Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме

Авторы патента:


Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме
G01N2030/027 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2746503:

МЕДИБИКОН ИНК. (US)

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к способам измерения количества флуоресцентного соединения в плазме. В одном варианте способ включает измерение количества флуоресцентного соединения - МВ-102, для чего осуществляют сбор образца плазмы, разбавление образца плазмы по меньшей мере одним растворителем, анализ разбавленного образца при помощи ВЭЖХ для измерения, таким образом, количества соединения в плазме, причем образец плазмы не сушат перед анализом ВЭЖХ и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта. В другом варианте способ включает измерение количества флуоресцентного соединения - МВ-102, для чего осуществляют сбор образца плазмы, добавление к образцу по меньшей мере одного растворителя, вызывая, таким образом, осаждение белков плазмы, удаление осажденных белков плазмы из образца и анализ образца при помощи ВЭЖХ для измерения, таким образом, количества соединения в плазме, причем образец не сушат перед анализом ВЭЖХ и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта. Группа изобретений обеспечивает создание простого и точного способа измерения количества флуоресцентного соединения в плазме. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 12 ил., 3 табл., 14 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США сер. № 62/588606, поданной 20 ноября 2017 года, содержание которой полностью включено посредством ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Область изобретения в целом относится к детекции и количественному определению флуоресцентного соединения в плазме. Более конкретно, заявка относится к способам анализа и количественного определения (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азандиил))бис(3–гидроксипропановой кислоты) в плазме пациента.

[0003] Анализ низкомолекулярных лекарственных средств в плазме пациента часто требуется как во время, так и после клинических испытаний. Во время клинических испытаний необходимо установить правильную дозу лекарственного средства, чтобы оптимизировать эффективность и минимизировать побочные эффекты. В некоторых случаях слишком малое количество лекарственного средства (то есть минимальная эффективность и терапевтический эффект) может быть таким же вредным, как и слишком большое (то есть неблагоприятные побочные эффекты).

[0004] Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) в почках широко признана как наиболее надежный показатель почечной функции у пациента. Таким образом, существует медицинская потребность в точном измерении СКФ в реальном времени для оценки функции почек в связи с острой или хронической почечной недостаточностью. В настоящее время общепринятой клинической практикой оценки функции почек является измерение уровня креатинина в сыворотке и его 24–часового клиренса для получения расчетной СКФ (рСКФ) на основании уравнений для определения СКФ Фергюсона и Вайкара или Инкера и соавт. Однако недостатком этого метода является отсутствие соответствующей чувствительности и точности, а также задержка во времени из–за того, что необходимо время для обработки образцов в подходящей лаборатории. Кроме того, результаты значительно различаются в зависимости от таких факторов, как возраст, восполнение дефицита воды, мышечная масса, режим питания и т.д.

[0005] Экзогенные радиоизотопные индикаторы СКФ, такие как йогексол (Omnipaque®), показанный на Фиг. 1, обеспечивают достоверную оценку СКФ. Йогексол не метаболизируется и не накапливается в органах пациента. Его распределение соответствует простому градиенту концентрации по капиллярам, и он полностью удаляется путем простой клубочковой фильтрации без канальцевой почечной секреции или реабсорбции. Чтобы использовать йогексол для определения СКФ, образцы крови собирают у пациента в разные моменты времени, после чего проводят тщательный лабораторный анализ. Значение СКФ определяют при помощи PK–анализа данных с использованием моделирующего и имитационного программного обеспечения WinNonlin PK/PD. Это трудоемкий процесс, который предъявляет значительные требования к медицинскому и лабораторному персоналу. Это также требует большого количества времени, поскольку необходимо собрать несколько образцов в течение нескольких часов в дополнение к лабораторному анализу, необходимому впоследствии.

[0006] Хроническая болезнь почек (ХБП) представляет собой медицинское состояние, характеризующееся постепенной потерей функции почек с течением времени. Она включает состояния, которые повреждают почки и уменьшают их способность должным образом удалять продукты жизнедеятельности из кровотока индивидуума. Осложнения ХБП включают высокое кровяное давление, анемию (низкий уровень эритроцитов), слабость костей, плохое алиментарное здоровье, повреждение нервов и повышенный риск сердечных заболеваний. По данным Национального Почечного Фонда, примерно две трети всех случаев ХБП вызваны диабетом или гипертензией. Помимо семейного анамнеза, другие факторы риска заболевания почек включают возраст, этническую принадлежность, гипертензию и диабет. СКФ является лучшим тестом для определения уровня функции почек и оценки стадии ХБП у пациента.

[0007] СКФ является важным тестом для определения уровня функции почек, который определяет стадию ХБП. Как показано ниже, чем ниже СКФ у пациента, тем серьезнее ХБП.

Стадия Описание СКФ
При повышенном риске Увеличение факторов риска (например, диабет, высокое кровяное давление, семейный анамнез, возраст, этническая принадлежность) > 90
1 Поражение почек с нормальной функцией почек > 90
2 Поражение почек с небольшой потерей функции почек 60–89
3a Потеря функции почек от легкой до средней степени 44–59
3b Потеря функции почек от средней до тяжелой степени 30–43
4 Тяжелая степень потери функции почек 15–29
5 Почечная недостаточность; требуется диализ < 15

[0008] Много усилий было направлено на поиск экзогенных флуоресцентных веществ, которые можно обнаружить трансдермально в режиме реального времени. См. US 9480687, US 9114160, US 8722685, US 8115000 и US 8778309 для руководства по этой теме; каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. В дополнение ко многим другим малым молекулам было синтезировано MB–102, флуоресцентное соединение, которое демонстрирует превосходные фотофизические свойства и другие химические и физические характеристики.

[0009] Соединение MB–102, (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азандиил))бис(3–гидроксипропановая кислота), показанное на Фиг. 1, представляет собой находящееся в процессе разработки флуоресцентное средство для определения СКФ в режиме реального времени. Оно излучает сильный флуоресцентный сигнал при 556 нм при возбуждении при 434 нм и в настоящее время проходит клиническое исследование на людях. Важно отметить, что количество MB–102, циркулирующего в кровотоке пациента, и скорость, с которой он выводится почечной фильтрацией, можно измерять трансдермально в режиме реального времени. Это устраняет необходимость в занимающем много времени сборе образцов и лабораторном анализе, позволяя медицинскому персоналу оценивать в реальном времени функцию почек у пациента. Таким образом, существует потребность в проверке точности методов, используемых для определения количества MB–102 в плазме или кровотоке пациента.

[0010] Лабораторный анализ образцов плазмы часто включает осаждение белка, испарение и сушку с последующим восстановлением в растворителе, совместимом с ВЭЖХ. Это трудоемкий процесс, который увеличивает время, необходимое для получения результатов. Другим недостатком методов осаждения белка является необходимость внутреннего стандарта в образце для обеспечения точных результатов. Эти шаги увеличивают время, необходимое для анализа, и создают возможности для ошибок. Таким образом, существует необходимость как в сокращении времени, необходимого для анализа, так и в уменьшении вероятности ошибок.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] В одном аспекте, в настоящей заявке раскрыт способ для измерения количества флуоресцентного соединения в плазме. Способ включает сбор образца плазмы, разбавление образца плазмы по меньшей мере одним растворителем и анализ разбавленного образца при помощи ВЭЖХ, измеряя таким образом количество соединения в плазме. Образец плазмы не сушат перед ВЭЖХ анализом и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта.

[0012] В другом аспекте, в настоящей заявке раскрыт способ для измерения количества флуоресцентного соединения в плазме. Способ включает сбор образца плазмы пациента, добавление к образцу по меньшей мере одного растворителя, вызывая осаждение белков плазмы, удаление осажденных белков плазмы из образца и анализ образца при помощи ВЭЖХ, измеряя таким образом количество соединения в плазме. Образец не сушат перед ВЭЖХ анализом и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0013] Фиг. 1 иллюстрирует структуры MB–102 и йогексола.

[0014] Фиг. 2 представляет собой наложение ВЭЖХ хроматограмм MB–102 при 3,3 нг/мл в 1% плазмы/PBS и контрольного раствора (1% плазмы/PBS).

[0015] Фиг. 3A и 3B иллюстрируют сигнал/шум, коэффициент асимметрии по USP и число теоретических тарелок в соответствии с USP для MB–102 при 0,4 нг/мл в 1% плазмы/PBS для двух различных образцов.

[0016] Фиг. 4 представляет чистоту пика MB–102, добавленного в 1X PBS.

[0017] Фиг. 5 представляет чистоту пика MB–102 в образце плазмы после получения стандартного образца.

[0018] Фиг. 6 представляет график корреляции MB–102 в плазме, полученной от пациентов, на основании результатов испытаний в контрактной лаборатории GMP по сравнению с результатами анализа в собственной лаборатории.

[0019] Фиг. 7 представляет результаты фармакокинетического анализа MB–102 у 12 пациентов в клинических испытаниях.

[0020] Фиг. 8a, 8b и 8c представляют графики, сравнивающие скорости клиренса MB–102 и йогексола у трех пациентов в клинических испытаниях.

[0021] Фиг. 9 представляет график корреляции MB–102 в плазме на основании результатов испытаний либо методом прямого разбавления, либо методом осаждения белка.

[0022] Фиг. 10 представляет график корреляции концентрации MB–102 в плазме, определенной методом прямого разбавления, для образцов, протестированных в собственной лаборатории, в сравнении с образцами, протестированными в контрактной лаборатории GMP.

[0023] Фиг. 11 представляет график корреляции концентрации MB–102 в образцах плазмы, показывающих гемолиз (уровни гемоглобина между 50 мг/дл и 100 мг/дл), протестированных методом прямого разбавления и методом осаждения белка.

[0024] Фиг. 12 представляет график корреляции концентрации MB–120 в образцах плазмы, показывающих гемолиз (уровни гемоглобина между 100 мг/дл и 250 мг/дл), протестированных методом прямого разбавления и осаждения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0025] В настоящей заявке раскрыт способ контроля концентрации флуоресцентного соединения у нуждающегося в этом пациента. Способ включает получение образца плазмы, разбавление образца плазмы по меньшей мере одним растворителем и анализ разбавленного образца при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Важно отметить, что образец не был высушен перед анализом, и при получении образца не был добавлен внутренний стандарт.

[0026] В некоторых вариантах осуществления флуоресцентное соединение представляет собой соединение формулы I, раскрытое в настоящей заявке. Предпочтительно, соединение представляет собой (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азандиил))бис(3–гидроксипропановую кислоту) (MB–102) или ее фармацевтически приемлемую соль, показанную ниже:

.

[0027] В некоторых вариантах осуществления образец плазмы получают путем взятия образца крови у пациента и собирают плазму с использованием способов, известных в данной области техники. Плазма может быть получена от человека, животного или из исследования in vitro. Примеры животных, от которых может быть получена плазма, включают, но не ограничиваются этим, собак, кошек, коров, лошадей, свиней, коз, обезьян, крыс и мышей. Предпочтительно, плазму получают от человека. Плазму можно немедленно проанализировать на флуоресцентное соединение или можно хранить для анализа, который будет проводиться через некоторое время. Если образец плазмы хранят для последующего анализа, хранение образца осуществляют так, чтобы минимизировать его разложение. Одним из способов хранения является замораживание образца при температуре –80°С или ниже. Другие способы хранения, признанные в данной области техники, которые предотвращают разложение образца, являются приемлемыми и охватываются настоящим изобретением.

[0028] Перед ВЭЖХ анализом образец разбавляют по меньшей мере одним растворителем. Растворитель может быть водным или органическим. В некоторых аспектах водный растворитель представляет собой насыщенный солевой раствор. В некоторых аспектах используют более одного растворителя. Каждый из растворителей может быть водным или неводным и выбран независимо от другого.

[0029] В некоторых аспектах водный растворитель находится в форме буфера, выбранного из группы, состоящей из фосфата, ацетата, бикарбоната, карбоната, формиата, глюконата, лактата, цитрата, сульфоната, аммония, гуанидиния, HEPES, какодилата, Tris, tris–HCl, малеата, бората, глицината, сукцината, PIPES и любой их комбинации. Предпочтительно, водный растворитель представляет собой фосфатно–солевой буферный раствор (PBS).

[0030] Подходящие неводные растворители включают, но не ограничиваются этим, метанол, этанол, этиленгликоль, этилацетат, гексан, хлороформ, DMF, DMSO, уксусную кислоту, ацетон, ацетонитрил, бутанол, тетрахлорид углерода, диэтиленгликоль, диэтиловый эфир, DME, этиленгликоль, метиленхлорид, нитрометан, петролейный эфир, пропанол, пиридин, толуол, MTBE, триэтиламин, ксилол и бензол. Предпочтительно, органический растворитель смешивается с водой. Наиболее предпочтительно, органический растворитель представляет собой метанол, этанол, ацетонитрил или DMSO. В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой метанол.

[0031] рН буфера должен быть совместим с системой растворителей ВЭЖХ и не вызывать разложения образца плазмы в течение периода времени, необходимого для проведения ВЭЖХ анализа. В некоторых аспектах pH будет составлять от около 2 до 12. В еще одном аспекте pH водного растворителя будет составлять около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11 или около 12. В контексте настоящей заявки термин “около” в отношении рН означает ± 0,5 единиц. В еще одном аспекте pH водного образца примерно соответствует физиологическому значению pH, приблизительно между 7,0 и 7,4.

[0032] Разбавление образца плазмы растворителем нужно осуществлять так, чтобы концентрацию флуоресцентного соединения в плазме можно было легко анализировать при помощи ВЭЖХ. Как известно в данной области техники, если концентрация аналита слишком высока, это может привести к перегрузке колонки и детектора. Это может привести к размыванию границы пика и изменениям времени удерживания аналитов, что может привести к ошибкам в количественном определении и идентификации. Если концентрация аналита слишком низкая, сигнал может быть потерян из–за фонового шума и неправильно определен. Следует избегать любой такой ситуации, чтобы методы, раскрытые в настоящей заявке, давали точные результаты. Нередко образец анализируют только для того, чтобы определить, что концентрация аналитов слишком высока. В таких случаях образец снова разбавляют и повторно анализируют. В некоторых аспектах образец плазмы разбавляют растворителем в соотношении 1:1 об/об (образец:растворитель). В еще одном аспекте соотношение при разбавлении составляет от 1:(0,1–100) об/об. В еще одном аспекте соотношение при разбавлении составляет от (0,1–100):1 об/об. В еще одном аспекте соотношение при разбавлении (об/об) составляет 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900 или 1:1000.

[0033] В еще одном аспекте способа для измерения концентрации флуоресцентного соединения в плазме пациента, раскрытого в настоящей заявке, способ включает получение образца плазмы от пациента, добавление по меньшей мере одного растворителя к образцу, чтобы вызвать осаждение белков, удаление осажденных белков из образца и анализ образца при помощи ВЭЖХ. Важно отметить, что образец не был высушен перед анализом и при получении образца не был добавлен внутренний стандарт.

[0034] Флуоресцентное соединение может представлять собой флуоресцентный краситель. Флуоресцентные красители по настоящему изобретению обычно имеют длины волн поглощения, возбуждения и эмиссии, которые находятся в ближней инфракрасной (NIR) или видимой областях спектра около 350 нм или более. Это полезно для диагностических процедур, так как свет видимой и NIR области спектра вряд ли может повредить ткани. Свет, имеющий длину волны около 350 нм или более, имеет тенденцию проникать в ткани, позволяя проводить диагностические процедуры в интересующих тканях, которые могут быть недоступны при использовании ультрафиолетовых волн с длиной волны менее чем около 350 нм. Подходящие флуоресцентные красители включают акридины, акридоны, антрацены, антрациновые линии, антрахиноны, азаазулены, азоазулены, бензолы, бензимидазолы, бензофураны, бензоиндокарбоцианины, бензоиндолы, бензотиофены, карбазолы, кумарины, цианины, дибензофураны, дибензотиофены, дирирроло красители, флавоны, флуоресцеины, имидазолы, индокарбоцианины, индоцианины, индолы, изоиндолы, изохинолины, нафтацендионы, нафталины, нафтохиноны, фенантрены, фенантридины, фенантридины, феноселеназины, фенотиазины, феноксазины, фенилксантены, полифторбензолы, пурины, пиразины, пиразолы, пиридины, пиримидоны, пирролы, квантовые точки, хинолины, хинолоны, родамины, сквараины, тетрацены, тиофены, трифенилметановые красители, ксантены, ксантоны и их производные.

[0035] В некоторых вариантах осуществления флуоресцентное соединение представляет собой соединение формулы I, раскрытое в настоящей заявке. Предпочтительно соединение представляет собой (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азандиил))бис(3–гидроксипропановую кислоту) (“MB–102”) или ее фармацевтически приемлемую соль, показанную ниже:

.

[0036] В некоторых вариантах осуществления образец плазмы получают путем взятия образца крови у пациента и плазму выделяют с использованием способов, известных в данной области техники. Плазму можно немедленно проанализировать на флуоресцентное соединение или можно хранить для анализа, который будет проводиться через некоторое время. Если образец плазмы хранят для последующего анализа, хранение образца осуществляют так, чтобы минимизировать его разложение. Одним из способов хранения является замораживание образца при температуре –80°С или ниже. Другие способы хранения, признанные в данной области техники, которые предотвращают разложение образца, являются приемлемыми и охватываются настоящим изобретением.

[0037] В некоторых вариантах осуществления растворитель, который добавляют, чтобы вызвать осаждение белков, представляет собой органический растворитель, выбранный из группы, состоящей из метанола, этанола, этиленгликоля, этилацетата, гексана, хлороформа, DMF, DMSO, уксусной кислоты, ацетона, ацетонитрила, бутанола, тетрахлорида углерода, диэтиленгликоля, диэтилового эфира, DME, этиленгликоля, метиленхлорида, нитрометана, петролейного эфира, пропанола, пиридина, толуола, MTBE, триэтиламина, ксилола и бензола. В некоторых аспектах используют более одного растворителя. Каждый из растворителей может быть водным или неводным и выбран независимо от другого.

[0038] Удаление осажденных белков осуществляют с использованием способов, известных в данной области. Фильтрация и центрифугирование являются двумя способами, охватываемыми настоящим изобретением.

[0039] После удаления осажденных белков образец анализируют непосредственно, или его можно разбавить дополнительным растворителем. Растворитель, используемый для разбавления, может быть водным, неводным или любой их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления водный растворитель представляет собой насыщенный солевой раствор. В еще одном аспекте растворитель представляет собой буфер, выбранный из группы, состоящей из фосфата, ацетата, бикарбоната, карбоната, формиата, глюконата, лактата, цитрата, сульфоната, аммония, гуанидиния, HEPES, какодилата, Tris, tris–HCl, малеата, бората, глицината, сукцината, PIPES и любой их комбинации. Предпочтительно, водный растворитель представляет собой фосфатно–солевой буферный раствор.

[0040] рH водной системы растворителей должен быть совместим с системой растворителей ВЭЖХ и не вызывать разложения образца плазмы в течение периода времени, необходимого для проведения ВЭЖХ анализа. В некоторых аспектах pH будет между около 2 и 12. В еще одном аспекте pH водного растворителя будет составлять около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11 или около 12. В данном контексте, “около” в отношении рН означает ± 0,5 единиц. В еще одном аспекте pH водного образца примерно соответствует физиологическому значению pH, между 7,0 и 7,4.

[0041] В еще одном аспекте растворитель, используемый для разбавления образца перед анализом, представляет собой органический неводный растворитель. Подходящие органические неводные растворители включают, но не ограничиваются этим, метанол, этанол, этиленгликоль, этилацетат, гексан, хлороформ, DMF, DMSO, уксусную кислоту, ацетон, ацетонитрил, бутанол, тетрахлорид углерода, диэтиленгликоль, диэтиловый эфир, DME, этиленгликоль, метиленхлорид, нитрометан, петролейный эфир, пропанол, пиридин, толуол, MTBE, триэтиламин, ксилол и бензол. Предпочтительно, органический растворитель смешивается с водой. Наиболее предпочтительно, органический растворитель представляет собой метанол, этанол, ацетонитрил или DMSO. В одном варианте осуществления органический растворитель представляет собой метанол.

[0042] В еще одном аспекте растворитель, используемый для разбавления образца, включает по меньшей мере два разных растворителя, выбранных из любых возможных комбинаций водных и органических растворителей, раскрытых в настоящей заявке. Кроме того, поскольку для анализа используют ВЭЖХ, систему растворителей выбирают таким образом, чтобы она не мешала детекции аналита.

[0043] Количество растворителя, используемого для осаждения белков и/или подготовки образца для ВЭЖХ анализа, будет варьироваться в зависимости от образца. Как обсуждалось выше, количество необходимого растворителя будет регулироваться таким образом, чтобы ВЭЖХ обеспечивала точные результаты. Этот метод может включать два разведения: а) добавление растворителя, чтобы вызвать осаждение белков, и b) добавление растворителя к супернатанту после удаления осажденных белков. В этом методе объединенное количество растворителя, добавляемого для этих двух стадий, будет влиять на концентрацию аналита в ВЭЖХ анализе. Общее количество растворителя, добавляемого к образцу плазмы, должно быть таким, чтобы концентрация аналита не была слишком высокой или слишком низкой. В некоторых аспектах, образец плазмы разбавляют растворителем в соотношении 1:1 об/об (образец:растворитель), где это относится к отношению образца к объединенному объему растворителей в обоих разведениях. В еще одном аспекте соотношение при разбавлении составляет от 1:(0,1–100) об/об. В еще одном аспекте соотношение при разбавлении составляет от (0,1–100):1 об/об. В еще одном аспекте соотношение при разбавлении (об/об) составляет от 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900 или 1:1000. Соотношение растворителей, используемых в двух разбавлениях может составлять от (0,1–100):(100–0,1) об/об относительно друг друга. В некоторых аспектах может использоваться только стадия разбавления для осаждения белков. Концентрация образца после осаждения белков может быть такой, что не требуется никакого дальнейшего разбавления.

[0044] Как известно в данной области техники, гемолиз крови может быть проблемой при сборе образцов крови у пациента. Существует множество причин гемолиза крови, включая сложность сбора образцов, небезопасные линии, загрязнение, неправильный размер иглы, неправильное смешивание пробирок, неправильно заполненные пробирки для образцов и хранение образцов. Любой гемолиз крови в собранном образце может помешать осуществлению анализа плазмы. Известно, что гемолиз приводит к неточным результатам лабораторных исследований во многих различных видах анализа из–за загрязнения плазмы содержимым гемолизированных эритроцитов. После гемолиза гемоглобин высвобождается в плазму или сыворотку пробы. Одним из общих признаков гемолиза является изменение цвета в плазме или сыворотке пациента. Приблизительную оценку количества гемоглобина в плазме или сыворотке, таким образом, наличие или отсутствие гемолиза, можно сделать визуально, используя таблицу цветов, найденную по ссылке:

http://blog.fisherbioservices.com/avoiding–hemolysis–in–blood–sample–collection–and–processing, содержание которой включено в качестве ссылки. Еще одним признаком гемолиза является уменьшение мутности образца крови из–за уменьшения количества эритроцитов, которые вызывают рассеяние света.

[0045] В некоторых аспектах способы измерения концентрации флуоресцентного соединения в плазме пациента применяют к образцу, где произошел по меньшей мере некоторый гемолиз. В еще одном аспекте способы измерения концентрации MB–102 в плазме пациента применяют к образцам плазмы, где произошел частичный или полный гемолиз.

[0046] В некоторых вариантах осуществления, раскрытых в настоящей заявке, флуоресцентное соединение представляет собой молекулу пиразина формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, где

каждый из X1 и X2 независимо представляет собой –CO2R1, –CONR1R2, –CO(AA) или –CONH(PS); каждый из Y1 и Y2 независимо выбран из группы, состоящей из –NR1R2 и

;

Z1 представляет собой простую связь, –CR1R2–, –O–, –NR1–, –NCOR1–, –S–, –SO– или –SO2–; каждый из R1 – R2 независимо выбраны из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aH, –CH2(CHOH)aCH3, –CH2(CHOH)aCO2H, –(CHCO2H)aCO2H, –(CH2CH2O)cH, –(CH2CH2O)cCH3, –(CH2)aSO3H, –(CH2)aSO3, –(CH2)aSO2H, –(CH2)aSO2, –(CH2)aNHSO3H, –(CH2)aNHSO3, –(CH2)aNHSO2H, –(CH2)aNHSO2,–(CH2)aPO4H3, –(CH2)aPO4H2, –(CH2)aPO4H2–, –(CH2)aPO43–, –(CH2)aPO3H2, –(CH2)aPO3H и –(CH2)aPO32–; AA представляет собой пептидную цепь, включающую одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из природных и неприродных аминокислот, связанных вместе пептидными или амидными связями, и каждый случай AA может быть таким же или отличаться от любого другого случая; PS представляет собой сульфатированную или несульфатированную полисахаридную цепь, включающую одно или несколько моносахаридных звеньев, связанных гликозидными связями; и ‘a’ представляет собой число от 1 до 10, ‘c’ представляет собой число от 1 до 100, и каждый из ‘m’ и ‘n’ независимо представляет собой число от 1 до 3. В некоторых аспектах по меньшей мере один из X1 и X2 представляет собой –CO(PS) или –CO(AA). В еще одном аспекте оба X1 и X2 представляют собой –CO(AA).

[0047] (AA) представляет собой пептидную цепь, включающую одну или несколько природных или неприродных аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Пептидная цепь (АА) может представлять собой одну аминокислоту, гомополипептидную цепь или гетерополипептидную цепь и может иметь любую подходящую длину. В некоторых вариантах осуществления природная или неприродная аминокислота представляет собой α–аминокислоту. В еще одном аспекте α–аминокислота представляет собой D–α–аминокислоту или L–α–аминокислоту. В полипептидной цепи, включающей две или более аминокислот, каждая аминокислота выбрана независимо от другой(других) во всех аспектах, включая, но не ограничиваясь этим, структуру боковой цепи и стереохимию. Например, в некоторых вариантах осуществления пептидная цепь может включать 1–100 аминокислот, 1–90 аминокислот, 1–80 аминокислот, 1–70 аминокислот, 1–60 аминокислот, 1–50 аминокислот, 1–40 аминокислот, 1–30 аминокислот, 1–20 аминокислот или даже 1–10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидная цепь может включать 1–100 α–аминокислот, 1–90 α–аминокислот, 1–80 α–аминокислот, 1–70 α–аминокислот, 1–60 α–аминокислот, 1–50 α–аминокислот, 1–40 α–аминокислот, 1–30 α–аминокислот, 1–20 α–аминокислот или даже 1–10 α–аминокислот. В некоторых вариантах осуществления аминокислота выбрана из группы, состоящей из D–аланина, D–аргинина, D–аспарагина, D–аспарагиновой кислоты, D–цистеина, D–глутаминовой кислоты, D–глутамина, глицина, D–гистидина, D–гомосерина, D–изолейцина, D–лейцина, D–лизина, D–метионина, D–фенилаланина, D–пролина, D–серина, D–треонина, D–тирозина, D–триптофана и D–валина. В некоторых вариантах осуществления α–аминокислоты пептидной цепи (AA) выбраны из группы, состоящей из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутамина, глутаминовой кислоты, гистидина, гомосерина, лизина и серина. В некоторых вариантах осуществления, α–аминокислоты пептидной цепи (AA) выбраны из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, гомосерина и серина. В некоторых вариантах осуществления пептидная цепь (АА) относится к одной аминокислоте (например, D–аспарагиновой кислоте или D–серину).

[0048] В некоторых вариантах осуществления (АА) представляет собой одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из 21 незаменимой аминокислоты. В других аспектах AA выбран из группы, состоящей из D–аргинина, D–аспарагина, D–аспарагиновой кислоты, D–глутамина, D–глутаминовой кислоты, D–гистидина, D–гомосерина, D–лизина и D–серина. Предпочтительно, AA представляет собой D–аспарагиновую кислоту, глицин, D–серин или D–тирозин. Наиболее предпочтительно, АА представляет собой D–серин.

[0049] В некоторых вариантах осуществления (AA) представляет собой β–аминокислоту. Примеры β–аминокислот включают, но не ограничиваются этим, β–фенилаланин, β–аланин, 3–амино–3–(3–бромфенил)пропионовую кислоту, 3–аминобутановую кислоту, цис–2–амино–3–циклопентен–1–карбоновую кислоту, транс–2–амино–3–циклопентен–1–карбоновую кислоту, 3–аминоизомасляную кислоту, 3–амино–2–фенилпропионовую кислоту, 3–амино–4–(4–бифенилил)масляную кислоту, цис–3–амино–циклогексанкарбоновую кислоту, транс–3–амино–циклогексанкарбоновую кислоту, 3амино–циклопентанкарбоновую кислоту, 3–амино–2–гидрокси–4–фенилмасляную кислоту, 2–(аминометил)фенилуксусную кислоту, 3–амино–2–метилпропионовую кислоту, 3–амино–4–(2–нафтил)масляную кислоту, 3–амино–5–фенилпентановую кислоту, 3–амино–2–фенилпропионовую кислоту, 4–бром–β–Phe–OH, 4–хлор–β–ГомоPhe–OH, 4–хлор–β–Phe–OH, 2–циано–β–ГомоPhe–OH, 2–циано–β–ГомоPhe–OH, 4–циано–β–ГомоPhe–OH, 3–циано–β–Phe–OH, 4–циано–β–Phe–OH, 3,4–диметокси–β–Phe–OH, γ,γ–дифенил–β–ГомоAla–OH, 4–фтор–β–Phe–OH, β–Gln–OH, β–ГомоAla–OH, β–ГомоArg–OH, β–ГомоGln–OH, β–ГомоGlu–OH, β–ГомоHyp–OH, β–ГомоLeu–OH, β–ГомоLys–OH, β–ГомоMet–OH, β2–гомофенилаланин, β–ГомоPhe–OH, β3–ГомоPro–OH, β–ГомоSer–OH, β–ГомоThr–OH, β–ГомоTrp–OH, β–ГомоTrp–OMe, β–ГомоTyr–OH, β–Leu–OH, β–Leu–OH, β–Lys(Z)–OH, 3–метокси–β–Phe–OH, 3–метокси–β–Phe–OH, 4–метокси–β–Phe–OH, 4–метил–β–ГомоPhe–OH, 2–метил–β–Phe–OH, 3–метил–β–Phe–OH, 4–метил–β–Phe–OH, β–Phe–OH, 4–(4–пиридил)–β–ГомоAla–OH, 2–(трифторметил)–β–ГомоPhe–OH, 3–(трифторметил)–β–ГомоPhe–OH, 4–(трифторметил)–β–ГомоPhe–OH, 2–(трифторметил)–β–Phe–OH, 3–(трифторметил)–β–Phe–OH, 4–(трифторметил)–β–Phe–OH, β–Tyr–OH, Этил 3–(бензиламино)пропионат, β–Ala–OH, 3–(амино)–5–гексеновую кислоту, 3–(амино)–2–метилпропионовую кислоту, 3–(амино)–2–метилпропионовую кислоту, 3–(амино)–4–(2–нафтил)масляную кислоту, 3,4–дифтор–β–ГомоPhe–OH, γ,γ–дифенил–β–ГомоAla–OH, 4–фтор–β–ГомоPhe–OH, β–Gln–OH, β–ГомоAla–OH, β–ГомоArg–OH, β–ГомоGln–OH, β–ГомоGlu–OH, β–ГомоHyp–OH, β–ГомоIle–OH, β–ГомоLeu–OH, β–ГомоLys–OH, β–ГомоMet–OH, β–ГомоPhe–OH, β3–гомопролин, β–ГомоThr–OH, β–ГомоTrp–OH, β–ГомоTyr–OH, β–Leu–OH, 2–метил–β–ГомоPhe–OH, 3–метил–β–ГомоPhe–OH, β–Phe–OH, 4–(3–пиридил)–β–ГомоAla–OH, 3–(трифторметил)–β–ГомоPhe–OH, β–Глутаминовую кислоту, β–Гомоаланин, β–Гомоглутаминовую кислоту, β–Гомоглутамин, β–Гомогидроксипролин, β–Гомоизолейцин, β–Гомолейцин, β–Гомометионин, β–Гомофенилаланин, β–Гомопролин, β–Гомосерин, β–Гомотреонин, β–Гомотриптофан, β–Гомотирозин, β–Лейцин, β–Фенилаланин, Пирролидин–3–карбоновую кислоту и β–Dab–OH.

[0050] (PS) представляет собой сульфатированную или несульфатированную полисахаридную цепь, включающую одно или несколько моносахаридных звеньев, связанных гликозидными связями. Полисахаридная цепь (PS) может иметь любую подходящую длину. Например, в некоторых вариантах осуществления полисахаридная цепь может включать 1–100 моносахаридных звеньев, 1–90 моносахаридных звеньев, 1–80 моносахаридных звеньев, 1–70 моносахаридных звеньев, 1–60 моносахаридных звеньев, 1–50 моносахаридных звеньев, 1–40 моносахаридных звеньев, 1–30 моносахаридных звеньев, 1–20 моносахаридных звеньев или даже 1–10 моносахаридных звеньев. В некоторых вариантах осуществления полисахаридная цепь (PS) представляет собой гомополисахаридную цепь, состоящую либо из пентозных, либо гексозных моносахаридных звеньев. В других вариантах осуществления полисахаридная цепь (PS) представляет собой гетерополисахаридную цепь, состоящую из одного или обоих пентозных и гексозных моносахаридных звеньев. В некоторых вариантах осуществления моносахаридные звенья полисахаридной цепи (PS) выбраны из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, маннозы, ксилозы и рибозы. В некоторых вариантах осуществления полисахаридная цепь (PS) относится к одному моносахаридному звену (например, либо к глюкозе, либо фруктозе). В еще одном аспекте полисахаридная цепь представляет собой аминосахар, где одна или несколько гидроксигрупп на сахаре заменены аминогруппой. Соединение с карбонильной группой может осуществляться либо через аминовую, либо через гидрокси группу.

[0051] В некоторых вариантах осуществления, для производного пиразина формулы I по меньшей мере один из Y1 или Y2 представляет собой

,

где Z1 представляет собой простую связь, –CR1R2–, –O–, –NR1–, –NCOR1–, –S–, –SO– или –SO2–; и каждый из R1 – R2 независимо выбран из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aH, –CH2(CHOH)aCH3, –CH2(CHOH)aCO2H, –(CHCO2H)aCO2H, –(CH2CH2O)cH, –(CH2CH2O)cCH3, –(CH2)aSO3H,–(CH2)aNHSO3H и –(CH2)aPO3H2; a, c и m имеют значения, определенные выше.

[0052] В еще одном аспекте по меньшей мере один из Y1 и Y2 представляет собой –NR1R2, и R1 – R2 имеют значение, определенное выше. В еще одном аспекте оба Y1 и Y2 представляют собой –NR1R2, и R1 – R2 имеют значение, определенное выше. Альтернативно, R1 и R2 оба независимо выбраны из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aCH3, –(CH2)aSO3H, –(CH2)aNHSO3H и –(CH2)aPO3H2. В еще одном аспекте оба R1 и R2 представляют собой водород.

[0053] Наиболее предпочтительно, пиразин представляет собой

,

или его фармацевтически приемлемую соль.

[0054] В любом аспекте пиразинового соединения один или несколько атомов могут альтернативно быть замещены изотопно–меченным атомом того же элемента. Например, атом водорода может быть изотопно помечен дейтерием или тритием; атом углерода может быть изотопно помечен 13C или 14C; атом азота может быть изотопно помечен 14N или 15N. Изотопная метка может быть стабильным изотопом или может быть нестабильным изотопом (то есть радиоактивным). Молекула пиразина может содержать одну или несколько изотопных меток. Изотопная метка может быть частичной или полной. Например, молекула пиразина может быть помечена 50% дейтерием, что придает молекуле сигнатуру, которую можно легко отслеживать масс–спектрометрией или другим методом. В качестве другого примера, молекула пиразина может быть мечена тритием, что придает молекуле радиоактивную сигнатуру, которую можно отслеживать как in vivo, так и ex vivo с использованием методов, известных в данной области техники.

[0055] Фармацевтически приемлемые соли известны в данной области. В любом аспекте в настоящей заявке пиразин может быть в форме фармацевтически приемлемой соли. В качестве примера, а не ограничения, фармацевтически приемлемые соли включают соли, описанные Berge, et al. в J. Pharm. Sci., 66(1), 1 (1977), содержание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. Соль может быть катионной или анионной. В некоторых вариантах осуществления противоион для фармацевтически приемлемой соли выбран из группы, состоящей из ацетата, бензолсульфоната, бензоата, безилата, бикарбоната, битартрата, бромида, эдетата кальция, камсилата, карбоната, хлорида, цитрата, дигидрохлорида, эдетата, эдизилата, эстолата, эзилата, фумарата, глуцептата, глюконата, глутамата, гликоллиларсанилата, гексилрезорцината, гидрабамина, гидробромида, гидрохлорида, гидроксинафтоата, йодида, изетионата, лактата, лактобионата, малата, малеата, манделата, мезилата, метилбромида, метилнитрата, метилсульфата, муцината, напсилата, нитрата, памоата, пантотената, фосфата, дифосфата, полигалактуроната, салицилата, стеарата, субацетата, сукцината, сульфата, танната, тартрата, теоклата, триэтиодида, адипата, альгината, аминосалицилата, ангидрометиленцитрата, ареколина, аспартата, бисульфата, бутилбромида, камфората, диглюконата, дигидробромида, дисукцината, глицерофосфата, гемисульфата, гидрофторида, гидройодида, метиленбис(салицината), нападисилата, оксалата, пектината, персульфата, фенилэтилбарбитурата, пикрата, пропионата, тиоцианата, тозилата, ундеканоата, бензатина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, меглумина, прокаина, бенетамина, клемизола, диэтиламина, пиперазина, трометамина, алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия, цинка, бария и висмута. Любая функциональная группа в производном пиразина, способная образовывать соль, может необязательно образовывать ее с использованием способов, известных в данной области. В качестве примера, а не ограничения, амингидрохлоридные соли могут быть образованы путем добавления хлористоводородной кислоты к пиразину. Фосфатные соли могут быть образованы путем добавления фосфатного буфера к пиразину. Любая присутствующая кислотная функциональная группа, такая как сульфоновая кислота, карбоновая кислота или фосфоновая кислота, может быть депротонирована при помощи подходящего основания и образованной соли. Альтернативно, аминогруппа может быть протонирована соответствующей кислотой с образованием соли амина. Солевая форма может быть однозарядной, двухзарядной или даже трехзарядной, и когда присутствует более одного противоиона, каждый противоион может быть одинаковым или они могут быть отличными друг от друга.

[0056] Все ссылки в настоящей заявке на “пиразин”, “производное пиразина”, “молекулу пиразина”, “соединение пиразина” или “аналог пиразина” относятся ко всем соединениям формулы I. Кроме того, каждая ссылка на пиразин включает все его фармацевтически приемлемые соли, если конкретно не указано иное. Солевые формы могут быть заряженными или незаряженными и могут быть протонированы для образования соответствующего катиона или депротонированы для образования соответствующего аниона. Все аспекты и варианты осуществления, раскрытые в настоящей заявке, применимы к соединениям формулы I, и конкретные примеры являются только иллюстративными и не ограничивающими объем раскрытия.

[0057] В некоторых аспектах у пациента подозревается или известно, что имеется по меньшей мере одно медицинское нарушение, связанное с почками, и способы, раскрытые в настоящей заявке, используют для определения уровня нарушения функции почек или почечной недостаточности у пациента. В некоторых аспектах пациент имеет расчетную СКФ (рСКФ) или ранее определенную СКФ менее чем 110, менее чем 90, менее чем 60, менее чем 30 или менее чем 15. рСКФ пациента определяют с использованием стандартных медицинских методик, и такие методы известны в данной области. В некоторых аспектах пациент не должен иметь медицинских проблем с почками, или не у него не должно быть подозрений на это. СКФ мониторинг можно проводить как часть общей или обычной оценки состояния здоровья пациента или в качестве меры предосторожности.

[0058] Поскольку увеличение концентрации белка в моче пациента может свидетельствовать о каком–либо типе почечной недостаточности или нарушения функции, способы, раскрытые в настоящей заявке, подходят для пациентов, у которых при анализе мочи наблюдается повышение уровня белка. В некоторых аспектах у пациента повышен уровень белка в моче, что определяют стандартными медицинскими тестами (например, тест–полосками для анализа мочи). В качестве примера, а не ограничения, анализ мочи пациента может показывать увеличение альбумина, увеличение креатинина, увеличение азота мочевины в крови (то есть BUN тест) или любую их комбинацию.

[0059] В некоторых аспектах пациенту ранее был поставлен диагноз по меньшей мере Стадия 1 ХБП. В других аспектах пациенту ранее был поставлен диагноз Стадия 2 ХБП, Стадия 3 ХБП, Стадия 4 ХБП или Стадия 5 ХБП. В еще одном аспекте у пациента еще не диагностирована ХБП, но имеется один или несколько факторов риска, связанных с ХБП. В еще одном аспекте пациент не имеет известных факторов риска ХБП.

Примеры

Получение (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис–(азандиил))–бис(3–гидроксипропановой кислоты) (“MB–102”)

[0060] Образцы MB–102 API получали и анализировали в соответствии с GMP стандартами для использования в двух клинических испытаниях. Следующая процедура является иллюстративной.

Стадия 1: Образование дибензил 2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)–бис(азандиил))(2R,2'R)–бис(3–гидроксипропаноата)

[0061] В круглодонную колбу объемом 500 мл, снабженную адаптером Клейзена и капельной воронкой, загружали гидрохлорид бензилового эфира D–серина (24,33 г, 105,0 ммоль) и через канюлю добавляли безводный DMF (300 мл). Раствор охлаждали на ледяной бане и перемешивали в течение 15 мин в атмосфере N2. Добавляли по каплям DIPEA (19,16 мл, 110,0 ммоль) через капельную воронку в течение 30 минут, а еще через 30 минут охлаждающую баню убирали и добавляли одной порцией дикислоту (9,91 г, 50,0 ммоль). Суспензию кирпично–красного цвета перемешивали в течение 30 минут и одной порцией добавляли HOBt·H2O (17,61 г, 115,0 ммоль). Через 15 минут реакционную колбу охлаждали на ледяной бане и порциями в течение 15 минут добавляли EDC·HCl (22,05 г, 115,0 ммоль). Полученной суспензии медленно давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи (около 17 часов) в атмосфере N2.

[0062] Темный раствор концентрировали до сиропообразного остатка в высоком вакууме (температура бани 60°C), затем распределяли между EtOAc и milli–Q H2O (по 400 мл каждого). Слои разделяли и водный слой экстрагировали при помощи EtOAc (3 × 200 мл). Объединенные EtOAc экстракты последовательно промывали 0,50 M KHSO4, насыщенным NaHCO3, H2O и насыщенным солевым раствором (по 250 мл каждого). Удаление растворителя при пониженном давлении давало 23,7 г оранжевого твердого вещества. Неочищенный продукт очищали флэш–хроматографией на силикагеле, используя градиент CHCl3:MeOH, с получением бис–амида (19,6 г, 71%) в виде оранжевого твердого вещества: Rf=0,45 [CHCl3:MeOH (9:1, об/об)]. 1H ЯМР (DMSO–d6) δ 8,56 (д, J=8,0 Гц, 2H, обмениваемый с D2O), 7,40–7,33 (м, 10H), 6,76 (с, 4H, обмениваемый с D2O), 5,37 (т, J=5,5 Гц, 2H), 5,20 (м, 4H), 4,66–4,63 (дт, J=8,0, 4,0 Гц, 2H), 3,97–3,93 (м, 2H), 3,81–3,77 (м, 2H). 13C ЯМР (DMSO–d6) δ 170,1, 164,9, 146,4, 135,8, 128,4, 128,0, 127,6, 125,9, 66,2, 61,1, 54,4; ОФ–ЖХ/МС (ESI) m/z 553,3 (M+H)+ (Rt=4,44 мин, 5–95% B/6 мин). Рассчит. для C26H28N6O8: C, 56,52; H, 5,11; N, 15,21. Найдено: C, 56,39; H, 5,11; N, 14,99.

Стадия 2: Образование (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис–(азандиил))–бис(3–гидроксипропановой кислоты)

[0063] Бисамид со Стадии 1 (7,74 г, 14,0 ммоль) гидрировали в присутствии 10% Pd/C (0,774 г) в смеси EtOH:H2O (560 мл; 3:1 об/об). Реакционную смесь продували аргоном и перемешивали в атмосфере водорода (медленное барботирование) при комнатной температуре в течение 5,5 часов. Реакционную смесь снова продували Ar и катализатор удаляли путем фильтрации через целит. Слой промывали смесью EtOH:H2O (400 мл; 1: 1 об./об.) и объединенные фильтраты концентрировали в вакууме. Продукт сушили в высоком вакууме. Остаток растирали с CH3CN с получением MB–102 (4,89 г, 94%) в виде оранжевого порошка. 1H ЯМР (DMSO–d6) δ 8,46 (д, J=8,3 Гц, 2H, обмениваемый с D2O), 6,78 (шир.с, 4H, обмениваемый с D2O), 4,48–4,45 (дт, J=8,1, 3,9 Гц, 2H), 3,88 (дд, J=11,1, 3,9 Гц, 2H), 3,74 (дд, J=11,1, 3,7 Гц, 2H). 13C ЯМР (DMSO–d6) δ 171,6, 164,7, 146,4, 125,9, 61,2, 54,3. ОФЖХ/МС (ESI) m/z 373,2 (M+H)+ (Rt=2,86 мин, 5–95% B/6 мин). Анал. Рассчит. для C12H16N6O8: C, 38,71; H, 4,33; N, 22,57. Найдено: C, 38,44; H, 4,51: N, 22,33.

Получение образца для анализа методом прямого разбавления

[0064] Для получения образца путем прямого разбавления получали калибровочные стандарты, содержащие 0,4, 1,0, 2,0, 4,0, 10,0, 16,0, 40,0, 100,0, 200,0, 400,0 нг/мл, и контроли качества при низком, среднем и высоком уровнях MB–102 в 1% плазмы человека в PBS в день валидационного исследования или анализа образца. Дозируемый раствор MB–102 (18,6 мг/мл), используемый в клиническом исследовании, разводили 1/100 сначала с использованием 1% плазмы человека в PBS для получения исходного раствора 186 мкг/мл MB–102. Этот исходный раствор дополнительно разбавляли 1% плазмы человека в PBS для получения рабочего раствора калибровочного стандарта 2000 нг/мл MB–102 для получения калибровочных стандартов. QC рабочий раствор при (300 нг/мл) также получали из исходного раствора 186 мкг/мл MB–102 путем разбавления раствором 1% плазмы в PBS. Низкий, средний и высокий уровни контролей качества(QC) получали из этого QC рабочего раствора путем разбавления раствором 1% плазмы человека в PBS.

Подготовка образца для анализа методом осаждения белков

[0065] Для получения образцов путем осаждения белков калибровочные стандарты, содержащие 0,4, 1,0, 2,0, 4,0, 10,0, 16,0, 40,0, 100,0, 200,0, 400,0 нг/мл, и контроли качества при низком, среднем и высоком уровнях MB–102 получали следующим образом. Тысячекратную концентрацию MB–102 в 1X PBS получали для каждых стандартов и QC. Эти исходные растворы разбавляли 1/100 плазмой с получением рабочих калибровочных стандартов и QC MB–102 в 99% плазмы/1% PBS. 200 мкл этих рабочих стандартов и QC разделяли на аликвоты в 600 мкл флаконы и хранили при –80°C до использования. С использованием такого же способа ВЭЖХ эти рабочие калибровочные стандарты и QC проверяли на соответствие требованиям и сертифицировали для анализа неизвестных образцов.

Анализ образцов, полученных от пациентов

[0066] Образцы плазмы были получены из двух клинических испытаний. Все образцы плазмы хранили при –80°C до анализа.

[0067] Для образцов, которые анализировали методом прямого разбавления, 10 мкл образца плазмы (оттаивали до комнатной температуры и тщательно смешивали) разбавляли 990 мкл 1X PBS, тщательно смешивали в течение около 10 минут и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 2 минут. Образец непосредственно анализировали методом ВЭЖХ.

[0068] Для образцов, которые анализировали методом осаждения белков, 50 мкл плазмы (оттаивали до комнатной температуры и тщательно смешивали) разбавляли 200 мкл метанола, содержащего 4,5% 1X PBS (об/об), смешивали по меньшей мере в течение 10 секунд и центрифугировали при >4000 об/мин в течение 10 минут. Весь супернатант переносили во второй контейнер. Из этого 50 мкл супернатанта смешивали с 950 мкл 1X PBS. Образец смешивали и анализировали методом ВЭЖХ. С использованием этой процедуры, высушенный супернатант после осаждения белков плазмы удалялся. Часть супернатанта разбавляли непосредственно 1X PBS для ВЭЖХ анализа так, чтобы внутренний стандарт, обычно используемый в методе осаждения белка, не потребовался.

[0069] ВЭЖХ анализ

[0070] Анализы осуществляли на системе Waters Acquity UPLC H Class Chromatography System, снабженной нагревателем колонки, нагревателем/охладителем образца, вакуумным дегазатором, автодозатором, детектором флуоресценции и насосом, способным создавать бинарный градиент. Для анализа использовали аналитическую ВЭЖХ колонку Phenomenex Luna C18 (2), 4,6 × 250 мм, 5 мкм, 100Å (Phenomenex, № по кат. 00G–4252–E0, S/N H15–133556) и Security Guard Cartridge C18, 4 × 3 мм в.д., 5 мкм (Phenomenex, № по кат. KJ0–4282). Программное обеспечение Waters Empower 3, оснащенное системой ВЭЖХ, использовали для настройки анализа, мониторинга анализа и обработки данных. Использовали две подвижные фазы: подвижная фаза A: 0,1% трифторуксусной кислоты в воде (Fisher, Optima® Grade) и подвижная фаза B: 0,1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле (Fisher, Optima® Grade). Температуру колонки устанавливали при 30°С, температуру автодозатора устанавливали при 5°С, длину волны возбуждения устанавливали при 434 нм, а длину волны детекции/эмиссии устанавливали при 556 нм. Скорость счета устанавливали при 5 отсчетов/сек; увеличение PMT устанавливали при 50; температура проточной ячейки представляла собой температуру окружающей среды; объем вводимой пробы составлял 10 мкл. MB–102 элюировал примерно через 3,6 минуты при использовании градиента, показанного ниже.

Время
(мин)
Скорость потока
(мл/мин)
% A % B Градиент кривой
0,00 1,1 85 15 6
5,00 1,1 40 60 6
5,05 1,6 10 90 6
6,75 1,6 10 90 6
6,80 1,1 85 15 6
10,00 1,1 85 15 6

Метод валидации

[0071] Используя этот метод ВЭЖХ и подготовку образца, описанные выше, было проведено валидационное исследование для определения прецизионности, точности, линейности, воспроизводимости, стабильности в плазме и растворе образца, стабильности при замораживании–оттаивании, самых низких пределов количественного определения и специфичности. Критерием приемлемости было отклонение данных ± 15% от нормальных значений, за исключением самого низкого предела количественного определения (LLOQ), где оно было установлено как ± 20%. Образцы были проанализированы как в собственной лаборатории, так и в контрактной лаборатории GMP, чтобы обеспечить как достоверность метода, так и точность результатов.

Специфичность и селективность

[0072] Влияние компонентов плазмы на MB–102 и анализ исследовали путем сравнения хроматограмм чистых образцов с образцами, в которые добавляли MB–102. Было определено, что LLQ по меньшей мере в 10 раз превышает уровень шума в контрольных образцах, в то же время было установлено, что LLOD по меньшей мере в три раза превышает уровень шума в контрольных образцах.

Точность и прецизионность

[0073] Подготовку образцов осуществляли в трех повторах при пяти уровнях концентраций MB–102 в 1% плазмы/PBS и анализировали для определения точности. Для определения точности введения проб было сделано десять инжекций образца 200 нг/мл, чтобы убедиться в высокой точности повторных инжекций.

Восстановление

[0074] Восстановление определяли при трех различных концентрациях MB–102 путем сравнения контрольных образцов плазмы с теми образцами плазмы, в которые добавили MB–102. Процент MB–102, выделенного из образцов с добавлением MB–102, определяли как % восстановления.

Стабильность в образце плазмы и стабильность в растворе плазмы

[0075] Оценивали стабильность MB–102 при обработке образцов после длительного хранения образцов плазмы (замороженных при –80°C) и кратковременного хранения (стандартные лабораторные условия, температура окружающей среды с/без воздействия света и 2–8°C) в растворе плазмы. Образцы плазмы испытывали с тремя циклами замораживания/оттаивания (от –80°C до комнатной температуры). Стабильность MB–102 в растворе плазмы при комнатной температуре с/без воздействия света, при 2–8°C и при температуре автодозатора (5°C) оценивали для временных интервалов 24 и 48 часов.

Результаты

[0076] Фиг. 2 иллюстрирует наложение ВЭЖХ хроматограмм MB–102 (3,3 нг/мл в 1% плазмы/PBS) и пустого контроля (1% плазмы/PBS). Длину волны флуоресценции, испускаемой MB–102 при 556 нм, контролировали для количественного определения. 1% белков плазмы в растворе образца не имеют пика, элюируемого при около 3,62 мин, мешающего детекции или количественному определению MB–102.

Валидация метода

[0077] Результаты исследования по валидации метода приведены в таблице 1. Калибровка стандартов MB–102 показала очень хороший линейный ответ больше чем на три порядка величины для концентраций от 0,4 нг/мл до 400 нг/мл, с R² 0,9997, с использованием линейной регрессии с взвешиванием 1/X. LLOQ при 0,4 нг/мл имеют отношение сигнал/шум 15,18, коэффициент асимметрии по USP 1,072 и число теоретических тарелок в соответствии с USP 39934, как показано на Фиг. 3А. Улучшенное отношение сигнал/шум (19,48) было получено при дополнительной корректировке инструмента (Фиг. 3В).

Таблица 1
Результаты валидационного исследования
Концентрация MB–102 (нг/мл) Количество наблюдений Средняя концентрация (нг/мл) RSD (%) % восстановления
380,0 3 384,7 0,73 101,2
160,0 3 159,6 0,80 99,7
60,0 3 59,3 0,76 98,8
20,0 3 19,8 1,46 99,2
3,0 3 2,9 3,20 95,7
Точность вводимых проб
200,0 10 198,5 0,45 99,2
Линейность
0,4 3 0,4 4,30 105,0
1,0 3 1,0 3,39 101,0
2,0 3 2,0 1,44 100,0
4,0 3 4,0 3,40 100,3
10,0 3 9,9 2,08 98,7
16,0 3 15,4 2,33 96,4
40,0 3 39,8 1,20 99,6
100,0 3 99,2 1,35 99,2
200,0 3 199,2 0,45 99,6
400,0 3 402,4 0,49 100,6
Slope 3 1,30E+04 1,61
3 0,9999 0,01
3 цикла замораживания/оттаивания
1,76 3 1,79 1,09 101,7
8,81 3 8,81 1,79 100,0
61,87 3 62,34 1,82 100,8
Стабильность раствора образца при 4°C в течение 48 часов
1,76 3 1,75 2,56 99,4
8,81 3 8,66 2,06 98,3
61,87 3 60,84 3,47 98,3
QC, полученные через три дня, которые хранили при 4°C в течение 48 часов
3,7 1 3,74 N/A 101,1
37,9 1 37,55 N/A 99,1
372,6 1 373,50 N/A 100,2
QC, полученные через три дня, которые хранили при комнатной температуре без света
3,7 1 3,87 N/A 104,6
37,9 1 37,15 N/A 98,0
372,6 1 372,58 N/A 100,0
QC, полученные через три дня, которые хранили при комнатной температуре со светом
3,7 1 3,76 N/A 101,6
37,9 1 36,40 N/A 96,0
372,6 1 364,59 N/A 97,9
Выделение MB–102, добавленного в плазму
0,6 3 0,67 4,24 111,7
6,0 3 6,14 5,48 102,3
60,0 3 60,25 2,9 100,4

[0078] Точность анализа была превосходной, показывая восстановление 99,2%, RSD 0,45% и точность в диапазоне от 95,7% до 101,2% восстановления для всех исследованных условий. Три цикла замораживания/оттаивания показывают, что плазма очень стабильна при –80°C. Стабильность раствора образца, хранящегося при 4°C и при комнатной температуре без света до 48 часов, также очень высокая. При хранении раствора при комнатной температуре со светом в течение 48 часов наблюдается небольшое разложение (~ 1–2%) MB–102. Все три концентрации восстановления добавленного соединения находились в пределах ± 15% добавленного количества. Чтобы определить чистоту пика MB–102, элюированного через 3,62 минуты для неизвестного образца, осуществляли осаждение белков из образца плазмы, супернатант высушивали и восстанавливали в PBS. Получали ВЭЖХ хроматограммы при 445 нм (в режиме PDA). Чистоту MB–102 PDA пика из образца с добавленным соединением в PBS сравнивали с чистотой пика из образца плазмы, взятого из клинического исследования. Результаты, показанные на Фиг. 4 и 5, показали, что пик MB–102, элюируемый через 3,62 минуты, который поглощает при 445 нм, из клинического исследования является чистым.

Анализ образцов от пациентов

[0079] В подтверждение клинических исследований для оценки полезности MB–102 для мониторинга функции почек путем трансдермального измерения флуоресценции получали образцы плазмы из образцов крови, взятых через 0, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360, 480, 600 и 720 минут у каждого участника исследования. Этот метод был передан в сертифицированную биоаналитическую лабораторию GMP для валидации и анализа образцов плазмы всего клинического исследования. Результаты, полученные из GMP лаборатории, сравнивали с результатами испытаний, полученными в собственной лаборатории, для обеспечения точности и воспроизводимости.

[0080] Образцы плазмы от 12 пациентов из одного и того же исследования использовали в собственной лаборатории для подтверждения результатов GMP лабораторных исследований. Сравнение результатов от этих субъектов, полученных в собственной лаборатории и GMP лаборатории, показано на Фиг. 6. Линейная регрессия корреляции показывает угол наклона 1,018 с R² 0,90303. Данные фармакокинетического анализа этих 12 субъектов показаны на Фиг. 7, и они показывают, что скорость клиренса МВ–102 варьируется между пациентами.

[0081] Поскольку в этом исследовании в качестве эталонного маркера вводили йогексол совместно с МВ–102, сравнение фармакокинетики МВ–102 и йогексола у трех субъектов показано на Фиг. 8а, 8b и 8с. Как показано на фигурах, скорость клиренса МВ–102 параллельна скорости клиренса йогексола для каждого из трех субъектов, как проиллюстрировано. Поэтому MB–102 может действовать аналогично йогексолу для определения СКФ.

[0082] Чтобы лучше понять корреляцию 1,0177, как показано на Фиг. 6, при сравнении измерений, выполненных в собственной лаборатории и в контрактной GMP лаборатории, был исследован традиционный метод подготовки образца плазмы путем осаждения белка для ВЭЖХ анализа. Образцы плазмы от тех же 12 субъектов анализировали с использованием модифицированного метода осаждения белка. График корреляции MB–102, определенный методом прямого разбавления в сравнении с методом осаждения белка, показан на Фиг. 9. Результаты с наклоном корреляции 1,0074 и R² 0,9944 полностью подтверждают достоверность анализа содержания MB–102 в плазме, подготовленной методом прямого разбавления. Подготовка образцов плазмы путем осаждения белка занимает много времени и требует установки дополнительного лабораторного оборудования. Подготовка образцов плазмы путем прямого разведения 1/100 в 1X PBS является простой, быстрой, прецизионной и точной.

[0083] Используя метод осаждения белка, были проанализированы образцы плазмы из клинического исследования 59 субъектов. Результаты сравнивали с результатами, полученными в GMP лаборатории, с использованием метода прямого разбавления. График корреляции этих двух наборов данных показан на Фиг. 10. Был получен наклон корреляции 1,0153 с R² 0,9941. p–Значение (0,579 > 0,05) из этих данных с использованием двухвыборочного t–критерия, предполагающего равные отклонения, указывает на то, что средние значения пар не являются статистически различными.

Анализ образцов крови, показывающих гемолиз

[0084] В процессе разработки способов, раскрытых в настоящем документе, было изучено влияние гемолиза на количественное определение MB–102 в плазме. Клинический протокол для сведения к минимуму гемолиза во время сбора крови и получения плазмы был передан и обсужден с клиницистами на месте испытания; однако среди всех образцов плазмы от 59 субъектов было отмечено несколько образцов с некоторой степенью гемолиза. Более 90% образцов плазмы, полученных из клинического исследования, имели содержание гемоглобина 50 мг/дл и ниже. В некоторых образцах плазмы содержание гемоглобина составляло от 100 до 250 мг/дл. Концентрацию MB–102 в этих образцах сравнивали с использованием методов прямого разбавления и осаждения белка. Результаты на Фиг. 11 представлены для образцов, имеющих содержание гемоглобина между 50 мг/дл и 100 мг/дл. Наклон (1,0194) кривой корреляции показал, что влияние на количественную оценку MB–102 является минимальным, по сравнению с наклоном (1,0153) кривой корреляции, показанной на Фиг. 10.

[0085] Результаты, показанные на Фиг. 12, представлены для образцов, в которых содержание гемоглобина составляет от 100 до 250 мг/дл. Наклон (1,1107) кривой корреляции указывает на влияние на количественное определение MB–102 по сравнению с наклоном (1,0153) кривой корреляции, показанной на Фиг. 10. Поскольку эти четыре образца плазмы были получены от четырех разных субъектов в разные моменты времени сбора образцов, их влияние на определение скорости клиренса и, следовательно, СКФ, не будет значительным.

[0086] Данные этих исследований показывают, что как способы прямого разбавления, так и способы осаждения с флуоресцентной детекцией являются прецизионными и точными и подходящими для анализа MB–102 в плазме человека.

1. Способ измерения количества флуоресцентного соединения в плазме, включающий:

сбор образца плазмы,

разбавление образца плазмы по меньшей мере одним растворителем и

анализ разбавленного образца при помощи ВЭЖХ для измерения, таким образом, количества соединения в плазме,

где образец плазмы не сушат перед анализом ВЭЖХ и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта,

где флуоресцентное соединение представляет собой

или его фармацевтически приемлемую соль.

2. Способ по п. 1, где образец плазмы демонстрирует признаки гемолиза крови.

3. Способ по п. 1, где плазма получена из исследования на людях, животных или in vitro.

4. Способ по п. 1, где по меньшей мере один растворитель представляет собой водный буфер, выбранный из группы, состоящей из фосфата, ацетата, бикарбоната, карбоната, формиата, глюконата, лактата, цитрата, сульфоната, аммония, гуанидиния, HEPES, какодилата, Tris, tris–HCl, малеата, бората, глицината, сукцината, PIPES и любой их комбинации.

5. Способ по п. 1, где по меньшей мере один растворитель представляет собой неводный растворитель, выбранный из группы, состоящей из метанола, этанола, этиленгликоля, этилацетата, гексана, хлороформа, DMF, DMSO, уксусной кислоты, ацетона, ацетонитрила, бутанола, тетрахлорида углерода, диэтиленгликоля, диэтилового эфира, DME, этиленгликоля, метиленхлорида, нитрометана, петролейного эфира, пропанола, пиридина, толуола, MTBE, триэтиламина, ксилола и бензола.

6. Способ по п. 1, где по меньшей мере один растворитель выбран из группы, состоящей из водных растворителей, неводных растворителей и любой их комбинации.

7. Способ по п. 1, где по меньшей мере один растворитель представляет собой PBS.

8. Способ измерения количества флуоресцентного соединения в плазме, включающий:

сбор образца плазмы,

добавление к образцу по меньшей мере одного растворителя, вызывая, таким образом, осаждение белков плазмы,

удаление осажденных белков плазмы из образца и

анализ образца при помощи ВЭЖХ для измерения, таким образом, количества соединения в плазме,

где образец не сушат перед анализом ВЭЖХ и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта,

где флуоресцентное соединение представляет собой

или его фармацевтически приемлемую соль.

9. Способ по п. 8, где удаление осажденных белков плазмы включает центрифугирование образца,

центрифугированный образец содержит супернатант и образовавшийся после центрифугирования осадок, и

супернатант разбавляют по меньшей мере одним растворителем перед анализом ВЭЖХ.

10. Способ по п. 8, где образец плазмы демонстрирует признаки гемолиза крови.

11. Способ по п. 8, где плазма получена из исследования на людях, животных или in vitro.

12. Способ по п. 8, где по меньшей мере один растворитель представляет собой водный буфер, выбранный из группы, состоящей из фосфата, ацетата, бикарбоната, карбоната, формиата, глюконата, лактата, цитрата, сульфоната, аммония, гуанидиния, HEPES, какодилата, Tris, tris–HCl, малеата, бората, глицината, сукцината, PIPES и любой их комбинации.

13. Способ по п. 8, где по меньшей мере один растворитель представляет собой неводный растворитель, выбранный из группы, состоящей из метанола, этанола, этиленгликоля, этилацетата, гексана, хлороформа, DMF, DMSO, уксусной кислоты, ацетона, ацетонитрила, бутанола, тетрахлорида углерода, диэтиленгликоля, диэтилового эфира, DME, этиленгликоля, метиленхлорида, нитрометана, петролейного эфира, пропанола, пиридина, толуола, MTBE, триэтиламина, ксилола и бензола.

14. Способ по п. 8, где по меньшей мере один растворитель выбран из группы, состоящей из метанола, PBS и любой их комбинации.

15. Способ по п. 8, где по меньшей мере один растворитель представляет собой PBS.

16. Способ по п. 8, где по меньшей мере один растворитель выбран из группы, состоящей из водных растворителей, неводных растворителей и любой их комбинации.

17. Способ по п. 16, где водный растворитель представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор, а неводный растворитель представляет собой метанол.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения наличия генетической предрасположенности к долголетию человека на основе данных о генетическом варианте локуса rs2802288.

Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах путем определения в периферической венозной крови беременной женщины иммунокомпетентных клеток, где в сроке 22-34 недели беременности до начала сохраняющей терапии определяют относительное содержание GranzymeB-продуцирующих терминально-дифференцированных клеток (GrB+CD62L-CD45RA+) в популяции CD8+ лимфоцитов и при их значении равном 8,2% или менее прогнозируют преждевременные роды.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу окрашивания антигенов при помощи флуоресцентных антител на свежезамороженных срезах опухоли и метастазов. Способ окрашивания антигенов при помощи флуоресцентных антител на свежезамороженных срезах опухоли и метастазов, заключающийся в том, что используют свежезамороженные срезы, переносят их на стекла с адгезивным покрытием, подвергают процессу инкубации в 2%-ном растворе формалина, сушат на воздухе при температуре 20-26°С в течение часа; на этапе регидратации стекла с фиксированными срезами помещают в ёмкость с солевым фосфатным буфером PBS на 15 минут, после чего производят отмывку в солевом фосфатном буфере два раза по 5 минут; следом на этапе демаскировки инкубируют препараты поочередно в 1%-ном додецилсульфате натрия и в солевом фосфатном буфере в течение 15 минут, далее промывают в солевом фосфатном буфере 3 раза по 5 минут; далее на этапе блокировки на мокрые срезы наносят 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, проводят блокировку в течение 30 минут и отмывают один раз 5 минут в солевом фосфатном буфере с добавлением детергента; следом проводят этап инкубации с первичными антителами, во влажной камере при температуре 20-26°С в течение 1 часа, далее промывают срезы в фосфатном буфере 3 раза по 5 минут; далее следует этап инкубации с вторичными антителами во влажной камере в течение 1 часа, после проводят отмывку 3 раза по 5 минут; далее происходит окрашивание ядер: на стекло наносят реагент Prolong DAPI, закрывают покровным стеклом, закрепляют прозрачным лаком.

Группа изобретений относится к области биомедицинских исследований, в частности к соединениям, которые можно применять для диагностики опухолей. Предложен флуоресцентный конъюгат, содержащий флуорохромный фрагмент F, соединенный c нацеливающим фрагментом T, где фрагмент F имеет формулу (I): Нацеливающий фрагмент Т обладает аффинностью в отношении опухолевого маркера.

Изобретение относится к новому производному 2-(хромено[4,3-d]пиримидин-5-ил)уксусной кислоты общей формулы I и к способу его получения. Соединение обладает флуоресценцией в фиолетово-синей области спектра 390-455нм и может быть использовано в качестве флуоресцентных красителей и/или зондов в биохимических исследованиях.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, педиатрии, акушерству и гинекологии. Предложен способ прегравидарного прогнозирования риска формирования спорадических септальных врожденных пороков сердца без хромосомных заболеваний в последующих поколениях.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способу получения В-клеток, секретирующих антиген-специфические антитела. Для получения B-клеток проводят следующие этапы: получение B-клеток из крови кролика; мечение IgG+-B-клеток и/или CD138+-B-клеток; инкубацию B-клеток при температуре 37°C в течение одного часа в среде для совместного культивирования перед размещением меченых B-клеток в виде одиночных клеток с последующим совместным культивированием с фидерными клетками в среде для совместного культивирования; выбор B-клетки, пролиферирующей на этом этапе; получение B-клетки.

Изобретение относится области люминесцентного анализа, в частности для медицинской диагностики биологических соединений и структур. Предложены соединения, представляющие собой хелатообразующие карбазолы общей формулы 1, имеющие два симметричных фторсодержащих β-дикарбонильных заместителя в положениях 3 и 6, а также N-карбоксилсодержащий спейсер.

Настоящее изобретение относится соединению формулы (I) или его мезомерным формам: где mCat+ или mAn- представляет собой органический или неорганический положительно/отрицательно заряженный противоион, и m представляет собой целое число, составляющее от 0 до 2; р представляет собой целое число, составляющее от 1 до 2; q представляет собой целое число, составляющее от 1 до 5; alk представляет собой углеродную цепочку, содержащую от 1 до 5 атомов углерода; Y представляет собой О или СН2; Z представляет собой ОН; n представляет собой 0 или 1; X представляет собой ОН или О-; Ra1 представляет собой SO3- или дополнительный С6-цикл, сконденсированный с соседним атомом углерода, где дополнительный цикл содержит SO3-; Ra2 представляет собой Н; Rc1 представляет собой С1-С6 алкил; Rc2 представляет собой С1-С6 алкил или группу С1-С6 алкилсульфоновой кислоты.

Изобретение относится к медицине, в частности к дерматовенерологии, и раскрывает способ прогнозирования риска развития инфекционных осложнений при атопическом дерматите на основании уровня экспрессии TLR-2 рецепторов моноцитами периферической крови.

Изобретение относится к аналитической химии и предоставляет способ количественного определения аминокапроновой кислоты (АКК) при ее совместном присутствии с сополимером 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона (СП) в различных готовых лекарственных формах, таких как, например, назальные капли или спреи.
Наверх