Вакцина для профилактики или лечения коронавирусной инфекции на основе генетической конструкции

Авторы патента:

Чирак Евгений Леонидович (RU)

Федорова Екатерина Алексеевна (RU)

Алексеев Алексей Викторович (RU)

Духовлинов Илья Владимирович (RU)

Колмаков Николай Николаевич (RU)

C12Q1/6806 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

C12N15/50 - Coronaviridae, например вирусы инфекционного бронхита, передающегося гастроэнтерита

C07K16/10 - из РНК вирусов

A61P31/14 - против вирусов РНК

A61K39/215 - Coronaviridae, например вирус инфекционного бронхита птиц

Владельцы патента RU 2747762:

Духовлинов Илья Владимирович (RU)

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине. Описан полинуклеотид для экспрессии в клетках целевого организма, кодирующий гибридный белок, включающий фрагменты белков M, S, N, Е коронавируса, соединенные гибкими мостиками, охарактеризованный последовательностью аминокислот SEQ ID NO.:1 или SEQ ID NO.:2. Также описан полинуклеотид для экспрессии в клетках целевого организма, кодирующий гибридный белок, включающий фрагменты белков M, S, N, Е коронавируса, соединенные гибкими мостиками, охарактеризованный последовательностью аминокислот SEQ ID NO.:1 или SEQ ID NO.:2, характеризующийся тем, что также содержит фрагмент, кодирующий гетерологичную секреторную последовательность. Представлена генетическая конструкция для экспрессии в клетках целевого организма указанного полинуклеотида. Представлена вакцина для профилактики или лечения коронавирусной инфекции у человека или животного, содержащая указанную генетическую конструкцию в качестве активного агента, в эффективном количестве, а также физиологически приемлемый носитель и буферный раствор. Кроме того, описан способ получения вакцины для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, заключающийся в том, что амплифицируют генетическую конструкцию с использованием ПЦР, очищают и смешивают с физиологически приемлемым носителем и буферным раствором. Изобретение может быть использовано для осуществления профилактики и лечения коронавирусной инфекции, вызываемой 2019-nCoV. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 пр.

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для осуществления профилактики или лечения коронавируса.

Коронавирусы (КоВ) – многочисленное семейство вирусов, вызывающих болезнь от бытовой простуды до более серьезных заболеваний, таких как ближневосточный респираторный синдром (БВРС-КоВ) и тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС-КоВ). Новый коронавирус (нКоВ, COVID-19, SARS-CoV-2) – это новый штамм, ранее у человека не выявлявшийся [https://www.who.int/ru/health-topics/coronavirus/coronavirus].

Особенностью данного штамма стала быстрая распространяемость, от человека к человеку, а также сложное течение болезни.

Первые случаи заражения COVID-19 зафиксированы в Китае в декабре 2019 г. Однако уже на 04 марта 2020 г. в мире зарегистрировано в общей сложности 93 090 случаев заболевания COVID-19 и 3198 смертей. Большая часть случаев и смертей – в Китае (80422 и 2984, соответственно), однако случаи коронавируса и смерти от него зафиксированы также в 76 странах мира [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200304-sitrep-44-covid-19.pdf?sfvrsn=783b4c9d_2]. ВОЗ признала коронавирусную инфекцию пандемией.

На 03 апреля 2020 г. в мире зарегистрировано в общей сложности 1 095 904 случаев заболевания COVID-19 и 58 814 смертей. Большая часть случаев и смертей – в США (275 744 и 7 086, соответственно), Италии (119 827 и 14 681, соответственно), Испании (119 199 и 11 198, соответственно), Германии (91 159 и 1 275, соответственно), в Китае (81 620 и 3 322, соответственно). Случаи коронавируса и смерти от него зафиксированы уже в 205 странах мира [https://www.worldometers.info/coronavirus/]. Очевидно, что темпы распространения инфекции крайне высокие, несмотря на принимаемые меры.

Среди наблюдаемых у заболевших состояний – ОРВИ, острое повреждение почек, сердечная недостаточность, дисфункция печени, аритмия, нередок летальный исход. Большинству пациентов требуется внешняя поддержка функции дыхания [Arabi, Y.M., Murthy, S. &Webb, S. COVID-19: anovelcoronavirusandanovelchallengeforcriticalcare. IntensiveCareMed (2020)].

2019-nCoV - это вирус, оказывающий серьезное воздействие на здоровье населения, экономику и социально-политические вопросы. Сдерживание COVID-19 должно быть главным приоритетом для всех стран [https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-mission-briefing-on-covid-19---4-march-2020]

Поскольку это новое инфекционное заболевание, то на сегодняшний день зарегистрированной вакцины против нового коронавируса нет [https://www.rospotrebnadzor.ru/about/info/news_time/news_details.php?ELEMENT_ID=13566].

Также существует острая неудовлетворенная потребность в оптимальном лечении, включая специфическую противовирусную терапию, изучении роли модуляции иммунной системы и как лучше всего обеспечить поддержку отказавших систем органов. На момент написания указанной выше статьи ArabiY.M. и соавторов было зарегистрировано более 160 рандомизированных и неслучайных исследований (http://www.chictr.org.cn/searchprojen.aspx и http://apps.who.int/trialsearch/default.aspx). Для лечения COVID-19 используют различные средства, включая кортикостероиды, различные комбинации рибавирина, лопинавира/ритонавира, хлорохина, гидроксихлорохина, интерферонов и других агентов. Проводится РКИ с использованием ремдесивира при тяжелом течении COVID-19 (NCT04257656). [Arabi, Y.M., Murthy, S. & Webb, S. COVID-19: a novel coronavirus and a novel challenge for critical care. IntensiveCareMed (2020)]. Лечение осуществляют также с использованием средств народной медицины.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание вакцины против коронавируса, безопасной, быстрой и простой при производстве и применении, которая имела бы эффективность и низкую стоимость и которую можно применить и для профилактики, и лечения коронавируса, особенно нового коронавируса.

Из всех направлений разработки новых вакцин автор настоящей группы изобретений считает наиболее перспективным использование вакцин, получаемых с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Однако их эффективность варьирует и обуславливается массой факторов, одними из самых важных из которых являются подбор компонентов и их форма (структура).

Для создания настоящего изобретения были выбраны фрагменты антигенов коронавируса – белков M, S, N, Е нового коронавируса. На их основе разработан гибридный белок. Компоненты гибридного белка соединены гибкими мостиками, что позволяет достигать полноценного функционирования каждого компонента белка. Разработанный белок эффективен также против SARS за счет перекрестной активности.

Важно, что разработанный гибридный белок за счет своей структуры не имеет гомологии с известными белками других организмов, кроме коронавируса, что обеспечивает специфичность их действия.

Важно, чтобы вакцина была специфически иммуногенна и протективна против коронавируса, и при этом безопасна также с точки зрения того, что не будет вызывать осложнения, вызываемые коронавирусом, а также иные побочные эффекты.

Важной особенностью вируса COVID-19 является то, что субъединица S1 (aa01–aa550) его гликопротеина S имеет RBD (рецептор-связывающий домен), который взаимодействует с рецептором клетки-хозяина, ангиотензин-превращающим ферментом 2 (ACE2). Проникновение коронавируса в клетку-хозяина и его захват происходит главным образом за счет N-концевого домена S1. Казалось бы, использование этого фрагмента как мишени для выработки иммунного ответа могло бы быть важным для блокирования проникновения вируса. Однако, при формировании антител к данному фрагменту, есть вероятность захвата ими молекул, и в результате недостаточности проникновения таких молекул организма в необходимые ткани, в результате эффект от такой вакцинации может быть совершенно небезопасным, за счет чего могут развиться указанные выше серьезные осложнения. Соответственно, использование вакцин, содержащих такой фрагмент, т.е. вакцин на основе ослабленного или убитого нового коронавируса, рекомбинантных вакцин, содержащих такой фрагмент белка S, является потенциально небезопасным.

Именно поэтому в разработанном нами гибридном белке использован иной фрагмент субъединицы S1 гликопротеина S, который позволит сформировать иммунный ответ в том числе на гликопротеин S, в том числе предотвратить проникновение вируса, однако не вызовет нарушение функционирования систем организма, в том числе сердечно-сосудистой и дыхательной.

Нами предложена вакцина для профилактики или лечения коронавируса у человека или животного, содержащая от 1 генетической конструкции в качестве активного агента, в эффективном количестве, а также физиологически приемлемый носитель и буферный раствор. Генетическая конструкция кодирует описанный выше гибридный белок.

Аналоги предлагаемой нами вакцины не выявлены. Вакцины на основе убитых или аттенуированных штаммов коронавируса аналогами не считаем, ввиду значительно меньшей безопасности, в том числе обусловленной наличием полноразмерного белка S. Все виды вакцин, не содержащих живые микроорганизмы, являются более безопасными не только из-за отсутствия рисков инфицирования, но и из-за отсутствия рисков развития побочных явлений у людей с мутациями в генах, обуславливающих строение молекул, ключевых для корректного функционирования иммунной системы. Однако и с ними важно не вызвать формирование побочных эффектов, в том числе описанных выше, в том числе за счет наличия белка S или N-концевого фрагмента его субъединицы S1.

Технический результат от использования изобретения выражается, в первую очередь, значительном ускорении производства вакцины, благодаря простому, с наименьшими требованиями, процессу получения действующего агента вакцины. С учетом распространяющейся стремительно инфекции скорость получения вакцины играет ключевую роль в победе над инфекцией, но также имеет экономический эффект – при карантинных мерах за несколько месяцев экономика впадет в сильнейший упадок, и только быстрая вакцинация в кратчайшие сроки сможет позволить снять карантин, самоизоляцию и не дать экономике прийти в сильный упадок.

Технический результат от использования вакцины также заключается в увеличении безопасности вакцины.

Указанный технический результат достигается, главным образом, тем, что синтезируемый гибридный белок по изобретению не содержит фрагменты, гомологичные фрагментам молекул организма.

Указанный технический результат достигается тем, что в качестве действующего вещества используется ДНК, которая существует в виде эписомы и не интегрируется в геном, с которой синтезируется и в одном из вариантов затем секретируется из клетки белок.

Указанный технический результат также достигается тем, что используемая ДНК не реплицируется после введения в организм млекопитающего, что позволяет осуществлять контроль над количеством синтезируемого белка и соответственно над эффектом.

Указанный технический результат достигается и за счет наличия в используемой ДНК таких регуляторных последовательностей, как сайленсер и/или инсулятор, в одном из вариантов изобретения, благодаря чему также осуществляется контроль над синтезом белка и соответственно,над эффектом: при необходимости есть возможность в быстрый срок остановить либо уменьшить экспрессию гена.

Указанный технический результат также достигается тем, что инфекционный агент как таковой не используется при производстве.

Указанный технический результат достигается в том числе в одном из вариантов тем, что используемый полинуклеотид содержит точные фрагменты генов, кодирующих белки коронавируса, соответственно действие такой генетической конструкции не будет неожиданным.

Технический результат выражается и в повышенной иммуногенности такой вакцины за счет природы используемых молекул. Так, показано, что сама по себе ДНК, наряду с введением иглой, действует как адъювант, что опосредует презентацию синтезируемых целевых антигенов, главным образом, с помощью MHC первого класса, что индуцирует, в свою очередь, формирование цитотоксического ответа. Также показано, что синтез одного внутриклеточного белка в больших количествах может способствовать активной презентации миофибриллами с помощью MHC первогокласса [Hartikka J. et al. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle // Hum. GeneTher. 1996. Vol. 7, № 10. P. 1205–1217].

Технический результат от использования вакцины на основе генетической конструкции по изобретению заключается также в повышенной эффективности благодаря тому, что гибридный белок длительно с нее синтезируется, причем в течение от нескольких дней до нескольких недель, в зависимости от строения используемой генетической конструкции. Также он достигается строением кодируемого гибридного белка.

Технический результат также заключается в упрощении и удешевлении производства вакцины за счет избегания производства и процессов очистки белковых препаратов in vitro благодаря тому, что синтез белка происходит in vivo. Производство, очистка и хранение ДНК-препаратов экономически выгоднее, чем белковых, так как первые более стабильны, их можно нарабатывать в больших количествах с меньшими затратами.

Технический результат также заключается в расширении спектра действующих веществ и вакцин на их основе против коронавируса. При нежелании использовать аналоги ввиду их вышеописанных недостатков, либо при противопоказаниях к применению аналогов данное действующее вещество или вакцина позволит осуществить защиту против коронавируса. Указанный технический результат достигается тем, что используют действующее вещество или вакцину по настоящему изобретению.

В условиях пандемии крайне важно быстро и масштабно внедрять вакцинацию, поскольку это единственный способ защитить от распространения и тяжелого течения болезни, летальных исходов. Предложенная вакцина как никакая другая на данный момент удовлетворяет данному требованию, помимо высокой безопасности.

Нами предложен способ получения вакцины по изобретению, заключающийся в том, что амплифицируют генетическую конструкцию – линейный фрагмент ДНК - с использованием ПЦР, очищают и смешивают с физиологически приемлемым носителем и буферным раствором.

Технический результат от использования способа получения разработанной вакцины – в получении вакцины в кратчайшие сроки. Так, процесс получения очищенного препарата генетической конструкции - линейного фрагмента ДНК – активного агента вакцины - занимает всего несколько часов (от 2-3 часов)! Ни один иной тип вакцины против коронавируса невозможно получить в такие краткие сроки.

Технический результат также заключается в простоте получения вакцины. Он достигается тем, что для производства такой вакцины не требуется разработка многоступенчатой технологии производства, не требуется длительной наладки стадий процесса, требуется минимальный набор реагентов, которые легкодоступны, не требуются допуски к работе с патогенными организмами, не требуются значительные вложения в строительство, ремонт помещений и оборудование. Такой способ возможно осуществить даже в стандартной лаборатории, занимающейся работой с ДНК.

Предложена генетическая конструкция для экспрессии в клетках целевого организма полинуклеотида по изобретению, включающая такой полинуклеотид и иные элементы, позволяющие реализовать указанное назначение – осуществить экспрессию полинуклеотида в клетках целевого организма. Целевой организм – человек или животное. Генетическая конструкция может быть представлена плазмидной ДНК для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, вектором на основе вируса, линейным фрагментом ДНК, содержащими полинуклеотид по изобретению.

Технический результат заключается, главным образом, в индукции иммунного ответа, не вызывающего побочных явлений, связанных с использованием иных фрагментов белка S нового коронавируса, либо полноразмерного такого белка, в генетических конструкциях, либо штаммах коронавируса.

Технический результат заключается в значительном ускорении и упрощении получения действующего вещества вакцины от коронавируса – генетической конструкции. Это достигается, в первую очередь, безопасностью используемых типов генетических конструкций и соответственно отсутствием жестких требований к работе с ними.

Технический результат заключается также в том, что генетическая конструкция служит матрицей для проведения ПЦР для получения вакцины по изобретению.

Кроме того, технический результат заключается в увеличении длительности синтеза кодируемого белка и достигается тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая целевой белок, содержит элементы, обуславливающие стабильность мРНК и, соответственно, увеличивающие время полужизни мРНК, в результате синтез белка с одной молекулы мРНК осуществляется большее количество раз, а также в результате увеличивается количество синтезируемого белка; а также тем, что нуклеотидная последовательность гибридного белка оптимизирована по кодонному составу для экспрессии в клетках целевого организма – человека и животного, млекопитающих, в результате синтез белка идет интенсивнее.

При внедрении в практику это позволит использовать крайне малое количество вводимой плазмидной ДНК.

Технический результат заключается также в расширении спектра генетических конструкций для синтеза иммуногенных коронавирусных антигенов в организме.

Предложен полинуклеотид для экспрессии в клетках целевого организма, кодирующий гибридный белок, включающий фрагменты белков M, S, N, Е коронавируса, соединенные гибкими мостиками, охарактеризованный последовательностью аминокислот SEQIDNO.:1 или 2. Полинуклеотид может содержать фрагмент, кодирующий гетерологичную секреторную последовательность.

Технический результат от использования предлагаемого нами полинуклеотида – главным образом, в получении генетической конструкции, благодаря использованию которой в вакцине у человека или животного формируется специфичный протективный иммунный ответ на коронавирус, главным образом, на новый коронавирус.

Технический результат от использования предлагаемого нами полинуклеотида заключается также в расширении спектра полинуклеотидов для синтеза иммуногенных коронавирусных антигенов в организме.

Предложена прокариотическая рекомбинантная клетка для получения генетической конструкции по изобретению – продуцент.

Технический результат от использования продуцента разработанной генетической конструкции – в стабильном хранении и воспроизведении генетической конструкции, а также в получении разработанной генетической конструкции.

Полинуклеотид, генетическая конструкция, продуцент генетической конструкции, способ получения вакцины – все эти объекты используют для получения вакцины по изобретению.

В связи с тем, что проблема нового коронавируса стоит очень остро, а выведение на рынок препарата удается не многим, и протективность аналогов на людях также пока неизвестна, данная группа изобретений позволит увеличить шансы в борьбе с данной инфекцией.

Подробное описание изобретения.

Предложена группа изобретений: полинуклеотид, генетическая конструкция, рекомбинантная клетка, вакцина на основе от 1 генетической конструкции для профилактики или лечения коронавируса, способ ее получения.

Разработан гибридный белок, который включает иммуногенные фрагменты белков M, S, N, Е коронавируса, соединенные гибкими мостиками, белок охарактеризован последовательностью аминокислот SEQ ID NO.:1 или 2. Особенностью белка является то, что он не имеет гомологии с белками иных организмов, чем коронавируса, а также не содержит сайта связывания с ACE2. Это обуславливает важное преимущество вакцины на его основе – дополнительный аспект безопасности вакцины. Такой белок будет синтезироваться в клетках целевого организма – человека или животного, - с предложенной генетической конструкции, содержащей предложенный полинуклеотид.

Предложен полинуклеотид, кодирующий разработанный гибридный белок, для синтеза в клетках целевого организма. При известности аминокислотной последовательности белка специалист в данной области сможет получить нуклеотидную последовательность. Это может быть как основанная на фрагментах природной нуклеотидной последовательности белков вируса, так и оптимизированная искусственно по кодонному составу последовательность. Кодонную оптимизацию могут проводить самостоятельно, используя информацию о частоте встречаемости кодонов у продуцента, например, в базе данных [например, NakamuraY, GojoboriT, IkemuraT. CodonusagetabulatedfrominternationalDNAsequencedatabases: statusfortheyear 2000. Nucleic Acids Res. 2000 Jan 1;28(1):292], либо с использованием специализированных программ, например, представленной на сайте http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm или molbiol.ru или иных ресурсах.

Полинуклеотид может не содержать (например, SEQIDNO.:3 или 4) или содержать (например, SEQIDNO.:5 или 6) гетерологичную секреторную последовательность, оптимизированную по кодонному составу для целевого организма – например, таковую TPA (tissue-type plasminogen activator), ГРЧ (гормон роста человека), ИГФ (инсулиноподобный фактор роста), EPO (эритропоэтина), но ими не ограничиваясь. В случае без секреторной последовательности иммунный ответ будет наиболее сдвинут в сторону цитотоксического, во втором случае, помимо цитотоксического, также будет в значительной степени индуцирован гуморальный - антительный иммунный ответ. Поскольку, особенно в условиях сложности тестирования на коронавирус, сложно оценить, заражен ли человек, то явным преимуществом предлагаемой вакцины является индукция профиля иммунного ответа, где цитотоксический ответ проявлен значительно, в отличии от иммунного ответа, формирующегося на вводимый белковый иммуноген или вирусную частицу. То есть оба варианта полинуклеотида являются подходящими.

Предложена генетическая конструкция для экспрессии в клетках продуцента описанного полинуклеотида; каждая конструкция включает, помимо полинуклеотида, элементы, позволяющие реализовать указанное назначение – осуществить экспрессию полинуклеотида. За счет того, что действующим веществом вакцины является именно генетическая конструкция, с которой осуществляется синтез антигена, возможно получить профиль иммунного ответа, в котором немалую роль сыграет цитотоксический иммунный ответ, однако и антительный ответ также будет формироваться. Также благодаря длительности синтеза антигена в организме и при этом отсутствии инфекционности, вероятность вызвать формирование иммунного ответа, адекватного, с формированием иммунологической памяти, возрастает. Сама по себе молекула также обладает адъювантным действием.

Под генетической конструкцией подразумевается прежде всего линейный фрагмент ДНК или рекомбинантный вектор, который может быть представлен вирусным, либо плазмидным вектором.

Рекомбинантный вектор должен содержать существенные для организмов его поддержания и использования элементы, вкупе с соответствующими регуляторными последовательностями. Регуляторные последовательности – нуклеотидные последовательности, способные повлиять на экспрессию гена на уровне транскрипции и/или трансляции, а также на механизмы, обеспечивающие существование и поддержание функционирования рекомбинантного вектора.

Существенными для прокариотической системы являются ориджин репликации, для поддержания в клетке со средней, предпочтительно высокой, копийностью, и маркерный ген для возможности селекции штамма-продуцента. Бактериальные элементы плазмидной ДНК не должны отрицательно влиять на экспрессию в клетках млекопитающих и обуславливать побочный эффект от применения плазмидной ДНК. Подходящий ориджин репликации представлен pM1 (der.), ColE1 (der.) и F1, pUC и F1, но не ограничивается ими. Подходящий маркерный ген представлен репортерным геном или геном устойчивости к антибиотику, например, ампициллином, премущественно канамицином, но не ограничивается ими. В литературе имеются данные о том, что использование гена устойчивости к ампициллину в качестве маркерного гена может быть нежелательным в связи с развитием реакции у пациентов на ампициллин, однако авторы считают такие последствия связанными с низким качеством очистки ДНК, но не самим элементом.

Существенными элементами рекомбинантного вектора для использования у млекопитающих являются элементы для эффективного функционирования, для экспрессии закодированного гена, - промотор, в том числе сигналы инициации транскрипции, лидерная последовательность мРНК, терминирующая последовательность, регуляторные последовательности.

Промотор является важным компонентом вектора, который запускает экспрессию интересующего гена. Классические промоторы для рекомбинантных векторов -компонентов препаратов - это CMV человека/немедленно-ранний или CMV-chicken-βactin (CAGG) промотор. Промоторы CMV используется для большинства ДНК-вакцин, так как они опосредуют высокие уровни конститутивной экспрессии в широком диапазоне тканей млекопитающих [Manthorpe M, Cornefert-Jensen F, Hartikka J, et al. Gene therapy by intramuscular injection of plasmid DNA: studies on firefly luciferase gene expression in mice. Hum. GeneTher. 1993;4(4):419–431] и не подавляют прочитывание downstream. Увеличение уровня экспрессии наблюдают при изменении CMV промотора, например, включением HTLV-1R-U5 downstream от промотора цитомегаловируса или при использовании химерного SV40-CMV промотора [Williams JA, Carnes AE, Hodgson CP. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009;27(4):353–370]. Альтернативой CMV промоторам служат тканеспецифические промоторы хозяина, которые позволяют избежать конститутивной экспрессии антигенов вне подходящих тканях [Cazeaux N, Bennasser Y, Vidal PL, Li Z, Paulin D, Bahraoui E. Comparative study of immune responses induced after immunization with plasmids encoding the HIV-1 Nef protein under the control of the CMV-IE or the muscle-specific desmin promoter. Vaccine. 2002;20(27–28):3322–3331].

Промотор может быть с соответствующими регуляторными последовательностями из природных промоторов со своими регуляторными элементами (CaMkinaseII, CMV, nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, p-globin, GFAP, GAP43, тирозингидроксилаза, субъединица 1 каинатного рецептора и субъединица В глутаматного рецептора и другие), либо синтетических промоторов с регуляторными последовательностями, для получения необходимого характера экспрессии (соотношения продолжительности и уровня экспрессии) целевого гена на уровне транскрипции.

Возможные регуляторные последовательности по отношению к промотору:

- энхансер, для увеличения уровня экспрессии через улучшение взаимодействия РНК-полимеразы и ДНК.

- инсулятор, для модулировании функций энхансера,

- сайленсеры, либо их фрагменты, для снижения уровня транскрипции, например, для тканеспецифической экспрессии,

- 5` нетранслируемая область до промотора, включая интрон.

Регуляторные последовательности – нуклеотидные последовательности, способные повлиять на экспрессию гена на уровне транскрипции и/или трансляции, а также на механизмы, обеспечивающие существование и поддержание функционирования генетической конструкции. Рекомбинантный вектор - плазмидная или вирусная ДНК по настоящему изобретению - содержит от одной из вышеприведенных регуляторных последовательностей, в зависимости от варианта ДНК, основанного на выборе промотора и желаемых параметрах экспрессии целевого гена. Опираясь на существующий уровень техники, на известные и очевидные варианты таких элементов и их использования, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может содержать любые отвечающие вышеуказанным условиям комбинации, при которых с него осуществляется синтез разработанного гибридного белка в клетках целевого организма – человека или животного. При использовании сайленсера, либо инсулятора в составе конструкции возможно регулировать экспрессию целевого гена.

Иные регуляторные последовательности:

- нетранслируемая область downstream от промотора, включая интрон, для повышения стабильности мРНК и увеличения экспрессии целевого гена.

Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению в одном из вариантов дополнительно содержит такой регуляторный элемент.

Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению содержит и такой важный элемент, как лидерную последовательность мРНК, содержащую сигналы инициации трансляции, старт-кодон. Сигналыинициациитрансляции - последовательностьКозакуэукариот [Kozak M. (1986) "Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes", Cell 44, 283-292].

Рекомбинантный вектор также содержит сайт, преимущественно сайты, разные, для клонирования целевого гена, для осуществления правильной ориентации целевого гена в рекомбинантном векторе, и сайт, преимущественно сайты, для посадки праймеров для его секвенирования.

Рекомбинантный вектор содержит и описанный выше полинуклеотид.

Рекомбинантный вектор также содержит терминирующую последовательность, содержащую последовательно стоп-кодон, 3` нетранслируемую область с сигналом и сайтом полиаденилирования, стоп-кодон, за счет которой сохраняется стабильность мРНК, и осуществляется надлежащее прекращение транскрипции и экспорт мРНК из ядра. На экспрессию генов можно повлиять путем изменения терминирующей последовательности, которая необходима для сохранения стабильности мРНК, надлежащего прекращения транскрипции и экспорта мРНК из ядра, в том числе ее укорачиванием. Во многих современных ДНК-вакцинах используют последовательность терминатора транскрипции бычьего гормона роста [Montgomery DL, Shiver JW, Leander KR, et al. Heterologous and homologous protection against influenza A by DNA vaccination: optimization of DNA vectors. DNA Cell Biol. 1993;12(9):777–783]. Полиаденилирование (полиА) необходимодлястабилизациитранскрипта. ИзменениепоследовательностиполиАможетпривестикувеличениюуровняэкспрессиигена [Norman JA, Hobart P, Manthorpe M, Felgner P, Wheeler C. Development of improved vectors for DNA-based immunization and other gene therapy applications. Vaccine. 1997;15(8):801–803].В плазмиде pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) область терминатора бычьего гормона роста содержит область гомопурина, которая чувствительна к нуклеазе. Показано, что альтернативная полиА последовательность может значительно улучшить стабильность плазмиды к нуклеазе [AzzoniAR, RibeiroSC, MonteiroGA, PrazeresDMF. The impact of polyadenylation signals on plasmid nuclease-resistance and transgene expression. JGeneMed. 2007;9:392–402]. Введение двух стоп-кодонов перед 3` нетранслируемой областью позволяет увеличить эффективность терминатора транскрипции. Опираясь на существующий уровень техники, на известные и очевидные варианты такого элемента, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может содержать любую отвечающую вышеуказанным условиям терминирующую последовательность, при которой с него осуществляется синтез целевого белка в клетках человека или животного. Пример терминирующей последовательности для клеток млекопитающих - таковая бычьего гормона роста (BGH).

Могут содержаться и иные элементы, требуемые для функционирования экспрессионной системы.

Предпочтительными рекомбинантными векторами для использования у человека являются векторы, проверенные на людях, содержащие описанные выше элементы с соответствующими регуляторными последовательностями, возможно, модифицированные для соответствия заявленным критериям, что позволяет уменьшить количество требуемых исследований для регистрации средства. Однако возможно и использование иных рекомбинантных векторов, содержащих требуемые описанные элементы.

Проведено множество клинических исследований ДНК-вакцин, продемонстрировавших их безопасность.

На 2019 год количество проведенных клинических исследований в области генной терапии - 3001 шт. [http://www.abedia.com/wiley/countries.php], в том числе 184 исследования проведено в отношении инфекционных заболеваний. При этом 15% всех клинических исследований в области генной терапии проведено в отношении агентов на основе плазмидной ДНК, 8% - на основе аденоассоциированного вируса. Таким образом, данное направление является реальным и внедряемым.

В руководстве FDA (2007) заявлено, что исследования биораспределения вещества после его введения в организм могут быть отменены для ДНК-вакцин, производимых клонированием нового гена в плазмидный вектор, в отношении которого ранее документально установлено приемлемые биораспределение и профиль интеграции. В руководстве ВОЗ (2007) заявлено, что исследования биологического распределения и сохранения требуются, если еще не имеется значительный опыт работы с почти идентичным или аналогичным продуктом. В руководстве EMEA (2006) заявлено, что опыт работы с векторной системой позволит оптимизировать и сфокусироваться на доклинических исследованиях. Исследования по безопасности с использованием ДНК-векторов с различными клонированными генами продемонстрировали аналогичное биораспределение [Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Duffy C, Nason M, Andrews C, Kong WP, Nabel GJ, Gomez PL.Biodistribution of DNA plasmid vaccines against HIV-1, Ebola, Severe Acute Respiratory Syndrome, or West Nile virus is similar, without integration, despite differing plasmid backbones or gene inserts.Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Duffy C, Nason M, Andrews C, Kong WP, Nabel GJ, Gomez PL.Toxicol Sci. 2006 Jun;91(2):610-9. Epub 2006 Mar 28.] итоксикологию [Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Andrews C, Bailer R, Rathmann J, Gomez PL.Toxicological safety evaluation of DNA plasmid vaccines against HIV-1, Ebola, Severe Acute Respiratory Syndrome, or West Nile virus is similar despite differing plasmid backbones or gene-inserts.ToxicolSci. 2006 Jun;91(2):620-30. Epub 2006 Mar 28]. Для плазмидной ДНК для применения у млекопитающих, кроме человека, требования менее строгие, в связи с чем возможно использование более широкого спектра плазмид.

Последовательность расположения описанных элементов в рекомбинантном векторе понятна среднему специалисту в данной области.

Касаемо вектора pcDNA3.1(+), элементы, обеспечивающие экспрессию гена, обуславливающего устойчивость к антибиотику неомицину, а также репликацию плазмиды в виде эписомы в клетках млекопитающих, не функционируют в целевом организме, поскольку такие клетки – клетки организма введения таких плазмидных ДНК - не содержат большой Т-антиген SV40. Вектор pcDNA3.1(+) не содержит транспозонов, а также элементов, отвечающих за трансмиссивность. Такая ДНК не встраивается в геном и не реплицируется в клетках млекопитающих. Все это безусловно говорит о безопасности применения средств на его основе.

Под вектором на основе вируса, в котором клонирован полинуклеотид, - подразумевается безопасный вектор, такой как, например, рекомбинантный аденоассоциированный вирус, но им не ограничивается.

Под линейным фрагментом ДНК подразумевается фрагмент ДНК, содержащий промотор, лидерную последовательность мРНК, описанный выше полинуклеотид, терминирующую последовательность, в том числе 1 или 2 стоп-кодона, регуляторные последовательности. К элементам применимы описанные выше требования. Такие элементы являются ключевыми, но могут содержаться и иные элементы. С такого фрагмента в клетках целевого организма синтезируется гибридный белок. Последовательность расположения описанных элементов понятна среднему специалисту в данной области.

Синтез с линейного фрагмента ДНК идет менее длительно, чем с плазмидного или вирусного вектора, однако его получение – намного более быстрое. Таким образом, каждая генетическая конструкция имеет свои преимущества и может быть применена в той или иной ситуации. Например, если требуется наработка доз вакцины в кратчайший срок – в течение нескольких часов (от 2-3 ч), то будет использован линейный фрагмент ДНК, если есть больше времени, тогда возможны остальные варианты.

Соответственно предложен способ получения вакцины против коронавируса на основе линейного фрагмента ДНК, который заключается в амплификации линейного фрагмента ДНК с использованием полимеразной цепной реакции - ПЦР, очистке от примесей и смешивании с физиологически приемлемым носителем и буферным раствором. Такой способ получения вакцины является самым быстрым, и ни одна зарегистрированная в России вакцина не нарабатывается таким способом. Однако в условиях такой стремительно распространяющейся инфекции, как коронавирусная инфекция 2020 года, охватившая мир, только такой способ наработки вакцины отвечает брошенному природой вызову.

Вакцину на основе иных генетических конструкций возможно получить культивированием микроорганизмов - прокариотической рекомбинантной клетки-продуцента, с последующим выделением и очисткой генетической конструкции. Такой способ займет больше времени (около 4-5 дней), однако он также является быстрым и применимым в настоящих реалиях нового коронавируса.

Оба способа также являются безопасными как для производства, так и применения вакцины, поскольку препарат инфекцию вызвать не может даже гипотетически.

Вакцины на основе белков или мРНК или ослабленных или убитых вирусов – намного сложнее и дольше в производстве, в особенности первый период – разработка технологии получения активного агента – белка в мономерной, активной форме, не вызывающего побочных эффектов; сама наработка мРНК, - молекулы, которая менее стабильна, чем ДНК; работа с опасным вирусом.

Предложена прокариотическая рекомбинантная клетка для получения генетической конструкции. Прокаритический продуцент представлен, например, Escherichia coli, Bacillus subtilis. В одном из вариантов это штамм бактерий Escherichiacoli DH10B/R, содержащий вектор pcDNA3.1(+), который содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO.:3-6.

Предложена вакцина для профилактики или лечения коронавируса, содержащая описанную выше генетическую конструкцию в качестве активного агента, в эффективном количестве, а также физиологически приемлемый носитель и буферный раствор. Фармацевтически приемлемые носители и буферные растворы известны из уровня техники и включают те, которые описаны в различных текстах, таких как, например, Remington's Pharmaceutical Sciences. В качестве потребителя вакцины может выступать как человек, так и животное, в том числе из домашних или сельскохозяйственных животных.

Введение ДНК-конструкций, кодирующих антиген патогена, как правило, осуществляется в мышечную ткань, и данная конструкция попадает в соматические клетки, где происходит экспрессия целевого гена. Синтезированный белок экспонируется на поверхности соматической клетки с помощью молекул МНС класса I, что вызывает формирование цитотоксических Т-лимфоцитов. Однако при введении в состав белка секреторного пептида он, в основном, секретируется во внеклеточное пространство, и реализуется механизм гуморального иммунного ответа.

Авторы предлагают парентеральное введение вакцины, причем в одном из вариантов – она содержит и генетическую конструкцию с секреторной последовательностью, и без таковой. Также вакцину можно вводить с использованием электропорации, для увеличения эффективности доставки в клетки для экспрессии полинуклеотида.

Авторами настоящего изобретения проведены лабораторные исследования, подтверждающие возможность реализации охарактеризованного изобретения. Полученные результаты исследований проиллюстрированы примерами (1-3).

Пример 1. Моделирование гибридного белка

Для моделирования белков были произведены следующие действия:

1. Поиск компонентов гибридного белка

2. Построение модели целого белка для определения ориентации доменов

3. Построение моделей для каждого домена (с использованием образцов 3D структур и ab initio)

4. Докинг моделей с использованием модели целого белка.

Для получения наиболее реалистичных результатов в автоматическом режиме использовали алгоритм I-Tasser для моделирования белков.

Смоделированный гибридный белок в одном варианте состоит из 422 а.о., с метионином на N-конце – 423 а.о., представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1. Анализ аминокислотной последовательности данного белка с помощью программы ProtParam (http://au.expasy.org/tools/protparam.html) показал, что гибридный белок имеет молекулярную массу 46,4 кДа, pI 9,61, белок стабилен, период полужизни в млекопитающих около 100 часов. С метионином на N-конце – 46,5 кДа, pI 9,61, белок стабилен, период полужизни в млекопитающих около 30 часов. При добавлении секреторной последовательности ИГФ (GKISSLPTQLFKCCFCDFLK), с метионином на N-конце гибридный белок состоит из 443 а.о., молекулярная масса 48,8 кДа, pI 9,55, белок стабилен. При добавлении секреторной последовательности ГРЧ (ATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA), с метионином на N-конце гибридный белок состоит из 448 а.о., молекулярная масса 49,1 кДа, pI 9,57, белок стабилен. При добавлении секреторной последовательности TPA (mdamkrglccvlllcgavfvsps), гибридный белок состоит из 445 а.о., молекулярная масса 48,8 кДа, pI 9,53, белок стабилен.

Смоделированный гибридный белок в одном варианте состоит из 424 а.о., с метионином на N-конце – 425 а.о., представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2. Анализ аминокислотной последовательности данного белка с помощью программы ProtParam (http://au.expasy.org/tools/protparam.html) показал, что гибридный белок имеет молекулярную массу 46,5 кДа, pI 9,61, белок стабилен, период полужизни в млекопитающих около 100 часов. С метионином на N-конце – 46,6 кДа, pI 9,61, белок стабилен, период полужизни в млекопитающих около 30 часов. При добавлении секреторной последовательности ИГФ, с метионином на N-конце гибридный белок состоит из 445 а.о., молекулярная масса 48,9 кДа, pI 9,55, белок стабилен. При добавлении секреторной последовательности ГРЧ, с метионином на N-конце гибридный белок состоит из 450 а.о., молекулярная масса 49,2 кДа, pI 9,57, белок стабилен. При добавлении секреторной последовательности TPA (mdamkrglccvlllcgavfvsps), гибридный белок состоит из 447 а.о., молекулярная масса 48,9 кДа, pI 9,53, белок стабилен.

При использовании иных секреторных сигналов показатели изменяются.

При экспрессии гибридного полинуклеотида в любой клетке синтезируется белок с метионином на N-конце, поскольку трансляция всегда начинается со старт-кодона. Далее метионин может отщепляться естественным путем, например, если белок секретируемый, в составе секреторного пептида.

Пример 2.Получение высокоочищенных генетических конструкций согласно изобретению

Рассчитывали последовательность нуклеотидов гена, коллинеарную последовательности аминокислот кодируемого им гибридного белка, охарактеризованного SEQ ID NO:1 или 2, с фланкированием целевого гена сайтами рестрикции, а также с добавлением последовательности Козак перед старт-кодоном для инициации трансляции, после старт кодона – в части вариантов - сигнальной последовательности, например, TPA, ГРЧ, ИГФ, EPO, либо представленной а.о. MLLLLLLLLLLALALA, для секреции синтезируемого белка из эукариотической клетки, с одновременной оптимизацией по кодонному составу для экспрессии в клетках человека, использован инструмент на сайте molbiol.ru. Получили, например, последовательности, охарактеризованные SEQ ID NO:3,4 и охарактеризованные SEQ ID NO:6, соответственно.

В одном из вариантов вместо искусственной оптимизации взяли соответствующие нуклеотидные последовательности нового коронавируса для получения генетической конструкции, поскольку эти последовательности экспрессируются у млекопитающих, остальные фрагменты оптимизировали как описано выше. Получили, например, нуклеотидную последовательность, охарактеризованную SEQ ID NO:5.

Рассчитанные нуклеотидные последовательности синтезировали химическим методом с помощью синтезатора ДНК ASM-800 (БИОССЕТ, Россия).

2.1. Получение плазмидной ДНК

2.1.1. Создание штамма-продуцента плазмидной ДНК

Синтезированные гены клонировали в эукариотических экспрессионных векторах pVAX1 (Invitrogen), pcDNA3.1+ (Invitrogen)по рестрикционным сайтам, фланкирующим целевые гены, по инструкции к вектору. Также получили вектор pcDNA3.1+, неспособный к экспрессии неомицина, за счет обработки данного вектора рестриктазой NsiI, в области SV40 промотора (-71 п.о.). В полученном векторе также клонировали полученные фрагменты.

На реакцию лигирования брали 3 мкл раствора синтезированной ДНК, 1 мкл раствора готового вектора, 5 мкл буфера для лигирования ×2 и 1 мкл Т4-лигазы. Реакцию проводили при +20°С в течение 2 часов.

После этого смесь прогревали при +95°С в течение 10 мин и очищали от солей диализом на нитроцелюлозных фильтрах с диаметром пор 0,025 мкм (Millipore, США). Диализ проводили против раствора, содержащего 0,5 мМ ЭДТА в 10% глицерине, в течение 10 мин.

Затем трансформировали клетки E.coli штамма DH10B/R (F-mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80dlacZΔM 15, ΔlacX74, deoR, recA1, endA1, araD139, Δ(ara,leu)769, galU, galKλ-, rpsL, nupG) полученными плазмидными ДНК методом электропорации с использованием электропоратора MicroPulser (BioRad). Данный штамм не содержит метилазу, что позволяет минимизировать возможность возникновения мутаций в ДНК, в том числе в клонированном в плазмиде, поддерживаемой в данном штамме, гене. К 12 мкл компетентных клеток добавляли 1 мкл диализованной лигазной смеси, помещали между электродами порационной ячейки и обрабатывали импульсом тока.

После трансформации клетки помещали в 1 мл SОС-cреды (2% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) и инкубировали в течение 40 мин при +37°С.

Проводили выявление клонов клеток E.coli, содержащих полученную плазмидную ДНК, на селективной среде, содержащей LB-агар, 50 мкг/мл канамицина, либо ампициллина (для плазмидных ДНК на основе pcDNA3.1+).

Из выросших клонов выделяли плазмидную ДНК. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора Wizard Minipreps DNA Purification System (Promega, США). Очищенную рекомбинантную плазмидную ДНК проверяли с помощью секвенирования.

Секвенирование клонированных фрагментов проводили по методу Сэнджера с использованием набора Applied Biosystems BigDye® Terminator (BDT) v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) по прилагающейся к нему инструкции. Для мечения продуктов реакции использовали меченные флуоресцентным красителем ddNTP, причем каждому ddNTP соответствовал свой краситель. Для секвенирования использовали немеченные специфические для плазмид праймеры. Проводили ПЦР-реакцию, затем реакционную смесь очищали от свободных меченых ddNTP по инструкции к набору BigDye X-Terminator Purification Kit (Applied Biosystems, США) и разделяли продукты реакции секвенирования с использованием капиллярного секвенатора Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) и реактива 3500/3500xL Genetic Analyzer Polymer “POP-6™” (Applied Biosystems, США).

Результаты разделения продуктов реакции секвенирования регистрировали путем сканирования лазером и детекции четырех флуоресцентных красителей, включенных во все типы ddNTP.

Компьютерный анализ последовательностей ДНК проводили с помощью персонального компьютера с использованием программ Chromas и BioEdit. Нуклеотидные последовательности исследованных фрагментов ДНК были выровнены относительно рассчитанных, была продемонстрирована идентичность синтезированных фрагментов рассчитанным. В результате были отобраны клоны клеток E.coli, содержащие полноразмерные последовательности целевых генов в составе плазмид - последовательности ДНК, кодирующие разработанные гибридные белки. Такие клоны использовали в качестве штамма-продуцента плазмид по изобретению. В одном из вариантов это штамм бактерий EscherichiacoliDH10B/R, содержащий вектор pcDNA3.1(+), который содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO.:3-6.

В качестве продуцента генетической конструкции также успешно использовали клетки бактерии Bacillus subtilis.

2.1.2. Наработка плазмидной ДНК, кодирующей гибридный белок

Отдельную колонию клеток продуцента E.coli, выращенную на LB-агаре в чашке Петри с добавлением канамицина, либо ампициллина, в зависимости от содержащейся плазмидной ДНК, помещали в 10 мл селективной среды. Клетки растили в течение 12 ч. при +37°С в условиях постоянного перемешивания (250 об/мин). Полученные клетки собирали центрифугированием при 4000g. Дальнейшее выделение и очистку плазмидной ДНК осуществляли с использованием набора EndoFree Plasmid Mega Kit (Qiagen), позволяющего получить апирогенную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК анализировали электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле, измеряли ее концентрацию с помощью флуориметрии. Использовали также и иные способы очистки плазмид, в частности, хроматографию.

Определенные в эксперименте значения соответствовали значениям отношений А₂₆₀/А₂₈₀ и А₂₆₀/А₂₃₀ для чистых препаратов, для всех полученных препаратов плазмидной ДНК.

Также проводили количественное определение примесей белка в полученных препаратах плазмидных ДНК с помощью microBCAassay [Smith, P.K., etall, Measurementofproteinusingbicinchoninicacid. Analyt. Biochem. 150, 76-85 (1985)], измеряя оптическую плотность образующихся окрашенных белковых комплексов с медью и бицинхониновой кислотой при длине волны 562 нм. Чувствительность метода microBCAassay составляет 0.5-20 мкг/мл белка. Концентрация тотального белка ни в одном из исследуемых препаратов плазмидной ДНК не превышала норму.

Определяли и содержание бактериального липополисахарида в препаратах плазмидных ДНК, с использованием гель-тромб варианта ЛАЛ-теста, с чувствительностью >0,25 EU/мл (ToxinSensor, GenScript, США). ЛАЛ-реагентом служил лизат амебоцитов подковообразного краба Limulus polyphemus. ЛАЛ-реактив специфически реагирует с бактериальными эндотоксинами, в результате ферментативной реакции происходит изменение реакционной смеси, пропорциональное концентрации эндотоксина. Результаты оценивали по наличию или отсутствию плотного тромба на дне пробирки путем переворачивания пробирки.Гель-тромб не образовался при исследовании образца, разведенного в 10 раз, для препаратов всех полученных плазмидных ДНК, т.е. при чувствительности метода 2,5 EU/мл, что, учитывая концентрацию плазмидной ДНК в образце, говорит о допустимом показателе очистки от эндотоксинов.

Выход плазмидной ДНК составил от 3,1 мг до 4,7 мг из 1 л питательной среды. Процесс занял около 4 дней.

2.2. Получение вектора на основе аденоассоциированного вируса, кодирующего гибридный белок

Синтезированные гены клонированли в векторе на основе аденоассоциированного вируса pAAVK-EF1α-MCS (System Biosciences (SBI)), на основе которого создавали штамм-продуцент данного вектора, используя клетки E.coli (RecA^-). В качестве продуцента также успешно использовали клетки бактерии Bacillus subtilis.

Далее выделяли вектор для использования у млекопитающих, все по инструкции к вектору. Выход вектора составил от 2 мг до 3,2 мг из 1 л питательной среды.

2.3. Получение короткой линейной конструкции, кодирующей гибридный белок по изобретению

Для наработки короткой линейной конструкции использовали полученную по п.2.1.2. плазмидную ДНК, либо вирусный вектор по п.2.2., либо амплифицированный с них фрагмент. С использованием специфичных праймеров и ПЦР, с использованием в качестве матрицы указанной в предыдущем предложении ДНК, амплифицировали фрагмент ДНК, содержащий промотор, лидерную последовательность мРНК, а также регуляторные последовательности для указанных элементов, полинуклеотид - гибридный ген, терминирующую последовательность. Амплификат может содержать и иные элементы, а указанные в предыдущем предложении элементы – ключевые.

Амплификацию указанной последовательности проводили в объеме 50 мкл, в тонкостенных полипропиленовых пробирках объемом 650 мкл, содержащих 5 мкл 10-кратного буфера Taq (700 mM Трис-HCl, pH 8.6/ 25ºC, 166 mM (NH₄)₂SO₄), 5 мкл MgCl₂ (1.25 мМ), 1 мкл дНТФ, 31,5 мкл воды, 1 мкл прямого и 1 мкл обратного праймеров, 5 мкл плазмидной ДНК и 0,5 мкл полимеразы Taq (Fermentas, Литва).

Реакционную смесь прогревали 5 мин. при 95°С для денатурации ДНК. Для предотвращения испарения на реакционную смесь объемом 50 мкл наслаивали 30 мкл минерального масла Bayol F (Sigma, США). Реакцию амплификации проводили в термоциклере С1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Проводили 35 циклов:95°С – 20 сек, 50-62°С (в зависимости от праймеров) – 20 сек.,72°С – 1 мин. Для достраивания образовавшихся цепей ДНК проводили дополнительный цикл: 5 мин при 72°С.

Результат ПЦР анализировали электрофорезом в агарозном геле. При положительном результате проводили препаративный электрофорез.

Амплифицированные фрагменты ДНК концентрировали и очищали при помощи препаративного электрофореза в 0,8-1,2% агарозном геле (Gibko BRL, США). Пробу смеси после проведения ПЦР смешивали с шестикратным буфером (0,25% бромфеноловый синий, 30% глицерин) (ThermoScientific, США) и наносили на гель, по 18 мкл в лунку. Электрофорез проводили в горизонтальном аппарате в буфере ТАЕ (40 мМТрис-ацетат, 2 мМ ЭДTA pH 8,0, 0,5 мкг/мл бромистого этидия) при напряжении 5-10 В/см. Результат разделения ДНК регистрировали в проходящем УФ-свете (302 нм) трансиллюминатора Macrovue (LKB, Швеция). Длину амплифицированного фрагмента определяли по логарифмической зависимости подвижности ДНК от длины фрагментов в маркере. В качестве маркеров использовали фирменную смесь фрагментов ДНК "GeneRuler 1000 bp DNA Ladder"(Fermentas, Литва). Участок агарозы, содержащий полосу ДНК необходимого размера, вырезали, и фрагмент ДНК очищали с помощью набора DNA&Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Великобритания) в соответствии с инструкцией.

Современные методы очистки ДНК, в частности с использованием диоксида кремния, позволяют избавиться от всей примесей и получить пригодную для использования у животных и человека ДНК. Также возможно очищать амплификат и без использования препаративного электрофореза, с использованием иных методик – например, хроматографией, на колонке. Таким образом, готовый для использования препарат возможно получить уже через 2-3 часа.

Также получали и иные генетические конструкции по изобретению, в том числе содержащие и иные компоненты, вдобавок к указанным выше ключевым, а также иные варианты полинуклеотида по изобретению, чем представленного SEQIDNO:3-6, с таких конструкций в клетках млекопитающих экспрессируется полинуклеотид по изобретению.

Выделенную генетическую конструкцию использовали у млекопитающих.

Пример 3. Демонстрация эффективности разработанной вакцины

Эксперимент выполнен на белых мышах неинбредных линий (Питомник лабораторных животных «Рапполово»). Животных, весом 19-22 г, содержали в стандартных условиях, при температуре окружающей среды +27±2°С с постоянной влажностью воздуха 55%, при 12-часовом световом дне. Они получали сухой стандартизованный корм и воду без ограничения.

Животным вводили внутримышечно плазмидную ДНК pcDNA3.1(+)seqidno5 в количестве 50 мкг в PBS, в качестве отрицательного контроля использовали животных без введения какого-либо вещества. Животных умерщвляли на 2, 5 и 7 день, у них отбирали кровь, и приготавливали сыворотки. Часть животных всех групп не выводили из опыта для оценки безопасности вакцины.

Полученные сыворотки анализировали электрофорезом в ПААГ с последующим переносом белков на нитроцеллюлозную мембрану и визуализацией целевого белка с использованием хемилюминесценции.

После проведения электрофореза в ПААГ осуществляли перенос белков на мембрану. Использовали следующие растворы: Раствор I - 10 мл этанола, 17 мл Tris-HCl 1М pH10,4, до 50 мл дH2O, Раствор II - 10 мл этанола, 1,25 мл Tris-HCl 1М pH10,4, до 50 мл дH2O, Раствор III - 10 мл этанола, 1,25 мл Tris-HCl 1М pH9,4, до 50 мл дH2O. Собирали «сэндвич» на аппарате для горизонтального переноса Semi-phor TE70 Semi-dry tranfer unit: 6 фрагментов ватмана, вымоченных в Растворе I, 3 фрагмента ватмана, вымоченных в Растворе II, нитроцеллюлозная мембрана BioRad, вымоченная в Растворе II, ПААГ после проведения электрофореза, который располагали на мембране и не двигали более, 9 фрагментов ватмана, вымоченных в Растворе III. Закрывали крышку прибора, подключалось питание, 100 В в течение часа, источник тока - Constant current PS unit model PS50, Hoefler Scentific Instruments (HSI).

Далее осуществлялось формирование иммобилизованного на мембране комплекса: гибридный белок - специфичное антитело - вторичное антитело - пероксидаза хрена.

Для этого мембрану обрабатывали 1% сухим обезжиренным молоком на фосфатно-солевом буфере с добавлением 0.5% Tween-20 (125 мкл 20% водного раствора на 50 мл молока), осуществляли инкубацию в течение 15 минут при комнатной температуре. Далее смесь сливали, добавляли антитела к белкам коронавируса - кроличьи антитела к белку S коронавируса Anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein monoclonal antibody (CABT-RM321), в 1% сухом обезжиренном молоке, в разведении 1:3000, затем осуществляли инкубацию в течение 16 ч при +4°С, после чего осуществляли нагревание до комнатной температуры. После осуществляли 3 отмывки 1% сухим обезжиренным молоком с добавлением 0.5% Tween-20, каждая - по 10 минут. После последней отмывки добавляли вторичные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена, - Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (Abcam), - в 1% сухом обезжиренном молоке, в разведении 1:6000, осуществляли инкубацию в течение 1 ч, после чего проводили 3 отмывки фосфатно-солевым буфером, каждая – по 10 минут.

Сформированные иммобилизованные на мембране комплексы проявляли с использованием набора для хемолюминисценции Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare). На влажную мембрану с иммобилизованными комплексами гибридный белок -специфичное антитело-вторичное антитело-пероксидаза хрена наносили смесь равных объемов реагентов 1 и 2 из данного набора, все упаковывали между слоями прозрачной пластиковой папки для бумаг (слайда). Данную конструкцию помещали в кассету для рентгеновских снимков (Kodak). Сверху наклеивали фрагмент рентгеновской пленки Amersham Hyperfilm ECL и фиксировали. Кассету закрывали и выдерживали в течение 12 ч. Пленку проявляли с использованием коммерческих растворов проявителя и фиксажа (Крок-рентген) согласно инструкции и высушивали. Данные действия осуществляли в темноте в свете красной лампы.

Далее при нормальном освещении выбирали картинку с лучшим качеством и сканировали параллельно с исходной мембраной, на которой расположены маркеры молекулярного веса и разметка дорожек. Полученные изображения совмещали с помощью программы PhotoFiltre 7.

Аналогичный опыт провели с использованием антител к белку N коронавируса - Rabbit anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody, clone 120 (CABT-RM320).

В обоих опытах продемонстрировано, что целевой ген, закодированный в плазмидной ДНК pcDNA3.1(+)seqidno5, экспрессируется, причем максимальный уровень экспрессии наблюдается на пятый день после введения такой плазмидной ДНК, и белок присутствует и через неделю после этого, и что данный белок может связываться с антителами к белкам S, N коронавируса.

Сходные результаты продемонстрированы также при использовании и иных заявленных генетических конструкций, в том числе линейной конструкции, вирусного вектора, и при использовании иных полинуклеотидов по изобретению, в том числе и с фрагментом, кодирующим секреторную последовательность, и без него, и в обоих вариантах гибридного белка, и при использовании более одной генетической конструкции по изобретению, и при режимах введения как стандартном, так и с использованием электропорации. При введении в организм генетических конструкций электропорацией продемонстрирован более высокий уровень экспрессии полинуклеотида и более сильный иммунный ответ.

Таким образом, оценена способность разработанной генетической конструкции к экспрессии кодируемого целевого гена после введения в мышцы, а также функционирование доменов разработанного гибридного белка, в частности представленных белками S и N нового коронавируса. Продемонстрирован синтез гибридного белка уже на вторые сутки после введения разработанной генетической конструкции, несущей кодирующий его ген, и в течение недели, причем максимальный уровень синтеза выявлен на 4-5 сутки после иммунизации. Это говорит о том, что используемая генетическая конструкция по изобретению позволяет осуществлять экспрессию целевого гена в клетках млекопитающих.

Поскольку в данном анализе использованы кроличьи антитела к белкам S и N нового коронавируса, и поскольку показано, что они связываются с синтезируемым в клетках мышей гибридным белком по изобретению, можно говорить о полноценном функционировании и доменов S и N в составе гибридного белка, а также самого гибридного белка, синтезируемого с разработанной генетической конструкции, - за счет получения в форме, узнаваемой специфично иммунной системой. Соответственно можно сказать, что продемонстрирована и доступность синтезируемого с разработанной плазмидной ДНК белка для узнавания иммунной системой и формирования адекватного ответа.

Для индукции длительного ответа, связанного с реакцией герминативных центров, у человека интервал между первичной и вторичной иммунизациями целесообразно делать не менее чем 1-2 месяца, оптимально – не менее 4-6 месяцев, для оптимального созревания аффинности В-клеток. При сокращении интервала бустерный ответ может быть меньше.

Проведены также иные исследования, в том числе с использованием иных количеств генетической конструкции, демонстрирующие эффективность разработанной вакцины, всех вариантов, для профилактики и терапии нового коронавируса.

Также продемонстрирована безопасность предлагаемой вакцины: животные соответствующих групп выжили и были выведены из эксперимента принудительно, в процессе испытаний побочные эффекты не наблюдали.

--->

Перечень последовательностей

<110> Духовлинов И.В.

<120> Вакцина для проф. или леч. коронавир. инфекции

на основе ген. констр-и

<160> 6

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 422

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> домен

<222> с 1 по 121 аминокислотный остаток

<223> домен М, с 60 по 180 аминокислотный остаток белка М нового

коронавируса

<220>

<221> домен

<222> с 128 по 202 аминокислотный остаток

<223> домен S, с 306 по 380 аминокислотный остаток белка S нового

коронавируса

<220>

<221> домен

<222> с 208 по 352 аминокислотный остаток

<223> домен N, с 216 по 360 аминокислотный остаток белка N нового

коронавируса

<220>

<221> домен

<222> с 358 по 422 аминокислотный остаток

<223> домен E, с 6 по 70 аминокислотный остаток белка E нового

коронавируса

<400> 1

Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp

1 5 10 15

Ile Thr Gly Gly Ile Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met

20 25 30

Trp Leu Ser Tyr Phe Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg

35 40 45

Ser Met Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro

50 55 60

Leu His Gly Thr Ile Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val

65 70 75 80

Ile Gly Ala Val Ile Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His

85 90 95

Leu Gly Arg Cys Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala

100 105 110

Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe

115 120 125

Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro

130 135 140

Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe

145 150 155 160

Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn

165 170 175

Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn

180 185 190

Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Asp

195 200 205

Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser

210 215 220

Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys

225 230 235 240

Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala

245 250 255

Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu

260 265 270

Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr

275 280 285

Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser

290 295 300

Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly

305 310 315 320

Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro

325 330 335

Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr

340 345 350

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser

355 360 365

Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala

370 375 380

Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn

385 390 395 400

Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn

405 410 415

Leu Asn Ser Ser Arg Val

420

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 424

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> домен

<222> с 1 по 121 аминокислотный остаток

<223> домен М, с 60 по 180 аминокислотный остаток белка М нового

коронавируса

<220>

<221> домен

<222> с 128 по 202 аминокислотный остаток

<223> домен S, с 306 по 380 аминокислотный остаток белка S нового

коронавируса

<220>

<221> домен

<222> с 209 по 353 аминокислотный остаток

<223> домен N, с 216 по 360 аминокислотный остаток белка N нового

коронавируса

<220>

<221> домен

<222> с 360 по 424 аминокислотный остаток

<223> домен E, с 6 по 70 аминокислотный остаток белка E нового

коронавируса

<400> 2

Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp

1 5 10 15

Ile Thr Gly Gly Ile Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met

20 25 30

Trp Leu Ser Tyr Phe Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg

35 40 45

Ser Met Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro

50 55 60

Leu His Gly Thr Ile Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val

65 70 75 80

Ile Gly Ala Val Ile Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His

85 90 95

Leu Gly Arg Cys Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala

100 105 110

Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe

115 120 125

Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro

130 135 140

Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe

145 150 155 160

Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn

165 170 175

Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn

180 185 190

Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly

195 200 205

Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu

210 215 220

Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr

225 230 235 240

Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr

245 250 255

Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro

260 265 270

Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly

275 280 285

Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala

290 295 300

Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser

305 310 315 320

Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp

325 330 335

Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala

340 345 350

Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val

355 360 365

Asn Ser Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr

370 375 380

Leu Ala Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile

385 390 395 400

Val Asn Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val

405 410 415

Lys Asn Leu Asn Ser Ser Arg Val

420

<210> SEQ ID NO: 3

<211> 1281

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полинуклеотид, опт. по кодон.сост. для млекопитающих, кодирующий

гибридный белок из 422 а.о.

<400> 3

gccgccacca tggtgaccct ggcctgcttc gtgctggccg ccgtgtaccg gatcaactgg 60

atcaccggcg gcatcgccat cgccatggcc tgcctggtgg gcctgatgtg gctgtcctac 120

ttcatcgcct ccttccggct gttcgcccgg acccggtcca tgtggtcctt caaccccgag 180

accaacatcc tgctgaacgt gcccctgcac ggcaccatcc tgacccggcc cctgctggag 240

tccgagctgg tgatcggcgc cgtgatcctg cggggccacc tgcggatcgc cggccaccac 300

ctgggccggt gcgacatcaa ggacctgccc aaggagatca ccgtggccac ctcccggacc 360

ctgtcctact acaagggcgg cggcggcggc ggcttcaccg tggagaaggg catctaccag 420

acctccaact tccgggtgca gcccaccgag tccatcgtgc ggttccccaa catcaccaac 480

ctgtgcccct tcggcgaggt gttcaacgcc acccggttcg cctccgtgta cgcctggaac 540

cggaagcgga tctccaactg cgtggccgac tactccgtgc tgtacaactc cgcctccttc 600

tccaccttca agtgctacgg cggcggcggc ggcgacgccg ccctggccct gctgctgctg 660

gaccggctga accagctgga gtccaagatg tccggcaagg gccagcagca gcagggccag 720

accgtgacca agaagtccgc cgccgaggcc tccaagaagc cccggcagaa gcggaccgcc 780

accaaggcct acaacgtgac ccaggccttc ggccggcggg gccccgagca gacccagggc 840

aacttcggcg accaggagct gatccggcag ggcaccgact acaagcactg gccccagatc 900

gcccagttcg ccccctccgc ctccgccttc ttcggcatgt cccggatcgg catggaggtg 960

accccctccg gcacctggct gacctacacc ggcgccatca agctggacga caaggacccc 1020

aacttcaagg accaggtgat cctgctgaac aagcacatcg acgcctacgg cggcggcggc 1080

ggctccgagg agaccggcac cctgatcgtg aactccgtgc tgctgttcct ggccttcgtg 1140

gtgttcctgc tggtgaccct ggccatcctg accgccctgc ggctgtgcgc ctactgctgc 1200

aacatcgtga acgtgtccct ggtgaagccc tccttctacg tgtactcccg ggtgaagaac 1260

ctgaactcct cccgggtgtg a 1281

<210> SEQ ID NO: 4

<211> 1287

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полинуклеотид, опт. по кодон.сост. для млекопитающих, кодирующий

гибридный белок из 424 а.о.

<400> 4