Способ очистки рекомбинантного ферментного препарата фосфолипазы а2 из штамма продуцента pichia pastoris

Авторы патента:

C12N15/52 - гены, кодирующие ферменты или проферменты

Владельцы патента RU 2746563:

Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения и очистки рекомбинантной фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber из штамм-продуцента Pichia pastoris. Изобретение позволяет получать рекомбинантную секреторную фосфолипазу А2 Streptomyces violaceoruber с высокой концентрацией и степенью очистки более 90%. Способ очистки фосфолипазы А2 из композиции, включающей фосфолипазу А2 и компоненты среды для культивирования клеток, включающий концентрирование культуральной жидкости на керамических фильтрах TAMI (10 кДа) с концентрированием объема культуральной жидкости в 5 раз, отличающийся тем, что способ состоит из нескольких последовательных стадий, после концентрирования производят разбавление концентрата культуральной жидкости в 10-кратном объеме буфера 20 мМ Tris-HCl рН=8.0, после чего разбавленный раствор культуральной жидкости наносят на анионообменную хроматографическую колонку с пришитыми к носителю четвертичными аминами и элюцию в 20 мМ Tris-HCl рН=8.0 в градиенте 0-1М хлорида натрия, и добавляют хлорид натрия до 2М к фракциям, не связавшимся с анионообменной хроматографической колонкой, затем на хроматографическую колонку наносят объединенные фракции с носителем для хроматографии гидрофобных взаимодействий, содержащие бутил-группы, затем объединенные фракции элюируют в 20 мМ Tris-HCl рН=8.0, в градиенте хлорида натрия от 2М до нуля, понижая содержание хлорида натрия, после чего производят сбор фракций в диапазоне 65-100% элюата, содержащих высокоактивную высокоочищенную фосфолипазу А2, которые объединяют после хроматографии гидрофобных взаимодействий. Изобретение позволяет получить высокоочищенный препарат рекомбинантной фосфолипазы А2 с высокой (более 90%) степенью очистки с выходом более 50% от начального содержания белка в культуральной жидкости. 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Фосфолипаза А2 является гидролазой, позволяющей гидролизовать фосфолипиды по положении sn-2 эфирной связи, с оптимумом активности при 55°С, рН 5.5. Предложен способ получения и очистки рекомбинантной фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber из штамм-продуцента Pichia pastoris. Изобретение позволяет получать рекомбинантную секреторную фосфолипазу А2 Streptomyces violaceoruber с высокой концентрацией и степенью очистки более 90%.

Изобретение относится к области индустриальной биотехнологии и может быть использовано в агропромышленной области для получения высокоочищенного препарата фосфолипазы А2 для ферментативного дегумирования растительного масла, в пищевой промышленности для получения лизо-фосфолипидов. Лизо-фосфолипиды активно применяются в пищевой промышленности в качестве эмульгаторов и при производстве майонеза.

Фосфолипаза А2 (ФЛА2) является фосфолипид-2-ацил гидролазой (Е.С.3.1.1.4), которая специфично катализирует гидролиз глицерофосфолипидов по sn-2 положению эфирной связи. ФЛА2 играет важную роль в передаче клеточного сигнала и катаболизме жирных кислот.

ФЛА2 присутствует практически во всех живых организмах, встречается в различных клеточных компартментах, белок присутствует, как и внутри клетки, так и во внеклеточном виде. Секреторная фосфолипаза А2 в виду ее хорошей стабильности является удобным объектом для промышленной биотехнологии.

На данный момент разработаны различные экспрессионные системы для синтеза секреторной фосфолипазы А2 в Streptomyces violaceoruber. Первые системы экспрессии рекомбинантной свиной ФЛА2 были созданы для Saccharomyces cerevisiae. В дальнейшем была экспрессирована человеческая секреторная ФЛА2 в Е. coli. Затем была разработана система для промышленного производства человеческой фосфолипазы А2 в системе клеток СНО.

Ранее была охарактеризована рекомбинантная ФЛА2 из Streptomyces, экспрессированная в P. pastoris. Для повышения эффективности производства были разработаны штаммы-продуценты с высокой копийностью гена, позволившие увеличить продукцию фермента в 1.4 раза.

Из уровня техники известны следующие решения для очистки фосфолипазы А2:

1) Получение фосфолипазы А2 в тельцах включения, т.е. агрегированной неактивной форме, при экспрессии в Е. coli [Purification and characterization of the second Streptomyces phospholipase A2 refolded from an inclusion body. Jovel S, Kumagai T, Danshiitsoodol N, Matoba Y, Nishimura M, Sugiyama M. Protein Expr Purif. 2006; 50(1):82-8. Epub 2006 May 26.], [Extracellular production of phospholipase A2 from Streptomyces violaceoruber by recombinant Escherichia coli. Takemori D, Yoshino K, Eba C, Nakano H, Iwasaki Y. Protein Expr Purif. 2012; 81(2): 145-50. doi: 10.1016/j.pep.2011.10.002. Epub 2011 Oct 14.]. После получения телец включения производился рефолдинг, при этом происходили большие потери и выходы свернутого активного белка были сравнительно небольшими, менее 27%.

2) Получение фосфолипазы А2 при экспрессии с последующей секрецией в Е. coli из культуральной жидкости. Последующие этапы очистки включают переосаждение сульфатом аммония, диализ, колоночную анионообменную хроматографию. Использование переосаждения сульфатом аммония приводило к частичной потери активности [A novel prokaryotic phospholipase А2. Characterization, gene cloning, and solution structure. Sugiyama M1, Ohtani K, Izuhara M, Koike T, Suzuki K, Imamura S, Misaki H. J Biol Chem. 2002;277(22):20051-8. Epub 2002 Mar 15.].

3) Получение фосфолипазы A2 при экспрессии с последующей секрецией в Е. coli из культуральной жидкости [Патент № CN 104328095 А Phospholipase А2 with most appropriate pH being in acid range and application thereof. Epub 2014.]. Белок из культуральной жидкости преципитировали ацетоном, преципитат перерастворяли в 10 мМ Tris-HCl, 20 мМ CaCl₂ рН=8.0, переводили при помощи гель-фильтрационной хроматографии на G-25 в 10 мМ цитрат натрия, рН=5.0. Далее фермент доочищался на катионообенной хроматографии на CM-Sepharose в градиенте 0-0,5М KCl.

4) Наиболее близким к заявленному способу является способ получение препарата фосфолипазы А2 при экспрессии в Pichia pastoris при помощи ультрафильтрации культуральной жидкости [Патент № RU 2676321 C1. Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV. Epub 2018.]. Культуральная жидкость подвергается ультрафильтрации последовательно на 100 кДа и 10 кДа мембране. Использование этого метода сопряжено с недостаточной степенью очистки и высокими потерями при очистке.

Основными недостатками известных методов очистки фосфолипазы А2 являются:

- высокая стоимость используемых реактивов и сорбентов, что отражается на себестоимости финального продукта;

- нетехнологичность приведенных методов очистки, их немасштабируемость и сложность;

- высокие потери при очистке или невысокая степень очистки полученного продукта.

Целью создания изобретения являлось создание альтернативного трехстадийного метода очистки, позволяющего получить концентрированную фосфолипазу А2 с высокой степенью очистки.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение высокоочищенной рекомбинантной фосфолипазы А2 с высокой (более 90%) степенью очистки с выходом более 50% от начального содержания белка в культуральной жидкости.

Способ выделения рекомбинантной фосфолипазы А2 из Streptomyces violaceoruber основан на использовании последовательных этапов очистки культуральной жидкости. Каждый из этих этапов играет свою роль и именно их последовательное применение и совместное использование позволяет достигать заявленного технического результата. Данные этапы включают в себя:

1) Концентрирование культуральной жидкости на керамических фильтрах TAMI (10 кДа) с концентрированием объема культуральной жидкости в 5 раз;

2) Разбавление культуральной жидкости в 10 кратным объемом буфера 20 мМ Tris-HCl рН=8.0;

3) Нанесение разбавленного раствора культуральной жидкости на анионобменную хроматографическую колонку с пришитыми к носителю четвертичными аминами и элюцию в 20 мМ Tris-HCl рН=8.0 в градиенте 0-1М NaCl; фракции, содержащие рекомбинантную фосфолипазу А2 не связываются с хроматографической колонкой;

4) Добавление хлорида натрия до 2М к фракциям, не связавшимся с анионообменной хроматографической колонкой;

5) Нанесение объединенных фракции на хроматографическую колонку с носителем для хроматографии гидрофобных взаимодействий, содержащими бутил-группы,

6) Элюцию в 20 мМ Tris-HCl рН=8.0, в градиенте хлорида натрия от 2М до нуля, понижая содержания хлорида натрия, сбор фракций в диапазоне 65-100% раствора Б; фракции после хроматографии гидрофобных взаимодействий объединяют; объединенные фракции являются конечным продуктом и содержат высокоактивную высокоочищенную фосфолипазу А2.

Пример №1. Очистка методом анионообменной хроматографии.

Культуральная жидкость объемом 4 л была сконцентрирована до объема 0,75 л на керамических фильтрах TAMI (10 кДа). Полученный после тангенциальной фильтрации раствор ФЛА2 разбавляли 10-кратным объемом буфера 20 мМ Tris-HCl рН=8.0 и наносили на хроматографическую колонку Sepharose Q Fast Flow. Элюцию проводили 20 мМ Tris-HCl рН=8.0 в градиенте 0-1М NaCl. Эффективность разделения была значительно лучше, чем при разделении на катионообменной смоле, чистота препарата составила ~70-75%.

При 10х кратном разбавлении раствора фосфолипазы А2 после тангенциальной фильтрации целевой продукт выходил в не адсорбировавшихся фракциях. Для увеличения выхода фосфолипазы А2 в не адсорбировавшихся фракциях в качестве раствора А использовали 20 мМ Tris-HCl, 20 мМ NaCl, рН=8.0. При этом примеси адсорбировались на хроматографическую колонку. Чистота фракций, содержащий целевой продукт была ~80% по белку.

Фосфолипаза А2 не связывалась с колонкой, при этом примеси адсорбировались на хроматографической колонке.

Пример №2. Очистка методом хроматографии гидрофобных взаимодействий.

С помощью анионообменной хроматографии препарат ФЛА2 удалось избавить от более крупных белковых примесей. После проведения анионообменной хроматографии использовали хроматографию гидрофобных взаимодействий. Был использован носитель Butyl-Sepharose Fast Flow. Не адсорбировавшиеся фракции после анионообменной хроматографии объединяли, добавляли 8,7 г NaCl на 50 мл фракций (до 3М NaCl) и наносили при скорости потока 1 мл/мин на хроматографическую колонку. Элюцию проводили 20 мМ Tris-HCl рН=8.0, понижая содержания хлорида натрия. Фракции собирали в диапазоне 65-100% раствора Б. Эти фракции содержали высокоочищенный препарат фосфолипазы А2.

Гидрофобная хроматография позволила избавиться от подавляющего большинства примесных продуктов, добиться высокой (~90% по данным денситометрического анализа) степени очистки, а также сконцентрировать образец. После очистки активность полученной фосфолипазы А2 соответствовала ферментативной активности в 210 ед./мл.

Пример №3. Определение фосфолипазной активности.

Фосфолипазную активность определяли с использованием флуоресцентного субстрата 1 -пальминтоил-2-(10-пиренилдеканоил)-зп-глицеро-3-фосфорилхолина (10-pyrene PC, Molecular probes, Голландия). Для измерения флуоресценции к 1 мл буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl, рН=7.5, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA добавляли 10 мкл субстрата (конечная концентрация 2 мкМ), 10 мкл 10% раствора БСА (конечная концентрация 0,1%), и 6 мкл 1М CaCl₂ (конечная концентрация 6 мМ). Реакцию инициировали добавлением 5 мкл раствора 0.5 мг/мл ФЛА2. В качестве положительного контроля использовали кислую ФЛА2 СМ2 из яда кобры N. kaouthia. Флуоресценцию детектировали на флуоресцентном спектрофотометре Fluoromax-4(HORIBA Scientfic, UK) (λex_max=345 нм, λeм_max=395 нм).

Активность фосфолипаз А2 рассчитывали по формуле A=2×10^-4×(S-S₀)×V/Fmax и приводили в мг белка, где S - увеличение интенсивности флуоресценции в минуту в присутствии фосфолипазы; S0 - увеличение интенсивности флуоресценции в минуту в контроле; V - объем добавляемого 0,2 мМ 10-pyrene PC, мкл; Fmax - максимальная интенсивность флуоресценции при добавлении 5 мкг кислую ФЛА2 СМ2 из яда кобры N. kaouthia.

Способ очистки фосфолипазы А2 из композиции, включающей фосфолипазу А2 и компоненты среды для культивирования клеток, включающий концентрирование культуральной жидкости на керамических фильтрах TAMI (10 кДа) с концентрированием объема культуральной жидкости в 5 раз, отличающийся тем, что способ состоит из нескольких последовательных стадий, после концентрирования производят разбавление концентрата культуральной жидкости в 10-кратном объеме буфера 20 мМ Tris-HCl рН=8.0, после чего разбавленный раствор культуральной жидкости наносят на анионообменную хроматографическую колонку с пришитыми к носителю четвертичными аминами и элюцию в 20 мМ Tris-HCl рН=8.0 в градиенте 0-1М хлорида натрия, и добавляют хлорид натрия до 2М к фракциям, не связавшимся с анионообменной хроматографической колонкой, затем на хроматографическую колонку наносят объединенные фракции с носителем для хроматографии гидрофобных взаимодействий, содержащие бутил-группы, затем объединенные фракции элюируют в 20 мМ Tris-HCl рН=8.0, в градиенте хлорида натрия от 2М до нуля, понижая содержание хлорида натрия, после чего производят сбор фракций в диапазоне 65-100% элюата, содержащих высокоактивную высокоочищенную фосфолипазу А2, которые объединяют после хроматографии гидрофобных взаимодействий.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения рекомбинантного полипептида включает: обеспечение подпитываемого периодического биореактора объемом от 100 л до 25000 л, содержащего клетки, способные экспрессировать рекомбинантный полипептид асфотазы альфа, и культуральную среду, подходящую для проведения такой экспрессии, при этом культуральная среда содержит от приблизительно 25 мкМ до приблизительно 300 мкМ цинка; культивирование этих клеток в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантной асфотазы альфа, при этом добавление по меньшей мере одного болюса подпитки в культуральную среду во время культивирования и культивирование клеток при первой температуре до достижения плотности клеток по меньшей мере приблизительно 2,5×106 жизнеспособных клеток и перехода к второй температуре, которая ниже, чем первая температура.

Микроорганизмы для получения о-сукцинилгомосферина и способ получения 0-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов // 2744938

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения метионина, включающий а) культивирование микроорганизма в среде; б) получение O-сукцинилгомосерина из микроорганизма или среды; в) превращение О-сукцинилгомосерина в метионин с использованием цистатионин-гамма-синтазы или O-сукцинилгомосеринсульфгидрилазы, где микроорганизм представляет собой микроорганизм Escherichia sp., продуцирующий O-сукцинилгомосерин, экспрессирующий полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосеринсукцинилтрансферазной активностью, где полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Способы получения промышленных продуктов из растительных липидов // 2743384

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения нефтепродукта, включающий стадии:(i) обработки в реакторе композиции, содержащей (a) вегетативные части растения, сухая масса которых составляет по меньшей мере 2 г и в которых общее содержание неполярных липидов составляет по меньшей мере 5% масс., в пересчете на сухую массу,(b) растворитель, который содержит воду, спирт или и то, и другое, и (c) необязательно катализатор, причем обработка включает нагревание композиции при температуре от около 270°C до около 400°C и давлении от 70 до 350 бар на протяжении периода от 1 до 120 минут в окислительной, восстановительной или инертной среде,(ii) извлечение нефтепродукта из реактора с выходом по меньшей мере 35% масс., в пересчете на сухую массу вегетативных частей растения, с получением таким образом нефтепродукта, где нефтепродукт является углеводородным продуктом, включающим эфиры жирных кислот, один или несколько алканов, один или несколько алкенов или комбинацию любых двух или нескольких из них.

Рекомбинантное получение стевиол-гликозидов // 2741103

Изобретение относится к области области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ получения соединения стевиол–гликозида или композиции стевиол–гликозидов, соединение ребаудиозида Z2, подсластитель, содержащий вышеуказанное соединение ребаудиозид Z2, и применение подсластителя в пищевом продукте.

Штамм гриба penicillium canescens mtcbhi продуцент термостабильной целлобиогидролазы i и ферментный препарат на его основе для биоконверсии возобновляемого растительного сырья в сахара // 2741078

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к созданию и производству ферментных препаратов (ФП), содержащих высокоактивные и термостабильные ферменты.

Варианты химозина с улучшенными свойствами // 2740317

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный вариант полипептида химозина, отличающийся тем, что он(а) имеет удельную свертывающую активность (IMCU (международная молокосвертывающая единица)/мг общего белка), которая составляет по меньшей мере 70% удельной свертывающей активности выделенного полипептида верблюжьего химозина, характеризующегося SEQ ID NO:4; и (б) расщепляет казеин с частотой меньше чем 50% от частоты расщепления казеина выделенного полипептида верблюжьего химозина, характеризующегося SEQ ID NO:4, где расщепление казеина определяют посредством количественного определения пептидов казеина, полученных инкубированием обезжиренного молока с вариантом химозина или верблюжьим химозином, где количественное определение осуществляют посредством RPHPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой) в сочетании с ESI-Q-TOF масс-спектрометром (времяпролетный квадрупольный масс-спектрометр с электрораспылительной ионизацией).

Вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы и способ получения пуринового нуклеотида с его использованием // 2736372

Группа изобретений относится к биотехнологии. Вариант фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазы, где (1) аминокислота в положении 2 заменена на метионин, (2) аминокислота в положении 445 заменена на аргинин или (3) аминокислота в положении 2 заменена на метионин и аминокислота в положении 445 заменена на аргинин от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

Полипептиды транспозазы и их применение // 2735700

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и представляет собой полипептиды и полинуклеотиды транспозазы, которые обладают высокой активностью в клетках млекопитающих.

Новая термостабильная фруктозо-6-фосфат-3-эпимераза и способ получения аллюлозы с ее использованием // 2733427

Изобретение относится к применению фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для получения аллюлозы. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для получения аллюлозы, содержащей фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразу по настоящему изобретению, и к способу получения аллюлозы с использованием фруктозо-6-фосфат-3-эпимеразы по настоящему изобретению.

Модифицированная гомосериндегидрогеназа и способ получения гомосерина или l-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, с использованием такой гомосериндегидрогеназы // 2733426

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к модифицированной гомосериндегидрогеназе и к способу получения L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, с использованием такой гомосериндегидрогеназы.