Интрогрессия двух qtl урожая в растения cucumis sativus

Авторы патента:

КЕЛЕВИЙН, Ханс-Петер (NL)

КАСА, Александра М. (US)

РЁЛИНГ, Герхард Т.М. (NL)

ВАН ДЕ ВАЛ, Марион (NL)

КРААН, Петер Арнольд Гийсберт (NL)

БЕЕНДЕРС, Франк (NL)

КАНГАЛ, Гюлай (NL)

ТЭНКСЛИ, Стивен Д. (US)

ГЕРМАНС, Фредди Виллем Карел (NL)

C12Q1/6827 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

A01H5/10 - семена

A01H5/08 - плоды

A01H5/00 - Цветковые, например покрытосеменные растения

A01H1/04 - способы селекции

Владельцы патента RU 2746936:

НУНХЕМС Б.В. (NL)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к культивированному растению Cucumis sativus var. sativus, содержащему фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца на хромосоме 2 в гомозиготной или гетерозиготной форме. Причем растение обладает увеличенным урожаем плодов по сравнению с растением, не содержащим указанный фрагмент интрогрессии. Также раскрыто семя, пригодное для выращивания вышеуказанного растения. Изобретение обладает увеличенным урожаем плодов по сравнению с растением, не содержащим вышеуказанный фрагмент интрогрессии. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 2 пр.

Настоящее изобретение относится к области разведения огурцов. Обеспечивается локус количественных признаков (QTL), расположенный на хромосоме 2 генома культивированного огурца и/или интрогрессия хромосоме 6 генома культивированного огурца, которые могут применяться для увеличения урожая культивированных огурцов (Cucumis sativus сорт sativus), таких как корнишоны (например, виды American pickling, European pickling), салатные огурцы (например, American slicing), длинные огурцы, короткие огурцы. Европейские тепличные огурцы, огурцы типа Бейт-Альфа, огурцы типа oriental trellis (также обозначаемые как 'burpless'), Азиатские огурцы (которые могут быть далее подразделены на различные типы, такие как индийский пестрый огурец, китайский длинный огурец, корейский огурец и японский огурец, причем первый относится к индийской группе огурцов, а последние три к восточноазиатской группе огурцов).

QTL увеличения урожая на хромосоме 2 обозначается в ненастоящей заявке как QTL2.1, и QTL увеличения урожая на хромосоме 6 обозначается как QTL6.1. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, оба представляют собой интрогрессии из одного и того же родственника огурца, т.е. из одного и того же номера доступа, и в одном варианте выполнения настоящего изобретения даже из одного и того же растения. Одно растение дикого родственника огурца было использовано для создания двойной гаплоидной популяции, которая затем использовалась для картирования и для интрогрессии QTL в европейский длинный тип огурца. Из этого типа один или оба QTL легко переносится в любой другой культивированный тип огурца, такой как короткие типы огурцов, или в другие линии разведения или сорта длинного огурца. Семена, содержащие оба фрагмента интрогрессии в гомозиготной форме, депонировали под номером доступа NCIMB 42545.

QTL увеличения урожая на хромосоме 2 изначально не был обнаружен, так как при картировании проекция QTL отрицательного влияния на урожай, уменьшающий массу плода, была обнаружена в той же области (смотрите Фиг. 1, наверху LOD диаграмма QTL положительного влияния на урожай, QTL2.1, на хромосоме 2, и внизу LOD диаграмма QTL отрицательного влияния на урожай, QTL2.2, на хромосоме 2).

Только после дальнейшего обратного скрещивания и экспериментов с урожаем с тестовыми гибридами становится очевидным, что QTL положительного влияния на урожай и QTL отрицательного влияния на урожай на хромосоме 2 могут быть разделены, т.е. находиться в различных областях.

влияние QTL отрицательного влияния на урожай становится очевидным, при сравнении линии, содержащей фрагмент интрогрессии с как QTL2.1, так и QTL2.2, с линией, содержащей только QTL2.1 (и без QTL2.2). Средняя длина плода уменьшилась в первой линии (содержащей QTL2.2) на более чем 2 см в длину.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение огурца, содержащее фрагмент интрогрессии на хромосомах 2, содержащий QTL2.1, причем фрагмент интрогрессии значительно увеличивает урожай плодов культивированного огурца, содержащего интрогрессию, по сравнению с таким же культивированным огурцом, не содержащим интрогрессию. Также один или более молекулярных маркеров (особенно однонуклеотидного полиморфизма или SNP), которые присутствуют на фрагменте интрогрессии и которые указывают на присутствие фрагмента интрогрессии, и способы применения таких маркеров обеспечиваются в настоящей заявке. Подобным образом, семена, части растений, клетки и/или ткани, содержащие QTL2.1 на хромосоме 2, обеспечиваются. В одном варианте выполнения настоящего изобретения растения, семена, части растений, клетки и/или ткани содержат фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца, причем фрагмент интрогрессии, содержащий QTL2.1, QTL которого расположен физически в области, начинающейся при 5.0 Мб и заканчивающейся при 11.0 Мб хромосомы 2. В одном варианте выполнения настоящего изобретения другие области хромосомы 2, т.е. от 0 Мб до 5.0 Мб и/или от 11.0 Мб до конца хромосомы 2 содержат или состоят из хромосомных областей культивированного огурца.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии не содержит QTL отрицательного влияния на урожай на хромосоме 2, который уменьшает среднюю массу плода на растение. Этот QTL отрицательного влияния на урожай в настоящей заявке упоминается как QTL2.2. Таким образом, фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца содержит в одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL2.1, и один или более SNP, связанных с QTL2.1, но не содержит QTL2.2. В семенах культивированного Cucumis sativus, депонированных заявителем под номером доступа NCIMB42545, QTL2.1 и QTL6.1 присутствуют в гомозиготной форме, тогда как QTL2.2 отсутствует (и, вместо этого, геном культивированного огурца присутствует в этой области).

В одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL2.1 (т.е. фрагмент интрогрессии, содержащий QTL) присутствует в гетерозиготной форме в культивированном растении огурца, клетке или ткани, особенно в длинном огурце. В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL2.1 (т.е. фрагмент интрогрессии, содержащий QTL) присутствует в гомозиготной форме в культивированном растении огурца, клетке или ткани, особенно в длинном огурце. В конкретном варианте культивированное растение огурца представляет собой F1 гибрид, особенно F1 гибрид, полученный посредством скрещивания двух инбредных родительских линий, причем по меньшей мере одна из родительских линий содержит QTL2.1 (т.е. фрагмент интрогрессии, содержащий QTL) в гомозиготной форме. В конкретном варианте культивированное растение огурца не содержит какие-либо другие фрагменты интрогрессии на хромосоме 2 генома огурца, которые влияют на урожай, предпочтительно хромосома 2 не содержит по меньшей мере QTL2.2.

QTL увеличения урожая на хромосоме 6 обнаруживается при низких температурах и, как оказалось, представляет собой QTL устойчивости к холоду, увеличения урожая в периоды осени и зимы и в более холодных климатических регионах. Поэтому, например, когда тепличные огурцы растут в более холодном климате или более холодные периоды года, такие как осень и зима, в странах южной Европы и Евразии, или более холодных областях, таких как северная Европа и Канада (или Северная Америка), QTL6.1 далее увеличивает урожай линий скрещивания и сортов, адаптированных для этого климата. Этот QTL, поэтому, особенно подходит для увеличения урожая сортов, адаптированных для более холодных температур. Однако необходимо понимать, что мороза необходимо избегать.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение огурца, содержащее фрагмент интрогрессии на хромосоме 6, содержащий QTL6.1, причем фрагмент интрогрессии значительно увеличивает урожай плодов культивированного огурца, содержащий интрогрессию, по сравнению с тем же самым культивированным огурцом, не содержащим интрогрессию. Также один или более молекулярных маркеров (особенно однонуклеотидного полиморфизма или SNP), которые присутствуют на фрагменте интрогрессии и которые указывают на присутствие фрагмента интрогрессии, и способы применения таких маркеров, обеспечиваются в настоящей заявке. Подобным образом, семена, части растений, клетки и/или ткани, содержащие QTL6.1 на хромосоме 6 и содержащие в ином случае хромосому 6 культивированного огурца в их геноме, обеспечиваются. В одном варианте выполнения настоящего изобретения растения, семена, части растений, клетки и/или ткани содержат фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца, причем фрагмент интрогрессии содержит QTL6.1, QTL которого расположен физически в области, начинающейся при 25.0 Мб и заканчивающейся при 29.0 Мб хромосомы 6. В одном варианте выполнения настоящего изобретения другие области хромосомы 6, т.е. от 0 Мб до 25.0 Мб и/или от 29.0 Мб до конца хромосомы 6 содержат или состоят из хромосомных областей культивированного огурца.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL6.1 (т.е. фрагмент интрогрессии, содержащий QTL) присутствует в гетерозиготной форме в культивированном растении огурца, клетке или ткани, предпочтительно в длинном огурце. В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL6.1 (т.е. фрагмент интрогрессии, содержащий QTL) присутствует в гомозиготной форме в культивированном растении огурца, клетке или ткани, предпочтительно в длинном огурце. В конкретном варианте культивированное растение огурца представляет собой F1 гибрид, особенно F1 гибрид, полученный путем скрещивания двух инбредных родительских линий, причем по меньшей мере одна из родительских линий содержит QTL6.1 (т.е. фрагмент интрогрессии, содержащий QTL) в гомозиготной форме. В конкретном варианте культивированное растение огурца не содержит какие-либо другие фрагменты интрогрессии на хромосоме 6 генома огурца, который влияет на урожай.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается культивированное растение огурца, содержащее как QTL2.1, так и QTL6.1 согласно настоящему изобретению, либо оба в гомозиготной форме, например, в инбредной родительской линии, или оба в гетерозиготной форме, например, в F1 гибриде, полученном путем скрещивания инбредной родительской линии, содержащей как QTL2.1, так и QTL6.1 в гомозиготной форме, с инбредной родительской линии, не содержащей как QTL2.1, так и QTL6.1. Как упомянуто, в семенах Cucumis sativus, депонированных заявителем под номером доступа NCIMB42545, QTL2.1 и QTL6.1 присутствуют в гомозиготной форме. Однако, QTL2.1 и QTL6.1 также могут применяться независимо для создания растений огурца, линий скрещивания и сортов с увеличенным выходом.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению обеспечивается культивированное растение огурца, содержащее как QTL2.1, так и QTL6.1 согласно настоящему изобретению, причем один из QTL находится в гомозиготной форме, и другой QTL находится в гетерозиготной форме.

В другом варианте, культивированное растение огурца содержит QTL2.1 и/или QTL6.1 из дикого родственника огурца, причем кроме фрагмента интрогрессии, сохраняющий хромосому 2 и/или 6 геном представляет собой геном культивированного огурца, в одном варианте выполнения настоящего изобретения Европейского тепличного огурца.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения также другие хромосомы присутствуют во всем геноме культивированного огурца, как например геном Европейского тепличного огурца. То есть в одном варианте выполнения настоящего изобретения согласно настоящему изобретению культивированный огурец содержит только один фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца в его геноме (содержащий либо QTL2.1, либо QTL6.1 в гомозиготной или гетерозиготной форме) или содержит только два фрагмента интрогрессии из дикого родственника огурца в его геноме, один, содержащий QTL2.1, и один, содержащий QTL6.1, причем оставшийся геном представляет собой геном культивированного огурца. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, два фрагмента интрогрессии происходят из одного и того же дикого родственника огурца, например, из одного и того же вида, предпочтительно из одного и того же номера доступа, необязательно даже из одного и того же растения этого номера доступа.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения, культивированное растение огурца согласно настоящему изобретению может, в дополнение к QTL2.1 и/или QTL6.1, содержать один или более других фрагментов интрогрессии из диких родственников огурца в его геноме. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, эти другие фрагменты интрогрессии не находятся на хромосоме 2 и/или на хромосоме 6.

Уровень техники

Культивированный огурец (Cucumis sativus сорт sativus L.) является важной овощной культурой во всем мире. Он принадлежит к семейству Cucurbitaceae. Предполагается, что он происходит из Юго-Восточной Азии от диких предков с небольшими горькими плодами, такими как Cucumis sativus сорт hardwickii.

Геном культивированного огурца имеет семь пар хромосом (n=7), и размер гаплоидного генома составляет около 367 Мб (мегабазы) с общей оценкой около 26,682 генов. Геном огурца стал первым геномом овощной культуры, который был секвенирован (Huang et al. 2009, Nature Genetics, Volume 41, Number 12, p1275-1283 и http://www.icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/).

Урожай культивированного огурца в последние десятилетия не увеличился. Shetty и Wehner 2002 (CropSci. 42: 2174-2183) провели скрининг USDA коллекции зародышевой плазмы огурца по качеству плодов и урожайности плодов в полевых условиях в Северной Каролине (США) и предположили, что культурные сорта с высокой урожайностью, выявленные в их исследовании, могут быть использованы для разработки культурных сортов с высокой урожайностью.

В WO2009/082222 применялись сведения, полученные Shetty и Wehner в 2002 (выше) для экземпляров Turkish Beit-Alpha местный сорт PI 169383, для идентификации QTL для массы плодов огурцов на стадии сбора урожая на группе сцепления 3 и/или 4 для PI69383.

Yuan et al. 2008 (Euphytica 164: 473-491) нанесли на генетическую карту специфические признаки плода в кроссе между северным китайским огурцом S94 и северо-западным европейским огурцом S06. Их группа сцепления 3, как оказалось, соответствует физической хромосоме 2, и их группа сцепления 2, как оказалось, соответствует физической хромосоме 6. Их нанесли в локусе, называемом fw2.1 (масса плода) вверху хромосомы 6 (LG2), и их нанесли в локусе, называемом fw3.1 (масса плода) внизу хромосомы 2 (LG3). Их нанесли в локусе, называемом fl3.1 (длина плода) в том же положении, как в локусе fw3.1, при картировании на основе разности в длине плода между S94 (плоды 30 см в длину) и S06 (плоды 15 см в длину). Однако они не отображали общий урожай плодов.

Fazio et al. 2003 (Theor Appl Genet 107: 864-874) нанесли на генетическую карту признаки, включая накопленные плоды на растение за три урожая и морфологические признаки, такие как мелколистность ('11'). Их группа сцепления 1, как оказалось, соответствует физической хромосоме 6. Локус, называемый fpl1.2 (плоды на растение), был постоянным в обеих окружающих средах, и локализовался в локусе мелколистности. Мелколистность физически локализуется в области, охватывающей 7 Мб и 8.5 Мб физической хромосомы 6, т.е. в вершине хромосомы 6.

Wei et al. 2014 (BMC Genomics 15: 1158, p1-10) раскрывают генетическую карту длины незрелого и зрелого плода и массы незрелого плода в популяции, полученной в результате скрещивания между китайской инбредной линией огурца (СС3) и NC76. NC76 получен из местного сорта Cucumis sativus сорт sativus из Афганистана (PI246930). Они обнаружили QTL для длины незрелого плода на группе сцепления 6.

WO2016/059090 и WO2016/059092 оба описываю два повышающих урожай QTL, один на хромосоме 2 в области от 0.4 до 2.9 Мб хромосомы и один на хромосоме 6 в области от 26 Мб до конца хромосомы, интрогрессированных из одного огурца дикого типа в культивированный огурец типа для засаливания. Семена культивированного огурца типа для засаливания, содержащие оба QTL в гетерозиготной форме, депонированы под номером NCIMB42262. Донор, применяемый в WO2016/059090 и WO2016/059092, отличен от донора, применяемого в настоящем изобретении.

Все еще сохраняется потребность в идентификации QTL для повышения общего (кумулятивного) урожая плодов огурца, чтобы обеспечить увеличение урожая современных сортов огурца, особенно в типах длинного огурца, подходящих для культивирования в теплице, например, культивирование с подвесной проволокой или традиционная зонтичная система для культивации. В частности обеспечиваются фрагменты интрогрессии, содержащие QTL повышения урожая, которые не содержат области интрогрессии, которые уменьшают среднюю длину плода. Также фрагменты интрогрессии, которые являются подходящими для повышения среднего урожая плодов в холодных условиях роста, желательны.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает LOD диаграммы результатов QTL картирования, где на хромосоме 2 QTL положительного влияния на урожай (QTL2.1, верхний чертеж) и QTL отрицательного влияния на урожай (QTL2.2, нижний чертеж) обнаруживаются очень близко друг другу, с пиком (вертикальная пунктирная линия) при почти том же самом положении на Х-оси (хромосома 2). QTL2.2 значительно уменьшил среднюю длину плода.

Общие определения

Форма единственного числа не исключает возможность, что присутствует более, чем один элемент, если исходя из контекста не следует, что присутствует один и только один из элементов. Форма единственного числа, таким образом, как правило, означает "по меньшей мере один".

Как применяется в настоящей заявке, "растение" включает в себя целое растение или любые части или их производные, такие как органы растений (например, собранные или несобранные органы накопления запасных питательных веществ, клубни, плоды, листья, семена, и т.д.), растительные клетки, протопласты растений, культуры растительных клеток или тканей, из которых могут быть регенерированы целые растения, каллусы растений, скопления клеток растений и растительные клетки, которые являются интактными в растениях, или части растений, такие как зародыши, пыльца, семяпочки, завязи, плоды (например, собранные ткани или органы, такие как собранные плоды огурца или их части), цветы, листья, семена, клубни, луковицы, размноженные клонами растения, корни, корнеплоды, стебли, верхушки корней и тому подобное. Также включена любая стадия развития, такая как саженцы, незрелые и зрелые, и т.д. Когда упоминаются «семена растения», они либо относятся к семенам, из которых растение может быть выращено, или к семенам, произведенным на растении, после самоопыления или перекрестного опыления.

«Сорт растения» представляет собой группу растений в пределах одного и того же ботанического таксона наименьшей известной степени, которая (независимо от того, выполнены ли условия для признания прав селекционера растений или нет) может быть определена на основе выражения признаков, которую в результате определенного генотипа или комбинации генотипов можно отличить от любой другой группы растений посредством выражения по меньшей мере одного из этих признаков, и можно рассматривать как единое целое, потому что можно размножать без какого-либо изменения. Поэтому термин «сорт растения» не может применяться для обозначения группы растений, даже если они одного вида, если все они характеризуются наличием одного или двух локусов или генов (или фенотипических характеристик, обусловленных этими конкретными локусами или генами), но которые могут сильно отличаться друг от друга в отношении других локусов или генов.

"F1, F2, F3, и т.д." относится к последовательным родственным поколениям после кросса между двумя родительскими растениями или родительскими линиями. Растения, выращенные из семян, полученных скрещиванием двух растений или линий, называют поколением F1. Самоопыление растений F1 приводит к поколению F2 и т.д.

Растение "F1 гибрид" (или F1 гибридное семя) представляет собой поколение, полученное скрещиванием двух инбредных родительских линий. Таким образом, F1 гибридные семена представляют собой семена, из которых вырастают F1 гибридные растения. F1 гибриды являются более сильными и дают более высокий урожай, благодаря гетерозису. Инбредные линии, по существу, являются гомозиготными в большинстве локусов генома.

Термин "линия растения" или "линия скрещивания" относится к растению и его потомству. Как применяется в настоящей заявке, термин "инбредная линия" относится к линии растений, которая неоднократно самоопылялась и является почти гомозиготной. Таким образом, термин "инбредная линия" или "родительская линия" относится к растению, которое подвергалось нескольким генерациям (например, по меньшей мере 5, 6, 7 или более) инбридинга, приводя к линии растения с высокой однородностью.

Термин "аллель (аллели)" означает любую одну или более альтернативные формы гена в конкретном локусе, все аллели которого относятся к одному признаку или характеристике в конкретном локусе. В диплоидной клетке организма аллели данного гена расположены в определенном месте или локусе (множество локусов) на хромосоме. Один аллель присутствует на каждой хромосоме пары гомологичных хромосом. Диплоидные виды растений могут содержать большое количество различных аллелей в определенном локусе. Это могут быть одинаковые аллели гена (гомозиготные) или два разных аллеля (гетерозиготные). Таким образом, например, в настоящей заявке может быть сделана ссылка на "аллель урожая" или "положительную аллель урожая" локуса урожая QTL2.1 и/или QTL6.1.

Термин «ген» означает последовательность (геномную) ДНК, содержащую область (транскрибируемый участок), которая транскрибируется в молекулу информационной РНК (мРНК) в клетке и функционально связанную регуляторную область (например, промотор). Различные аллели гена представляют собой, таким образом, различную альтернативную форму гена, которая может быть в виде, например, различий в один или более нуклеотидов в геномной последовательности ДНК (например, в промоторной последовательности, экзонных последовательностях, интронных последовательностях и т.д.), мРНК и/или аминокислотной последовательности кодируемого белка.

Термин "локус" (множество локусов) означает определенное место или места или участок на хромосоме, где обнаруживается, например QTL, ген или генетический маркер. Таким образом, локус урожая (локус увеличения урожая) является местом в геноме огурца, где QTL2.1 или QTL6.1 обнаруживается. В культивированном огурце согласно настоящему изобретению QTL находятся на хромосоме 2 и/или 6 (применяя хромосомное ассигнование из Huang et al. 2009, Nature Genetics, Volume 41, Number 12, p1275-1283 и http://www.icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/) т.е. они интрогрессированы в геном культивированного огурца (т.е. на хромосому 2 и/или 6) из дикого родственника огурца.

Термин "локус количественных признаков", или "QTL" представляет собой хромосомный локус, который кодирует один или более аллелей, которые влияют на экспрессивность непрерывно распределенного (количественного) фенотипа. Локус количественных признаков, обеспечивающий увеличенный урожай (или "QTL урожая"), называют в настоящей заявке QTL2.1 и QTL6.1.

"Геном огурца" и "физическое положение в геноме огурца" и "хромосома 2 и/или 6" относятся к физическому геному культивированного огурца, во всемирном Интернет-пространстве на icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/, и физическим хромосомам и физическому положению на хромосомах. Поэтому, например, SNP_01 расположен на нуклеотиде (или 'основании'), физически расположенном в месте нуклеотида 5,502,468 хромосомы 2, которая имеет физический размер от 0 до 23,17 Мб (т.е. 23,174,625 оснований). Подобным образом, SNP_27 расположен на нуклеотиде (или 'основании'), физически расположенном в месте нуклеотида 25,519,964 хромосомы 6, которая имеет физический размер от 0 до 29.07 Мб (т.е. 29,076,227 оснований).

«Физическое расстояние» между локусами (например, между молекулярными маркерами и/или между фенотипическими маркерами) на одной и той же хромосоме представляет собой фактически физическое расстояние, выраженное в основаниях или парах оснований (пары оснований), килооснованиях или парах килооснований (тысяча пар оснований) или мегабазах или парах мегабаз (Мб).

«Генетическое расстояние» между локусами (например, между молекулярными маркерами и/или между фенотипическими маркерами) на одной и той же хромосоме измеряется частотой кроссинговера или частотой рекомбинации (RF) и указывается в сантиморганах (сМ). Одному сМ соответствует частота рекомбинации 1%. Если никакие рекомбинанты не могут быть найдены, RF равна нулю, и локусы либо очень близки друг к другу физически, либо идентичны. Чем дальше расположены два локуса, тем выше RF.

"Фрагмент интрогрессии" или "сегмент интрогрессия" или "область интрогрессия" относится к фрагменту хромосомы (или части или области хромосомы), который был введен в другое растение того же или родственного вида путем скрещивания или традиционных методов разведения, таких как обратное скрещивание, т.е. интрогрессированный фрагмент является результатом методов размножения, ссылающихся на глагол «интрогрессировать» (например, обратное скрещивание). В отношении огурцов дикие или примитивные огурцы (например, местные сорта) или дикие родственники культивированного огурца могут применяться для интрогрессии фрагментов дикого генома в геном культивированного огурца, Cucumis sativus сорт sativus L. Такое культивированное растение огурца, таким образом, имеет "геном культивированного Cucumis sativus сорт sativus", но содержит в геноме фрагмент дикого или примитивного огурца (например, местный сорт) или дикого родственника огурца, например, фрагмент интрогрессии генома дикого родственника Cucumis sativus, такого как Cucumis sativus сорт hardwickii, С.sativus сорт sikkimensis Cucumis sativus сорт xishuangbannesis, или другого дикого родственника огурца. Поэтому, например, согласно настоящему изобретению обеспечивается культивированный огурец, содержащий геном культивированного огурца, и в этом геноме один фрагмент интрогрессии на хромосоме 2 и/или 6 культивированного огурца, которые сообщают увеличенный урожай по сравнению с геномом культивированного огурца, не содержащим фрагменты интрогрессии (и имеющим хромосому 2 и 6 культивированного огурца без фрагмента интрогрессии). Понятно, что термин "фрагментов интрогрессии" не включает хромосому целиком, а только часть хромосомы. Фрагменты интрогрессии могут быть большими, например, составлять три четверти или половину хромосомы, но предпочтительно он меньше, как например, около 15 Мб или менее, как например, около 10 Мб или менее, около 9 Мб или менее, около 8 Мб или менее, около 7 Мб или менее, около 6 Мб или менее, около 5 Мб или менее, около 4 Мб или менее, около 3 Мб или менее, около 2.5 Мб или 2 Мб или менее, около 1 Мб (равно 1,000,000 пар оснований) или менее, или около 0.5 Мб (равно 500,000 пар оснований) или менее, как например, около 200,000 пар оснований (равно 200 пар килооснований) или менее, около 100,000 пар оснований (100 тысяч пар оснований) или менее, около 50,000 пар оснований (50 тысяч пар оснований) или менее, около 25,000 пар оснований (25 тысяч пар оснований) или менее.

"Культивированный огурец" или "одомашненный огурец" относится к растениям Cucumis sativus сорт sativus т.е. сорта, линии скрещивания или культивары, культивированные людьми и имеющие хорошие агрономические характеристики, в частности производящих съедобные и маркируемые плоды хорошего качества и однородности; такие растения не являются растением "дикого родственника огурца" или "примитивного огурца", т.е. растениями, которые в общем дают намного более плохие урожаи и имеют более плохие агрономические характеристики, чем культивированные растения, и являются менее однородными генетически и по их физиологическим и/или морфологическим характеристикам. "Дикие растения" включают, например, экотипы, местные сорта или дикие экземпляры или дикие родственники видов. Культивированные растения огурца (линии или сорта) также могут отличаться от дикого или примитивного огурца значительно более низким количеством SNP (менее 2,000,000 SNP) и INDEL (вставки/делеции более короткие, чем 5 пар оснований; менее 150,000 INDEL) в геноме и их значительно более низкой нуклеотидной плотностью (равна или менее 2.3×10^-3 π), как описано в Таблица 1 в Qi et al. Nature Genetics December 2013, Vol 45, No. 12, pages 1510-1518. Число SNP, число INDEL и нуклеотидную плотность можно определить, как описано в настоящей заявке, в частности в части 'Способы'.

«Индийская группа огурцов» относится к диким огурцам или диким родственникам огурцов из Индии, имеющим большое числом SNP (более 3 000 000 SNP) и INDEL (вставки/делеции короче 5 пар оснований, более 200 000 INDEL) в геноме и высокую нуклеотидную плотность (более 3,0×10^-3 π или даже более 4.0×10^-3 π).

"Евразийская группа огурцов" относится к культивированным огурцам из центральной или западной Азии, Европы и Соединенных Штатов, имеющим низкое число SNP (менее 2,000,000 SNP, или менее 1,500,000 SNP) и INDEL (вставки/делеции короче 5 пар оснований; менее 150,000 INDEL, предпочтительно менее 100,000) в геноме и низкую нуклеотидную плотность (равна или менее 2.3×10^-3 π, предпочтительно менее 2.0×10^-3 π).

"Восточноазиатская группа огурцов" относится к культивированным огурцам из Восточной Азии, как например, Китай, Корея и Япония, имеющим низкое число SNP (менее 2,000,000 SNP, или менее 1,500,000 SNP) и INDEL (вставки/делеции короче 5 пар оснований; менее 150,000 INDEL, предпочтительно менее 100,000) в геноме и низкую нуклеотидную плотность (равна или менее 2.3×10^-3 π, предпочтительно менее 2.0×10^-3 π или даже менее 1.5×10^-3 π).

"Группа огурцов Xishuangbanna" относится к огурцам из области Xishuangbanna в Китае, имеющим низкое число SNP (менее 2,000,000 SNP, или менее 1,500,000 SNP или даже менее 100,000 SNP) и INDEL (вставки/делеции короче 5 пар оснований; менее 150,000 INDEL, предпочтительно менее 100,000) в геноме и низкую нуклеотидную плотность (равен или менее 2.3×10^-3 π, предпочтительно менее 2.0×10^-3 π или даже менее 1.5×10^-3 π).

"Дикий огурец" или "примитивный огурец" относится к С.sativus сорт sativus, которые обычно дают гораздо более плохие урожаи и имеют более плохие агрономические характеристики, чем культивированные растения и менее однородны генетически и по своим физиологическим и/или морфологическим характеристикам. Дикие растения включают, например, экотипы, местные сорта или дикие экземпляры или дикие родственники вида.

"Дикий родственник (родственники) огурца" относятся к Cucumis sativus сорт hardwickii, С.sativus сорт sikkimensis, Cucumis sativus сорт xishuangbannesis.

"Местный сорт (сорта)" относится к примитивным культиварам Cucumis sativus сорт sativus, разработанным в местных географических регионах, которые часто демонстрируют высокую степень генетической изменчивости в их геноме и проявляют высокую степень морфологической и/или физиологической изменчивости в пределах местного сорта (например, большая вариация в размере плода, и т.д.), т.е. являются значительно менее однородными, чем культивированный огурец. Местные сорта, поэтому, согласно настоящему изобретению включены в группу "дикий огурец", которая отличается от "культивированного огурца".

"Однородность" или "однородные" относится к генетическим и фенотипическим характеристикам линии растения или сорта. Инбредные линия являются весьма генетически однородными, поскольку их получают путем нескольких генераций инбридинга. Подобным образом, и F1 гибриды, которые получают из таких инбредных линий, являются весьма однородными по своим генотипическим и фенотипическим характеристикам и производительности.

Термин "аллель урожая" или «положительная аллель урожая» относится к аллелю, обнаруживаемому в локусе урожая QTL2.1 и/или QTL6.1, интрогрессированному в культивированный огурец (на хромосоме 2 или 6, соответственно, культивированного С.sativus сорт sativus) из дикого родственника огурца. Термин "аллель урожая", таким образом, также охватывает аллели урожая, получаемые из других экземпляров Cucumis. Когда один или два аллеля урожая присутствуют в локусе в геноме (т.е. в гетерозиготной или гомозиготной форме), линия или сорт растения дает значительно более высокий урожай плодов, чем генетический, не содержащий QTL, предпочтительно генетический контроль. В культивированном растении огурца, не содержащем фрагмент интрогрессии, аллель С.sativus сорт sativus, обнаруживаемая в том же локусе на хромосоме 2 или хромосоме, согласно настоящему изобретению обозначается как аллель "дикого типа" (wt). Так как QTL урожая являются доминантными, растения w//wt показывают стандартный урожай, тогда как растения QTL2.1/wt или растения QTL6.1/wt и растения QTL2.1/ QTL2.1 или QTL6.1/ QTL6.1 представляют собой растения, которые обладают фенотипом увеличенного урожая, обеспечиваемым аллелем (аллелями) урожая, по сравнению с wt/wt в локусе на хромосоме 2 или 6. Генотип SNP маркеров, раскрытых в настоящей заявке, также указывает на дикий тип или QTL либо в гомозиготной, либо в гетерозиготной форме. Например, генотип SNP_01, указывающий на QTL2.1 представляет собой 'СТ (QTL2.1/wt) или 'СС' (QTL2.1/ QTL2.1), тогда как генотипом, указывающим на дикий тип, является 'ТТ' (wt/wt). Подобным образом, генотип SNP_27, указывающий на QTL6.1 представляет собой 'GA' (QTL6.1/wt) или 'GG'(QTL6.1/QTL6.1), тогда как генотипом, указывающим на дикий тип, является 'АА'.

Генетический элемент, фрагмент интрогрессии или ген или аллель, сообщающий признак (такой как урожай) считается "получаемый из" или может быть "получен из" или "происходящий из" или может "происходить из" или "как присутствует в" или "как обнаружено в" растении или семени или ткани или клетки, если он может быть перенесен из растения или семени, в котором он присутствует, в другое растение или семя, в котором он не присутствует (как например линия или сорт), используя традиционные методы разведения, не приводящие к фенотипическому изменению растения-реципиента, за исключением добавления признака, сообщаемого генетическим элементов, локусом, фрагментом интрогрессии, геном или аллелем. Термины используются взаимозаменяемо, и генетический элемент, локус, фрагмент интрогрессии, ген или аллель могут, таким образом, быть перенесены в любой другой генетический фон, лишенный этого признака. Могут применяться не только семена, депонированные и содержащие генетический элемент, локус, фрагмент интрогрессии, ген или аллель, но также потомство/потомки таких семян, которые были отобраны для сохранения генетического элемента, локуса, фрагмента интрогрессии, гена или аллеля, могут применяться и охватываются настоящим изобретением, как например коммерческие сорта, разработанные из депонированных семян или из их потомства. Содержит ли растение (ли геномная ДНК, клетка или ткань растения) тот же самый генетический элемент, локус, фрагмент интрогрессии, ген или аллель, как получено из депонированных семян, может быть определено специалистом в данной области техники, используя одну или более методик, известных в данной области, таких как фенотипические анализы, секвенирование всего генома, анализ молекулярного маркера, нанесение признаков на генетическую карту, роспись хромосомы, тесты аллеморфизма и тому подобное, или комбинации методик.

"Вариант" или "ортолог" последовательности (вариантная или ортологическая последовательность) или "вариант QTL2.1" или "вариант QTL6.1" относится к QTL урожая (QTL2.1 или QTL6.1), или фрагменту интрогрессии, содержащему QTL, которые получены из других растений диких родственников огурца, чем QTL2.1 и QTL6.1, присутствующие в NCIMB42545, но вариант которых содержит один или более SNP, связанных с QTL2.1 или QTL6.1, и где вариантная геномная последовательность имеет существенную идентичность последовательности с SEQ ID NO: содержащей SNP (любой одной последовательностью из SEQ ID NO: 1-26, связанных с QTL2.1, и SEQ ID NO: 27-40, связанных с QTL6.1), т.е. имеет идентичность последовательности по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более. Таким образом, когда в настоящем описании делается ссылка на определенный генотип SNP в определенной геномной последовательности (выбранной из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 26 для QTL2.1, и SEQ ID NO: 27- SEQ ID NO: 40 для QTL6.1), это охватывает также генотип SNP в вариантах геномной последовательности, т.е. генотип SNP в геномной последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% с последовательностью, на которую ссылаются (выбранной из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 26 для QTL2.1, и SEQ ID NO: 27- SEQ ID NO: 40 для QTL6.1). Таким образом, любая ссылка в настоящей заявке на любую одну из последовательностей SEQ ID NO: 1 - 40 в одном варианте также охватывает вариант любой одной из SEQ ID NO: 1 - 40, причем указанный вариант имеет идентичность последовательности по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более с указанной последовательностью. При ссылки настоящей заявке на генотип SNP в конкретном положении, например в месте нуклеотида 75 последовательности SEQ ID NO: 1, "или последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с SEQ ID NO", это означает, что генотип SNP присутствует в вариантной последовательности при нуклеотиде, соответствующем тому же нуклеотиду (например, соответствующем нуклеотиду 75 последовательности SEQ ID NO: 1) в вариантной последовательности, т.е. в последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с указанной последовательностью SEQ ID NO. Например, вариантная последовательность может быть на один или несколько нуклеотидов короче, но когда попарно выравнивают вариантную последовательность с указанной SEQ ID NO, можно увидеть, какой нуклеотид вариантной последовательности соответствует тому же нуклеотиду. В вариантной последовательности это может быть, например, нуклеотид номер 76 или 74 вариантной последовательности, которая соответствует нуклеотиду 75 указанной последовательности.

"Урожай" или "урожай плодов" или "средний урожай" относится к среднему числу плодов на растение (FrPP) и/или средней массе плода (граммы) на растение (GrPP). Их определяют для каждой линии растения, гибрида или сорта, выращенных при таких же условиях (например, линия, гибрид или сорт с QTL и контроль, например генетический контроль, без QTL), и среднее FrPP и/или GrPP каждой линии, гибрида или сорта вычисляют.В зависимости от типа огурца, урожай плодов измеряют различными путями. Так, например, типы, которые производят плоды непрерывно в течение определенного периода времени, такие как поступающие на рынок в свежем виде (например, длинные типы огурцов, такие как Европейский тепличный огурец, мини- или миди-типы), плоды собираются, когда они достигают товарного размера, и сбор урожая производится в течение определенного периода времени упоминается как «период сбора урожая» (например, период сбора урожая начинается, когда первые плоды достигают товарного размера и могут иметь длину, соответствующую по меньшей мере 10, 11, 12 или более неделям). Так, например, среднее FrPP и/или GrPP на линию измеряется на день и складывается в течение всех дней в конце периода сбора, чтобы рассчитать кумулятивное FrPP и/или GrPP для каждой линии или сорта (смотрите также примеры). «Товарный размер» относится к плодам, которые являются достаточно длинными и достаточно тяжелыми для продажи. Таким образом, плоды товарного размера собирают в момент времени, который является оптимальным или около оптимального для товарного плода и плода для продажи. Для длинных типов огурцов, таких как Европейский тепличный огурец, товарный размер достигается, когда плод составляет по меньшей мере около 26 или 27 см в длину и имеет минимальную массу 250 грамм. Для типов огурцов, которые собирают только в один момент времени, таких как корнишоны, "урожай" или "урожай плодов" или "средний урожай" относится к среднему числу плодов, составляющих или выше 1.5 см по диаметру, на растение (FrPP) и/или среднюю массу плодов (граммы), составляющих или выше 1.5 см по диаметру, на растение (GrPP) в единый момент времени сбора урожая. Единый момент времени сбора урожая соответствует практике выращивания и выбран для максимального увеличения количества плодов, имеющих диаметр 1,5 см и 5,0 см. В зависимости от желаемого размера плода момент времени, как правило, достигается, когда около 5%, около 10%, около 15% или около 20% плодов больше по размеру (т.е. имеют диаметр плода, равный 5.0 см или более). Уборка производится вручную или машинным сбором. Таким образом, в одном варианте собирают все плоды на растение и подсчитывают и/или взвешивают только те, которые имеют диаметр по меньше мере 1,5 см (т.е. подсчитываются и/или взвешиваются все плоды с диаметром по меньше мере 1,5 см, в том числе и негабаритные).

"Увеличенный урожай плодов" или "значительно увеличенный урожай плодов" относится к линии или сорту культивированного растения огурца, содержащим фрагмент интрогрессии на хромосоме 2 и/или 6, содержащий QTL2.1 и/или QTL6.1, дающим (благодаря QTL) статистически значительно более высокое среднее число плодов на растение (FrPP) и/или значительно более высокую среднюю массу плода на растение (GrPP), по сравнению с растением контроля, например генетического контроля, не содержащим фрагменты интрогрессии на хромосоме 2 и 6, при выращивании в экспериментах на урожай в тех же условиях. Предпочтительно полевые условия проводятся с несколькими повторениями (2, 3, или предпочтительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, или более) с достаточным количеством растений (например, по меньшей мере 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, или более растений на линию), содержащих фрагмент интрогрессии на хромосоме 2 и/или 6 и не содержащих фрагмент интрогрессии на хромосоме 2 и 6 контрольных растений (предпочтительно генетические контроли).

«Контроль» представляет собой линию, гибрид или сорт огурца, не содержащий фрагменты интрогрессии. "Генетический контроль" представляет собой линию, сорт или гибрид огурца, который имеет такой же или очень подобный культурный геном, как и растение огурца, содержащее интрогрессию на хромосоме 2 и/или 6, за исключением того, что не содержит интрогрессии на хромосоме 2 и 6, т.е. хромосомы 2 и 6 являются "дикого типа", т.е. геном культивированного огурца. Например, семена, депонированные под номером доступа NCIMB42545, представляют собой семена BC1S3, содержащие QTL2.1 и QTL6.1 в гомозиготной форме (но без QTL2.2), в элитной линии скрещивания длинного огурца. Подходящим генетическим контролем являются семена, депонированные под номером NCIMB42345, не содержащие QTL2.1 и QTL6.1.

Термин "анализ маркера" относится к анализу молекулярного маркера, который может применяться, чтобы протестировать присутствует ли на хромосоме 2 и/или 6 культивированного С.sativus сорт sativus интрогрессия из дикого родственника огурца, фрагмент интрогрессии которых содержит QTL2.1 или QTL6.1 (или содержит ли дикий родственник огурца QTL2.1 или QTL6.1 или его вариант в его геноме), путем определения генотипа любого одного или более маркеров, связанных с QTL2.1 или с QTL6.1, например, например, генотипа одного или более SNP маркеров, выбранных из SNP_01 - SNP_26 для QTL2.1, или генотипа одного или более SNP маркеров, выбранных из SNP_27 - SNP_40 для QTL6.1, и/или любого специфичного для генома дикого родственника огурца маркера между SNP маркерами SNP_01 и SNP_26 на хромосоме 2 (т.е. в физической области, начинающейся при 5.0 Мб - 11.0 Мб хромосомы 2) или между SNP_27 и SNP_40 на хромосоме 6 (т.е. в физической области, начинающейся при 25.0 Мб - 29.0 Мб хромосомы 2), и/или в пределах 7 сМ или в пределах 5 сМ, 3 сМ, 2 сМ, 1 сМ любого одного из этих маркеров, и/или в пределах 5 Мб, 3 Мб, 2 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 0.1 Мб, 50 тысяч пар оснований, 20 кб, 10 кб, 5 кб, 2 кб, 1 кб или менее любого одного из этих маркеров. Маркер "между" двумя маркерами физически располагается между маркерами на хромосоме.

SNP маркеры, приведенные в настоящей заявке, т.е. SNP_01 - SNP_26 для хромосомы 2 и SNP_27 - SNP_40 для хромосомы 6, локализуются в данном порядке на фрагменте интрогрессии. "Последовательные" маркеры относятся к маркерам в том же порядке последовательности, так например, двумя последовательными маркерами могут быть SNP_01 и SNP_02; SNP_02 и SNP_03; SNP_03 и SNP_04, и т.д.. и тремя последовательными маркерами могут быть SNP_01 и SNP_02 и SNP_03; SNP_02 и SNP_03 и SNP_04; и т.д.

"Среднее значение" или "среднее" относится согласно настоящему изобретению к среднему арифметическому значению, и оба термина используются взаимозаменяемо. Термин "среднее значение" или "среднее", таким образом, относится к среднему арифметическому значению для нескольких измерений. Специалисту в данной области техники понятно, что фенотип линии растения или сорта зависит в некоторой степени от условий произрастания, и поэтому измеряются средние арифметические значения для по меньшей мере 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 или более растений (или частей растений), предпочтительно в рандомизированных экспериментальных моделях с несколькими повторениями и подходящими контрольными растениями, выращенными при тех же условиях в том же эксперименте. "Статистически значимый" или "статистически значимо" отличный или "значительно" отличный относится к характеристике линии растения или сорта, которые, при сравнении с подходящим контролем (например, генетическим контролем), показывают статистически значимое отличие их характеристик (например, р-значение составляет менее 0.05, р<0.05, применяя ANOVA) от (среднего значения) контроля.

"Рекомбинантная хромосома" относится к хромосоме, имеющей новый генетический облик, возникающий в результате кроссинговера между гомологичными хромосомами, например "рекомбинантная хромосома 2" или "рекомбинантная хромосома б", т.е. хромосома 2 или 6, которая не присутствует ни в одном из родительских растений и возникла в результате редкого события кроссинговера между гомологичными хромосомами пары хромосомы 2 или 6. Согласно настоящему изобретению обеспечиваются, например, рекомбинантная хромосома огурца 2, содержащая интрогрессию из дикого родственника огурца, которая содержит QTL, который увеличивает урожай плодов, и обеспечивается рекомбинантная хромосома 6, содержащая интрогрессию из дикого родственника огурца, которая содержит QTL, который увеличивает урожай плодов, особенно при росте при холодных температурах. QTL6.1 может, поэтому, также упоминаться как QTL толерантности к холоду, или QTL толерантности к замораживанию, так как он усиливает урожай в условиях стресса холодом.

Термин "традиционные методы разведения" согласно настоящему изобретению охватывает скрещивание, обратное скрещивание, самоопыление, селекцию, получение двойного галоида, эмбриональное спасение, слияние протопластов, выбор с помощью маркера, мутационную селекцию и т.д. как известно селекционеру (т.е. методы, отличные от методов генетической модификации/трансформации/трансгенных методов), посредством которых, например, рекомбинантную хромосому 2 или 6 можно получить, идентифицировать и/или переносить.

"Обратное скрещивание" относится к методу селекции, с помощью которого (одиночный) признак, такой как QTL урожая, может быть перенесен из более низшего генетического фона (например, дикого родственника огурца или огурца дикого типа; также обозначается как «донор») в высший генетический фон (также обозначается как "рекуррентный родитель"), например культивированный огурец. Потомство кросса (например, растение F1, полученное скрещиванием дикого родственника огурца с культивированным огурцом; или растение F2 или растение F3, и т.д., полученное самоопылением F1) является "обратно скрещенным" до родителя с высшим генетическим фоном, например культивированного родителя. После повторного обратного скрещивания, признак низшего генетического фона будет включен в высший генетический фон.

"Выбор с помощью маркера" или "MAS" представляет собой процесс использования присутствия молекулярных маркеров, которые генетически связаны с определенным локусом или с определенной областью хромосомы (например, фрагмент интрогрессии), для выбора растений по присутствию конкретного локуса или области (фрагмент интрогрессии). Например, молекулярный маркер, генетически и физически связанный с QTL урожая, может применяться для обнаружения и/или выбора растения огурца, содержащего QTL урожая на хромосоме 2 и/или 6. Чем ближе генетическая связь молекулярного маркера с локусом (например около 7 сМ, 6 сМ, 5 сМ, 4 сМ, 3 сМ, 2 сМ, 1 сМ, 0.5 сМ или менее), тем менее вероятно, что маркер диссоциирует от локуса посредством мейотической рекомбинации. Аналогично, чем ближе два маркера связаны друг с другом (например, в пределах 7 сМ или 5 сМ, 4 сМ, 3 сМ, 2 сМ, 1 сМ или менее), тем менее вероятно, что два маркера будут отделены друг от друга (и, скорее всего, они будут совместно выделяться как единое целое).

Маркер "в пределах 7 сМ или в пределах 5 сМ, 3 сМ, 2 сМ, или 1 сМ" другого маркера относится к маркеру, который генетически привязывается к области, фланкирующей маркер, в пределах 7 сМ или 5 сМ, 3 сМ, 2 сМ, или 1 сМ (т.е. с обеих сторон маркера). Подобным образом, маркер в пределах 5 Мб, 3 Мб, 2.5 Мб, 2 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 0.4 Мб, 0.3 Мб, 0.2 Мб, 0,1 Мб, 50 тысяч пар оснований, 20 тысяч пар оснований, 10 тысяч пар оснований, 5 тысяч пар оснований, 2 тысяч пар оснований, 1 тысяч пар оснований или менее, области геномной ДНК, фланкирующей маркер (т.е. с обеих сторон маркера).

"LOD-оценка" (логарифм (основание 10) расхождений) относится к статистическому тесту, часто используемому для анализа сцепления в популяциях животных и растений. Оценка LOD сравнивает вероятность получения тестовых данных, если эти два локуса (локусы молекулярных маркеров и/или локусы фенотипических признаков) действительно сцеплены, с вероятностью наблюдения одних и тех же данных чисто случайно. Положительные оценки LOD свидетельствуют о наличие сцепления, и оценка LOD выше 3.0 рассматривается как очевидное сцепление. Оценка LOD, равная +3, указывает на вероятность от 1000 до 1, что наблюдаемое сцепление не происходит случайно.

"Вегетативное размножение", "вегетативная репродукция" или "клональное размножение" применяются в настоящей заявке взаимозаменяемо и означают способ, в котором берут часть растения и позволяют части растения образовать по меньшей мере корни, где часть растения, например, определяется как или происходит из (например, путем разрезания) листа, пыльцы, зародыша, семядолей, гипокотиля, клеток, протопласт, меристематической клетки, корня, кончика корня, пестика, пыльника, цветка, кончика побега, побега, стебля, плода, черешка и т.д. Когда целое растение регенерируется путем вегетативного размножения, это также обозначается как вегетативное размножение.

"Клеточная культура" или "тканевая культура" относится к in vitro культуре клеток или тканей растения.

"Регенерация" относится к развитию растения из клеточной культуры или тканевой культуры или вегетативному размножению.

Термин "неразмножающаяся клетка" относится к клетке, которая не может регенерироваться в целое растение.

"Трансген" или "химерный ген" относится к генетическому локусу, содержащему последовательность ДНК, такую как рекомбинантный ген, который был введен в геном растения путем трансформации, такой как трансформация, опосредованная Agrobacterium. Растение, содержащее трансген, стабильно интегрированный в его геном, обозначается как "трансгенное растение".

"Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты" или "выделенная ДНК" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая больше не находится в природной среде, из которой она была выделена, например, последовательности нуклеиновой кислоты в бактериальной клетке-хозяине или в ядерном или пластидном геноме растении.

"Клетка-хозяин" или "рекомбинантная клетка-хозяин" или "трансформированная клетка" являются терминами, относящимися к новой индивидуальной клетке (или организму), возникающей в результате по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, введенной в указанную клетку. Клетка-хозяин предпочтительно является растительной клеткой или бактериальной клеткой. Клетка-хозяин может содержать нуклеиновую кислоту в качестве экстрахромосомно (эписомальной) реплицирующейся молекулы, или содержать нуклеиновую кислоту, интегрированную в ядерный или пластидный геном клетки-хозяина, или в качестве введенной хромосомы, например минихромосомы.

"Идентичность последовательности" и "сходство последовательности" можно определить выравниванием двух пептидных или двух нуклеотидных последовательностей с использованием глобальных или локальных алгоритмов выравнивания. Последовательности могут затем обозначаться как «по существу идентичные" или "весьма подобные", когда они оптимально выровнены, например, с помощью программы GAP или BESTFIT или фильтрующей программы "Needle" (с использованием параметров по умолчанию, см. ниже), определяя по меньшей мере определенный минимальный процент идентичности последовательности (как определено ниже). Эти программы используют глобальный алгоритм выравнивания Нидлмана-Вунша для выравнивания двух последовательностей по всей длине, получая максимальное количество совпадений и сводя к минимуму количество гэпов. Обычно параметры по умолчанию используется штраф за открытие гэпа = 10 и штраф за расширение гэпа = 0,5 (как для нуклеотидного, так и белкового выравнивания). Для нуклеотидов применяемой матрицей весов замен является DNAFULL, и для белков матрицей весов замен является Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919). Выравнивания последовательности и показатели процентной идентичности последовательности, например, могут быть определены с помощью компьютерных программ, таких как EMBOSS, как доступно во всемирной сети по адресу ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Альтернативно подобие или идентичность последовательности могут быть определены с помощью функции поиска в базах данных, таких как FASTA, BLAST и т.д., но совпадения должны быть получены и приведены в соответствие попарно, чтобы сравнить идентичность последовательности. Два протеина или два белковых домена или две последовательности нуклеиновых кислот имеют «существенную идентичность последовательности», если идентичность последовательности в процентах составляет по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более (например по меньшей мере 99.1, 99.2 99.3 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 или более (как определено с помощью Emboss "needle", используя параметры по умолчанию, т.е. штраф за открытие гэпа = 10, штраф за расширение гэпа = 0.5, используя матрицу весов замен DNAFULL для нуклеиновых кислот, и Blosum62 для белков).

Когда делается ссылка на последовательность нуклеиновой кислоты (например, ДНК или геномную ДНК), имеющую "последовательность, по существу идентичную" ссылочной последовательности или имеющую последовательность, идентичную на по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98% или 99% ссылочной последовательности, в одном варианте выполнения настоящего изобретения указанная нуклеотидная последовательность рассматривается как по существу идентичная данной нуклеотидной последовательности и может быть идентифицирована, используя строгие условия гибридизации. В другом варианте выполнения настоящего изобретения, последовательность нуклеиновой кислоты содержит одну или более мутаций, по сравнению с данной нуклеотидной последовательностью, но все еще может быть идентифицирована, используя строгие условия гибридизации.

"Строгие условия гибридизации" могут применяться для идентификации нуклеотидных последовательностей, которые по существу идентичны данной нуклеотидной последовательности. Строгие условия зависят от последовательности и будут отличаться в разных обстоятельствах. Как правило, строгие условия выбираются так, что составляют на около 5°С точки плавления (Tm) для конкретных последовательностей при определенной ионной силе и рН. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизуется идеально подобранным зондом. Обычно выбирают такие строгие условия, при которых концентрация соли составляет около 0,02 моля при рН 7, а температура составляет по меньшей мере 60°С. Уменьшение концентрации соли и/или повышение температуры увеличивает жесткость условий. Строгие условия для гибридизаций РНК-ДНК (нозерн-блоты с использованием зонда, например, 100 нт) являются, например, теми, которые включают по меньшей мере одну промывку в 0.2Х SSC при 63°С в течение 20 мин, или эквивалентные условия. Строгие условия для гибридизации ДНК-ДНК (Саузерн-блоты с использованием зонда, например, 100 нт) являются, например, теми, которые включают по меньшей мере одну промывку (как правило 2) в 0.2Х SSC при температуре, равной по меньшей мере 50°С, как правило около 55°С, в течение 20 мин, или эквивалентные условия. Смотрите также Sambrook et al. (1989) и Sambrook и Russell (2001).

"Тонкое картирование" относится к способам, посредством которых положение QTL может быть определено более точно (сужено), и посредством которых размер фрагмента интрогрессии, содержащего QTL, сокращается. Например, почти изогенная линия для QTL (QTL-NIL) может быть получена, которая содержит различные, перекрывающиеся фрагменты интрогрессии в пределах иной однородной генетической среды рекуррентного родителя. Такие линии могут затем применяться для нанесения на генетическую карту места локализации QTL и для идентификации линии, имеющей более короткий фрагмент интрогрессии, содержащий QTL.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к культивированному растению Cucumis sativus сорт sativus, содержащему одну или две QTL урожая на хромосоме 2 и/или хромосоме 6, интрогрессированных из дикого родственника огурца. Таким образом, повышенная урожайность обеспечивается (сообщается) фрагментом интрогрессии на хромосоме культивированного огурца 2 (содержащей QTL2.1 или его вариант) и/или на хромосоме культивированного огурца 6 (содержащей QTL6.1 или его вариант), где указанный фрагмент интрогрессии происходит из дикого родственника огурца. Необходимо отметить, что QTL2.1 и QTL6.1 сами по себе повышают урожай плодов, но также могут быть объединены в одном растении. Набор обоих QTL является предпочтительным, так как они обеспечивают, что достигается повышение урожая при различных условиях культивации.

Когда в настоящей заявке делается ссылка на фрагмент интрогрессии на хромосоме 2, содержащей положительный QTL урожая, это охватывает различные размеры фрагментов интрогрессии, например, фрагмент, как обнаружено в NCIMB42545, генотип SNP дикого родственника огурца для всех маркеров SNP (SNP_01 - SNP_26, или любой маркер между ними, для фрагмента на хромосоме 2), но также более маленькие фрагменты интрогрессии (содержащие генотип SNP дикого родственника огурца для менее чем 26, как например, только, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 из маркеров SNP), где, однако, фрагмент сохраняет QTL2.1 или его вариант, то есть все еще обеспечивает значительно увеличенную урожайность (по сравнению с контролем, например, генетическим контролем), когда фрагмент интрогрессии находится в гетерозиготной или гомозиготной форме в геноме культивированного огурца.

Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение огурца, содержащее фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца, где фрагмент интрогрессии содержит QTL2.1, или его вариант, и где фрагмент интрогрессии содержит всю или часть области, начинающейся при нуклеотиде (или основании) 5,502,468 хромосомы 2 и заканчивающейся или нуклеотиде (или основании) 10,882,440 хромосомы 2. Другими словами, вся или часть области, начинающейся при нуклеотиде 5,502,468 хромосомы 2 и заканчивающейся или нуклеотиде 10,882,440 хромосомы 2, происходит в одном варианте выполнения настоящего изобретения из дикого родственника огурца и содержит QTL2.1 или его вариант. Подобласть, которая содержит QTL2.1, может быть идентифицирована, например, посредством тонкого генетического картирования. Поэтому, например, если QTL2.1, как обнаружено, находится между SNP_01 и SNP_10, тогда растение согласно настоящему изобретению должно содержать только область интрогрессии, начинающуюся при нуклеотиде 5,502,468 хромосомы 2 (SNP_01) и заканчивающуюся или нуклеотиде 7,509,399 (SNP_10) хромосомы 2.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL2.1 (или его вариант) расположен между маркером SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 1) и маркером SNP_26 в SEQ ID NO: 26 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 26). В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL2.1 (или его вариант) расположен между маркером SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 1) и маркером SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 10). В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL2.1 (или его вариант) расположена между маркером SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 10) и маркером SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 20). В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL2.1 (или его вариант) расположен между маркером SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 20) и маркером SNP_26 в SEQ ID NO: 26 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 26). В другом варианте QTL2.1 (или его вариант) расположен между маркером SNP_06 в SEQ ID NO: 06 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 06) и маркером SNP_23 в SEQ ID NO: 23 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 23).

В другом варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии согласно настоящему изобретению (содержащий QTL2.1 или его вариант) представляет собой фрагмент, содержащий более маленький фрагмент (часть) области, начинающейся при 5,502,468 паре оснований и заканчивающейся при 10,882,440 паре оснований хромосомы 2, например, имеющий размер, например, 5.0 Мб, 4.0 Мб, 3.0 Мб, 2.5 Мб, 2 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 100 тысяч пар оснований, 50 тысяч пар оснований, 35 тысяч пар оснований, 30 тысяч пар оснований, 20 тысяч пар оснований, или менее и содержащий QTL или его вариант. В одном варианте выполнения настоящего изобретения часть составляет по меньшей мере 5 тысяч пар оснований, 10 тысяч пар оснований, 20 тысяч пар оснований по размеру, или более. Более маленький фрагмент сохраняет QTL2.1, т.е. более маленький фрагмент обеспечивает увеличение урожая плодов огурца, например, как описано для полного фрагмента интрогрессии.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение огурца согласно настоящему изобретению содержит фрагмент интрогрессии из огурца дикого типа или дикого родственника огурца, где фрагмент интрогрессии содержит QTL2.1 или его вариант, где фрагмент интрогрессии содержит все части области, начинающейся при 5.5 Мб и заканчивающейся при 10.9 Мб физической хромосомы 2; в другом варианте выполнения настоящего изобретения, начинающейся при 5.0 Мб и заканчивающейся при 10.89 Мб.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии на хромосоме 2, содержащий QTL2.1, получают скрещиванием растения, выращенного из NCIMB42545 с другим растением огурца, особенно культивированного растения огурца, в одном варианте выполнения настоящего изобретения огурцом длинного типа.

В ходе программы картирования QTL, QTL2.1 изначально не был распознан, так как другой QTL около QTL2.1 на хромосоме 2 имел отрицательное влияние на среднюю массу плода на растение, и пики обоих QTL были настолько близки друг к другу, что отделение одного от другого не представлялось возможным (смотрите Фиг. 1). Эта отрицательная область фрагмента интрогрессии на хромосоме, однако, неожиданно может быть удалена посредством рекомбинации, т.е. путем удаления частей области дикого родственника огурца далее ниже от SNP_26. Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения хромосомная область между SNP_26 (физическое положение основание 10,882,440) и концом хромосомы 2 (т.е. вплоть до основания 23,174,625) не содержит QTL отрицательного влияния на урожай (QTL2.2), который уменьшал длину плода, из дикого родственника огурца, и предпочтительно представляет собой геном культивированного огурца. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает растения, содержащие QTL2.1, которые имеют повышенный кумулятивный урожай плодов, по сравнению с генетическим контролем (без QTL2.1) без уменьшения средней длины плода, т.е. средняя длина плода не отличается от средней длины плода генетического контроля.

Когда в настоящей заявке делается ссылка на фрагмент интрогрессии на хромосоме 6, содержащей положительный QTL урожая, это охватывает различные размеры фрагментов интрогрессии, например, фрагмент, как обнаружено в NCIMB42545, генотип SNP дикого родственника огурца для всех маркеров SNP (SNP_27 - SNP_40, или любой маркер между ними, для фрагмента на хромосоме 6), но также более маленькие фрагменты интрогрессии (содержащие генотип SNP дикого родственника огурца для менее чем этих 14 SNP маркеров, таких как, только, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 из маркеров SNP), где, однако, фрагмент сохраняет QTL6.1 или его вариант, то есть все еще обеспечивает значительно увеличенную урожайность (по сравнению с контролем, например, генетическим контролем), когда фрагмент интрогрессии находится в гетерозиготной или гомозиготной форме в геноме культивированного огурца.

Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение огурца, содержащее фрагмент интрогрессии из дикого родственника огурца, где фрагмент интрогрессии содержит QTL6.1, или его вариант, и где фрагмент интрогрессии содержит всю или часть области, начинающуюся при нуклеотиде (или основании) 25,519,964 хромосомы 6 и заканчивающуюся или нуклеотиде (или основании) 28,300,913 хромосомы 6. Другими словами, вся или часть области, начинающейся при нуклеотиде 25,519,964 хромосомы 6 и заканчивающейся или нуклеотиде 28,300,913 хромосомы 6, происходит в одном варианте выполнения настоящего изобретения из дикого родственника огурца, и содержит QTL6.1 или его вариант. Подобласть, которая содержит QTL6.1, может быть идентифицирована, например, посредством тонкого генетического картирования. Поэтому, например, если QTL6.1, как обнаружено, находится между SNP_27 и SNP_33, тогда растение согласно настоящему изобретению должно содержать только область интрогрессии, начинающуюся при нуклеотиде 25,519,964 хромосомы 6 (SNP_27) и заканчивающуюся или нуклеотиде 26,501,889 (SNP_33) хромосомы 6.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения QTL6.1 (или его вариант) расположен между маркером SNP_27 в SEQ ID NO: 27 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 27) и маркером SNP_40 в SEQ ID NO: 40 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 40). В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL6.1 (или его вариант) расположен между маркером SNP_27 в SEQ ID NO: 27 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 27) и маркером SNP_33 в SEQ ID NO: 33 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 33). В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL6.1 (или его вариант) расположен между маркером SNP_33 в SEQ ID NO: 33 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 33) и маркером SNP_40 в SEQ ID NO: 40 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 40). В другом варианте QTL6.1 (или его вариант) расположен между маркером SNP_29 в SEQ ID NO: 29 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 29) и маркером SNP_38 в SEQ ID NO: 38 (или в вариантной последовательности SEQ ID NO: 38).

В другом варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии согласно настоящему изобретению (содержащий QTL6.1 или его вариант) представляет собой фрагмент, содержащий более маленький фрагмент (часть) области, начинающейся при 25,519,964 паре оснований и заканчивающейся при 28,300,913 паре оснований хромосомы 6, например, имеющий размер, например, 2.8 Мб, 1.9 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 100 тысяч пар оснований, 50 тысяч пар оснований, 35 тысяч пар оснований, 30 тысяч пар оснований, 20 тысяч пар оснований, или менее и содержащий QTL или его вариант. В одном варианте выполнения настоящего изобретения часть составляет по меньшей мере 5 тысяч пар оснований, 10 тысяч пар оснований, 20 тысяч пар оснований по размеру, или более. Более маленький фрагмент сохраняет QTL6.1, т.е. более маленький фрагмент обеспечивает увеличение урожая плодов огурца, например, как описано для полного фрагмента интрогрессии.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения культивированное растение огурца согласно настоящему изобретению содержит фрагмент интрогрессии из огурца дикого типа или дикого родственника огурца, где фрагмент интрогрессии содержит QTL6.1 или его вариант, где фрагмент интрогрессии содержит всю или часть области, начинающейся при 26 Мб и заканчивающейся при 28.5 Мб, или на конце физической хромосомы 6, т.е. при 29.07 Мб; в другом варианте выполнения настоящего изобретения - начинающуюся при 25.6 Мб и заканчивающуюся при 28.5 Мб или на конце хромосомы 6.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии на хромосоме 6, содержащий QTL6.1, получают посредством скрещивания растения, выращенного из NCIMB42545, с другим растением огурца, особенно культивированным растением огурца, в одном варианте выполнения настоящего изобретения огурцом длинного типа.

Когда делается ссылка на маркеры SNP в настоящей заявке, которые указывают на присутствие фрагмента интрогрессии на хромосоме 2 или 6 (и любого из QTL увеличения урожая, присутствующих на фрагменте интрогрессии), понятно, что упоминается генотип SNP, который является показателем фрагмента интрогрессии, т.е. генотип SNP, как представлено в Таблице 7 далее для хромосомы 2 и в Таблице 8 для хромосомы 6. Отмечается, что генотип маркера SNP может отличать фрагмент интрогрессии, находящийся в гомозиготной или гетерозиготной форме, как показано в таблице. В гомозиготной форме нуклеотид идентичен, а в гетерозиготной форме нуклеотид не идентичен. SNP-генотип хромосомы «дикого типа» без фрагмента интрогрессии это другой генотип, также приведенный в Таблице 7 и 8 (под генотипом рецидивирующего родителя). Так, например, генотип SNP_01 указывающий на фрагмент интрогрессии, содержащий QTL2.1, представляет собой 'СС' (QTL2.1/ QTL2.1) или 'CT' (QTL2.1/wt), тогда как генотип SNP, указывающий на дикий тип/генетический контроль/контроль (отсутствие фрагмента интрогрессии), представляет собой 'ТТ' (wt/wt). Таким образом, при ссылке на растение или часть растения (например, клетка), содержащие фрагмент интрогрессии в гомозиготной или гетерозиготной форме, понятно, что маркеры SNP, связанные с фрагментом интрогрессии, имеют соответствующий генотип SNP.

Поэтому, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, обеспечивает культивированное растение Cucumis sativus сорт sativus, содержащее фрагмент интрогрессии на хромосоме 2 и/или 6 в гомозиготной или гетерозиготной форме, где указанный фрагмент интрогрессии обеспечивает увеличение урожая плодов огурца по сравнению с растением огурца, не содержащим фрагмент интрогрессии на хромосоме 2 и 6, например, генетическим контролем или контрольным сортом, при выращивании при тех же условиях.

Увеличение урожая плодов огурца фенотипически выражается как (статистически) значительно более высокое среднее число плодов на растение (FrPP) линии или разновидности культивированного растения огурца, содержащей фрагмент интрогрессии на хромосоме 2 и/или 6 в гомозиготной или гетерозиготной форме, по сравнению с линией или разновидностью генетического контроля, не содержащей фрагмент интрогрессии на хромосоме 2 и 6, при выращивании в той же среде, и/или значительно более высокая средняя масса плода на растение (GrPP) линии или разновидности растений, содержащей фрагмент интрогрессии, по сравнению с линией или разновидностью генетического контроля, не содержащей фрагмент интрогрессии, при выращивании в той же среде.

Урожай плодов (общее среднее FrPP и/или GrPP) предпочтительно составляет у растения огурца, содержащего QTL2.1 (или вариант) и/или QTL6.1 (или вариант) по меньшей мере на 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% выше. чем у контроля, предпочтительно чем у генетического контроля, при выращивании при тех же условиях.

Растения согласно настоящему изобретению поэтому содержат геном культивированного огурца, с по меньшей мере одной или двумя рекомбинантными хромосомами 2 (т.е. гетерозиготной или гомозиготной) и/или с по меньшей мере одной или двумя рекомбинантными хромосомами 6 (т.е. гетерозиготной или гомозиготной). Рекомбинантные хромосомы содержат фрагмент дикого родственника огурца, который легко отличить от генома культивированного огурца посредством анализа молекулярного маркера, секвенирования всего генома, "росписи" хромосомы и подобных методик.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии на хромосоме 2 происходит из дикого родственника огурца, содержит положительный QTL2.1 урожая, или его вариант, и содержит всю или часть области, начинающейся при нуклеотиде 5,502,468 и заканчивающейся при нуклеотиде 10,882,440 хромосомы. Таким образом, фрагмент интрогрессии содержит QTL2.1 урожая или его вариант и один или более или все (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26) SNP маркеры дикого родственника огурца, выбранного SNP_01 - SNP_26, как показано в Таблице 7.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фрагмент интрогрессии на хромосоме 6 происходит из дикого родственника огурца, содержит положительный QTL6.1 урожая, или его вариант, и содержит всю или часть области, начинающейся при нуклеотиде 25,519,964 и заканчивающейся при нуклеотиде 28,300,913 хромосомы. Таким образом, фрагмент интрогрессии содержит QTL6.1 урожая или его вариант и один или более или все (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14) SNP маркеры дикого родственника огурца, выбранного SNP_27 - SNP_40.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения присутствие фрагмента интрогрессии на хромосомах 2 или 6 в геноме растения или клетке растения или ткани растения (или в ДНК, экстрагированной из них) обнаруживается посредством анализа молекулярного маркера, который обнаруживает один или более молекулярных маркеров фрагмента интрогрессии. Однако, как упомянуто, могут применяться другие методики, например, SNP генотип маркеров также может быть обнаружен посредством секвенирования или применяя альтернативные маркеры, локализованные между SNP маркерами, раскрытыми в настоящей заявке, или в пределах 7 сМ, или в пределах 5 сМ, маркера, раскрытого в настоящей заявке; или в пределах 5 Мб, 3 Мб, 2.5 Мб, 2 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 0.4 Мб, 0.3 Мб, 0.2 Мб, 0.1 Мб, 50 кб, 20 кб, 10 кб, 5 кб, 2 кб, 1 кб или менее маркера, раскрытого в настоящей заявке.

Когда ссылка делается на один или более молекулярные маркеры, являющиеся "обнаруживаемыми" посредством анализа молекулярного маркера, это означает, конечно, что растение или часть растения содержит один или более маркеров в его геноме, так как, в противном случае, маркеры были бы не обнаруживаемыми.

Растения огурца, содержащие фрагмент интрогрессии на хромосоме 2 (QTL 2.1 урожая)

QTL2.1 расположен в области между SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в ее варианте) и SNP_26 в SEQ ID NO: 26 (или в ее варианте).

Поэтому, в одном варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение Cucumis sativus сорт sativus, содержащее интрогрессии на хромосоме 2 в гомозиготной или гетерозиготной форме, где указанный фрагмент интрогрессии обеспечивает увеличение урожая плодов огурца(по сравнению с растением, не содержащим фрагмент интрогрессии, например, генетическим контролем), и где указанный фрагмент интрогрессии является обнаруживаемым посредством анализа молекулярного маркера (т.е. растение содержит один или более молекулярных маркеров), который обнаруживает по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 из маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

a) генотип СС или СТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в ее варианте);

b) генотип GG или GA для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_02 в SEQ ID NO: 2(или в ее варианте);

c) генотип GG или GA для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_03 в SEQ ID NO: 3 (или в ее варианте);

d) генотип ТТ или ТС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_04 в SEQ ID NO: 4 (или в ее варианте);

e) генотип ТТ или ТС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_05 в SEQ ID NO: 5 (или в ее варианте);

f) генотип СС или СТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_06 в SEQ ID NO: 6 (или в ее варианте);

g) генотип СС или СТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_07 в SEQ ID NO: 7 (или в ее варианте);

h) генотип АА или AG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_08 в SEQ ID NO: 8 (или в ее варианте);

i) генотип ТТ или TG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_09 в SEQ ID NO: 9 (или в ее варианте);

j) генотип ТТ или TG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в ее варианте);

k) генотип GG или AG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_11 в SEQ ID NO: 11 (или в ее варианте);

l) генотип GG или GT для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_12 в SEQ ID NO: 12 (или в ее варианте);

m) генотип СС или СА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_13 в SEQ ID NO: 13 (или в ее варианте);

n) генотип АА или AG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_14 в SEQ ID NO: 14 (или в ее варианте);

о) генотип СС или СТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_15 в SEQ ID NO: 15 (или в ее варианте);

р) генотип АА или АС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_16 в SEQ ID NO: 16 (или в ее варианте);

q) генотип ТТ или ТС для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_17 в SEQ ID NO: 17 (или в ее варианте);

r) генотип GG или GA для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_18 в SEQ ID NO: 18 (или в ее варианте);

s) генотип АА или AG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_19 в SEQ ID NO: 19 (или в ее варианте);

t) генотип GG или GA для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_20 в SEQ ID NO: 20 (или в ее варианте);

u) генотип GG или GA для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_21 в SEQ ID NO: 21 (или в ее варианте);

v) генотип GG или GT для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_22 в SEQ ID NO: 22 (или в ее варианте);

w) генотип ТТ или TG для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_23 в SEQ ID NO: 23 (или в ее варианте);

х) генотип GG или GT для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_24 в SEQ ID NO: 24 (или в ее варианте);

у) генотип GG или GA для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_25 в SEQ ID NO: 25 (или в ее варианте);

z) генотип СС или СА для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_26 в SEQ ID NO: 26 (или в ее варианте);

аа) любой специфичный для генома дикого родственника огурца маркер между маркерами SNP_01 и SNP_26.

Как упомянуто ранее, при ссылке на SNP в вариантной последовательности, эта вариантная последовательность на по меньшей мере 85% идентична упомянутой последовательности.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанные по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 маркеров выбирают из группы, состоящей из маркеров а) - z). В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанные по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 ли 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 маркеры являются последовательными маркерами.

Как упомянуто, специалист в данной области техники также может разработать другие молекулярные маркеры, например, маркер, специфичный для генома дикого родственника огурца, между маркером SNP_01 и SNP_26 и/или в пределах 7 сМ или в пределах 5 сМ любого из SNP_01 - SNP_26, и/или в пределах 5 Мб, 3 Мб, 2.5 Мб, 2 Мб, 1 Мб, 0.5 Мб, 0.4 Мб, 0.3 Мб, 0.2 Мб, 0.1 Мб, 50 кб, 20 кб, 10 кб, 5 тысяч пар оснований или менее любого из SNP_01 - SNP_26. Такими маркерами также могут быть удлинение нуклеотида, CAPS маркеры, INDEL и т.д. Специалист в данной области техники может, например, секвенировать фрагмент интрогрессии, обнаруженный в семенах, депонированных под номером доступа NCIMB42545 и применять информацию о последовательности для разработки новых маркеров и анализов маркеров.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения QTL2.1 расположен в области между SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в ее варианте) и SNP_10 в SEQ ID NO: 10 (или в е варианте).

Таким образом, в другом варианте выполнения настоящего изобретения обеспечивается культивированное растение Cucumis sativus сорт sativus, содержащее интрогрессии на хромосоме 2 в гомозиготной или гетерозиготной форме, где указанный фрагмент интрогрессии обеспечивает увеличение урожая плодов огурца (по сравнению с растением, не содержащим фрагмент интрогрессии, например, генетическим контролем), и где указанный фрагмент интрогрессии является обнаруживаемым посредством анализа молекулярного маркера, который обнаруживает по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 из маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

a) генотип СС или СТ для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_01 в SEQ ID NO: 1 (или в ее варианте);

b) генотип GG или GA для маркера однонуклеотидного полиморфизма SNP_02 в SEQ ID NO: 2 (или в ее варианте);