischerei Prösch, Krummesse
	Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder		ThermoFisher Scientific
	стрептавидин-PolyHRP80, 1 мг/мл раствор	#SP80C	SDT (Stereospecific Detection Technologies)
	Мясо свиньи, инфицированное трихиннелезом с от 20 до 50 личинок на грамм		Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)
Zeba™ Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 10 мл	87772	ThermoFisher Scientific

Методы

Способ получения образцов экстракта тканей

В данном способе обнаружения мясо должно быть не переварено ферментативно, а только механически измельчено. При этом размер частиц мяса должен быть <200 мкм. Личинки имеют размер коллагеновых капсул примерно 200-600 мкм длиной и 200-300 мкм шириной, так что при желательном размере частиц <200 мкм предполагают, что инкапсулированные личинки Trichinella по меньшей мере один раз должны быть захвачены режущим ножом устройства для измельчения. В капсуле находится множество E/S-белков, которые при измельчении высвобождаются и находятся затем свободно в материале образца (фигура 1). При измельчении личинок дополнительно могут быть обнаружены соматические белки.

После измельчения происходит обнаружение антигена в форме Antigen-Capture ELISA анализа или ручного или автоматического хемилюминесцентного иммунного анализа.

Подготовка образцов для исследования

Обычно на бойне отбирали примерно 5 г мяса от каждого животного. Образец по стандарту отбирали из мышечной части диафрагмы уже убитого животного. Для исследования мяса на трихинеллез от одной свиньи использовали 1 г образца материала. Для других частей тел, таких как язык или междуреберные мышцы количество образца может отклоняться. Как правило, объединяли 100 образцов свинины, так что количество образцов составляло 100×1 г. Образцы охлаждали до 4°C.

Измельчение образцов мяса

Образец материала (100×1 г мяса) помещали в охлажденную до 4°C емкость для измельчения в устройстве для измельчения. Для измельчения применяли ножевую мельницу Grindomix GM 200 от Retsch. Принцип измельчения основан на разрезании образца. Ножевая мельница оснащается ножом с волнообразной заточкой, так что даже волокнистые материалы, такие как мышечные ткани можно измельчать очень мелко. К образцу добавляли 200 мл PBS с температурой 4°C. При 10000 об/мин и вместе с этим при максимальной мощности образец материала измельчали в течение указанного времени, например, 9 мин.

Для того чтобы проверить произошло ли измельчение мяса, проводили измерение размера частиц с помощью Camsizer®XT от фирмы Retsch и LA-960 от фирмы HORIBA. LA-960 основан на функциональном принципе статического лазерного рассеяния, тогда как Camsizer®XT основан на динамической обработке изображений. Три образца мяса после 6 мин. или 9 мин. извлекали и сразу после этого исследовали. Измерение проводили в среднем у 60 миллионов частиц. Размер частиц измеряли в x_{c min} и согласно DIN 66141 определяли: самый маленький диаметр частиц в измерениях, максимальный диаметр в пределах проекции частиц (англ яз: particle diameter which is the shortest chord of the measured set of maximum chords of a particle projection) [8].

Центрифугирование

После измельчения из стакана для измельчения отбирали от 1 мл до 15 мл образца с помощью пипетки. Седиментация грубых частиц в образце происходила при 10-минутном центрифугировании при 5000 x г и 4°C. Жидкая фракция после седиментации является образцом материала для последующего обнаружения антигенов и означается как экстракт тканей.

Способ обнаружения Trichinella spiralis в образце экстракта тканей

Получение образцов материала

T. spiralis лизат

Мышечные личинки T. spiralis (ML) были предоставлены институтом Justyna Bień vom Witold Stefański PAS в Варшаве. 120000 мл 10 мин. центрифугировали при 16000 x г и комнатной температуре (RT), так что все личинки были гранулированы. Жидкую фракцию выбрасывали и добавляли 1 мл PBS. Личинки подвергали пяти циклам замораживания-оттаивания и затем измельчали на ручном гомогенизаторе. Затем образцы обрабатывали ультразвуком: 20 циклов по 5 сек. со средним мощностью и интервалом между обработками 5 сек. Выдержка на льду. Далее происходило 20-минутное центрифугирование при 16000 x г и 4°C. Жидкая фракция представляла собой антиген T. spiralis лизата.

E/S-антиген

E/S-антиген T. spiralis мл предоставлялся институтом Justyna Bień vom Witold Stefański PAS в Варшаве.

Получение антител

Антитела, которые применяли в анализе Antigen-Capture ELISA, получали с помощью Phage Display способа [9]. Последовательности изменяющихся участков тяжелых и легких цепочек (VH и VL) обоих антител Anti-[TRISP][B7] и Anti-[TRISP][C9] (сокращенно: AK B7 и AK C9) выглядели следующим образом:

Anti-[TRISP][B7] VH (SEQ ID NO:1):

AVTLDESGGGLQTPRGGLSLVCKASGYTFSSHNMAWVRQAPGKGLEFVAGISNTGSFTLYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKHAGVGLYSIDAWGHGTEVIVSS

Anti-[TRISP][B7] VL (SEQ ID NO:2):

ALTQPSSVSANLGGTVKITCSGGTSDYGWYQQKAPGSAPVTLIYDNTNRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVQAEDEAVYFCGSADRTYAGVFGAGTTLTVL

ANTI-[TRISP][C9] VH (SEQ ID NO:3):

AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSISSYSMQWVRQAPGKGLEWVAGIYYDGNTWYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLRLNNLRAEDTATYFCAKYAGGYSIDAWGHGTEVIVSS

ANTI-[TRISP][C9] VL (SEQ ID NO:4):

ALTQPSSVSANPGETVKITCSGSSGSYGWYQQKSPGSGPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSASGSTATLTITGVQAEDEAVYFCGGYDSSTYVGIFGAGTTLTVL

Биотинилирование антител Anti-[TRISP][B7]

AK B7 для Antygen-Capture ELISA c EZ-Link™ NHS-PEG12-биотином при 20-кратном избытке один час при комнатной температуре инкубировали на ротационном шейкере. Для того чтобы удалить избыточный биотин, антитело (AK) согласно инструкции производителя с помощью разделительной хроматографической колонны (Zeba™ Spin Desalting Columns) было очищено.

SDS PAGE и вестерн-блоттинг для SDS PAGE по 5 мкг T. spiralis лизата или лизата Trypanosoma cruzi, Ascaris suum, Strongyloides ratti, Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Salmonella typhimurium, Salmonella cholerasuis штам A, Salmonella cholerasuis штам B, Salmonella typhisuis и Trichuris suis вносили в полиакриламидный гель и проводили электрофорез 50 мин, при 175 В в MOPS-буфере. Перенос происходил на нитроцеллюлозную мембрану 60 мин, при 400 мА в буферном растворе. Мембрану для блокирования инкубировали 30 мин. на шейкере. Затем AK B7 и C9 переносили в промывной буферный раствор с концентрацией 0,4 мкг/мл и в течение одной ночи инкубировали не шейкере. После промывки моющим буферным раствором мембрану инкубировали в моющем буферном растворе с разбавленным ферментным конъюгатом "щелоче-фосфотаза-маркированный Anti-Human-IgG" от EUROIMMUN. Затем после еще одной стадии промывки добавляли раствор субстрата (NBT/BCIP) и инкубировали до заметного изменения окраски.

Непрямой иммунофлуоресцентный тест

Для того чтобы проверить, какие структуры связывают проявленные AK, разработали непрямой иммунофлуоресцентный тест для T. spiralis. BIOCHIPS были снабжены замороженными срезами мышечных личинок T. spiralis и инкапсулированными личинками. Инкубация и микроскопия происходила согласно руководству Anti-Schistosoma-mansoni-IIFTs от EUROIMMUN (номер FI 2300-1005 G). В качестве образцов AK B7 и C9 с концентрацией 2 мкг/мл вносили на BIOCHIPS.

Обнаружение антигенов с помощью Antygen-Capture ELISA

Для обнаружения антигенов применяли Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) в качестве способа обнаружения. 96-луночный планшет для микротитрования покрывали 0,25 мкг/мл AK C9 в PBS и выдерживали одну ночь при 4°C. На следующий день планшет ля микротитрования один раз промывали PBST (PBS+0,05% твин-20), блокирующим буферным раствором блокировали 2 часа и затем 2 часа сушили. В качестве обнаружения связанных с AK C9 антигенов применяли AK B7 с концентрацией 0,05 мкг/мл и стрептавидин-polyHRP80 с концентрацией 0,1 мкг/мл вместе с AK-буферным раствором для разбавления и в течение ночи инкубировали.

Инкубация образцов

Инкубация происходила как представлено на фигуре 2 схеме. В качестве образца E/S-антиген T. spiralis в различных концентрациях (0-50 нг/мл) и образцы тканевых экстрактов в объеме 100 мл вносили на планшет для микротитрования. Инкубация происходила один час при комнатной температуре на ротационном шейкере. "Положительный" образец экстрактов тканей получали таким образом, что перед измельчением зараженное трихинеллезом мясо свиньи добавляли к отрицательным тканям ствола диафрагмы таким образом, что в образце находилось примерно 100 инкапсулированных личинок Trichinella.

После шести промывок промывным буферным раствором конъюгат объемом 100 мкл также один час инкубировали при комнатной температуре на ротационном шейкере. Затем снова шесть раз промывали и вносили субстрат. После 15 мин. реакцию прекращали с помощью останавливающего раствора и определяли оптическую плотность (O.D.) образцов с помощью фотометра с длиной волны 450 нм.

Пример 2: Результаты

Измельчение образцов мяса

Сразу после измельчения мяса свиньи ножевой мельницей GM200 проводили определение размеров частиц с помощью Camsizer®XT и HORIBA LA-960. Оценку образцов проводили после 6 или, соответственно, 9 мин измельчения. Результаты определения распределения масс представлены на фигуре 3, где размер частиц [мкм] нанесен на диаграмме относительно Q3 [%]. Q3 представляет собой долю частиц в процентах, которые меньше, чем x по отношению ко всему объему. Так как оба два устройства для измерения размеров частиц основаны на разных методах измерения, то результаты отклоняются друг от друга.

Результаты измерения на HORIBA LA-960 показали, что 95% частиц <26 мкм и все частицы < 100 мкм. Измерения на Camsizer®XT показали, что 95% частиц < 300 мкм. Только 70% частиц были < 100 мкм. На фигуре 4 в качестве примера представлено какие формы имеют частицы мяса. Из-за мышечных волокон и миофибрилл структура очень волокнистая, что сильно снижает отношение ширины к длине.

В любом случае коллагеновая капсула личинки Trichinella, если имеется, статистически по меньшей мере один раз будет разрезана ножом, так что E/S-белки смогут высвободиться. Эти высвобожденные белки на следующей стадии можно обнаружить с помощью Antigen-Capture ELISA.

Получение образцов материала и антител

Для того чтобы проверить, пригодны ли антитела Anti-[TRISP][B7] и Anti-[TRISP][C9] для обнаружения антигенов T. spiralis, в качестве проверки работоспособности проводили непрямой иммуннофлуоресцентный тест (IIFT) и вестерн-блоттинг. Результаты представлены на фигуре 5.

При применении AK B7 разрезанная капсула флуоресцирует сильнее всего (фигура 5A). Личинка внутри и отдельные протеины на поверхности капсулы также флуоресцируют. Замороженные срезы мышечных личинок показали отчетливую реакцию на внешней мембране (фигура 5B). В поперечном разрезе инкапсулированной личинки вся личинка флуоресцирует сильнее всего при инкубации с AK C9 (фигура 5 C). Отдельные белки на поверхности капсулы и разрезанная капсула флуоресцирует слабо. У мышечной личинки не только внешняя мембрана показывает отчетливую реакцию, но и внутренняя часть личинки (фигура 5D)

В вестерн-блоттинге также можно видеть отчетливые реакции для AK B7 и C9 (фигура 5 E). Оба AK показали идентичные полосы. Сильные полосы получились при. 48, 50, 52, 60, 65 и 110 кДа. Эпитоп, который связывается с AK, появляется в нескольких белках или гликопротеинах, что может положительно сказываться на обнаружении очень небольших концентраций антигенов Trichinella в образце материала.

Чтобы проверить, связываются ли AK исключительно с специфическими структурами T. spiralis и никакими антигенами структур других паразитов и/или бактерий, проводили вестерн-блоттинг. При этом вносили лизаты патогенов, которые встречаются у свиней. Результаты показаны на фигуре 6. Протестированные лизаты не обладают структурами, которые связываются с AK B7 или AK C9. Ошибочно-положительная реакция позднее может быть исключена в анализе Antigen-Capture ELISA для данных патогенов с высокой вероятностью.

Antigen-Capture ELISA

Для проверки работоспособности разработанного анализа T. spiralis ELISA применяли различные концентрации E/S-антигенов в тесте (фигура 7A). Предел обнаружения находился на граничном значении 0,3 O.D. при примерно 6 нг/мл.

На фигуре 7B представлены результаты образцов тканевых экстрактов, которые были поучены согласно описанному здесь способу. Испытывали как положительный образец, в котором примерно 100 инкапсулированных личинок находилось в свинине, а также отрицательный образец. Antigen-Capture ELISA показало отчетливое различие почти 2 O.D между положительным и отрицательным образцами экстракта тканей.

Концентрация T. spiralis антигена в образце экстракта тканей соответствовала примерно 30 нг/мл E/S-антигена. Следовательно, 100 измельченных инкапсулированных личинок высвобождают такое количество белков в мясной сок, которое может быть обнаружено анализом

Antigen-Capture ELISA с различными измельченными образцами материала

На фигуре 8 представлены результаты измельчения после 3, 6 и 9 мин. положительного и отрицательного экстрактов тканей. Можно видеть, что отрицательный экстракт тканей без личинок в образце материала не показал значимой реакции, так как O.D. в ELISA находится на границе 0,3. Напротив, экстракт тканей, который получен из мяса и в котором находилось примерно 100 инкапсулированных T. spiralis личинок, показал отчетливую реакцию с >1,5 O.D. Следует отметить воздействие степени измельчения, так как реакция с возрастающим временем измельчения возрастает. O.D. при 9-минутном измельчении на 0,5 выше, чем при 3-минутном измельчении.

Реакция в анализе ELISA в случае образца материала, который измельчали 3 мин. слабее, чем после измельчения 9 мин. Следовательно, более долгое измельчение образца материала приводит к большему количеству высвобожденных T. spiralis антигенов. Благодаря более долгому измельчению, вероятно, все инкапсулированные Trichinella личинки по меньшей мере один раз, а большей частью несколько раз подвергаются разрезанию ножом устройства для измельчения, так что по сравнению с более коротким измельчением больше обнаруживаемых антигенов предоставляются для анализа ELISA в образце материала.

Пример 3: Обнаружение антигенов с помощью ручного инкубирования и автоматизированного хемилюминесцентного иммунного анализа

Для ручного инкубирования и основанного на гранулах хемилюминесцентного иммунного анализа (CLIA) антитела уловители вносят не на планшет для микротитрования, а на магнитные гранулы. Для этого применяли тозил-активированные Dynabeads™. При этом гидрофобная полиуретановая поверхность была активирована группами тозила, вследствие чего антитела ковалентно связывались с гранулами. 4 мг гранул были уравновешены 1 мл 1 M трис-буферного раствора. К уравновешенным гранулам добавляли 30 мМ трис, 0,4 M сульфата аммония и 28 мкг Anti-[TRISP][18H1]-антител (сокращенно: AK 18H1). Инкубация происходила в течение ночи при 37°C на роликовой мешалке. На следующий день гранулы три раза промывали по 1 мл StabilCoat® Plus и затем в течение ночи при 37°C на роликовой мешалке инкубировали для того, чтобы блокировать еще реакционноспособные функциональные группы. После блокирования гранулы помещали в свежий StabilCoat® Plus и с концентрацией 1 мг/мл при 4°C хранили до применения.

Покрытые 18H1-AK гранулы для CLIA были с помощью пипетки помещены по 10 мкг в лунки планшета для микротитрования (NuncTM полистирольный планшет). Было добавлено 100 мкл неразбавленного образца экстрактов тканей и 30 минут инкубировано на ротационном шейкере. После трех автоматических промывок HydroFlex™ промывным раствором инкубировали 100 мкл биотинилированного B7-AK с концентрацией 0,1 мкг/мл 30 мин на ротационном шейкере. Затем производили три автоматические промывки. Для реакции хемилюминесценции экстравидин/акридин-реагент с концентрацией 80 нг/мл и объемом 100 мкл добавляли к гранулам и 15 мин инкубировали. После трех промывок происходило измерение с помощью Centro XS³ микропланшетного люминометра. Люминометр автоматически добавлял в каждую лунку по 100 мкл триггера A и B для того, чтобы началась реакция хемилюминесценции. Эмиссия света была измерена при длине волны 425 нм 1 сек. и указана в относительных световых единицах (Relative Light Units, RLU). Схема инкубации ручной инкубации CLIA показана на фиг. 9.

Автоматический и основанный на гранулах хемилюминесцентный иммунный анализ основан на структуре ручной инкубации CLIA. Различие состоит в том, что тест обрабатывается с помощью автоматизированного устройства для хемилюминесцентного анализа (Automated Chemiluminescent Analyzer SuperFlex, PerkinElmer). При этом гранулы магнитным стержнем по очереди погружают в различные реагенты. Магнитный стержень может производить электрическое поле и может таким образом принимать гранулы, отдавать и перемешивать реагенты в определенном интервале.

Для автоматизированного CLIA образцы экстрактов тканей помещали в ящик для образцов устройства для анализа. Емкости для реагентов заполняли как показано на фиг. 10. На реакцию применяли 10 мкг покрытых 18H1-AK гранул. Их инкубировали с 100 мкл образца экстракта такни и 100 мкл биотинизированного Anti-TRISP[B7]-AK с концентрацией 0,25 мкг/мл в течение 30 мин. Гранулы после инкубации извлекали с помощью магнитного стержня и 3x промывали в промывном буферном растворе (V=400 мкл). Затем происходила 10-минутная инкубация с 100 мкл 0,1 мкг/мл экстравидин/акридин-реагентом. После трех промывок гранулы были добавлены в 100 мкл триггера A, а триггер B (V=100 мкл) был в устройстве для анализа добавлен с помощью пипетки для того, чтобы началась реакция хемилюминесценци. Эмиссия света была измерена при длине волны 425 нм 1 сек. и указана в относительных световых единицах (Relative Light Units, RLU).

Результаты хемилюминесценного иммунного анализа (CLIA) с ручной инкубацией

Инкубировали различные концентрации образца T. spiralis лизата с помощью ручной инкубации CLIA. Предел обнаружения составлял 1 нг/мл T. spiralis лизата.

Результаты автоматизированного хемилюминесцентного иммунного анализа (CLIA)

Также различные концентрации лизата образца T. spiralis инкубировали в автоматизированном хемилюминесцентном иммунном анализе. Предел обнаружения составил 10 нг/мл T. spiralis лизата. Наряду с зараженными Trichinella образцами мяса также измельчали образцы мяса, которые были снабжены другим количеством мышечных личинок Trichinella. В них находилось от 3 до 30 личинок. Предел обнаружения автоматизированного CLIA для различных количеств мышечных личинок составил 3 личинки на 100 грамм мяса.

На фиг. 11 представлена корреляция между размером частиц и результатами CLIA измельченного Trichinella-положительного экстракта тканей. Видно, что размер частиц мяса с увеличением времени измельчения уменьшается, а реакция CLIA, напротив, возрастает. С большим измельчением мяса, и вместе с этим также личинок, увеличивается высвобождение антигенов Trichinella. Затем они могут быть обнаружены CLIA. Относительные световые единицы (RLU) возрастают также с увеличивающимся числом личинок в образце мяса. Trichinella-положительный экстракт тканей, который образован из образца мяса, снабженного 30 личинками, после 6 мин. измельчения показал более чем в 30 раз более высокую реакцию (150000 RLU), чем экстракт ткани с 6 личинками (50000 RLU).

Данное изобретение описано здесь в общем виде и в основном. Каждый из более узких видов и подгрупп, которые попадают под родовое раскрытие, образуют также часть изобретения. Это включает общее описание данного изобретения с ограничивающими условиями или отрицательными ограничениями, которые каждый объект из (под)группы удаляют, независимо от того, процитирован ли здесь удаленный объект или нет. Другие варианты осуществления содержатся в последующей формуле изобретения.

Специалист легко узнает, пригодно ли данное изобретение для того, чтобы выполнять задачи и достигать ожидаемых преимуществ, а также связанных с этим целей. Кроме того, специалисту сразу очевидно, что различные замещения и модификации раскрываемого здесь изобретения могут производиться без того, чтобы отклоняться от объема и духа данного изобретения. Описанный здесь способ, применение, обработки, молекулы и комплект являются репрезентативными для предпочтительных вариантов осуществления, которые являются примерными и не ограничивают объема изобретения. Изменения и другие применения предполагаемые специалистом, включены в объем изобретения и определены с помощью формулы изобретения. Приведение списком или обсуждение опубликованных документов в данном описании не должно восприниматься подтверждением того, что документ принадлежит к уровню техники или в основном известен.

Здесь наглядно объясненное изобретение может быть пригодным образом исполнено в отсутствие каких-либо элементов или ограничений, которые раскрываются здесь не специально. Таким образом, например, выражения "включая", "включительно", "содержит" и т.д. читаются всеобъемлюще и без ограничения. Слова "включать" или вариации, такие как "включает" или "включающий", понимаются в соответствии с этим как подразумеваемые, то есть например, так, что указанные данные включены, но не исключаются. Дополнительно использованные здесь понятия и выражения применялись в качестве выражения описания, а не ограничения, и нет намерения применять такие понятия и выражения для того, чтобы ограничивать какие-либо эквиваленты показанных и описанных признаков или их частей. То есть то, что различные модификации в пределах объема защиты заявленного изобретения возможны. Таким образом, следует понимать, что хотя данное изобретение с помощью примеров вариантов осуществления и опциональных признаков было специфически раскрыто, модификации и вариации данного изобретения, которые раскрываются здесь, могут использоваться специалистами на практике, и что такие модификации и вариации следует рассматривать как находящиеся в пределах объема защиты данного изобретения. Содержание всех документов и патентных документов, которые процитированы здесь, следует воспринимать как ссылки в их совокупности.

Сокращения

Сокращение	Английский	Немецкий
мкг		микрограмм
мкл		микролитр
AG		антиген
AK		антитело
CLIA	Chemiluminescent Immunoassay	Хемилюминисцентный иммунный анализ
E/S	Excretory/Secretory	экскреторный/секреторный
ELISA	Enzyme-linked Immunosorbent Assay
EU		Европейский Союз
г		грамм
IIFT		непрямой иммунофлуоресцентный тест
л		литр
мг		миллиграмм
мин.		минута
мл		миллилитр
ML		мышечная личинка
NBL	New Born Larvae	новорожденная личинка
NBT/BCIP		нитроголубойтетразолиумхлорид/5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат
нг		нанограмм
нм		нанометр
O.D.		оптическая плотность
оборотов в мин	rounds per minute	обороты в минуту
RT		комнатная температура
сек.		секунды
SDS PAGE	Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis	Натриядодецилсульфат-полиакриламидный гель для электрофореза

Список литературы

1. Dupouy J, Murrell KD: FAO/WHO/OIE guidelines for the surveillance, management, prevention and control of trichinellosis; 2007.

2. Mitreva M, Jasmer DP: WormBook: Biology and genome of Trichinella spiralis; 2006.

3. Zarlenga DS, La Rosa G, Pozio E, Rosenthal B: Identification and classification within the genus Trichinella, with special emphasis on nonencapsulated species. Vet Parasitol 2004, 125:75-78.

4. Liu M, Boireau P: Trichinellosis in China: epidemiology and control. Trends Parasitol 2002, 18(12):553-556.

5. BfR: Trichinellose - Erkennung, Behandlung und Verhütung. Information BfR 2007.

6. Kapel CM: Changes in the EU legislation on Trichinella inspection--new challenges in the epidemiology. Vet Parasitol 2005, 132(1-2):189-194.

7. Nöckler K, Serrano FJ, Boireau P, Kapel CM, Pozio E: Experimental studies in pigs on Trichinella detection in different diagnostic matrices. Vet Parasitol 2005, 132(1-2):85-90.

8. RKI: Ringversuch zum Nachweis von Trichinellen in Fleisch. In.: Robert Koch Institut; 2016.

9. Report on the validation of the Trichin-L antigen test kit of the Bio-Rad company In.: European Union Reference Laboratory for Parasites; 2010.

10. Retsch GmbH: CAMSIZER® Characteristics - Basis of definition DIN 66141. 2009.

11. Appleton J A, Schain LR, and McGregor DD. 1988. Rapid expulsion of Trichinella spiralis in suckling rats: mediation by monoclonal antibodies. Immunology 65: 487-492.

12. Altschul SF, Gish, W, Miller W, Myers EW & Lipman DJ. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403- 410

13. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang H, Miller W, and Lipman DJ. (1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402

14. Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500

15. Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217

--->

Список последовательностей

<110> Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG

<120> Обнаружение антигенов трихинеллы

<130> 17PP142EP2

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Anti-[TRISP][B7] VH

<400> 1

Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Arg Gly

1 5 10 15

Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser His

20 25 30

Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Gly Ala Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Ala Gly Val Gly Leu Tyr Ser Ile Asp Ala Trp Gly His

100 105 110

Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 103

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Anti-[TRISP][B7] VL

<400> 2

Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val

1 5 10 15

Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Thr Ser Asp Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln

20 25 30

Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asp Asn Thr Asn

35 40 45

Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ser Gly Ser

50 55 60

Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val

65 70 75 80

Tyr Phe Cys Gly Ser Ala Asp Arg Thr Tyr Ala Gly Val Phe Gly Ala

85 90 95

Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu

100

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ANTI-[TRISP][C9] VH

<400> 3

Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys

50 55 60

Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu

65 70 75 80

Arg Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Lys Tyr Ala Gly Gly Tyr Ser Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu

100 105 110

Val Ile Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 104

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ANTI-[TRISP][C9] VL

<400> 4

Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val

1 5 10 15

Lys Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln

20 25 30

Lys Ser Pro Gly Ser Gly Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn Asp Lys

35 40 45

Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser

50 55 60

Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val

65 70 75 80

Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Tyr Val Gly Ile Phe Gly

85 90 95

Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu

100

<210> 5

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ANTI-[TRISP][18H1] VH

<400> 5

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Asn

20 25 30

Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Trp Ser Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Ile Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met His Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Pro Tyr Tyr Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ANTI-[TRISP][18H1] VL

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Leu Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Gly Thr Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Leu Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Thr Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Phe Tyr Asp Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<---

1. Способ обнаружения Trichinella в образце экстрактов тканей, предусматривающий отбор образца исследуемого материала, механическое его измельчение, фильтрацию или центрифугирование с получением жидкой фазы и последующим проведением иммунного анализа, включающего иммунную реакцию между антигеном и антителом для обнаружения антигена Trichinella, при этом в образце 90% частиц имеет диаметр 300 мкм или менее - D90≤300 мкм.

2. Способ по п. 1, при этом образцы экстрактов тканей представляют собой образцы тканей млекопитающего, предпочтительно образцы тканей свиньи.

3. Способ по п. 1 или 2, при этом в образцах экстрактов тканей 90% частиц имеют диаметр 250 мкм или менее - D90≤250 мкм, предпочтительно 200 мкм или менее - D90≤200 мкм.

4. Способ по пп. 1-3, при этом образцы экстрактов тканей происходят из мышечных тканей.

5. Способ по пп. 1-4, при этом при получении образцов экстрактов тканей температура не превышает 45°C, предпочтительно 40°C.

6. Способ по пп. 1-5, при этом способ применяется в рамках санитарного осмотра мяса; и/или имеет предел обнаружения ≤7 нг антигена на мл экстракта тканей.

7. Способ по пп. 1-6, при этом способ проводят с помощью иммунного анализа, предпочтительно с помощью анализа ELISA, анализа в боковом потоке, лайн-блоттинга, вестерн-блоттинга, анализа гранул, анализа на вертикальном фильтре или 3D-иммунофильтрационного анализа.

8. Способ по пп. 1-7, при этом Trichinella представляет собой Trichinella spiralis.