Нанопоровые секвенаторы

Примеры нанопоровых секвенаторов включают цис-лунку, транс-лунку и нанопору, соединяющую по текучей среде цис- и транс-лунки. В одном из примеров секвенатора модифицированный электролит (включающий электролит и агент, образующий комплексы с катионами) находится в цис-лунке, или транс-лунке, или в цис- и транс-лунках. В другом примере секвенатора в цис-лунке, или транс-лунке, или в цис- и транс-лунках находится полиэлектролит в виде геля. 5 н. и 13 з.п. ф-лы, 8 ил.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка претендует на полезный эффект предварительной патентной заявки US 62/522628, поданной 20 июня 2017 г., содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Различные методики секвенирования полинукпеотидов включают выполнение большого количества контролируемых реакций на поверхностях локальных подложек или в ограниченных реакционных камерах. За протеканием заданных реакций затем можно наблюдать или обнаруживать их протекание, и последующий анализ может позволить идентифицировать или обнаруживать свойства полинуклеотида, участвующего в реакции. Была разработана другая методика секвенирования полинукпеотидов, в которой применяют нанопоры, которые могут образовывать канал для протекания ионного электрического тока. Под действием внешних сил полинуклеотид проходит через нанопору, и процесс прохождения полинуклеотида через нанопору нарушает течение электрического тока через нанопору. Каждое пропускание нуклеотида или серии нуклеотидов приводит к созданию характеристического электрического тока, и регистрируемое значение тока соответствует последовательному встраиванию полинуклеотида.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один из примеров нанопорового секвенатора, раскрытого в данном документе, включает: цис-лунку; транс-лунку; нанопору, соединяющую по текучей среде цис-лунку и транс-лунку; и модифицированный электролит, находящийся в цис-лунке или транс-лунке или в цис- и транс-лунках, где модифицированный электролит включает электролит и агент, образующий комплексы с катионами.

Другой пример нанопорового секвенатора, раскрытого в данном документе, включает: цис-лунку; транс-лунку; нанопору, соединяющую по текучей среде цис-лунку и транс-лунку; и полиэлектролит в виде геля, находящийся в цис-лунке или транс-лунке или в цис- и транс-лунках.

Другой пример нанопорового секвенатора включает: цис-лунку; транс-лунку; нанопору, соединяющую по текучей среде цис-лунку и транс-лунку; электродную конструкцию цис-лунки, связанную с цис-лункой, где электродная конструкция цис-лунки включает первый базовый (нижний, англ. base) электрод и окислительно-восстановительное твердое вещество, иммобилизованное на первом базовом электроде; электродную конструкцию транс-лунки, связанную с транс-лункой, где электродная конструкция транс-лунки включает второй базовый электрод и окислительно-восстановительное твердое вещество, иммобилизованное на втором базовом электроде; и электролит, включающий катион, который поглощается или высвобождается в результате протекания соответствующих окислительно-восстановительных реакций на первой электродной конструкции и второй электродной конструкции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Признаки примеров настоящего изобретения станут более очевидными после рассмотрения приведенного ниже подробного описания и графических материалов, в которых подобными числовыми обозначениями обозначены сходные, но не обязательно идентичные, компоненты. Для краткости, числовые обозначения или признаки, имеющие функцию, описанную ранее, могут быть вновь рассмотрены или не быть вновь рассмотрены при описании других графических материалов, в которых они появляются.

На Фиг. 1 схематически изображен в частичном разрезе пример нанопорового секвенатора, описанного в данном документе;

На Фиг. 2 схематически изображен в частичном разрезе другой пример нанопорового секвенатора, описанного в данном документе;

На Фиг. 3 представлена блок-схема, иллюстрирующая два примера способа, описанного в данном документе, один из которых включает применение нанопорового секвенатора, представленного на Фиг. 1, а другой включает применение нанопорового секвенатора, представленного на Фиг. 2;

На Фиг. 4 схематически изображен в частичном разрезе другой пример нанопорового секвенатора, описанного в данном документе;

На Фиг. 5 представлена блок блок-схема, иллюстрирующая другой пример способа, раскрытого в данном документе, который включает применение нанопорового секвенатора, представленного на Фиг. 4;

На Фиг. 6А, 6В и 6С представлены графики зависимости величины электрического тока (i, пА (пикоАмпер)) от напряжения (В), полученные в А) двух нанопоровых секвенаторах (1, 2) без добавления краун-эфира, В) в нанопоровых секвенаторах (2) без добавления краун-эфира и нанопоровом секвенаторе (2) с добавлением краун-эфира и в цис-, и в транс-лунки, и С) в нанопоровом секвенаторе (2) без добавления краун-эфира и в нанопоровом секвенаторе (2), показанном на Фиг. 6В, после того, как краун-эфир был удален из цис-камеры с потоком;

На Фиг. 7А представлен график зависимости ионного (электрического) тока (пА) от времени (мсек) при перемещении шпилькообразной структуры через единичную пору из порина A Mycobacterium smegmatis (англ. Mycobacterium smegmatis porin, сокращенно MspA) без добавления краун-эфира;

На Фиг. 7 В представлена гистограмма (импульсы от амплитуды), построенная по данным, представленным на Фиг. 7А;

На Фиг. 8А представлен график зависимости ионного (электрического) тока (пА) от времени (мсек) при транслокации шпилькообразной структуры через единичную пору из MspA в присутствии добавленного краун-эфира; и

На Фиг. 8В представлена гистограмма (импульсы от амплитуды), построенная по данным, представленным на Фиг. 8А.

ВВЕДЕНИЕ

Согласно первому аспекту, нанопоровый секвенатор включает цис-лунку; транс-лунку; нанопору, соединяющую по текучей среде цис-лунку и транс-лунку; и модифицированный электролит, находящийся в цис-лунке или транс-лунке или в цис- и транс-лунках, где модифицированный электролит включает электролит и агент, образующий комплексы с катионами.

В одном из примеров первого аспекта модифицированный электролит находится в цис-лунке, нанопоровый секвенатор дополнительно включает немодифицированный электролит, находящийся в транс-лунке, и немодифицированный электролит включает электролит, не содержащий агент, образующий комплексы с катионами; или модифицированный электролит находится в транс-лунке, нанопоровый секвенатор дополнительно включает немодифицированный электролит, находящийся в цис-лунке, и немодифицированный электролит включает электролит, не содержащий агент, образующий комплексы с катионами.

В другом примере первого аспекта, нанопоровый секвенатор дополнительно включает множество транс-лунок, образованных в подложке (англ. substrate), каждая из которых соединена по текучей среде с цис-лункой посредством соответствующей нанопоры, где плотность множества транс-лунок составляет от приблизительно 10 транс-лунок на мм² подложки до приблизительно 1000000 транс-лунок на мм² подложки.

В другом примере первого аспекта электролит включает катион калия и связанный с ним анион, катион натрия и связанный с ним анион или их комбинации; и агент, образующий комплексы с катионами, выбран из группы, состоящей из краун-эфира, каликсарена и валиномицина.

В другом примере первого аспекта модифицированный электролит включает от более чем 0 мМ до приблизительно 500 мМ агента, образующего комплексы с катионами.

Следует понимать, что любые признаки первого аспекта устройства для секвенирования на нанопорах могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом и/или в виде любой конфигурации.

Согласно второму аспекту, нанопоровый секвенатор включает цис-лунку; транс-лунку; нанопору, соединяющую по текучей среде цис-лунку и транс-лунку; и полиэлектролит в виде геля, находящийся в цис-лунке или транс-лунке или в цис- и транс-лунках.

В одном из примеров второго аспекта полиэлектролит находится в цис-лунке, и нанопоровый секвенатор дополнительно включает электролит, находящийся в транс-лунке; или полиэлектролит находится в транс-лунке, и нанопоровый секвенатор дополнительно включает электролит, находящийся в цис-лунке. В одном из примеров полиэлектролит выбран из группы, состоящей из хлорида полидиаллилдиметиламмония, ионной формы полиэтиленимина, ионной формы неразветвленного полиэтиленимина, полиаллиламингидрохлорида и ионной формы поли-4-винилпиридина, и электролит включает катион калия и связанный с ним анион, катион натрия и связанный с ним анион или их комбинации.

В другом примере второго аспекта нанопоровый секвенатор дополнительно включает множество транс-лунок, образованных в подложке, каждая из которых соединена по текучей среде с цис-лункой посредством соответствующей нанопоры, и плотность множества транс-лунок составляет от приблизительно 10 транс-лунок на мм² подложки до приблизительно 1000000 транс-лунок на мм² подложки.

В другом примере второго аспекта полиэлектролит находится и в цис-, и в транс-лунках; и полиэлектролит выбран из группы, состоящей из хлорида полидиаллилдиметиламмония, ионной формы полиэтиленимина, ионной формы неразветвленного полиэтиленимина, полиаллиламингидрохлорида и ионной формы поли-4-винилпиридина.

Следует понимать, что любые признаки второго аспекта нанопорового секвенатора могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом.

Кроме того, следует понимать, что любые комбинации признаков первого нанопорового секвенатора и/или второго нанопорового секвенатора могут быть применены совместно, и/или любые признаки любого или обоих этих аспектов могут быть скомбинированы с любыми из примеров, рассмотренных в настоящей работе.

Согласно третьему аспекту, нанопоровый секвенатор включает цис-лунку; транс-лунку; нанопору, соединяющую по текучей среде цис-лунку и транс-лунку; электродную конструкцию цис-лунки, связанную с цис-лункой, где электродная конструкция цис-лунки включает первый базовый электрод и окислительно-восстановительное твердое вещество, иммобилизованное на первом базовом электроде; электродную конструкцию транс-лунки, связанную с транс-лункой, где электродная конструкция транс-лунки включает второй базовый электрод и окислительно-восстановительное твердое вещество, иммобилизованное на втором базовом электроде; и электролит, включающий катион, который расходуется или высвобождается в результате протекания соответствующих окислительно-восстановительных реакций на электродной конструкции цис-лунки и электродной конструкции транс-лунки.

В одном из примеров третьего аспекта окислительно-восстановительное твердое вещество выбрано из группы, состоящей из тетрацианохинодиметана (англ. tetracyanoquinodimethane, сокращенно TCNQ), берлинской лазури и полипиррола.

В другом примере третьего аспекта материалы первого и второго базовых электродов независимо выбраны из группы, состоящей из графита, платины, золота, серебра, меди, углеродного волокна, алмаза и палладия.

Следует понимать, что любые признаки третьего аспекта нанопорового секвенатора могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любые комбинации признаков третьего аспекта нанопорового секвенатора и/или второго аспекта нанопорового секвенатора и/или первого аспекта нанопорового секвенатора могут быть применены совместно, и/или что любые признаки любого или любых названных аспектов могут быть скомбинированы с любыми примерами, рассмотренными в настоящей работе.

Согласно четвертому аспекту, способ применения нанопорового секвенатора согласно первому аспекту включает регулирование расходования окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в электролите, находящемся в устройстве для секвенирования на нанопорах, посредством приложения между цис-лункой нанопорового секвенатора и транс-лункой нанопорового секвенатора напряжения смещения, находящегося в диапазоне от приблизительно -1 В до приблизительно 1 В.

В одном из примеров четвертого аспекта способ дополнительно включает предоставление нанопорового секвенатора, содержащего: модифицированный электролит в цис-лунке и электролит, не содержащий агент, образующий комплексы с катионами, в транс-лунке; или модифицированный электролит в транс-лунке и электролит, не содержащий агент, образующий комплексы с катионами в цис-лунке.

В другом примере четвертого аспекта способ дополнительно включает введение в электролит агента, образующего комплексы с катионами, с образованием модифицированного электролита; и введение модифицированного электролита в цис-лунку или транс-лунку или цис- и транс-лунки.

В другом примере четвертого аспекта электролит включает катион калия и связанный с ним анион, катион натрия и связанный с ним анион или их комбинации; и агент, образующий комплексы с катионами, выбран из группы, состоящей из краун-эфира, каликсарена и валиномицина.

Следует понимать, что любые признаки четвертого аспекта способа могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любые комбинации признаков четвертого аспекта способа и/или третьего аспекта нанопорового секвенатора и/или второго аспекта нанопорового секвенатора и/или первого аспекта нанопорового секвенатора могут быть применены названных аспектов могут быть скомбинированы с любыми примерами, рассмотренными в настоящей работе.

Согласно пятому аспекту, способ применения нанопорового секвенатора согласно второму аспекту включает регулирование расходования окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в полиэлектролите, находящемся в нанопоровом секвенаторе, посредством приложения напряжения смещения, составляющего от приблизительно -1 В до приблизительно 1 В, между цис-лункой нанопорового секвенатора и транс-лункой нанопорового секвенатора.

Следует понимать, что любые признаки пятого аспекта способа могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любые комбинации признаков пятого аспекта способа и/или четвертого аспекта способа и/или третьего аспекта нанопорового секвенатора ах и/или второго аспекта нанопорового секвенатора и/или первого аспекта нанопорового секвенатора могут быть применены совместно, и/или что любые признаки любого или любых названных аспектов могут быть скомбинированы с любыми примерами, рассмотренными в настоящей работе.

Согласно шестому аспекту, способ применения нанопорового секвенатора согласно третьему аспекту включает регулирование расходования окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в электролите, находящемся в нанопоровом секвенаторе, посредством приложения первого напряжения к электродной конструкции, находящейся в цис-лунке, что приводит к инициированию катодной реакции, в которой расходуются катионы электролита, находящегося в секвенаторе; и посредством приложения второго напряжения к электродной конструкции, находящейся в транс-лунке, что приводит к инициированию анодной реакции, приводящей к высвобождению катиона электролита.

В одном из примеров шестого аспекта окислительно-восстановительное твердое вещество выбрано из группы, состоящей из тетрацианохинодиметана (TCNQ), берлинской лазури и полипиррола.

Следует понимать, что любые признаки шестого аспекта способа могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любые комбинации признаков шестого аспекта способа и/или пятого аспекта способа и/или четвертого аспекта способа и/или третьего аспекта нанопорового секвенатора и/или второго аспекта нанопорового секвенатора и/или первого аспекта нанопорового секвенатора могут быть применены совместно, и/или что любые признаки любого или любых названных аспектов могут быть скомбинированы с любыми примерами, рассмотренными в настоящей работе.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В методике нанопорового секвенирования для распознавания нуклеотидных оснований применяют изменения величины электрического тока. В нанопоровых секвенаторах для поддержания протекания через систему фарадеевского электрического тока один содержащийся в электролите окислительно-восстановительный реагент может быть частично израсходован на электроде транслунки (или камеры). Частично израсходованный окислительно-восстановительный реагент, содержащийся в электролите, не может быть эффективно восполнен на соответствующем электроде цис-лунки, частично из-за ингибирования транспорта ионов через нанопору (нанопоры). Например, хлоридные анионы могут быть частично израсходованы на транс-стороне в результате электролитического осаждения, и их концентрация может быть не полностью восстановлена на цис-стороне. Возникает градиент концентраций обоих содержащихся в электролите окислительно-восстановительных реагентов (т.е. катиона и аниона), и на трансстороне устанавливается новое равновесие при гораздо более низкой концентрации частично израсходованного реагента. Дисбаланс транспорта окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в электролите, через нанопору в результате частичного расходования одного из реагентов на транс-электроде может приводить к дрейфу электрического тока, который может негативно влиять на возможность распознавания нуклеотидных оснований.

Частичное расходование содержащегося в электролите окислительно-восстановительного реагента зависит от нескольких факторов, которые включают начальную концентрацию содержащегося в электролите окислительно-восстановительного реагента, величину электрического тока, проходящего через нанопору, и размер транс-камеры (например, в камерах больших размеров обычно происходит меньшее расходование реагента, и в камерах меньших размеров обычно происходит большее расходование реагента).

Частичное расходование может проявляться как снижение исходной концентрации реагента, которое может превышать 10-кратное снижение. В некоторых примерах многократное снижение концентрации имеет кратность, составляющую от 20 до 100 раз. Например, концентрация хлорида в электролите, в котором исходная концентрация хлорида составляла приблизительно 300 мМ, в транс-лунке размером 10 мкм может снижаться до приблизительно 10 мМ, и, таким образом, исходная концентрация снижается приблизительно в 30 раз. В другом примере концентрация хлорида в электролите, в котором исходная концентрация хлорида составляла приблизительно 10 мМ, в транс-лунке размером 10 мкм может снижаться до приблизительно 0,1 мМ, и, таким образом, исходная концентрация снижается приблизительно в 100 раз. Следует понимать, что частичное расходование/истощение может достигать 100% (т.е. концентрация содержащегося в электролите окислительно-восстановительного реагента, который остается в системе, достигает 0%), но даже при таких низких уровнях частично израсходованного реагента между содержащимися в электролите окислительно-восстановительными реагентами будет устанавливаться равновесие.

Примеры нанопорового секвенатора и соответствующего способа, раскрытые в данном документе, позволяют эффективно снижать частичное расходование или истощение содержащегося в электролите окислительно-восстановительного реагента (реагентов) на электроде (электродах) транс-лунки (или камеры) секвенатора (т.е. устройства для секвенирования). В примерах, описанный в данном документе, все же может происходить снижение исходной концентрации реагента, однако это снижение составляет менее 10% и, вероятно, менее 1%. В результате в течение соответствующего периода времени присутствует большее количество реагента (например, по сравнению с примерами, приведенными выше), и, таким образом, снижается расходование или истощение реагента. В некоторых примерах частичное расходование/истощение окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в электролите, снижается за счет ослабления диффузии электрохимически пассивных частиц (например, катионов, содержащихся в электролите) через нанопору (нанопоры) секвенатора. В некоторых примерах электрохимически пассивной частицей является катион электролита. Ослабление диффузии катионов приводит к тому, что заряд переносится исключительно анионами электролита. При использовании в качестве переносчиков заряда исключительно анионов (в отличие от переноса зарядов как анионами, так и катионами) по меньшей мере снижается любой дисбаланс заряда, создаваемый разностью между подачей анионов и расходованием анионов. В результате также снижается расходование анионов, находящихся в транс-лунке (лунках) устройства для секвенирования на нанопорах. В других примерах по меньшей мере снижение расходования/истощения анионов, содержащихся в электролите, происходит за счет применения системы электродов, в которой не расходуются анионы, и которая, напротив, позволяет генерировать катионы электролита на одном электроде и расходовать те же катионы электролита на другом электроде.

Как было отмечено выше, для распознавания нуклеотидных оснований в методике секвенирования на нанопорах применяют изменение величины электрического тока. Расходование частиц электролита приводит снижению (или нежелательному изменению) электрического тока, которое негативно влияет на возможность получения точных показаний электрического тока, требуемых для распознавания нуклеотидных оснований. Уравновешивание транспорта ионных частиц через нанопору с расходованием таких частиц на транс-электроде позволяет ослаблять дрейф электрического тока и повышать срок службы электролита, трансэлектрода и транс-лунки.

Следует понимать, что, если не указано иное, то используемые в настоящем описании термины имеют свои обычные значения, известные в соответствующей области техники. Некоторые используемые в настоящем описании термины и их значения приведены ниже.

Формы единственного числа включают множественное число, если из контекста не ясно иное.

Термины "включающий", "содержащий" и различные формы этих терминов синонимичны по отношению друг к другу и имеют одинаково широкое значение. Кроме того, если ясно не указано обратное, примеры, включающие, содержащие или имеющие элемент или совокупность элементов, имеющих определенное свойство, могут включать дополнительные элементы, независимо от того, имеют или нет эти дополнительные элементы указанное свойство.

Используемые в настоящей работе термины "соединение по текучей среде", "сообщение по текучей среде", "соединенный по текучей среде" и подобные термины относятся к двум пространственным областям, которые соединены друг с другом таким образом, что между этими пространственными областями могут протекать жидкость или газ. Например, цис-лунка может быть соединена по текучей среде с транс-лункой или множеством транс-лунок таким образом, что по меньшей мере часть электролита может свободно протекать между соединенными лунками. Две пространственные области могут быть соединены по текучей среде через нанопору или через один или более клапанов, дросселей или других гидравлических компонентов, с помощью которых осуществляют контроль или регулирование потока текучей среды через систему.

Используемый в настоящем описании термин "промежуточная область" относится к участку, находящемуся в подложке/твердом носителе или мембране, или к участку на поверхности, который разделяет другие участки, области, элементы, связанные с носителем или мембраной или поверхностью. Например, промежуточная область мембраны может отделять одну нанопору массива (англ. array) от другой нанопоры массива. В другом примере промежуточная область подложки может отделять одну транс-лунку от другой транс-лунки. Два участка, отделенные друг от друга, могут быть дискретными, т.е. не иметь физического контакта друг с другом. В различных примерах промежуточная область непрерывна, в то время как участки дискретны, например, как в случае множества нанопор, образованного в мембране, непрерывной на остальной площади, или в случае множества лунок, образованного в носителе, непрерывном на остальной площади. Разделение, обеспечиваемое промежуточной областью, может быть частичным или полным. Промежуточные области могут включать поверхностный материал, который отличается от поверхностного материала элементов, имеющихся на поверхности. Например, поверхностный материал промежуточных областей может представлять собой липидный материал, и нанопора, образованная в липидном материале, может содержать количество или концентрацию полипептида, превышающую его количество или концентрацию в промежуточных областях. В некоторых примерах в промежуточных областях полипептид может отсутствовать.

Используемый в настоящем документе термин "мембрана" относится к непроницаемому или полупроницаемому барьеру или другому листовому материалу, который разделяет две камеры с жидкостью/гелем (например, цис-лунку и транс-лунку), в которых могут содержаться одинаковые или разные композиции. Проницаемость мембраны по отношению к любой заданной частице зависит от природы мембраны. В некоторых примерах мембрана может быть непроницаемой для ионов, для электрического тока и/или текучих сред. Например, липидная мембрана может быть непроницаемой для ионов (т.е. не допускать транспорта ионов через мембрану), но может быть по меньшей мере частично проницаемой для воды (например, коэффициент диффузии воды составляет от приблизительно 40 мкм/с до приблизительно 100 мкм/с). В другом примере твердая мембрана, например, полученная из нитрида кремния, может быть непроницаема для ионов, электрических зарядов и текучих сред (т.е. диффузия всех перечисленных частиц равна нулю). Согласно настоящему изобретению может быть применена любая мембрана, при условии, что эта мембрана может включать сквозные отверстия в виде нанопор и может поддерживать разность потенциалов между обеими сторонами мембраны. Мембрана может быть однослойной или многослойной. Многослойная мембрана включает несколько слоев, каждый из которых состоит из непроницаемого или полупроницаемого материала.

Мембрана может быть получена из материалов биологического или небиологического происхождения. Материалом биологического происхождения называют материал, полученный или выделенный из биологической среды, такой как организм или клетка, или синтетически полученный вариант структуры, которая может быть получена из биологической среды.

Примером мембраны, полученной из материала биологического происхождения, является однослойная мембрана из болалипида. Другой пример мембраны, полученной из материала биологического происхождения, включает липидный бислой. Подходящие липидные бислои включают, например, мембрану клетки, мембрану органеллы, липосому, планарный липидный бислой и липидный бислой на носителе. Липидный бислой может быть образован, например, из двух расположенных друг напротив друга слоев фосфолипидов, которые расположены так, что их гидрофобные концевые группы обращены друг к другу и образуют гидрофобное внутреннее пространство, в то время как гидрофильные головные группы липидов обращены наружу, в направлении водного окружения, с каждой стороны бислоя. Липидные бислои также могут быть получены, например, способом, в котором липидный монослой располагают на границе раздела водного раствора и воздуха по обе стороны от отверстия, которое перпендикулярно этой границе раздела. Липид обычно наносят на поверхность водного раствора электролита, сначала растворяя его в органическом растворителе и затем оставляя каплю растворителя испаряться с поверхности водного раствора по обе стороны от отверстия. После по меньшей мере частичного испарения органического растворителя, границы раздела раствор/воздух по обе стороны от отверстия физически перемещают вверх и вниз относительно отверстия до образования бислоя. Другие подходящие способы образования бислоя включают погружение наконечника (tip-dipping), накраска бислоев и пэтч-клэмп (patch-clamping) липосомных бислоев. Также могут быть применены любые другие способы получения или формирования липидных бислоев.

Материалом мембраны также может быть материал небиологического происхождения. Некоторые из таких материалов представляют собой твердые материалы, которые могут образовывать мембраны в твердом состоянии (твердые мембраны), и другие материалы могут образовывать тонкую пленку или мембрану из жидкости. Твердая мембрана может быть однослойной, такой как покрытие или пленка на несущей подложке (т.е. на твердом носителе) или самоподдерживающийся элемент. Твердая мембрана также может состоять из композиционного материала, состоящего из многослойных материалов, образующих конфигурацию в виде "сэндвича". Может быть применен любой материал небиологического происхождения при условии, что получаемая мембрана может включать сквозное отверстие в виде нанопоры и может поддерживать разность потенциалов между обеими сторонами мембраны. Мембраны могут включать органические материалы, неорганические материалы или материалы обоих этих видов. Примеры подходящих твердых материалов включают, например, материалы, применяемые в микроэлектронике, изолирующие материалы (например, нитрид кремния (Si₃N₄), оксид алюминия (Al₂O₃) и оксид кремния (SiO)), некоторые органические и неорганические полимеры (например, полиамид, пластические массы, такие как политетрафторэтилен (ПТФЭ), или эластомеры, такие как двухкомпонентные отверждаемые в результате реакции полиприсоединения кремнийорганические каучуки) и стекла. Кроме того, твердая мембрана может быть получена из монослоя графена, который представляет собой слой атомов углерода толщиной в один атом, в котором атомы углерода плотно упакованы в виде двухмерной решетки, имеющей форму пчелиных сот, из многослойного графена или одного или более слоев графена, смешанных с одним или более слоями других материалов, находящихся в твердом состоянии. Твердая графен-содержащая мембрана может включать по меньшей мере один слой графена, который представляет собой наноленту из графена или нанозазор из графена, который может быть применен в качестве электрического датчика для идентификации целевого полинуклеотида. Твердая мембрана может быть получена любым подходящим способом. В качестве примеров можно отметить, что графе новая мембрана может быть получена либо химическим осаждением из газовой фазы (англ. chemical vapor deposition, сокращенно CVD) или расслоением из графита. Примеры подходящих материалов тонких жидкостных пленок, которые могут быть применены, включают диблоксополимеры, триблоксополимеры, такие как амфифильные триблоксополимеры типа ABA: PMOXA-PDMS-PMOXA (от англ. poly(2-methyloxazoline)-poly(dimethylsiloxane)-poly(2-methyloxazoline), что означает сополимер поли-2-метилоксазолина-полидиметилсилоксана-поли-2-метилоксазолина).

В контексте данного документа термин "нанопора" означает полую дискретную структуру, образованную на мембране и проходящую через мембрану, которая может пропускать ионы, электрический ток и/или текучие среды с одной стороны мембраны на другую сторону мембраны. Например, мембрана, затрудняющая прохождение ионов или растворимых в воде молекул, может включать структуру, имеющую нанопоры, проходящие сквозь мембрану, по которым ионы или растворимые в воде молекулы могут перемещаться с одной стороны мембраны на другую сторону мембраны. Диаметр нанопоры может быть различным на протяжении ее длины (т.е. от одной стороны мембраны до другой стороны мембраны), но в каждой точке он находится в нанодиапазоне (т.е. от приблизительно 1 нм до приблизительно 100 нм). Примеры нанопор включают, например, биологические нанопоры, нанопоры твердых веществ и гибридные нанопоры биологических и твердых веществ.

Используемый в настоящей работе термин "биологическая нанопора" означает нанопору, часть структуры которой получена из материалов биологического происхождения. Биологическое происхождение означает, что материал получен из или выделен из биологической среды, такой как организм или клетка, или из полученного синтетическим образом варианта структуры, имеющейся в биологической среде. Биологические нанопоры включают, например, полипептидные нанопоры и полинуклеотидные нанопоры.

Используемый в настоящей работе термин "полипептидная нанопора" означает полипептид, который простирается через мембрану и позволяет ионам, электрическому току и/или текучим средам перетекать с одной стороны мембраны на другую сторону мембраны. Полипептидная нанопора может быть мономером, гомополимером или гетерополимером. Структуры полипептидных нанопор включают, например, нанопору в виде α-спирального пучка и нанопору в виде β-барреля. Примеры полипептидных нанопор включают α-гемолизин, порин А Mycobacterium smegmatis (MspA), грамицидин А, мальтопорин, OmpF, OmpC, PhoE, Tsx, F-фимбрии и т.д. Порин A Mycobacterium smegmatis (MspA) представляет собой мембранный порин, вырабатываемый микобактериями, который позволяет гидрофильным молекулам проникать внутрь бактерии. MspA образует плотно сопряженный октамер и трансмембранный бета-баррель, напоминающий по внешнему виду бокал, который содержит центральный канал/пору.

Полипептидная нанопора может быть синтетической. Синтетическая полипептидная нанопора включает подобную белку аминокислотную последовательность, которая не встречается в природе. Подобная белку аминокислотная последовательность может включать некоторые известные существующие аминокислоты, которые не образуют основу белков (т.е. непротеиногенные аминокислоты). Подобная белку аминокислотная последовательность может быть искусственно синтезирована, а не экспрессирована организмом и затем очищена/выделена.

Используемый в настоящем документе термин "полинуклеотидная нанопора" относится к полинуклеотиду, который проходит через мембрану и позволяет ионам, электрическому току и/или текучим средам протекать с одной стороны мембраны на другую сторону мембраны. Полинуклеотидная пора может включать, например, полинуклеотид-оригами (например, наноразмерно сложенную ДНК, образующую нанопору).

Также используемый в настоящей работе термин "твердая нанопора" означает нанопору, часть структуры которой включает материалы небиологического происхождения (т.е. не биологического происхождения). Твердая нанопора может быть образована неорганическим или органическим материалом. Твердые нанопоры включают, например, нанопоры из нитрида кремния, нанопоры из диоксида кремния (SiO₂) и графеновые нанопоры.

Нанопоры согласно изобретению могут представлять собой гибридные нанопоры. Термин "гибридная нанопора" относится к нанопоре, включающей материалы как биологического, так и небиологического происхождения. Пример гибридной нанопоры включает твердую полипептидную гибридную нанопору и твердую полинуклеотидную нанопору.

Используемый в настоящем документе термин "устройство для секвенирования на нанопорах (нанопоровый секвенатор)" относится к любому устройству, рассмотренному в настоящей работе, которое может быть применено для нанопорового секвенирования. В рассмотренных в настоящей работе примерах в процессе нанопорового секвенирования нанопору погружают в пример (примеры) электролита, рассмотренные в настоящей работе, и к мембране прикладывают разность потенциалов. В одном из примеров разность потенциалов представляет собой разность электрических потенциалов или разность электрохимических потенциалов. Разность электрических потенциалов может быть приложена к мембране под действием источника напряжения, который подает электрический ток к по меньшей мере одному из ионов электролита, содержащегося в цис-лунке или одной или более транс-лунок. Разность электрохимических потенциалов может быть установлена при различии ионного состава в цис- и транс-лунках в комбинации с электрическим потенциалом. Различия в ионном составе могут быть обусловлены, например, наличием в каждой лунке разных ионов или наличием в каждой лунке различных концентраций одинаковых ионов.

Приложение разности потенциалов к нанопорам может индуцировать перенос нуклеиновой кислоты через нанопору. При этом генерируется один или более сигналов, соответствующих перемещению нуклеотида через нанопору. Соответственно, по мере перемещения целевого полинуклеотида или мононуклеотида или зонда, полученного из целевого полинуклеотида или мононуклеотида, через нанопору электрический ток на участке толщины мембраны изменяется в результате, например, блокирования конструкции, тип которого зависит от типа основания (или типа зонда). Сигнал полученного изменения электрического тока может быть измерен любым из множества существующих способов. Каждый сигнал уникален и зависит от вида нуклеотида (нуклеотидов) (или зонда), находящегося в нанопоре, то есть получаемый сигнал может быть применен для определения характеристики полинуклеотида. Например, может быть определена принадлежность одного или более вида нуклеотида (нуклеотидов) (или зонда), который создает характеристический сигнал.

Используемый в настоящем документе термин "нуклеотид" включает азотсодержащее гетероциклическое основание, сахар и одну или более фосфатных групп. Нуклеотиды представляют собой мономерные единицы последовательности нуклеиновой кислоты. Примеры нуклеотидов включают, например, рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. В рибонуклеотидах (РНК) сахар представляет собой рибозу, и в дезоксирибонуклеотидах (ДНК) сахар представляет собой дезоксирибозу, т.е. сахар, не имеющий гидроксильной группы, которая присутствует в положении 2' рибозы. Азотсодержащее гетероциклическое основание может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание. Пуриновые основания включают аденин (А) и гуанин (G) и их модифицированные производные или аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U) и их модифицированные производные или аналоги. Атом С-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидна или N-9 пурина. Фосфатные группы могут находиться в виде моно-, ди- или три-фосфатов. Такие нукпеотиды представляет собой природные (натуральные) нукпеотиды, но также следует понимать, что согласно изобретению могут быть применены ненатуральные нукпеотиды, модифицированные нукпеотиды или аналоги указанных выше нуклеотидов.

Используемый в настоящей работе термин "сигнал" означает индикатор, предоставляющий информацию. Сигналы включают, например, электрический сигнал и оптический сигнал. Термин "электрический сигнал" относится к индикатору электрической природы, который предоставляет информацию. Индикатором может служить, например, электрический ток, напряжение, туннельный эффект, сопротивление, потенциал, проводимость или поперечный электрический эффект. Термин "электронный ток" или "электрический ток" относится к потоку электрического заряда. В одном из примеров электрический сигнал может представлять собой электрический ток, проходящий через нанопору, и электрический ток может течь, если к нанопоре приложена разность электрических потенциалов.

Термин "подложка" относится к жесткому твердому носителю, который нерастворим в водной жидкости и не может пропускать жидкость в отсутствие отверстия, канала или другого подобного проводника жидкости. В примерах, рассмотренных в настоящей работе, в подложке могут быть образованы лунки или камеры. Примеры подходящих материалов подложек включают стекло и модифицированное или функционализированное стекло, полимеры (включающие акриловые полимеры, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (ПТФЭ) (такой как TEFLON®, поставляемый Chemours), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (англ. cycloolefin polymer, сокращенно СОР) (такие как ZEONOR®, поставляемый Zeon), полиимиды и т.д.), нейлон, керамические материалы, оксид кремния или материалы на основе оксида кремния, кремний и модифицированный кремний, углерод, металлы, неорганические стекла и пучки оптических волокон.

Термины "верхняя часть", "нижняя часть", "верхний", "нижний", "на" и т.д. используются в настоящей работе для описания нанопорового секвенатора и/или различных компонентов нанопорового секвенатора. Следует понимать, что такие обозначения направления не относятся к специальной ориентации, а применяются для обозначения ориентации компонентов относительно друг друга. Применение обозначений направления не должно рассматриваться как ограничение примеров, рассмотренных в настоящей работе, какой-либо конкретной ориентацией (ориентациями).

Используемые в настоящей работе термины "лунка" и "камера" применяют взаимозаменяемо, и они относятся к дискретному элементу, имеющемуся в секвенаторе, который может содержать текучую среду (например, жидкость, гель, газ). "Цис-лунка" представляет собой общую камеру, которая содержит или частично ограничена цис-электродом, а также соединена гидравлическим соединением с каждой из множества транс-лунок через соответствующую нанопору. Секвенатор может содержать одну цис-лунку или множество цис-лунок. Каждая "транс-лунка" представляет собой единичную камеру, которая содержит или частично ограничена своим собственным транс-электродом, а также соединена гидравлическим соединением с одной из цис-лунок. Каждая транс-лунка электрически изолирована от любой другой транс-лунки, и соответствующие транс-электроды соединены с соответствующими усилителями (например, усилителями Axopatch 200В) для усиления электрических сигналов, проходящих через соответствующие нанопоры, связанные с каждой из транс-лунок. Поперечное сечение лунки в направлении, параллельном поверхности подложки, по меньшей мере частично ограничивающей лунку, может быть искривленным, квадратным, многоугольным, гиперболическим, коническим, остроугольным и т.д.

Приведенные выше определения позволяют лучше понять аспекты и примеры, раскрытые в настоящем описании и прилагаемых пунктах формулы изобретения.

На Фиг. 1 представлен нанопоровый секвенатор 10 согласно одному из примеров осуществления изобретения. Нанопоровый секвенатор 10 включает цис-лунку 14, транс-лунку 16, нанопору 18, соединяющую по текучей среде цис-лунку 14 и транс-лунку 16, и модифицированный электролит 20, содержащийся в цис-лунке 14 или транс-лунке 16 или цис- и транс-лунках 14, 16. В тех примерах, в которых модифицированный электролит 20 находится в одной из цис-лунок 14 или транслунок 16, немодифицированный электролит 22 может быть присутствовать в другой транс-лунке 16 или цис-лунке 14.

Как показано на Фиг. 1, подложка 12 может включать множество образованных в ней транс-лунок 16. Каждая из транс-лунок 16 может быть соединена по текучей среде с общей цис-лункой 14 посредством соответствующей нанопоры 18. Несмотря на то, что на Фиг. 1 показана одна общая цис-лунка 14, следует понимать, что секвенатор 10 может включать несколько цис-лунок 14, изолированных друг от друга текучей средой и соединенных по текучей среде с соответствующими множествами транс-лунок 16, образованных в подложке 12. Наличие множества цис-лунок 14 может быть желательным, например, при необходимости исследования множества образцов на одной подложке 12.

На Фиг. 1 сообщение по текучей среде через нанопору (нанопоры) 18 указано стрелкой. Также, как показано на Фиг. 1, на подложке 12 между цис-лункой 14 и транс-лункой (лунками) 16 может быть расположена мембрана 24, и нанопора (нанопоры) 18 может быть расположена в мембране 24 и проходить через мембрану 24 для создания соединения по текучей среде между цис-лункой 14 и транс-лункой (лунками) 16.

Цис-лунка 14 представляет собой камеру для текучей среды, которая образована на части подложки 12 боковой стенкой (стенками) 13, соединенными с подложкой 12. В некоторых примерах боковая стенка (стенки) 13 и подложка 12 могут составлять одно целое, то есть детали 13, 12 сформованы из непрерывного куска материала (например, стекла или полимера). В других примерах боковая стенка (стенки) 13 и подложка 12 могут быть отдельными компонентами, которые соединены друг с другом. В одном из примеров боковая стенка (стенки) изготовлены из полимеров, способных подвергаться фотолитографиии.

В примере, показанном на Фиг. 1, цис-лунка 14 имеет внутренние стенки 26, 26', ограниченные боковой стенкой (стенками) 13, верхнюю поверхность 28, ограниченную цис-электродом 30, и нижнюю поверхность 28', ограниченную мембраной 24. Таким образом, цис-лунка 14 образуется пространством, ограниченным цис-электродом 30, частью подложки 12 и мембраной 24. Следует понимать, что в нижней поверхности 28' имеется отверстие (отверстия), создаваемое сквозное нанопорой (нанопорами) 18, которая имеется в мембране 24. Цис-лунка 14 может иметь любые подходящие размеры. В одном из примеров размеры цис-лунки 14 составляют от приблизительно 1 мм × 1 мм до приблизительно 5 мм × 5 мм.

Цис-электрод 30, внутренняя поверхность которого представляет собой верхнюю поверхность 28 цис-лунки 14, может быть физически соединен с боковой стенкой (стенками) 13. Цис-электрод 30 может быть физически соединен с боковой стенкой (стенками) 13, например, клеящим веществом или с помощью другого подходящего скрепляющего механизма. Граница раздела между цис-электродом 30 и боковой стенкой (стенками) 13 может замыкать верхнюю часть цис-лунки 14.

Тип применяемого цис-электрода 30 по меньшей мере частично зависит от окислительно-восстановительной пары, содержащейся в модифицированном электролите 20. В некоторых примерах цис-электрод 30 может быть изготовлен из золота (Au), платины (Ft), углерода (С) (например, графита, алмаза и т.д.), палладия (Pd), серебра (Ag), меди (Cu) или подобного материала. В одном из примеров цис-электрод 30 может представлять собой электрод из серебра/хлорида серебра (Ag/AgCl).

Цис-лунка 14 позволяет поддерживать контакт модифицированного электролита 20 или немодифицированного электролита 22 с нанопорой (нанопорами) 18. В одном из примеров цис-лунка 14 находится в контакте с массивом нанопор 18 и, таким образом, позволяет поддерживать контакт модифицированного электрода 20 или немодифицированного электролита 22 с каждой нанопорой 18 массива.

Как показано на Фиг. 1, нанопоровый секвенатор 10 для включает множество транс-лунок 16. Каждая транс-лунка 16 представляет собой камеру для текучей среды, которая образована в части подложки 12. Обычно транс-лунки 16 могут проходить через всю толщину подложки 12 и могут иметь отверстия на противоположных концах (например, верхнем конце 38 и нижнем конце 40) подложки 12. В примере, показанном на Фиг. 1, каждая транс-лунка 16 имеет боковые стенки 31, 31', ограниченные подложкой 12 и/или промежуточными областями 32 подложки 12, нижнюю поверхность 36, ограниченную трансэлектродом 34, и верхнюю поверхность 36', ограниченную мембраной 24. Таким образом, каждая транс-лунка 16 образована пространством, ограниченным трансэлектродом 34, другой частью и/или промежуточными областями 32 подложки 12 и мембраной 24. Следует понимать, что верхняя поверхность 36' имеет отверстие (отверстия), создаваемые нанопорой (нанопорами) 18, расположенными в мембране 24.

Транс-электрод 34, внутренней поверхностью которого является нижняя поверхность 36 транс-лунки 16, может быть физически соединен с подложкой 12 (например, с промежуточными областями 32 или с внутренней стенкой подложки 12). Транс-электрод 34 может быть изготовлен в процессе формирования подложки 12 (например, во время формирования транс-лунок 16). Методики изготовления микродеталей, которые могут быть применены для формования подложки 12 и транс-электрода 34, включают литографию, осаждение металла и взрывную литографию, сухое осаждение пленки и/или осаждение пленки центрифугированием, травление и т.д. Граница раздела между транс-электродом 34 и подложкой 12 может замыкать нижнюю часть транс-лунки 16.

Тип применяемого транс-электрода 34 по меньшей мере частично зависит от окислительно-восстановительной пары, содержащейся в модифицированном электролите 20. В некоторых примерах транс-электрод 34 может быть изготовлен из золота (Au), платины (Ft), углерода (С) (например, графита, алмаза и т.д.), палладия (Pd), серебра (Ag), меди (Cu) или подобного материала. В одном из примеров трансэлектрод 34 может представлять собой электрод из серебра/хлорида серебра (Ag/AgCl).

Согласно изобретению, могут быть применены различные схемы расположения транс-лунок 16, включающие регулярные, повторяющиеся и нерегулярные схемы. В одном из примеров транс-лунки 16 расположены в виде гексагональной сетки с целью плотной упаковки и достижения повышенной плотности. Другие схемы расположения могут включать, например, прямолинейные (т.е. прямоугольные) схемы расположения, треугольные схемы расположения и т.д. В некоторых примерах схема или шаблон расположения транс-лунок 16 может находиться в х-у формате, то есть включать ряды и колонки. В некоторых других примерах схема или шаблон расположения транс-лунок 16 и/или промежуточных областей 32 может представлять собой повторяющееся размещение. В других примерах схема или шаблон расположения транс-лунок 16 и/или промежуточных областей 32 может представлять собой размещение в случайном порядке. Шаблон может включать участки, столбики, полосы, изгибы, линии, треугольники, прямоугольники, круги, арки, шахматные схемы, перекрещивающиеся полосы, диагонали, стрелки, квадраты и/или перекрещивающиеся штрихи.

Схема расположения может быть охарактеризована плотностью транс-лунок 16 (т.е. количеством транс-лунок 16 на определенной площади подложки 12).

Например, транс-лунки 16 могут присутствовать с плотностью, составляющей от приблизительно 10 лунок на мм² до приблизительно 1000000 лунок на мм². Могут быть достигнуты различные значения плотности, включающие, например, плотность, составляющую по меньшей мере приблизительно 10 лунок на мм², приблизительно 5000 лунок на мм², приблизительно 10000 лунок на мм², приблизительно 0,1 миллион лунок на мм² или более. В альтернативном варианте или дополнительно может выбрана величина плотности, не превышающая приблизительно 1000000 лунок на мм², приблизительно 0,1 миллион лунок на мм², приблизительно 10000 лунок на мм², приблизительно 5000 лунок на мм² или менее. Также следует понимать, что величина плотности размещения транс-лунок 16 на подложке 12 может составлять от одной из нижних величин до одной из верхних величин, выбранных из указанных выше диапазонов.

Также или в альтернативном варианте характеристикой схемы расположения может быть средний шаг, т.е. расстояние от центра нанопоры 18 до центра соседней нанопоры 18 (расстояние от центра до центра). Структура может быть упорядоченной, то есть иметь малый коэффициент отклонения среднего шага, или структура может быть неупорядоченной, и в этом случае коэффициент отклонения может быть относительно большим. В одном из примеров средний шаг может составлять от приблизительно 100 нм до приблизительно 500 мкм. Средний шаг может составлять, например, по меньшей мере приблизительно 100 нм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно наибольшее значение среднего шага может составлять, например, приблизительно 500 мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 50 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 5 мкм или менее. Средний шаг в примере массива, имеющего конкретную структуру расположения нанопор 18, может составлять от одной из нижних величин до одной из верхних величин, выбранных из указанных выше диапазонов. В одном из примеров средний шаг (расстояние от центра до центра) в массиве составляет приблизительно 10 мкм.

Транс-лунки 16 могут представлять собой микролунки (имеющие по меньшей мере один размер порядка микрона, например, приблизительно от 1 мкм до 1000 мкм, исключая верхнюю границу) или нанолунки (имеющие по меньшей мере один размер порядка нанометриа, например, приблизительно от 10 нм до 1000 нм, исключая верхнюю границу). Каждая лунка 16 может быть охарактеризована аспектным соотношением (например, отношением ее ширины или диаметра к ее глубине или высоте в этом примере).

В одном из примеров аспектное соотношение каждой из транс-лунок 16 может составлять от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:5. В другом примере аспектное соотношение каждой из транс-лунок 16 может составлять от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:50. В одном из примеров аспектное соотношение транс-лунки 16 составляет приблизительно 3,3.

Глубина/высота и ширина/диаметр могут быть выбраны так, чтобы было достигнуто требуемое аспектное соотношение. Глубина/высота каждой транс-лунки 16 может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно наибольшее значение глубины может составлять приблизительно 1000 мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,1 мкм или менее. Ширина/диаметр каждой транс-лунки 16 может составлять по меньшей мере приблизительно 50 нм, приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно наибольшее значение ширины/диаметра может составлять приблизительно 1000 мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 50 нм или менее.

Каждая транс-лунка 16 имеет отверстие (например, обращенное к цис-лунке 14), достаточно большое для вмещения по меньшей мере части мембраны 24 и связанной с ней нанопоры 18. Например, конец нанопоры 18 может проходить через мембрану 24 и достигать отверстия транс-лунки 16.

Цис-лунка 14 и транс-лунки 16 могут быть изготовлены с применением различных методик, примеры которых включают фотолитографию, наноимпринтную литографию, методики штамповки, методики тиснения, методики формования, методики микротравления и т.д. Как должно быть понятно специалистам в данной области техники, тип применяемой методики зависит от состава и формы подложки 12 и боковой стенки (стенок) 13. В одном из примеров цис-лунка 14 может быть ограничена боковой стенкой (стенками) 13, расположенной на конце 38 подложки 12, и через подложку 12 могут проходить транс-лунки 16.

Мембрана 24 может состоять из любых непроницаемых или полупроницаемых материалов, указанных в настоящем описании. Мембрана 24 расположена между цис-лункой 14 и транс-лунками 16 и, таким образом, обеспечивает барьер между лунками 14, 16. Мембрана может быть расположена на промежуточных областях 32 подложки 12.

Нанопора (нанопоры) 18 может представлять собой любую биологическую нанопору, твердую нанопору и гибридную нанопору, рассмотренную в настоящем описании. Как указано в настоящем описании, каждая нанопора 18 соединяет по текучей среде одну из соответствующих транс-лунок 16 с цис-лункой 14. Таким образом, отношение нанопоры 18 к транс-лункам 16 составляет 1:1.

Нанопора 18 имеет два открытых конца и полую центральную часть или сквозное отверстие, которое соединяет два открытых конца. При введении в мембрану 24 один из открытых концов нанопоры 18 обращен к цис-лунке 14, а другой открытый конец нанопоры 18 обращен к транс-лунке 16 и выровнен с по меньшей мере частью отверстия транс-лунки 16. Полая центральная часть нанопоры 18 обеспечивает соединение по текучей среде между лунками 14, 16. Диаметр полой центральной части может составлять от приблизительно 1 нм до 1 мкм и может изменяться по длине нанопоры 18. В некоторых примерах открытый конец, обращенный к цис-лунке 14, может быть шире открытого конца, обращенного к транс-лунке 16. В других примерах открытый конец, обращенный к цис-лунке 14, может быть уже открытого конца, обращенного к транс-лунке 16.

Нанопора (нанопоры) 18 может быть введена в мембрану 24, или мембрана 24 может быть сформирована вокруг нанопоры (нанопор) 18. В одном из примеров нанопора 18 может внедряться в образованный липидный бислой (один из примеров мембраны 24) Например, нанопора 18, которая находится в мономерной форме или полимерной форме (например, в виде октамера), может внедряться в липидный бислой и собираться в виде трансмембранной поры. В другом примере требуемая концентрация нанопоры 18 может быть добавлена на опорную сторону липидного бислоя, после чего она внедряется в липидный бислой. В другом примере липидный бислой может быть образован в отверстии, имеющемся в пленке из политетрафторэтилена (ПТФЭ), и расположен между цис и транс-лунками. Нанопора может быть добавлена к опорной части цис-камеры и может внедряться в липидный бислой на участке, где образовано отверстие из ПТФЭ. В еще одном примере нанопора 18 может быть прикреплена к твердому носителю (например, кремнию, оксиду кремния, кварцу, оксиду индия-олова, золоту, полимеру и т.д.). Закрепление молекулы, которая может составлять часть самой нанопоры 18 или может быть присоединена к нанопоре 18, позволяет присоединять нанопору 18 к твердому носителю. Присоединение через закрепление молекулы может быть произведено таким образом, что происходит иммобилизация одной поры 18 (например, между двумя камерами/лунками). Затем вокруг нанопоры 18 может быть сформован липидный бислой.

Как было отмечено выше, некоторые примеры нанопорового секвенатора 10 включают размещение модифицированного электролита 20 как в цис-лунке 14, так и в транс-лунках 16. В других примерах модифицированный электролит 20 находится либо в транс-лунках 16, либо в цис-лунке 14. Таким образом, нанопоровый секвенатор 10, представленный на Фиг. 1, также может включать два электролита, а именно: модифицированный электролит 20 и немодифицированный электролит 22.

Модифицированный электролит 20 включает электролит и агент, образующий комплексы с катионами. Электролит может представлять собой любой электролит, способный диссоциировать на противоионы (катион и связанный с ним анион). В некоторых примерах электролит может представлять собой любой электролит, способный при диссоциации генерировать катион калия (K+) или катион натрия (Na+). Электролит такого типа включает катион калия и связанный с ним анион или катион натрия и связанный с ним анион или их комбинации. Примеры калийсодержащих электролитов включают хлорид калия (KCl), феррицианид калия (K₃[Fe(CN)₆]⋅3H₂O или K₄[Fe(CN)₆]⋅3H₂O) или другие калийсодержащие электролиты (например, бикарбонат (KHCO₃) или фосфаты (например, KH₂PO₄, K₂HPO₄, K₃PO₄). Примеры натрийсодержащих электролитов включают хлорид натрия (NaCl) или другие натрийсодержащие электролиты, такие как бикарбонат натрия (NaHCO₃) и фосфаты натрия (например, NaH₂PO₄, Na₂HPO₄ или Na₃PO₄). В другом примере электролит может представлять собой любой электролит, способный при диссоциации генерировать рутенийсодержащий катион (например, гексаамминрутения, такой как [Ru(NH₃)₆]²⁺ или [Ru(NH₃)₆]³⁺). Также могут быть применены электролиты, которые способны при диссоциации генерировать катион лития (Li⁺), катион рубидия (Rb⁺), катион магния (Mg²⁺) или катион кальция (Са²⁺).

Тип агента, образующего комплексы с катионами, который добавляют в модифицированный электролит 20, зависит от типа катиона, содержащегося в применяемом электролите. Агент, образующий комплексы с катионами, применяют для образования координационного соединения с катионом электролита, и, таким образом, диаметр центральной полости агента, образующего комплексы с катионами, выбирают таким образом, чтобы он соответствовал размеру катиона. Под "соответствием" понимают то, что катион может помещаться в центральную полость, и что атомы агента, образующего комплексы с катионами, могут образовывать координационное соединение с катионом.

Примеры подходящих агентов, образующих комплексы с катионами, включают краун-эфиры, каликсарены и валиномицин. Примеры подходящих краун-эфиров включают:

Следует понимать, что также могут быть применены производные этих краун-эфиров, такие как бензо- или дибензо-15-краун-5, бензо- или дибензо-18-краун-6, бензо- или дибензо-21-краун-7, дициклогексано-18-краун-6, дициклогексано-21-краун-7 или подобные соединения. Также могут быть применены азакраун-эфиры (например, аза-15-краун-5) или ти а краун-эфиры. Примеры подходящих каликсаренов включают C₃Cal-5, C₃Cal-6 и сложные тетраэфиры каликс[4]арена. Структура валиномицина представлена ниже:

Примеры подходящих катионов и агентов, образующих комплексы с катионами, представлены в Таблице 1.

Количество агента, образующего комплексы с катионами, в модифицированном электролите 20 может быть различным в зависимости, по меньшей мере частично, от сродства комплексообразующего агента к катиону. С учетом этого сродства, агент, образующий комплексы с катионами, может быть добавлен в любом подходящем количестве, которое приводит к образованию комплекса с по меньшей мере 99% доступного катиона. Обычно молярная концентрация агента, образующего комплексы с катионами, может составлять от величины, превышающей 0 мМ, до приблизительно 1М. В одном из примеров 18-краун-6 может быть добавлен в калийсодержащий электролит для достижения молярной концентрации, составляющей от приблизительно 50 мМ до приблизительно 500 мм. В более конкретном примере 18-краун-6 может быть добавлен в калийсодержащий электролит для достижения молярной концентрации, составляющей приблизительно 300 мм. В другом примере в калийсодержащий или натрийсодержащий электролит могут быть добавлены каликсарены для достижения молярной концентрации, составляющей от величины, превышающей 0 мМ, до приблизительно 20 мм. Любая из создаваемых концентраций может зависеть от растворимости агента, образующего комплексы с катионами, в электролите.

Немодифицированный электролит 22 включает тот же электролит, что и модифицированный электролит 20, но не содержит агент, образующий комплексы с катионами. Таким образом, немодифицированный электролит не включает агент, образующий комплексы с катионами.

Если модифицированный электролит 20 помещают в цис-лунку 14 и транслунки 16, то немодифицированный электролит 22 не применяют.Если модифицированный электролит 20 помещают в цис-лунку 14, то немодифицированный электролит может быть помещен в транс-лунки 16. Если немодифицированный электролит 22 помещают в цис-лунку 14, то модифицированный электролит может быть помещен в транс-лунки 16.

Независимо от того, в какую из лунок, 14 и/или 16, помещен модифицированный электролит 20, следует понимать, что агент, образующий комплексы с катионами, будет образовывать комплекс с доступными катионами электролита в лунке 14 и/или 16, в результате чего образующийся объемный комплекс не позволит катиону перемещаться из лунки 14 и/или 16 через нанопору (нанопоры) 18. Диаметр координированного катиона (катионов) практически идентичен (например, в пределах приблизительно 5%) или превышает диаметр по меньшей мере одного из открытых концов нанопоры (нанопор) 18. Например, диаметр комплекса K⁺ и 18-краун-6 составляет приблизительно 1,15 нм, и диаметр полого центра нанопоры MspA (в наименьшем сечении) составляет приблизительно 1,2 нм. Координированный катион не сможет пройти через нанопору (нанопоры) 18, и, таким образом во время функционирования устройства 10 для секвенирования на нанопорах транспорт катиона через нанопору (нанопоры) 18 будет подавлен. При ограничении транспорта катионов, разность в ионном электрическом токе восполняется за счет анионов электролита, и, таким образом, по меньшей мере снижается дисбаланс между генерацией анионов и расходованием анионов на транс-электроде 34.

На Фиг. 3 представлены примеры способа 100, 100', в котором применяют примеры нанопоровых секвенаторов 10, 10' (последний из которых представлен на Фиг. 2). Пример способа 100, включающего нанопоровый секвенатор 10, описан позициями 102 и 104. Как показано цифровым обозначением 102, способ 100 включает регулирование расходования окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в электролите, в нанопоровом секвенаторе 10 посредством приложения между цис-лункой 14 нанопорового секвенатора 10 и транс-лункой 16 нанопорового секвенатора 10 напряжения смещения, находящегося в диапазоне от приблизительно -1 В до приблизительно 1 В, и как показано цифровым обозначением 104, модифицированный электролит 20, включающий электролит и агент, образующий комплексы с катионами, находится в цис-лунке 14 или транслунке 16 или цис- и транс-лунках 14, 16. Прикладываемое напряжение смещения может зависеть от местонахождения модифицированного электролита 20, например, при его использовании в комбинации с немодифицированным электролитом 22. Если модифицированный электролит 20 присутствует в каждой из лунок 14, 16, то может быть приложено любое напряжение смещения, находящееся в заданном диапазоне. Это объясняется тем фактом, что движение ионов является однонаправленным, и, таким образом, координированные ионы, находящиеся по одной стороне мембраны 24 не будут влиять на транспорт под действием электрического тока при приложении определенной разности потенциалов. Например, при приложении отрицательного напряжения смещения координированные ионы, находящиеся в транс-лунке 16, не влияют на транспорт под действием электрического тока.

В одном из примеров образование краун-эфиром комплекса с катионом (например, K⁺) ослабляет транспорт катиона через нанопору посредством снижения протекающего электрического тока приблизительно в 2 раза. Кратность снижения протекающего электрического тока может составлять от 1 до приблизительно 3 раз.

В некоторых примерах способ 100 также может включать предоставление устройства 10 для секвенирования на нанопорах, содержащего модифицированный электролит 20 в каждой из цис-лунок 14 и в транс-лунок 16. В других примерах способ 100 также может включать предоставление устройства 10 для секвенирования на нанопорах, содержащего модифицированный электролит 20 в одной цис-лунке 14 или транс-лунке 16 и содержащего электролит, не включающий агент, образующий комплексы с катионами (т.е. немодифицированный электролит 22) в других транс-лунках 16 или цис-лунках 14.

Способ 100 также может включать включение агента, образующего комплексы с катионами, в электролит для образования модифицированного электролита 20, введение модифицированного электролита 20 в одну из цис-лунок 14 или транс-лунок 16 и введение электролита, не содержащего агент, образующий комплексы с катионами (т.е. немодифицированного электролита 22), в другие транслунки 16 или цис-лунки 14. Как указано в настоящем описании, концентрация агента, образующего комплексы с катионами, может быть различной и зависеть, по меньшей мере частично, от сродства комплексообразующего агента к катиону.

Способ 100 может быть осуществлен при нанопоровом секвенировании. Приложение электрического потенциала (т.е. разности потенциалов между цис- и транс-электродами 30, 34, которая является источником электрического тока) к нанопоре 18 инициирует перенос через нанопору 18 нуклеотида совместно с анионами, несущими заряд. В зависимости от разности потенциалов, нуклеотид может быть перемещен из цис-лунки 14 в транс-лунку 16 или из транс-лунки 16 в цис-лунку 14. По мере прохождения нуклеотида через нанопоры 18, величина электрического тока, протекающего через барьер, изменяется в результате, например, зависящей от типа основания блокировки, например, блокировки сужения поры. Сигнал, определяющий полученное изменение электрического тока, может быть измерен с помощью усилителя или другого известного устройства обнаружения сигнала.

Диапазон напряжений может быть выбран от приблизительно -1 В до приблизительно 1 В. Обычно прикладывают напряжение такой полярности, чтобы отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты перемещались в нанопоры 18 под действием электрофоретических сил. В некоторых примерах для выполнения определенной функции напряжение может быть снижено или полярность может быть обращена.

На Фиг. 2 представлен еще один пример нанопорового секвенатора 10'. Нанопоровый секвенатор 10' включает цис-лунку 14, транс-лунку 16, нанопору 18, соединяющую по текучей среде цис-лунку 14 и транс-лунку 16, и полиэлектролит 42, находящийся в цис-лунке 14 или транс-лунке 16 или цис- и транс-лунках 14, 16. В тех примерах, в которых полиэлектролит 42 находится в одной из цис-лунок 14 или транс-лунок 16, электролит 44 может присутствовать в другой транс-лунке 16 или цис-лунке 14.

Как показано на Фиг. 2, в подложке 12 может образовано множество транс-лунок 16, и подложка 12 может быть соединена с боковой стенкой (стенками) 13, которая по меньшей мере частично ограничивает цис-лунку 14. Каждая из транс-лунок 16 может быть соединена по текучей среде с общей цис-лункой 14 посредством соответствующей нанопоры 18. Несмотря на то, что на Фиг. 2 показана одна общая цис-лунка 14, следует понимать, что секвенатор 10' может включать несколько цис-лунок 14, изолированных друг от друга текучей средой и соединенных по текучей среде с соответствующими множествами транс-лунок 16, образованных в подложке 12. Наличие множества цис-лунок 14 может быть желательным, например, при необходимости исследования совокупности образцов на одной подложке 12.

На Фиг. 2 сообщение по текучей среде через нанопору (нанопоры) 18 указано стрелкой. Также, как показано на Фиг. 2, на подложке 12 между цис-лункой 14 и транс-лункой (лунками) 16 может быть расположена мембрана 24, и нанопора (нанопоры) 18 может быть расположена в мембране 24 и проходить через мембрану 24 для создания гидравлического соединения между цис-лункой 14 и транс-лункой (лунками) 16.

Цис-лунка 14 и транс-лунка 16 нанопорового секвенатора 10' могут быть образованы тем же образом и иметь те же конфигурации (например, размеры, расположение и т.д.), что и те же элементы нанопорового секвенатора 10, рассмотренного в настоящем описании. Кроме того, цис-электрод 30 и трансэлектрод (электроды) 34 могут быть физически соединены, соответственно, с боковой стенкой (стенками) 13 и подложкой 12 и могут, соответственно, ограничивать верхнюю поверхность 28 цис-лунки 14 и нижнюю поверхность 36 транс-лунки (лунок) 16.

В нанопоровом секвенаторе 10' цис-лунка 14 позволяет поддерживать контакт электролита 44 или полиэлектролита 42 с нанопорой (нанопорами) 18. В одном из примеров цис-лунка 14 находится в контакте с массивом нанопор 18 и, таким образом, позволяет поддерживать контакт электролита 44 или полиэлектролита 42 с каждой нанопорой 18 массива. Также, в нанопоровом секвенаторе 10' каждая транс-лунка 16 имеет отверстие (например, обращенное к цис-лунке 14), достаточно большое для вмещения по меньшей мере части мембраны 24 и связанной с ней нанопоры 18. Например, конец нанопоры 18 может проходить через мембрану 24 и достигать отверстия транс-лунки 16.

В нанопоровом секвенаторе 10' могут быть применены любые мембраны 24 и нанопоры 18, рассмотренные в настоящем описании.

Как было отмечено выше, некоторые примеры нанопорового секвенатора 10' включают полиэлектролит 42, содержащийся в цис-лунке 14 и в транс-лунках 16. В других примерах полиэлектролит 42 находится либо в транс-лунках 16, либо в цис-лунке 14. Таким образом, нанопоровый секвенатор 10', представленный на Фиг. 2, может включать два электролита, а именно: полиэлектролит 42 и электролит 42. В примере, показанном на Фиг. 2, полиэлектролит 42 находится в транс-лунках 16, и полиэлектролит 42 или электролит 44 находится в цис-лунке 14.

Полиэлектролит 42 представляет собой заряженный полимер в виде геля, который может проводить электрический ток, благодаря взаимодействию ионов противоположного заряда. В рассматриваемом примере полиэлектролит 42 имеет положительно заряженную основную цепь, которая взаимодействует с отрицательно заряженными ионами (т.е. анионами). Поскольку катионы являются частью основной цепи полиэлектролита 42, они не могут выходить из лунки 16 или 14 и поступать в нанопору (нанопоры) 18. Примеры подходящих полиэлектролитов 42 выбирают из группы, состоящей из хлорида полидиаллилдиметиламмония (англ. polydiallyldimethylammonium chloride, сокращенно PDDA), ионной формы полиэтиленимина (англ. polyethyleneimine, сокращенно PEI), ионной формы неразветвленного полиэтиленимина (англ. linear polyethyleneimine, сокращенно LPEI), полиаллиламингидрохлорида (англ. poly(allylamine hydrochloride), сокращенно РАН) и ионной формы поли-4-винилпиридина (англ. poly(4-vinylpyridine), сокращенно P4VP). Некоторые примеры структур представлены ниже:

В этих примерах -NH₂⁺ в неразветвленном полиэтиленимине (LPEI) координирован с Cl^-, и -NH⁺ в поли-4-винилпиридине (P4VP) координирован с Cl^- (т.е. образуется гидрохлорид поли-4-винилпиридина). Другим примером ионной формы поли-4-винилпиридина (P4VP) является поли-4-винилпиридинметилхлорид, в котором группа -N⁺CH₃ поли-4-винилпиридина координирована с Cl^-. В зависимости от типа электролита 44, добавляемого в другие лунки 14, 16, и природы электрохимической реакции на транс-электроде 34, могут быть применены анионы, отличные от хлорида. На транс-стороне желательно сохранять баланс электролита, и, таким образом, ионы, израсходованные или генерированные на транс-электроде 34, должны соответствовать ионам полиэлектролита 42.

Несмотря на то, что полиэлектролит 42 может не проходить через нанопору 18 также быстро, как свободный электролит, было показано, что заряженные полимеры (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), ДНК) могут проходить через нанопоры 18. Таким образом, для дополнительного замедления переноса полиэлектролита 42 через пору 18 могут быть применены нелинейные полиэлектролиты 42. Примеры включают разветвленный PEI или сополимер полиэлектролита 42 и мономера, содержащего сшиваемые группы.

Если полиэлектролит 42 содержится в транс-лунке (лунках) 16, то полиэлектролит 42 также может способствовать повышению механической прочности и структурной стабильности мембраны 24 (например, липидного бислоя).

Если применяют электролит 42, то электролит 42 может представлять собой любой электролит, способный диссоциировать на противоионы (катион и связанный с ним анион). В некоторых примерах электролит может представлять собой любой электролит, способный при диссоциации генерировать катион калия (K⁺) или катион натрия (Na⁺). Электролит такого типа включает катион калия и связанный с ним анион или катион натрия и связанный с ним анион или их комбинации. Примеры калийсодержащих электролитов включают хлорид калия (KCl), феррицианид калия (K₃[Fe(CN)₆]⋅3H₂O или K₄[Fe(CN)₆]⋅3H₂O) или другие калийсодержащие электролиты (например, бикарбонат (KHCO₃) или фосфаты (например, KH₂PO₄, K₂HPO₄, K₃PO₄). Примеры натрийсодержащих электролитов включают хлорид натрия (NaCl) или другие натрийсодержащие электролиты, такие как бикарбонат натрия (NaHCO₃) или фосфаты натрия (например, NaH₂PO₄, Na₂HPO₄ или Na₃PO₄). В другом примере электролит может представлять собой любой электролит, способный при диссоциации генерировать рутенийсодержащий катион (например, гексаамминрутения, такой как [Ru(NH₃)₆]²⁺ или [Ru(NH₃)₆]³⁺). Также могут быть применены электролиты, которые способны при диссоциации генерировать катион лития (Li⁺), катион рубидия (Rb⁺), катион магния (Mg²⁺) или катион кальция (Са²⁺).

В одном из примеров нанопорового секвенатора 10' полиэлектролит 42 находится как в цис-, так и в транс-лунках 14, 16, и полиэлектролит 42 выбран из группы, состоящей из хлорида полидиаллилдиметиламмония, ионной формы полиэтиленимина, ионной формы неразветвленного полиэтиленимина, полиаллиламингидрохлорида и ионной формы поли-4-винилпиридина.

В другом примере нанопорового секвенатора 10' полиэлектролит 42 выбран из группы, состоящей из хлорида полидиаллилдиметиламмония, ионной формы полиэтиленимина, ионной формы неразветвленного полиэтиленимина, полиаллиламингидрохлорида и ионной формы поли-4-винилпиридина, и электролит 42 включает катион калия и связанный с ним анион или катион натрия и связанный с ним анион или их комбинации.

На Фиг. 3 представлен пример способа 100', включающего применение нанопорового секвенатора 10', который обозначен цифровыми обозначениями 102 и 106. Как показано цифровым обозначением 102, способ 100' включает регулирование расходования окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в электролите, в нанопоровом секвенаторе 10' посредством приложения между цис-лункой 14 нанопорового секвенатора 10' и транс-лункой 16 нанопорового секвенатора 10' напряжения смещения, составляющего от приблизительно -1 В до приблизительно 1 В, и, как показано цифровым обозначением 106, полиэлектролит 42 находится в цис-лунке 14 или в транс-лунке 16 или в цис- и транс-лунках 14, 16. Может быть приложено любое напряжение смещения, которое позволяет сохранять баланс электролита на транс-стороне.

В некоторых примерах способ 100' может включать предоставление нанопорового секвенатора 10', содержащего полиэлектролит 42 в виде геля в каждой из цис-лунок 14 и транс-лунок 16. В других примерах способ 100' также может включать предоставление нанопорового секвенатора 10', содержащего полиэлектролит 42 в виде геля в одной из цис-лунок 14 или транс-лунок 16 и электролит 44 в других транс-лунках 16 или цис-лунках 14.

Способ 100' также может включать введение полиэлектролита 42 (в виде геля) в цис-лунку 14 или транс-лунку (лунки) 16 или как в цис-, так и в транс-лунки 14, 16. Если полиэлектролит 42 находится в одной из лунок 14 или 16, то способ 100' может включать введение электролита 44 в другие транс-лунки 16 или цис-лунки 14.

Способ 100' может быть осуществлен при нанопоровом секвенировании. Приложение электрического потенциала (т.е. разности потенциалов между цис- и транс-электродами 30, 34, которая является источником электрического тока) к нанопоре 18 инициирует перенос через нанопору 18 нуклеотида совместно с анионами, несущими заряд. В зависимости от разности потенциалов, нуклеотид может быть перемещен из цис-лунки 14 в транс-лунку 16 или из транс-лунки 16 в цис-лунку 14. По мере прохождения нуклеотида через нанопоры 18, величина электрического тока, протекающего через барьер, изменяется в результате, например, зависящей от типа основания блокировки, например, блокировки сужения поры. Сигнал, определяющий полученное изменение электрического тока, может быть измерен с помощью усилителя или другого известного устройства обнаружения сигнала.

Диапазон напряжений может быть выбран от приблизительно -1 В до приблизительно 1 В. Обычно прикладывают напряжение такой полярности, чтобы отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты перемещались в нанопоры 18 под действием электрофоретических сил. В некоторых примерах для выполнения определенной функции напряжение может быть снижено или полярность может быть обращена.

На Фиг. 4 представлен нанопоровый секвенатор 10'' согласно еще одному примеру осуществления изобретения. Нанопоровый секвенатор 10'' включает цис-лунку 14', транс-лунку 16', нанопору 18, соединяющую по текучей среде цис-лунку 14' и транс-лунку 16', электродную конструкцию 47 цис-лунки, связанную с цис-лункой 14' (электродная конструкция 47 цис-лунки включает первый базовый электрод 30' и окислительно-восстановительное твердое вещество 48, иммобилизованное на первом базовом электроде 30'), электродную конструкцию 50 транс-лунки, связанную с транс-лункой 16' (электродная конструкция 50 транс-лунки включает второй базовый электрод 34' и окислительно-восстановительное твердое вещество 48, иммобилизованное на втором базовом электроде 34'), и электролит 46, включающий катион, который расходуется или высвобождается в результате протекания соответствующих окислительно-восстановительных реакций на электродной конструкции 47 цис-лунки и электродной конструкции 50 транс-лунки.

Как показано на Фиг. 4, в подложке 12 может быть образовано множество транс-лунок 16'. Каждая из транс-лунок 16' может быть соединена по текучей среде с общей цис-лункой 14' посредством соответствующей нанопоры 18. Несмотря на то, что на Фиг. 4 показана одна общая цис-лунка 14', следует понимать, что секвенатор 10'' может включать несколько цис-лунок 14, изолированных друг от друга текучей средой и соединенных по текучей среде с соответствующими множествами транс-лунок 16', образованных в подложке 12. Наличие множества цис-лунок 14' может быть желательным, например, при необходимости исследования множества образцов на одной подложке 12.

На Фиг. 4 сообщение по текучей среде через нанопору (нанопоры) 18 указано стрелкой. Также, как показано на Фиг. 4, между цис-лункой 14' и транс-лункой (лунками) 16' может быть расположена мембрана 24, и нанопора (нанопоры) 18 может быть расположена в мембране 24 и проходить через мембрану 24 для создания соединения по текучей среде между цис-лункой 14 и транс-лункой (лунками) 16.

Цис-лунка 14' и транс-лунка 16' нанопорового секвенатора 10' могут иметь такие же конфигурации (например, размеры, расположение и т.д.), что и цис-лунка 14 и транс-лунки 16 нанопорового секвенатора 10, рассмотренного в настоящем описании.

В этом примере цис-лунка 14' имеет внутренние стенки 26, 26', ограниченные боковой стенкой (стенками) 13', верхнюю поверхность 28, ограниченную окислительно-восстановительным твердым веществом 48 электродной конструкции

47 цис-лунки, и нижнюю поверхность 28', ограниченную мембраной 24. Таким образом, цис-лунка 14' образуется пространством, ограниченным окислительно-восстановительным твердым веществом 48 электродной конструкции 47 цис-лунки, боковой стенкой (стенками) 13' и мембраной 24.

Электродная конструкция 47 цис-лунки может быть физически соединена с боковой стенкой (стенками) 13'. Электродная конструкция 47 цис-лунки может быть физически соединена с боковой стенкой (стенками) 13', например, с помощью клеящего вещества или другого подходящего скрепляющего механизма. Граница раздела между электродной конструкцией 47 цис-лунки и боковой стенкой (стенками) 13' может замыкать верхнюю часть цис-лунки 14'.

Как было отмечено выше, электродная конструкция 47 цис-лунки включает первый базовый электрод 30' и окислительно-восстановительное твердое вещество 48, иммобилизованное на первом базовом электроде 30'. Первый базовый электрод 30' может включать или в некоторых примерах состоять из материала, выбранного из группы, состоящей из графита, платины, золота, серебра, меди, углеродного волокна, алмаза и палладия. Окислительно-восстановительное твердое вещество 48 может быть выбрано из группы, состоящей из тетрацианохинодиметана (TCNQ), берлинской лазури (которая может быть применена в качестве твердого электрода, например, в датчиках глюкозы) и полипиррола.

Как показано на Фиг. 4, нанопоровый секвенатор 10'' включает множество транс-лунок 16'. Каждая транс-лунка 16' имеет отверстие (например, обращенное к цис-лунке 14'), достаточно большое для вмещения по меньшей мере части мембраны 24 и связанной с ней нанопоры 18. Например, конец нанопоры 18 может проходить через мембрану 24 и достигать отверстия транс-лунки 16'.

Каждая транс-лунка 16' представляет собой камеру для текучей среды, образованную в подложке 12. В примере, показанном на Фиг. 4, каждая транс-лунка 16' имеет боковые стенки 31, 31', ограничиваемые подложкой 12 и/или промежуточными областями 32 подложки 12, нижнюю поверхность 36, ограниченную окислительно-восстановительным твердым веществом 48 электродной конструкции 50 транс-лунки, и верхнюю поверхность 36', ограниченную мембраной 24. Таким образом, каждая транс-лунка 16' образована внутри пространства, ограниченного окислительно-восстановительным твердым веществом 48 электродной конструкции 50 транс-лунки, другой частью и/или промежуточными областями 32 подложки 12 и мембраной 24. Следует понимать, что верхняя поверхность 36' имеет отверстие (отверстия), проходящее через нанопору (нанопоры) 18, расположенную в мембране 24.

Электродная конструкция 50 транс-лунки может быть физически соединена с подложкой 12 и может быть изготовлена в процессе формирования подложки 12 (например, во время формирования транс-лунок 16'). Методики изготовления микродеталей, которые могут быть применены для формования подложки 12 и транс-электрода 34', включают литографию, осаждение металла и взрывную литографию, сухое осаждение пленки и/или осаждение пленки центрифугированием, травление и т.д. Граница раздела между электродной конструкцией 50 транс-лунки и подложкой 12 может замыкать нижнюю часть транслунки 16'.

Как было отмечено выше, электродная конструкция 50 транс-лунки включает второй базовый электрод 34' и окислительно-восстановительное твердое вещество 48, иммобилизованное на втором базовом электроде 34'. Окислительно-восстановительное твердое вещество 48 на втором базовом электроде 34' представляет собой окислительно-восстановительное твердое вещество 48 того же типа, что и вещество, иммобилизованное на первом базовом электроде 30'. Таким образом, окислительно-восстановительное твердое вещество 48 на втором базовом электроде 34' может быть выбрано из группы, состоящей из тетрацианохинодиметана (TCNQ), берлинской лазури и полипиррола. Базовый электрод 34' может быть изготовлен из того же материала, что и базовый электрод 30', или из другого материала. Таким образом, второй базовый электрод 34' может включать или в некоторых примерах состоять из материала, выбранного из группы, состоящей из графита, платины, золота, серебра, меди, углеродного волокна, алмаза и палладия.

Окислительно-восстановительное твердое вещество 48 может быть осаждено на соответствующий базовый электрод 30', 34' любым подходящим способом химического или электрохимического осаждения. Например, берлинская лазурь может быть осаждена из водных растворов, содержащих смесь ионов железа (III) (Fe³⁺) и феррицианидных ([Fe³⁺(CN)₆]^3-) ионов, как самопроизвольно при разомкнутой цепи, так и при приложении электрохимического восстановителя.

Толщина слоя окислительно-восстановительного твердого вещества 48 может составлять от приблизительно 10 нм до приблизительно 10 мкм. Например, слой окислительно-восстановительного твердого вещества TCNQ может представлять собой толстую пленку, толщина которой составляет от приблизительно 100 нм до 5 мкм. Несмотря на то, что выше были приведены несколько диапазонов значения толщины, следует понимать, что толщина может частично зависеть от заданных пределов способа осаждения и от требований к тому, чтобы определенное количество окислительно-восстановительного твердого вещества выдерживало длительный период работы секвенатора.

В нанопоровом секвенаторе 10'' х могут быть применены любые мембраны 24 и нанопоры 18, рассмотренные в настоящем описании.

Электролит 46, содержащийся в нанопоровом секвенаторе 10'', может быть электролитом любого из примеров, представленных для электролита 44. Коротко говоря, электролит 46 может представлять собой любой электролит, способный диссоциировать на противоионы (катион и связанный с ним анион), в котором катион также может генерироваться и расходоваться под действием окислительно-восстановительного твердого вещества 48 на базовых электродах 30', 34'. В некоторых примерах электролит 46 представляет собой водный раствор одного из электролитов 44. В этом примере нанопорового секвенатора 10'' электролит 46 находится в цис-лунке 14' и транс-лунке (лунках) 16'. Таким образом, цис-лунка 14' и транс-лунка (лунки) 16' могут поддерживать электролит 46 в контакте с нанопорой (нанопорами) 18.

Окислительно-восстановительное твердое вещество 48 активно в окислительно-восстановительных реакциях, протекающих в электролите 46, который находится в цис-лунке 14' и транс-лунке (лунках) 16', в том диапазоне потенциалов, в котором не происходит разложение воды. Примеры окислительно-восстановительного твердого вещества 48, рассмотренные в настоящей работе, вступают в окислительно-восстановительные реакции при относительно низких значениях потенциала (например, от -1 В до 1 В). Окислительно-восстановительное твердое вещество 48 может вступать в катодную реакцию (под действием отрицательного потенциала), в которой расходуется катион электролита 46 (см., например, приведенное ниже Уравнение 1), и может вступать в анодную реакцию (под действием положительного потенциала), в которой происходит генерация электролитом 46 катиона (см., например, приведенное ниже Уравнение 2). В одном из примеров окислительно-восстановительные реакции, протекающие на электродных конструкциях 47, 50, включающих окислительно-восстановительное твердое вещество 48, которое представляет собой TCNQ, иммобилизованное на соответствующих базовых электродах 30', 34', включают:

Эти реакции могут быть инициированы приложением подходящего потенциала, и в результате в транс-лунке (лунках) 16' происходит высвобождение катионов (например, K⁺), которые расходуются в цис-лунке 14'. Это позволяет устранить расходование анионов в транс-лунке (лунках) 16'.

Показанный на Фиг. 5 пример способа 200, включающего применение нанопорового секвенатора 10'' включает регулирование расходования окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в электролите 46, в нанопоровом секвенаторе 10'' посредством приложения первого напряжения к электродной конструкции 47 цис-лунки, что приводит к инициированию катодной реакции, в которой в нанопоровом секвенаторе 10'' расходуются катионы электролита 46 (что показано цифровым обозначением 202), и посредством приложения второго напряжения к электродной конструкции 50 транс-лунки, что приводит к инициированию анодной реакции, приводящей к высвобождению катиона электролита 46.

Способ 200 также может включать предоставление нанопорового секвенатора 10'', включающего электродные конструкции 47, 50 и электролит 46, содержащийся в каждой цис-лунке 14' и транс-лунке 16'. Способ 200 также может включать введение электролита 46 в каждую из цис-лунок 14' и транс-лунок 16'.

Способ 200 может быть осуществлен при нанопоровом секвенировании. Приложение электрического потенциала (т.е. заданной разности потенциалов между первой и второй электродными конструкциями 47, 50, которая является источником электрического тока) к нанопоре 18 инициирует перенос через нанопору 18 нуклеотида совместно с катионами и/или анионами, несущими заряд. В зависимости от разности потенциалов, нуклеотид может быть перемещен из цис-лунки 14' в транс-лунку 16' или из транс-лунки 16' в цис-лунку 14'. По мере прохождения нуклеотида через нанопоры 18, величина электрического тока, протекающего через барьер, изменяется в результате, например, зависящей от типа основания блокировки, например, блокировки сужения поры. Сигнал, определяющий полученное изменение электрического тока, может быть измерен с помощью усилителя или другого известного устройства обнаружения сигнала.

Диапазон напряжений может быть выбран от приблизительно -1 В до приблизительно 1,5 В. В одном из примеров диапазон напряжений, подходящих для работы секвенатора 10'', содержащего TCNQ, применяемый в качестве окислительно-восстановительного твердого вещества 48, составляет от приблизительно 0,4 В до приблизительно 1,2 В. Это соответствует напряжению смещения, прикладываемому между первым и вторым базовыми электродами 30', 34'. Может быть создана такая полярность напряжения, чтобы отрицательно заряженная нуклеиновая кислота под действием электрофоретических сил проникала в нанопоры 18. В некоторых примерах для выполнения определенной функции может быть снижено напряжение или может быть обращена полярность.

Для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения ниже приведены примеры. Следует понимать, что эти примеры приведены для иллюстративных целей и не ограничивают объем настоящего изобретения.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Были изготовлены два нанопоровых секвенатора (соответственно обозначенные "1" или "пора 1" и "2" или "пора 2"), включающие одну цис-лунку и одну транс-лунку. Хлорид калия без добавления краун-эфира помещали в цис- и транс-лунки устройств 1, 2 для секвенирования. Каждый из нанопоровых секвенаторов 1, 2 включал нанопоры MspA, расположенные в мембране из липидного бислоя между цис-лункой и транс-лункой.

К каждой из нанопор, находящихся в соответствующих устройствах 1, 2 для секвенирования на нанопорах, прикладывали разности потенциалов различной величины и измеряли электрические токи. Результаты представлены на Фиг. 6А. При обратном смещении (англ. reverse-biased), называемом "гейтингом (gating)", от нанопорового секвенатора 1 (поры 1) был получен асимметричный ответный сигнал, и от нанопорового секвенатора 2 (поры 2) был получен симметричный ответный сигнал.

Затем из цис- и транс-лунок нанопорового секвенатора 2 был слит раствор хлорида калия. К хлориду калия был добавлен краун-эфир, 18-краун-6, до достижения концентрации 400 мМ, и полученный электролит вводили в цис- и транслунки нанопорового секвенатора 2. К нанопоре устройства 2 для секвенирования на нанопорах прикладывали различные разности потенциалов и измеряли электрический ток. Результаты представлены на Фиг. 6В. Для сравнения на Фиг. 6В также показаны результаты, полученные в нанопоровом секвенаторе 2, показанные на Фиг. 6А (без краун-эфира). После добавления краун-эфира, в нанопоровом секвенаторе 2 наблюдали снижение величины тока как в прямом, так и в обратном направлении смещения. Снижение проводимости как при отрицательном сдвиге, так и при положительном сдвиге показывает, что 18-краун-6 замедляет транспорт K⁺ через нанопору MspA. Этот результат показывает, что образование ионами K⁺ комплексов с краун-эфиром затрудняет транспорт ионов K⁺ через нанопору, снижая величину электрического тока в 2 раза, как и ожидалось.

Затем хлорид калия, содержащий краун-эфир, был слит из цис-лунки нанопорового секвенатора 2. Поскольку цис- и транс-лунки были разделены липидным слоем, хлорид калия с добавленным краун-эфиром оставался в транслунке нанопорового секвенатора 2. К нанопоре устройства 2 для секвенирования на нанопорах прикладывали различные величины разности потенциалов и измеряли электрический ток. Результаты представлены на Фиг. 6С графиком, обозначенным "пора 2 - промытая". На Фиг. 6С для сравнения также представлены результаты, полученные в нанопоровом секвенаторе 2 и показанные на Фиг. 6А (без краун-эфира). После удаления краун-эфира вольт-амперная характеристика нанопорового секвенатора 2 (линия, обозначенная "пора 2 - промытая" на Фиг. 6С) практически вернулась в первоначальное положение (линия, обозначенная "пора 2" на Фиг. 6С).

Наблюдались некоторые остаточные изменения транспорта под действием электрического тока обратного сдвига, которые объясняются небольшими остаточными количествами краун-эфира, захваченными в транс-лунке.

Пример 2

В эксперименте по переносу ионов применяли олигомер, имеющий шпилькообразную структуру, содержащую 87 нуклеотидных оснований, и температуру плавления 66°С. Применяли два нанопоровых секвенатора. Каждый включал одну цис-лунку и одну транс-лунку, и нанопору MspA, расположенную в мембране из липидного бислоя между цис-лункой и транс-лункой.

Раствор хлорида калия, в который не добавляли краун-эфира, вводили в цис-и транс-лунки сравнительного секвенатора. В цис- и транс-лунки примера секвенатора согласно изобретению вводили хлорид калия, содержащий 400 мМ 18-краун 6. Соответствующие олигомеры перемещались через сравнительный секвенатор и пример секвенатора.

Изменения ионного тока в зависимости от времени в сравнительном секвенаторе представлены на Фиг. 7А, и гистограмма результатов представлена на Фиг. 7В. В сравнительном секвенаторе электрический ток в открытой поре составлял 107,5 пА (пикоАмпер), и средний электрический ток при блокаде составлял 73,5 пА (68%). Полагают, что показания в диапазоне от 20 пА до 50 пА, представленные на Фиг. 7А, соответствуют глубокой блокаде, при которой шпилькообразная структура олигомерной ДНК распаковывается, и перенос прекращается. Полагают, что на гистограмме глубокая блокада проявляется в диапазоне амплитуд от 70 до 80.

Изменения ионного тока в зависимости от времени в секвенаторе согласно изобретению представлены на Фиг. 8А, и гистограмма результатов представлена на Фиг. 8В. В секвенаторе согласно изобретению электрический ток в открытой поре составлял 88,5 пА, и средний электрический ток при блокаде составлял 57,5 пА (65%). Как показано на Фиг. 8А, в диапазоне от 20 пА до 50 пА имеется пониженное количество показаний. Полагают, что образование комплекса с ионами K⁺ облегчает распаковку ДНК, что ослабляет глубокую блокаду. На Фиг. 8В показано, что в диапазоне амплитуд от 70 до 80 сигнал отсутствует, что также указывает на ослабление или прекращение глубокой блокады.

В целом, сдвиги величин электрического тока в секвенаторе согласно изобретению согласуются со снижением вклада ионов K⁺ в проводимость через нанопору. Полагают, что это, в свою очередь, снижает расходование Cl^- ионов.

Дополнительные замечания

Следует понимать, что все комбинации приведенных выше признаков и дополнительных признаков, более подробно раскрытых ниже (при условии, что эти признаки не являются взаимоисключающими) составляют часть предмета изобретения, раскрытого в настоящем описании. В частности, все комбинации раскрытых предметов изобретения, очевидные после прочтения предлагаемого описания, составляют часть предмета изобретения, рассмотренного в настоящем описании. Также следует понимать, что применяемая в настоящем описании терминология, которая также может употребляться в любом документе, включенном в настоящее описание посредством ссылки, должна иметь значение, в наибольшей мере соответствующее конкретным признакам, рассмотренным в настоящем описании.

Упоминание в настоящем описании "одного примера", "другого примера", "примера" и т.д. означает, что конкретный элемент (например, признак, структура и/или характеристика), раскрытый при описании этого примера, включен в по меньшей мере один пример, рассмотренный в настоящем описании, и может присутствовать или может отсутствовать в других примерах. Кроме того, следует понимать, что, если из контекста не ясно иное, то рассмотренные элементы любого примера могут быть скомбинированы в различных примерах любым подходящим образом.

Следует понимать, что приведенные в настоящем описании диапазоны включают указанные диапазоны и любые величины или поддиапазоны, находящиеся в пределах указанного диапазона. Например, следует понимать, что диапазон, составляющий от приблизительно 50 мМ до приблизительно 500 мМ включает не только явным образом упомянутые пределы от приблизительно 50 мМ до приблизительно 500 мм, но также включает индивидуальные величины, такие как приблизительно 100 мм, приблизительно 335 мм, приблизительно 400,5 мм, приблизительно 490 мм и т.д., и поддиапазоны, такие как от приблизительно 75 мм до приблизительно 475 мм, от приблизительно 200 мм до приблизительно 300 мм и т.д. Кроме того, если для описания величины используют модификаторы "приблизительно" и/или "по существу", то они составляют небольшие вариации (до +/- 10%) от означенной величины.

Несмотря на то, что некоторые примеры были описаны подробно, следует понимать, что рассмотренные примеры могут быть модифицированы. Таким образом, приведенное выше описание не является ограничивающим.

1. Нанопоровый секвенатор, включающий:

цис-лунку;

транс-лунку;

нанопору, соединяющую по текучей среде цис-лунку и транс-лунку;

а также:

а) модифицированный электролит, находящийся в цис-лунке, и

немодифицированный электролит, находящийся в транс-лунке;

или б) модифицированный электролит, находящийся в транс-лунке, и

немодифицированный электролит, находящийся в цис-лунке;

причем модифицированный электролит включает электролит и агент, образующий комплексы с катионами, а немодифицированный электролит включает электролит без агента, образующего комплексы с катионами.

2. Нанопоровый секвенатор по п. 1, дополнительно включающий множество транс-лунок, образованных в подложке, каждая из которых соединена по текучей среде с цис-лункой посредством соответствующей нанопоры, при этом плотность указанного множества транс-лунок составляет от приблизительно 10 транс-лунок на мм² подложки до приблизительно 1000000 транс-лунок на мм² подложки.

3. Нанопоровый секвенатор по п. 1, в котором:

электролит включает катион калия и связанный с ним анион, катион натрия и

связанный с ним анион или их комбинации;

и агент, образующий комплексы с катионами, выбран из группы, состоящей из

краун-эфира, каликсарена и валиномицина.

4. Нанопоровый секвенатор по п. 1, в котором модифицированный электролит включает от более чем 0 мМ до приблизительно 500 мМ агента, образующего комплексы с катионами.

5. Нанопоровый секвенатор по п. 1, дополнительно включающий:

электродную конструкцию цис-лунки, связанную с цис-лункой, при этом электродная конструкция цис-лунки включает первый базовый электрод и окислительно-восстановительное твердое вещество, иммобилизованное на первом базовом электроде;

и электродную конструкцию транс-лунки, связанную с транс-лункой, при этом электродная конструкция транс-лунки включает второй базовый электрод и окислительно-восстановительное твердое вещество, иммобилизованное на втором базовом электроде;

причем указанный электролит включает катион, подлежащий расходованию или высвобождению в результате протекания на электродной конструкции цис-лунки и электродной конструкции транс-лунки соответствующих окислительно-восстановительных реакций.

6. Нанопоровый секвенатор по п. 5, в котором окислительно-восстановительное твердое вещество выбрано из группы, состоящей из тетрацианохинодиметана (TCNQ), берлинской лазури и полипиррола.

7. Нанопоровый секвенатор по п. 5, в котором первый и второй базовые электроды независимо выбраны из группы, состоящей из графита, платины, золота, серебра, меди, углеродного волокна, алмаза и палладия.

8. Способ применения нанопорового секвенатора по п. 1, включающий:

регулирование расходования окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в электролите, находящемся в нанопоровом секвенаторе, посредством приложения между цис-лункой нанопорового секвенатора и транс-лункой нанопорового секвенатора напряжения смещения, находящегося в диапазоне от приблизительно -1 В до приблизительно 1 В.

9. Способ по п. 8, дополнительно включающий:

введение в электролит агента, образующего комплексы с катионами, с образованием модифицированного электролита;

и введение модифицированного электролита в цис-лунку или транс-лунку.

10. Способ по п. 8, в котором:

электролит включает катион калия и связанный с ним анион, катион натрия и связанный с ним анион или их комбинации;

и агент, образующий комплексы с катионами, выбран из группы, состоящей из краун-эфира, каликсарена и валиномицина.

11. Нанопоровый секвенатор, включающий:

цис-лунку;

транс-лунку;

нанопору, соединяющую по текучей среде цис-лунку и транс-лунку;

и полиэлектролит в виде геля, находящийся в цис-лунке или транс-лунке или в цис- и транс-лунках.

12. Нанопоровый секвенатор по п. 11, в котором:

полиэлектролит находится в цис-лунке, при этом нанопоровый секвенатор дополнительно включает электролит, находящийся в транс-лунке;

или полиэлектролит находится в транс-лунке, при этом нанопоровый секвенатор дополнительно включает электролит, находящийся в цис-лунке.

13. Нанопоровый секвенатор по п. 12, в котором:

полиэлектролит выбран из группы, состоящей из хлорида полидиаллилдиметиламмония, ионной формы полиэтиленимина, ионной формы неразветвленного полиэтиленимина, полиаллиламингидрохлорида и ионной формы поли-4-винилпиридина;

и электролит включает катион калия и связанный с ним анион, катион натрия и связанный с ним анион или их комбинации.

14. Нанопоровый секвенатор по п. 11, дополнительно включающий множество транс-лунок, образованных в подложке, каждая из которых соединена по текучей среде с цис-лункой посредством соответствующей нанопоры, при этом плотность множества транс-лунок составляет от приблизительно 10 транс-лунок на мм² подложки до приблизительно 1000000 транс-лунок на мм² подложки.

15. Нанопоровый секвенатор по п. 11, в котором:

полиэлектролит находится и в цис-, и в транс-лунках;

и полиэлектролит выбран из группы, состоящей из хлорида полидиаллилдиметиламмония, ионной формы полиэтиленимина, ионной формы неразветвленного полиэтиленимина, полиаллиламингидрохлорида и ионной формы поли-4-винилпиридина.

16. Способ применения нанопорового секвенатора по п. 11, включающий:

регулирование расходования окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в полиэлектролите, находящемся в нанопоровом секвенаторе, посредством приложения напряжения смещения, составляющего от приблизительно -1 В до приблизительно 1 В, между цис-лункой нанопорового секвенатора и транс-лункой нанопорового секвенатора.

17. Способ применения нанопорового секвенатора, включающего: цис-лунку; транс-лунку; нанопору, соединяющую по текучей среде цис-лунку и транс-лунку; электродную конструкцию цис-лунки, связанную с цис-лункой, при этом электродная конструкция цис-лунки включает первый базовый электрод и окислительно-восстановительное твердое вещество, иммобилизованное на первом базовом электроде; электродную конструкцию транс-лунки, связанную с транс-лункой, при этом электродная конструкция транс-лунки включает второй базовый электрод и окислительно-восстановительное твердое вещество, иммобилизованное на втором базовом электроде; и электролит, включающий катион, причем обеспечена возможность расходования или высвобождения указанного катиона в результате протекания на электродной конструкции цис-лунки и электродной конструкции транс-лунки соответствующих окислительно-восстановительных реакций, причем способ включает:

регулирование расходования окислительно-восстановительного реагента, содержащегося в электролите, находящемся в нанопоровом секвенаторе, посредством следующего:

приложение первого напряжения к электродной конструкции цис-лунки, что приводит к инициированию катодной реакции, в которой расходуются катионы электролита, находящегося в нанопоровом секвенаторе;

и приложение второго напряжения к электродной конструкции транс-лунки, что приводит к инициированию анодной реакции, высвобождающей катионы электролита.

18. Способ по п. 17, в котором окислительно-восстановительное твердое вещество выбрано из группы, состоящей из тетрацианохинодиметана (TCNQ), берлинской лазури и полипиррола.