Способ выявления активности врожденного иммунитета

Авторы патента:

Изместьева Анна Васильевна (RU)

Бабаева Фатима Эльшановна (RU)

Руссу Леонид Иванович (RU)

Кравченко Сергей Кириллович (RU)

Сычевская Ксения Андреевна (RU)

Оспельникова Татьяна Петровна (RU)

Мезенцева Марина Владимировна (RU)

Иванова Алла Михайловна (RU)

Полосков Владислав Васильевич (RU)

Саримсаков Абдушукур Абдухалилович (UZ)

Суетина Ирина Александровна (RU)

Ершов Феликс Иванович (RU)

Наровлянский Александр Наумович (RU)

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

Владельцы патента RU 2747486:

Наровлянский Александр Наумович (RU)

Изобретение относится к медицине, в частности к способам выявления активности врожденного иммунитета. Способ выявления активности врожденного иммунитета, включающий введение в образец крови стимулирующего агента и последующую количественную оценку активности врожденного иммунитета, причём в качестве стимулирующего агента используют натриевую соль сополимера (1→4)-6-0-карбоксиметил-β-D-глюкозы, (1→4)-β-D-глюкозы, (2→24)2,3,14,15,21,24,29,32-октагидрокси-23-(карбоксиметоксиметил)-7,10-диметил-4,13-ди(2-пропил)-19,22,26,30,31-пентаоксагенацикло [23,3,2,2¹⁶O^5,28O^9,18O^12,17] дотриактонта 1,3,5(28),6,6(27),9(18),10,12(17),13,15-декаена с молекулярной массой Mm=28000-30000 и определенной структурной формулой, стимулирующий агент вводят в количестве, обеспечивающем его концентрацию 0,5 или 0,05 мг/мл в образце крови, а количественную оценку уровня активности гена USP18 производят по его изменению по отношению к активности гена контрольного образца и в случае возрастания его активности делают вывод об активности врожденного иммунитета. Вышеописанный способ позволяет расширить арсенал средств для решения поставленной задачи. 1 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности к способам выявления активности врожденного иммунитета, и может быть использовано для выбора способа лечения вирусных заболеваний и злокачественных новообразований и прогнозирования его эффективности.

Известны способы выявления активности врожденного иммунитета, включающий введение в образец крови стимулирующего агента и последующей количественной оценке активности врожденного иммунитета (https://meduniver.com/Medical/Physiology/1994.html; http://www.med24info.com/books/immunologiya/4-8-1-z-ocenka-sostoyaniya-vrozhdennogo-immuniteta-23222.html).

Известные способы достаточны сложны и требуют значительных временных затрат и/или дорогостоящих реактивов и оборудования.

Технический результат от использования предлагаемого способа выявления активности врожденного иммунитета заключается в его упрощении, снижении временных затрат и удешевлении процесса его реализации, а также расширении арсенала средств для решения поставленной задачи.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе выявления активности врожденного иммунитета, включающем введение в образец крови стимулирующего агента и последующей количественной оценке активности врожденного иммунитета, в качестве стимулирующего агента используют натриевую соль сополимера (1→4)-6-0-карбоксиметил-β-D-глюкозы, (1→4)-β-D-глюкозы, (2→24)2,3,14,15,21,24,29,32-октагидрокси-23-(карбоксиметоксиметил)-7,10-диметил-4,13-ди(2-пропил)-19,22,26,30,31-пентаоксагенацикло [23,3,2,2¹⁶O^5,28O^9,18O^12,17] дотриактонта 1,3,5(28),6,6(27),9(18),10,12(17),13,15-декаена с молекулярной массой Mm=28000-30000 и структурной формулой:

где a:b:c:d=(2-3)_а:(1-2)_b:(70-65)_с:(27-30)_d на 100 исходных ангидроглюкозных единиц целлюлозы,

производят количественную оценку уровня изменения активности гена USP18 и в случае возрастания его активности делают вывод об активности врожденного иммунитета.

Способ осуществляют следующим образом.

Цельную кровь испытуемых разводят в питательной среде. В разведенную кровь добавляют индуктор интерферона с указанными химической и структурной формулами. Для контроля используют разведенную кровь без добавления препарата. Полученные растворы инкубируют в термостате и центрифугируют. Осадки лизируют. Выделяют суммарную РНК, производят реакцию обратной транскрипции и полученную комплементарную ДНК (кДНК) используют для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени со специфическими парами праймеров. Регистрируют уровни флюоресценции, интеркалирующего в ДНК красителя. Определяют уровень изменения активности генов относительно контроля.

В случае выявления возрастания уровня активности гена USP18 делают вывод об активности врожденного иммунитета. Подтверждением активности врожденного иммунитета является наблюдаемое при этом возрастание уровня активности генов ISG15 и Р53(TP33) или одного из них.

Пример

В исследовании приняли участие 14 пациентов, ранее не принимавших лечение, в возрасте от 32 до 72 лет. Диагноз: фолликулярная лимфома (ФЛ). Всех пациентов обследовали после поступления в стационар согласно правовым аспектам оказания медицинской помощи с получением от них информированного письменного согласия.

Кровь забрали в стерильных условиях из локтевой вены утром натощак в вакуумную пробирку с цитратом натрия для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени. Все исследования выполняли в день забора крови.

Цельную кровь испытуемых развели в 3 раза в среде RPMI-1640 с глютамином, содержащей 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (ЭТС) и антибиотики. Разведенную кровь разлили по 1,8 мл и добавили по 200 мкл индуктора интерферона для получения растворов с концентрацией 0,5 и 0,05 мг/мл, в контрольный образец добавили 200 мкл среды RPMI-1640. Пробы инкубировали в термостате в течение 2 часов. Затем образцы центрифугировали при 1000 об/мин 10 минут. Осадки лизировали с помощью лизирующего буфера и выделили РНК с помощью готового набора «РНК-экстран».

Реакцию обратной транскрипции (ОТ) провели с помощью готового набора для проведения ОТ от «Синтол» с универсальным праймером «random 6» согласно инструкции. Полученные кДНК хранили при - 70°С.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени провели на амплификаторе CFX-96 с готовой двукратной смесью SsoAdvanced SYBR Green Supermix (Bio-Rad, США) в микропробирках (0,2 мл) с оптически проницаемыми крышками (SSI, США). При этом использовали готовые структуры олигонуклеотидных праймеров, ранее рассчитанные в программе Primer 3 Blast NCBI GB и апробированные к исследованным видам мРНК: Р53(ТР53) [Шувалов А.Н., Соколова Т.М., Шаповал И.М., Ершов Ф.И. Модуляция транскрипции клеточных генов препаратом иммуномакс: активация генов интерферонов и интерлейкинов. Иммунология. 2014; 35(1): 16-20], IFN-α2 [Соколова Т.М., Шувалов А.Н., Колодяжная Л.В., Оспельникова Т.П., Ершов Ф.И. Механизмы действия препарата «Кагоцел» в клетках человека. Сообщение 1. Регуляция транскрипции генов системы интерферона и апоптоза. В кн.: Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., ред. Интерферон - 2011. М.; 2012: 389-401], IFN-λ1, ISG13 [Соколова Т.М., Кособокова Е.Н., Шувалов А.Н., Шаповал И.М., Косоруков B.C., Ершов Ф.И. Активность генов системы интерферона в клетках аденокарциномы толстого кишечника htc116: регуляция рекомбинантными интерферонами альфа2 из бактериальных и растительных продуцентов. Российский биотерапевтический журнал. 2013; 12(3): 39-44], USP18 [Hashemi SMA, Sarvari j, Fattahi MR, Dowran R, Ramezani A, Hosseini SY. Comparison of ISG15, IL28B and USP18 mRNA levels in peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis В virus infected patients and healthy individuals. Gastroenterol Hepatol Bed Bench 2019; 12(1):38-45] глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) [Li L.D., Sun H.F., Liu X.X., Gao S.P., Jiang H.L., Hu X., et al. Down-regulation of NDUFB9 promotes breast cancer cell proliferation, metastasis by mediating mitochondrial metabolism. PLoS One. 2015; 10(12): e0144441. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0144441].

Далее в боксе для проведения ПЦР смешали 2 мкл специфических пар праймеров (прямой и обратный) с 3 мкл кДНК (разведенной в 3 раза) и 5 мкл 2-кратной смеси SsoAdvanced SYBR Green Supermix. Каждую пробу исследовали в 2-3 повторах. Программа ПЦР: 96°С - 2 мин (1 цикл), далее 50-55 циклов 94°С - 10 с, 55-60°С - 20 с, 72°С - 30 с. Программа плавления в конечной точке 65-95°С, шаг 0,5°С - 10 с. Ген «домашнего хозяйства» GAPDH был использован как стабильный референс-нормализатор генной экспрессии. Специфичность ДНК-продуктов устанавливали по Т-плавления. Изменения активности генов (кратность стимуляции - КС) оценили относительно контроля, принятого равным 1, используя программное обеспечение для расширенного статистического анализа данных «CFX Maestro» к амплификатору CFX-96.

В результате оценки было установлено, что у 9-и пациентов средняя КС гена USP18 составила 6,69, КС гена ISG15 - 6,04, КС гена Р53(TP53) - 9,84 (выявлена активность врожденного иммунитета). У 5-и пациентов средняя КС гена USP18 составила 0,78, КС гена ISG15 - 0,64, КС гена P53(TP53) - 0,52 (активность врожденного иммунитета не выявлена).

Эти результаты могут быть использованы для выбора способа лечения вирусных заболеваний и злокачественных новообразований и прогнозирования его эффективности.

Способ выявления активности врожденного иммунитета, включающий введение в образец крови стимулирующего агента и последующую количественную оценку активности врожденного иммунитета, отличающийся тем, что в качестве стимулирующего агента используют натриевую соль сополимера (1→4)-6-0-карбоксиметил-β-D-глюкозы, (1→4)-β-D-глюкозы, (2→24)2,3,14,15,21,24,29,32-октагидрокси-23-(карбоксиметоксиметил)-7,10-диметил-4,13-ди(2-пропил)-19,22,26,30,31-пентаоксагенацикло [23,3,2,2¹⁶O^5,28O^9,18O^12,17] дотриактонта 1,3,5(28),6,6(27),9(18),10,12(17),13,15-декаена с молекулярной массой Mm=28000-30000 и структурной формулой:

где a:b:c:d=(2-3)_а:(1-2)_b:(70-65)_с:(27-30)_d на 100 исходных ангидроглюкозных единиц целлюлозы, стимулирующий агент вводят в количестве, обеспечивающем его концентрацию 0,5 или 0,05 мг/мл в образце крови,

производят количественную оценку уровня изменения активности гена USP18 по отношению к активности гена контрольного образца, и в случае возрастания его активности делают вывод об активности врожденного иммунитета.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа приготовления эритроцитарного диагностикума иммуноглобулинового туляремийного. Сущность способа заключается в том, что получают 20% взвеси формалинизированных эритроцитов для сенсибилизации туляремийными иммуноглобулинами, выделенными из иммунной сыворотки, фракционированной каприловой кислотой.

Способ выявления антител - иммуноглобулинов класса g в сыворотке крови к возбудителям тяжелых острых респираторных вирусных инфекций, включая sars-cov-2, с одновременным прогнозом тяжести протекания коронавирусной инфекции covid-19, на гидрогелевом биочипе // 2746815

Изобретение относится к области вирусологии и иммунологии. Предложен способ для мультиплексного обнаружения антител класса G против антигенов коронавируса SARS-CoV-2 и других вирусов семейства бета-коронавирусов, вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа II и III типов при одновременном выявлении прогностических аутоантител класса G против интерферонов I типа, ассоциированных с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19.

Способ оценки имплантационной состоятельности эндометрия при повторных неудачах имплантации, ассоциированных с хроническим эндометритом // 2746644

Изобретение относится к области медицины, а именно к патоморфологии, гинекологии и репродуктологии, и может быть использовано для выявления нарушений имплантационных возможностей эндометрия при хроническом эндометрите (ХЭ) у пациенток с повторными неудачами имплантации (ПНИ).

Способ получения и анализа флуоресцентных соединений в плазме // 2746503

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к способам измерения количества флуоресцентного соединения в плазме. В одном варианте способ включает измерение количества флуоресцентного соединения - МВ-102, для чего осуществляют сбор образца плазмы, разбавление образца плазмы по меньшей мере одним растворителем, анализ разбавленного образца при помощи ВЭЖХ для измерения, таким образом, количества соединения в плазме, причем образец плазмы не сушат перед анализом ВЭЖХ и к образцу не добавляют никакого внутреннего стандарта.

Универсальный антителоопосредованный биосенсор // 2746486

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к антитело-опосредованному биосенсору, содержащему клетку, экспрессирующую химерный гибридный белок, который содержит антитело-связывающий домен Fcγ-рецептора, трансмембранный домен и сигнальный домен альфа-иммуноглобулина, и может быть использовано в медицине.

Способ трансфекции и культивирования клеток, синтезирующих рекомбинантный белок глутаматдекарбоксилазу // 2746162

Изобретение относится к области молекулярной генетики и медицинской биотехнологии и может быть использовано в медицине при создании технологий дифференциальной диагностики аутоиммунного сахарного диабета, синдрома мышечной скованности и других заболеваний.

Способ приготовления библиотеки днк // 2746126

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ приготовления библиотеки ДНК из ДНК, выделенной из биологического образца, для последующего секвенирования методами секвенирования нового поколения, в котором: (1) фрагментируют ДНК, выделенную из образца с получением смесифрагментов ДНК; (2) восстанавливают концевые последовательности фрагментов ДНК, полученных на стадии (1), (затупляют концы) и обогащают полученную смесь фрагментов ДНК целевыми последовательностями ДНК посредством магнитных частиц с ковалентно-присоединенными к ним олигонуклеотидными зондами, являющимися специфичными к целевым последовательностям ДНК;(3) лигируют целевые последовательности ДНК, полученные на этапе (2), с олигонуклеотидными адаптерами, содержащими олигонуклеотидную последовательность, применяющуюся в упомянутом методе секвенирования нового поколения; (4) очищают последовательности ДНК, полученные на этапе (3), посредством упомянутых магнитных частиц, характеризующийся тем, что упомянутые магнитные частицы представляют собой магнитные частицы, к которым ковалентно присоединены олигонуклеотидные зонды, имеющие последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 1 - 387.

Способ прогнозирования репродуктивных потерь в сроке до 22 недель беременности у женщин с угрожающим выкидышем и привычным невынашиванием в анамнезе // 2746033

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и раскрывает способ прогнозирования репродуктивных потерь у женщин с угрожающим выкидышем ранних сроков и привычным невынашиванием в анамнезе.

Способ изготовления матричного биосенсора на основе восстановленного оксида графена и матричный биосенсор на полимерной подложке // 2745663

Использование: для проведения исследований в области биотехнологий. Сущность изобретения заключается в том, что изготовление матричного биологического сенсора на основе восстановленного оксида графена включает формирование на полимерной подложке пленки оксида графена, локальную модификацию оксид-графеновой пленки по заданному рисунку с образованием нескольких проводящих каналов и иммобилизацию на модифицированной оксид-графеновой пленке биомолекул, обеспечивающих избирательное взаимодействие с другими биологическими агентами.

Способ прогнозирования риска развития повторного инфаркта миокарда у мужчин трудоспособного возраста // 2745472

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и касается прогнозирования повторного инфаркта миокарда у мужчин трудоспособного возраста. Для этого у пациента с инфарктом миокарда (ИМ) в общем анализе крови определяют уровень гемоглобина, определяют величину фракции выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ), определяют индекс Gensini.