Олигонуклеотиды для понижения экспрессии pd-l1

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая антисмысловой олигонуклеотид для снижения экспрессии лиганда-1 запрограммированной смерти (PD-L1), конъюгат вышеуказанного антисмыслового олигонуклеотида, содержащий конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина, фармацевтическую композицию для лечения или предупреждения вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV, паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, или рака печени или метастазов в печени, способ in vivo или in vitro снижения экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, применение антисмыслового олигонуклеотида, конъюгата антисмыслового олигонуклеотида или фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения инфекции HBV, способ лечения или предупреждения заболевания, где указанное заболевание представляет собой вирусную инфекцию печени, такую как HBV, HCV и HDV, паразитарную инфекцию, такую как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, или рак печени или метастазы в печени, способ лечения или предупреждения инфекции HBV. Изобретение расширяет арсенал средств для снижения экспрессии PD-L1. 7 н. и 7 з.п. ф-лы, 13 ил., 24 табл., 9 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам (олигомерам), которые являются комплементарными лиганду-1 запрограммированной смерти (PD-L1), приводящим к понижению экспрессии PD-L1 в печени. Настоящее изобретение также относится к способу облегчения исчерпания Т-клеток, вызванного инфекцией печени или раком в печени. Релевантными инфекциями являются хронические инфекции HBV (вирус гепатита В), HCV (вирус гепатита С) и HDV (вирус гепатита D) и паразитарные инфекции, подобные малярии и токсоплазмозу (например, вызванные протистами Plasmodium, в частности, видами P. vivax, P. malariae и P. falciparum).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно то, что костимулирующий путь, состоящий из рецептора запрограммированной смерти-1 (PD-1) и его лиганда - PD-L1 (или B7-H1, или CD274) - непосредственно способствует исчерпанию Т-клеток, приводящему к отсутствию контроля за вирусами во время хронических инфекций печени. Путь PD-1 также играет роль в автоиммунитете, так как у мышей с нарушениями данного пути развиваются аутоиммунные заболевания.

Было показано то, что антитела, которые блокируют взаимодействие между PD-1 и PD-L1, усиливают ответы Т-клеток, в частности, ответ цитотоксических Т-клеток CD8+ (см. Barber et al 2006 Nature Vol 439 p682 и Maier et al 2007 J. Immunol. Vol 178 p 2714).

В WO 2006/042237 описан способ диагностики рака посредством оценки экспрессии PD-L1 (B7-H1) в опухолях и предложена доставка пациенту агента, который препятствует взаимодействию PD-1/PD-L1. Препятствующими агентами могут быть антитела, фрагменты антител, миРНК (малая интерферирующая РНК) или антисмысловые олигонуклеотиды. Нет ни конкретных примеров таких препятствующих агентов, ни какого-либо упоминания хронических инфекций печени.

Опосредованное РНК-интерференцией ингибирование PD-L1 с использованием двухцепочечных молекул РНК (дцРНК, РНКи или миРНК) также было раскрыто, например, в WO 2005/007855, WO 2007/084865 и US 8507663. Ни в одной из них не описана таргетная доставка в печень.

В Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 описана доставка in vivo молекул миРНК, нацеленных на PD-L1, в клетки Купфера, усиливая, посредством этого клиренс клетками NK (природная клетка-киллер) и Т-клетками CD8+ у мышей, инфицированных MCMV (мышиный цитомегаловирус). В данной статье делается заключение о том, что молекулы миРНК, нацеленные на PD-L1, доставленные в гепатоциты, не являются эффективными в отношении усиления эффекторной функции Т-леток CD8+.

Подход с миРНК значительно отличается от подхода с одноцепочечными антисмысловыми олигонуклеотидами, так как биораспределение и механизмы действия являются совершенно разными. Как описано в Xu et al 2003 Biochem. Biophys. Res. Comm. том 306, страницы 712-717, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК имеют разные предпочтения в отношении сайтов-мишеней в мРНК.

В WO 2016/138278 описано ингибирование иммунных контрольных точек, включая PD-L1, с использованием двух или более чем двух одноцепочечных антисмысловых олигонуклеотидов, которые связаны на их 5'-концах. В данной заявке не упоминается HBV или таргетная доставка в печень.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении идентифицированы новые олигонуклеотиды и конъюгаты олигонуклеотидов, которые очень эффективно понижают уровень мРНК PD-L1 в клетках печени - как в паренхимных (например, гепатоциты), так и в непаренхимных клетках, таких как клетки Купфера и синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSEC). Посредством понижения или сайленсинга PD-L1 олигонуклеотиды и конъюгаты олигонуклеотидов уменьшают опосредованное PD-1 ингибирование и, посредством этого, активизируют иммуностимуляцию истощенных Т-клеток. Облегчение исчерпания Т-клеток при хронической патогенной инфекции печени будет приводить к возобновленному иммунному контролю и пониженным уровням вирусных антигенов в крови во время хронической патогенной инфекции печени. Клетки природные киллеры (NK) и Т-клетки природные киллеры (NKТ) также могут активироваться олигонуклеотидами и конъюгатами олигонуклеотидов по настоящему изобретению.

Конъюгаты олигонуклеотидов обеспечивают местное снижение уровня PD-L1 в клетках печени и, следовательно, уменьшают риск аутоиммунных побочных эффектов, таких как пневмонит, невирусный гепатит и колит, ассоциированный с системным исчерпанием PD-L1.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам или их конъюгатам, нацеленным на нуклеиновую кислоту, способным модулировать экспрессию PD-L1 и лечить или предупреждать заболевания, связанные с функционированием PD-L1. Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, в частности, могут использоваться для лечения заболеваний, при которых был истощен иммунный ответ против инфекционного агента.

Соответственно, в первом аспекте изобретения предложены олигонуклеотиды, которые содержат непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью к нуклеиновой кислоте мишени PD-L1. Данный олигонуклеотид может представлять собой антисмысловой олигонуклеотид, предпочтительно с гэпмерной конструкцией. Предпочтительно данный олигонуклеотид способен ингибировать экспрессию PD-L1 посредством расщепления нуклеиновой кислоты-мишени. Расщепление предпочтительно достигается посредством рекрутирования нуклеазы.

В другом аспекте данный олигонуклеотид конъюгирован с по меньшей мере одной конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, такой как конъюгатная группировка, содержащая по меньшей мере одну N-ацетилгалактозаминную (GalNAc) группировку. Конъюгатная группировка и олигонуклеотид могут быть связаны друг с другом посредством линкера, в частности, биорасщепляемого линкера.

В другом аспекте согласно изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по изобретению и фармацевтически приемлемые разбавители, носители, соли и/или адъюванты.

В другом аспекте согласно изобретению предложены способы in vivo или in vitro для понижения экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспрессирует PD-L1, посредством введения в указанную клетку олигонуклеотида или композиции по изобретению в эффективном количестве.

В другом аспекте согласно изобретению предложены олигонуклеотиды, конъюгаты олигонуклеотидов или фармацевтические композиции для применения в восстановлении иммунитета против вируса или паразита.

В другом аспекте согласно изобретению предложены олигонуклеотиды, конъюгаты олигонуклеотидов или фармацевтические композиции для применения в качестве лекарственного средства.

В другом аспекте согласно изобретению предложены способы лечения или предупреждения заболевания, расстройства или дисфункции посредством введения терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида по изобретению субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию, расстройству или дисфункции, в частности, к заболеваниям, выбранным из вирусных инфекций печени или паразитарных инфекций.

В другом аспекте олигонуклеотид, конъюгаты олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению используются для лечения или предупреждения вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV, или паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, или рака печени, или метастазов в печени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: иллюстрирует типичные конъюгаты антисмыслового олигонуклеотида, где данный олигонуклеоид либо представлен волнистой линией (А-Г), либо как «олигонуклеотид» (Д-З), либо как Т₂ (И), а конъюгатные группировки, нацеленные на рецептор асиалогликопротеина, представляют собой трехвалентные N-ацетилгалактозаминные группировки. Соединения А-Г содержат дилизиновую разветвляющую молекулу, ПЭГ3 спейсер и три концевые GalNAc углеводные группировки. В соединении А и Б олигонуклеотид непосредственно присоединен к конъюгатной группировке, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, без линкера. В соединении В и Г олигонуклеотид непосредственно присоединен к конъюгатной группировке, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, через С6 линкер. Соединения Д-И содержат утраивающую разветвляющую молекулу, спейсеры варьирующей длины и структуры, и три концевые GalNAc углеводные группировки.

Фиг. 2: график, демонстрирующий ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация) (А) и нокдаун PD-L1 как % от воздействия физиологическим раствором (Б) для соединений, протестированных в Примере 2, в связи с их положением на нуклеиновой кислоте-мишени. Клеточными линиями, в которых тестировали данное соединение, были и

Фиг. 3: структурная формула трехвалентного GalNAc кластера (GN2). GN2 является полезным в настоящем изобретении в качестве конъюгатной группировки. Волнистая линия иллюстрирует сайт конъюгирования данного кластера, например, с С6 аминолинкером или непосредственно с олигонуклеотидом.

Фиг. 4: структурная формула CMP ID NO 766_2.

Фиг. 5: структурная формула CMP ID NO 767_2.

Фиг. 6: структурная формула CMP ID NO 768_2.

Фиг. 7: структурная формула CMP ID NO 769_2.

Фиг. 8: структурная формула CMP ID NO 770_2.

Фиг. 9: вестерн-блот, выявляющий экспрессию белка PD-L1 в печени от животных, индуцированных поли(IC), после обработки физиологическим раствором и указанными CMP ID NO. Каждый блот показывает голый олигонуклеотид относительно версии того же самого олигонуклеотида, конъюгированной с GalNAc, блот А) CMP ID NO 744_1 и 755_2, Б) CMP ID NO 747_1 и 758_2, В) CMP ID NO 748_1 и 759_2, Г) CMP ID NO 752_1 и 763_2, и Д) CMP ID NO 753_1 и 764_2. Верхняя полоса представляет собой контроль загрузки - винкулин, нижняя полоса представляет собой белок PD-L1. Первая дорожка в каждом блоте демонстрирует мышей, обработанных физиологическим раствором, без индукции поли(IC). Данные мыши экспрессируют очень мало белка PD-L.

Фиг. 10: популяция одноядерных клеток в печени после обработки носителем (группа 10 и 1), ДНК-вакциной (группа 11 и 2), антителом против PD-L1 (группа 12), голым АСО (антисмысловой олигонуклеотид) против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлена для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблица 18). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05; *** - Р меньше 0,001, и **** Р меньше 0,0001). А) представляет число Т-клеток в печени после обработки. Б) представляет долю Т-клеток CD4+, и В) представляет долю Т-клеток CD8+.

Фиг. 11: модуляция PD-L1-позитивных клеток в печени после обработки носителем (группа 10 и 1), ДНК-вакциной (группа 11 и 2), антителом против PD-L1 (группа 12), голым АСО против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлена для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблицу 19). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05 и **** - Р меньше 0,0001). А) представляет процентную долю Т-клеток CD8+, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки. Б) представляет процентную долю Т-клеток CD4+, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки, и В) представляет процентную долю В-клеток, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки.

Фиг. 12: специфичные в отношении антигена HBV цитокин-секретирующие клетки CD8+ после обработки носителем (группа 10 и 1), ДНК-вакциной (группа 11 и 2), антителом против PD-L1 (группа 12), голым АСО против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлены для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблицу 20). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05). А) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ (интерферон-гамма) Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении антигена PreS2+S HBV, после обработки. Б) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении корового антигена HBV, после обработки, и В) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ и TNF-α (фактор некроза опухолей-альфа) Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении антигена PreS2+S HBV, после обработки.

Фиг. 13: ДНК HBV, HВsAg и HВeAg у мышей AAV/HBV после обработки антисмысловым CMP NO: 759_2 против PD-L1, конъюгированным с GalNAc , по сравнению с носителем . Вертикальная линия показывает конец обработки.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Олигонуклеотид

Термин «олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется таким образом, как обычно понятно специалисту, как молекула, содержащая два или более чем два ковалентно связанных нуклеозида. Такие ковалентно связанные нуклеозиды также могут называться молекулами нуклеиновой кислоты или олигомерами. Олигонуклеотиды обычно получают в лаборатории посредством твердофазного химического синтеза с последующей очисткой. При ссылке на последовательность олигонуклеотида, делается ссылка на последовательность или порядок группировок нуклеиновых оснований или их модификаций ковалентно связанных нуклеотидов или нуклеозидов. Олигонуклеотид по изобретению является искусственным, синтезируется химически и типично очищается или выделяется. Олигонуклеотид по изобретению может содержать один или более чем один модифицированный нуклеозид или нуклеотид.

Антисмысловые олигонуклеотиды

Термин «антисмысловой олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется как олигонуклеотид, способный модулировать экспрессию гена-мишени посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, в частности с непрерывной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды по существу не являются двухцепочечными и, следовательно, не являются миРНК. Предпочтительно антисмысловые олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются одноцепочечными.

Непрерывная нуклеотидная последовательность

Термин «непрерывная нуклеотидная последовательность» относится к области олигонуклеотида, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени. Данный термин используется в данном документе взаимозаменяемо с термином «непрерывная последовательность нуклеиновых оснований» и термином «последовательность олигонуклеотидного мотива». В некоторых воплощениях все нуклеотиды данного олигонуклеотида составляют непрерывную нуклеотидную последовательность. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность и, возможно, может содержать дополнительный(ные) нуклеотид(ды), например, область нуклеотидного линкера, которая может использоваться для присоединения функциональной группы к непрерывной нуклеотидной последовательности. Область нуклеотидного линкера может быть или может не быть комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.

Нуклеотиды

Нуклеотиды представляют собой структурные элементы олигонуклеотидов и полинуклеотидов и для целей настоящего изобретения включают и встречающиеся в природе, и не встречающиеся в природе нуклеотиды. В природе нуклеотиды, такие как нуклеотиды ДНК и РНК, содержат группировку сахара рибозы, группировку нуклеинового основания и одну или более чем одну фосфатную группу (которая отсутствует в нуклеозидах). Нуклеозиды и нуклеотиды также могут взаимозаменяемо называться «звеньями» или «мономерами».

Модифицированный нуклеозид

Термин «модифицированный нуклеозид» или «модификация нуклеозида» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к нуклеозидам, модифицированным по сравнению с эквивалентным нуклеозидом ДНК или РНК посредством введения одной или более чем одной модификации сахарной группировки или группировки (нуклеинового) основания. В предпочтительном воплощении модифицированный нуклеозид содержит модифицированную сахарную группировку. Термин «модифицированный нуклеозид» также может использоваться в данном документе взаимозаменяемо с термином «аналог нуклеозида» или модифицированные «звенья» или модифицированные «мономеры».

Модифицированная межнуклеозидная связь

Термин «модифицированная межнуклеозидная связь» определяется так, как обычно понятно специалисту: как связи, отличные от фосфодиэфирных (РО) связей, которые ковалентно связывают вместе два нуклеозида. Нуклеотиды с модифицированными межнуклеозидными связями также называются «модифицированными нуклеотидами». В некоторых воплощениях модифицированная межнуклеозидная связь увеличивает устойчивость олигонуклеотида к нуклеазе по сравнению с фосфодиэфирной связью. Для олигонуклеотидов, встречающихся в природе, межнуклеозидная связь включает фосфатные группы, создающие фосфодиэфирную связь между соседними нуклеозидами. Модифицированные межнуклеозидные связи являются особенно полезными в стабилизации олигонуклеотидов для применения in vivo, и они могут служить для защиты против нуклеазного расщепления в областях нуклеозидов ДНК или РНК в олигонуклеотиде по изобретению, например в пределах области гэпа (gap) гэпмерного олигонуклеотида, а также в областях модифицированных нуклеозидов.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит одну или более чем одну межнуклеозидную связь, модифицированную от природного фосфодиэфира до связи, которая, например, является более устойчивой к нуклеазной атаке. Устойчивость к нуклеазе можно определять посредством инкубирования олигонуклеотида в сыворотке крови или посредством применения анализа устойчивости к нуклеазе (например, фосфодиэстеразе яда змеи (SVPD)), которые оба хорошо известны в данной области. Межнуклеозидные связи, которые способны усиливать устойчивость олигонуклеотида к нуклеазе, называются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. Будет понятно то, что в некоторых воплощениях нуклеозиды, которые связывают олигонуклеотид по изобретению с ненуклеотидной функциональной группой, такой как конъюгат, могут содержать фосфодиэфир. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями.

Модифицированные межнуклеозидные связи могут быть выбраны из группы, содержащей фосфоротиоат, дифосфоротиоат и боранофосфат. В некоторых воплощениях модифицированные межнуклеозидные связи, например, фосфоротиоатная, дифосфоротиоатная или боранофосфатная, являются совместимыми с рекрутированием олигосахаридом по изобретению РНКазы Н.

В некоторых воплощениях межнуклеозидная связь, такая как фосфоротиоатная межнуклеозидная связь, содержит серу (S).

Фосфоротиоатная межнуклеозидная связь является особенно полезной из-за устойчивости к нуклеазе, полезной фармакокинетики и легкости получения. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат, как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит одну или более чем одну нейтральную межнуклеозидную связь, в частности, межнуклеозидную связь, выбранную из фосфотриэфира, метилфосфоната, MMI, амида-3, формацеталя или тиоформацеталя.

Дополнительные межнуклеозидные связи раскрываются в WO2009/124238 (включенной в данный документ посредством ссылки). В одном воплощении межнуклеозидная связь выбрана из линкеров, раскрытых в WO2007/031091 (включенной в данный документ посредством ссылки). В частности, межнуклеозидная связь может быть выбрана из -O-P(O)₂-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, -S-P(O)₂-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)₂-O-, -O-P(O)₂-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)₂-S-, -O-PO(R^H)-O-, 0-PO(OCH₃)-0-, -O-PO(NR^H)-O-, -O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-, -O-PO(BH₃)-O-, -O-PO(NHR^H)-O-, -O-P(O)₂-NR^H-, -NR^H-P(O)₂-O-, -NR^H-CO-O-, -NR^H-CO-NR^H-, и/или межнуклеозидный линкер может быть выбран из группы, состоящей: -O-CO-O-, -O-CO-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-, -O-CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -CO-NR^H-CH₂-, -CH₂-NR^HCO-, -O-CH₂-CH₂-S-, -S-CH₂-CH₂-O-, -S-CH₂-CH₂-S-, -CH₂-SO₂-CH₂-, -CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-CO -, -CH₂-NCH₃-O-CH₂-, где R^H выбран из водорода и C1-4-алкила.

Нуклеазоустойчивые связи, такие как фосфотиоатные связи, являются особенно полезными в областях олигонуклеотидов, способных рекрутировать нуклеазу, при формировании дуплекса с нуклеиновой кислотой-мишенью, таких как область G для гэпмеров или немодифицированная область нуклеозидов хэдмеров (headmer) и тэйлмеров (tailmer). Однако, фосфоротиоатные связи могут быть также полезными в областях, не рекрутирующих нуклеазу, и/или в областях, усиливающих аффинность, таких как области F и F' для гэпмеров, или в области модифицированных нуклеозидов хэдмеров и тэйлмеров.

Каждая из сконструированных областей может, однако, содержать межнуклеозидные связи, отличные от фосфоротиоатных, такие как фосфодиэфирные связи, в частности, в областях, где модифицированные нуклеозиды, такие как LNA (запертые нуклеиновые кислоты), защищают связь от нуклеазной деградации. Включение фосфодиэфирных связей, как, например, одной или двух связей, в частности между или рядом с модифицированными нуклеозидными звеньями (типично в областях, не рекрутирующих нуклеазу), может модифицировать биодоступность и/или биораспределение олигонуклеотида - см. WO2008/113832, включенную в данный документ посредством ссылки.

В одном воплощении все межнуклеозидные связи в олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. Предпочтительно все межнуклеозидные связи в олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные связи.

Нуклеиновое основание

Нуклеиновое основание включает пуриновую (например, аденин и гуанин) и пиримидиновую (например, урацил, тимин и цитозин) группировку, присутствующую в нуклеозидах и нуклеотидах, которые образуют водородные связи при гибридизации нуклеиновых кислот. В контексте настоящего изобретения термин нуклеиновое основание также охватывает модифицированные нуклеиновые основания, которые могут отличаться от встречающихся в природе нуклеиновых оснований, но являются функциональными во время гибридизации нуклеиновых кислот. В данном контексте термин «нуклеиновое основание» относится и к встречающимся в природе нуклеиновым основаниям, таким как аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин, также как и к не встречающимся в природе вариантам. Такие варианты, например, описываются в Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.

В некоторых воплощениях группировка нуклеинового основания модифицируется заменой пурина или пиримидина на модифицированный пурин или пиримидин, такой как замещенный пурин или замещенный пиримидин, как, например, нуклеиновое основание, выбранное из изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-метилцитозина, 5-тиозолоцитозина, 5-пропинилцитозина, 5-пропинилурацила, 5-бромурацил-5-тиазолоурацила, 2-тиоурацила, 2'-тиотимидина, инозина, диаминопурина, 6-аминопурина, 2-аминопурина, 2,6-диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина.

Группировки нуклеиновых оснований могут быть указаны буквенным кодом для каждого соответствующего нуклеинового основания, например, A, T, G, C или U, где каждая буква возможно может включать модифицированные нуклеиновые основания с эквивалентной функцией. Например, в проиллюстрированных в качестве примеров олигонуклеотидах группировки нуклеиновых оснований выбраны из A, T, G, C и 5-метилцитозина. Возможно для гэпмеров LNA можно использовать 5-метилцитозин нуклеозидов LNA.

Модифицированный олигонуклеотид

Термин «модифицированный олигонуклеотид» описывает олигонуклеотид, содержащий один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром и/или модифицированными межнуклеозидными связями. Термин «химерный олигонуклеотид» представляет собой термин, который использовали в литературе для описания олигонуклеотидов с модифицированными нуклеозидами.

Комплементарность

Термин «комплементарность» описывает способность нуклеозидов/нуклеотидов к образованию пар оснований по Уотсону-Крику. Парами оснований по Уотсону-Крику являются гуанин (G)-цитозин (С) и аденин (А)-тимин (Т)/урацил (U). Будет понятно то, что олигонуклеотиды могут содержать нуклеозиды с модифицированными нуклеиновыми основаниями, например, 5-метилцитозин часто используется вместо цитозина, и термин «комплементарность» как таковой охватывает образование пар оснований по Уотсону-Крику между немодифицированными и модифицированными нуклеиновыми основаниями (см., например, Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).

Термин «% комплементарности» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к числу нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, в олигонуклеотиде) в процентах, которые, в данном положении, являются комплементарными (т.е. образуют пары оснований по Уотсону-Крику) в данном положении непрерывной нуклеотидной последовательности отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты-мишени). Данная процентная доля рассчитывается подсчетом числа выровненных оснований, которые образуют пары между двумя последовательностями (при выравнивании с использованием последовательности-мишени 5'-3' и последовательности олигонуклеотида от 3' к 5'), деля на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100. При таком сравнении нуклеиновое основание/нуклеотид, который не выравнивается (не образует пару оснований), называется несоответствием.

Термин «полностью комплементарный» относится к 100%-ной комплементарности.

Следующее представляет собой пример олигонуклеотида (SEQ ID NO: 5), который является полностью комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени (SEQ ID NO: 772).

5'gcagtagagccaatta3' (SEQ ID NO:772)

3'cgtcatctcggttaat5' (SEQ ID NO: 5)

Идентичность

Термин «идентичность» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к числу нуклеотидов в процентах непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, в олигонуклеотиде), которые в данном положении являются идентичными (т.е. по их способности образовать пары оснований по Уотсону-Крику с комплементарным нуклеозидом) непрерывной нуклеотидной последовательности в данном положении отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты-мишени). Данная процентная доля рассчитывается посредством подсчета числа выровненных оснований, которые являются идентичными между двумя последовательностями, включая пробелы, деля на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100.

Процент идентичности = (Соответствия × 100)/Длину выровненной области (с пробелами).

Гибридизация

Термин «осуществление гибридизации» или «гибридизуется» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как две нити нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-мишень), образующие водородные связи между парами оснований на противоположных нитях, формируя, посредством этого, дуплекс. Аффинность связывания между двумя нитями нуклеиновой кислоты представляет собой силу гибридизации. Она часто описывается в показателях температуры плавления (T_m), определенной как температура, при которой половина олигонуклеотидов образует дуплекс с нуклеиновой кислотой-мишенью. При физиологических условиях T_m не является строго пропорциональной аффинности (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). Свободная энергия Гиббса в стандартном состоянии - ΔG° - является более точным представлением аффинности связывания и связана с константой диссоциации (K_d) реакции согласно уравнению ΔG° = -RTln(K_d), где R представляет собой газовую постоянную, и Т представляет собой абсолютную температуру. Следовательно, очень низкая ΔG° реакции между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью отражает сильную гибридизацию между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью. ΔG° представляет собой энергию, связанную с реакцией, где концентрации в воде составляют 1 М, рН составляет 7, и температура составляет 37°С. Гибридизация олигонуклеотидов с нуклеиновой кислотой-мишенью представляет собой спонтанную реакцию, и для спонтанных реакций ΔG° меньше, чем ноль. ΔG° можно измерять экспериментально, например, посредством применения способа изотермической титрационной калориметрии (ITC), как описано в Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 и Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. Специалисту будет известно, что доступно имеющееся в продаже оборудование для измерений ΔG°. ΔG° также можно оценивать численно посредством применения модели ближайшего соседа, как описывается SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465, с использованием подходящим образом выведенных термодинамических параметров, описанных Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 и McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Для того чтобы иметь возможность модулирования их намеченной нуклеиновой кислоты-мишени посредством гибридизации, олигонуклеотиды по настоящему изобретению гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше -41,8 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 10-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях степень или сила гибридизации измеряется посредством свободной энергии Гиббса в стандартном состоянии - ΔG°. Олигонуклеотиды могут гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше интервала -41,8 кДж, как, например, меньше -62,8 кДж, как, например, меньше -83,7 кДж и как, например, меньше -104,6 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 8-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочным значением ΔG° от -41,8 до -251 кДж, как, например, от -50,2 до -167,4 кДж, как, например, от -62,8 до -125,5 кДж или от -66,9 до 113 кДж, как, например, от -75,3 до -104,6 кДж.

Нуклеиновая кислота-мишень

Согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота-мишень представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует PD-L1 млекопитающего и может представлять собой, например, ген, РНК, мРНК и пре-мРНК, зрелую мРНК или последовательность кДНК. Следовательно, данная мишень может называться нуклеиновая кислота-мишень PD-L1. Олигонуклеотид по изобретению, например, может быть нацелен на области экзонов PD-L1 млекопитающего, или, например, может быть нацелен на область интрона пре-мРНК PD-L1 (см. Таблицу 1).

Таблица 1: экзоны и интроны человеческого PD-L1

Экзонные области в пре-мРНК человеческого PD-L1 (SEQ ID NO 1)	Интронные области в пре-мРНК человеческого PD-L1 (SEQ ID NO 1)
ID	начало	конец	ID	начало	конец
e1	1	94	i1	95	5597
e2	5598	5663	i2	5664	6576
e3	6577	6918	i3	6919	12331
e4	12332	12736	i4	12737	14996
e5	14997	15410	i5	15411	16267
e6	16268	16327	i6	16328	17337
e7	17338	20064

Подходящим образом, нуклеиновая кислота-мишень кодирует белок PD-L1, в частности PD-L1 млекопитающего, такой как PD-L1 человека (см., например, Таблицы 2 и 3, в которых приводится ссылка на последовательности мРНК и пре-мРНК для человеческого, обезьяньего и мышиного PD-L1). В контексте настоящего изобретения пре-мРНК также считается нуклеиновой кислотой, которая кодирует белок.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2 и 3 или их встречающихся в природе вариантов (например, последовательностей, кодирующих белок PD-L1 млекопитающего).

При использовании олигонуклеотида по изобретению в исследовании или диагностике нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой кДНК или синтетическую нуклеиновую кислоту, происходящую из ДНК или РНК.

Для применения in vivo или in vitro олигонуклеотид по изобретению типично способен ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени PD-L1 в клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту-мишень PD-L1. Непрерывная последовательность нуклеиновых оснований олигонуклеотида по изобретению типично комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1 при измерении по длине олигонуклеотида, возможно, за исключением одного или двух несоответствий, и, возможно, исключая линкерные области на основе нуклеотидов, которые могут связывать олигонуклеотид с возможной функциональной группой, такой как конъюгат или другие некомплементарные концевые нуклеотиды (например, область D' или D''). Нуклеиновая кислота-мишень в некоторых воплощениях может представлять собой РНК или ДНК, такую как матричная РНК, как, например, зрелая мРНК или пре-мРНК. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК или ДНК, которая кодирует белок PD-L1 млекопитающего, такой как человеческий PD-L1, например, последовательность пре-мРНК человеческого PD-L1, такую как последовательность, раскрытая как SEQ ID NO 1, или последовательность человеческой мРНК с регистрационным номером NM_014143 NCBI (Национальный центр биотехнологической информации). Дополнительная информация по типичым нуклеиновым кислотам-мишеням приводится в Таблицах 2 и 3.

Таблица 2: информация по геному и сборке для PD-L1 между видами.

Вид	Хр.	Нить	Геномные координаты	Сборка	Номер доступа мРНК эталонной последователь-ности NCBI*
Начало	Конец
Человек	9	прям.	5450503	5470566	GRCh38: CM000671.2	NM_014143
Яванский макак	15		73560846	73581371	GCF_ 000364345.1	XM_005581779
Мышь	19	прям.	29367455	29388095	GRCm38: CM001012.2	NM_021893

Прям. - прямая нить. Геномные координаты дают последовательность пре-мРНК (геномная последовательность). Ссылка NCBI дает последовательность мРНК (последовательность кДНК).

* База данных эталонных последовательностей Национального центра биотехнологической информации представляет собой всеохватывающий, интегрированный, неизбыточный, хорошо аннотированный набор эталонных последовательностей, включающих геномные, последовательности транскриптов и белков. Она размещается на www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq.

Таблица 3: подробности последовательностей для PD-L1 между видами.

Вид	Тип РНК	Длина (нт)	SEQ ID NO
Человек	пре-мРНК	20064	1
Яванский макак	пре-мРНК ссылка GCF	20261	2
Яванский макак	пре-мРНК Внутренняя	20340	3
Мышь	пре-мРНК	20641	4

Последовательность-мишень

Термин «последовательность-мишень» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к последовательности нуклеотидов, присутствующей в нуклеиновой кислоте-мишени, которая содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая является комплементарной олигонуклеотиду по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность-мишень состоит из области на нуклеиновой кислоте-мишени, которая является комплементарной непрерывной нуклеотидной последовательности олигонуклеотида по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность-мишень длиннее, чем комплементарная последовательность одного олигонуклеотида, и, например, может представлять предпочтительную область нуклеиновой кислоты-мишени, на которую могут быть нацелены несколько олигонуклеотидов по изобретению.

Последовательность-мишень может представлять собой подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени.

В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из а1-а149 (см. Таблицы 4). В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из экзона мРНК PD-L1, такого как экзон человеческой мРНК PD-L1, выбранный из группы, состоящей из e1, e2, e3, e4, e5, e6 и e7 (см. Таблицу 1 выше).

В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из интрона мРНК PD-L1, такого как интрон человеческой мРНК PD-L1, выбранный из группы, состоящей из i1, i2, i3, i4, i5 и i6 (см. Таблицу 1 выше).

Олигонуклеотид по изобретению содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной или гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, такой как подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени, такой как последовательность-мишень, описанная в данном документе.

Данный олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из по меньшей мере 8 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется с последовательностью-мишенью, присутствующей в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени. Непрерывная нуклеотидная последовательность (и, следовательно, последовательность-мишень) содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеотидов, как, например, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеотидов, как, например, 12-25, как, например, 14-18 смежных нуклеотидов.

Клетка-мишень

Термин «клетка-мишень» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых воплощениях клетка-мишень может находиться в условиях in vivo или in vitro. В некоторых вопощениях клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка грызуна, как, например, клетка мыши или клетка крысы, или клетку примата, как, например, клетка обезьяны или клетка человека.

В предпочтительных воплощениях клетка-мишень экспрессирует мРНК PD-L1, такую как пре-мРНК PD-L1 или зрелая мРНК PD-L1. Поли А хвост мРНК PD-L1 типично не принимается во внимание для нацеливания антисмыслового олигонуклеотида.

Вариант, встречающийся в природе

Термин «вариант, встречающийся в природе» относится к вариантам гена PD-L1 или транскриптам, которые происходят из тех же самых генетических локусов, что и нуклеиновая кислота-мишень, но могут отличаться, например, за счет вырожденности генетического кода, вызывающей множественность кодонов, кодирующих ту же самую аминокислоту, или благодаря альтернативному сплайсингу пре-мРНК, или присутствию полиморфизмов, таких как однонуклеотидные полиморфизмы и аллельные варианты. На основе присутствия достаточно комплементарной последовательности к олигонуклеотиду, олигонуклеотид по изобретению, следовательно, может быть нацелен на нуклеиновую кислоту-мишень и ее встречающиеся в природе варианты.

В некоторых воплощениях встречающиеся в природе варианты имеют по меньшей мере 95%, как, например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1 млекопитающего, такой как нуклеиновая кислота-мишень, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO 1, 2 и 3.

В гене PD-L1 известны многочисленные однонуклеотидные полиморфизмы, например, однонуклеотидные полиморфизмы, раскрытые в следующей таблице (начало/эталонная последовательность человеческой пре-мРНК представляет собой SEQ ID NO 2).

Название варианта	Варианты аллелей	Минорный аллель	Частота минорного аллеля	Начало на SEQ ID NO: 1
rs73397192	G/A	A	0,10	2591
rs12342381	A/G	G	0,12	308
rs16923173	G/A	A	0,13	14760
rs2890658	C/A	A	0,16	14628
rs2890657	G/C	C	0,21	2058
rs3780395	A/G	A	0,21	14050
rs147367592	AG/-	-	0,21	13425
rs7023227	T/C	T	0,22	6048
rs2297137	G/A	A	0,23	15230
rs1329946	G/A	A	0,23	2910
rs5896124	-/G	G	0,23	2420
rs61061063	T/C	C	0,23	11709
rs1411263	T/C	C	0,23	8601
rs59906468	A/G	G	0,23	15583
rs6476976	T/C	T	0,24	21012
rs35744625	C/A	A	0,24	3557
rs17804441	T/C	C	0,24	7231
rs148602745	C/T	T	0,25	22548
rs4742099	G/A	A	0,25	20311
rs10815228	T/C	C	0,25	21877
rs58817806	A/G	G	0,26	20769
rs822342	T/C	T	0,27	3471
rs10481593	G/A	A	0,27	7593
rs822339	A/G	A	0,28	2670
rs860290	A/C	A	0,28	2696
rs822340	A/G	A	0,28	2758
rs822341	T/C	T	0,28	2894
rs12002985	C/G	C	0,28	6085
rs822338	C/T	C	0,28	1055
rs866066	C/T	T	0,28	451
rs6651524	A/T	T	0,28	8073
rs6415794	A/T	A	0,28	8200
rs4143815	G/C	C	0,28	17755
rs111423622	G/A	A	0,28	24096
rs6651525	C/A	A	0,29	8345
rs4742098	A/G	G	0,29	19995
rs10975123	C/T	T	0,30	10877
rs2282055	T/G	G	0,30	5230
rs4742100	A/C	C	0,30	20452
rs60520638	-/TC	TC	0,30	9502
rs17742278	T/C	C	0,30	6021
rs7048841	T/C	T	0,30	10299
rs10815229	T/G	G	0,31	22143
rs10122089	C/T	C	0,32	13278
rs1970000	C/A	C	0,32	14534
rs112071324	AGAGAG/-	AGAGAG	0,33	16701
rs2297136	G/A	G	0,33	17453
rs10815226	A/T	T	0,33	9203
rs10123377	A/G	A	0,36	10892
rs10123444	A/G	A	0,36	11139
rs7042084	G/T	G	0,36	7533
rs10114060	G/A	A	0,36	11227
rs7028894	G/A	G	0,36	10408
rs4742097	C/T	C	0,37	5130
rs1536926	G/T	G	0,37	13486
rs1411262	C/T	T	0,39	8917
rs7041009	G/A	A	0,45	12741

Модуляция экспрессии

Термин «модуляция экспрессии» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как общий термин для способности олигонуклеотида изменять количество PD-L1 по сравнению с количеством PD-L1 до введния данного олигонуклеотида. В качестве альтернативы, модуляцию экспрессии можно определять посредством ссылки на контрольный экспермент. Обычно понятно то, что контроль представляет собой индивида или клетку-мишень, обработанную композицией физиологического раствора, или индивида или клетку-мишень, обработанную ненацеленым олигонуклеотидом (имитация). Однако он также может представлять собой индивида, которого лечили стандартом лечения.

Одним типом модуляции является способность олигонуклеотида ингибировать, осуществлять понижающую регуляцию, уменьшать, подавлять, удалять, останавливать, блокировать, предотвращать, ослаблять, снижать, устранять или прекращать экспрессию PD-L1, например, посредством деградации мРНК или блокировки транскрипции. Другим типом модуляции является способность олигонуклеотида восстанавливать, увеличивать или усиливать экспрессию PD-L1, например, посредством репарации сайтов сплайсинга или предотвращения сплайсинга, или устранения или блокировки ингибирующих механизмов, таких как репрессия микроРНК.

Высокоаффинные модифицированные нуклеозиды

Высокоаффинный модифицированный нуклеозид преставляет собой модифицированный нуклеотид, который, при включении в олигонуклеотид, увеличивает аффинность олигонуклеотида в отношении его комплементарной мишени, например, при измерении по температуре плавления (T^m). Высокоаффинный модифицированный нуклеозид по настоящему изобретению предпочтительно приводит к увеличению температуры плавления от +0,5 до +12°С, более предпочтительно - от +1,5 до +10°С, и наиболее предпочтительно - от +3 до +8°С на модифицированный нуклеозид. В данной области известны многочисленные высокоаффинные модифицированные нуклеозиды, и они включают, например, многие 2'-замещенные нуклеозиды, а также запертые нуклеиновые кислоты (LNA) (см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 и Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).

Модификации сахара

Олигомер по изобретению может содержать один или более чем один нуклеозид, который имеет модифицированную сахарную группировку, т.е. модификацию сахарной группировки по сравнению с рибозной сахарной группировкой, находящейся в ДНК и РНК.

Были получены многочисленные нуклеозиды с модификацией рибозной сахарной группировки, главным образом, с целью улучшения определенных свойств олигонуклеотидов, таких как аффинность и/или нуклеазоустойчивость.

Такие модификации включают модификации, где модифицируется структура рибозного кольца, например, посредством замены на гексозное кольцо (HNA) или бициклическое кольцо, которое типично имеет бирадикальный мостик между углеродами С2 и С4 на рибозном кольце (LNA), или на несвязанное рибозное кольцо, у которого типично отсутствует связь между углеродами С2 и С3 (например, UNA). Другие нуклеозиды с модифицированным сахаром включают, например, бициклогексозные нуклеиновые кислоты (WO2011/017521) или трициклические нуклеиновые кислоты (WO 2013/154798). Модифицированные нуклеозиды также включают нуклеозиды, где сахарная группировка заменяется на несахарную группировку, например, в случае пептидных нуклеиновых кислот (PNA) или морфолинонуклеиновых кислот.

Модификации сахаров также включают модификации, сделанные посредством изменения замещающих групп на рибозном кольце на группы, отличные от водорода, или группы 2'-OH, находящейся в природе в нуклеозидах ДНК и РНК. Заместители, например, можно вводить в 2'-, 3'-, 4'- или 5'-положения. Нуклеозиды с модифицированными сахарными группировками также включают 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В самом деле, значительное внимание было потрачено на разработку 2'-замещенных нуклеозидов, и было обнаружено то, что многочисленные 2'-замещенные нуклеозиды имеют полезные свойства при включении в олигонуклеотиды, такие как повышенная устойчивость нуклеозидов и повышенная аффинность.

2'-Модифицированные нуклеозиды

Нуклеозид с 2'-модифицированным сахаром представляет собой нуклеозид, который имеет в положении 2' заместитель, отличный от Н или -ОН (2'-замещенный нуклеозид) или содержит 2'-связанный бирадикал и включает 2'-замещенные нуклеозиды и нуклеозиды LNA (связанные 2'-4' бирадикальным мостиком). Например, 2'-модифицированный сахар может обеспечивать повышенную аффинность связывания и/или повышенную нуклеазоустойчивость олигонуклеотида. Примерами 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов являются 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-фтор-ANA (F-ANA) нуклеозид. Относительно дополнительных примеров, пожалуйста, см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 и Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Ниже приводятся иллюстрации некоторых 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов.

Нуклеозиды запертых нуклеиновых кислот (LNA)

Нуклеозиды LNA представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые содержат линкерную группу (именуемую бирадикал или мостик) между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеотида. Данные нуклеозиды также называются в литературе мостиковой нуклеиновой кислотой или бициклической нуклеиновой кислотой (BNA).

В некоторых воплощениях модифицированный нуклеозид или нуклеозиды LNA олигомера по изобретению имеют общую структуру формулы I или II:

где W выбран из -O-, -S-, -N(R^a)-, -C(R^aR^b)-, таким образом, что в некоторых воплощениях -О-; В обозначает нуклеиновое основание или модифицированную группировку нуклеинового основания;

Z обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 5'-концевую группу;

Z* обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 3'-концевую группу;

Х обозначает группу, выбранную из списка, состоящего из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -O-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях Х выбран из группы, состоящей из: -O-, -S-, NH-, NR^aR^b, -CH₂-, CR^aR^b, -C(=CH₂)- и -C(=CR^aR^b)-.

В некоторых воплощениях Х представляет собой -О-.

Y обозначает группу, выбранную из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -O-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -CH₂-, -C(R^aR^b)-, -CH₂CH₂-, -C(R^aR^b)-C(R^aR^b)-, -CH₂CH₂CH₂-, -C(R^aR^b)C(R^aR^b)C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)- и -C(R^a)=N-.

В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -CH₂-, -CHR^a-, -CHCH₃-, CR^aR^b-.

или -Х-Y- совместно обозначают двухвалентную линкерную группу (также именуемую радикал), состоящую из 1, 2, 3 или 4 групп/атомов, выбранных из группы, состоящей из -C(R^aR^b)-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -O-, -Si(R^a)₂-, -S-, -SO₂-, -N(R^a)- и >C=Z.

В некоторых воплощениях -Х-Y- обозначает бирадикал, выбранный из групп, состоящих из: -X-CH₂-, -X-CR^aR^b-, -X-CHR^a-, -X-C(HCH₃)^-, -O-Y-, -O-CH₂-, -S-CH₂-, -NH-CH₂-, -O-CHCH₃-, -CH₂-O-CH₂, -O-CH(CH₃CH₃)-, -O-CH₂-CH₂-, OCH₂-CH₂-CH₂-,-O-CH₂OCH₂-, -O-NCH₂-, -C(=CH₂)-CH₂-, -NR^a-CH₂-, N-O-CH₂, -S-CR^aR^b- и -S-CHR^a-.

В некоторых воплощениях -Х-Y- обозначает -O-CH₂- или -O-CH(CH₃)-,

где Z выбран из -О-, -S- и -N(R^a)-,

и R^a, и, при наличии R^b, каждый независимо выбран из водорода, возможно замещенного С_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного С_2-6-алкинила, гидрокси, возможно замещенного С_1-6-алкокси, С_2-6-алкоксиалкила, С_2-6-алкенилокси, карбокси, С_1-6-алкоксикарбонила, С_1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-карбонила, амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, С_1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, С_1-6-алканоилокси, сульфоно, С_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С_1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя R^a и R^b могут вместе обозначать возможно замещенный метилен (=СН₂), где для всех хиральных центров асимметрические группы могут находиться либо в R, либо в S ориентации,

где R¹, R², R³, R⁵ и R^5* независимо выбраны из группы, состоящей из: водорода, возможно замещенного С_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного С_2-6-алкинила, гидрокси, С_1-6-алкокси, С_2-6-алкоксиалкила, С_2-6-алкенилокси, карбокси, С_1-6-алкоксикарбонила, С_1-6-алкилкарбонила, формила, арила, арилокси-карбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилокси-карбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С_1-6-алкил)-амино-карбонила, амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино-С_1-6-алкил-аминокарбонила, С_1-6-алкил-карбониламино, карбамидо, С_1-6-алканоилокси, сульфоно, С_1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С_1-6-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя могут вместе обозначать оксо, тиоксо, имино или возможно замещенный метилен.

В некоторых воплощениях R¹, R², R³, R⁵ и R^5* независимо выбраны из С_1-6-алкила, такого как метил, и водорода.

В некоторых воплощениях все R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода.

В некоторых воплощениях все R¹, R², R³ представляют собой атомы водорода, и либо R⁵, либо R^5* также представляет собой атом водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, представляет собой С_1-6-алкил, такой как метил.

В некоторых воплощениях R^а представляет собой либо атом водорода, либо метил. В некоторых воплощениях R^b, при наличии, представляет собой либо атом водорода, либо метил.

В некоторых воплощениях один или оба из R^а и R^b представляют собой атом водорода.

В некоторых воплощениях один из R^а и R^b представляет собой атом водорода, а другой отличается от атома водорода.

В некоторых воплощениях один из R^а и R^b представляет собой метил, а другой представляет собой атом водорода.

В некоторых воплощениях оба из R^а и R^b представляют собой метил.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН₂-, W представляет собой О, и все R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 и WO 2004/046160, которые все включены в данный документ посредством ссылки, и они включают то, что обычно известно как нуклеозиды бета-О-окси LNA и альфа-L-окси LNA.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые включены тем самым посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -NH-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды амино LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН₂-СН₂- или -О-СН₂-СН₂-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 00/047599 и Morita et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76, которые тем самым включены посредством ссылки, и включают то, что обычно известно как нуклеиновые кислоты, связанные 2'-O-4'C-этиленовым мостиком (ENA).

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН₂-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³ и один из R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, С_1-6алкил, такой как метил. Такие 5'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO2007/134181, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CR^aR^b, где один или оба из R^a и R^b отличаются от атома водорода, как, например, метил, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³ и один из R⁵ и R^5* представляют собой атом водорода, а другой из R⁵ и R^5* отличается от атома водорода, как, например, С_1-6алкил, такой как метил. Такие бис-модифицированные нуклеозиды LNA раскрыты в WO2010/077578, которая тем самым включена в данный документ посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CH₂OCH₃)- (2'O-метоксиэтилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CH₂CH₃) - (2'O-этилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CНR^a, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 10036698 и WO 07090071, которые обе тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CН(СН₂ОСН₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA также известны в данной области как циклические МОЕ (сМОЕ) и раскрыты в WO 07090071.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CH₃)- либо в R-, либо в S-конфигурации. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH₂-O-CH₂- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CН(СН₃)-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-метилнуклеозиды LNA также известны в данной области как сЕТ нуклеозиды и могут представлять собой либо (S)cET, либо (R)cET стереоизомеры, как раскрыто в WO 07090071 (бета-D) и WO 2010/036698 (альфа-L), которые оба тем самым включены посредством ссылки).

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CR^aR^b-, в котором ни один из R^a или R^b не является атомом водорода, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях и R^a, и R^b представляют собой метил. Такие 6'-двухзамещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2009006478, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-CHR^a-, W представляет собой О, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 11156202, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях 6'-замещенных тио LNA R^a представляет собой метил.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -C(=CH2)-C(R^aR^b)-, как, например, -C(=CH₂)-CH₂- или -C(=CH₂)-CH(CH₃)-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды винилкарбо LNA раскрыты в WO 08154401 и WO 09067647, которые обе тем самым включены посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(-OR^a)-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как N-замещенные LNA и раскрываются в WO 2008/150729, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-NR^a-CH₃- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(R^a)-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил.

В некоторых воплощениях один или оба из R⁵ и R^5* представляют собой атом водорода, и, при замещении, другой из R⁵ и R^5* представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. В таком воплощении все из R¹, R², R³ могут представлять собой атомы водорода, и бирадикал -X-Y- может быть выбран из -O-CH2- или -O-C(HCR^a)-, такого как -O-C(HCH3)-.

В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -CR^aR^b-O-CR^aR^b-, такой как CH₂-O-CH₂-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как конформационно ограниченные нуклеотиды (CRN) и раскрываются в WO 2013036868, которая тем самым включена посредством ссылки.

В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -O-CR^aR^b-O-CR^aR^b-, такой как O-CH₂-O-CH₂-, W представляет собой O, и все из R¹, R², R³, R⁵ и R^5* представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R^a представляет собой C_1-6алкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как нуклеотиды СОС и раскрываются в Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238, которая тем самым включена посредством ссылки.

Будет понятно то, что, если не определено, нуклеозиды LNA могут находиться в бета-D или альфа-L стереоизоформе.

Некоторые примеры нуклеозидов LNA представлены на Схеме 1.

Схема 1

Как проиллюстрировано в Примерах, в предпочтительных воплощениях изобретения нуклеозиды LNA в олигонуклеотидах представляют собой нуклеозиды бета-D-окси-LNA.

Деградация, опосредованная нуклеазой

Термин «деградация, опосредованная нуклеазой» относится к олигонуклеотиду, способному опосредовать деградацию комплементарной нуклеотидной последовательности при образовании дуплекса с такой последовательностью.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид может функционировать посредством деградации нуклеиновой кислоты-мишени, опосредованной нуклеазой, где олигонуклеотиды по изобретению способны рекрутировать нуклеазу, в частности, эндонуклеазу, предпочтительно эндорибонуклеазу (РНКазу), такую как РНКаза Н. Примерами конструкций олигонуклеотидов, которые работают посредством механизмов, опосредованных нуклеазой, являются олигонуклеотиды, которые типично содержат область из по меньшей мере 5 или 6 нуклеозидов ДНК и фланкированы на одной стороне или на обеих сторонах нуклеозидами, увеличивающими аффинность, например, гэпмеры, хэдмеры и тэйлмеры.

Активность и рекрутирование РНКазы Н

Термин «активность РНКазы Н антисмыслового олигонуклеотида» относится к его способности при нахождении в дуплексе с комплементарной молекулой РНК рекрутировать РНКазу Н. В WO 01/23613 предложены способы in vitro для определения активности РНКазы Н, которые можно использовать для определения способности рекрутировать РНКазу Н. Типично олигонуклеотид считается способным рекрутировать РНКазу Н, если он, при предоставлении с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, имеет исходную скорость, измеренную в пмоль/л/мин, по меньшей мере 5%, как, например, по меньшей мере 10% или больше, чем 20% от исходной скорости, определенной при использовании олигонуклеотида, имеющего такую же последовательность оснований, что и тестируемый модифицированный олигонуклеотид, но содержащего только мономеры ДНК с фосфоротиоатными связями между всеми мономерами в олигонуклеотиде, и с использованием методологии, предложенной в Примерах 91-95 WO 01/23613 (включенной тем самым посредством ссылки).

Гэпмер

Термин «гэпмер» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит область олигонуклеотидов (гэп), рекрутирующую РНКазу Н, которая фланкирована 5' и 3' областями (фланги или крылья), которые содержат один или более чем один модифицированный нуклеозид, усиливающий аффинность. В данном документе описываются разные конструкции гэпмеров, и они характеризуются по их способности рекрутировать РНКазу Н. Хэдмеры и тэйлмеры представляют собой олигонуклеотиды, способные рекрутировать РНКазу Н, где отсутствует один из флангов, т.е. только один из концов олигонуклеотида содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность. Для хэдмеров отсутстует 3'-фланг (т.е. 5'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность), и для тэйлмеров отсутстует 5'-фланг (т.е. 3'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность).

Гэпмер LNA

Термин «гэпмер LNA» относится к гэпмерному олигонуклеотиду, в котором по меньшей мере один из модифицированных нуклеозидов, усиливающих аффинность, представляет собой нуклеозид LNA.

Гэпмер со смешанными крыльями

Термин «гэпмер со смешанными крыльями» или «гэпмер со смешанными флангами» относится к гэпмеру LNA, в котором по меньшей мере одна фланговая область содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, не являющийся LNA, такой как по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, такой как, например, нуклеозид(ды) 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-F-ANA. В некоторых воплощениях гэпмер со смешанными крыльями имеет один фланг, который содержит только нуклеозиды LNA (например, 5' или 3'), и другой фланг (3' или 5' соответственно) содержит 2'-замещенный(ные) модифицированный(ные) нуклеозид(ды) и возможно нуклеозиды LNA.

Олигонуклеотид с разорванным гэпом

Термин «олигонуклеотид с разорванным гэпом» используется по отношению к гэпмеру, способному поддерживать рекрутирование РНКазы Н, даже несмотря на то, что область гэпа разрывается нуклеозидом, не рекрутирующим РНКазу Н (нуклеозидом, разрывающим гэп, Е), таким образом, что область гэпа содержит меньше, чем 5 последовательных нуклеозидов ДНК. Нуклеозиды, не рекрутирующие РНКазу Н, представляют собой, например, нуклеозиды в 3'-эндоконформации, такие как LNA, где мостик между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеозида находится в бета-конформации, как, например, нуклеозид бета-D-окси LNA или ScET. Способность олигонуклеотида с разорванным гэпом рекрутировать РНКазу Н типично является специфичной в отношении последовательности или даже соединения - см. Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487, в которой раскрыты «олигонуклеотиды с разорванным гэпом», которые рекрутируют РНКазу Н, которые в некоторых случаях обеспечивает более специфичное расщеплениее РНК-мишени.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению представляет собой олигонуклеотид с разорванным гэпом. В некоторых воплощениях олигонуклеотид с разорванным гэпом содержит 5'-фланг (F), гэп (G) и 3'-фланг (F'), где гэп разорван нуклеозидом, не рекрутирующим РНКазу Н (нуклеозидом, разрывающим гэп, Е), таким образом, что гэп содержит по меньшей мере 3 или 4 последовательных нуклеозида ДНК. В некоторых воплощениях нуклеозид, разрывающий гэп (Е), представляет собой нуклеозид LNA, где мостик между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеозида находится в бета-конформации, и он размещается в пределах области гэпа таким образом, что нуклеозид LNA, разрывающий гэп, фланкирован 5' и 3' по меньшей мере 3(5') и 3(3') или по меньшей мере 3(5') и 4(3'), или по меньшей мере 4(5') и 3(3') нуклеозидами ДНК, и где данный олигонуклеотид способен рекрутировать РНКазу Н.

Олигонуклеотид с разорванным гэпом может быть представлен следующими формулами:

F-G-E-G-F'; в частности F_1-7-G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7

D'-F-G-F', в частности D'_1-3-F_1-7- G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7

F-G-F'-D'', в частности F_1-7- G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7-D''_1-3

D'-F-G-F'-D'', в частности D'_1-3-F_1-7- G_3-4-E₁-G_3-4-F'_1-7-D''_1-3

Где области D' и D'' являются такими, как описано в разделе «Конструкция гэпмера».

В некоторых воплощениях нуклеозид, разрывающий гэп (Е), представляет собой бета-D-окси LNA или ScET, или другие нуклеозиды бета-LNA, показанные на Схеме 1).

Конъюгат

Термин «конъюгат» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к олигонуклеотиду, который ковалентно связан с ненуклеотидной группировкой (конъюгатная группировка или область С, или третья область), также именуемому конъюгатом олигонуклеотида.

Конъюгирование олигонуклеотида по изобретению с одной или более чем одной ненуклеотидной группировкой может улучшать фармакологию данного олигонуклеотида, например, посредством влияния на активность, клеточное распределение, клеточное поглощение или стабильность олигонуклеотида. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка нацеливает олигонуклеотид в печень. В то же самое время конъюгат служит для уменьшения активности олигонуклеотида в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями, например, активность вне мишени или активность в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями. В одном воплощении изобретения конъюгат олигонуклеотида по изобретению демонстрирует улучшенное ингибирование PD-L1 в клетке-мишени по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом. В другом воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретнию имеет улучшенное клеточное распределение между печенью и другими органами, такими как селезенка или почки (т.е. больше конъюгированного олигонуклеотида поступает в печень, чем в селезенку или в почки), по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом. В другом воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретнию демонстрирует улучшенное клеточное поглощение в печень конъюгата олигонуклеотида по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом.

В WO 93/07883 и WO 2013/033230 предложены подходящие конъюгатные группировки, которые тем самым являются включенными посредством ссылки. Дополнительными подходящими конъюгатными группировками являются группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr). В частности, подходящими для связывания с ASGPr являются трехвалентные N-ацетилгалактозаминные конъюгатные группировки, см., например, WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620 (включенные тем самым посредством ссылки). Конъюгатная группировка является по существу частью конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов, которая не состоит из нуклеиновых кислот.

Конъюгаты олигонуклеотидов и их синтез также были описаны во всеохватывающих обзорах Manoharan в Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 и Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.

В одном воплощении ненуклеотидная группировка (конъюгатная группировка) выбрана из группы, состоящей из углеводов, лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов (например, бактериальных токсинов), витаминов, вирусных белков (например, капсидов) или их комбинаций.

Линкеры

Связка или линкер представляет собой соединение между двумя атомами, которое связывает одну химическую группу или интересующий сегмент с другой химической группой или интересующим сегментом посредством одной или более чем одной ковалентной связи. Конъюгатные группировки могут присоединяться к олигонуклеотиду непосредственно или через связывающую группировку (например, линкер или связку). Линкеры служат для ковалентного присоединения третьей области, например, конъюгатной группировки (области С), к первой области, например, олигонуклеотиду или непрерывной нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (область А).

В некоторых воплощениях изобретения конъюгат или конъюгат олигонуклеотида по изобретению возможно может содержать линкерную область (вторая область или область В, и/или область Y), которая располагается между олигонуклеотидом или непрерывной нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (область А или первая область), и конъюгатной группировкой (область С или третья область).

Область В относится к биорасщепляемым линкерам, содержащим или состоящим из физиологически лабильной связи, которая является расщепляемой при условиях, которые обычно встречаются или являются аналогичными условиям, которые встречаются в организме млекопитающего. Условия, при которых физиологически лабильные линкеры подвергаются химическому превращению (например, расщеплению), включают такие химические условия, как рН, температура, окислительные или восстановительные условия или агенты и концентрация соли, обнаруженные или аналогичные условиям, встречающимся в клетках млекопитающих. Внутриклеточные условия у млекопитающих также включают присутствие ферментативной активности, обычно присутствующей в клетке млекопитающего, как, например, от протеолитических ферментов или гидролитических ферментов, или нуклеаз. В одном воплощении биорасщепляемый линкер чувствителен к расщеплению нуклеазой S1. В предпочтительном воплощении нуклеазочувствительный линкер содержит от 1 до 10 нуклеозидов, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов, более предпочтительно - от 2 до 6 нуклеозидов, и наиболее предпочтительно - от 2 до 4 связанных нуклеозидов, содержащих по меньшей мере две последовательные фосфодиэфирные связи, как, например, по меньшей мере 3 или 4, или 5 последовательных фосфодиэфирных связей. Предпочтительно нуклеозидами являются ДНК или РНК. Биорасщепляемые линкеры, содержащие фосфодиэфир, более подробно описываются в WO 2014/076195 (включенной тем самым посредством ссылки).

Область Y относится к линкерам, которые не обязательно являются биорасщепляемыми, но, главным образом, служат для ковалентного присоединения конъюгатной группировки (области С или третьей области) к олигонуклеотиду или непрерывной нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (области А или первой области). Линкеры области Y могут содержать структуру цепи или олигомер из повторяющихся звеньев, такой как этиленгликоль, аминокислотные звенья или аминоалкильные группы. Конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению могут быть сконструированы из следующих элементов областей: A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C или A-Y-C. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой аминоалкил, как, например, С2-С36 аминоалкильную группу, включающую, например, С6-С12 аминоалкильные группы. В предпочтительном воплощении линкер (область Y) представляет собой С6 аминоалкильную группу.

Лечение

Термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится как к лечению существующего заболевания (например, заболевания или расстройства, на которые дается ссылка в данном документе), так и к предупреждению заболевания, т.е. профилактике. Следовательно, будет понятно, что лечение в том виде, в котором на него дается ссылка в данном документе, в некоторых воплощениях может быть профилактическим.

Восстановление иммунного ответа против патогенов

Иммунный ответ подразделяется на врожденный и адаптивный иммунный ответ. Врожденная иммунная система обеспечивает немедленный, но неспецифичный ответ. Адаптивный иммунный ответ активируется врожденным иммунным ответом и является высокоспецифичным по отношению к конкретному патогену. При презентации антигена, происходящего из патогена, на поверхности антигенпрезентирующих клеток иммунные клетки адаптивного иммунного ответа (т.е. Т- и В-лимфоциты) активируются посредством их антигенспецифичных рецепторов, приводя к патогенспецифичному иммунному ответу и развитию иммунологической памяти. Хронические вирусные инфекции, такие как HBV и HCV, ассоциированы с исчерпанием Т-клеток, характеризуемым неотвечаемостью вирусоспецифичных Т-клеток. Исчерпание Т-клеток хорошо изучено, относительно обзора см., например, Yi et al 2010 Immunology 129, 474-481. Хронические вирусные инфекции также ассоциированы с пониженной функцией NK-клеток, которые являются врождеными иммунными клетками. Усиление иммунного ответа против вирусов является важным для клиренса хронической инфекции. Восстановление иммунного ответа против патогенов, опосредованного Т-клетками и NK-клетками, можно оценивать посредством измерения пролиферации, секреции цитокинов и цитолитической функции (Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 и Пример 6 в данном документе).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению антисмысловых олигонуклеотидов, их конъюгатов и содержащих их фармацевтических композиций для восстановления иммунного ответа против патогенов, которые инфицировали животное, в частности человека. Конъюгаты антисмысловых олигонуклеотидов по настоящему изобретению являются особенно полезными против патогенов, которые инфицировали печень, в частности, против хронических инфекций печени, подобных HBV. Данные конъюгаты обеспечивают таргетное распределение олигонуклеотидов и предотвращают системный нокдаун нуклеиновой кислоты-мишени.

Олигонуклеотиды по изобретению

Данное изобретение относится к олигонуклеотидам, способным модулировать экспрессию PD-L1. Модуляция может достигаться гибридизацией с нуклеиновой кислотой-мишенью, кодирующей PD-L1, или с той, которая участвует в регуляции PD-L1. Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой последовательность PD-L1 млекопитающего, такую как последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3. Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой пре-мРНК, мРНК или любую последовательность РНК, экспрессируемую из клетки млекопитающего, которая поддерживает экспрессию или регуляцию PD-L1.

Олигонуклеотид по изобретению представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, который нацелен на PD-L1.

В одном аспекте изобретения олигонуклеотиды по изобретению конъюгированы с конъюгатной группировкой, в частности, с конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен модулировать экспрессию мишени посредством осуществления ее ингибирования или понижающей регуляции. Предпочтительно такая модуляция дает ингибирование экспрессии по меньшей мере 20% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени, более предпочтительно по меньшей мере 30%-ное, 40%-ное, 50%-ное, 60%-ное, 70%-ное, 80%-ное или 90%-ное ингибирование по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени. Предпочтительно такая модуляция дает ингибирование экспрессии по меньшей мере 20% по сравнению с уровнем экспрессии при заражении клетки или организма инфекционным агентом, или при обработке агентом, имитирующим заражение инфекционным агентом (например, поли I:C или LPS (липополисахарид)), более предпочтительно по меньшей мере 30%-ное, 40%-ное, 50%-ное, 60%-ное, 70%-ное, 80%-ное или 90%-ное ингибирование по сравнению с с уровнем экспрессии при заражении клетки или организма инфекционным агентом, или при обработке агентом, имитирующим заражение инфекционным агентом (например, поли I:C или LPS). В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии мРНК PD-L1 по меньшей мере на 60% или 70% in vitro с использованием клеток KARPAS-299 или ТНР1. В некоторых воплощениях соединения по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии белка PD-L1 по меньшей мере на 50% in vitro с использованием клеток KARPAS-299 или ТНР1. Подходящим образом в примерах предложены анализы, которые можно использовать для измерения РНК PD-L1 (например, Пример 1). Модуляция мишени запускается гибридизацией между непрерывной нуклеотидной последовательностью олигонуклеотида и нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит несоответствия между данным олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью. Несмотря на несоответствия гибридизация с нуклеиновой кислотой-мишенью все еще может быть достаточной для демонстрации желательной модуляции экспрессии PD-L1. Пониженная аффинность связывания, происходящая из-за несоответствий, преимущественно может компенсироваться большим числом нуклеотидов в олигонуклеотиде и/или большим числом модифицированных нуклеозидов, способных увеличивать аффинность связывания с мишенью, таких как 2'-модифицированные нуклеозиды, включая LNA, присутствующих в пределах последовательности олигонуклеотида.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен восстанавливать патогенспецифичные Т-клетки. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению способны увеличивать число патогенспецифичных Т-клеток по меньшей мере на 40%, 50%, 60% или 70% по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. В одном воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HBV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. Подходящим образом, в данных примерах предложены анализы, которые можно использовать для измерения HBV-специфичных Т-клеток (например, пролиферация Т-клеток, секреция цитокинов и цитолитическая активность). В другом воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HСV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. В другом воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HDV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен уменьшать уровни HBsAg у животного или человека. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению способны уменьшать уровни HВsAg по меньшей мере на 40%, 50%, 60% или 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, 90% или 95% по сравнению с уровнем до обработки. Наиболее предпочтительно олигонуклеотиды по изобретению способны достигать сероконверсии HВsAg у животного или человека, иницированного HBV.

Один аспект настоящего изобретения относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1.

В некоторых воплощениях данный олигонуклеотид содержит непрерывную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% комплементарной, как, например, по меньшей мере на 91%, как, например, по меньшей мере на 92%, как, например, по меньшей мере на 93%, как, например, по меньшей мере на 94%, как, например, по меньшей мере на 95%, как, например, по меньшей мере на 96%, как, например, по меньшей мере на 97%, как, например, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарной области нуклеиновой кислоты-мишени.

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению или его непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарным (на 100% комплементарным) области нуклеиновой кислоты-мишени, или в некоторых воплощениях может содержать одно или два несоответствия между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, с полной (или 100%-ной) комплементарностью с областью нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, 100%-ной комплементарностью с соответствующей областью нуклеиновой кислоты-мишени, где непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, выбранной из группы, состоящей из положения 371-3068, 5467-12107 и 15317-19511 на SEQ ID NO: 1. В другом воплощении подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из положения 371-510, 822-1090, 1992-3068, 5467-5606, 6470-12107, 15317-15720, 15317-18083, 18881-19494 и 1881-19494 на SEQ ID NO: 1. В предпочтительном воплощении подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из положения 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 и 15690-15735 на SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, 100%-ной комплементарностью с соответствующей областью нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1, где область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из областей от а1 до а449 в Таблице 4.

Таблица 4: области SEQ ID NO 1, на которые может осуществляться нацеливание с использованием олигонуклеотида по изобретению

Обл. a	Положение в SEQ ID NO 1	Длина	Обл. a	Положение в SEQ ID NO 1	Длина	Обл. a	Положение в SEQ ID NO 1	Длина
от	до	от	до	от	до
a1	51	82	32	a151	6994	7020	27	a301	13092	13115	24
a2	87	116	30	a152	7033	7048	16	a302	13117	13134	18
a3	118	133	16	a153	7050	7066	17	a303	13136	13169	34
a4	173	206	34	a154	7078	7094	17	a304	13229	13249	21
a5	221	287	67	a155	7106	7122	17	a305	13295	13328	34
a6	304	350	47	a156	7123	7144	22	a306	13330	13372	43
a7	354	387	34	a157	7146	7166	21	a307	13388	13406	19
a8	389	423	35	a158	7173	7193	21	a308	13408	13426	19
a9	425	440	16	a159	7233	7291	59	a309	13437	13453	17
a10	452	468	17	a160	7300	7333	34	a310	13455	13471	17
a11	470	484	15	a161	7336	7351	16	a311	13518	13547	30
a12	486	500	15	a162	7353	7373	1	a312	13565	13597	33
a13	503	529	27	a163	7375	7412	38	a313	13603	13620	18
a14	540	574	35	a164	7414	7429	16	a314	13630	13663	34
a15	576	649	74	a165	7431	7451	21	a315	13665	13679	15
a16	652	698	47	a166	7453	7472	20	a316	13706	13725	20
a17	700	750	51	a167	7474	7497	24	a317	13727	13774	48
a18	744	758	15	a168	7517	7532	16	a318	13784	13821	38
a19	774	801	28	a169	7547	7601	55	a319	13831	13878	48
a20	805	820	16	a170	7603	7617	15	a320	13881	13940	60
a21	827	891	65	a171	7632	7647	16	a321	13959	14013	55
a22	915	943	29	a172	7649	7666	18	a322	14015	14031	17
a23	950	982	33	a173	7668	7729	62	a323	14034	14049	16
a24	984	1000	17	a174	7731	7764	34	a324	14064	14114	51
a25	1002	1054	53	a175	7767	7817	51	a325	14116	14226	111
a26	1060	1118	59	a176	7838	7860	23	a326	14229	14276	48
a27	1124	1205	82	a177	7862	7876	15	a327	14292	14306	15
a28	1207	1255	49	a178	7880	7944	65	a328	14313	14384	72
a29	1334	1349	16	a179	7964	8012	49	a329	14386	14408	23
a30	1399	1425	27	a180	8028	8072	45	a330	14462	14481	20
a31	1437	1458	22	a181	8086	8100	15	a331	14494	14519	26
a32	1460	1504	45	a182	8102	8123	22	a332	14557	14577	21
a33	1548	1567	20	a183	8125	8149	25	a333	14608	14628	21
a34	1569	1586	18	a184	8151	8199	49	a334	14646	14668	23
a35	1608	1662	55	a185	8218	8235	18	a335	14680	14767	88
a36	1677	1700	24	a186	8237	8276	40	a336	14765	14779	15
a37	1702	1721	20	a187	8299	8344	46	a337	14815	14844	30
a38	1723	1745	23	a188	8346	8436	91	a338	14848	14925	78
a39	1768	1794	27	a189	8438	8470	33	a339	14934	14976	43
a40	1820	1835	16	a190	8472	8499	28	a340	14978	15009	32
a41	1842	1874	33	a191	8505	8529	25	a341	15013	15057	45
a42	1889	1979	91	a192	8538	8559	22	a342	15064	15091	28
a43	1991	2011	21	a193	8562	8579	18	a343	15094	15140	47
a44	2013	2038	26	a194	8581	8685	105	a344	1514	15165	17
a45	2044	2073	30	a195	8688	8729	42	a345	15162	15182	21
a46	2075	2155	81	a196	8730	8751	22	a346	15184	15198	15
a47	2205	2228	24	a197	8777	8800	24	a347	15200	15221	22
a48	2253	2273	21	a198	8825	8865	41	a348	15232	15247	16
a49	2275	2303	29	a199	8862	8894	33	a349	15250	15271	22
a50	2302	2333	32	a200	8896	8911	16	a350	15290	15334	45
a51	2335	2366	32	a201	8938	8982	45	a351	15336	15369	34
a52	2368	2392	25	a202	8996	9045	50	a352	15394	15416	23
a53	2394	2431	38	a203	9048	9070	23	a353	15433	15451	19
a54	2441	2455	15	a204	9072	9139	68	a354	15453	15491	39
a55	2457	2494	38	a205	9150	9168	19	a355	15496	15511	16
a56	2531	2579	49	a206	9170	9186	17	a356	15520	15553	34
a57	2711	2732	22	a207	9188	9202	15	a357	15555	15626	72
a58	2734	2757	24	a208	9204	9236	33	a358	15634	15652	19
a59	2772	2786	15	a209	9252	9283	32	a359	15655	15688	34
a60	2788	2819	32	a210	9300	9331	32	a360	15690	15735	46
a61	2835	2851	17	a211	9339	9354	16	a361	15734	15764	31
a62	2851	2879	29	a212	9370	9398	29	a362	15766	15787	22
a63	2896	2912	17	a213	9400	9488	89	a363	15803	15819	17
a64	2915	2940	26	a214	9490	9537	48	a364	15846	15899	54
a65	2944	2973	30	a215	9611	9695	85	a365	15901	15934	34
a66	2973	2992	20	a216	9706	9721	16	a366	15936	15962	27
a67	2998	3016	19	a217	9723	9746	24	a367	15964	15985	22
a68	3018	3033	16	a218	9748	9765	18	a368	15987	16023	37
a69	3036	3051	16	a219	9767	9788	22	a369	16025	16061	37
a70	3114	3139	26	a220	9794	9808	15	a370	16102	16122	21
a71	3152	3173	22	a221	9812	9859	48	a371	16134	16183	50
a72	3181	3203	23	a222	9880	9913	34	a372	16185	16281	97
a73	3250	3271	22	a223	9923	9955	33	a373	16283	16298	16
a74	3305	3335	31	a224	9966	10007	42	a374	16305	16323	19
a75	3346	3363	18	a225	10009	10051	43	a375	16325	16356	32
a76	3391	3446	56	a226	10053	10088	36	a376	16362	16404	43
a77	3448	3470	23	a227	10098	10119	22	a377	16406	16456	51
a78	3479	3497	19	a228	10133	10163	31	a378	16494	16523	30
a79	3538	3554	17	a229	10214	10240	27	a379	16536	16562	27
a80	3576	3597	22	a230	10257	10272	16	a380	16564	16580	17
a81	3603	3639	37	a231	10281	10298	18	a381	16582	16637	56
a82	3663	3679	17	a232	10300	10318	19	a382	16631	16649	19
a83	3727	3812	86	a233	10339	10363	25	a383	16655	16701	47
a84	3843	3869	27	a234	10409	10426	18	a384	16737	16781	45
a85	3874	3904	31	a235	10447	10497	51	a385	16783	16804	22
a86	3926	3955	30	a236	10499	10529	31	a386	16832	16907	76
a87	3974	3993	20	a237	10531	10546	16	a387	16934	16965	32
a88	3995	4042	48	a238	10560	10580	21	a388	16972	17035	64
a89	4053	4073	21	a239	10582	10596	15	a389	17039	17069	31
a90	4075	4123	49	a240	10600	10621	22	a390	17072	17109	38
a91	4133	4157	25	a241	10623	10664	42	a391	17135	17150	16
a92	4158	4188	31	a242	10666	10685	20	a392	17167	17209	43
a93	4218	4250	33	a243	10717	10773	57	a393	17211	17242	32
a94	4277	4336	60	a244	10775	10792	18	a394	17244	17299	56
a95	4353	4375	23	a245	10794	10858	65	a395	17304	17344	41
a96	4383	4398	16	a246	10874	10888	15	a396	17346	17400	55
a97	4405	4446	42	a247	10893	10972	80	a397	17447	17466	20
a98	4448	4464	17	a248	10974	10994	21	a398	17474	17539	66
a99	4466	4493	28	a249	10996	11012	17	a399	17561	17604	44
a100	4495	4558	64	a250	11075	11097	23	a400	17610	17663	54
a101	4571	4613	43	a251	11099	11124	26	a401	17681	17763	83
a102	4624	4683	60	a252	11140	11157	18	a402	17793	17810	18
a103	4743	4759	17	a253	11159	11192	34	a403	17812	17852	41
a104	4761	4785	25	a254	11195	11226	32	a404	17854	17928	75
a105	4811	4858	48	a255	11235	11261	27	a405	17941	18005	65
a106	4873	4932	60	a256	11279	11337	59	a406	18007	18035	29
a107	4934	4948	15	a257	11344	11381	38	a407	18041	18077	37
a108	4955	4974	20	a258	11387	11411	25	a408	18085	18146	62
a109	4979	5010	32	a259	11427	11494	68	a409	18163	18177	15
a110	5012	5052	41	a260	11496	11510	15	a410	18179	18207	29
a111	5055	5115	61	a261	11512	11526	15	a411	18209	18228	20
a112	5138	5166	29	a262	11528	11551	24	a412	18230	18266	37
a113	5168	5198	31	a263	11570	11592	23	a413	18268	18285	18
a114	5200	5222	23	a264	11594	11634	41	a414	18287	18351	65
a115	5224	5284	61	a265	11664	11684	21	a415	18365	18395	31
a116	5286	5302	17	a266	11699	11719	21	a416	18402	18432	31
a117	5317	5332	16	a267	11721	11746	26	a417	18434	18456	23
a118	5349	5436	88	a268	11753	11771	19	a418	18502	18530	29
a119	5460	5512	53	a269	11787	11873	87	a419	18545	18590	46
a120	5514	5534	21	a270	11873	11905	33	a420	18603	18621	19
a121	5548	5563	16	a271	11927	11942	16	a421	18623	18645	23
a122	5565	5579	15	a272	11946	11973	28	a422	18651	18708	58
a123	5581	5597	17	a273	11975	11993	19	a423	18710	18729	20
a124	5600	5639	40	a274	12019	12114	96	a424	18731	18758	28
a125	5644	5661	18	a275	12116	12135	20	a425	18760	18788	29
a126	5663	5735	73	a276	12137	12158	22	a426	18799	18859	61
a127	5737	5770	34	a277	12165	12192	28	a427	18861	18926	66
a128	5778	5801	24	a278	12194	12216	23	a428	18928	18980	53
a129	5852	5958	107	a279	12218	12246	29	a429	19001	19018	18
a130	6007	6041	35	a280	12262	12277	16	a430	19034	19054	21
a131	6049	6063	15	a281	12283	12319	37	a431	19070	19092	23
a132	6065	6084	20	a282	12334	12368	35	a432	19111	19154	44
a133	6086	6101	16	a283	12370	12395	26	a433	19191	19213	23
a134	6119	6186	68	a284	12397	12434	38	a434	19215	19240	26
a135	6189	6234	46	a285	12436	12509	74	a435	19255	19356	102
a136	6236	6278	43	a286	12511	12543	33	a436	19358	19446	89
a137	6291	6312	22	a287	12545	12565	21	a437	19450	19468	19
a138	6314	6373	60	a288	12567	12675	109	a438	19470	19512	43
a139	6404	6447	44	a289	12677	12706	30	a439	19514	19541	28
a140	6449	6482	34	a290	12708	12724	17	a440	19543	19568	26
a141	6533	6555	23	a291	12753	12768	16	a441	19570	19586	17
a142	6562	6622	61	a292	12785	12809	25	a442	19588	19619	32
a143	6624	6674	51	a293	12830	12859	30	a443	19683	19739	57
a144	6679	6762	84	a294	12864	12885	22	a444	19741	19777	37
a145	6764	6780	17	a295	12886	12916	31	a445	19779	19820	42
a146	6782	6822	41	a296	12922	12946	25	a446	19822	19836	15
a147	6824	6856	33	a297	12948	12970	23	a447	19838	19911	74
a148	6858	6898	41	a298	12983	13003	21	a448	19913	19966	54
a149	6906	6954	49	a299	13018	13051	34	a449	19968	20026	59
a150	6969	6992	24	a300	13070	13090	21

В некотором воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последователность является комплементарным области нуклеиновой кислоты-мишени, где данная область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из a7, a26, a43, a119, a142, a159, a160, a163, a169, a178, a179, a180, a189, a201, a202, a204, a214, a221, a224, a226, a243, a254, a258, 269, a274, a350, a360, a364, a365, a370, a372, a381, a383, a386, a389, a400, a427, a435 и a438.

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной области нуклеиновой кислоты-мишени, где область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из a160, a180, a221, a269 и a360.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из 8-35 нуклеотидов в длину, как, например, от 9 до 30, как, например, от 10 до 22, как, например, от 11 до 20, как, например, от 12 до 18, как, например, от 13 до 17 или от 14 до 16 смежных нуклеотидов в длину. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид содержит или состоит из 16-20 нуклеотидов в длину. Следует понимать то, что любой интервал, приведенный в данном документе, включает конечные точки интервала. Соответственно, если говорится то, что олигонуклеотид включает от 10 до 30 нуклеотидов, включены и 10, и 30 нуклеотидов.

В некоторых воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеотидов в длину. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид содержит или состоит из 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов в длину.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, перечисленных в Таблице 5.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-743 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 5).

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-743 и 771.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 и 735.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 287.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 342.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 640.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 466.

В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 566.

В воплощениях, где олигонуклеотид длиннее, чем непрерывная нуклеотидная последовательность (которая комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени), мотивы последоваельностей в Таблице 5 образуют часть непрерывной нуклеотидной последовательности антисмысловых олигонуклеотидов по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является эквивалентной непрерывной нуклеотидной последовательности (например, если не добавляются биорасщепляемые линкеры).

Понятно то, что непрерывные последовательности из нуклеиновых оснований (мотив последовательности) могут быть модифицированы, например, для увеличения устойчивости к нуклеазе и/или аффинности связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Модификации описываются в определениях и в разделе «Конструкция олигонуклеотидов». В Таблице 5 перечислены предпочтительные конструкции каждого мотива последовательности.

Конструкция олигонуклеотида

Термин «конструкция олигонуклеотида» относится к картине модификаций сахара нуклеозидов в последовательности олигонуклеотида. Олигонуклеотиды по изобретению содержат нуклеозиды с модифицированным сахаром и также могут содержать нуклеозиды ДНК или РНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит нуклеозиды с модифицированным сахаром и нуклеозиды ДНК. Включение модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотид по изобретению может увеличивать аффинность олигонуклеотида в отношении нуклеиновой кислоты-мишени. В данном случае модифицированные нуклеозиды можно называть модифицированными нуклеотидами, увеличивающими аффинность, модифицированные нуклеозиды также можно называть звеньями.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере 1 модифицированный нуклеозид, как, например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 16 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении олигонуклеотид содержит от 1 до 10 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 2 до 8 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 3 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 4 до 6 модифицированных нуклеозидов, как, например, 3, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов.

В одном воплощении олигонуклеотид содержит один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром, как, например, нуклеозиды, модифицированные 2' сахаром. Предпочтительно олигонуклеотид по изобретению содержит один или более чем один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и нуклеозидов LNA. Даже более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой запертую нуклеиновую кислоту (LNA).

В другом воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные или боранофосфатные межнуклеозидные связи. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи в непрерывной последовательности олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеозидов LNA, как, например, от 2 до 6 нуклеозидов LNA, как, например, от 3 до 7 нуклеозидов LNA, от 4 до 6 нуклеозидов LNA или 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеозидов LNA. В некоторых воплощениях по меньшей мере 75% модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотиде представляют собой нуклеозиды LNA, как, например, 80%, как, например, 85%, как, например, 90% модифицированных нуклеозидов представляют собой нуклеозиды LNA В еще одном другом воплощении все модифицированные нуклеозиды в олигонуклеотиде представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении олигонуклеотид может содержать и бета-D-окси-LNA, и один или более чем один из следующих нуклеозидов LNA: тио-LNA, амино-LNA, окси-LNA и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В другом воплощении все цитозиновые звенья LNA представляют собой 5-метилцитозин. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 1 нуклеозид LNA на 5'-конце и по меньшей мере 2 нуклеозида LNA на 3'-конце нуклеотидной последовательности.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, который представляет собой нуклеозид 2'-MOE-РНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов 2'-MOE-РНК. В некоторых воплощениях по меньшей мере один из указанных модифицированных нуклеозидов представляет собой 2'-фтор-ДНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов 2'-фтор-ДНК.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид содержит и нуклеозиды, модифицированные 2'-сахаром, и звенья ДНК. Предпочтительно олигонуклеотид содержит и нуклеотиды (звенья) LNA, и ДНК. Предпочтительно объединенное общее число звеньев LNA и ДНК составляет 8-30, как, например, 10-25, предпочтительно 12-22, как, например, 12-18, даже более предпочтительно 11-16. В некоторых воплощениях изобретения нуклеотидная последовательность олигонуклеотида, такая как непрерывная нуклеотидная последовательность, состоит из по меньшей мере из одного или двух нуклеотидов LNA, и остальные нуклеозилы представляют собой звенья ДНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит только нуклеозиды LNA и встречающиеся в природе нуклеозиды (такие как нуклеозиды РНК или ДНК, наиболее предпочтительно нуклеозиды ДНК), возможно с модифицированными межнуклеозидными связями, такими как фосфоротиоатная.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид по изобретению способен рекрутировать РНКазу Н.

Структурная конструкция олигонуклеотида по изобретению может быть выбрана из гэпмеров, олигонуклеотидов с разорванным гэпом, хэдмеров и тэйлмеров.

Конструкция гэпмера

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению имеет конструкцию или структуру гэпмера, также именуемую в данном документе просто «гэпмер». В структуре гэпмера олигонуклеотид содержит по меньшей мере три отличные структурные области: 5'-фланг, гэп и 3'-фланг, F-G-F' в ориентации '5 -> 3'. В данной конструкции фланкирующие области F и F' (также именуемые области крыльев) содержат непрерывный отрезок модифицированных нуклеозидов, которые являются комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1, тогда как область гэпа - G - содержит непрерывный отрезок нуклеотидов, который способен рекрутировать нуклеазу, предпочтительно эндонуклеазу, такую как РНКаза, например, РНКаза Н, когда олигонуклеотид находится в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью. Нуклеозиды, которые способны рекрутировать нуклеазу, в частности РНКазу Н, могут быть выбраны из группы, состоящей из ДНК, альфа-L-окси-LNA, 2'-фтор-ANA и UNA. Области F и F', фланкирующие 5'- и 3'-концы области G, предпочительно содержат нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу (нуклеозиды с 3'-эндоструктурой), более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид, увеличивающий аффинность. В некоторых воплощениях 3'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, предпочтительно по меньшей мере 2 нуклеозида LNA. В некоторых воплощениях 5'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях обе 5'- и 3'-фланкирующие области содержат нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды в данных фланкирующих областях представляют собой нуклеозиды LNA. В других воплощениях фланкирующие области могут содержать и нуклеозиды LNA, и другие нуклеозиды (смешанные фланги), такие как нуклеозиды ДНК и/или модифицированные нуклеозиды, не являющиеся нуклеозидами LNA, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В данном случае гэп определяется как непрерывная последовательность из по меньшей мере 5 нуклеозидов, рекрутирующих РНКазу Н (нуклеозиды с 2'-эндоструктурой, предпочтительно ДНК), фланкированная на 5'- и 3'-конце модифицированным нуклеозидом, увеличивающим аффинность, предпочтительно LNA, таким как бета-D-окси-LNA. Следовательно, нуклеозиды 5'-фланкирующей области и 3'- фланкирующей области, которые являются смежными с областью гэпа, представляют собой модифицированные нуклеозиды, предпочтительно нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу.

Область F

Область F (5'-фланг или 5'-крыло), присоединенная к '5-концу области G, включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F содержит или состоит из от 1 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-5 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце данной области.

В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F имеют 3'-эндоструктуру.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F представляет собой 2'-модифицированные нуклеозиды.

В другом воплощении область F содержит ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце (рядом с областью G) области F. В одном воплощении область F содержит нуклеозиды ДНК, как, например, от 1 до 3 смежных нуклеозидов ДНК, как, например, от 1 до 3 или от 1 до 2 смежных нуклеозидов ДНК. Данные нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. В некоторых воплощениях 2'-модифицированные нуклеозиды и нуклеозиды ДНК и/или РНК в области F чередуются с 1-3 2'-модифицированными нуклеозидами и 1-3 нуклеозидами ДНК и/или РНК. Такие фланги также могут называться флангами с чередованием. Длина 5'-фланга (области F) в олигонуклеотидах с флангами с чередованием может составлять от 4 до 10 нуклеозидов, как, например, от 4 до 8, как, например, от 4 до 6 нуклеозидов, как, например, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов. В некоторых воплощениях только 5'-фланг олигонуклеотида является флангом с чередованием. Конкретными примерами области F с чередующимися нуклеозидами являются:

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2- N'_1-2-2'_1-2,

где 2' показывает модифицированный нуклеозид, и N' представляет собой РНК или ДНК. В некоторых воплощениях все модифицированные нуклеозиды во флангах с чередованием представляют собой LNA, а N' представляет собой ДНК. В другом воплощении один или более чем один 2'-модифицированный нуклеозид в области F выбран из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.

В некоторых воплощениях область F содержит и нуклеозид LNA, и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.

В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, cET и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F содержит по меньшей мере 1 звено бета-D-окси LNA на 5'-конце непрерывной последовательности.

Область G

Область G (область гэпа) предпочтительно включает, содержит или состоит из по меньшей мере 4, как, например, из по меньшей мере 5, как, например, из по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 16 последовательных нуклеозидов, способных рекрутировать вышеупомянутую нуклеазу, в частности РНКазу Н. В другом воплощении область G включает, содержит или состоит из от 5 до 12 или от 6 до 10, или от 7 до 9, как, например, из 8 последовательных нуклеотидных звеньев, способных рекрутировать вышеупомянутую нуклеазу.

Нуклеозидные звенья в области G, которые способны рекрутировать нуклеазу, в одном воплощении выбраны из группы, состоящей из ДНК, альфа-L-LNA, C4'-алкилированой ДНК (как описано в PCT/EP2009/050349 и Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300, которые обе включены в данный документ посредством ссылки), нуклеозидов, происходящих из арабинозы, подобных ANA и 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (незапертая нуклеиновая кислота) (как описано в Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, включенной в данный документе посредством ссылки). UNA представляет собой незапертую нуклеиновую кислоту, типично где связь между С2 и С3 рибозы была удалена, образуя незапертый «сахарный» остаток.

В еще одном другом воплощении по меньшей мере одно нуклеозидное звено в области G представляет собой нуклеозидное звено ДНК, как, например, от 1 до 18 звеньев ДНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 звеньев ДНК, предпочтительно от 2 до 17 звеньев ДНК, как, например, от 3 до 16 звеньев ДНК, как, например, от 4 до 15 звеньев ДНК, как, например, от 5 до 14 звеньев ДНК, как, например, от 6 до 13 звеньев ДНК, как, например, от 7 до 12 звеньев ДНК, как, например, от 8 до 11 звеньев ДНК, более предпочтительно от 8 до 17 звеньев ДНК или от 9 до 16 звеньев ДНК, от 10 до 15 звеньев ДНК или от 11 до 13 звеньев ДНК, как, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 звеньев ДНК. В некоторых воплощениях область G состоит из 100% звеньев ДНК.

В других воплощениях область G может состоять из смеси ДНК и других нуклеозидов, способных опосредовать расщепление РНКазой Н. Область G может состоять из по меньшей мере 50% ДНК, более предпочтительно - из 60%, 70% или 80% ДНК, и даже более предпочтительно из 90% или 95% ДНК.

В еще одном другом воплощении по меньшей мере одно нуклеозидное звено в области G представляет собой нуклеозидное звено альфа-L-LNA, как, например, по меньшей мере одно звено альфа-L-LNA, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 звеньев альфа-L-LNA. В другом воплощении область G содержит по меньшей мере одно звено альфа-L-LNA, которое представляет собой звено альфа-L-окси-LNA. В другом воплощении область G содержит комбинацию нуклеозидных звеньев ДНК и альфа-L-LNA.

В некоторых воплощениях нуклеозиды в области G имеют 2'-эндоструктуру.

В некоторых воплощениях область G может содержать нуклеозид, разрывающий гэп, приводящий к олигонуклеотиду с разорванным гэпом, который способен рекрутировать РНКазу Н.

Область F'

Область F' (3'-фланг или 3'-крыло), присоединенная к '3-концу области G, включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F' содержит или состоит из от 1 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F' определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и на 3'-конце данной области.

В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F' имеют 3'-эндоструктуру.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F' представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой 2'-модифицированные нуклеозиды.

В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F' представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид.

В одном воплощении все нуклеозиды в области F' представляет собой 2'-модифицированные нуклеозиды. В другом воплощении область F' содержит ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце (смежном с областью G) и 3'-конце области F'. В одном воплощении область F' содержит нуклеозиды ДНК, как, например, от 1 до 4 смежных нуклеозидов ДНК, как, например, от 1 до 3 или от 1 до 2 смежных нуклеозидов ДНК. Данные нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. В некоторых воплощениях 2'-модифицированные нуклеозиды и нуклеозиды ДНК и/или РНК в области F' чередуются с 1-3 2'-модифицированными нуклеозидами и 1-3 нуклеозидами ДНК и/или РНК, причем такие фланги также могут называться флангами с чередованием. Длина 3'-фланга (области F') в олигонуклеотидах с флангами с чередованием может составлять от 4 до 10 нуклеозидов, как, например, от 4 до 8, как, например, от 4 до 6 нуклеозидов, как, например, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов. В некоторых воплощениях только 3'-фланг олигонуклеотида является флангом с чередованием. Конкретными примерами области F' с чередующимися нуклеозидами являются:

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2- N'_1-2-2'_1-2,

где 2' показывает модифицированный нуклеозид, и N' представляет собой РНК или ДНК. В некоторых воплощениях все модифицированные нуклеозиды во флангах с чередованием представляют собой LNA, а N' представляет собой ДНК. В другом воплощении модифицированные нуклеозиды в области F' выбраны из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.

В некоторых воплощениях область F' содержит и LNA и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.

В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F' независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, cET и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F' имеет по меньшей мере 2 звена бета-D-окси LNA на 3'-конце непрерывной последовательности.

Область D' и D''

Область D' и D'' может быть присоединена к 5'-концу области F или к 3'-концу области F' соответственно. Область D' или D'' является опцией.

Область D' и D'' может независимо содержать от 0 до 5, как, например, от 1 до 5, как, например, от 2 до 4, как, например, 0, 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов, которые могут быть комплементарными или некомплементарными нуклеиновой кислоте-мишени. В данном отношении олигонуклеотид по изобретению может в некоторых воплощениях содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, способную модулировать мишень, которая фланкирована на 5'- и/или 3'-конце дополнительными нуклеотидами. Такие дополнительные нуклеотиды могут служить в качестве нуклеазочувствительного биорасщепляемого линкера (см. определение линкеров). В некоторых воплощениях дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеозиды связаны фосфодиэфирными связями и могут представлять собой ДНК или РНК. В другом воплощении дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеозиды представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые могут быть включены, например, для увеличения нуклеазоустойчивости или для легкости синтеза. В одном воплощении олигонуклеотид по изобретению содержит область D' и/или D'' на 5'- или 3'-конце непрерывной нуклеотидной последовательности. В другом воплощении область D' и/или D'' состоит из 1-5 нуклеозидов ДНК или РНК, связанных фосфодиэфирными связями, которые не являются комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени.

Гэпмерный олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть представлен следующими формулами:

3'-F-G-F'-3'; в частности, F_1-7-G_4-12-F'_1-7

5'-D'-F-G-F'-3', в частности, D'_1-3-F_1-7-G_4-12-F'_1-7

5'-F-G-F'-D''-3', в частности, F_1-7-G_4-12-F'_1-7-D''_1-3

5'-D'-F-G-F'-D'-3'', в частности, D'_1-3-F_1-7-G_4-12-F'_1-7-D''_1-3

Предпочтительное число и типы нуклеозидов в областях F, G и F', D' и D'' были описаны выше. Конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению имеют область С, ковалентно присоединенную либо к 5'-, либо к 3'-концу олигонуклеотида, в частности гэпмерных олигонуклеотидов, представленных выше.

В одном воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретению содержит олигонуклеотид с формулой 5'-D'-F-G-F'-3' или 5'-F-G-F'-D''-3', где области F и F' независимо содержат 1-7 модифицированных нуклеозидов, G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н, и область D' или D'' содержит 1-5 нуклеозидов, связанных фосфодиэфирными связями. Предпочтительно область D' или D'' присутствует в конце олигонуклеотида, где рассматривается конъюгирование с конъюгатной группировкой.

Примеры олигонуклеотидов с флангами с чередованием могут быть представлены следующими формулами:

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3-G_6-12-2'_1-2-N'_1-4-2'_1-4

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-G_6-12-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2- N'_1-2-2'_1-2

F-G_6-12-2'_1-2-N'_1-4-2'_1-4

F-G_6-12-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2

2'_1-3-N'_1-4-2'_1-3-G_6-12-F'

2'_1-2-N'_1-2-2'_1-2-N_1-2-2'_1-2-G_6-12-F'

где фланг указан F или F', если он содержит только 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как нуклеозиды LNA. Предпочтительное число и типы нуклеозидов в областях с чередованием и области F, G и F', D' и D'' были описаны выше.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид представляет собой гэпмер, состоящий из 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 нуклеотидов в длину, где каждая из областей F и F' независимо состоит из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозных звеньев, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 нуклеозидных звеньев, способных рекрутировать нуклеазу при нахождении в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1, и область D' состоит из 2 ДНК, связанных фосфодиэфирной связью.

В других воплощениях олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' независимо состоит из 3, 4, 5 или 6 модифицированных нуклеозных звеньев, таких как нуклеозидные звенья, содержащие сахар 2'-O-метоксиэтил-рибозу (2'-MOE), или нуклеозидные звенья, содержащие сахар 2'-фтор-дезоксирибозу, и/или звенья LNA, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеозидных звеньев, таких как звенья ДНК или другие нуклеозиды, рекрутирующие нуклеазу, такие как L-LNA или смесь нуклеозидов ДНК и нуклеозидов, рекрутирующих нуклеазу.

В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' состоит из двух звеньев LNA, и область G состоит из 12, 13, 14 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 2-12-2, 2-13-2 и 2-14-2.

В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' независимо состоит из трех звеньев LNA, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 3-8-3, 3-9-3 3-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3 и 3-14-3.

В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' состоит из четырех звеньев LNA, и область G состоит из 8 или 9, 10, 11 или 12 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 4-8-4, 4-9-4, 4-10-4, 4-11-4 и 4-12-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 6 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-6-1, 1-6-2, 2-6-1, 1-6-3, 3-6-1, 1-6-4, 4-6-1, 2-6-2, 2-6-3, 3-6-2 2-6-4, 4-6-2, 3-6-3, 3-6-4 и 4-6-3.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 7 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-7-1, 2-7-1, 1-7-2, 1-7-3, 3-7-1, 1-7-4, 4-7-1, 2-7-2, 2-7-3, 3-7-2, 2-7-4, 4-7-2, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 и 4-7-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 8 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-8-1, 1-8-2, 1-8-3, 3-8-1, 1-8-4, 4-8-1,2-8-1, 2-8-2, 2-8-3, 3-8-2, 2-8-4, , 4-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3 и 4-8-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 9 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-9-1, 2-9-1, 1-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 1-9-4, 4-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 2-9-4, 4-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3 и 4-9-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 10 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 и 4-10-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 11 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3-11-1, 1-11-4, 4-11-1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 и 4-11-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 12 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3-12-1, 1-12-4, 4-12-1, 2-12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 и 4-12-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 13 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-13-1, 2-13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3-13-1, 1-13-4, 4-13-1, 2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 3-13-4, 4-13-3 и 4-13-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 14 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-14-1, 2-14-1, 1-14-2, 1-14-3, 3-14-1, 1-14-4, 4-14-1, 2-14-2, 2-14-3, 3-14-2, 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 3-14-4, 4-14-3 и 4-14-4.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 15 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-15-1, 2-15-1, 1-15-2, 1-15-3, 3-15-1, 1-15-4, 4-15-1, 2-15-2, 2-15-3, 3-15-2, 2-15-4, 4-15-2 и 3-15-3.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 16 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-16-1, 2-16-1, 1-16-2, 1-16-3, 3-16-1, 1-16-4, 4-16-1, 2-16-2, 2-16-3, 3-16-2, 2-16-4, 4-16-2 и 3-16-3.

Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 17 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-17-1, 2-17-1, 1-17-2, 1-17-3, 3-17-1, 1-17-4, 4-17-1, 2-17-2, 2-17-3 и 3-17-2.

Во всех случаях конструкция F-G-F' может дополнительно включать область D' и/или D'', которая может иметь 1, 2 или 3 нуклеозидных звена, таких как звенья ДНК, таких как 2 звена ДНК, связанных 2-фосфодиэфиром. Предпочтительно нуклеозиды в области F и F' представляют собой модифицированные нуклеозиды, тогда как нуклеотиды в области G предпочтительно представляют собой немодифицированные нуклеозиды.

При каждой конструкции предпочтительным модифицированным нуклеозидом является LNA.

В другом воплощении все межнуклеозидные связи в гэпе в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом воплощении все межнуклеозидные связи во флангах (области F и F') в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в области D' и D'' в гэпмере представляют собой фосфодиэфирные связи.

Для конкретных гэпмеров, как раскрыто в данном документе, при аннотации остатков цитозина (С) как 5-метил-цитозин в разных воплощениях один или более чем один С, присутствующий в олигонуклеотиде, может представлять собой немодифицированный остаток С.

В конкретном воплощении гэпмер представляет собой так называемый шортмер, как описано в WO2008/113832, включенной в данный документ посредством ссылки.

Дополнительные конструкции гэпмеров раскрыты в WO2004/046160, WO2007/146511 и включены посредством ссылки.

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO от 5_1 до 743_1 и 771_1.

Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1, and 735_1.

В одном предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 287_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 342_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 640_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 466_1.

В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 566_1.

В другом воплощении изобретения непрерывная нуклеотидная последовательность олигонуклеотидных мотивов и олигонуклеотидных соединений по изобретению содержит от двух до четырех дополнительных нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью, на 5'-конце непрерывной нуклеотидной последовательности (например, области D'). В одном воплощении нуклеозиды служат в качестве биорасщепляемого линкера (см. раздел «Биорасщепляемые линкеры»). В предпочтительном воплощении динуклеотид са (цитидин-аденозин) связан с 5'-концом непрерывной нуклеотидной последовательности (т.е. с любым из мотивов последовательностей или олигонуклеотидных соединений, перечисленных в Таблице 5) посредством фосфодиэфирной связи. В предпочтительном воплощении динуклеотид са не является комплементарным последовательности-мишени в положении, где остальная часть непрерывного нуклеотида является комплементарной.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей нуклеотидных мотивов с SEQ ID NO: 766, 767, 768, 769 и 770.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 и 770_1.

Углеводные конъюгатные группировки

Углеводные конъюгатные группировки включают галактозу, лактозу, N-ацетилгалактозамин, маннозу и моннозо-6-фосфат, но не ограничиваются ими. Углеводные конъюгаты могут использоваться для увеличения доставки или активности в целом ряде тканей, таких как печень и/или мышцы. См., например, EP1495769, WO99/65925, Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21. Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17.

В некоторых воплощениях углеводные конъюгатные группировки являются многовалентными, таким образом, что, например, 2, 3 или 4 идентичные или неидентичные углеводные группировки могут быть ковалентно связаны с олигонуклеотидом, возможно через линкер или линкеры. В некоторых воплощениях согласно изобретению предложен конъюгат, содержащий олигонуклеотид по изобретению и углеводную конъюгатную группировку. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка представляет собой или может содержать маннозу или маннозо-6-фосфат. Это особенно полезно для нацеливания в мышечные клетки, см., например, US 2012/122801.

Конъюгатные группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr) являются особенно полезными для нацеливания в гепатоциты в печени. В некоторых воплощениях согласно изобретению предложен конъюгат олигонуклеотида, содержащий олигонуклеотид по изобретению и конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина. Конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит одну или более чем одну углеводную группировку, способную к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (углеводные группировки, связывающиеся с ASGPr) с аффинностью, равной или большей, чем аффинность галактозы. Аффинности многочисленных производных галактозы в отношении рецептора асиалогликопротеина были исследованы (см., например, Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686) или легко определяются с использованием способов, типичных в данной области.

Одним аспектом настоящего изобретения является конъюгат антисмыслового олигонуклеотида, содержащий а) олигонуклеотид (область А), содержащий непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью к нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1; и б) по меньшей мере одну конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина (область С), ковалентно присоединенную к олигонуклеотиду в а). Олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность может быть такой, как описано в любом из разделов «Олигонуклеотиды по изобретению», «Конструкция олигонуклеотидов» и «Конструкция гэпмеров».

В некоторых воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит по меньшей мере одну углеводную группировку, связывающуюся с ASPGr, выбранную из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина и N-изобутаноилгалактозамина. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является одновалентной, двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной (т.е. содержащей 1, 2, 3 или 4 концевые углеводные группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина). Предпочтительно конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является двухвалентной, даже более предпочтительно она является трехвалентной. В предпочтительном воплощении конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит 1-3 группировки N-ацетилгалактозамина (GalNAc) (также именуемая GalNAc конъюгат). В некоторых воплощениях конъюгат олигонуклеотида содержит конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина, которая является трехвалентной N-ацетилгалактозаминной (GalNAc) группировкой. GalNAc конъюгаты использовали с фосфодиэфирными, метилфосфонатными и PNA антисмысловыми олигонуклеотидами (например, US 5994517 и Hangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701, Biessen et al 1999 Biochem J. 340, 783-792, и Maier et al 2003 Bioconjug Chem 14, 18-29 ) и миРНК (например, WO 2009/126933, WO 2012/089352 и WO 2012/083046) и с модифицированными нуклеозидами LNA и 2'-MOE (WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620, включенные тем самым посредством ссылки).

Для получения конъюгатной группировки, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr (предпочтительно GalNAc), присоединяются к разветвляющей молекуле через C-1 углероды сахаридов. Углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, предпочтительно связываются с разветвляющей молекулой через спейсеры. Предпочтительным спейсером является гибкий гидрофильный спейсер (патент США 5885968; Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). Предпочтительным гибким гидрофильным спейсером является ПЭГ (полиэтиленгликоль) спейсер. Предпочтительным ПЭГ спейсером является ПЭГ3 спейсер (три этиленовых звена). Разветвляющей молекулой может быть любая маленькая молекула, которая допускает присоединение двух или трех концевых углеводных группировок, связывающихся с ASPGr, и дополнительно обеспечивает присоединение точки разветвления к олигонуклеотиду. Типичной разветвляющей молекулой является дилизин. Молекула дилизина содержит три аминогруппы, посредством которых три углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, могут быть присоединены к карбоксильной реакционноспособной группе, через которую дилизин может быть присоединен к олигонуклеотиду. Альтернативными разветвляющими молекулами могут быть удвоитель или утроитель, такие как поставляемые Glen Research. В некоторых воплощениях разветвляющая молекула может быть выбрана из группы, состоящей из 1,3-бис-[5-(4,4'-диметокситритилокси)пентиламидо]пропил-2-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)] фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1920-xx), три-2,2,2-[3-(4,4'-диметокситритилокси)пропилоксиметил]этил-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1922-xx), трис-2,2,2-[3-(4,4'- диметокситритилокси)пропилоксиметил]метиленоксипропил-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита и 1-[5-(4,4'-диметокси-тритилокси)пентиламидо]-3-[5-флюоренометокси-карбонил-окси-пентиламидо]-пропил-2-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1925-xx). В WO 2014/179620 и заявке PCT № PCT/EP2015/073331 описано получение разных конъюгатных группировок GalNAc (включенных тем самым посредством ссылки). Между разветвляющей молекулой и олигонуклеотидом может быть вставлен один или более чем один линкер. В предпочтительном воплощении линкер представляет собой биорасщепляемый линкер. Линкер может быть выбран из линкеров, описанных в разделе «Линкеры» и его подразделах.

Конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, в частности, конъюгатная группировка GalNAc, может быть присоединена к 3'- или 5'-концу олигонуклеотида с использованием способов, известных в данной области. В предпочтительных воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, связывается с 5'-концом олигонуклеотида.

Модуляторы фармакокинетики в отношении доставки миРНК были описаны в WO 2012/083046 (включенной тем самым посредством ссылки). В некоторых воплощениях углеводная конъюгатная группировка содержит модулятор фармакокинетики, выбранный из группы, состоящей из гидрофобной группы, имеющей 16 или более атомов углерода, гидрофобной группы, имеющей 16-20 атомов углерода, пальмитоила, гексадек-8-еноила, олеила, (9Е,12Е)-октадека-9,12-диеноила, диоктаноила, С16-С20-ацила и холестерина. В предпочтительном воплощении углеводная конъюгатная группировка, содержащая модулятор фармакокинетики, представляет собой GalNAc конъюгат.

Предпочтительные углеводные конъюгатные группировки содержат от одной до трех концевых углеводных группировок, связывающихся с ASPGr, предпочтительно группировку(ки) N-ацетилгалактозамина. В некоторых воплощениях углеводная конъюгатная группировка содержит три углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, предпочтительно N-ацетилгалактозаминные группировки, связанные через спейсер с разветвляющей молекулой. Спейсерная молекула может иметь длину от 8 до 30 атомов. Предпочтительная углеводная конъюгатная группировка содержит три концевые GalNAc группировки, связанные через ПЭГ спейсер с разветвляющей молекулой дилизином. Предпочтительно ПЭГ спейсер представляет собой 3ПЭГ. Подходящие конъюгатные группировки, нацеленные на рецептор асиалогликопротеина, показаны на Фиг. 1. Предпочтительная конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, показана на Фиг. 3.

Другие GalNAc конъюгатные группировки могут включать, например, маленькие пептиды с присоединенными GalNAc группировками, такие как Tyr-Glu-Glu-(аминогексил-GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3; гликотрипептид, который связывается с рецептором асиалогликопротеина на гепатоцитах, см., например, Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297); галактозные кластеры на основе лизина (например, L3G4; Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214); и галактозные кластеры на основе холана (например, мотив распознавания углевода для рецептора асиалогликопротеина).

В некоторых воплощениях изобретения конъюгат антисмыслового олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из следующих CPM ID NO: 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 и 770_2.

В предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 4.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 5.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 6.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 7.

В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 8.

Линкеры

Биорасщепляемые линкеры (область В)

Применение конъюгата часто ассоциировано с улучшенными фармакокинетическими или фармакодинамическими свойствами. Однако присутствие конъюгатной группировки может препятствовать активности олигонуклеотида против намеченной мишени, например посредством стерического препятствия, предотвращающего гибридизацию или рекрутирование нуклеазы (например, РНКазы Н). Применение физиологически лабильной связи (биорасщепляемого линкера) между олигонуклеотидом (область А или первая область) и конъюгатной группировкой (область С или третья область) обеспечивает улучшенне свойства из-за присутствия конъюгатной группировки при обеспечении того, что при нахождении в ткани-мишени конъюгатная группа не предотвращает эффективную активность олигонуклеотида.

Расщепление физиологически лабильной связи происходит спонтанно при достижении молекулой, содержащей лабильную связь, подходящей внутри- и/или внеклеточной среды. Например, рН-лабильная связь может расщепляться при поступлении молекулы в подкисленную эндосому. Таким образом, рН-лабильная связь может рассматриваться как связь, расщепляемая в эндосоме. Связи, расщепляемые ферментом, могут расщепляться при воздействии ферментов, таких как ферметы, присутствующие в эндосоме или в лизосоме, или в цитоплазме. Дисульфидная связь может расщепляться при поступлении молекулы в более восстанавливающую среду цитоплазмы клетки. Таким образом, дисульфид может рассматриваться как связь, расщепляемая в цитоплазме. рН-лабильная связь в том виде, в котором данный термин используется в данном документе, представляет собой лабильную связь, которая селективно расщепляется при кислотных условиях (рН меньше 7). Такие связи также могут называться эндосомно-лабильными связыми, так как клеточные эндосомы и лизосомы имеют рН меньше, чем 7.

Для биорасщепляемых линкеров, ассоциированных с конъюгатной группировкой для таргетной доставки, предпочтительным является то, что скорость расщепления, наблюдаемая в ткани-мишени (например, в мышце, печени, почке или опухоли), была больше, чем наблюдающаяся в сыворотке крови. Подходящие способы для определения уровня (%) расщепления в ткани-мишени относительно сыворотки или расщепления нуклеазой S1 описываются в разделе «Материаы и методы». В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер (также именуемый физиологически лабильный линкер или нуклеазочувствительный линкер, или область В) в конъюгате по изобретению расщепляется по меньшей мере примерно на 20%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 30%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 40%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 50%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 60%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 70%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 75% по сравнению со стандартом.

В некоторых воплощениях конъюгат олигонуклеотида по изобретению содержит три области: i) первую область (область А), которая содержит 10-25 смежных нуклеотидов, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени; ii) вторую область (область В), которая содержит биорасщепляемый линкер, и iii) третью область (область С), которая содержит конъюгатную группировку, такую как конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, где третья область ковалентно связана со второй областью, которая ковалентно связана с первой областью.

В одном воплощении настоящего изобретения конъюгат олигонуклеотида содержит биорасщепляемый линкер (область В) между непрерывной нуклеотидной последовательностью (область А) и конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина (область С).

В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер может находиться или на 5'-конце и/или на 3'-конце смежных нуклеотидов, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени (область А). В предпочтительном воплощении биорасщепляемый линкер находится на 5'-конце.

В некоторых воплощениях расщепляемый линкер является чувствительным к нуклеазе(зам), которые, например, могут экспрессироваться в клетке-мишени. В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер состоит из 2-5 последовательных фосфодиэфирных связей. Данный линкер может представлять собой короткую область (например, из 1-10, как подробно описано в определении линкеров) нуклеозидов, связанных фосфодиэфирными связями. В некоторых воплощениях нуклеозиды в области В биорасщепляемого линкера (возможно независимо) выбраны из группы, состоящей из нуклеозидов ДНК и РНК или их модификаций, которые не препятствуют нуклеазному расщеплению. Модификации нуклеозидов ДНК и РНК, которые не препятствуют нуклеазному расщеплению, могут представлять собой не встречающиеся в природе нуклеиновые основания. Некоторые нуклеозиды с модифицированным сахаром также могут обеспечивать нуклеазное расщепление, как, например, альфа-L-окси-LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды области В содержат (возможно независимо) либо сахар 2'-OH-рибозу (РНК), либо 2'-H сахар - т.е. РНК или ДНК. В предпочтительном воплощении по меньшей мере два последовательных нуклеозида области В представляют собой нуклеозиды ДНК или РНК (как, например, по меньшей мере 3 или 4, или 5 последовательных нуклеозидов ДНК или РНК). В даже более предпочтительном воплощении нуклеозиды области В представляют собой нуклеозиды ДНК. Предпочтительно область В состоит из от 1 до 5 или от 1 до 4, как, например, из 2, 3, 4 последовательных нуклеозидов ДНК, связанных фосфодиэфирной связью. В предпочтительных воплощениях область В является такой короткой, что она не рекрутирует РНКазуН. В некоторых воплощениях область В содержит не больше, чем 3 или больше, чем 4 последовательных нуклеозида ДНК и/или РНК, связанных фосфодиэфирной связью (таких как нуклеозиды ДНК).

Когда область В состоит из нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью, область А и В могут вместе образовать олигонуклеотид, который связан с областью С. В данном контексте область А может отличаться от области В тем, что область А начинается с по меньшей мере одного, предпочтительно по меньшей мере двух модифицированных нуклеозидов с повышенной аффинностью связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью (например, LNA или нуклеозиды с 2'-замещенной сахарной группировкой), и область А сама по себе способна к модуляции экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени в релевантной линии клеток. Кроме того, если область А содержит нуклеозиды ДНК или РНК, они связаны нуклеазоустойчивой межнуклеозидной связью, такой как фосфоротиоатная или боранофосфатная. Область В, с другой стороны, содержит фосфодиэфирные связи между нуклеозидами ДНК или РНК. В некоторых воплощениях область В не является комплементарной или содержит по меньшей мере 50% несоответствий с нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых воплощениях область В не является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или смежным нуклеотидам, комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени в области А.

В некоторых воплощениях область В является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. В данном отношении области А и В вместе могут образовать одну непрерывную последовательность, которая является комплементарной последовательности-мишени.

В некоторых аспектах изобретения межнуклеозидная связь между первой (область А) и второй областью (область В) может рассматриваться как часть второй области.

В некоторых воплощениях последовательность оснований в области В выбрана для обеспечения оптимального сайта расщепления эндонуклеазой на основе преобладающих эндонуклеазных расщепляющих ферментов, присутствующих в ткани-мишени или в клетке-мишени, или в субклеточном компартменте-мишени. В данном отношении посредством выделения клеточных экстрактов из тканей-мишеней и тканей, не являющихся мишенями, могут быть выбраны последовательности расщепления эндонуклеазой для применения в области В на основе предпочтительной расщепляющей активности в желательной клетке-мишени (например, печени/гепатоцитах) по сравнению с клеткой, не являющейся мишенью (например, почки). В данном отношении эффективность соединения в отношении понижающей регуляции мишени может быть оптимизирована для желательной ткани/клетки.

В некоторых воплощениях область В содержит динуклеотид последовательности AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC, или GG, в которм С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидная связь представляет собой фосфодиэфирную связь. В некоторых воплощениях область В содержит тринуклеотид последовательности AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC и GGG, в которм С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидные связи представляют собой фосфодиэфирные связи. В некоторых воплощениях область В содержит тетрануклеотид последовательности AAAX, AATX, AACX, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, ACAX, ACTX, ACCX, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, TAAX, TATX, TACX, TAGX, TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, CAAX, CATX, CACX, CAGX, CTAX, CTGX, CTCX, CTTX, CCAX, CCTX, CCCX, CCGX, CGAX, CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX и GGGX, где Х может быть выбран из группы, состоящей из A, T, U, G, C и их аналогов, где С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидные связи представляют собой фосфодиэфирные связи. Будет понятно то, что при ссылке на (встречающиеся в природе) нуклеиновые основания A, T, U, G, C они могут быть заменены аналогами нуклеиновых оснований, которые функционируют как эквивалент природных нуклеиновых оснований (например, пара оснований с комплементарным нуклеозидом).

Другие линкеры (область Y)

Линкер может иметь по меньшей мере две функциональные группы: одну для присоединения олигонуклеотида и другую - для присоединения конъюгатной группировки. Типичные функциональные группы линкера могут быть электрофильными для осуществления реакции с нуклеофильными группами на олигонуклеотиде или конъюгатной группировке или нуклеофильными для осуществления реакции с электрофильными группами. В некоторых воплощениях функциональные группы линкера включают амино, гидроксил, карбоновую кислоту, тиол, фосфорамидат, фосфоротиоат, фосфат, фосфит, ненасыщенные группы (например, с двойными или тройными связями) и тому подобное. Некоторые типичные линкеры (область Y) включают 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (ADO), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-l-карбоксилат (SMCC), 6- аминогексановую кислоту (AHEX или AHA), 6-аминогексилокси, 4-аминомасляную кислоту, 4-аминоциклогексилкарбоновую кислоту, сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-l-карбокси-(6-амидо-капроат) (LCSMCC), сукцинимидил-м-малеимидо-бензоилат (MBS), сукцинимидил-N-e-малеимидо-капроилат (EMCS), сукцинимидил-6-(бета-малеимидо-пропионамидо)гексаноат (SMPH), сукцинимидил-N-(a-малеимидоацетат) (AMAS), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (SMPB), бета-аланин (бета-ALA), фенилглицин (PHG), 4-аминоциклогексановую кислоту (ACHC), бета-(циклопропил)аланин (бета-CYPR), аминододекановую кислоту (ADC), алилендиолы, полиэтиленгликоли, аминокислоты и тому подобное. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой аминоалкил, как, например, С2-С36 аминоалкильную группу, включающую, например, С6-С12 аминоалкильные группы. В предпочтительном воплощении линкер (область Y) представляет собой С6 аминоалкильную группу. Аминоалкильная группа может быть добавлена к олигонуклеотиду (область А или область А-В) в качестве части стандартного синтеза олигонуклеотида, например, с использованием (например, защищенного) аминоалкилфосфорамидита. Связывающая группа между аминоалкилом и олигонуклеотдом может представлять собой, например, фосфоротиоат или фосфодиэфир, или одну из других нуклеозидных связывающих групп, на которые дается ссылка в данном документе. Аминоалкильная группа квалентно связывается с 5' или 3'-концом олигонуклеотида. Имеющиеся в продаже аминоалкильные линкеры представляют собой, например, 3'-аминомодифицирующий реактив для связывания на 3'-конце олигонуклеотида, и для связывания на 5'-конце олигонуклеотида доступен 5'-аминомодификатор С6. Данные реактивы доступны у Glen Research Corporation (Sterling, Va.). Данные соединения или аналогичные соединения были использованы Krieg, et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161 для связывания флюоресцеина с 5'-концом олигонуклеотида. В данной области известен широкий спектр других линкерных групп, и они могут быть полезными при присоединении конъюгатных группировок к олигонуклеотидам. Обзор многих полезных линкерных групп можно найти, например, в Antisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350. Другие соединения, такие как акридин, присоединяли к 3'-концевой фосфатной группе олигонуклеотида посредством полиметиленовой связи (Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297). Любую из приведенных выше групп можно использовать в качестве одиночного линкера (область Y) или в комбинации с одним или более чем одним другим линкером (область Y-Y' или область Y-B, или B-Y).

Линкеры и их применение в получении конъюгатов олигонуклеотидов приводятся во всей данной области, как, например, в WO 96/11205 и WO 98/52614 и в патентах США № 4948882; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5580731; 5486603; 5608046; 4587044; 4667025; 5254469; 5245022; 5112963; 5391723; 5510475; 5512667; 5574142; 5684142; 5770716; 6096875; 6335432 и 6335437, WO 2012/083046, каждая из которых включена посредством ссылки во всей ее полноте.

Способ изготовления

В другом аспекте согласно изобретению предложены способы изготовления олигонуклеотидов по изобретению, включающие проведение взаимодействия нуклеотидных звеньев и, посредством этого, образование ковалентно связанных смежных нуклеотидных звеньев, содержащихся в олигонуклеотиде. Предпочтительно в данном способе используется фосфорамидитная химия (см., например, Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology том 154, страницы 287-313). В другом воплощении данный способ дополнительно включает проведение взаимодействия непрерывной нуклеотидной последовательности с конъюгируемой группировкой (лигандом). В другом аспекте предложен способ изготовления композиции по изобретению, включающий смешивание олигонуклеотида или конъюгированного олигонуклеотида по изобретению с фармацевтически приемлемым разбавителем, растворителем, носителем, солью и/или адъювантом.

Фармацевтическая композиция

В другом аспекте согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая любой из вышеупомянутых олигонуклеотидов и/или конъюгатов олигонуклеотидов и фармацевтически приемлемый разбавитель, растворитель, носитель, соль и/или адъювант. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), а фармацевтически приемлемые соли включают натриевые и калиевые соли, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой стерильный фосфатно-солевой буферный раствор. В некоторых воплощениях олигонуклеотид используется в фармацевтически приемлемом разбавителе в виде раствора в концентрации 50-300 мкМ.

Подходящие препараты для применения в настоящем изобретении находятся в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985. Относительно краткого обзора способов доставки лекарственного средства, см., например, Langer (Science 249:1527-1533, 1990). В WO 2007/031091 предложены дполнительные подходящие и предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей и адъювантов (включенные тем самым посредством ссылки). Подходящие дозировки, препараты, пути введения, композиции, лекарственные формы, комбинации с другими терапевтическими агентами, препараты пролекарств также приводятся в WO 2007/031091.

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по изобретению могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными или инертными веществами для приготовления фармацевтических композиций или препаратов. Композиции и способы для приготовления фармацевтических композиций зависят от целого ряда критериев, включающих путь введения, степень заболевания или дозу, подлежащую введению, но не ограничивающихся ими.

Данные композиции можно стерилизовать традиционными методиками стерилизации, или они могут подвергаться стерилизующему фильтрованию. Образующиеся водные растворы могут быть упакованы для применения в том виде, в котором они находятся, или лиофилизируются, причем лиофилизированный препарат объединяется со стерильным водным раствором перед введением. рН препаратов типично будет составлять от 3 до 11, более предпочтительно - от 5 до 9 или от 6 до 8, и наиболее предпочтительно - от 7 до 8, как, например, от 7 до 7,5. Образующиеся композиции в твердой форме можно упаковывать в многочисленные единичные стандартные дозы, причем каждая из них содержит фиксированное количество вышеупомянутого агента или агентов, как, например, в запечатанной упаковке или таблетках, или капсулах. Композицию в твердой форме также можно упаковывать в контейнер для гибкого количества, такой как поддающийся выдавливанию тюбик, разработанный для местно наносимого крема или мази.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида по изобретению представляет собой пролекарство. В частности, в отношении конъюгатов олигонуклеотидов конъюгатная группировка отщепляется от олигонуклеотида, как только пролекарство доставляется к месту действия, например, в клетку-мишень.

Применения

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению могут использоваться в качестве исследовательских реактивов, например, для диагностики, терапии и профилактики.

В исследовании такие олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов можно использовать для специфичной модуляции синтеза белка PD-L1 в клетках (например, в культурах клеток in vitro) и в экспериментальных животных, облегчая, посредством этого, функциональный анализ мишени или оценку ее полезности в качестве мишени для терапевтического вмешательства. Типично модуляция мишени достигается посредством осуществления деградации или ингибирования мРНК, продуцирующей белок, предотвращая, посредством этого, образование белка, или посредством осуществления деградации или ингибирования модулятора гена или мРНК, продуцирующей белок.

При использовании олигонуклеотида по изобретению в исследовании или диагностике нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой кДНК или синтетическую нуклеиновую кислоту, полученную из ДНК или РНК.

Согласно настоящему изобретению предложен способ in vivo или in vitro модуляции экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспрессирует PD-L1, причем указанный способ включает введение в указанную клетку олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида по изобретению в эффективном количестве.

В некоторых воплощениях клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего, в частности, человеческую клетку. Клетка-мишень может представлять собой культуру клеток in vitro или клетку in vivo, образующую часть ткани млекопитающего. В предпочтительных воплощениях клетка-мишень присутствует в печени. Клетка-мишень печени может быть выбрана из паренхимных клеток (например, гепатоцитов) и непаренхимных клеток, таких как клетки Купфера, LSEC, звездчатые клетки (или клетки Ито), холангиоциты и лейкоциты, ассоциированные с печенью (включающие Т-клетки и NK-клетки). В некоторых воплощениях клетка-мишень представляет собой антигенпрезентирующую клетку. Антигенпрезентирующие клетки подвергают дисплею чужеродные антигены, образующие комплекс с главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса I или класса II на их поверхностях. В некоторых воплощениях антигенпрезентирующие клетки экспрессируют МНС класса II (т.е. профессиональные антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, макрофаги и В-клетки).

При диагностике данные олигонуклеотиды могут быть использованы для выявления и количественного измерения экспрессии PD-L1 в клетке и тканях посредством норзерн-блоттинга, гибридизации in situ или аналогичных методик.

Для терапии олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению или их фармацевтические копозиции могут вводиться животному или человеку, у которого подозревается наличие заболевания или расстройства, которое может быть облегчено или вылечено посредством уменьшения экспрессии PD-L1, в частности, посредством уменьшения экспрессии PD-L1 в клетках-мишенях печени.

Согласно изобретению предложены способы лечения или предупреждения заболевания, включающие введение терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида, конъюгата олигонуклеотида или фармацевтической композиции по изобретению субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.

Данное изобретение также относится к олигонуклеотиду, конъюгату олигонуклеотида или фармацевтической композиции согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

Олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическую композицию согласно изобретению типично вводят в эффективном количестве.

Согласно изобретению также предложено применение олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида, или фармацевтической композиции по изобретению, как описано, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, на которые дается ссылка в данном документе. В одном воплощении данное заболевание выбрано из: а) вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV; б) паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, и в) рака печени или метастазов в печени.

В одном воплощении данное изобретение относится к олигонуклеотидам, конъюгатам олигонуклеотидов или фармацевтическим композициям для применения в лечении заболеваний или расстройств, выбранных из вирусных или паразитарных инфекций. В другом воплощении данное заболевание выбрано из: а) вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV; б) паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, и в) рака печени или метастазов в печени.

Заболевание или расстройство, на которые дается ссылка в данном документе, ассоциировано с истощением иммунной системы. В частности, данное заболевание или расстройство ассоциировано с истощением вирусоспецифичных ответов Т-клеток. В некоторых воплощениях заболевание или расстройство может быть облегчено или вылечено посредством уменьшения экспрессии PD-L1.

Способы по изобретению предпочтительно используют для лечения или профилактики против заболеваний, ассоциированных с истощением иммунной системы.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтические композиции по изобретению используются в восстановлении иммунного ответа против рака печени или метастазов в печени.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтические композиции по изобретению используются в восстановлении иммунного ответа против патогена. В некоторых воплощениях патоген может находиться в печени. Данными патогенами могут быть вирус или паразит, в частности, вирусы или паразиты, описанные в данном документе. В предпочтительном воплощении патоген представляет собой HBV.

Данное изобретение дополнительно относится к применению олигонуклеотида, конъюгата олигонуклеотида или фармацевтической композиции, как определено в данном документе, для изготовления лекарственного средства для восстановления иммунитета против вирусной или паразитарной инфекции, как упомянуто в данном документе.

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать в лечении вирусных инфекций, в частности, вирусных инфекций в печени, где подвержен влиянию путь PD-1 (см., например, Kapoor and Kottilil 2014 Future Virol Vol. 9 pp. 565-585 и Salem and El-Badawy 2015 World J Hepatol Vol. 7 pp. 2449-2458). Вирусные инфекции печени могут быть выбраны из группы, состоящей из вирусов гепатита, в частности HBV, HCV и HDV, в частности, хронических форм данных инфекций. В одном воплощении олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению используются для лечения HBV, в частности, хронического HBV. Показателями хронических инфекций HBV являются высокие уровни вирусной нагрузки (ДНК HBV) и даже более высокие уровни пустых частиц HВsAg (более чем 100-кратный избыток относительно вирионов) в системе кровообращения.

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению также можно использовать для лечения вирусных инфекций печени, которые наблюдаются в качестве сопутствующих инфекций ВИЧ (вирус иммунодефицита человека). Другими вирусными инфекциями, которые можно лечить олигонуклеотидами или конъюгатами олигонуклеотидов, или фармацевтическими композициями по настоящему изобретению, являются lcmv (вирус лимфоцитарного хориоменингита) и ВИЧ в качестве моноинфекции, HSV-1 и -2, и другие герпесвирусы. Данные вирусы не являются гепатотрофическими, однако, они могут быть чувствительными к понижающей регуляции PD-L1.

В некоторых воплощениях восстановление иммунитета или иммунного ответа включает улучшение ответа Т-клеток и/или NK-клеток, и/или ослабление исчерпания Т-клеток, в частности, восстанавливается HBV-специфичный Т-клеточный ответ, HСV-специфичный Т-клеточный ответ и HDV-специфичный Т-клеточный ответ. Улучшение Т-клеточного ответа, например, можно оценивать как увеличение уровня Т-клеток в печени, в частности, увеличение уровня Т-клеток CD8+ и/или CD4+ по сравнению с контролем (т.е. уровнем до обработки или уровнем у субъекта, обработанного носителем). В другом воплощении восстанавливается или возрастает именно уровень вирусоспецифичных Т-клеток CD8+ по сравнению с контролем, в частности, восстанавливается или возрастает уровень HBV-специфичных Т-клеток CD8+ или HСV-специфичных Т-клеток CD8+, или HDV-специфичных Т-клеток CD8+ по сравнению с контролем. В предпочтительном воплощении возрастает уровень Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена s HBV (HВsAg) и/или Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена e HBV (HBeAg), и/или Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена кора HBV (HBсAg), у субъектов, обработанных олигонуклеотидом, конъюгатом олигонуклеотида или фармацевтической композицией по настоящему изобретению по сравнению с контролем. Предпочтительно Т-клетки CD8+, специфичные в отношении антигена HBV, продуцируют один или более чем один цитокин, такой как интерферон-гамма (IFN-γ) или фактор некроза опухолей альфа (TNF-α). Увеличение уровня Т-клеток CD8+, описанных выше, в частности, наблюдается в печени. Описанное в данном документе увеличение должно быть статистически значимым по сравнению с контролем. Предпочтительно данное увеличение составляет по меньшей мере 20%, как, например, 25%, как, например, 50%, как, например, 75% по сравнению с контролем. В другом воплощении олигонуклеотидами или конъюгатами олигонуклеотидов по настоящему изобретению активируются природные клетки-киллеры (NK) и/или природные Т-клетки-киллеры (NKТ).

Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать в лечении паразитарных инфекций, в частности, паразитарных инфекций, где подвергается влиянию путь PD-1 (см., например, Bhadra et al. 2012 J Infect Dis vol 206 pp. 125-134; Bhadra et al. 2011 Proc Natl Acad Sci U S A Vol. 108 pp. 9196-9201; Esch et al. J Immunol vol 191 pp 5542-5550; Freeman and Sharpe 2012 Nat Immunol Vol 13 pp. 113-115; Gutierrez et al. 2011 Infect Immun Vol 79 pp. 1873-1881; Joshi et al. 2009 PLoS Pathog Vol 5 e1000431; Liang et al. 2006 Eur J Immunol Vol. 36 pp 58-64; Wykes et al. 2014 Front Microbiol Vol 5 pp 249). Паразитарные инфекции могут быть выбраны из группы, состоящей из малярии, токсоплазмоза, лейшманиоза и трипаносомоза. Малярийная инфекция вызвана протистом рода Plasmodium, в частности вида P. vivax, P. malariae и P. falciparum. Токсоплазмоз представляет собой паразитарное заболевание, вызванное Toxoplasma gondii. Лейшманиоз представляет собой заболевание, вызванное протозойными паразитами рода Leishmania. Трипаносомоз вызван простейшим рода Trypanosoma. Болезнь Чагаса, которая является тропической формой, вызывается видом Trypanosoma cruzi, а расстройство сна вызывается видом Trypanosoma brucei.

В некоторых воплощениях восстановление иммунитета включает восстановление ответа паразитоспецифичных Т-клеток и NK-клеток, в частности, ответа Plasmodium-специфичных Т-клеток, ответа Toxoplasma gondii-специфичных Т-клеток и NK-клеток, ответа Leishmania-специфичных Т-клеток и NK-клеток, ответа Trypanosoma cruzi-специфичных Т-клеток и NK-клеток или ответа Trypanosoma brucei-специфичных Т-клеток и NK-клеток. В другом воплощении восстанавливается именно ответ паразитоспецифичных Т-клеток CD8+ и NK-клеток.

Введение

Олигонуклеотиды или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить местно (как, например, на кожу, посредством ингаляции, в глаз или в ухо), энтерально (как, например, перорально или через желудочно-кишечный тракт) или парентерально (как, например, внутривенно, подкожно, внутримышечно, интрацеребрально, интрацеребровентрикулярно или подоболочечно).

В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводятся посредством парентрального пути, включающего внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию, внутриоболочечное или внутричерепное, например, интрацеребральное или интравентрикулярное, интравитреальное введение. В одном воплощении активный олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида вводится внутривенно. В другом воплощении активный олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида вводится подкожно.

В некоторых воплощениях олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению вводится в дозе 0,1-15 мг/кг, как, например, 0,1-10 мг/кг, как, например, 0,2-10 мг/кг, как, например, 0,25-10 мг/кг, как, например, 0,1-5 мг/кг, как, например, 0,2-5 мг/кг, как, например, 0,25-5 мг/кг. Введение может осуществляться один раз в неделю, каждую 2-ую неделю, каждую третью неделю или даже один раз в месяц.

Комбинированные терапии

В некоторых воплощениях олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению предназначены для применения в комбинированном лечении с другим терапевтическим агентом. Данный терапевтический агент может представлять собой, например, стандарт лечения для описанных выше заболеваний или расстройств.

Для лечения хронических инфекций HBV в качестве стандарта лечения рекомендуется комбинация противовирусных лекарственных средств и модуляторов иммунной системы. Эффективными противовирусными лекарственными средствами против HBV являются, например, аналоги нуклеоз(т)идов. Имеется пять аналогов нуклеоз(т)идов, лицензированных для терапии HBV, а именно: ламивудин (эпивир), адефовир (гепсера), тенофовир (виреад), телбивудин (тизека), энтекавир (бараклуд). Они являются эффективными в подавлении вирусной репликации (ДНК HBV), но не имеют влияния на уровни HВsAg. Другие антивирусные лекарственные средства включают рибавирин и терапию антителом против HBV (моноклональным или поликлональным). Модуляторами иммунной системы могут быть, например, интерферон-альфа-2а и ПЭГилированный интерферон-альфа-2а (пегасис) или агонисты TLR7 (например, GS-9620), или терапевтические вакцины. Лечение IFN-α демонстрирует лишь очень умеренный эффект в уменьшении вирусной нагрузки, но приводит к некоторому снижению уровня HВsAg, хотя и очень не эффективно (меньше 10% после 48 недель терапии).

Олигонуклеотид или конъюгаты олигонуклеотида по настоящему изобретению также могут быть объединены с другими противовирусными лекарственными средствами, эффективными против HBV, такими как антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в WO2012/145697 и WO 2014/179629, или молекулы миРНК, описанные в WO 2005/014806, WO 2012/024170, WO 2012/2055362, WO 2013/003520 и WO 2013/159109.

При введении олигонуклеотидов или конъюгатов олигонуклеотидов по данному изобретению в комбинированных терапиях с другими агентами, они могут вводиться индивиду последовательно или сопутствующе. В качестве альтернативы, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать комбинацию олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида по настоящему изобретению в ассоциации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, как описано в данном документе, и с другим терапевтическим или профилактическим агентом, известным в данной области.

ВОПЛОЩЕНИЯ

Следующие воплощения настоящего изобретения можно использовать в комбинации с любыми другими воплощениями, описанными в данном документе.

1. Антисмысловой олигонуклеотид, который содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности из 10-30 нуклеотидов в длину, способный уменьшать экспрессию PD-L1.

2. Олигонуклеотид по воплощению 1, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1.

3. Олигонуклеотид по воплощению 1 или 2, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3.

4. Олигонуклеотид по воплощениям 1-3, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна области в пределах положения 1 и 15720 на SEQ ID NO: 1.

5. Олигонуклеотид по воплощениям 1-4, где данный олигонуклеотид способен гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3, с ΔG° меньше -41,8 кДж.

6. Олигонуклеотид по воплощениям 1-5, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, где данная подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из положения 371-3068, 5467-12107, 15317-15720, 15317-18083, 15317-19511 и 18881-19494 на SEQ ID NO: 1.

7. Олигонуклеотид по воплощению 6, в котором подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из положения 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 и 15690-15735 на SEQ ID NO: 1.

8. Олигонуклеотид по воплощениям 2-7, в котором нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК.

9. Олигонуклеотид по воплощению 8, где РНК представляет собой мРНК.

10. Олигонуклеотид по воплощению 9, где мРНК представляет собой пре-мРНК или зрелую мРНК.

11. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из по меньшей мере 14 непрерывных нуклеотидов, в частности, из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 непрерывных нуклеотидов.

12. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 16-20 нуклеотидов.

13. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, где данный олигонуклеотид содержит или состоит из 14-35 нуклеотидов в длину.

14. Олигонуклеотид по воплощению 13, где данный олигонуклеотид содержит или состоит из 18-22 нуклеотидов в длину.

15. Олигонуклеотид по воплощениям 1-14, где данный олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность является одноцепочечной.

16. Олигонуклеотид по воплощениям 1-15, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, где данная подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из A7, A26, A43, A119, A142, A159, A160, A163, A169, A178, A179, A180, A189, A201, A202, A204, A214, A221, A224, A226, A243, A254, A258, 269, A274, A350, A360, A364, A365, A370, A372, A381, A383, A386, A389, A400, A427, A435 и A438.

17. Олигонуклеотид по воплощению 16, в котором подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из A221, A360, A180, A160 и A269.

18. Олигонуклеотид по воплощениям 1-17, где данный олигонуклеотид не является миРНК и не является комплементарным самому себе.

19. Олигонуклеотид по воплощениям 1-18, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5-743 или 771.

20. Олигонуклеотид по воплощениям 1-19, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 и 735.

21. Олигонуклеотид по воплощениям 1-20, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 466, 640, 342, 287 и 566.

22. Олигонуклеотид по воплощениям 1-21, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет от нуля до трех несоответствий по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью, которой она комплементарна.

23. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет одно несоответствие по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью.

24. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет два несоответствия по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью.

25. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.

26. Олигонуклеотид по воплощениям 1-25, содержащий один или более чем один модифицированный нуклеозид.

27. Олигонуклеотид по воплощению 26, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой высокоаффинные модифицированные нуклеозиды.

28. Олигонуклеотид по воплощению 26 или 27, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром.

29. Олигонуклеотид по воплощению 28, в котором один или более чем один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбран из группы, состоящей из нуклеозидов 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, 2'-фтор-ANA и LNA.

30. Олигонуклеотид по воплощению 28, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид LNA.

31. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид LNA представляет собой окси-LNA.

32. Олигонуклеотид по воплощению 31, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой бета-D-окси-LNA.

33. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой тио-LNA.

34. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой амино-LNA.

35. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой сЕТ.

36. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой ENA.

37. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид LNA выбран из бета-D-окси-LNA, альфа-L-окси-LNA, бета-D-амино-LNA, альфа-L-амино-LNA, бета-D-тио-LNA, альфа-L-тио-LNA, (S)cET, (R)cET, бета-D-ENA и альфа-L-ENA.

38. Олигонуклеотид по воплощениям 30-37, в котором, помимо модифицированного нуклеозида LNA, имеется по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид.

39. Олигонуклеотид по воплощению 38, в котором 2'-замещенный модифицированный нуклеозид выбран из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, 2'-фтор-ANA.

40. Олигонуклеотид по любому из воплощений 1-39, где данный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.

41. Олигонуклеотид по воплощению 40, в котором модифицированная межнуклеозидная связь является устойчивой к нуклеазе.

42. Олигонуклеотид по воплощению 40 или 41, в котором по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи или боранофосфатные межнуклеозидные связи.

43. Олигонуклеотид по воплощению 40 или 41, в котором все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

44. Олигонуклеотид по воплощениям 1-43, где данный олигонуклеотид способен рекрутировать РНКазу Н.

45. Олигонуклеотид по воплощению 44, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер.

46. Олигонуклеотид по воплощению 44 или 45, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер формулы 5'-F-G-F'-3', где области F и F' независимо содержат или состоят из 1-7 модифицированных нуклеозидов, и G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н.

47. Олигонуклеотид по воплощению 44 или 45, где гэпмер имеет формулу 5'-D'-F-G-F'-3' или 5'-F-G-F'-D''-3', где области F и F' независимо содержат 1-7 модифицированных нуклеозидов, G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н, и области D' или D'' содержат 1-5 нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью.

48. Олигонуклеотид по воплощению 47, в котором D' или D'' являются опционными.

49. Олигонуклеотид по воплощению 47, в котором область D' состоит из двух нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью.

50. Олигонуклеотид по воплощению 49, в котором нуклеозиды, связанные фосфодиэфирной связью, представляют собой са (цитидин-аденозин).

51. Олигонуклеотид по воплощению 46 или 47, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из нуклеозидов 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и LNA.

52. Олигонуклеотид по воплощениям 46-51, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F и F' представляет собой нуклеозид LNA.

53. Олигонуклеотид по воплощению 52, в котором все модифицированные нуклеозиды в области F и F' представляет собой нуклеозиды LNA.

54. Олигонуклеотид по воплощению 53, в котором область F и F' состоит из нуклеозидов LNA.

55. Олигонуклеотид по воплощениям 52-54, в котором все модифицированные нуклеозиды в области F и F' представляет собой нуклеозиды окси-LNA.

56. Олигонуклеотид по воплощению 52, в котором по меньшей мере одна из областей F и F' дополнительно содержит по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК и 2'-фтор-ДНК.

57. Олигонуклеотид по воплощениям 46-56, в котором нуклеозиды, рекрутирующие РНКазу Н, в области G независимо выбраны из ДНК, альфа-L-LNA, C4'-алкилированной ДНК, ANA, 2'-F-ANA и UNA.

58. Олигонуклеотид по воплощению 57, в котором нуклеозиды в области G представляют собой нуклеозиды ДНК и/или альфа-L-LNA.

59. Олигонуклеотид по воплощению 57 или 58, в котором область G состоит из по меньшей мере 75% нуклеозидов ДНК.

60. Олигонуклеотид по воплощениям 1-59, где данный олигонуклеотид выбран из любого олигонуклеотида CMP ID NO: от 5_1 до 743_1 и 771_1 (Таблица 5).

61. Олигонуклеотид по воплощениям 1-60, где данный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из CMP ID NO: 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1 и 735_1.

62. Олигонуклеотид по воплощениям 1-61, где данный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из CMP ID NO: 287_1, 342_1, 466_1, 640_1, 566_1, 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 и 770_1.

63. Конъюгат антисмыслового олигонуклеотида, содержащий:

а. олигонуклеотид по любому из воплощений 1-62 (область А); и

б. по меньшей мере одну конъюгатную группировку (область С), ковалентно присоединенную к указанному олигонуклеотиду.

64. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63, в котором конъюгатная группировка выбрана из углеводов, лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов, витаминов, вирусных белков или их комбинаций.

65. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63 или 64, в котором конъюгатная группировка представляет собой углеводсодержащую группировку.

66. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 65, в котором углеводная конъюгатная группировка содержит по меньшей мере одну группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина, ковалентно присоединенную к олигонуклеотиду по любому из пп. 1-62.

67. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 66, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит по меньшей мере одну углеводную группировку, выбранную из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина и N-изобутаноилгалактозамина.

68. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 66 или 67, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является одновалентной, двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной.

69. Конъюгат олигомера по воплощению 68, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, состоит из двух-четырех концевых GalNAc группировок, ПЭГ спейсера, связывающего каждую GalNAc группировку с разветвляющей молекулой.

70. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 66-69, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, представляет собой трехвалентную N-ацетилгалактозаминную (GalNAc) группировку.

71. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 66-70, в котором конъюгатная группировка выбрана из одной из трехвалентных GalNAc группировок на Фиг. 1.

72. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 71, в котором конъюгатная группировка представляет собой трехвалентную GalNAc группировку на Фиг. 3.

73. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63-72, в котором присутствует линкер между олигонуклеотидом или непрерывной олигонуклеотидной последовательностью и конъюгатной группировкой.

74. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 73, в котором линкер представляет собой физиологически лабильный линкер (область В).

75. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 74, в котором физиологически лабильный линкер представляет собой нуклеазочувствительный линкер.

76. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 74 или 75, в котором физиологически лабильный линкер состоит из 2-5 последовательных фосфодиэфирных связей.

77. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 76, в котором физиологически лабильный линкер является эквивалентным области D' или D'', присутствующей в воплощении 47-50.

78. Конъюгат олигонуклеотида по любому из воплощений 63-77, где данный конъюгат олигонуклеотида выбран из CMP ID NO: 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 и 770_2.

79. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 78, где данный конъюгат олигонуклеотида выбран из конъюгата олигонуклеотида, представленного на Фиг. 4, 5, 6, 7 и 8.

80. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 63-76, который демонстрирует улучшенное ингибирование PD-L1 в клетке-мишени или улучшенное клеточное распределение между печенью и селезенкой, или улучшенное клеточное поглощение в печени конъюгата олигонуклеотида по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом.

81. Фармацевтическая композиция, содержащая олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль и/или адъювант.

82. Способ изготовления олигонуклеотида по воплощению 1-62, включающий проведение взаимодействия нуклеотидных звеньев, образуя, посредством этого, ковалентно связанные смежные нуклеотидные звенья, содержащиеся в олигонуклеотиде.

83. Способ по воплощению 82, дополнительно включающий проведение взаимодействия непрерывной нуклеотидной последовательности с ненуклеотидной конъюгатной группировкой.

84. Способ изготовления композиции по воплощению 81, включающий смешивание олигонуклеотида с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солью и/или адъювантом.

85. Способ in vivo или in vitro модулирования экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспресирует PD-L1, причем указанный способ включает введение олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80, или фармацевтической композиции по воплощению 81 в эффективном количестве в указанную клетку.

86. Способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80, или фармацевтической композиции по воплощению 81 субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.

87. Способ восстановления иммунитета против вируса или паразита, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества конъюгата олигонуклеотида по воплощениям 63-80 или олигонуклеотида по воплощениям 1-62, или фармацевтической композиции по воплощению 81 субъекту, инфицированному вирусом или паразитом.

88. Способ по воплощению 87, причем восстановление иммунитета представляет собой увеличение в печени Т-клеток CD8+, специфичных в отношении одного или более чем одного антигена HBV по сравнению с контролем.

89. Олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80, или фармацевтическая композиции по воплощению 81 для применения в качестве лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.

90. Применение олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80 для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.

91. Олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80, или фармацевтическая композиции по воплощению 81 для применения в восстановлении иммунитета против вируса или паразита.

92. Применение по воплощению 91, где восстановление иммунитета представляет собой увеличение в печени Т-клеток CD8+, специфичных в отношении одного или более чем одного антигена HBV по сравнению с контролем.

93. Применение по воплощению 92, где антиген HBV представляет собой HBsAg.

94. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-93, где заболевание ассоциировано с активностью PD-L1 in vivo.

95. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-94, где заболевание ассоциировано с повышенной экспрессией PD-L1 в антигенпрезентирующей клетке.

96. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 95, где экспрессия PD-L1 снижается по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% по сравнению с экспрессией без обработки или до обработки олигонуклеотидом по воплощениям 1-62 или конъюгатом по воплощениям 63-80, или фармацевтической композицией по воплощению 81.

97. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-95, где заболевание выбрано из вирусной инфекции печени или паразитарных инфекций.

98. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 98, где вирусная инфекция представляет собой HBV, HCV или HDV.

99. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-95, где заболевание представляет собой хроническую инфекцию HBV.

100. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 98, где паразитарная инфекция представляет собой малярию, токсоплазмоз, лейшманиоз или трипаносомоз.

101. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-100, где субъект представляет собой млекопитающее.

102. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 101, где млекопитающее представляет собой человека.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

Мотивы последовательностей и олигонуклеотидные соединения

Таблица 5: список последовательностей олигонуклеотидных мотивов (указанных по SEQ ID NO), нацеленных на транскрипт человеческого PD-L1 (SEQ ID NO: 1), их конструкции, а также специфичные антисмысловые олигонуклеотидные соединения (указанные по CMP ID NO), разработанные на основе мотива последовательности.

SEQ ID NO	Мотив последовательности	Конструкция	Олигонуклеотидное соединение	CMP ID NO	ID NO начала: 1	dG
5	taattggctctactgc	2-11-3	TAattggctctacTGC	5_1	236	-20
6	tcgcataagaatgact	4-10-2	TCGCataagaatgaCT	6_1	371	-19
7	tgaacacacagtcgca	2-12-2	TGaacacacagtcgCA	7_1	382	-19
8	ctgaacacacagtcgc	3-10-3	CTGaacacacagtCGC	8_1	383	-22
9	tctgaacacacagtcg	3-11-2	TCTgaacacacagtCG	9_1	384	-19
10	ttctgaacacacagtc	3-11-2	TTCtgaacacacagTC	10_1	385	-17
11	acaagtcatgttacta	2-11-3	ACaagtcatgttaCTA	11_1	463	-16
12	acacaagtcatgttac	2-12-2	ACacaagtcatgttAC	12_1	465	-14
13	cttacttagatgctgc	2-11-3	CTtacttagatgcTGC	13_1	495	-20
14	acttacttagatgctg	2-11-3	ACttacttagatgCTG	14_1	496	-18
15	gacttacttagatgct	3-11-2	GACttacttagatgCT	15_1	497	-19
16	agacttacttagatgc	2-11-3	AGacttacttagaTGC	16_1	498	-18
17	gcaggaagagacttac	3-10-3	GCAggaagagactTAC	17_1	506	-20
18	aataaattccgttcagg	4-9-4	AATAaattccgttCAGG	18_1	541	-22
19	gcaaataaattccgtt	3-10-3	GCAaataaattccGTT	19_2	545	-18
19	gcaaataaattccgtt	4-8-4	GCAAataaattcCGTT	19_1	545	-20
20	agcaaataaattccgt	4-9-3	AGCAaataaattcCGT	20_1	546	-20
21	cagagcaaataaattcc	4-10-3	CAGAgcaaataaatTCC	21_1	548	-21
22	tggacagagcaaataaat	4-11-3	TGGAcagagcaaataAAT	22_1	551	-19
23	atggacagagcaaata	4-8-4	ATGGacagagcaAATA	23_1	554	-20
24	cagaatggacagagca	2-11-3	CAgaatggacagaGCA	24_1	558	-21
25	ttctcagaatggacag	3-11-2	TTCtcagaatggacAG	25_1	562	-17
26	ctgaactttgacatag	4-8-4	CTGAactttgacATAG	26_1	663	-20
27	aagacaaacccagactga	2-13-3	AAgacaaacccagacTGA	27_1	675	-21
28	tataagacaaacccagac	4-10-4	TATAagacaaacccAGAC	28_1	678	-22
29	ttataagacaaacccaga	4-10-4	TTATaagacaaaccCAGA	29_1	679	-23
30	tgttataagacaaaccc	4-10-3	TGTTataagacaaaCCC	30_1	682	-22
31	tagaacaatggtacttt	4-9-4	TAGAacaatggtaCTTT	31_1	708	-20
32	gtagaacaatggtact	4-10-2	GTAGaacaatggtaCT	32_1	710	-19
33	aggtagaacaatggta	3-10-3	AGGtagaacaatgGTA	33_1	712	-19
34	aagaggtagaacaatgg	4-9-4	AAGAggtagaacaATGG	34_1	714	-21
35	gcatccacagtaaatt	2-12-2	GCatccacagtaaaTT	35_1	749	-17
36	gaaggttatttaattc	2-11-3	GAaggttatttaaTTC	36_1	773	-13
37	ctaatcgaatgcagca	4-9-3	CTAAtcgaatgcaGCA	37_1	805	-22
38	tacccaatctaatcga	3-10-3	TACccaatctaatCGA	38_1	813	-20
39	tagttacccaatctaa	3-10-3	TAGttacccaatcTAA	39_1	817	-19
40	catttagttacccaat	3-10-3	CATttagttacccAAT	40_1	821	-18
41	tcatttagttacccaa	3-10-3	TCAtttagttaccCAA	41_1	822	-19
42	ttcatttagttaccca	2-10-4	TTcatttagttaCCCA	42_1	823	-22
43	gaattaatttcatttagt	4-10-4	GAATtaatttcattTAGT	43_1	829	-19
44	cagtgaggaattaattt	4-9-4	CAGTgaggaattaATTT	44_1	837	-20
45	ccaacagtgaggaatt	4-8-4	CCAAcagtgaggAATT	45_1	842	-21
46	cccaacagtgaggaat	3-10-3	CCCaacagtgaggAAT	46_1	843	-22
47	tatacccaacagtgagg	2-12-3	TAtacccaacagtgAGG	47_1	846	-21
48	ttatacccaacagtgag	2-11-4	TTatacccaacagTGAG	48_1	847	-21
49	tttatacccaacagtga	3-11-3	TTTatacccaacagTGA	49_1	848	-21
50	cctttatacccaacag	3-10-3	CCTttatacccaaCAG	50_1	851	-23
51	taacctttatacccaa	4-8-4	TAACctttatacCCAA	51_1	854	-22
52	aataacctttataccca	3-10-4	AATaacctttataCCCA	52_1	855	-23
53	gtaaataacctttata	3-11-2	GTAaataacctttaTA	53_1	859	-14
54	actgtaaataacctttat	4-10-4	ACTGtaaataacctTTAT	54_1	860	-20
55	atatatatgcaatgag	3-11-2	ATAtatatgcaatgAG	55_1	903	-14
56	agatatatatgcaatg	2-12-2	AGatatatatgcaaTG	56_1	905	-12
57	gagatatatatgcaat	3-10-3	GAGatatatatgcAAT	57_1	906	-15
58	ccagagatatatatgc	2-11-3	CCagagatatataTGC	58_1	909	-19
59	caatattccagagatat	4-9-4	CAATattccagagATAT	59_1	915	-20
60	gcaatattccagagata	4-10-3	GCAAtattccagagATA	60_1	916	-22
61	agcaatattccagagat	3-11-3	AGCaatattccagaGAT	61_1	917	-22
62	cagcaatattccagag	3-9-4	CAGcaatattccAGAG	62_1	919	-22
63	aatcagcaatattccag	4-9-4	AATCagcaatattCCAG	63_1	921	-23
64	acaatcagcaatattcc	4-9-4	ACAAtcagcaataTTCC	64_1	923	-21
65	actaagtagttacacttct	2-14-3	ACtaagtagttacactTCT	65_1	957	-20
66	ctaagtagttacacttc	4-11-2	CTAAgtagttacactTC	66_1	958	-18
67	gactaagtagttacactt	3-12-3	GACtaagtagttacaCTT	67_1	959	-20
68	tgactaagtagttaca	3-9-4	TGActaagtagtTACA	68_1	962	-19
69	ctttgactaagtagtta	4-10-3	CTTTgactaagtagTTA	69_1	964	-19
70	ctctttgactaagtag	3-10-3	CTCtttgactaagTAG	70_1	967	-19
71	gctctttgactaagta	4-10-2	GCTCtttgactaagTA	71_1	968	-21
72	ccttaaatactgttgac	2-11-4	CCttaaatactgtTGAC	72_1	1060	-20
73	cttaaatactgttgac	2-12-2	CTtaaatactgttgAC	73_1	1060	-13
74	tccttaaatactgttg	3-10-3	TCCttaaatactgTTG	74_1	1062	-18
75	tctccttaaatactgtt	4-11-2	TCTCcttaaatactgTT	75_1	1063	-19
76	tatcatagttctcctt	2-10-4	TAtcatagttctCCTT	76_1	1073	-21
77	agtatcatagttctcc	3-10-3	AGTatcatagttcTCC	77_1	1075	-22
78	gagtatcatagttctc	2-11-3	GAgtatcatagttCTC	78_1	1076	-18
79	agagtatcatagttct	2-10-4	AGagtatcatagTTCT	79_1	1077	-18
79	agagtatcatagttct	3-10-3	AGAgtatcatagtTCT	79_2	1077	-19
80	cagagtatcatagttc	3-10-3	CAGagtatcatagTTC	80_1	1078	-18
81	ttcagagtatcatagt	4-10-2	TTCAgagtatcataGT	81_1	1080	-18
82	cttcagagtatcatag	3-9-4	CTTcagagtatcATAG	82_1	1081	-19
83	ttcttcagagtatcata	4-11-2	TTCTtcagagtatcaTA	83_1	1082	-19
84	tttcttcagagtatcat	3-10-4	TTTcttcagagtaTCAT	84_1	1083	-20
85	gagaaaggctaagttt	4-9-3	GAGAaaggctaagTTT	85_1	1099	-19
86	gacactcttgtacatt	2-10-4	GAcactcttgtaCATT	86_1	1213	-19
87	tgagacactcttgtaca	2-13-2	TGagacactcttgtaCA	87_1	1215	-18
88	tgagacactcttgtac	2-11-3	TGagacactcttgTAC	88_1	1216	-18
89	ctttattaaactccat	2-10-4	CTttattaaactCCAT	89_1	1266	-18
90	accaaactttattaaa	4-10-2	ACCAaactttattaAA	90_1	1272	-14
91	aaacctctactaagtg	4-10-2	AAACctctactaagTG	91_1	1288	-16
92	agattaagacagttga	2-11-3	AGattaagacagtTGA	92_1	1310	-16
93	aagtaggagcaagaggc	2-12-3	AAgtaggagcaagaGGC	93_1	1475	-22
94	aaagtaggagcaagagg	4-10-3	AAAGtaggagcaagAGG	94_1	1476	-20
95	gttaagcagccaggag	2-12-2	GTtaagcagccaggAG	95_1	1806	-20
96	agggtaggatgggtag	2-12-2	AGggtaggatgggtAG	96_1	1842	-20
97	aagggtaggatgggta	3-11-2	AAGggtaggatgggTA	97_1	1843	-20
98	caagggtaggatgggt	2-12-2	CAagggtaggatggGT	98_2	1844	-20
98	caagggtaggatgggt	3-11-2	CAAgggtaggatggGT	98_1	1844	-21
99	ccaagggtaggatggg	2-12-2	CCaagggtaggatgGG	99_1	1845	-22
100	tccaagggtaggatgg	2-12-2	TCcaagggtaggatGG	100_1	1846	-20
101	cttccaagggtaggat	4-10-2	CTTCcaagggtaggAT	101_1	1848	-21
102	atcttccaagggtagga	3-12-2	ATCttccaagggtagGA	102_1	1849	-22
103	agaagtgatggctcatt	2-11-4	AGaagtgatggctCATT	103_1	1936	-21
104	aagaagtgatggctcat	3-10-4	AAGaagtgatggcTCAT	104_1	1937	-21
105	gaagaagtgatggctca	3-11-3	GAAgaagtgatggcTCA	105_1	1938	-21
106	atgaaatgtaaactggg	4-9-4	ATGAaatgtaaacTGGG	106_1	1955	-21
107	caatgaaatgtaaactgg	4-10-4	CAATgaaatgtaaaCTGG	107_1	1956	-20
108	gcaatgaaatgtaaactg	4-10-4	GCAAtgaaatgtaaACTG	108_1	1957	-20
109	agcaatgaaatgtaaact	4-10-4	AGCAatgaaatgtaAACT	109_1	1958	-20
110	gagcaatgaaatgtaaac	4-10-4	GAGCaatgaaatgtAAAC	110_1	1959	-19
111	tgaattcccatatccga	2-12-3	TGaattcccatatcCGA	111_1	1992	-22
112	agaattatgaccatat	2-11-3	AGaattatgaccaTAT	112_1	2010	-15
113	aggtaagaattatgacc	3-10-4	AGGtaagaattatGACC	113_1	2014	-21
114	tcaggtaagaattatgac	4-10-4	TCAGgtaagaattaTGAC	114_1	2015	-22
115	cttcaggtaagaattatg	4-10-4	CTTCaggtaagaatTATG	115_1	2017	-21
116	tcttcaggtaagaatta	4-9-4	TCTTcaggtaagaATTA	116_1	2019	-20
117	cttcttcaggtaagaat	4-9-4	CTTCttcaggtaaGAAT	117_1	2021	-21
118	tcttcttcaggtaagaa	4-10-3	TCTTcttcaggtaaGAA	118_1	2022	-20
119	tcttcttcaggtaaga	3-10-3	TCTtcttcaggtaAGA	119_1	2023	-20
120	tggtctaagagaagaag	3-10-4	TGGtctaagagaaGAAG	120_1	2046	-20
121	gttggtctaagagaag	4-9-3	GTTGgtctaagagAAG	121_1	2049	-19
123	cagttggtctaagagaa	2-11-4	CAgttggtctaagAGAA	123_1	2050	-20
124	gcagttggtctaagagaa	3-13-2	GCAgttggtctaagagAA	124_1	2050	-22
122	agttggtctaagagaa	3-9-4	AGTtggtctaagAGAA	122_1	2050	-20
126	gcagttggtctaagaga	2-13-2	GCagttggtctaagaGA	126_1	2051	-21
125	cagttggtctaagaga	4-10-2	CAGTtggtctaagaGA	125_1	2051	-21
127	gcagttggtctaagag	2-11-3	GCagttggtctaaGAG	127_1	2052	-21
128	ctcatatcagggcagt	2-10-4	CTcatatcagggCAGT	128_1	2063	-24
129	cacacatgttctttaac	4-11-2	CACAcatgttctttaAC	129_1	2087	-18
130	taaatacacacatgttct	3-11-4	TAAatacacacatgTTCT	130_1	2092	-19
131	gtaaatacacacatgttc	4-11-3	GTAAatacacacatgTTC	131_1	2093	-19
132	tgtaaatacacacatgtt	4-10-4	TGTAaatacacacaTGTT	132_1	2094	-22
133	gatcatgtaaatacacac	4-10-4	GATCatgtaaatacACAC	133_1	2099	-20
134	agatcatgtaaatacaca	4-10-4	AGATcatgtaaataCACA	134_1	2100	-21
135	caaagatcatgtaaatacac	4-12-4	CAAAgatcatgtaaatACAC	135_1	2101	-19
136	acaaagatcatgtaaataca	4-12-4	ACAAagatcatgtaaaTACA	136_1	2102	-20
137	gaatacaaagatcatgta	4-10-4	GAATacaaagatcaTGTA	137_1	2108	-20
138	agaatacaaagatcatgt	4-10-4	AGAAtacaaagatcATGT	138_1	2109	-20
139	cagaatacaaagatcatg	4-10-4	CAGAatacaaagatCATG	139_1	2110	-21
140	gcagaatacaaagatca	4-9-4	GCAGaatacaaagATCA	140_1	2112	-22
141	aggcagaatacaaagat	4-11-2	AGGCagaatacaaagAT	141_1	2114	-19
142	aaggcagaatacaaaga	4-10-3	AAGGcagaatacaaAGA	142_1	2115	-19
143	attagtgagggacgaa	3-10-3	ATTagtgagggacGAA	143_1	2132	-18
144	cattagtgagggacga	2-11-3	CAttagtgagggaCGA	144_1	2133	-20
145	gagggtgatggattag	2-11-3	GAgggtgatggatTAG	145_1	2218	-19
146	ttaggagtaataaagg	2-10-4	TTaggagtaataAAGG	146_1	2241	-14
147	ttaatgaatttggttg	3-11-2	TTAatgaatttggtTG	147_1	2263	-13
148	ctttaatgaatttggt	2-12-2	CTttaatgaatttgGT	148_1	2265	-14
149	catggattacaactaa	4-10-2	CATGgattacaactAA	149_1	2322	-16
150	tcatggattacaacta	2-11-3	TCatggattacaaCTA	150_1	2323	-16
151	gtcatggattacaact	3-11-2	GTCatggattacaaCT	151_1	2324	-18
152	cattaaatctagtcat	2-10-4	CAttaaatctagTCAT	152_1	2335	-16
153	gacattaaatctagtca	4-10-3	GACAttaaatctagTCA	153_1	2336	-19
154	agggacattaaatcta	4-10-2	AGGGacattaaatcTA	154_1	2340	-18
155	caaagcattataacca	4-9-3	CAAAgcattataaCCA	155_1	2372	-18
156	acttactaggcagaag	2-10-4	ACttactaggcaGAAG	156_1	2415	-19
157	cagagttaactgtaca	4-10-2	CAGAgttaactgtaCA	157_1	2545	-20
158	ccagagttaactgtac	4-10-2	CCAGagttaactgtAC	158_1	2546	-20
159	gccagagttaactgta	2-12-2	GCcagagttaactgTA	159_1	2547	-20
160	tgggccagagttaact	2-12-2	TGggccagagttaaCT	160_1	2550	-21
161	cagcatctatcagact	2-12-2	CAgcatctatcagaCT	161_1	2576	-19
162	tgaaataacatgagtcat	3-11-4	TGAaataacatgagTCAT	162_1	2711	-19
163	gtgaaataacatgagtc	3-10-4	GTGaaataacatgAGTC	163_1	2713	-19
164	tctgtttatgtcactg	4-10-2	TCTGtttatgtcacTG	164_1	2781	-20
165	gtctgtttatgtcact	4-10-2	GTCTgtttatgtcaCT	165_1	2782	-22
166	tggtctgtttatgtca	2-10-4	TGgtctgtttatGTCA	166_1	2784	-21
167	ttggtctgtttatgtc	4-10-2	TTGGtctgtttatgTC	167_1	2785	-20
168	tcacccattgtttaaa	2-12-2	TCacccattgtttaAA	168_1	2842	-15
169	ttcagcaaatattcgt	2-10-4	TTcagcaaatatTCGT	169_1	2995	-17
170	gtgtgttcagcaaatat	3-10-4	GTGtgttcagcaaATAT	170_1	2999	-21
171	tctattgttaggtatc	3-10-3	TCTattgttaggtATC	171_1	3053	-18
172	attgcccatcttactg	2-12-2	ATtgcccatcttacTG	172_1	3118	-19
173	tattgcccatcttact	3-11-2	TATtgcccatcttaCT	173_1	3119	-21
174	aaatattgcccatctt	2-11-3	AAatattgcccatCTT	174_1	3122	-17
175	ataaccttatcataca	3-11-2	ATAaccttatcataCA	175_1	3174	-16
176	tataaccttatcatac	2-11-3	TAtaaccttatcaTAC	176_1	3175	-14
177	ttataaccttatcata	3-11-2	TTAtaaccttatcaTA	177_1	3176	-14
178	tttataaccttatcat	3-10-3	TTTataaccttatCAT	178_1	3177	-16
179	actgctattgctatct	2-11-3	ACtgctattgctaTCT	179_1	3375	-19
180	aggactgctattgcta	2-11-3	AGgactgctattgCTA	180_1	3378	-21
181	gaggactgctattgct	3-11-2	GAGgactgctattgCT	181_1	3379	-22
182	acgtagaataataaca	2-12-2	ACgtagaataataaCA	182_1	3561	-11
183	ccaagtgatataatgg	2-10-4	CCaagtgatataATGG	183_1	3613	-19
184	ttagcagaccaagtga	2-10-4	TTagcagaccaaGTGA	184_1	3621	-21
185	gtttagcagaccaagt	2-12-2	GTttagcagaccaaGT	185_1	3623	-19
186	tgacagtgattatatt	2-12-2	TGacagtgattataTT	186_1	3856	-13
187	tgtccaagatattgac	4-10-2	TGTCcaagatattgAC	187_1	3868	-18
188	gaatatcctagattgt	3-10-3	GAAtatcctagatTGT	188_1	4066	-18
189	caaactgagaatatcc	2-11-3	CAaactgagaataTCC	189_1	4074	-16
190	gcaaactgagaatatc	3-11-2	GCAaactgagaataTC	190_1	4075	-16
191	tcctattacaatcgta	3-11-2	TCCtattacaatcgTA	191_1	4214	-19
192	ttcctattacaatcgt	4-10-2	TTCCtattacaatcGT	192_1	4215	-19
193	actaatgggaggattt	2-12-2	ACtaatgggaggatTT	193_1	4256	-15
194	tagttcagagaataag	2-12-2	TAgttcagagaataAG	194_1	4429	-13
195	taacatatagttcaga	2-11-3	TAacatatagttcAGA	195_1	4436	-15
196	ataacatatagttcag	3-11-2	ATAacatatagttcAG	196_1	4437	-14
197	cataacatatagttca	2-12-2	CAtaacatatagttCA	197_1	4438	-13
198	tcataacatatagttc	2-12-2	TCataacatatagtTC	198_1	4439	-12
199	tagctcctaacaatca	4-10-2	TAGCtcctaacaatCA	199_1	4507	-22
200	ctccaatctttgtata	4-10-2	CTCCaatctttgtaTA	200_1	4602	-20
201	tctccaatctttgtat	4-10-2	TCTCcaatctttgtAT	201_1	4603	-19
202	tctatttcagccaatc	2-12-2	TCtatttcagccaaTC	202_1	4708	-17
203	cggaagtcagagtgaa	3-10-3	CGGaagtcagagtGAA	203_1	4782	-19
204	ttaagcatgaggaata	4-10-2	TTAAgcatgaggaaTA	204_1	4798	-16
205	tgattgagcacctctt	3-10-3	TGAttgagcacctCTT	205_1	4831	-22
206	gactaattatttcgtt	3-11-2	GACtaattatttcgTT	206_1	4857	-15
207	tgactaattatttcgt	3-10-3	TGActaattatttCGT	207_1	4858	-17
208	gtgactaattatttcg	3-10-3	GTGactaattattTCG	208_1	4859	-17
209	ctgcttgaaatgtgac	4-10-2	CTGCttgaaatgtgAC	209_1	4870	-20
210	cctgcttgaaatgtga	2-11-3	CCtgcttgaaatgTGA	210_1	4871	-21
211	atcctgcttgaaatgt	2-10-4	ATcctgcttgaaATGT	211_1	4873	-20
212	attataaatctattct	3-10-3	ATTataaatctatTCT	212_1	5027	-13
213	gctaaatactttcatc	2-11-3	GCtaaatactttcATC	213_1	5151	-16
214	cattgtaacataccta	2-10-4	CAttgtaacataCCTA	214_1	5251	-19
215	gcattgtaacatacct	2-12-2	GCattgtaacatacCT	215_1	5252	-18
216	taatattgcaccaaat	2-12-2	TAatattgcaccaaAT	216_1	5295	-13
217	gataatattgcaccaa	2-11-3	GAtaatattgcacCAA	217_1	5297	-16
218	agataatattgcacca	2-12-2	AGataatattgcacCA	218_1	5298	-16
219	gccaagaagataatat	2-10-4	GCcaagaagataATAT	219_1	5305	-17
220	cacagccacataaact	4-10-2	CACAgccacataaaCT	220_1	5406	-21
221	ttgtaattgtggaaac	2-12-2	TTgtaattgtggaaAC	221_1	5463	-12
222	tgacttgtaattgtgg	2-11-3	TGacttgtaattgTGG	222_1	5467	-18
223	tctaactgaaatagtc	2-12-2	TCtaactgaaatagTC	223_1	5503	-13
224	gtggttctaactgaaa	3-11-2	GTGgttctaactgaAA	224_1	5508	-16
225	caatatgggacttggt	2-12-2	CAatatgggacttgGT	225_1	5522	-18
226	atgacaatatgggact	3-11-2	ATGacaatatgggaCT	226_1	5526	-17
227	tatgacaatatgggac	4-10-2	TATGacaatatgggAC	227_1	5527	-17
228	atatgacaatatggga	4-10-2	ATATgacaatatggGA	228_1	5528	-17
229	cttcacttaataatta	2-11-3	CTtcacttaataaTTA	229_1	5552	-13
230	ctgcttcacttaataa	4-10-2	CTGCttcacttaatAA	230_1	5555	-18
231	aagactgcttcactta	2-11-3	AAgactgcttcacTTA	231_1	5559	-17
232	gaatgccctaattatg	4-10-2	GAATgccctaattaTG	232_1	5589	-19
233	tggaatgccctaatta	3-11-2	TGGaatgccctaatTA	233_1	5591	-19
234	gcaaatgccagtaggt	3-11-2	GCAaatgccagtagGT	234_1	5642	-23
235	ctaatggaaggatttg	3-11-2	CTAatggaaggattTG	235_1	5673	-15
236	aatatagaacctaatg	2-12-2	AAtatagaacctaaTG	236_1	5683	-10
237	gaaagaatagaatgtt	3-10-3	GAAagaatagaatGTT	237_1	5769	-12
238	atgggtaatagattat	3-11-2	ATGggtaatagattAT	238_1	5893	-15
239	gaaagagcacagggtg	2-12-2	GAaagagcacagggTG	239_1	6103	-18
240	ctacatagagggaatg	4-10-2	CTACatagagggaaTG	240_1	6202	-18
241	gcttcctacatagagg	2-10-4	GCttcctacataGAGG	241_1	6207	-24
242	tgcttcctacatagag	4-10-2	TGCTtcctacatagAG	242_1	6208	-22
243	tgggcttgaaatatgt	2-11-3	TGggcttgaaataTGT	243_1	6417	-19
244	cattatatttaagaac	3-11-2	CATtatatttaagaAC	244_1	6457	-11
245	tcggttatgttatcat	2-10-4	TCggttatgttaTCAT	245_1	6470	-19
246	cactttatctggtcgg	2-10-4	CActttatctggTCGG	246_1	6482	-22
247	aaattggcacagcgtt	3-10-3	AAAttggcacagcGTT	247_1	6505	-18
248	accgtgacagtaaatg	4-9-3	ACCGtgacagtaaATG	248_1	6577	-20
249	tgggaaccgtgacagta	2-13-2	TGggaaccgtgacagTA	249_1	6581	-22
250	ccacatataggtcctt	2-11-3	CCacatataggtcCTT	250_1	6597	-21
251	catattgctaccatac	2-11-3	CAtattgctaccaTAC	251_1	6617	-18
252	tcatattgctaccata	3-10-3	TCAtattgctaccATA	252_1	6618	-19
253	caattgtcatattgct	4-8-4	CAATtgtcatatTGCT	253_1	6624	-21
254	cattcaattgtcatattg	3-12-3	CATtcaattgtcataTTG	254_1	6626	-18
255	tttctactgggaatttg	4-9-4	TTTCtactgggaaTTTG	255_1	6644	-20
256	caattagtgcagccag	3-10-3	CAAttagtgcagcCAG	256_1	6672	-21
257	gaataatgttcttatcc	4-10-3	GAATaatgttcttaTCC	257_1	6704	-20
258	cacaaattgaataatgttct	4-13-3	CACAaattgaataatgtTCT	258_1	6709	-20
259	catgcacaaattgaataat	4-11-4	CATGcacaaattgaaTAAT	259_1	6714	-20
260	atcctgcaatttcacat	3-11-3	ATCctgcaatttcaCAT	260_1	6832	-22
261	ccaccatagctgatca	2-12-2	CCaccatagctgatCA	261_1	6868	-22
262	accaccatagctgatca	2-12-3	ACcaccatagctgaTCA	262_1	6868	-23
263	caccaccatagctgatc	2-13-2	CAccaccatagctgaTC	263_1	6869	-21
264	tagtcggcaccaccat	2-12-2	TAgtcggcaccaccAT	264_1	6877	-22
265	cttgtagtcggcaccac	1-14-2	CttgtagtcggcaccAC	265_1	6880	-21
266	cttgtagtcggcacca	1-13-2	CttgtagtcggcacCA	266_1	6881	-21
267	cgcttgtagtcggcac	2-12-2	CGcttgtagtcggcAC	267_1	6883	-21
268	tcaataaagatcaggc	3-11-2	TCAataaagatcagGC	268_1	6942	-17
269	tggacttacaagaatg	2-12-2	TGgacttacaagaaTG	269_1	6986	-14
270	atggacttacaagaat	3-11-2	ATGgacttacaagaAT	270_1	6987	-15
271	gctcaagaaattggat	4-10-2	GCTCaagaaattggAT	271_1	7073	-19
272	tactgtagaacatggc	4-10-2	TACTgtagaacatgGC	272_1	7133	-21
273	gcaattcatttgatct	4-9-3	GCAAttcatttgaTCT	273_1	7239	-20
274	tgaagggaggagggacac	2-14-2	TGaagggaggagggacAC	274_1	7259	-20
275	agtggtgaagggaggag	2-13-2	AGtggtgaagggaggAG	275_1	7265	-21
276	tagtggtgaagggaggag	2-14-2	TAgtggtgaagggaggAG	276_1	7265	-21
277	atagtggtgaagggaggag	1-16-2	AtagtggtgaagggaggAG	277_1	7265	-20
278	tagtggtgaagggagga	2-13-2	TAgtggtgaagggagGA	278_1	7266	-21
279	atagtggtgaagggagga	2-14-2	ATagtggtgaagggagGA	279_1	7266	-21
280	tagtggtgaagggagg	3-11-2	TAGtggtgaagggaGG	280_1	7267	-21
281	atagtggtgaagggagg	3-12-2	ATAgtggtgaagggaGG	281_1	7267	-22
282	gatagtggtgaagggagg	2-14-2	GAtagtggtgaagggaGG	282_1	7267	-21
283	atagtggtgaagggag	4-10-2	ATAGtggtgaagggAG	283_1	7268	-20
284	gatagtggtgaagggag	2-12-3	GAtagtggtgaaggGAG	284_1	7268	-21
285	gagatagtggtgaagg	2-10-4	GAgatagtggtgAAGG	285_1	7271	-20
286	catgggagatagtggt	4-10-2	CATGggagatagtgGT	286_1	7276	-22
287	acaaataatggttactct	4-10-4	ACAAataatggttaCTCT	287_1	7302	-20
288	acacacaaataatggtta	4-10-4	ACACacaaataatgGTTA	288_1	7306	-20
289	gagggacacacaaataat	3-11-4	GAGggacacacaaaTAAT	289_1	7311	-21
290	atatagagaggctcaa	4-8-4	ATATagagaggcTCAA	290_1	7390	-21
291	ttgatatagagaggct	2-10-4	TTgatatagagaGGCT	291_1	7393	-20
292	gcatttgatatagaga	4-9-3	GCATttgatatagAGA	292_1	7397	-20
293	tttgcatttgatatag	2-11-3	TTtgcatttgataTAG	293_1	7400	-15
294	ctggaagaataggttc	3-11-2	CTGgaagaataggtTC	294_1	7512	-17
295	actggaagaataggtt	4-10-2	ACTGgaagaataggTT	295_1	7513	-18
296	tactggaagaataggt	4-10-2	TACTggaagaatagGT	296_1	7514	-18
297	tggcttatcctgtact	4-10-2	TGGCttatcctgtaCT	297_1	7526	-25
298	atggcttatcctgtac	2-10-4	ATggcttatcctGTAC	298_1	7527	-22
299	tatggcttatcctgta	4-10-2	TATGgcttatcctgTA	299_1	7528	-22
300	gtatggcttatcctgt	3-10-3	GTAtggcttatccTGT	300_1	7529	-23
301	atgaatatatgcccagt	2-11-4	ATgaatatatgccCAGT	301_1	7547	-22
302	gatgaatatatgccca	2-10-4	GAtgaatatatgCCCA	302_1	7549	-22
303	caagatgaatatatgcc	3-10-4	CAAgatgaatataTGCC	303_1	7551	-21
304	gacaacatcagtataga	4-9-4	GACAacatcagtaTAGA	304_1	7572	-22
305	caagacaacatcagta	4-8-4	CAAGacaacatcAGTA	305_1	7576	-20
306	cactcctagttccttt	3-10-3	CACtcctagttccTTT	306_1	7601	-22
307	aacactcctagttcct	3-10-3	AACactcctagttCCT	307_1	7603	-22
308	taacactcctagttcc	2-11-3	TAacactcctagtTCC	308_1	7604	-20
309	ctaacactcctagttc	2-12-2	CTaacactcctagtTC	309_1	7605	-18
310	tgataacataactgtg	2-12-2	TGataacataactgTG	310_1	7637	-13
311	ctgataacataactgt	2-10-4	CTgataacataaCTGT	311_1	7638	-18
312	tttgaactcaagtgac	4-10-2	TTTGaactcaagtgAC	312_1	7654	-16
313	tcctttacttagctag	4-9-3	TCCTttacttagcTAG	313_1	7684	-23
314	gagtttggattagctg	2-11-3	GAgtttggattagCTG	314_1	7764	-20
315	tgggatatgacaggga	2-11-3	TGggatatgacagGGA	315_1	7838	-21
316	tgtgggatatgacagg	4-10-2	TGTGggatatgacaGG	316_1	7840	-22
317	atatggaagggatatc	4-10-2	ATATggaagggataTC	317_1	7875	-17
318	acaggatatggaaggg	3-10-3	ACAggatatggaaGGG	318_1	7880	-21
319	atttcaacaggatatgg	4-9-4	ATTTcaacaggatATGG	319_1	7885	-20
320	gagtaatttcaacagg	2-11-3	GAgtaatttcaacAGG	320_1	7891	-17
321	agggagtaatttcaaca	4-9-4	AGGGagtaatttcAACA	321_1	7893	-22
322	attagggagtaatttca	4-9-4	ATTAgggagtaatTTCA	322_1	7896	-21
323	cttactattagggagt	2-10-4	CTtactattaggGAGT	323_1	7903	-20
324	cagcttactattaggg	2-11-3	CAgcttactattaGGG	324_1	7906	-20
326	atttcagcttactattag	3-11-4	ATTtcagcttactaTTAG	326_1	7908	-20
325	tcagcttactattagg	3-10-3	TCAgcttactattAGG	325_1	7907	-20
327	ttcagcttactattag	2-10-4	TTcagcttactaTTAG	327_1	7908	-17
328	cagatttcagcttact	4-10-2	CAGAtttcagcttaCT	328_1	7913	-21
329	gactacaactagaggg	3-11-2	GACtacaactagagGG	329_1	7930	-19
330	agactacaactagagg	4-10-2	AGACtacaactagaGG	330_1	7931	-19
331	aagactacaactagag	2-12-2	AAgactacaactagAG	331_1	7932	-13
332	atgatttaattctagtcaaa	4-12-4	ATGAtttaattctagtCAAA	332_1	7982	-20
333	tttaattctagtcaaa	3-10-3	TTTaattctagtcAAA	333_1	7982	-12
334	gatttaattctagtca	4-8-4	GATTtaattctaGTCA	334_1	7984	-20
771	tgatttaattctagtca	3-10-4	TGAtttaattctaGTCA	771_1	7984	-20
335	atgatttaattctagtca	4-11-3	ATGAtttaattctagTCA	335_1	7984	-20
336	gatgatttaattctagtca	4-13-2	GATGatttaattctagtCA	336_1	7984	-20
337	gatttaattctagtca	2-10-4	GAtttaattctaGTCA	337_1	7984	-18
338	gatgatttaattctagtc	4-11-3	GATGatttaattctaGTC	338_1	7985	-20
339	tgatttaattctagtc	2-12-2	TGatttaattctagTC	339_1	7985	-13
340	gagatgatttaattcta	4-9-4	GAGAtgatttaatTCTA	340_1	7988	-20
341	gagatgatttaattct	3-10-3	GAGatgatttaatTCT	341_1	7989	-16
342	cagattgatggtagtt	4-10-2	CAGAttgatggtagTT	342_1	8030	-19
343	ctcagattgatggtag	2-10-4	CTcagattgatgGTAG	343_1	8032	-20
344	gttagccctcagattg	3-10-3	GTTagccctcagaTTG	344_1	8039	-23
345	tgtattgttagccctc	2-10-4	TGtattgttagcCCTC	345_1	8045	-24
346	acttgtattgttagcc	2-10-4	ACttgtattgttAGCC	346_1	8048	-22
347	agccagtatcagggac	3-11-2	AGCcagtatcagggAC	347_1	8191	-23
348	ttgacaatagtggcat	2-10-4	TTgacaatagtgGCAT	348_1	8213	-20
349	acaagtggtatcttct	3-10-3	ACAagtggtatctTCT	349_1	8228	-19
350	aatctactttacaagt	4-10-2	AATCtactttacaaGT	350_1	8238	-16
351	cacagtagatgcctgata	2-12-4	CAcagtagatgcctGATA	351_1	8351	-24
352	gaacacagtagatgcc	2-11-3	GAacacagtagatGCC	352_1	8356	-21
353	cttggaacacagtagat	4-11-2	CTTGgaacacagtagAT	353_1	8359	-20
354	atatcttggaacacag	3-10-3	ATAtcttggaacaCAG	354_1	8364	-18
355	tctttaatatcttggaac	3-11-4	TCTttaatatcttgGAAC	355_1	8368	-19
356	tgatttctttaatatcttg	2-13-4	TGatttctttaatatCTTG	356_1	8372	-19
357	tgatgatttctttaatatc	2-13-4	TGatgatttctttaaTATC	357_1	8375	-18
358	aggctaagtcatgatg	3-11-2	AGGctaagtcatgaTG	358_1	8389	-19
359	ttgatgaggctaagtc	4-10-2	TTGAtgaggctaagTC	359_1	8395	-19
360	ccaggattatactctt	3-11-2	CCAggattatactcTT	360_1	8439	-20
361	gccaggattatactct	2-10-4	GCcaggattataCTCT	361_1	8440	-23
362	ctgccaggattatact	3-11-2	CTGccaggattataCT	362_1	8442	-21
363	cagaaacttatactttatg	4-13-2	CAGAaacttatactttaTG	363_1	8473	-19
364	aagcagaaacttatact	4-9-4	AAGCagaaacttaTACT	364_1	8478	-20
365	gaagcagaaacttatact	3-11-4	GAAgcagaaacttaTACT	365_1	8478	-20
366	tggaagcagaaacttatact	3-15-2	TGGaagcagaaacttataCT	366_1	8478	-21
367	tggaagcagaaacttatac	3-13-3	TGGaagcagaaacttaTAC	367_1	8479	-20
368	aagcagaaacttatac	2-11-3	AAgcagaaacttaTAC	368_1	8479	-13
369	tggaagcagaaacttata	3-11-4	TGGaagcagaaactTATA	369_1	8480	-21
370	aagggatattatggag	4-10-2	AAGGgatattatggAG	370_1	8587	-18
371	tgccggaagatttcct	2-12-2	TGccggaagatttcCT	371_1	8641	-21
372	atggattgggagtaga	4-10-2	ATGGattgggagtaGA	372_1	8772	-21
373	agatggattgggagta	2-12-2	AGatggattgggagTA	373_1	8774	-18
374	aagatggattgggagt	3-11-2	AAGatggattgggaGT	374_1	8775	-18
375	acaagatggattggga	2-10-4	ACaagatggattGGGA	375_1	8777	-20
375	acaagatggattggga	2-12-2	ACaagatggattggGA	375_2	8777	-17
376	agaaggttcagacttt	3-9-4	AGAaggttcagaCTTT	376_1	8835	-20
377	gcagaaggttcagact	2-11-3	GCagaaggttcagACT	377_1	8837	-21
377	gcagaaggttcagact	3-11-2	GCAgaaggttcagaCT	377_2	8837	-22
378	tgcagaaggttcagac	4-10-2	TGCAgaaggttcagAC	378_1	8838	-22
379	agtgcagaaggttcag	2-11-3	AGtgcagaaggttCAG	379_1	8840	-20
379	agtgcagaaggttcag	4-10-2	AGTGcagaaggttcAG	379_2	8840	-21
380	aagtgcagaaggttca	4-10-2	AAGTgcagaaggttCA	380_1	8841	-20
381	taagtgcagaaggttc	2-10-4	TAagtgcagaagGTTC	381_1	8842	-19
382	tctaagtgcagaaggt	2-10-4	TCtaagtgcagaAGGT	382_1	8844	-21
383	ctcaggagttctacttc	3-12-2	CTCaggagttctactTC	383_1	8948	-20
384	ctcaggagttctactt	3-10-3	CTCaggagttctaCTT	384_1	8949	-21
385	atggaggtgactcaggag	1-15-2	AtggaggtgactcaggAG	385_1	8957	-20
386	atggaggtgactcagga	2-13-2	ATggaggtgactcagGA	386_1	8958	-21
387	atggaggtgactcagg	2-11-3	ATggaggtgactcAGG	387_1	8959	-21
388	tatggaggtgactcagg	2-12-3	TAtggaggtgactcAGG	388_1	8959	-21
389	atatggaggtgactcagg	2-14-2	ATatggaggtgactcaGG	389_1	8959	-21
390	tatggaggtgactcag	4-10-2	TATGgaggtgactcAG	390_1	8960	-21
391	atatggaggtgactcag	2-11-4	ATatggaggtgacTCAG	391_1	8960	-22
392	catatggaggtgactcag	2-14-2	CAtatggaggtgactcAG	392_1	8960	-20
393	atatggaggtgactca	3-10-3	ATAtggaggtgacTCA	393_1	8961	-20
394	catatggaggtgactca	2-12-3	CAtatggaggtgacTCA	394_1	8961	-21
395	catatggaggtgactc	2-10-4	CAtatggaggtgACTC	395_1	8962	-20
396	gcatatggaggtgactc	2-13-2	GCatatggaggtgacTC	396_1	8962	-21
397	tgcatatggaggtgactc	2-14-2	TGcatatggaggtgacTC	397_1	8962	-21
398	ttgcatatggaggtgactc	1-16-2	TtgcatatggaggtgacTC	398_1	8962	-20
399	tttgcatatggaggtgactc	1-17-2	TttgcatatggaggtgacTC	399_1	8962	-21
400	gcatatggaggtgact	2-12-2	GCatatggaggtgaCT	400_1	8963	-20
401	tgcatatggaggtgact	2-13-2	TGcatatggaggtgaCT	401_1	8963	-20
402	ttgcatatggaggtgact	3-13-2	TTGcatatggaggtgaCT	402_1	8963	-22
403	tttgcatatggaggtgact	1-16-2	TttgcatatggaggtgaCT	403_1	8963	-20
404	tgcatatggaggtgac	3-11-2	TGCatatggaggtgAC	404_1	8964	-20
405	ttgcatatggaggtgac	3-11-3	TTGcatatggaggtGAC	405_1	8964	-21
406	tttgcatatggaggtgac	4-12-2	TTTGcatatggaggtgAC	406_1	8964	-21
407	tttgcatatggaggtga	4-11-2	TTTGcatatggaggtGA	407_1	8965	-21
408	tttgcatatggaggtg	2-10-4	TTtgcatatggaGGTG	408_1	8966	-21
409	aagtgaagttcaacagc	2-11-4	AAgtgaagttcaaCAGC	409_1	8997	-20
410	tgggaagtgaagttca	2-10-4	TGggaagtgaagTTCA	410_1	9002	-20
411	atgggaagtgaagttc	2-11-3	ATgggaagtgaagTTC	411_1	9003	-17
412	gatgggaagtgaagtt	4-9-3	GATGggaagtgaaGTT	412_1	9004	-21
413	ctgtgatgggaagtgaa	3-11-3	CTGtgatgggaagtGAA	413_1	9007	-20
414	attgagtgaatccaaa	3-10-3	ATTgagtgaatccAAA	414_1	9119	-14
415	aattgagtgaatccaa	2-10-4	AAttgagtgaatCCAA	415_1	9120	-16
416	gataattgagtgaatcc	4-10-3	GATAattgagtgaaTCC	416_1	9122	-20
417	gtgataattgagtgaa	3-10-3	GTGataattgagtGAA	417_1	9125	-16
418	aagaaaggtgcaataa	3-10-3	AAGaaaggtgcaaTAA	418_1	9155	-14
419	caagaaaggtgcaata	2-10-4	CAagaaaggtgcAATA	419_1	9156	-15
420	acaagaaaggtgcaat	4-10-2	ACAAgaaaggtgcaAT	420_1	9157	-16
421	atttaaactcacaaac	2-12-2	ATttaaactcacaaAC	421_1	9171	-10
422	ctgttaggttcagcga	2-10-4	CTgttaggttcaGCGA	422_1	9235	-24
423	tctgaatgaacatttcg	4-9-4	TCTGaatgaacatTTCG	423_1	9260	-20
424	ctcattgaaggttctg	2-10-4	CTcattgaaggtTCTG	424_1	9281	-20
425	ctaatctcattgaagg	3-11-2	CTAatctcattgaaGG	425_1	9286	-17
426	cctaatctcattgaag	2-12-2	CCtaatctcattgaAG	426_1	9287	-16
427	actttgatctttcagc	3-10-3	ACTttgatctttcAGC	427_1	9305	-20
428	actatgcaacactttg	2-12-2	ACtatgcaacacttTG	428_1	9315	-15
429	caaatagctttatcgg	3-10-3	CAAatagctttatCGG	429_1	9335	-17
430	ccaaatagctttatcg	2-10-4	CCaaatagctttATCG	430_1	9336	-19
431	tccaaatagctttatc	4-10-2	TCCAaatagctttaTC	431_1	9337	-18
432	gatccaaatagcttta	4-10-2	GATCcaaatagcttTA	432_1	9339	-18
433	atgatccaaatagctt	2-10-4	ATgatccaaataGCTT	433_1	9341	-19
434	tatgatccaaatagct	4-10-2	TATGatccaaatagCT	434_1	9342	-18
435	taaacagggctgggaat	4-9-4	TAAAcagggctggGAAT	435_1	9408	-22
436	acttaaacagggctgg	2-10-4	ACttaaacagggCTGG	436_1	9412	-21
437	acacttaaacagggct	2-10-4	ACacttaaacagGGCT	437_1	9414	-22
438	gaacacttaaacaggg	4-8-4	GAACacttaaacAGGG	438_1	9416	-20
439	agagaacacttaaacag	4-9-4	AGAGaacacttaaACAG	439_1	9418	-20
440	ctacagagaacactta	4-8-4	CTACagagaacaCTTA	440_1	9423	-20
441	atgctacagagaacact	3-10-4	ATGctacagagaaCACT	441_1	9425	-22
442	ataaatgctacagagaaca	4-11-4	ATAAatgctacagagAACA	442_1	9427	-20
443	agataaatgctacagaga	2-12-4	AGataaatgctacaGAGA	443_1	9430	-20
444	tagagataaatgctaca	4-9-4	TAGAgataaatgcTACA	444_1	9434	-21
445	tagatagagataaatgct	4-11-3	TAGAtagagataaatGCT	445_1	9437	-20
446	caatatactagatagaga	4-10-4	CAATatactagataGAGA	446_1	9445	-21
447	tacacaatatactagatag	4-11-4	TACAcaatatactagATAG	447_1	9448	-21
448	ctacacaatatactag	3-10-3	CTAcacaatatacTAG	448_1	9452	-16
449	gctacacaatatacta	4-8-4	GCTAcacaatatACTA	449_1	9453	-21
450	atatgctacacaatatac	4-10-4	ATATgctacacaatATAC	450_1	9455	-20
451	tgatatgctacacaat	4-8-4	TGATatgctacaCAAT	451_1	9459	-20
452	atgatatgatatgctac	4-9-4	ATGAtatgatatgCTAC	452_1	9464	-21
453	gaggagagagacaataaa	4-10-4	GAGGagagagacaaTAAA	453_1	9495	-20
454	ctaggaggagagagaca	3-11-3	CTAggaggagagagACA	454_1	9500	-22
455	tattctaggaggagaga	4-10-3	TATTctaggaggagAGA	455_1	9504	-21
456	ttatattctaggaggag	4-10-3	TTATattctaggagGAG	456_1	9507	-21
457	gtttatattctaggag	3-9-4	GTTtatattctaGGAG	457_1	9510	-20
458	tggagtttatattctagg	2-12-4	TGgagtttatattcTAGG	458_1	9512	-22
459	cgtaccaccactctgc	2-11-3	CGtaccaccactcTGC	459_1	9590	-25
460	tgaggaaatcattcattc	4-10-4	TGAGgaaatcattcATTC	460_1	9641	-22
461	tttgaggaaatcattcat	4-10-4	TTTGaggaaatcatTCAT	461_1	9643	-20
462	aggctaatcctatttg	4-10-2	AGGCtaatcctattTG	462_1	9657	-22
463	tttaggctaatcctat	4-8-4	TTTAggctaatcCTAT	463_1	9660	-22
464	tgctccagtgtaccct	3-11-2	TGCtccagtgtaccCT	464_1	9755	-27
465	tagtagtactcgatag	2-10-4	TAgtagtactcgATAG	465_1	9813	-18
466	ctaattgtagtagtactc	3-12-3	CTAattgtagtagtaCTC	466_1	9818	-20
467	tgctaattgtagtagt	2-10-4	TGctaattgtagTAGT	467_1	9822	-19
468	agtgctaattgtagta	4-10-2	AGTGctaattgtagTA	468_1	9824	-19
469	gcaagtgctaattgta	4-10-2	GCAAgtgctaattgTA	469_1	9827	-20
470	gaggaaatgaactaattta	4-13-2	GAGGaaatgaactaattTA	470_1	9881	-18
471	caggaggaaatgaacta	4-11-2	CAGGaggaaatgaacTA	471_1	9886	-19
472	ccctagagtcatttcc	2-11-3	CCctagagtcattTCC	472_1	9902	-24
473	atcttacatgatgaagc	3-11-3	ATCttacatgatgaAGC	473_1	9925	-20
475	agacacactcagatttcag	2-15-2	AGacacactcagatttcAG	475_1	9967	-20
474	gacacactcagatttcag	3-13-2	GACacactcagatttcAG	474_1	9967	-20
476	aagacacactcagatttcag	3-15-2	AAGacacactcagatttcAG	476_1	9967	-21
477	agacacactcagatttca	2-13-3	AGacacactcagattTCA	477_1	9968	-20
478	aagacacactcagatttca	3-13-3	AAGacacactcagattTCA	478_1	9968	-21
479	aaagacacactcagatttca	2-14-4	AAagacacactcagatTTCA	479_1	9968	-20
480	gaaagacacactcagatttc	3-14-3	GAAagacacactcagatTTC	480_1	9969	-20
481	aagacacactcagatttc	4-11-3	AAGAcacactcagatTTC	481_1	9969	-21
482	aaagacacactcagatttc	4-11-4	AAAGacacactcagaTTTC	482_1	9969	-20
483	tgaaagacacactcagattt	4-14-2	TGAAagacacactcagatTT	483_1	9970	-20
484	tgaaagacacactcagatt	2-13-4	TGaaagacacactcaGATT	484_1	9971	-21
485	tgaaagacacactcagat	3-12-3	TGAaagacacactcaGAT	485_1	9972	-20
486	attgaaagacacactca	4-10-3	ATTGaaagacacacTCA	486_1	9975	-19
487	tcattgaaagacacact	2-11-4	TCattgaaagacaCACT	487_1	9977	-18
488	ttccatcattgaaaga	3-9-4	TTCcatcattgaAAGA	488_1	9983	-18
489	ataataccacttatcat	4-9-4	ATAAtaccacttaTCAT	489_1	10010	-20
490	ttacttaatttctttgga	2-12-4	TTacttaatttcttTGGA	490_1	10055	-20
491	ttagaactagctttatca	3-12-3	TTAgaactagctttaTCA	491_1	10101	-20
492	gaggtacaaatatagg	3-10-3	GAGgtacaaatatAGG	492_1	10171	-18
493	cttatgatacaactta	3-10-3	CTTatgatacaacTTA	493_1	10384	-15
494	tcttatgatacaactt	2-11-3	TCttatgatacaaCTT	494_1	10385	-15
495	ttcttatgatacaact	3-11-2	TTCttatgatacaaCT	495_1	10386	-15
496	cagtttcttatgatac	2-11-3	CAgtttcttatgaTAC	496_1	10390	-16
497	gcagtttcttatgata	3-11-2	GCAgtttcttatgaTA	497_1	10391	-19
498	tacaaatgtctattaggtt	4-12-3	TACAaatgtctattagGTT	498_1	10457	-21
499	tgtacaaatgtctattag	4-11-3	TGTAcaaatgtctatTAG	499_1	10460	-20
500	agcatcacaattagta	3-11-2	AGCatcacaattagTA	500_1	10535	-18
501	ctaatgatagtgaagc	3-11-2	CTAatgatagtgaaGC	501_1	10548	-17
502	agctaatgatagtgaa	3-11-2	AGCtaatgatagtgAA	502_1	10550	-16
503	atgccttgacatatta	4-10-2	ATGCcttgacatatTA	503_1	10565	-20
504	ctcaagattattgacac	4-9-4	CTCAagattattgACAC	504_1	10623	-20
505	acctcaagattattga	2-10-4	ACctcaagattaTTGA	505_2	10626	-18
505	acctcaagattattga	3-9-4	ACCtcaagattaTTGA	505_1	10626	-20
506	aacctcaagattattg	4-10-2	AACCtcaagattatTG	506_1	10627	-17
507	cacaaacctcaagattatt	4-13-2	CACAaacctcaagattaTT	507_1	10628	-20
508	gtacttaattagacct	3-9-4	GTActtaattagACCT	508_1	10667	-21
509	agtacttaattagacc	4-9-3	AGTActtaattagACC	509_1	10668	-20
510	gtatgaggtggtaaac	4-10-2	GTATgaggtggtaaAC	510_1	10688	-18
511	aggaaacagcagaagtg	2-11-4	AGgaaacagcagaAGTG	511_1	10723	-21
512	gcacaacccagaggaa	2-12-2	GCacaacccagaggAA	512_1	10735	-20
513	caagcacaacccagag	3-11-2	CAAgcacaacccagAG	513_1	10738	-20
514	ttcaagcacaacccag	3-10-3	TTCaagcacaaccCAG	514_1	10740	-21
515	aattcaagcacaaccc	2-10-4	AAttcaagcacaACCC	515_1	10742	-20
516	taataattcaagcacaacc	4-13-2	TAATaattcaagcacaaCC	516_1	10743	-20
517	actaataattcaagcac	4-9-4	ACTAataattcaaGCAC	517_1	10747	-20
518	ataatactaataattcaagc	4-12-4	ATAAtactaataattcAAGC	518_1	10749	-19
519	tagatttgtgaggtaa	2-10-4	TAgatttgtgagGTAA	519_1	11055	-18
520	agccttaattctccat	4-10-2	AGCCttaattctccAT	520_1	11091	-24
521	aatgatctagagcctta	4-9-4	AATGatctagagcCTTA	521_1	11100	-22
522	ctaatgatctagagcc	3-10-3	CTAatgatctagaGCC	522_1	11103	-22
523	actaatgatctagagc	3-9-4	ACTaatgatctaGAGC	523_1	11104	-21
524	cattaacatgttcttatt	3-11-4	CATtaacatgttctTATT	524_1	11165	-19
525	acaagtacattaacatgttc	4-12-4	ACAAgtacattaacatGTTC	525_1	11170	-22
526	ttacaagtacattaacatg	4-11-4	TTACaagtacattaaCATG	526_1	11173	-20
527	gctttattcatgtttat	4-9-4	GCTTtattcatgtTTAT	527_1	11195	-22
528	gctttattcatgttta	3-11-2	GCTttattcatgttTA	528_1	11196	-18
529	agagctttattcatgttt	3-13-2	AGAgctttattcatgtTT	529_1	11197	-20
530	ataagagctttattcatg	4-10-4	ATAAgagctttattCATG	530_1	11200	-21
531	cataagagctttattca	4-9-4	CATAagagctttaTTCA	531_1	11202	-21
532	agcataagagctttat	4-8-4	AGCAtaagagctTTAT	532_1	11205	-22
533	tagattgtttagtgca	3-10-3	TAGattgtttagtGCA	533_1	11228	-20
534	gtagattgtttagtgc	2-10-4	GTagattgtttaGTGC	534_1	11229	-21
535	gacaattctagtagatt	4-9-4	GACAattctagtaGATT	535_1	11238	-21
536	ctgacaattctagtag	3-9-4	CTGacaattctaGTAG	536_1	11241	-20
537	gctgacaattctagta	4-10-2	GCTGacaattctagTA	537_1	11242	-21
538	aggattaagatacgta	2-12-2	AGgattaagatacgTA	538_1	11262	-15
539	caggattaagatacgt	2-11-3	CAggattaagataCGT	539_1	11263	-17
540	tcaggattaagatacg	3-11-2	TCAggattaagataCG	540_1	11264	-16
541	ttcaggattaagatac	2-10-4	TTcaggattaagATAC	541_1	11265	-15
542	aggaagaaagtttgattc	4-10-4	AGGAagaaagtttgATTC	542_1	11308	-21
543	tcaaggaagaaagtttga	4-10-4	TCAAggaagaaagtTTGA	543_1	11311	-20
544	ctcaaggaagaaagtttg	4-10-4	CTCAaggaagaaagTTTG	544_1	11312	-20
545	tgctcaaggaagaaagt	3-10-4	TGCtcaaggaagaAAGT	545_1	11315	-21
546	aattatgctcaaggaaga	4-11-3	AATTatgctcaaggaAGA	546_1	11319	-20
547	taggataccacattatga	4-12-2	TAGGataccacattatGA	547_1	11389	-22
548	cataatttattccattcctc	2-15-3	CAtaatttattccattcCTC	548_1	11449	-22
549	tgcataatttattccat	4-10-3	TGCAtaatttattcCAT	549_1	11454	-22
550	actgcataatttattcc	4-10-3	ACTGcataatttatTCC	550_1	11456	-21
551	ctaaactgcataatttatt	4-11-4	CTAAactgcataattTATT	551_1	11458	-20
552	ataactaaactgcata	2-10-4	ATaactaaactgCATA	552_1	11465	-16
553	ttattaataactaaactgc	3-12-4	TTAttaataactaaaCTGC	553_1	11468	-19
554	tagtacattattaataact	4-13-2	TAGTacattattaataaCT	554_1	11475	-18
555	cataactaaggacgtt	4-10-2	CATAactaaggacgTT	555_1	11493	-17
556	tcataactaaggacgt	2-11-3	TCataactaaggaCGT	556_1	11494	-16
557	cgtcataactaaggac	4-10-2	CGTCataactaaggAC	557_1	11496	-17
558	tcgtcataactaagga	2-12-2	TCgtcataactaagGA	558_1	11497	-16
559	atcgtcataactaagg	2-10-4	ATcgtcataactAAGG	559_1	11498	-17
560	gttagtatcttacatt	2-11-3	GTtagtatcttacATT	560_1	11525	-15
561	ctctattgttagtatc	3-10-3	CTCtattgttagtATC	561_1	11532	-17
562	agtatagagttactgt	3-10-3	AGTatagagttacTGT	562_1	11567	-19
563	ttcctggtgatacttt	4-10-2	TTCCtggtgatactTT	563_1	11644	-21
564	gttcctggtgatactt	4-10-2	GTTCctggtgatacTT	564_1	11645	-21
565	tgttcctggtgatact	2-12-2	TGttcctggtgataCT	565_1	11646	-20
566	ataaacatgaatctctcc	2-12-4	ATaaacatgaatctCTCC	566_1	11801	-20
567	ctttataaacatgaatctc	3-12-4	CTTtataaacatgaaTCTC	567_1	11804	-19
568	ctgtctttataaacatg	3-10-4	CTGtctttataaaCATG	568_1	11810	-19
569	ttgttataaatctgtctt	2-12-4	TTgttataaatctgTCTT	569_1	11820	-18
570	ttaaatttattcttggata	3-12-4	TTAaatttattcttgGATA	570_1	11849	-19
571	cttaaatttattcttgga	2-12-4	CTtaaatttattctTGGA	571_1	11851	-19
572	cttcttaaatttattcttg	4-13-2	CTTCttaaatttattctTG	572_1	11853	-18
573	tatgtttctcagtaaag	4-9-4	TATGtttctcagtAAAG	573_1	11877	-19
574	gaattatctttaaacca	3-10-4	GAAttatctttaaACCA	574_1	11947	-18
575	cccttaaatttctaca	3-11-2	CCCttaaatttctaCA	575_1	11980	-20
576	acactgctcttgtacc	4-10-2	ACACtgctcttgtaCC	576_1	11995	-23
577	tgacaacactgctctt	3-10-3	TGAcaacactgctCTT	577_1	12000	-21
578	tacatttattgggctc	4-10-2	TACAtttattgggcTC	578_1	12081	-19
579	gtacatttattgggct	2-10-4	GTacatttattgGGCT	579_1	12082	-23
580	ttggtacatttattgg	3-10-3	TTGgtacatttatTGG	580_1	12085	-18
581	catgttggtacatttat	4-10-3	CATGttggtacattTAT	581_1	12088	-21
582	aatcatgttggtacat	4-10-2	AATCatgttggtacAT	582_1	12092	-16
583	aaatcatgttggtaca	2-12-2	AAatcatgttggtaCA	583_1	12093	-14
584	gacaagtttggattaa	3-11-2	GACaagtttggattAA	584_1	12132	-14
585	aatgttcagatgcctc	2-10-4	AAtgttcagatgCCTC	585_1	12197	-21
586	gcttaatgttcagatg	2-12-2	GCttaatgttcagaTG	586_1	12201	-17
587	cgtacatagcttgatg	4-10-2	CGTAcatagcttgaTG	587_1	12267	-20
588	gtgaggaattaggata	3-11-2	GTGaggaattaggaTA	588_1	12753	-17
589	gtaacaatatggtttg	3-11-2	GTAacaatatggttTG	589_1	12780	-15
590	gaaatattgtagacta	2-11-3	GAaatattgtagaCTA	590_1	13151	-14
591	ttgaaatattgtagac	3-11-2	TTGaaatattgtagAC	591_1	13153	-12
592	aagtctagtaatttgc	2-10-4	AAgtctagtaatTTGC	592_1	13217	-17
593	gctcagtagattataa	4-10-2	GCTCagtagattatAA	593_1	13259	-17
594	catacactgttgctaa	3-10-3	CATacactgttgcTAA	594_1	13296	-19
595	atggtctcaaatcatt	3-10-3	ATGgtctcaaatcATT	595_1	13314	-17
596	caatggtctcaaatca	4-10-2	CAATggtctcaaatCA	596_1	13316	-18
597	ttcctattgattgact	4-10-2	TTCCtattgattgaCT	597_1	13568	-20
598	tttctgttcacaacac	4-10-2	TTTCtgttcacaacAC	598_1	13600	-17
599	aggaacccactaatct	2-11-3	AGgaacccactaaTCT	599_1	13702	-20
600	taaatggcaggaaccc	3-11-2	TAAatggcaggaacCC	600_1	13710	-19
601	gtaaatggcaggaacc	4-10-2	GTAAatggcaggaaCC	601_1	13711	-20
602	ttgtaaatggcaggaa	2-11-3	TTgtaaatggcagGAA	602_1	13713	-16
603	ttatgagttaggcatg	2-10-4	TTatgagttaggCATG	603_1	13835	-19
604	ccaggtgaaactttaa	3-11-2	CCAggtgaaactttAA	604_1	13935	-17
605	cccttagtcagctcct	3-10-3	CCCttagtcagctCCT	605_1	13997	-30
606	acccttagtcagctcc	2-10-4	ACccttagtcagCTCC	606_1	13998	-27
607	cacccttagtcagctc	2-11-3	CAcccttagtcagCTC	607_1	13999	-24
608	tctcttactaggctcc	3-10-3	TCTcttactaggcTCC	608_1	14091	-24
609	cctatctgtcatcatg	2-11-3	CCtatctgtcatcATG	609_1	14178	-20
610	tcctatctgtcatcat	3-11-2	TCCtatctgtcatcAT	610_1	14179	-20
611	gagaagtgtgagaagc	3-11-2	GAGaagtgtgagaaGC	611_1	14808	-19
612	catccttgaagtttag	4-10-2	CATCcttgaagtttAG	612_1	14908	-19
613	taataagatggctccc	3-10-3	TAAtaagatggctCCC	613_1	15046	-21
614	caaggcataataagat	3-11-2	CAAggcataataagAT	614_1	15053	-14
615	ccaaggcataataaga	2-10-4	CCaaggcataatAAGA	615_1	15054	-18
616	tgatccaattctcacc	2-12-2	TGatccaattctcaCC	616_1	15151	-19
617	atgatccaattctcac	3-10-3	ATGatccaattctCAC	617_1	15152	-19
618	cgcttcatcttcaccc	3-11-2	CGCttcatcttcacCC	618_1	15260	-26
619	tatgacactgcatctt	2-10-4	TAtgacactgcaTCTT	619_1	15317	-19
620	gtatgacactgcatct	3-10-3	GTAtgacactgcaTCT	620_1	15318	-21
621	tgtatgacactgcatc	2-10-4	TGtatgacactgCATC	621_1	15319	-20
622	ttctcttctgtaagtc	4-10-2	TTCTcttctgtaagTC	622_1	15363	-19
623	ttctacagaggaacta	2-10-4	TTctacagaggaACTA	623_1	15467	-17
624	actacagttctacaga	3-10-3	ACTacagttctacAGA	624_1	15474	-19
625	ttcccacaggtaaatg	4-10-2	TTCCcacaggtaaaTG	625_1	15561	-21
626	attatttgaatatactcatt	4-12-4	ATTAtttgaatatactCATT	626_1	15594	-20
627	tgggaggaaattatttg	4-10-3	TGGGaggaaattatTTG	627_1	15606	-20
628	tgactcatcttaaatg	4-10-2	TGACtcatcttaaaTG	628_1	15621	-17
629	ctgactcatcttaaat	3-11-2	CTGactcatcttaaAT	629_1	15622	-16
630	tttactctgactcatc	3-10-3	TTTactctgactcATC	630_1	15628	-17
631	tattggaggaattatt	3-11-2	TATtggaggaattaTT	631_1	15642	-14
632	gtattggaggaattat	3-11-2	GTAttggaggaattAT	632_1	15643	-16
633	tggtatacttctctaagtat	2-15-3	TGgtatacttctctaagTAT	633_1	15655	-22
634	gatctcttggtatact	4-10-2	GATCtcttggtataCT	634_1	15666	-20
635	cagacaactctatacc	2-12-2	CAgacaactctataCC	635_1	15689	-18
636	aacatcagacaactcta	4-9-4	AACAtcagacaacTCTA	636_1	15693	-21
637	taacatcagacaactc	4-10-2	TAACatcagacaacTC	637_1	15695	-16
638	tttaacatcagacaactc	4-10-4	TTTAacatcagacaACTC	638_1	15695	-20
639	atttaacatcagacaa	2-12-2	ATttaacatcagacAA	639_1	15698	-11
640	cctatttaacatcagac	2-11-4	CCtatttaacatcAGAC	640_1	15700	-20
641	tccctatttaacatca	3-10-3	TCCctatttaacaTCA	641_1	15703	-21
642	tcaacgactattggaat	4-9-4	TCAAcgactattgGAAT	642_1	15737	-20
643	cttatattctggctat	4-9-3	CTTAtattctggcTAT	643_1	15850	-20
644	atccttatattctggc	4-10-2	ATCCttatattctgGC	644_1	15853	-23
645	gatccttatattctgg	2-10-4	GAtccttatattCTGG	645_1	15854	-21
646	tgatccttatattctg	3-10-3	TGAtccttatattCTG	646_1	15855	-19
647	attgaaacttgatcct	4-8-4	ATTGaaacttgaTCCT	647_1	15864	-21
648	actgtcattgaaactt	2-10-4	ACtgtcattgaaACTT	648_1	15870	-16
649	tcttactgtcattgaa	3-11-2	TCTtactgtcattgAA	649_1	15874	-16
650	aggatcttactgtcatt	2-11-4	AGgatcttactgtCATT	650_1	15877	-21
651	gcaaatcaactccatc	3-10-3	GCAaatcaactccATC	651_1	15896	-20
652	gtgcaaatcaactcca	3-10-3	GTGcaaatcaactCCA	652_1	15898	-22
653	caattatttctttgtgc	4-10-3	CAATtatttctttgTGC	653_1	15910	-21
654	tggcaacaattatttctt	3-11-4	TGGcaacaattattTCTT	654_1	15915	-21
655	gctggcaacaattatt	3-9-4	GCTggcaacaatTATT	655_1	15919	-21
656	atccatttctactgcc	4-10-2	ATCCatttctactgCC	656_1	15973	-24
657	taatatctattgatttcta	4-11-4	TAATatctattgattTCTA	657_1	15988	-20
658	tcaatagtgtagggca	2-12-2	TCaatagtgtagggCA	658_1	16093	-18
659	ttcaatagtgtagggc	3-11-2	TTCaatagtgtaggGC	659_1	16094	-19
660	aggttaattaattcaatag	4-11-4	AGGTtaattaattcaATAG	660_1	16102	-21
661	catttgtaatccctag	3-10-3	CATttgtaatcccTAG	661_2	16163	-20
661	catttgtaatccctag	3-9-4	CATttgtaatccCTAG	661_1	16163	-22
662	acatttgtaatcccta	3-10-3	ACAtttgtaatccCTA	662_1	16164	-20
663	aacatttgtaatccct	2-10-4	AAcatttgtaatCCCT	663_2	16165	-21
663	aacatttgtaatccct	3-9-4	AACatttgtaatCCCT	663_1	16165	-22
664	taaatttcaagttctg	2-11-3	TAaatttcaagttCTG	664_1	16184	-14
665	gtttaaatttcaagttct	3-11-4	GTTtaaatttcaagTTCT	665_1	16185	-19
666	ccaagtttaaatttcaag	4-10-4	CCAAgtttaaatttCAAG	666_1	16189	-21
667	acccaagtttaaatttc	4-9-4	ACCCaagtttaaaTTTC	667_1	16192	-22
668	catacagtgacccaagttt	2-14-3	CAtacagtgacccaagTTT	668_1	16199	-23
669	acatcccatacagtga	2-11-3	ACatcccatacagTGA	669_1	16208	-21
670	agcacagctctacatc	2-10-4	AGcacagctctaCATC	670_1	16219	-22
671	atatagcacagctcta	3-9-4	ATAtagcacagcTCTA	671_1	16223	-21
672	tccatatagcacagct	3-11-2	TCCatatagcacagCT	672_1	16226	-22
673	atttccatatagcaca	3-9-4	ATTtccatatagCACA	673_1	16229	-20
674	tttatttccatatagca	4-9-4	TTTAtttccatatAGCA	674_1	16231	-22
675	tttatttccatatagc	3-10-3	TTTatttccatatAGC	675_1	16232	-18
676	aaggagaggagattatg	4-9-4	AAGGagaggagatTATG	676_1	16409	-21
677	agttcttgtgttagct	3-11-2	AGTtcttgtgttagCT	677_1	16456	-21
678	gagttcttgtgttagc	2-12-2	GAgttcttgtgttaGC	678_1	16457	-20
679	attaattatccatccac	3-10-4	ATTaattatccatCCAC	679_1	16590	-21
680	atcaattaattatccatc	3-11-4	ATCaattaattatcCATC	680_1	16593	-19
681	agaatcaattaattatcc	3-12-3	AGAatcaattaattaTCC	681_1	16596	-18
682	tgagataccgtgcatg	2-12-2	TGagataccgtgcaTG	682_1	16656	-18
683	aatgagataccgtgca	2-10-4	AAtgagataccgTGCA	683_1	16658	-21
684	ctgtggttaggctaat	3-11-2	CTGtggttaggctaAT	684_1	16834	-19
685	aagagtaagggtctgtggtt	1-17-2	AagagtaagggtctgtggTT	685_1	16842	-21
686	gatgggttaagagtaa	4-9-3	GATGggttaagagTAA	686_1	16854	-19
687	agcagatgggttaaga	3-11-2	AGCagatgggttaaGA	687_1	16858	-20
688	tgtaaacatttgtagc	2-10-4	TGtaaacatttgTAGC	688_1	16886	-19
689	cctgcttataaatgta	3-11-2	CCTgcttataaatgTA	689_1	16898	-19
690	tgccctgcttataaat	4-10-2	TGCCctgcttataaAT	690_1	16901	-23
691	tcttcttagttcaata	2-12-2	TCttcttagttcaaTA	691_1	16935	-15
692	tggtttctaactacat	2-10-4	TGgtttctaactACAT	692_1	16980	-18
693	agtttggtttctaacta	2-12-3	AGtttggtttctaaCTA	693_1	16983	-19
694	gaatgaaacttgcctg	3-10-3	GAAtgaaacttgcCTG	694_1	17047	-18
695	attatccttacatgat	3-10-3	ATTatccttacatGAT	695_1	17173	-17
696	gtacccaattatcctt	2-11-3	GTacccaattatcCTT	696_1	17180	-21
697	tgtacccaattatcct	3-10-3	TGTacccaattatCCT	697_1	17181	-24
698	ttgtacccaattatcc	2-11-3	TTgtacccaattaTCC	698_1	17182	-20
699	tttgtacccaattatc	3-11-2	TTTgtacccaattaTC	699_1	17183	-17
700	agcagcaggttatatt	4-10-2	AGCAgcaggttataTT	700_1	17197	-22
701	tgggaagtggtctggg	3-10-3	TGGgaagtggtctGGG	701_1	17292	-25
702	ctggagagtgataata	3-11-2	CTGgagagtgataaTA	702_1	17322	-17
703	aatgctggattacgtc	4-10-2	AATGctggattacgTC	703_1	17354	-19
704	caatgctggattacgt	2-11-3	CAatgctggattaCGT	704_1	17355	-19
705	ttgttcagaagtatcc	2-10-4	TTgttcagaagtATCC	705_1	17625	-19
706	gatgatttgcttggag	2-10-4	GAtgatttgcttGGAG	706_1	17646	-21
707	gaaatcattcacaacc	3-10-3	GAAatcattcacaACC	707_1	17860	-17
708	ttgtaacatctactac	3-10-3	TTGtaacatctacTAC	708_1	17891	-16
709	cattaagcagcaagtt	3-11-2	CATtaagcagcaagTT	709_1	17923	-17
710	ttactagatgtgagca	3-11-2	TTActagatgtgagCA	710_1	17942	-18
711	tttactagatgtgagc	2-11-3	TTtactagatgtgAGC	711_1	17943	-18
712	gaccaagcaccttaca	3-11-2	GACcaagcaccttaCA	712_1	17971	-22
713	agaccaagcaccttac	3-10-3	AGAccaagcacctTAC	713_1	17972	-22
714	atgggttaaataaagg	2-10-4	ATgggttaaataAAGG	714_1	18052	-15
715	tcaaccagagtattaa	2-12-2	TCaaccagagtattAA	715_1	18067	-13
716	gtcaaccagagtatta	3-11-2	GTCaaccagagtatTA	716_1	18068	-18
717	attgtaaagctgatat	2-11-3	ATtgtaaagctgaTAT	717_1	18135	-14
718	cacataattgtaaagc	2-10-4	CAcataattgtaAAGC	718_1	18141	-16
719	gaggtctgctatttac	2-11-3	GAggtctgctattTAC	719_1	18274	-19
720	tgtagattcaatgcct	2-11-3	TGtagattcaatgCCT	720_1	18404	-20
721	cctcattatactatga	2-11-3	CCtcattatactaTGA	721_1	18456	-19
722	ccttatgctatgacac	2-12-2	CCttatgctatgacAC	722_1	18509	-18
723	tccttatgctatgaca	4-10-2	TCCTtatgctatgaCA	723_1	18510	-22
724	aagatgtttaagtata	3-10-3	AAGatgtttaagtATA	724_1	18598	-13
725	ctgattattaagatgt	2-10-4	CTgattattaagATGT	725_1	18607	-17
726	tggaaaggtatgaatt	2-12-2	TGgaaaggtatgaaTT	726_1	18808	-13
727	acttgaatggcttgga	2-12-2	ACttgaatggcttgGA	727_1	18880	-18
728	aacttgaatggcttgg	3-10-3	AACttgaatggctTGG	728_1	18881	-19
729	caatgtgttactattt	4-10-2	CAATgtgttactatTT	729_1	19004	-16
730	acaatgtgttactatt	3-10-3	ACAatgtgttactATT	730_1	19005	-15
731	catctgctatataaga	4-10-2	CATCtgctatataaGA	731_1	19063	-18
732	cctagagcaaatactt	4-10-2	CCTAgagcaaatacTT	732_1	19223	-20
733	cagagttaataataag	3-10-3	CAGagttaataatAAG	733_1	19327	-13
734	gttcaagcacaacgaa	4-10-2	GTTCaagcacaacgAA	734_1	19493	-18
735	agggttcaagcacaac	2-11-3	AGggttcaagcacAAC	735_1	19496	-18
736	tgttggagacactgtt	2-12-2	TGttggagacactgTT	736_1	19677	-17
737	aaggaggagttaggac	3-11-2	AAGgaggagttaggAC	737_1	19821	-18
738	ctatgccatttacgat	4-10-2	CTATgccatttacgAT	738_1	19884	-21
739	tcaaatgcagaattag	2-12-2	TCaaatgcagaattAG	739_1	19913	-12
740	agtgacaatcaaatgc	2-10-4	AGtgacaatcaaATGC	740_1	19921	-18
741	aagtgacaatcaaatg	2-11-3	AAgtgacaatcaaATG	741_1	19922	-12
742	gtgtaccaagtaacaa	3-11-2	GTGtaccaagtaacAA	742_1	19978	-16
743	tgggatgttaaactga	3-10-3	TGGgatgttaaacTGA	743_1	20037	-20

Мотивы последовательностей представляют собой непрерывную последовательность нуклеиновых оснований, присутствующую в олигонуклеотиде.

Конструкции относятся к конструкции гэпмеров - F-G-F' - где каждое число представляет число последовательных модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (первое число - 5'-фланг), с последующим числом нуклеозидов ДНК (второе число - область гэпа), с последующим числом модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (третье число - 3'-фланг), которому возможно предшествуют или после которого возможно следуют дополнительные повторяющиеся области ДНК и LNA, которые не являются необходимой частью данной непрерывной последовательности, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.

Олигонуклеотидные соединения представляют конкретные конструкции мотивов последовательности. Заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

Таблица 6: олигонуклеотиды, нацеленные на мышиный транскрипт PD-L1 (SEQ ID NO: 4), их конструкция, а также специфичные олигонуклеотидные соединения (указанные по CMP ID NO), разработанные на основе последовательности мотива.

SEQ ID NO	Мотив последова-тельности	Конс-трук-ция	Олигонуклеотид-ное соединение	CMP ID NO	Начало на SEQ ID NO: 4	dG
744	agtttacattttctgc	3-10-3	AGTttacattttcTGC	744_1	4189	-20
745	tatgtgaagaggagag	3-10-3	TATgtgaagaggaGAG	745_1	7797	-19
746	cacctttaaaacccca	3-10-3	CACctttaaaaccCCA	746_1	9221	-23
747	tcctttataatcacac	3-10-3	TCCtttataatcaCAC	747_1	10386	-19
748	acggtattttcacagg	3-10-3	ACGgtattttcacAGG	748_1	12389	-21
749	gacactacaatgagga	3-10-3	GACactacaatgaGGA	749_1	15088	-20
750	tggtttttaggactgt	3-10-3	TGGtttttaggacTGT	750_1	16410	-21
751	cgacaaattctatcct	3-10-3	CGAcaaattctatCCT	751_1	18688	-20
752	tgatatacaatgctac	3-10-3	TGAtatacaatgcTAC	752_1	18735	-16
753	tcgttgggtaaattta	3-10-3	TCGttgggtaaatTTA	753_1	19495	-17
754	tgctttataaatggtg	3-10-3	TGCtttataaatgGTG	754_1	19880	-19

Мотивы последовательностей представляют собой непрерывную последовательность нуклеиновых оснований, присутствующую в олигонуклеотиде.

Конструкции относятся к конструкции гэпмеров - F-G-F' - где каждое число представляет число последовательных модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (первое число - 5'-фланг), с последующим числом нуклеозидов ДНК (второе число - область гэпа), с последующим числом модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (третье число - 3'-фланг), которому возможно предшествуют или после которого возможно следуют дополнительные повторяющиеся области ДНК и LNA, которые не являются необходимой частью данной непрерывной последовательности, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.

Олигонуклеотидные соединения представляют конкретные конструкции мотивов последовательности. Заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

Таблица 7: последовательности олигонуклеотидных мотивов и антисмысловые соединения с 5'-ca биорасщепляемым линкером.

SEQ ID NO	мотив последовательности	олигонуклеотидное соединение с линкером са	CMP ID NO
755	caagtttacattttctgc	coaoAGTttacattttcTGC	755_1
756	catatgtgaagaggagag	coaoTATgtgaagaggaGAG	756_1
757	cacctttaaaacccca	coaoCACctttaaaaccCCA	757_1
758	catcctttataatcacac	coaoTCCtttataatcaCAC	758_1
759	caacggtattttcacagg	coaoACGgtattttcacAGG	759_1
760	cagacactacaatgagga	coaoGACactacaatgaGGA	760_1
761	catggtttttaggactgt	coaoTGGtttttaggacTGT	761_1
762	cacgacaaattctatcct	coaoCGAcaaattctatCCT	762_1
763	catgatatacaatgctac	coaoTGAtatacaatgcTAC	763_1
764	catcgttgggtaaattta	coaoTCGttgggtaaatTTA	764_1
765	catgctttataaatggtg	coaoTGCtttataaatgGTG	765_1
766	caacaaataatggttactct	coaoACAAataatggttaCTCT	766_1
767	cacagattgatggtagtt	coaoCAGAttgatggtagTT	767_1
768	cacctatttaacatcagac	coaoCCtatttaacatcAGAC	768_1
769	cactaattgtagtagtactc	coaoCTAattgtagtagtaCTC	769_1
770	caataaacatgaatctctcc	coaoATaaacatgaatctCTCC	770_1

Заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, подстрочный символ _o представляет фосфодиэфирную межнуклеозидную связь, и, если не указано иначе, другие межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

Таблица 8: антисмысловые олигонуклеотидные соединения, конъюгированные с GalNAc

конъюгат антисмыслового олигонуклеотида	CMP ID NO
GN2-C6ocoaoAGTttacattttcTGC	755_2
GN2-C6ocoaoTATgtgaagaggaGAG	756_2
GN2-C6ocoaoCACctttaaaaccCCA	757_2
GN2-C6ocoaoTCCtttataatcaCAC	758_2
GN2-C6ocoaoACGgtattttcacAGG	759_2
GN2-C6ocoaoGACactacaatgaGGA	760_2
GN2-C6ocoaoTGGtttttaggacTGT	761_2
GN2-C6ocoaoCGAcaaattctatCCT	762_2
GN2-C6ocoaoTGAtatacaatgcTAC	763_2
GN2-C6ocoaoTCGttgggtaaatTTA	764_2
GN2-C6ocoaoTGCtttataaatgGTG	765_2
GN2-C6ocoaoACAAataatggttaCTCT	766_2
GN2-C6ocoaoCAGAttgatggtagTT	767_2
GN2-C6ocoaoCCtatttaacatcAGAC	768_2
GN2-C6ocoaoCTAattgtagtagtaCTC	769_2
GN2-C6ocoaoATaaacatgaatctCTCC	770_2

GN2 представляет трехвалентный GalNAc кластер, показанный на Фиг. 3, С6 представляет аминоалкильную группу с 6 атомами углерода, заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, подстрочный символ _o представляет фосфодиэфирную нуклеозидную связь, и, если не указано иначе, другие межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи. Химические формулы, представляющие некоторые из данных молекул, показаны на Фиг. 4-8.

Мышиные модели AAV/HBV

Модель Пастера:

В Институте Пастера создали и разводили трансгенных по HLA-A2.1-/HLA-DR1 нокаутированных по H-2 класса I-/класса II мышей (именуемых в данном документе HLA-A2/DR1). Данные мыши представляют собой экспериментальную модель in vivo для исследований человеческой иммунной функции без какого-либо мешающего влияния ответа мышиного МНС (главный комплекс гистосовместиости) (Pajot et al 2004 Eur J Immunol. 34(11):3060-9.

В данных исследованиях использовали вектор на основе аденосателлитного вируса (AAV) серотипа AAV 2/8, несущий компетентный к репликации ДНК-геном HBV. Вектор AAV-HBV (партия GVPN #6163) разводили в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) с достижением титра 5×10¹¹ вг (геном вектора)/мл. Мышам внутривенно (в.в.) инъецировали 100 мкл данного разведенного раствора (доза/мышь: 5×10¹⁰ вг) в хвостовую вену. В крови мышей-носителей HBV выявляли полные вирусные частицы, содержащие ДНК HBV. HBcAg выявляли в течение вплоть до одного года в печени, наряду с циркулирующими белками HBV - HBeAg и HBsAg - в крови. У всех мышей, трансдуцированных AAV2/8-HBV, HBsAg, HBeAg и ДНК HBV сохранялись в сыворотке в течение по меньшей мере одного года (Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563).

Шанхайская модель:

В данной модели у мышей, инфицированных рекомбинантным аденосателлитным вирусом (AAV), несущим геном HBV (AAV/HBV), поддерживается стабильная виремия и антигенимия в течение больше, чем 30 недель (Dan Yang, et al. 2014 Cellular & Molecular Immunology 11, 71-78).

Самцов мышей C57BL/6 (4-6-недельных), не содержащих специфических патогенов, приобретали в SLAC (Центр животных Шанхайской лаборатории Китайской академии наук) и содержали в виварии в индивидуально вентилируемых клетках. Следовали руководствам по уходу и применению животных, как указывается WuXi IACUC (Институциональный комитет по уходу и применению животных, номер потокола WUXI IACUC R20131126-мышь). Мышам давали акклиматизироваться к новым условиям в течение 3 суток и группировали их согласно схеме экперимента.

Рекомбинантный AAV-HBV разводили в PBS, 200 мкл на инъекцию. Данный рекомбинантный вирус несет 1,3 копии генома HBV (генотип D, серотип ayw).

В сутки 0 всем мышам инъецировали через хвостовую вену 200 мкл AAV-HBV. В сутки 6, 13 и 20 после инъекции AAV всем мышам делали подчелюстное кровопускание (0,1 мл крови/мышь) для отбора сыворотки. В сутки 22 после инъекции мыши со стабильной виремией были готовы для обработки олигонуклеотидами. Данные олигонуклеотиды могут быть неконъюгированными или конъюгированными с GalNAc.

ДНК-вакцина

Плазмидная ДНК не содержала эндотоксинов и была изготовлена Plasmid-Factory (Германия). pCMV-S2.S ayw кодирует домены preS2 и S HBsAg (генотип D), и их экспрессия контролируется немедленным ранним промотором гена цитомегаловируса (Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311). pCMV-HBc кодирует капсид HBV, несущий Ag (антиген) кора вируса гепатита (HBc) (Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563).

Обработку ДНК-вакциной проводили, как описано в данном документе. За пять суток до вакцинации в мышцы мышей инъецировали кардиотоксин (CaTx, латоксан реф. L81-02, 50 мкл/мышцу). CaTx деполяризует мышечные волокна с индукцией дегенерации клеток, через 5 суток после инъекции появятся новые мышечные волокна, и они будут получать ДНК-вакцину для лучшей эффективности трансфекции. Каждый из pCMV-S2.S ayw и pCMVCore в концентрации 1 мг/мл смешивали в равном количестве, и каждая мышь получала всего 100 мкг двухсторонней внутримышечной инъекции в обработанные кардиотоксином передние большеберцовые мышцы, как было описано ранее в Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311, под анестезией (100 мкл 12,5 мг/мл кетамина, 1,25 мг/мл ксилазина).

Антитело против PD-L1

Это мышиное антитело IgG1 против мышиного PD-L1 клона 6Е11, произведенное внутри Genetech. Оно представляет собой имитирующее антитело, которое перекрестно блокирует атезолизумаб, и имеет аналогичную активность, блокирующую in vitro атезолизумаб, произведенный внутри Roche. Данное антитело вводили внутрибрюшинной инъекцией (в.б.) в дозе 12,5 мкг/г.

Синтез олигонуклеотидов

Синтез олигонуклеотидов обычно известен в данной области. Ниже представлен протокол, который можно применять. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению возможно были получены слегка отличными способами в показателях использованных прибора, подложки и концентраций.

Олигонуклеотиды синтезируются на уридиновых универсальных подложках с использованием фосфорамидитного подхода на Oligomaker 48 в масштабе 1 мкмоль. В конце синтеза олигонуклеотиды отщепляются от твердой подложки с использованием водного аммиака в течение 5-16 часов при 60°С. Олигонуклеотиды очищаются посредством ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ) или посредством экстракций твердой фазы и характеризуются посредством СВЭЖХ (сверхэффективная жидкостная хроматография), и далее подтверждается молекулярная масса посредством МС-ЭРИ (масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией).

Элонгация олигонуклеотида:

Связывание β-цианоэтил-фосфорамидитов (ДНК-А(Bz), ДНК-G(ibu), ДНК-C(Bz), ДНК-Т, LNA-5-метил-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) или LNA-T) проводится посредством применения раствора 0,1 М амидита, защищенного 5'-O-DMT, в ацетонитриле и DCI (4,5-дицианоимидазол) в ацетонитриле (0,25 М) в качестве активатора. Для последнего цикла может быть использован фосфорамидит с желательными модификациями, например, С6-линкер для присоединения конъюгатной группы или конъюгатная группа как таковая. Тиолирование для введения фосфортиоатных связей проводится с использованием ксантангидрида (0,01 М в ацетонитриле/пиридине 9:1). Фосфодиэфирные связи могут вводиться с использованием 0,02 М йода в THF/пиридине/воде 7:2:1. Остальными реактивами являются реактивы, типично используемые для синтеза олигонуклеотидов.

Для конъюгирования после твердофазного синтеза можно использовать имеющийся в продаже С6 аминолинкер фосфорамидит в последнем цикле твердофазного синтеза, и после снятия защиты и отщепления от твердой подложки выделяется связанный аминолинкером олигонуклеотид со снятой защитой. Конъюгаты вводятся через активацию функциональной группы с использованием стандартных способов синтеза.

В качестве альтернативы, конъюгатную группировку можно добавлять к олигонуклеотиду, в то время как он все еще находится на твердой подложке с использованием фосфорамидита с GalNAc или с кластером GalNAc, как описано в PCT/EP2015/073331 или в заявке EP № 15194811.4.

Очистка посредством ВЭЖХ-ОФ:

Неочищенные соединения очищают препаративной ВЭЖХ-ОФ на колонке Phenomenex Jupiter C18 10 мкм 150×10 мм. В качестве буферов используют 0,1 М ацетат аммония, рН 8, и ацетонитрил при скорости тока 5 мл/мин. Отобранные фракции лиофилизируют с получением очищенного соединения - типично в виде белого твердого вещества.

Сокращения:

DCI:	4,5-дицианоимидазол
DCM:	дихлорметан
DMF:	диметилформамид
DMT:	4,4'-диметокситритил
THF:	тетрагидрофуран
Bz:	бензоил
Ibu:	изобутирил

ВЭЖХ-ОФ: высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой

Анализ T_m

Дуплексы олигонуклеотида и РНК-мишени (связанной фосфатом - РО) разводят до 3 мМ в 500 мл воды, не содержащей РНКазы, и смешивают с 500 мл 2× T_m-буфера (200 мМ NaCl, 0,2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 20 мМ фосфат Na, pH 7,0). Данный раствор нагревают до 95°С в течение 3 мин и затем дают осуществляться отжигу при комнатной температуре в течение 30 мин. Температуры плавления дуплекса (T_m) измеряют на спектрофотометре Lambda 40, работающем в ультрафиолетовой/видимой области, оснащенном программатором температуры Пелетье РТР6, используя программу PE Templab (Perkin Elmer). Температура повышается от 20°С до 95°С и затем снижается до 25°С, с записью поглощения при 260 нм. Для оценки T_m дуплекса используются первая производная и локальные максимумы как плавления, так и отжига.

Анализ тканеспецифичного расщепления линкера in vitro

Меченные FAM олигонуклеотиды с биорасщепляемым линкером, подлежащие тестированию (например, фосфодиэфирный линкер ДНК (РО линкер)), подвергаются расщеплению in vitro с использованием гомогенатов релевантных тканей (например, печени или почки) и сыворотки.

Образцы ткани и сыворотки отбирают у подходящего животного (например, мыши, обезьяны, свиньи или крысы) и гомогенизируют в гомогенизационном буфере (0,5% Igepal CA-630, 25 мМ Tris, рН 8,0, 100 мМ NaCl, pH 8,0 (доведенный 1 н. NaOH). В гомогенаты ткани и сыворотку впрыскивают олигонуклеотид до концентраций 200 мкг/г ткани. Образцы инкубируются в течение 24 часов при 37°С, и затем данные образцы подвергают экстракции фенолом-хлороформом. Растворы подвергают анализам ВЭЖХ АО (высокоэффективная жидкостная хроматография на анионообменной колонке) на Dionex Ultimate 3000 с использованием колонки Dionex DNApac p-100 и градиента в интервале от 10 мМ до 1 М перхлората натрия при рН 7,5. Содержание расщепленного и нерасщепленного олигонуклеотида определяется относительно стандарта с использованием как флюоресцентного детектора при 615 нм, так и УФ детектора при 260 нм.

Анализ расщепления нуклеазой S1

Меченные FAM олигонуклеотиды с линкерами, чувствительными к нуклеазе S1 (например, фосфодиэфирный ДНК-линкер (РО линкер)), подвергаются расщеплению in vitro в экстракте нуклеазы S1 или сыворотке.

100 мкМ олигонуклеотидов подвергаются расщеплению in vitro нуклеазой S1 в буфере для нуклеазы (60 U на 100 мкл) в течение 20 и 120 минут. Ферментативную активность останавливают добавлением в раствор буфера EDTA. Растворы подвергают анализам ВЭЖХ АО на Dionex Ultimate 3000 с использованием колонки Dionex DNApac p-100 и градиента в интервале от 10 мМ до 1 М перхлората натрия при рН 7,5. Содержание расщепленного и нерасщепленного олигонуклеотида определяется относительно стандарта с использованием как флюоресцентного детектора при 615 нм, так и УФ детектора при 260 нм.

Получение одноядерных клеток печени

Клетки печени от мышей AAV/HBV получали, как описано ниже, и согласно способу, описанному Tupin et al 2006 Methods Enzymol 417:185-201, с небольшими модификациями. После умерщвления мышей осуществляли перфузию печени 10 мл стерильного PBS через портальную вену печени с использованием шприца с иглой калибра 25. Когда орган становлся бледным, данный орган отбирали в сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) (GIBCO® HBSS, 24020) плюс 5 % фетальной телячьей сыворотки с удаленным комплементом (FCS). Отобранную печень аккуратно продавливали через 100 мкм клеточное сито (BD Falcon, 352360), и клетки суспендировали в 30 мл HBSS плюс 5% FCS. Суспензию клеток центрифугировали при 50 g в течение 5 мин. Супернатанты затем центрифугировали при 289 g в течение 10 мин при 4°С. После центрифугирования супернатанты отбрасывали, и осадки ресуспендировали в 15 мл при комнатной температуре в 35%-ном изотоничном растворе перколла (Percoll от GE Healthcare #17-0891-01, разведенный в RPMI 1640 (GIBCO, 31870)) и переносили в 15 мл пробирку. Клетки далее центрифугировали при 1360 g в течение 25 мин при комнатной тмпературе. Супернатант отбрасывали отсасыванием, и осадок, содержащий одноядерные клетки, дважды промывали HBSS плюс 5% FCS.

Клетки культивировали в полной среде (α-минимальная незаменимая среда (Gibco, 22571), дополненная 10% FCS (Hyclone, # SH30066, партия APG21570), 100 U/мл пенициллина плюс 100 мкг/мл стрептомицина плюс 0,3 мг/мл L-глутамина (Gibco, 10378), 1× заменимыми аминокислотами (Gibco, 11140), 10 мМ Hepes (Gibco, 15630), 1 мМ пируватом натрия (Gibco, 11360) и 50 мкM β-меркаптоэтанолом (LKB, 1830)).

Поверхностное мечение клеток

Клетки высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном и промывали PBS для FACS (флуоресцентная сортировка клеток) (PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% азида натрия). Клетки инкубировали с 5 мкл PBS для FACS, содержащего крысиное антитело против мышиного CD16/CD32 и маркер жизнеспособности LD фиксируемый желтый, Thermofisher, L34959, в течение 10 мин в темноте при 4°С. Затем клетки окрашивали в течение 20 мин в темноте при 4°С с использованием 25 мкл PBS для FACS, содержащего моноклональные антитела (Mab) против NK P46 BV421 (крысиное Mab против мышиного NK P46, Biolegend, 137612) и F4/80 (крысиное Mab против мышиного F4/80, конъюгированное с FITC (флюоресцеинизотиоцианат), BD Biolegend, 123108), и также добавляли два дополнительных поверхностных маркера: PD1 (крысиное Mab против мышиного PD1, конъюгированное с PE (фосфоэстераза), BD Biosciences, 551892) и PDL1 (крысиное Mab против мышиного PDL1 BV711, Biolegend, 124319).

Анализ внутриклеточного окрашивания на цитокины (ICS)

Анализы ICS проводили и на спленоцитах, и на одноядерных клетках печени. Клетки высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном. Планшеты с клетками инкубировали в течение ночи при 37° либо в одной полной среде в качестве негативного контроля, либо с пептидами, описанными в Таблице 9, в концентрации 2 мкг/мл. После одного часа инкубации добавляли брефельдин А (Sigma, B6542) в концентрации 2 мкг/мл.

После культуры в течение ночи клетки промывали PBS для FACS и инкубировали с 5 мкл PBS для FACS, содержащего крысиное антитело против мышиного CD16/CD32 и маркер жизнеспособности LD фиксируемый желтый, Thermofisher, L34959, в течение 10 мин в темноте при 4°С. Затем клетки окрашивали в течение 20 мин в темноте при 4°С с использованием 25 мкл PBS для FACS, содержащего Mab. Смесь состояла из моноклональных антител против CD3 (Mab хомяка против мышиного CD3-PerCP, BD Biosciences, 553067), против CD8 (крысиное Mab против мышиного CD8-APC-H7, BD Biosciences, 560182), против CD4 (крысиное Mab против мышиного CD4-РЕ-Cy7, BD Biosciences, 552775) и против NK-клеток (крысиное Mab против мышиных NK P46 BV421, Biolegend, 137612). Клетки фиксировали после нескольких промывок и делали проницаемыми в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре с использованием Cytofix/Cytoperm, промывали раствором Perm/Wash (BD Biosciences, 554714) при 4°С.

Внутриклеточное окрашивание на цитокины с использованием антител против IFNγ (интерферон-гамма) (крысиное Mab против мышиного IFNγ-APC, клон XMG1.2, BD Biosciences, 554413) и фактора некроза опухолей-альфа (TNFα) (крысиное Mab против мышиного TNFα-FITC, клон MP6-XT22; 1/250 (BD Biosciences 554418) проводили в течение 30 мин в темноте при 4°С. Перед анализом посредством проточной цитометрии с использованием анализатора MACSQuant клетки промывали Perm/Wash и ресуспендировали в PBS для FACS, содержащем 1% формальдегида.

Живые клетки CD3+CD8+CD4- и CD3+CD8-CD4+ сортировали и представляли на точечном графке. Определяли две области для сортировки позитивных клеток в отношении каждого цитокина. Число событий, обнаруженное при данных сортировках, делили на общее число событий в родительской популяции для получения процентных содержаний отвечающих Т-клеток. Для каждой мыши процентная доля, полученная в одной среде, рассматривалась как фон и вычиталась из процентной доли, полученной при стимулированиях пептидами.

Порог позитивности определяли согласно фону эксперимента, т.е. средней процентной доле окрашенных клеток, полученной для каждой группы в условиях одной среды, плюс два стандартных отклонения. Только процентная доля цитокина, представленного по меньшей мере в 5 событиях, считалась позитивной.

Таблица 9: эпитопы, ограниченные HLA-A2/DR1, содержащиеся в коровом белке HBV и доменах оболочки HВsAg (S2+S).

Белок	Положение начала	Положение конца	Последовательность	Ограничение HLA	Ссылки
Ядро	18	27	FLPSDFFPSV (SEQ ID NO: 773)	A2	Bertoletti et al Gastroenterology 1997;112:193-199
111	125	GRETVLEYLVSFGVW (SEQ ID NO: 774)	DR1	(Bertoletti et al Gastroenterology 1997;112:193-199
Оболочка (S2+S)	114	128	TTFHQTLQDPRVRGL (SEQ ID NO: 775)	DR1	Pajot et al Microbes Infect 2006;8:2783-2790.
	179	194	QAGFFLLTRILTIPQS (SEQ ID NO: 776)	A2 + DR1	Pajot et al Microbes Infect 2006;8:2783-2790.
	183	191	FLLTRILTI (SEQ ID NO: 777)	A2	Sette et al J Immunol 1994;153:5586-5592.
	200	214	TSLNFLGGTTVCLGQ (SEQ ID NO: 778)	A2 + DR1	Pajot et al Microbes Infect 2006;8:2783-2790.
	204	212	FLGGTTVCL (SEQ ID NO: 779)	A2	Rehermann et al J Exp Med 1995;181: 1047-1058.
	335	343	WLSLLVPFV (SEQ ID NO: 780)	A2	Nayersina et alJ Immunol 1993;150: 4659-4671.
	337	357	SLLVPFVQWFVGLSPTVWLSV (SEQ ID NO: 781)	A2 + DR1	Loirat et al J Immunol 2000;165: 4748-4755
	348	357	GLSPTVWLSV (SEQ ID NO: 782)	A2	Loirat et al J Immunol 2000;165: 4748-4755
370	379	SILSPFLPLL (SEQ ID NO: 783)	A2	Mizukoshi et al J Immunol 2004;173: 5863-5871.

Пример 1. Тестирование эффективности in vitro

Проводили прогулку по гену по человеческому транскрипту PD-L1, используя, главным образом, 16-20-мерные гэпмеры. Тестирование эффективности проводили в эксперименте in vitro в моноцитарной линии клеток человеческого лейкоза ТНР1 и в линии клеток человеческой неходжкинской лимфомы K (KARPAS-299).

Линии клеток

Линию клеток ТНР1 и Karpas-299 исходно приобретали в Европейской коллекции аутентичных культур клеток (ЕСАСС) и поддерживали, как рекомендовано поставщиком, в увлажненном инкубаторе при 37°С с 5% СО₂.

Эффективность олигонуклеотидов

Клетки ТНР-1 (3×10⁴ в RPMI-Glutamax, 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина (Thermo Fisher Scientific) добавляли к олигонуклеотидам (4-5 мкл) в 96-луночные круглодонные планшеты и культивировали в течение 6 суток в конечном объеме 100 мкл/лунку. Олигонуклеотиды подвергали скринингу в одной единственной концентрации (20 мкМ) и в интервале дозы-концентрациях от 25 мкМ до 0,004 мкМ (разведение 1:3 в воде). Общую мРНК экстрагировали с использованием набора для клеточной РНК в большом объеме MagNA Pure 96 на системе MagNA Pure 96 System (Roche Diagnostics) согласно инструкциям изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР-ОТ (количественная полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией) с использованием набора TaqMan RNA-to-ct 1-Step (Thermo Fisher Scientific) на приборе QuantStudio (Applied Biosystems) с предварительно сконструированными праймерами Taqman, нацеленными на человеческий PD-L1 и ACTB, используемый в качестве эндогенного контроля (Thermo Fisher Scientific). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 рассчитывали с использованием способа 2(-дельта дельта С(Т)), а процентную долю ингибирования выражали в % по сравнению с контрольным образцом (необработанные клетки).

Клетки Karpas-299 культивировали в RPMI 1640, 2 мМ глутамине и 20% FBS (Sigma). Клетки, посеянные в количестве 10000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты, инкубировали в течение 24 часов перед добавлением олигонуклеотидов, растворенных в PBS. Конечная концентрация олигонуклеотидов была в одной дозе 5 мкМ в конечном объеме культуры 100 мкл/лунку, или их добавляли в дозе, варьирующей от 50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158 мкМ в объеме культуры 100 мкл. Клетки отбирали через 3 суток после добавления олигонуклеотидных соединений, и РНК экстрагировали с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфат) (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием мастер-микса (2×) TaqMan Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализов PD-L1 (Applied Biosystems; Hs01125299_m1) и TBP (Applied Biosystems; 4325803). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 10 как % от контрольного образца (клетки, обработанные PBS).

Таблица 10: эффективность in vitro соединений против PD-L1 в линиях клеток ТНР1 и KARPAS-299 (среднее из экспериментов с n, равным 3). Уровни мРНК PD-L1 нормировали к ТВР в клетках KARPAS-299 или к АСТВ в клетках ТНР1, и они показаны как % от контроля (клетки, обработанные PBS).

CMP ID NO	Клетки KARPAS-299 5 мкМ CMP	Клетки THP1 20 мкМ CMP	Соединение (CMP)	Начало на SEQ ID NO 1
% мРНК от контроля	sd	% мРНК от контроля	sd
4_1	50	1	32	11	TAattggctctacTGC	236
5_1	25	5	9	6	TCGCataagaatgaCT	371
6_1	29	2	15	5	TGaacacacagtcgCA	382
7_1	27	7	3	1	CTGaacacacagtCGC	383
8_1	23	4	11	3	TCTgaacacacagtCG	384
9_1	32	3	19	6	TTCtgaacacacagTC	385
10_1	57	5	39	16	ACaagtcatgttaCTA	463
11_1	75	5	37	12	ACacaagtcatgttAC	465
12_1	22	2	10	3	CTtacttagatgcTGC	495
13_1	33	4	23	11	ACttacttagatgCTG	496
14_1	33	7	21	6	GACttacttagatgCT	497
15_1	41	6	18	10	AGacttacttagaTGC	498
16_1	96	14	40	7	GCAggaagagactTAC	506
17_1	22	2	9	3	AATAaattccgttCAGG	541
18_1	34	6	21	9	GCAAataaattcCGTT	545
18_2	51	4	27	11	GCAaataaattccGTT	545
19_1	38	5	23	7	AGCAaataaattcCGT	546
20_1	73	8	56	15	CAGAgcaaataaatTCC	548
21_1	83	8	65	10	TGGAcagagcaaataAAT	551
22_1	86	6	80	8	ATGGacagagcaAATA	554
23_1	44	4	30	2	CAgaatggacagaGCA	558
24_1	63	10	40	11	TTCtcagaatggacAG	562
25_1	31	1	39	5	CTGAactttgacATAG	663
26_1	60	4	56	19	AAgacaaacccagacTGA	675
27_1	36	4	34	10	TATAagacaaacccAGAC	678
28_1	40	4	28	13	TTATaagacaaaccCAGA	679
29_1	30	2	18	6	TGTTataagacaaaCCC	682
30_1	77	3	67	10	TAGAacaatggtaCTTT	708
31_1	81	17	20	14	GTAGaacaatggtaCT	710
32_1	29	5	14	8	AGGtagaacaatgGTA	712
33_1	32	1	43	20	AAGAggtagaacaATGG	714
34_1	70	4	35	13	GCatccacagtaaaTT	749
35_1	83	2	66	21	GAaggttatttaaTTC	773
36_1	18	2	15	5	CTAAtcgaatgcaGCA	805
37_1	64	7	35	10	TACccaatctaatCGA	813
38_1	69	1	49	13	TAGttacccaatcTAA	817
39_1	49	5	26	9	CATttagttacccAAT	821
40_1	23	7	8	2	TCAtttagttaccCAA	822
41_1	24	6	12	3	TTcatttagttaCCCA	823
42_1	51	7	40	5	GAATtaatttcattTAGT	829
43_1	71	9	45	3	CAGTgaggaattaATTT	837
44_1	60	5	45	17	CCAAcagtgaggAATT	842
45_1	63	1	37	15	CCCaacagtgaggAAT	843
46_1	31	3	29	12	TAtacccaacagtgAGG	846
47_1	44	3	27	0	TTatacccaacagTGAG	847
48_1	38	3	26	6	TTTatacccaacagTGA	848
49_1	20	4	7	1	CCTttatacccaaCAG	851
50_1	22	3	6	2	TAACctttatacCCAA	854
51_1	28	1	29	16	AATaacctttataCCCA	855
52_1	80	11	48	10	GTAaataacctttaTA	859
53_1	54	4	37	14	ACTGtaaataacctTTAT	860
54_1	81	4	53	15	ATAtatatgcaatgAG	903
55_1	86	12	70	15	AGatatatatgcaaTG	905
56_1	56	8	27	7	GAGatatatatgcAAT	906
57_1	28	7	13	5	CCagagatatataTGC	909
58_1	88	13	69	23	CAATattccagagATAT	915
59_1	29	3	14	6	GCAAtattccagagATA	916
60_1	25	3	14	3	AGCaatattccagaGAT	917
61_1	29	4	17	2	CAGcaatattccAGAG	919
62_1	27	3	14	3	AATCagcaatattCCAG	921
63_1	23	6	12	6	ACAAtcagcaataTTCC	923
64_1	53	9	43	15	ACtaagtagttacactTCT	957
65_1	32	5	14	6	CTAAgtagttacactTC	958
66_1	35	4	31	6	GACtaagtagttacaCTT	959
67_1	64	10	55	14	TGActaagtagtTACA	962
68_1	62	11	57	16	CTTTgactaagtagTTA	964
69_1	42	9	59	13	CTCtttgactaagTAG	967
70_1	81	6	56	12	GCTCtttgactaagTA	968
71_1	27	3	39	9	CCttaaatactgtTGAC	1060
72_1	75	5	36	7	CTtaaatactgttgAC	1060
73_1	35	6	43	13	TCCttaaatactgTTG	1062
74_1	57	4	79	25	TCTCcttaaatactgTT	1063
75_1	53	6	28	6	TAtcatagttctCCTT	1073
76_1	26	4	9	2	AGTatcatagttcTCC	1075
77_1	74	5	39	12	GAgtatcatagttCTC	1076
78_1	49	5	35	6	AGagtatcatagTTCT	1077
78_2	74	6	36	8	AGAgtatcatagtTCT	1077
79_1	19	2	19	13	CAGagtatcatagTTC	1078
80_1	23	2	26	2	TTCAgagtatcataGT	1080
81_1	35	3	36	11	CTTcagagtatcATAG	1081
82_1	24	6	20	7	TTCTtcagagtatcaTA	1082
83_1	20	2	16	2	TTTcttcagagtaTCAT	1083
84_1	33	4	37	10	GAGAaaggctaagTTT	1099
85_1	42	2	35	18	GAcactcttgtaCATT	1213
86_1	50	4	54	8	TGagacactcttgtaCA	1215
87_1	50	8	28	8	TGagacactcttgTAC	1216
88_1	61	4	33	6	CTttattaaactCCAT	1266
89_1	71	8	43	12	ACCAaactttattaAA	1272
90_1	62	5	42	9	AAACctctactaagTG	1288
91_1	22	3	12	5	AGattaagacagtTGA	1310
92_1	46	3	ND - не определяется	ND	AAgtaggagcaagaGGC	1475
93_1	42	4	60	24	AAAGtaggagcaagAGG	1476
94_1	86	15	46	10	GTtaagcagccaggAG	1806
95_1	66	6	82	27	AGggtaggatgggtAG	1842
96_1	83	19	62	36	AAGggtaggatgggTA	1843
97_1	60	9	69	5	CAAgggtaggatggGT	1844
97_2	76	13	34	7	CAagggtaggatggGT	1844
98_1	65	8	76	28	CCaagggtaggatgGG	1845
99_1	61	2	75	17	TCcaagggtaggatGG	1846
100_1	83	4	82	13	CTTCcaagggtaggAT	1848
101_1	45	3	52	14	ATCttccaagggtagGA	1849
102_1	29	2	17	7	AGaagtgatggctCATT	1936
103_1	26	3	22	1	AAGaagtgatggcTCAT	1937
104_1	34	6	22	2	GAAgaagtgatggcTCA	1938
105_1	41	5	21	5	ATGAaatgtaaacTGGG	1955
106_1	40	8	29	6	CAATgaaatgtaaaCTGG	1956
107_1	24	3	16	4	GCAAtgaaatgtaaACTG	1957
108_1	30	4	20	6	AGCAatgaaatgtaAACT	1958
109_1	44	4	34	14	GAGCaatgaaatgtAAAC	1959
110_1	18	1	13	3	TGaattcccatatcCGA	1992
111_1	69	8	35	8	AGaattatgaccaTAT	2010
112_1	77	7	38	10	AGGtaagaattatGACC	2014
113_1	97	10	56	13	TCAGgtaagaattaTGAC	2015
114_1	69	8	54	21	CTTCaggtaagaatTATG	2017
115_1	91	7	115	42	TCTTcaggtaagaATTA	2019
116_1	88	6	104	36	CTTCttcaggtaaGAAT	2021
117_1	85	6	118	17	TCTTcttcaggtaaGAA	2022
118_1	105	14	102	9	TCTtcttcaggtaAGA	2023
119_1	37	2	76	18	TGGtctaagagaaGAAG	2046
120_1	46	6	81	11	GTTGgtctaagagAAG	2049
121_1	74	11	64	4	AGTtggtctaagAGAA	2050
122_1	74	9	55	21	CAgttggtctaagAGAA	2050
123_1	65	9	95	21	GCAgttggtctaagagAA	2050
124_1	63	7	ND	ND	CAGTtggtctaagaGA	2051
125_1	65	6	ND	ND	GCagttggtctaagaGA	2051
126_1	67	14	104	34	GCagttggtctaaGAG	2052
127_1	22	6	10	3	CTcatatcagggCAGT	2063
128_1	50	4	46	9	CACAcatgttctttaAC	2087
129_1	22	4	12	12	TAAatacacacatgTTCT	2092
130_1	24	2	43	28	GTAAatacacacatgTTC	2093
131_1	33	3	20	12	TGTAaatacacacaTGTT	2094
132_1	73	17	57	21	GATCatgtaaatacACAC	2099
133_1	47	5	28	14	AGATcatgtaaataCACA	2100
134_1	35	6	26	11	CAAAgatcatgtaaatACAC	2101
135_1	30	2	14	3	ACAAagatcatgtaaaTACA	2102
136_1	52	6	24	18	GAATacaaagatcaTGTA	2108
137_1	33	5	20	6	AGAAtacaaagatcATGT	2109
138_1	37	1	22	15	CAGAatacaaagatCATG	2110
139_1	85	6	53	8	GCAGaatacaaagATCA	2112
140_1	79	4	40	6	AGGCagaatacaaagAT	2114
141_1	56	2	53	20	AAGGcagaatacaaAGA	2115
142_1	28	5	20	5	ATTagtgagggacGAA	2132
143_1	26	2	22	10	CAttagtgagggaCGA	2133
144_1	29	6	16	4	GAgggtgatggatTAG	2218
145_1	45	6	22	5	TTaggagtaataAAGG	2241
146_1	65	7	44	9	TTAatgaatttggtTG	2263
147_1	84	8	43	10	CTttaatgaatttgGT	2265
148_1	32	0	15	3	CATGgattacaactAA	2322
149_1	33	2	20	4	TCatggattacaaCTA	2323
150_1	29	1	11	3	GTCatggattacaaCT	2324
151_1	64	2	40	9	CAttaaatctagTCAT	2335
152_1	97	8	63	22	GACAttaaatctagTCA	2336
153_1	92	7	ND	ND	AGGGacattaaatcTA	2340
154_1	35	4	25	15	CAAAgcattataaCCA	2372
155_1	34	3	24	6	ACttactaggcaGAAG	2415
156_1	102	6	113	18	CAGAgttaactgtaCA	2545
157_1	102	10	103	15	CCAGagttaactgtAC	2546
158_1	88	7	95	18	GCcagagttaactgTA	2547
159_1	78	10	ND	ND	TGggccagagttaaCT	2550
160_1	59	5	26	5	CAgcatctatcagaCT	2576
161_1	78	8	42	10	TGAaataacatgagTCAT	2711
162_1	31	6	ND	ND	GTGaaataacatgAGTC	2713
163_1	18	2	11	3	TCTGtttatgtcacTG	2781
164_1	56	5	29	9	GTCTgtttatgtcaCT	2782
165_1	37	8	12	5	TGgtctgtttatGTCA	2784
166_1	39	1	19	3	TTGGtctgtttatgTC	2785
167_1	41	3	35	14	TCacccattgtttaAA	2842
168_1	18	3	14	4	TTcagcaaatatTCGT	2995
169_1	36	8	13	2	GTGtgttcagcaaATAT	2999
170_1	18	2	11	4	TCTattgttaggtATC	3053
171_1	67	4	26	12	ATtgcccatcttacTG	3118
172_1	71	2	33	9	TATtgcccatcttaCT	3119
173_1	47	4	20	5	AAatattgcccatCTT	3122
174_1	74	4	34	7	ATAaccttatcataCA	3174
175_1	98	19	44	12	TAtaaccttatcaTAC	3175
176_1	100	10	64	11	TTAtaaccttatcaTA	3176
177_1	72	38	28	5	TTTataaccttatCAT	3177
178_1	47	6	34	6	ACtgctattgctaTCT	3375
179_1	41	3	23	6	AGgactgctattgCTA	3378
180_1	32	6	27	7	GAGgactgctattgCT	3379
181_1	83	1	46	20	ACgtagaataataaCA	3561
182_1	94	4	52	9	CCaagtgatataATGG	3613
183_1	49	2	16	3	TTagcagaccaaGTGA	3621
184_1	96	3	26	5	GTttagcagaccaaGT	3623
185_1	78	3	46	10	TGacagtgattataTT	3856
186_1	88	5	45	21	TGTCcaagatattgAC	3868
187_1	46	6	23	6	GAAtatcctagatTGT	4066
188_1	79	3	45	14	CAaactgagaataTCC	4074
189_1	63	5	27	8	GCAaactgagaataTC	4075
190_1	77	9	37	11	TCCtattacaatcgTA	4214
191_1	74	10	36	9	TTCCtattacaatcGT	4215
192_1	91	8	51	28	ACtaatgggaggatTT	4256
193_1	95	14	67	24	TAgttcagagaataAG	4429
194_1	86	5	47	16	TAacatatagttcAGA	4436
195_1	87	4	81	20	ATAacatatagttcAG	4437
196_1	101	6	67	20	CAtaacatatagttCA	4438
197_1	91	6	60	13	TCataacatatagtTC	4439
198_1	61	3	31	10	TAGCtcctaacaatCA	4507
199_1	79	12	49	11	CTCCaatctttgtaTA	4602
200_1	74	2	58	13	TCTCcaatctttgtAT	4603
201_1	53	3	33	10	TCtatttcagccaaTC	4708
202_1	25	4	30	9	CGGaagtcagagtGAA	4782
203_1	32	5	21	7	TTAAgcatgaggaaTA	4798
204_1	34	10	26	11	TGAttgagcacctCTT	4831
205_1	81	12	62	12	GACtaattatttcgTT	4857
206_1	57	7	37	7	TGActaattatttCGT	4858
207_1	26	5	21	6	GTGactaattattTCG	4859
208_1	48	3	33	13	CTGCttgaaatgtgAC	4870
209_1	32	1	34	13	CCtgcttgaaatgTGA	4871
210_1	60	5	50	19	ATcctgcttgaaATGT	4873
211_1	111	8	110	26	ATTataaatctatTCT	5027
212_1	107	1	67	12	GCtaaatactttcATC	5151
213_1	26	3	19	6	CAttgtaacataCCTA	5251
214_1	33	2	20	4	GCattgtaacatacCT	5252
215_1	89	8	53	16	TAatattgcaccaaAT	5295
216_1	25	2	29	9	GAtaatattgcacCAA	5297
217_1	27	1	27	6	AGataatattgcacCA	5298
218_1	79	6	45	11	GCcaagaagataATAT	5305
219_1	159	16	68	14	CACAgccacataaaCT	5406
220_1	90	2	72	12	TTgtaattgtggaaAC	5463
221_1	10	2	11	5	TGacttgtaattgTGG	5467
222_1	82	1	67	18	TCtaactgaaatagTC	5503
223_1	30	1	32	9	GTGgttctaactgaAA	5508
224_1	53	7	53	15	CAatatgggacttgGT	5522
225_1	44	1	33	10	ATGacaatatgggaCT	5526
226_1	49	1	41	14	TATGacaatatgggAC	5527
227_1	77	1	54	15	ATATgacaatatggGA	5528
228_1	100	3	98	29	CTtcacttaataaTTA	5552
229_1	90	12	80	19	CTGCttcacttaatAA	5555
230_1	91	0	79	23	AAgactgcttcacTTA	5559
231_1	49	8	77	34	GAATgccctaattaTG	5589
232_1	17	7	88	33	TGGaatgccctaatTA	5591
233_1	40	5	35	10	GCAaatgccagtagGT	5642
234_1	81	6	72	25	CTAatggaaggattTG	5673
235_1	97	17	87	25	AAtatagaacctaaTG	5683
236_1	98	4	83	21	GAAagaatagaatGTT	5769
237_1	93	2	102	26	ATGggtaatagattAT	5893
238_1	110	24	44	14	GAaagagcacagggTG	6103
239_1	66	5	36	10	CTACatagagggaaTG	6202
240_1	70	4	34	8	GCttcctacataGAGG	6207
241_1	64	NA - не анализировали	33	6	TGCTtcctacatagAG	6208
242_1	30	NA	19	7	TGggcttgaaataTGT	6417
243_1	88	6	69	15	CATtatatttaagaAC	6457
244_1	8	2	5	2	TCggttatgttaTCAT	6470
245_1	18	9	12	4	CActttatctggTCGG	6482
246_1	37	2	19	5	AAAttggcacagcGTT	6505
247_1	46	12	29	8	ACCGtgacagtaaATG	6577
248_1	31	2	25	2	TGggaaccgtgacagTA	6581
249_1	17	2	23	9	CCacatataggtcCTT	6597
250_1	15	6	23	7	CAtattgctaccaTAC	6617
251_1	4	2	9	2	TCAtattgctaccATA	6618
252_1	65	12	85	14	CAATtgtcatatTGCT	6624
253_1	20	2	51	7	CATtcaattgtcataTTG	6626
254_1	48	8	91	41	TTTCtactgggaaTTTG	6644
255_1	11	5	23	8	CAAttagtgcagcCAG	6672
256_1	43	7	62	13	GAATaatgttcttaTCC	6704
257_1	28	2	36	19	CACAaattgaataatgtTCT	6709
258_1	64	4	78	22	CATGcacaaattgaaTAAT	6714
259_1	53	8	104	73	ATCctgcaatttcaCAT	6832
260_1	54	5	59	14	CCaccatagctgatCA	6868
261_1	42	8	52	22	ACcaccatagctgaTCA	6868
262_1	68	5	118	66	CAccaccatagctgaTC	6869
263_1	40	2	73	20	TAgtcggcaccaccAT	6877
264_1	64	6	72	35	CttgtagtcggcaccAC	6880
265_1	56	4	82	35	CttgtagtcggcacCA	6881
266_1	41	5	46	21	CGcttgtagtcggcAC	6883
267_1	51	4	33	14	TCAataaagatcagGC	6942
268_1	61	2	49	10	TGgacttacaagaaTG	6986
269_1	45	7	40	9	ATGgacttacaagaAT	6987
270_1	51	12	36	12	GCTCaagaaattggAT	7073
271_1	17	0	14	5	TACTgtagaacatgGC	7133
272_1	15	3	11	3	GCAAttcatttgaTCT	7239
273_1	64	11	ND	ND	TGaagggaggagggacAC	7259
274_1	52	6	50	28	AGtggtgaagggaggAG	7265
275_1	79	7	ND	ND	TAgtggtgaagggaggAG	7265
276_1	81	6	ND	ND	AtagtggtgaagggaggAG	7265
277_1	70	9	ND	ND	TAgtggtgaagggagGA	7266
278_1	84	9	ND	ND	ATagtggtgaagggagGA	7266
279_1	40	6	64	53	TAGtggtgaagggaGG	7267
280_1	42	10	ND	ND	ATAgtggtgaagggaGG	7267
281_1	63	7	ND	ND	GAtagtggtgaagggaGG	7267
282_1	27	7	38	11	ATAGtggtgaagggAG	7268
283_1	60	22	ND	ND	GAtagtggtgaaggGAG	7268
284_1	23	3	97	54	GAgatagtggtgAAGG	7271
285_1	51	6	72	19	CATGggagatagtgGT	7276
286_1	7	1	21	9	ACAAataatggttaCTCT	7302
287_1	66	8	48	20	ACACacaaataatgGTTA	7306
288_1	67	6	58	20	GAGggacacacaaaTAAT	7311
289_1	46	2	50	21	ATATagagaggcTCAA	7390
290_1	22	6	ND	ND	TTgatatagagaGGCT	7393
291_1	11	2	17	3	GCATttgatatagAGA	7397
292_1	70	18	44	8	TTtgcatttgataTAG	7400
293_1	30	1	30	9	CTGgaagaataggtTC	7512
294_1	53	5	42	10	ACTGgaagaataggTT	7513
295_1	56	2	41	15	TACTggaagaatagGT	7514
296_1	80	8	53	13	TGGCttatcctgtaCT	7526
297_1	73	6	52	14	ATggcttatcctGTAC	7527
298_1	75	7	89	25	TATGgcttatcctgTA	7528
299_1	52	5	50	11	GTAtggcttatccTGT	7529
300_1	27	3	31	6	ATgaatatatgccCAGT	7547
301_1	41	8	33	9	GAtgaatatatgCCCA	7549
302_1	8	2	ND	ND	CAAgatgaatataTGCC	7551
303_1	32	5	37	14	GACAacatcagtaTAGA	7572
304_1	28	5	30	23	CAAGacaacatcAGTA	7576
305_1	47	5	41	9	CACtcctagttccTTT	7601
306_1	39	6	33	7	AACactcctagttCCT	7603
307_1	68	3	42	14	TAacactcctagtTCC	7604
308_1	115	5	69	22	CTaacactcctagtTC	7605
309_1	97	16	57	14	TGataacataactgTG	7637
310_1	36	1	23	10	CTgataacataaCTGT	7638
311_1	38	5	24	5	TTTGaactcaagtgAC	7654
312_1	42	3	39	5	TCCTttacttagcTAG	7684
313_1	15	2	14	3	GAgtttggattagCTG	7764
314_1	49	28	ND	ND	TGggatatgacagGGA	7838
315_1	34	6	ND	ND	TGTGggatatgacaGG	7840
316_1	47	3	37	8	ATATggaagggataTC	7875
317_1	11	3	ND	ND	ACAggatatggaaGGG	7880
318_1	48	4	ND	ND	ATTTcaacaggatATGG	7885
319_1	18	2	16	4	GAgtaatttcaacAGG	7891
320_1	74	6	44	5	AGGGagtaatttcAACA	7893
321_1	38	5	56	28	ATTAgggagtaatTTCA	7896
322_1	66	9	32	11	CTtactattaggGAGT	7903
323_1	13	1	15	5	CAgcttactattaGGG	7906
324_1	26	4	20	9	TCAgcttactattAGG	7907
325_1	43	4	17	2	ATTtcagcttactaTTAG	7908
326_1	54	5	57	16	TTcagcttactaTTAG	7908
327_1	28	3	8	2	CAGAtttcagcttaCT	7913
328_1	43	4	37	16	GACtacaactagagGG	7930
329_1	45	12	36	10	AGACtacaactagaGG	7931
330_1	99	8	94	32	AAgactacaactagAG	7932
331_1	59	4	52	19	ATGAtttaattctagtCAAA	7982
332_1	100	2	84	23	TTTaattctagtcAAA	7982
333_1	91	9	60	19	GATTtaattctaGTCA	7984
771_1	74	6	50	5	TGAtttaattctaGTCA	7984
334_1	73	5	54	12	ATGAtttaattctagTCA	7984
335_1	15	1	26	3	GATGatttaattctagtCA	7984
336_1	71	22	49	16	GAtttaattctaGTCA	7984
337_1	43	5	30	11	GATGatttaattctaGTC	7985
338_1	98	5	90	27	TGatttaattctagTC	7985
339_1	87	21	86	2	GAGAtgatttaatTCTA	7988
340_1	92	5	85	27	GAGatgatttaatTCT	7989
341_1	7	1	7	1	CAGAttgatggtagTT	8030
342_1	7	2	24	11	CTcagattgatgGTAG	8032
343_1	3	1	14	9	GTTagccctcagaTTG	8039
344_1	14	5	20	7	TGtattgttagcCCTC	8045
345_1	10	2	11	5	ACttgtattgttAGCC	8048
346_1	52	4	52	17	AGCcagtatcagggAC	8191
347_1	33	3	18	8	TTgacaatagtgGCAT	8213
348_1	7	2	13	5	ACAagtggtatctTCT	8228
349_1	63	8	44	15	AATCtactttacaaGT	8238
350_1	36	2	ND	ND	CAcagtagatgcctGATA	8351
351_1	24	2	30	9	GAacacagtagatGCC	8356
352_1	23	4	103	14	CTTGgaacacagtagAT	8359
353_1	20	2	45	2	ATAtcttggaacaCAG	8364
354_1	25	3	24	6	TCTttaatatcttgGAAC	8368
355_1	39	2	41	10	TGatttctttaatatCTTG	8372
356_1	54	5	88	43	TGatgatttctttaaTATC	8375
357_1	31	4	45	27	AGGctaagtcatgaTG	8389
358_1	18	3	43	20	TTGAtgaggctaagTC	8395
359_1	6	2	11	2	CCAggattatactcTT	8439
360_1	43	5	40	14	GCcaggattataCTCT	8440
361_1	56	8	73	13	CTGccaggattataCT	8442
362_1	23	1	33	7	CAGAaacttatactttaTG	8473
363_1	49	8	45	14	AAGCagaaacttaTACT	8478
364_1	39	6	37	4	GAAgcagaaacttaTACT	8478
365_1	26	4	45	13	TGGaagcagaaacttataCT	8478
366_1	21	4	44	5	TGGaagcagaaacttaTAC	8479
367_1	97	4	70	22	AAgcagaaacttaTAC	8479
368_1	34	3	32	11	TGGaagcagaaactTATA	8480
369_1	71	7	46	19	AAGGgatattatggAG	8587
370_1	51	9	79	38	TGccggaagatttcCT	8641
371_1	45	6	52	25	ATGGattgggagtaGA	8772
372_1	27	7	30	8	AGatggattgggagTA	8774
373_1	13	3	28	6	AAGatggattgggaGT	8775
374_1	42	10	44	11	ACaagatggattGGGA	8777
374_2	41	3	45	14	ACaagatggattggGA	8777
375_1	83	9	88	32	AGAaggttcagaCTTT	8835
376_1	40	5	33	3	GCAgaaggttcagaCT	8837
376_2	28	5	20	4	GCagaaggttcagACT	8837
377_1	70	2	43	8	TGCAgaaggttcagAC	8838
378_1	23	3	55	17	AGtgcagaaggttCAG	8840
378_2	51	6	41	8	AGTGcagaaggttcAG	8840
379_1	34	6	35	7	AAGTgcagaaggttCA	8841
380_1	44	11	24	6	TAagtgcagaagGTTC	8842
381_1	37	5	45	9	TCtaagtgcagaAGGT	8844
382_1	75	5	147	26	CTCaggagttctactTC	8948
383_1	90	10	141	55	CTCaggagttctaCTT	8949
384_1	73	8	234	116	AtggaggtgactcaggAG	8957
385_1	33	4	42	7	ATggaggtgactcagGA	8958
386_1	24	3	29	14	ATggaggtgactcAGG	8959
387_1	37	2	65	15	TAtggaggtgactcAGG	8959
388_1	50	10	81	19	ATatggaggtgactcaGG	8959
389_1	42	5	61	10	TATGgaggtgactcAG	8960
390_1	36	2	76	50	ATatggaggtgacTCAG	8960
391_1	52	6	64	6	CAtatggaggtgactcAG	8960
392_1	63	5	57	6	ATAtggaggtgacTCA	8961
393_1	53	7	64	12	CAtatggaggtgacTCA	8961
394_1	51	5	56	24	CAtatggaggtgACTC	8962
395_1	23	3	41	34	GCatatggaggtgacTC	8962
396_1	34	3	54	10	TGcatatggaggtgacTC	8962
397_1	54	5	71	24	TtgcatatggaggtgacTC	8962
398_1	61	11	59	13	TttgcatatggaggtgacTC	8962
399_1	25	2	30	6	GCatatggaggtgaCT	8963
400_1	34	4	25	9	TGcatatggaggtgaCT	8963
401_1	25	4	31	20	TTGcatatggaggtgaCT	8963
402_1	51	6	37	11	TttgcatatggaggtgaCT	8963
403_1	26	1	33	5	TGCatatggaggtgAC	8964
404_1	25	2	69	19	TTGcatatggaggtGAC	8964
405_1	26	4	24	4	TTTGcatatggaggtgAC	8964
406_1	19	3	20	7	TTTGcatatggaggtGA	8965
407_1	16	5	46	16	TTtgcatatggaGGTG	8966
408_1	9	2	9	6	AAgtgaagttcaaCAGC	8997
409_1	26	8	109	52	TGggaagtgaagTTCA	9002
410_1	31	5	24	5	ATgggaagtgaagTTC	9003
411_1	49	9	19	10	GATGggaagtgaaGTT	9004
412_1	28	10	17	9	CTGtgatgggaagtGAA	9007
413_1	54	4	34	8	ATTgagtgaatccAAA	9119
414_1	11	1	14	2	AAttgagtgaatCCAA	9120
415_1	58	6	14	2	GATAattgagtgaaTCC	9122
416_1	5	1	16	3	GTGataattgagtGAA	9125
417_1	73	5	61	14	AAGaaaggtgcaaTAA	9155
418_1	86	6	64	13	CAagaaaggtgcAATA	9156
419_1	75	19	64	14	ACAAgaaaggtgcaAT	9157
420_1	75	8	50	13	ATttaaactcacaaAC	9171
421_1	21	8	23	6	CTgttaggttcaGCGA	9235
422_1	54	10	30	5	TCTGaatgaacatTTCG	9260
423_1	11	4	15	5	CTcattgaaggtTCTG	9281
424_1	87	3	52	8	CTAatctcattgaaGG	9286
425_1	95	1	85	13	CCtaatctcattgaAG	9287
426_1	31	7	22	7	ACTttgatctttcAGC	9305
427_1	64	7	49	16	ACtatgcaacacttTG	9315
428_1	18	6	21	3	CAAatagctttatCGG	9335
429_1	19	6	17	4	CCaaatagctttATCG	9336
430_1	35	4	27	8	TCCAaatagctttaTC	9337
431_1	75	8	43	7	GATCcaaatagcttTA	9339
432_1	67	11	32	8	ATgatccaaataGCTT	9341
433_1	53	5	43	6	TATGatccaaatagCT	9342
434_1	97	9	66	29	TAAAcagggctggGAAT	9408
435_1	58	12	44	17	ACttaaacagggCTGG	9412
436_1	58	10	30	12	ACacttaaacagGGCT	9414
437_1	87	38	41	3	GAACacttaaacAGGG	9416
438_1	70	4	59	33	AGAGaacacttaaACAG	9418
439_1	83	17	28	9	CTACagagaacaCTTA	9423
440_1	49	12	27	4	ATGctacagagaaCACT	9425
441_1	53	10	24	13	ATAAatgctacagagAACA	9427
442_1	23	6	20	10	AGataaatgctacaGAGA	9430
443_1	48	6	27	7	TAGAgataaatgcTACA	9434
444_1	51	3	32	8	TAGAtagagataaatGCT	9437
445_1	38	5	ND	ND	CAATatactagataGAGA	9445
446_1	52	3	31	1	TACAcaatatactagATAG	9448
447_1	65	6	48	11	CTAcacaatatacTAG	9452
448_1	67	9	29	2	GCTAcacaatatACTA	9453
449_1	103	17	65	15	ATATgctacacaatATAC	9455
450_1	71	13	129	22	TGATatgctacaCAAT	9459
451_1	19	4	9	1	ATGAtatgatatgCTAC	9464
452_1	75	10	45	21	GAGGagagagacaaTAAA	9495
453_1	68	6	43	10	CTAggaggagagagACA	9500
454_1	72	7	79	25	TATTctaggaggagAGA	9504
455_1	31	3	29	9	TTATattctaggagGAG	9507
456_1	38	5	62	17	GTTtatattctaGGAG	9510
457_1	15	6	15	8	TGgagtttatattcTAGG	9512
458_1	34	3	21	3	CGtaccaccactcTGC	9590
459_1	41	5	55	22	TGAGgaaatcattcATTC	9641
460_1	81	8	47	22	TTTGaggaaatcatTCAT	9643
461_1	76	8	39	5	AGGCtaatcctattTG	9657
462_1	93	12	216	12	TTTAggctaatcCTAT	9660
463_1	15	6	30	9	TGCtccagtgtaccCT	9755
464_1	27	3	25	6	TAgtagtactcgATAG	9813
465_1	9	2	7	3	CTAattgtagtagtaCTC	9818
466_1	52	3	32	6	TGctaattgtagTAGT	9822
467_1	68	11	36	16	AGTGctaattgtagTA	9824
468_1	35	6	32	3	GCAAgtgctaattgTA	9827
469_1	91	9	ND	ND	GAGGaaatgaactaattTA	9881
470_1	92	5	ND	ND	CAGGaggaaatgaacTA	9886
471_1	67	5	42	6	CCctagagtcattTCC	9902
472_1	35	5	20	8	ATCttacatgatgaAGC	9925
473_1	13	1	20	5	GACacactcagatttcAG	9967
474_1	24	4	20	2	AGacacactcagatttcAG	9967
475_1	25	4	24	7	AAGacacactcagatttcAG	9967
476_1	26	6	19	4	AGacacactcagattTCA	9968
477_1	28	4	32	13	AAGacacactcagattTCA	9968
478_1	31	8	37	6	AAagacacactcagatTTCA	9968
479_1	63	7	51	26	GAAagacacactcagatTTC	9969
480_1	37	10	ND	ND	AAGAcacactcagatTTC	9969
481_1	41	4	ND	ND	AAAGacacactcagaTTTC	9969
482_1	19	5	48	14	TGAAagacacactcagatTT	9970
483_1	60	8	68	10	TGaaagacacactcaGATT	9971
484_1	42	8	63	22	TGAaagacacactcaGAT	9972
485_1	48	9	41	20	ATTGaaagacacacTCA	9975
486_1	27	6	27	12	TCattgaaagacaCACT	9977
487_1	88	13	121	33	TTCcatcattgaAAGA	9983
488_1	80	12	ND	ND	ATAAtaccacttaTCAT	10010
489_1	13	4	27	15	TTacttaatttcttTGGA	10055
490_1	32	5	60	24	TTAgaactagctttaTCA	10101
491_1	58	10	55	17	GAGgtacaaatatAGG	10171
492_1	4	1	12	3	CTTatgatacaacTTA	10384
493_1	37	6	35	5	TCttatgatacaaCTT	10385
494_1	30	0	27	6	TTCttatgatacaaCT	10386
495_1	27	8	18	3	CAgtttcttatgaTAC	10390
496_1	25	10	25	6	GCAgtttcttatgaTA	10391
497_1	77	6	72	29	TACAaatgtctattagGTT	10457
498_1	66	5	69	17	TGTAcaaatgtctatTAG	10460
499_1	27	10	20	4	AGCatcacaattagTA	10535
500_1	31	10	25	5	CTAatgatagtgaaGC	10548
501_1	21	7	30	8	AGCtaatgatagtgAA	10550
502_1	35	5	39	8	ATGCcttgacatatTA	10565
503_1	64	11	79	26	CTCAagattattgACAC	10623
504_2	25	4	83	32	ACctcaagattaTTGA	10626
504_1	94	7	22	6	ACCtcaagattaTTGA	10626
505_1	31	6	34	10	AACCtcaagattatTG	10627
506_1	55	6	62	17	CACAaacctcaagattaTT	10628
507_1	66	12	40	4	GTActtaattagACCT	10667
508_1	78	5	80	10	AGTActtaattagACC	10668
509_1	36	5	42	15	GTATgaggtggtaaAC	10688
510_1	40	4	48	22	AGgaaacagcagaAGTG	10723
511_1	27	7	13	6	GCacaacccagaggAA	10735
512_1	54	5	ND	ND	CAAgcacaacccagAG	10738
513_1	35	7	ND	ND	TTCaagcacaaccCAG	10740
514_1	49	6	52	15	AAttcaagcacaACCC	10742
515_1	72	4	106	49	TAATaattcaagcacaaCC	10743
516_1	43	4	57	21	ACTAataattcaaGCAC	10747
517_1	37	3	60	12	ATAAtactaataattcAAGC	10749
518_1	9	3	6	1	TAgatttgtgagGTAA	11055
519_1	59	10	31	5	AGCCttaattctccAT	11091
520_1	41	4	34	9	AATGatctagagcCTTA	11100
521_1	34	6	34	7	CTAatgatctagaGCC	11103
522_1	52	6	52	17	ACTaatgatctaGAGC	11104
523_1	60	4	54	10	CATtaacatgttctTATT	11165
524_1	57	4	55	8	ACAAgtacattaacatGTTC	11170
525_1	53	6	44	5	TTACaagtacattaaCATG	11173
526_1	54	11	49	17	GCTTtattcatgtTTAT	11195
527_1	34	7	17	5	GCTttattcatgttTA	11196
528_1	11	2	21	4	AGAgctttattcatgtTT	11197
529_1	22	4	33	7	ATAAgagctttattCATG	11200
530_1	30	5	32	15	CATAagagctttaTTCA	11202
531_1	77	8	24	4	AGCAtaagagctTTAT	11205
532_1	8	3	15	6	TAGattgtttagtGCA	11228
533_1	4	2	10	2	GTagattgtttaGTGC	11229
534_1	41	6	33	11	GACAattctagtaGATT	11238
535_1	50	1	37	7	CTGacaattctaGTAG	11241
536_1	49	7	36	6	GCTGacaattctagTA	11242
537_1	59	2	42	11	AGgattaagatacgTA	11262
538_1	28	11	28	4	CAggattaagataCGT	11263
539_1	96	5	20	6	TCAggattaagataCG	11264
540_1	70	11	59	11	TTcaggattaagATAC	11265
541_1	53	5	28	4	AGGAagaaagtttgATTC	11308
542_1	92	13	59	12	TCAAggaagaaagtTTGA	11311
543_1	44	3	67	7	CTCAaggaagaaagTTTG	11312
544_1	43	4	32	4	TGCtcaaggaagaAAGT	11315
545_1	41	7	44	20	AATTatgctcaaggaAGA	11319
546_1	11	4	26	8	TAGGataccacattatGA	11389
547_1	25	4	26	12	CAtaatttattccattcCTC	11449
548_1	64	6	ND	ND	TGCAtaatttattcCAT	11454
549_1	48	17	49	7	ACTGcataatttatTCC	11456
550_1	91	10	92	15	CTAAactgcataattTATT	11458
551_1	85	8	38	9	ATaactaaactgCATA	11465
552_1	86	4	ND	ND	TTAttaataactaaaCTGC	11468
553_1	91	13	92	21	TAGTacattattaataaCT	11475
554_1	50	4	37	7	CATAactaaggacgTT	11493
555_1	41	5	30	7	TCataactaaggaCGT	11494
556_1	80	7	55	13	CGTCataactaaggAC	11496
557_1	86	3	59	11	TCgtcataactaagGA	11497
558_1	51	9	33	12	ATcgtcataactAAGG	11498
559_1	91	6	65	26	GTtagtatcttacATT	11525
560_1	30	3	41	8	CTCtattgttagtATC	11532
561_1	59	8	18	6	AGTatagagttacTGT	11567
562_1	65	11	41	11	TTCCtggtgatactTT	11644
563_1	57	13	45	13	GTTCctggtgatacTT	11645
564_1	57	15	30	7	TGttcctggtgataCT	11646
565_1	17	4	35	4	ATaaacatgaatctCTCC	11801
566_1	16	3	30	4	CTTtataaacatgaaTCTC	11804
567_1	60	5	45	11	CTGtctttataaaCATG	11810
568_1	20	2	19	5	TTgttataaatctgTCTT	11820
569_1	68	9	44	4	TTAaatttattcttgGATA	11849
570_1	76	8	48	12	CTtaaatttattctTGGA	11851
571_1	62	5	66	5	CTTCttaaatttattctTG	11853
572_1	28	4	44	10	TATGtttctcagtAAAG	11877
573_1	29	6	36	11	GAAttatctttaaACCA	11947
574_1	74	6	34	7	CCCttaaatttctaCA	11980
575_1	37	8	30	9	ACACtgctcttgtaCC	11995
576_1	45	14	27	6	TGAcaacactgctCTT	12000
577_1	2	1	12	5	TACAtttattgggcTC	12081
578_1	65	14	39	9	GTacatttattgGGCT	12082
579_1	34	4	53	12	TTGgtacatttatTGG	12085
580_1	41	7	35	6	CATGttggtacattTAT	12088
581_1	11	4	12	5	AATCatgttggtacAT	12092
582_1	96	16	48	9	AAatcatgttggtaCA	12093
583_1	71	15	42	13	GACaagtttggattAA	12132
584_1	46	34	39	6	AAtgttcagatgCCTC	12197
585_1	37	26	28	12	GCttaatgttcagaTG	12201
586_1	75	8	43	12	CGTAcatagcttgaTG	12267
587_1	41	10	28	5	GTGaggaattaggaTA	12753
588_1	41	5	27	9	GTAacaatatggttTG	12780
589_1	67	10	37	7	GAaatattgtagaCTA	13151
590_1	97	10	80	12	TTGaaatattgtagAC	13153
591_1	64	10	47	9	AAgtctagtaatTTGC	13217
592_1	84	7	60	9	GCTCagtagattatAA	13259
593_1	42	8	32	9	CATacactgttgcTAA	13296
594_1	101	6	79	17	ATGgtctcaaatcATT	13314
595_1	53	14	46	7	CAATggtctcaaatCA	13316
596_1	47	6	36	6	TTCCtattgattgaCT	13568
597_1	97	12	41	6	TTTCtgttcacaacAC	13600
598_1	85	1	49	11	AGgaacccactaaTCT	13702
599_1	56	3	34	7	TAAatggcaggaacCC	13710
600_1	15	4	24	8	GTAAatggcaggaaCC	13711
601_1	40	6	26	8	TTgtaaatggcagGAA	13713
602_1	59	12	26	6	TTatgagttaggCATG	13835
603_1	62	2	42	10	CCAggtgaaactttAA	13935
604_1	77	9	55	18	CCCttagtcagctCCT	13997
605_1	82	13	42	11	ACccttagtcagCTCC	13998
606_1	74	1	39	10	CAcccttagtcagCTC	13999
607_1	76	9	30	8	TCTcttactaggcTCC	14091
608_1	82	5	50	13	CCtatctgtcatcATG	14178
609_1	82	1	48	12	TCCtatctgtcatcAT	14179
610_1	41	6	50	13	GAGaagtgtgagaaGC	14808
611_1	70	5	84	19	CATCcttgaagtttAG	14908
612_1	64	14	61	16	TAAtaagatggctCCC	15046
613_1	85	2	51	14	CAAggcataataagAT	15053
614_1	47	1	35	10	CCaaggcataatAAGA	15054
615_1	74	8	53	11	TGatccaattctcaCC	15151
616_1	63	4	41	11	ATGatccaattctCAC	15152
617_1	46	7	42	9	CGCttcatcttcacCC	15260
618_1	104	4	15	4	TAtgacactgcaTCTT	15317
619_1	8	3	8	5	GTAtgacactgcaTCT	15318
620_1	21	3	27	10	TGtatgacactgCATC	15319
621_1	37	7	38	11	TTCTcttctgtaagTC	15363
622_1	49	7	36	11	TTctacagaggaACTA	15467
623_1	47	1	32	10	ACTacagttctacAGA	15474
624_1	78	8	69	6	TTCCcacaggtaaaTG	15561
625_1	70	7	ND	ND	ATTAtttgaatatactCATT	15594
626_1	73	7	49	25	TGGGaggaaattatTTG	15606
627_1	80	5	64	11	TGACtcatcttaaaTG	15621
628_1	71	6	66	19	CTGactcatcttaaAT	15622
629_1	31	6	41	6	TTTactctgactcATC	15628
630_1	88	2	68	18	TATtggaggaattaTT	15642
631_1	53	2	27	6	GTAttggaggaattAT	15643
632_1	23	3	39	7	TGgtatacttctctaagTAT	15655
633_1	42	9	33	3	GATCtcttggtataCT	15666
634_1	38	1	30	16	CAgacaactctataCC	15689
635_1	10	2	19	3	AACAtcagacaacTCTA	15693
636_1	13	1	11	3	TAACatcagacaacTC	15695
637_1	14	2	27	2	TTTAacatcagacaACTC	15695
638_1	101	14	81	16	ATttaacatcagacAA	15698
639_1	14	1	17	1	CCtatttaacatcAGAC	15700
640_1	65	2	ND	ND	TCCctatttaacaTCA	15703
641_1	41	6	42	12	TCAAcgactattgGAAT	15737
642_1	37	2	29	5	CTTAtattctggcTAT	15850
643_1	31	7	35	4	ATCCttatattctgGC	15853
644_1	13	3	8	1	GAtccttatattCTGG	15854
645_1	25	5	20	4	TGAtccttatattCTG	15855
646_1	33	6	54	10	ATTGaaacttgaTCCT	15864
647_1	43	3	27	6	ACtgtcattgaaACTT	15870
648_1	54	7	32	12	TCTtactgtcattgAA	15874
649_1	12	1	25	2	AGgatcttactgtCATT	15877
650_1	13	4	11	3	GCAaatcaactccATC	15896
651_1	10	5	16	3	GTGcaaatcaactCCA	15898
652_1	7	0	36	18	CAATtatttctttgTGC	15910
653_1	21	3	31	7	TGGcaacaattattTCTT	15915
654_1	75	9	73	24	GCTggcaacaatTATT	15919
655_1	21	6	39	6	ATCCatttctactgCC	15973
656_1	25	3	38	8	TAATatctattgattTCTA	15988
657_1	14	2	11	5	TCaatagtgtagggCA	16093
658_1	11	4	10	3	TTCaatagtgtaggGC	16094
659_1	18	1	32	12	AGGTtaattaattcaATAG	16102
660_1	33	7	25	10	CATttgtaatccCTAG	16163
660_2	64	14	31	8	CATttgtaatcccTAG	16163
661_1	48	6	34	6	ACAtttgtaatccCTA	16164
662_2	29	6	23	5	AAcatttgtaatCCCT	16165
662_1	30	6	18	6	AACatttgtaatCCCT	16165
663_1	49	1	26	6	TAaatttcaagttCTG	16184
664_1	17	3	30	10	GTTtaaatttcaagTTCT	16185
665_1	22	7	40	9	CCAAgtttaaatttCAAG	16189
666_1	89	11	ND	ND	ACCCaagtttaaaTTTC	16192
667_1	60	16	87	8	CAtacagtgacccaagTTT	16199
668_1	65	9	50	12	ACatcccatacagTGA	16208
669_1	83	8	103	4	AGcacagctctaCATC	16219
670_1	80	9	150	36	ATAtagcacagcTCTA	16223
671_1	57	14	ND	ND	TCCatatagcacagCT	16226
672_1	53	10	106	8	ATTtccatatagCACA	16229
673_1	78	3	96	14	TTTAtttccatatAGCA	16231
674_1	77	9	31	7	TTTatttccatatAGC	16232
675_1	32	6	ND	ND	AAGGagaggagatTATG	16409
676_1	32	5	24	6	AGTtcttgtgttagCT	16456
677_1	19	4	17	4	GAgttcttgtgttaGC	16457
678_1	14	3	25	3	ATTaattatccatCCAC	16590
679_1	11	2	20	6	ATCaattaattatcCATC	16593
680_1	31	5	40	11	AGAatcaattaattaTCC	16596
681_1	8	3	30	10	TGagataccgtgcaTG	16656
682_1	11	3	ND	ND	AAtgagataccgTGCA	16658
683_1	15	3	33	10	CTGtggttaggctaAT	16834
684_1	45	7	38	7	AagagtaagggtctgtggTT	16842
685_1	24	5	ND	ND	GATGggttaagagTAA	16854
686_1	11	2	ND	ND	AGCagatgggttaaGA	16858
687_1	ND	ND	51	7	TGtaaacatttgTAGC	16886
688_1	83	1	54	11	CCTgcttataaatgTA	16898
689_1	103	4	73	14	TGCCctgcttataaAT	16901
690_1	104	2	64	22	TCttcttagttcaaTA	16935
691_1	ND	ND	60	9	TGgtttctaactACAT	16980
692_1	ND	ND	94	22	AGtttggtttctaaCTA	16983
693_1	8	2	17	5	GAAtgaaacttgcCTG	17047
694_1	98	6	51	9	ATTatccttacatGAT	17173
695_1	48	4	18	4	GTacccaattatcCTT	17180
696_1	94	2	48	9	TGTacccaattatCCT	17181
697_1	31	5	42	13	TTgtacccaattaTCC	17182
698_1	41	4	39	6	TTTgtacccaattaTC	17183
699_1	63	0	28	12	AGCAgcaggttataTT	17197
700_1	99	6	43	12	TGGgaagtggtctGGG	17292
701_1	103	2	28	5	CTGgagagtgataaTA	17322
702_1	52	6	27	9	AATGctggattacgTC	17354
703_1	67	3	37	7	CAatgctggattaCGT	17355
704_1	36	10	80	12	TTgttcagaagtATCC	17625
705_1	19	9	47	9	GAtgatttgcttGGAG	17646
706_1	44	NA	60	9	GAAatcattcacaACC	17860
707_1	46	9	32	9	TTGtaacatctacTAC	17891
708_1	56	0	79	17	CATtaagcagcaagTT	17923
709_1	30	9	46	7	TTActagatgtgagCA	17942
710_1	29	4	36	6	TTtactagatgtgAGC	17943
711_1	41	13	41	6	GACcaagcaccttaCA	17971
712_1	36	19	49	11	AGAccaagcacctTAC	17972
713_1	30	6	34	7	ATgggttaaataAAGG	18052
714_1	70	2	24	8	TCaaccagagtattAA	18067
715_1	11	4	26	8	GTCaaccagagtatTA	18068
716_1	126	56	26	6	ATtgtaaagctgaTAT	18135
717_1	73	1	42	10	CAcataattgtaAAGC	18141
718_1	23	9	55	18	GAggtctgctattTAC	18274
719_1	50	1	42	11	TGtagattcaatgCCT	18404
720_1	79	3	39	10	CCtcattatactaTGA	18456
721_1	27	6	30	8	CCttatgctatgacAC	18509
722_1	26	7	50	13	TCCTtatgctatgaCA	18510
723_1	59	1	48	12	AAGatgtttaagtATA	18598
724_1	54	2	50	13	CTgattattaagATGT	18607
725_1	92	10	84	19	TGgaaaggtatgaaTT	18808
726_1	24	8	61	16	ACttgaatggcttgGA	18880
727_1	8	4	51	14	AACttgaatggctTGG	18881
728_1	35	4	35	10	CAATgtgttactatTT	19004
729_1	36	9	53	11	ACAatgtgttactATT	19005
730_1	70	2	41	11	CATCtgctatataaGA	19063
731_1	38	NA	42	9	CCTAgagcaaatacTT	19223
732_1	102	15	15	4	CAGagttaataatAAG	19327
733_1	37	10	8	5	GTTCaagcacaacgAA	19493
734_1	13	1	38	11	AGggttcaagcacAAC	19496
735_1	49	NA	36	11	TGttggagacactgTT	19677
736_1	48	NA	32	10	AAGgaggagttaggAC	19821
737_1	36	NA	64	11	CTATgccatttacgAT	19884
738_1	105	19	66	19	TCaaatgcagaattAG	19913
739_1	44	NA	41	6	AGtgacaatcaaATGC	19921
740_1	107	NA	68	18	AAgtgacaatcaaATG	19922
741_1	102	4	27	6	GTGtaccaagtaacAA	19978
742_1	110	10	30	16	TGGgatgttaaacTGA	20037

Пример 2 - тестирование эффективности in vitro в кривой доза-ответ

Набор олигонуклеотидов из Таблицы 10 тестировали в клетках KERPAS-299 с использованием полу-log серийных разведений в PBS (от 50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158 мкМ олигонуклеотида) в анализе эффективности in vitro, описанном в Примере 1. Для данных олигонуклеотидов оценивали IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация) и максимальное ингибирование (% остаточной экспрессии PD-L1).

Расчеты ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация) проводили в GraphPad Prism6. IC50 и максимальный уровень нокдауна PD-L1 показаны в Таблице 11 как % от контрольных клеток (обработанных PBS).

Таблица 11: максимальное ингибирование как % от обработки физиологическим раствором и ЕС50 в линии клеток KARPAS-299.

CMP ID NO	Макс. ингибирование (% остаточной экспрессии PD-L1; % от обработанных физиологическим раствором)	EC50 (мкM)	Соединение CMP	Начало на SEQ ID NO: 1
Средн.	SD	Средн.	SD
6_1	11	3,3	0,69	0,11	TCGCataagaatgaCT	371
8_1	29	1,7	0,06	0,01	CTGaacacacagtCGC	383
9_1	19	1,7	0,23	0,02	TCTgaacacacagtCG	384
13_1	14	4,7	0,45	0,12	CTtacttagatgcTGC	495
41_1	10	1,8	0,19	0,02	TCAtttagttaccCAA	822
42_1	17	1,3	0,19	0,02	TTcatttagttaCCCA	823
58_1	23	1,5	0,17	0,01	CCagagatatataTGC	909
77_1	24	2,4	0,16	0,02	AGTatcatagttcTCC	1075
92_1	12	2,4	0,25	0,03	AGattaagacagtTGA	1310
111_1	3	2,0	0,27	0,03	TGaattcccatatcCGA	1992
128_1	11	1,8	0,25	0,03	CTcatatcagggCAGT	2063
151_1	16	2,7	0,28	0,05	GTCatggattacaaCT	2324
164_1	19	1,6	0,15	0,01	TCTGtttatgtcacTG	2781
166_1	36	1,7	0,11	0,02	TGgtctgtttatGTCA	2784
169_1	10	1,6	0,22	0,02	TTcagcaaatatTCGT	2995
171_1	12	2,0	0,21	0,02	TCTattgttaggtATC	3053
222_1	1	2,0	0,21	0,02	TGacttgtaattgTGG	5467
233_1	1	4,3	0,89	0,17	TGGaatgccctaatTA	5591
245_1	4	2,0	0,17	0,02	TCggttatgttaTCAT	6470
246_1	7	2,1	0,25	0,03	CActttatctggTCGG	6482
250_1	0	2,5	0,23	0,03	CCacatataggtcCTT	6597
251_1	0	2,8	0,75	0,10	CAtattgctaccaTAC	6617
252_1	3	2,2	0,19	0,02	TCAtattgctaccATA	6618
256_1	5	2,2	0,32	0,03	CAAttagtgcagcCAG	6672
272_1	1	3,2	0,69	0,10	TACTgtagaacatgGC	7133
273_1	3	2,8	0,28	0,04	GCAAttcatttgaTCT	7239
287_1	1	1,4	0,13	0,01	ACAAataatggttaCTCT	7302
292_1	2	2,1	0,21	0,02	GCATttgatatagAGA	7397
303_1	0	1,2	0,21	0,01	CAAgatgaatataTGCC	7551
314_1	3	2,1	0,39	0,04	GAgtttggattagCTG	7764
318_1	3	1,4	0,14	0,01	ACAggatatggaaGGG	7880
320_1	2	2,4	0,22	0,03	GAgtaatttcaacAGG	7891
324_1	0	2,4	0,44	0,05	CAgcttactattaGGG	7906
336_1	0	2,5	0,21	0,03	GATGatttaattctagtCA	7984
342_1	1	2,2	0,12	0,01	CAGAttgatggtagTT	8030
343_1	4	1,8	0,11	0,01	CTcagattgatgGTAG	8032
344_1	0	0,9	0,12	0,01	GTTagccctcagaTTG	8039
345_1	0	2,3	0,36	0,04	TGtattgttagcCCTC	8045
346_1	1	2,1	0,22	0,02	ACttgtattgttAGCC	8048
349_1	4	2,9	0,21	0,03	ACAagtggtatctTCT	8228
359_1	6	2,9	0,39	0,05	TTGAtgaggctaagTC	8395
360_1	0	1,7	0,18	0,02	CCAggattatactcTT	8439
374_1	5	1,7	0,33	0,03	AAGatggattgggaGT	8775
408_1	3	1,8	0,21	0,02	TTtgcatatggaGGTG	8966
409_1	0	1,8	0,21	0,02	AAgtgaagttcaaCAGC	8997
415_1	0	1,4	0,23	0,02	AAttgagtgaatCCAA	9120
417_1	7	0,9	0,15	0,01	GTGataattgagtGAA	9125
424_1	6	3,2	0,19	0,03	CTcattgaaggtTCTG	9281
429_1	5	2,5	0,48	0,05	CAAatagctttatCGG	9335
430_1	1	2,7	0,68	0,09	CCaaatagctttATCG	9336
458_1	0	4,1	0,35	0,07	TGgagtttatattcTAGG	9512
464_1	0	4,1	0,56	0,10	TGCtccagtgtaccCT	9755
466_1	1	2,1	0,21	0,02	CTAattgtagtagtaCTC	9818
474_1	0	2,4	0,27	0,03	GACacactcagatttcAG	9967
490_1	0	1,9	0,29	0,03	TTacttaatttcttTGGA	10055
493_1	3	1,8	0,20	0,02	CTTatgatacaacTTA	10384
512_1	0	3,3	0,63	0,10	GCacaacccagaggAA	10735
519_1	5	1,5	0,15	0,01	TAgatttgtgagGTAA	11055
529_1	0	2,7	0,24	0,03	AGAgctttattcatgtTT	11197
533_1	6	1,5	0,14	0,01	TAGattgtttagtGCA	11228
534_1	5	0,9	0,06	0,00	GTagattgtttaGTGC	11229
547_1	1	1,6	0,26	0,02	TAGGataccacattatGA	11389
566_1	0	3,0	0,40	0,06	ATaaacatgaatctCTCC	11801
567_1	2	2,5	0,34	0,04	CTTtataaacatgaaTCTC	11804
578_1	2	1,3	0,09	0,01	TACAtttattgggcTC	12081
582_1	1	1,6	0,20	0,02	AATCatgttggtacAT	12092
601_1	1	2,1	0,47	0,05	GTAAatggcaggaaCC	13711
619_1	4	3,4	0,44	0,08	TAtgacactgcaTCTT	15317
620_1	1	1,2	0,12	0,01	GTAtgacactgcaTCT	15318
636_1	0	1,3	0,19	0,01	AACAtcagacaacTCTA	15693
638_1	0	2,2	0,36	0,04	TAACatcagacaacTC	15695
637_1	0	2,1	0,21	0,02	TTTAacatcagacaACTC	15695
640_1	2	3,3	0,42	0,06	CCtatttaacatcAGAC	15700
645_1	1	2,9	0,34	0,04	GAtccttatattCTGG	15854
650_1	0	2,4	0,24	0,03	AGgatcttactgtCATT	15877
651_1	4	3,4	0,33	0,05	GCAaatcaactccATC	15896
652_1	0	1,3	0,16	0,01	GTGcaaatcaactCCA	15898
653_1	4	2,0	0,09	0,01	CAATtatttctttgTGC	15910
658_1	3	1,6	0,32	0,02	TCaatagtgtagggCA	16093
659_1	5	1,4	0,20	0,01	TTCaatagtgtaggGC	16094
660_1	4	2,1	0,22	0,02	AGGTtaattaattcaATAG	16102
665_1	3	1,8	0,18	0,02	GTTtaaatttcaagTTCT	16185
678_1	3	2,1	0,43	0,04	GAgttcttgtgttaGC	16457
679_1	0	3,5	0,31	0,05	ATTaattatccatCCAC	16590
680_1	4	1,6	0,12	0,01	ATCaattaattatcCATC	16593
682_1	3	2,4	0,27	0,03	TGagataccgtgcaTG	16656
683_1	0	3,2	0,16	0,03	AAtgagataccgTGCA	16658
684_1	2	2,3	0,25	0,03	CTGtggttaggctaAT	16834
687_1	5	1,3	0,13	0,01	AGCagatgggttaaGA	16858
694_1	0	1,7	0,16	0,02	GAAtgaaacttgcCTG	17047
706_1	15	3,6	0,27	0,06	GAtgatttgcttGGAG	17646
716_1	10	2,1	0,15	0,02	GTCaaccagagtatTA	18068
728_1	5	1,2	0,09	0,01	AACttgaatggctTGG	18881
733_1	0	12,7	8,01	3,62	CAGagttaataatAAG	19327
734_1	0	14,6	3,49	2,39	GTTCaagcacaacgAA	19493
735_1	0	2,5	0,30	0,04	AGggttcaagcacAAC	19496

Набор олигонуклеотидов из Таблицы 6 тестировали в клетках ТНР-1 с использованием серийного разведения 1:3 в воде от 25 мкМ до 0,004 мкМ в анализе эффективности in vitro, описанном в Примере 1. Для данных олигонуклеотидов оценивали IC50 и максимальное ингибирование (% остаточной экспрессии PD-L1).

Расчеты ЕС50 проводили в GraphPad Prism6. IC50 и максимальный уровень нокдауна PD-L1 показаны в Таблице 12 как % от контрольных клеток (обработанных PBS).

Таблица 12: максимальное ингибирование как % от обработки физиологическим раствором и ЕС50 в линии клеток ТНР1.

CMP ID NO	Макс. ингибирование (% остаточной экспрессии PD-L1; % от обработанных физиологическим раствором)	EC50 (мкM)	Соединение СМР	Начало на SEQ ID NO: 1
Средн.	SD	Средн.	SD
6_1	12	11,5	0,73	0,38	TCGCataagaatgaCT	371
8_1	6	5,6	0,11	0,04	CTGaacacacagtCGC	383
9_1	1	14,3	0,36	0,27	TCTgaacacacagtCG	384
13_1	2	12,4	0,49	0,31	CTtacttagatgcTGC	495
41_1	14	14,6	0,38	0,27	TCAtttagttaccCAA	822
42_1	21	10,4	0,22	0,10	TTcatttagttaCCCA	823
58_1	6	19,8	0,97	0,81	CCagagatatataTGC	909
77_1	5	4,8	0,14	0,04	AGTatcatagttcTCC	1075
92_1	0	12,9	0,57	0,39	AGattaagacagtTGA	1310
128_1	15	10,1	0,23	0,13	CTcatatcagggCAGT	2063
151_1	9	14,4	0,18	0,15	GTCatggattacaaCT	2324
164_1	16	22,0	0,57	0,60	TCTGtttatgtcacTG	2781
166_1	13	11,9	0,17	0,11	TGgtctgtttatGTCA	2784
169_1	0	9,3	0,22	0,11	TTcagcaaatatTCGT	2995
171_1	11	12,9	0,28	0,20	TCTattgttaggtATC	3053
222_1	16	19,7	0,68	0,64	TGacttgtaattgTGG	5467
245_1	14	6,1	0,26	0,08	TCggttatgttaTCAT	6470
246_1	28	7,3	0,10	0,20	CActttatctggTCGG	6482
252_1	19	8,0	0,29	0,12	TCAtattgctaccATA	6618
272_1	3	9,7	0,25	0,14	TACTgtagaacatgGC	7133
314_1	13	9,6	0,31	0,15	GAgtttggattagCTG	7764
344_1	11	8,0	0,14	0,06	GTTagccctcagaTTG	8039
349_1	12	12,5	0,18	0,14	ACAagtggtatctTCT	8228
415_1	11	9,6	0,26	0,12	AAttgagtgaatCCAA	9120
493_1	15	16,5	0,48	0,34	CTTatgatacaacTTA	10384
512_1	43	14,1	0,31	0,68	GCacaacccagaggAA	10735
519_1	9	12,2	0,45	0,26	TAgatttgtgagGTAA	11055
533_1	11	13,6	0,29	0,21	TAGattgtttagtGCA	11228
534_1	9	6,5	0,09	0,03	GTagattgtttaGTGC	11229
582_1	0	12,3	0,33	0,23	AATCatgttggtacAT	12092
619_1	8	10,4	0,32	0,18	TAtgacactgcaTCTT	15317
620_1	12	24,6	1,10	1,08	GTAtgacactgcaTCT	15318
638_1	2	5,4	0,00	0,00	TAACatcagacaacTC	15695
645_1	20	29,6	1,10	1,50	GAtccttatattCTGG	15854
651_1	0	11,2	0,14	0,09	GCAaatcaactccATC	15896
658_1	11	13,8	0,48	0,32	TCaatagtgtagggCA	16093
659_1	0	8,2	0,11	0,06	TTCaatagtgtaggGC	16094
733_1	0	69,6	11,03	26,95	CAGagttaataatAAG	19327
734_1	36	16,8	2,84	2,12	GTTCaagcacaacgAA	19493

Результаты в Таблицах 7 и 8 также показаны на Фиг. 2 в связи с их положением, где они нацелены на пре-мРНК PD-L1 SEQ ID NO: 1.

Из этого можно видеть то, что почти все из соединений имеют значения ЕС50 меньше 1 мкМ и целевой нокдаун меньше 25% от уровня экспрессии PD-L1 в контрольных клетках (обработанных физиологическим раствором).

Пример 3 - активность и эффективность in vitro и снижение уровня PD-L1 in vivo у мышей, индуцированных поли(I:C), с использованием голых и конъюгированных с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1

Тестирование эффективности и активности проводили в эксперименте in vitro в исследованиях доза-ответ в клетках МСР-11 с использованием олигонуклеотидов в Таблице 6. Те же самые олигонуклеотиды, а также версии, конъюгированные с GalNAc (Таблица 8, CMP ID NO 755_2-765_2), тестировали in vivo у самок мышей C57BL/6J, индуцированных поли(I:C), на их способность уменьшать экспрессию мРНК и белка PD-L1.

Анализ in vitro

Клетки МСР-11 (исходно купленные в АТСС (Американская коллекция типовых клеточных культур)), суспендированные в DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) (кат. № Sigma D0819), дополненной 10% лошадиной сыворотки, 2 мМ L-глутамином, 0,025 мг/мл гентамицином и 1 мМ пируватом натрия, добавляли при плотности 8000 клеток/лунку к олигонуклеотидам (10 мкл) в 96-луночные круглодонные планшеты и культивировали в течение 3 суток в конечном объеме 200 мкл/лунку в увлажненном инкубаторе при 37°С с 5% СО₂. Олигонуклеотиды подвергали скринингу в интервале концентраций (50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158 мкМ).

Общую мРНК экстрагировали с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием мастер-микса (2×) TaqMan Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализа PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) и Gusb (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm01197698-m1). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 9 как % остаточной экспрессии PD-L1 в % от контрольных образцов с PBS (клетки, обработанные PBS). Расчеты ЕС50 проводили в GraphPadPrism6. ЕС50 и максимальный уровень нокдауна PD-L1 показаны в Таблице 13 как % от контрольных (PBS) клеток.

Анализ in vivo

Самкам мышей C57BL/6J (20-23 г; 5 мышей на группу) п.к. инъецировали 5 мг/кг неконъюгированных олигонуклеотидов к мышиному PD-L1 или 2,8 мг/кг конъюгированных с GalNAc олигонуклеотидов к мышиному PD-L1. Через трое суток мышам в.в. инъецировали 10 мг/кг поли(I:C) (LWM, Invivogen). Мышей умерщвляли через 5 ч после инъекции поли(I:C), и образцы печени помещали в RNAlater (Thermo Fisher Scientific) для экстракции РНК или замораживали на сухом льду для экстракции белка.

Общую мРНК экстрагировали из гомогенизированных образцов печени с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием мастер-микса (2×) TaqMan® Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализа мРНК PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) и ТВР (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 13 как % контрольных образцов от мышей, которым инъецировали физиологический раствор и поли(I:C).

Гомогенаты печени получали посредством проведения гомогенизации образцов печени в 2 мл на 100 мг ткани реактива для эктракции тканевого белка T-PER® (Thermo Fisher Scientific), смешанного с 1× смесью ингибиторов протеаз Halt, не содержащей EDTA (Thermo Fisher Scientific). Концентрации белка в гомогенатах печени измеряли с использованием реактива для анализа кумасси плюс (Бредфорд) (Thermo Scientific) согласно инструкциям изготовителя. Гомогенаты печени (40 мкг белка) разделяли на 4-12%-ных Bis-Tris Plus полиакриламидных гелях (Thermo Fisher Scientific) в 1× электродном буфере MOPS и переносили на нитроцеллюлозные мембраны с использованием системы блоттинга iBLOT Dry (Thermo Fisher Scientific) согласно инструкциям изготовителя. Каждый блот разрезали горизонтально на две части по полосе 64 кДа. После блокирования в TBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0,05% Tween 20, мембраны инкубировали в течение ночи при 4°С с кроличьим моноклональным антителом против винкулина (Abcam, кат. № ab129002), разведенным 1:10000 (верхние мембраны), или с поликлональным антителом козы против mPD-L1 (R&D Systems, кат. № AF1019), разведенным 1:1000 (нижние мембраны) в TBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0,05% Tween 20. Мембраны промывали в TBS, содержащем 0,05% Tween 20, и подвергали воздействию в течение 1 ч при комнатной температуре свиного антитела против IgG кролика, конъюгированного с HRP (пероксидаза хрена) (DAKO), разведенного 1:3000 (верхние мембраны), или кроличьего антитела против IgG козы, конъюгированного с HRP (DAKO), разведенного 1:2000 в TBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0,05% Tween 20. После промывки мембран реактивность выявляли с использованием ECL select (Amersham GE Healthcare). Для каждой группы мышей, обработанных олигонуклеотидами, оценивали интенсивность полос PD-L1 по отношению к полосам винкулина посредством сравнения с интенсивностями полос PD-L1/винкулин мышей, которым инъецировали физиологический раствор и поли(I:C) (контроль). Результаты показаны в Таблице 13, и вестерн-блоты с парами голых и конъюгированных олигонуклеотидов показаны на Фиг. 9А-Д.

Таблица 13: эффективность in vitro и in vivo олигонуклеотидов к мышиному PD-L1.

CMP ID NO	Соединение CMP	Макс. ингибирование (% от PBS)	EC50 (мкM)	мРНК PD-L1 (% от контроля)	Белок PD-L1 (относительно контроля)
744_1	AGTttacattttcTGC	9,1	0,56	86	++
746_1	CACctttaaaaccCCA	5,0	0,46	181	nd
747_1	TCCtttataatcaCAC	4,4	0,52	104	++
748_1	ACGgtattttcacAGG	1,8	0,26	102	+++
749_1	GACactacaatgaGGA	7,6	1,21	104	nd
750_1	TGGtttttaggacTGT	12,4	0,74	84	nd
751_1	CGAcaaattctatCCT	9,9	0,69	112	nd
752_1	TGAtatacaatgcTAC	10,5	1,11	142	+++
753_1	TCGttgggtaaatTTA	5,7	0,53	116	+++
754_1	TGCtttataaatgGTG	5,2	0,35	98	nd
755_2	5'-GN2-C6-caAGTttacattttcTGC	nd	nd	58	+
757_2	5'-GN2-C6-caCACctttaaaaccCCA	nd	nd	62	nd
758_2	5'-GN2-C6-caTCCtttataatcaCAC	nd	nd	53	+
759_2	5'-GN2-C6-caACGgtattttcacAGG	nd	nd	66	+
760_2	5'-GN2-C6-caGACactacaatgaGGA	nd	nd	101	nd
761_2	5'-GN2-C6-caTGGtttttaggacTGT	nd	nd	99	nd
762_2	5'-GN2-C6-caCGAcaaattctatCCT	nd	nd	84	nd
763_2	5'-GN2-C6-caTGAtatacaatgcTAC	nd	nd	93	+++
764_2	5'-GN2-C6-caTCGttgggtaaatTTA	nd	nd	53	+
765_2	5'-GN2-C6-caTGCtttataaatgGTG	nd	nd	106	nd

+++: аналогичная интенсивности полосы PD-L1/винкулина контроля; ++: слабее, чем интенсивность полосы PD-L1/винкулина контроля; +: значительно слабее, чем интенсивность полосы PD-L1/винкулина контроля; nd - не определяется.

Из данных Таблицы 13 можно видеть то, что конъюгирование олигонуклеотидов с GalNAc явно улучшает уменьшение уровня PD-L1 in vivo. Уменьшение уровня мРНК обычно коррелирует с уменьшением уровня белка PD-L1. За исключением CMP ID NO: 754_1, низкое значение ЕС50 in vitro обычно отражает хорошее снижение уровня мРНК PD-L1 in vivo, если только олигонуклеотид конъюгирован с GalNAc.

Пример 4 - PK (фармакокинетика)/PD (фармакодинамика) in vivo в сортированных гепатоцитах и непаренхимных клетках от мышей, индуцированных поли(I:C)

Исследовали распределение голых и конъюгированных с GalNAc олигонуклеотидов, а также уменьшение уровня мРНК PD-L1 в гепатоцитах и непаренхимных клетках, выделенных из мышей, индуцированных поли(I:C).

Самкам мышей C57BL/6J (n равно 3 на группу) п.к. (подкожно) инъецировали 5 мг/кг неконъюгированного олигонуклеотида (748_1) или 7 мг/кг олигонуклеотидов, конъюгированных с GalNAc (759_2), нацеленных на мышиную мРНК PD-L1. Через двое суток мышам в.б. (внутрибрюшинно) инъецировали 15 мг/кг поли(I:C) (LWM, Invivogen). Через 18-20 ч после инъекции поли(I:C) мышей анестезировали, и подвергали печень перфузии при скорости тока 7 мл в мин через полую вену с использованием сбалансированного солевого раствора Хэнкса, содержащего 15 мМ Hepes и 0,38 мM EGTA, в течение 5 мин, с последующей перфузией раствором коллагеназы (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, содержащий 0,17 мг/мл коллагеназы типа 2 (Worthington 4176), 0,03% BSA, 3,2 мM CaCl₂ и 1,6 г/л NaHCO₃) в течение 12 мин. После перфузии печень удаляли и открывали капсулу печени, суспензию печени фильтровали через 70 мкм клеточное сито с использованием среды William E, и аликвоту клеточной суспензии (смешанные клетки печени) удаляли для более позднего анализа. Остаток клеточной суспензии центрифугировали в течение 3 мин при 50 g. Супернатант отбирали для более поздней очистки непаренхимных клеток. Осадок ресуспендировали в 25 мл среды William E (Sigma, кат. № W1878, дополненная 1× пенициллином/стрептомицином, 2 мМ L-глутамином и 10% FBS (ATCC #30-2030)), смешивали с 25 мл среды William E, содержащей 90% перколла, и гепатоциты осаждали центрифугированием при 50 g в течение 10 мин. После 2-кратной промывки в среде William E осажденные гепатоциты ресуспендировали в среде William E. Супернатант, содержащий непаренхимные клетки, центрифугировали при 500 g 7 мин, и данные клетки ресуспендировали в 4 мл среды RPMI и центрифугировали через два слоя перколла (25% и 50% перколла) при 1800 g в течение 30 мин. После отбора непаренхимных клеток между двумя слоями перколла, данные клетки промывали и ресуспендировали в среде RPMI.

Общую мРНК экстрагировали из очищенных гепатоцитов, непаренхимных клеток и общей суспензии печени (нефракционированные клетки печени) с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием мастер-микса (2×) TaqMan Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализа PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) и ТВР (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 10 как % контрольных образцов от мышей, которым инъецировали физиологический раствор и поли(I:C).

Анализ содержания олигонуклеотидов проводили с использованием ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) с использованием биотинилированного захватывающего зонда с последовательностью 5'-TACCGT-s-Bio-3' и выявляющего зонда, конъюгированного с дигоксигенином, с последовательностью 5'- DIG-C12-S1-CCTGTG - 3'. Данные зонды состояли только из LNA с фосфодиэфирной связью. Образцы печени (приблизительно 50 мг) гомогенизировали в 1,4 мл буфера для лизиса MagNa pure (Roche, кат. № 03604721001) в 2 мл пробирке Эппендорфа, содержащей один 5 мм шарик из нержавеющей стали. Образцы гомогенизировали на гомогенизаторе Retsch MM400 (Merck Eurolab), пока не был получен однородный лизат. Образцы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Стандарты получали впрыскиванием неконъюгированного антисмыслового олигонуклеотидного соединения (CMP ID NO 748_1) в определенных концентрациях в образец необработанной печени, и обрабатывали их также, как и образцы. Впрыснутые концентрации выбирали так, чтобы они соответствовали ожидаемому содержанию олигонуклеотидов в образце (в пределах ~10-кратных отличий).

Гомогенизированные образцы разводили минимум в 10 раз в 5 × буфере SSCT (750 мМ NaCl и 75 мМ цитрат натрия, содержащий 0,05% (об./об.) Tween-20, pH 7,0), и делали серию 6 разведений в 2 раза с использованием раствора для захвата-выявления (35 нМ захватывающий зонд и 35 нМ выявляющий зонд в 5 × буфере SSCT) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы переносили в 96-луночный планшет, покрытый стрептавидином (Nunc, кат. № 436014), по 100 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. В каждой лунке была сделана промывка три раза 2× буфером SSCT, было добавлено 100 мкл фрагмента Fab против DIG-AP (Roche Applied Science, кат. № 11093274910), разведенного 1:4000 в PBST (фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,05% (об./об.) Tween-20, pH 7,2, свежеприготовленный), и проведена инкубация в течение 1 часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. Была сделана промывка три раза 2× буфером SSCT, и было добавлено 100 мкл раствора субстрата щелочной фосфатазы (АР) (субстрат Blue Phos, KPL, код продукта 50-88-00, свежеприготовленный). Интенсивность окрашивания измеряли спектрофотометрически при 615 нм после 30-минутной инкубации с легким встряхиванием. Необработанные данные экспортировали из ридеров (программа Gen5 2.0) в формат Excel и далее анализировали в Excel. Стандартные кривые получали с использованием программы GraphPadPrism 6 и логистической регрессионной модели 4PL.

Таблица 14: экспрессия PD-L1 и содержание олигонуклеотидов в общей суспензии печени, гепатоцитах и непаренхимных клетках от поли(I:C) мышей, обработанных неконъюгированными и конъюгированными с GalNAc олигонуклеотидами, n равно 3.

Тип клеток	CMP ID no	Экспрессия PD-L1 (% от физиологического раствора-поли(I:C))	Содержание олигонуклеотидов (нг/105 клеток)
Среднее	SD	Среднее	SD
Общая печень	748_1	31	12,4	2,3	0,3
759_2	28	5,3	8,3	1,1
Гепатоциты	748_1	33	8,0	5,1	3,7
759_2	7	1,0	43,8	18,9
Непаренхимные клетки	748_1	31	10,1	2,2	0,7
759_2	66	1,6	1,7	0,9

Результаты показывают то, что голые (CMP ID NO: 748_1) и конъюгированные (CMP ID NO: 759_2) олигонуклеотиды одинаково хорошо снижают уровень мРНК PD-L1 в общих клетках печени. В выделенных гепатоцитах эффект конъюгированного олигонуклеотида почти в 5 раз сильнее, чем эффект голого олигонуклеотида, тогда как голые олигонуклеотиды демонстрировали в два раза более сильный эффект, чем олигонуклеотиды, конъюгированные с GalNAc, в непаренхимных клетках. В гепатоцитах и непаренхимных клетках уменьшение экспрессии мРНК PD-L1 в некоторой степени коррелирует с содержанием олигонуклеотидов в данных типах клеток.

Пример 5 - нокдаун PD-L1 in vivo у мышей AAV/HBV с использованием голых и конъюгированных с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1

В настоящем исследовании мышей AAV/HBV обрабатывали голыми или конъюгированными с GalNAc антисмысловыми олигонуклеотидами против PD-L1, и оценивали в печени экспрессию мРНК PD-L1 и экспрессию генов HBV.

Самок мышей HLA-A2/DR1 5-8-недельного возраста (5 животных на группу) предобрабатывали в неделю -1 носителем (физиологический раствор), голыми антисмысловыми олигонуклеотидами к PD-L1 (CMP ID NO 752_1 п.к. в дозе 5 мг/кг) и антисмысловыми олигонуклеотидами к PD-L1, конъюгированными с GalNAc (CMP ID NO 763_2 п.к. в дозе 7 мг/кг), данные дозы соответствуют эквимолярным концентрациям олигонуклеотидов. Данных мышей трансдуцировали 5×10¹⁰ вг AAV-HBV в неделю 0 (относительно дополнительных подробностей см. описание мышиной модели AAV/HBV в разделе Материалы и методы). С W1 (неделя 1) после трансдукции AAV-HBV до W4 мыши получали 4 дополнительные п.к. инъекции олигонуклеотидов к PD-L1 или носителя (физиологический раствор), которые давали с интервалом в одну неделю.

Образцы крови отбирали за одну неделю до трансдукции и через одну неделю после каждой инъекции.

Мышей умерщвляли через две недели после последних инъекций, и их печень удаляли после перфузии PBS. Печень разрезали на меньшие куски и прямо замораживали.

Для измерения экспрессии генов HBV ДНК экстрагировали из сыворотки с использованием Qiagen Biorobot, используя QIAamb One для всего набора нуклеиновых кислот, кат. № 965672, сыворотку разводили 1:20 в PBS, всего 100 мкл лизировали в 200 мкл буфера AL. ДНК элюировали из набора в 100 мкл.

Для кПЦР в реальном времени использовали мастер-микс для экспрессии генов TaqMan (кат. № 4369016, Applied Biosystems) вместе со смесью праймеров, приготовленной посредством добавления 1:1:0,5 следующих праймеров: F3_core, R3_core, P3_core (Integrated DNA Technologies, все разведены до концентрации 100 мкМ каждый):

Прямой (F3_core): CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO: 784)

Обратный (R3_core): AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO: 785)

Зонд (P3_core): 56-FAM-AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G-3IABkFQ (SEQ ID NO: 786)

Получали стандартную кривую с использованием плазмиды HBV (генотип D, GTD), используя 10-кратные разведения, начиная с 1×10⁹ копий/мкл вплоть до 1 копии/мкл, и использовали в 5 мкл на реакцию.

Для каждой реакции добавляли 10 мкл мастер-микса для экспрессии генов, 4,5 мкл воды, 0,5 мкл смеси праймеров и 5 мкл образца или стандарта, и проводили кПЦР.

Для анализа рассчитывали число копий/мл/лунку с использованием стандартной кривой. Результаты показаны в Таблице 15.

Экспрессию мРНК PD-L1 измеряли с использованием кПЦР.

мРНК экстрагировали из замороженных кусков печени, которые добавляли в 2 мл пробирки, содержащие керамические шарики (пробирки Lysing Matrix D, 116913500, mpbio) и 1 мл тризола.

Кусок печени гомогенизировали с использованием дезинтегратора тканей Precellys. В гомогенат добавляли 200 мкл хлороформа, перемешивали на вибромешалке и центрифугировали при 4°С в течение 20 мин при 10000 об./мин. Прозрачную фазу, содержащую РНК (около 500 мкл) переносили в свежую пробирку, и добавляли такой же объем 70%-ного EtOH. После хорошего перемешивания данный раствор переносили на колонку RNeasy spin, и РНК далее экстрагировали, следуя руководству набора RNeasy для мининабора RNeasy, кат. № 74104, Qiagen (включающего расщепление РНК, набор ДНКазы, не содержащий РНКазу, кат. № 79254). Элюирование осуществляли в 50 мкл Н₂О. Конечную концентрацию РНК измеряли и доводили до 100 нг/мкл для всех образцов.

кПЦР проводили на 7,5 мкл РНК с использованием набора RNA-to-ct 1-step от Taqman, кат. № 4392938, Thermo Fisher, согласно инструкциям изготовителя. Использованные смешанные праймеры содержали PD-L1_1-3 (номер праймера Mm00452054_m1, Mm03048247_m1 и Mm03048248_m1) и эндогенные контроли (ATCB Mm00607939_s1, CANX Mm00500330_m1, YWHAZ Mm03950126_s1 и GUSB Mm01197698_m1).

Данные анализировали с использованием способа 2^-ddct. Для расчета значений dct использовали среднее всех четырех эндогенных контролей. Экспрессию PD-L1 выражали относительно среднего значения для эндогенных контролей и в % от физиологического раствора.

Таблица 15: экспрессия мРНК PD-L1 и ДНК HBV у мышей AAV/HBV, обработанных неконъюгированными и конъюгированными с GalNAc олигонуклеотидами, n равно 5.

	CMP ID no	Экспрессия мРНК PD-L1 (% от физиологического раствора)	Экспрессия ДНК HBV (% от физиологического раствора)
Средн.	SD	Средн.	SD
Голый	752_1	55	35	72	16
Конъюгированный с GalNAc	763_2	34	3	79	9

Из данных результатов можно видеть то, что и голые, и конъюгированные с GalNAc олигонуклеотиды способны понижать экспрессию мРНК PD-L1 в печени мыши AAV/HBV, причем олигонуклеотид, конъюгированный с GalNAc, является в некоторой степени лучшим. Оба олигонуклеотида также приводили в некоторому снижению уровня ДНК HBV в сыворотке.

Пример 6 - влияние in vivo на ответ Т-клеток у мышей AAV/HBV

В настоящем исследовании мышей AAV/HBV из модели Пастера обрабатывали антителом или антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на PD-L1. Антисмысловые олигонуклеотиды были либо голыми, либо конъюгированными с GalNAc. Во время обработки животные были иммунизированы ДНК-вакциной против антигенов HBs и HBc (см. раздел Материалы и методы) для обеспечения эффективного примирования Т-клеток антигенпрезентирующими клетками. Оценивали, как данная обработка влияла на популяцию клеток в печени и селезенке, а также на экспрессию PD-L1 в данных популяциях и то, мог ли быть идентифицирован HBV-специфичный ответ Т-клеток.

Протокол обработки:

Самок мышей HLA-A2/DR1 обрабатывали согласно протоколам, приведенным ниже. Данное исследование проводили в двух отдельных подисследованиях с небольшими различиями в схемах введения, как показано в Таблице 16 и 17 ниже.

ДНК-вакцину и антитело против PD-L1 вводили, как описано в разделе Материалы и методы. Использованными антисмысловыми олигонуклеотидами были CMP ID NO 748_1 (голый) в дозе 5 мг/кг и CMP ID NO: 759_2 (конъюгированный с GalNAc) в дозе 7 мг/кг, которые оба вводили в виде подкожных инъекций (п.к.).

Таблица 16: протокол обработки мышей AAV/HBV ДНК-вакциной и ДНК-вакциной плюс антителом против PD-L1, 6 мышей в каждой группе

Сутки	Носитель (Группа 10)	ДНК-вакцина (Группа 11)	ДНК-вакцина + Ab против PD-L1 (Группа 13)
0	AAV/HBV
29*	Рандомизация животных
34	Физ. р-р + изотипическое	-	Ab
41	Физ. р-р + изотипическое	-	Ab
48	Физ. р-р + изотипическое	-	Ab
50	-	CaTx	CaTx
55*	PBS + изотипическое	ДНК	ДНК+Ab
62	Физ. р-р + изотипическое	-	Ab
69	PBS + изотипическое	ДНК	ДНК+Ab
76*	Физ. р-р + изотипическое	-	Ab
83	Физ. р-р + изотипическое	-	Ab
97*	Умерщвление

Изотипическое - мышиное контрольное Ab IgG, CaTx - кардиотоксин, ДНК - ДНК-вакцина, Ab - антитело против PD-L1, и * - отбор сыворотки.

Таблица 17: протокол обработки мышей AAV/HBV ДНК-вакциной и ДНК-вакциной плюс голым или конъюгированным олигонуклеотидом к PD-L1 (ASO), 7 мышей в каждой группе

Сутки	Носитель (Группа 1)	ДНК-вакцина (Группа 2)	ДНК-вакцина + ASO к PD-L1 (Группа 7)	ДНК-вакцина + GN- ASO к PD-L1 (Группа 8)
0	AAV/HBV
29*	Рандомизация животных
39	Физ. р-р	Физ. р-р
41		Физ. р-р	ASO	GN-ASO
46	Физ. р-р	Физ. р-р
49		Физ. р-р	ASO	GN-ASO
53	Физ. р-р	Физ. р-р
55	CaTx	CaTx	CaTx	CaTx
56		Физ. р-р	ASO	GN-ASO
59	PBS+ физ. р-р	ДНК+PBS	ДНК	ДНК
62*		Физ. р-р	ASO	GN-ASO
67	Физ. р-р	Физ. р-р
70		Физ. р-р	ASO	GN-ASO
74	PBS+ физ. р-р	ДНК+PBS	ДНК	ДНК
77		Физ. р-р	ASO	GN-ASO
81	Физ. р-р	Физ. р-р
84*		Физ. р-р	ASO	GN-ASO
88	Физ. р-р	Физ. р-р
91		Физ. р-р	ASO	GN-ASO
102	Умерщвление

ДНК - ДНК-вакцина, CaTx - кардиотоксин, Ab - антитело против PD-L1, ASO - голый олигонуклеотид к PD-L1, GN-ASO - конъюгированный с GalNAc олигонуклеотид к PD-L1 и * - отбор сыворотки.

В момент умерщвления отбирали одноядерные клетки крови, селезенки и печени каждой мыши из каждой группы, и обедняли эритроцитами (лизирующий буфер, BD biosciences, 555899). Одноядерные клетки печени требуют специфического приготовления, как описано в разделе Материалы и методы.

Популяции клеток:

В печени популяцию клеток анализировали поверхностным мечением на одноядерные клетки печени (см. Материалы и методы) с использованием цитометрии.

Не отмечали значимых изменений в частотах NK-клеток в селезенке и печени обработанных мышей по сравнению с контрольными группами (т.е. группами, иммунизированными носителем и ДНК). В Таблице 18 показано то, что в печени группы, обработанные голым олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO 748_1) и конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO: 759_2), имели значимое увеличение числа Т-клеток по сравнению с каждой из контрольных групп (т.е. группами, иммунизированными носителем и ДНК), также представленных на Фиг. 10А. Данное увеличение было обусловлено увеличением обеих популяций Т-клеток: CD4+ и CD8+ (Таблица 18 и Фиг. 10Б и 10В соответственно).

Таблица 18: Т-клетки в печени после обработки, в миллионах клеток

	T-клетки (миллионы)	T-клетки CD4+ (миллионы)	T-клетки CD8+ (миллионы)
Средн.	Std	Средн.	Std	Средн.	Std
Носитель (Группа 1)	0,77	0,44	0,51	0,35	0,11	0,05
ДНК-вакцина (Группа 2)	0,90	0,24	0,58	0,16	0,16	0,08
ДНК-вакцина + Ab против PD-L1 (Группа 13)	1,98	0,90	1,40	0,81	0,41	0,23
Носитель (Группа 10)	1,73	0,87	1,13	0,55	0,40	0,25
ДНК-вакцина (Группа 11)	1,27	0,97	0,79	0,58	0,32	0,32
ДНК-вакцина + ASO к PD-L1 (Группа 7)	3,78	1,31	2,46	0,72	0,79	0,39
ДНК-вакцина + ASO GN-PD-L1 (Группа 8)	3,33	0,66	2,18	0,40	0,67	0,17

Экспрессия PD-L1:

Экспрессию белка PD-L1 оценивали на макрофагах, В- и Т-клетках из селезенки и печени во время умерщвления. Присутствие антитела против PD-L1 в смеси антител, метящих поверхность (см. Материалы и методы), обеспечивало количественное измерение клеток, экспрессирующих PD-L1, посредством цитометрии.

В селезенке не наблюдали значимого различия между обработками в % макрофагов, В-клеток и Т-клеток CD4+, экспрессирующих PD-L1. % Т-клеток CD8+, экспрессирующих PD-L1, был ниже у мышей, обработанных голым олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO 748_1) и конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO: 759_2), по сравнению с другими обработками (данные не показаны).

В печени PD-L1 экспрессировался, главным образом, на Т-клетках CD8+ со средней частотой 32% и 41% в контрольных группах (две группы носителя и комбинированные группы с ДНК-вакцинацией соответственно, Фиг. 11А). Обработка голым олигонуклеотидом к PD-L1 или конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1 приводила к уменьшению частоты Т-клеток CD8+, экспрессирующих PD-L1 (см. Таблицу 19, Фиг. 11А). Значимые различия в % клеток, экспрессирующих PD-L1, также были отмечены для В-клеток и Т-клеток CD4+ после обработки ASO, хотя данные типы клеток экспрессируют значимо меньше PD-L1, чем Т-клетки CD8+ (см. Таблицу 19 и Фиг. 11Б и В). Обработка Ab против PD-L1 также приводила к кажущемуся снижению в экспрессии PD-L1 во всех типах клеток. Однако возможно то, что данное снижение частично обусловлено блокадой эпитопа PD-L1 антителом против PD-L1, используемым для обработки, таким образом, что предотвращается связывание с PD-L1 антитела, выявляющего PD-L1, в смеси антител для мечения поверхности. Следовательно, то, что проявляется как понижающая регуляция PD-L1 антителом против PD-L1, используемым для обработки, может быть результатом конкуренции за эпитоп между антителом для обработки и выявляющим антителом.

Таблица 19: % популяции клеток печени с экспрессией PD-L1

	% T-клеток CD8+	% T-клеток CD4+	% B-клеток
	Средн.	Std	Средн.	Std	Средн.	Std
Носитель (Группа 10)	35,5	4,7	0,75	0,52	5,9	1,5
ДНК-вакцина (Группа 11)	36,8	7,7	0,61	0,08	5,5	1,1
ДНК-вакцина + Ab против PD-L1 (Группа 13)	18,6	12,3	0,33	0,10	2,9	1,7
Носитель (Группа 1)	28,5	11,5	0,64	0,21	5,9	1,7
ДНК-вакцина (Группа 2)	44,9	14,4	1,43	0,69	8,7	3,1
ДНК-вакцина + ASO к PD-L1 (Группа 7)	9,6	2,4	0,37	0,21	2,9	0,8
ДНК-вакцина + ASO GN-PD-L1 (Группа 8)	14,6	3,3	0,31	0,11	2,8	0,8

Ответ HBV-специфичных Т-клеток:

NK-клетки и Т-клетки CD4+ и CD8+, продуцирующие провоспалительные цитокины, выявляли с использованием анализов окрашивания на внутриклеточные цитокины (см. раздел Материалы и методы), выявляющих продукцию IFNγ и TNFα.

В селезенке на выявлялись NK-клетки, секретирующие IFNγ и TNFα, и выявлялось мало Т-клеток CD4+, секретирующих IFNγ и TNFα, (частота меньше 0,1%) в момент умерщвления. IFNγ-продуцирующие Т-клетки CD8+, нацеленные на два антигена HBV, выявлялись у мышей, обработанных голым олигонуклеотидом к PD-L1 или конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1, а также у мышей из данного исследования, которые получали только ДНК-вакцину (данные не показаны).

В печени иммунизированных ДНК мышей-носителей HBV не выявляли NK-клеток, продуцирующих IFNγ, в момент умерщвления, тогда как секретирующие IFNγ Т-клетки CD4+, специфичные в отношении кора или S2+S, выявляли в печени немногих иммунизированных ДНК мышей с низкой частотой (меньше 0,4%, данные не показаны). Специфичные в отношении S2+S HBV T-клетки CD8+, продуцирующие IFNγ, выявляли у большинства мышей, иммунизированных ДНК. Частота Т-клеток CD8+, секретирующих IFNγ, возрастала у мышей, обработанных комбинацией ДНК-вакцины и голого олигонуклеотида к PD-L1 или конъюгированного с GalNAc олигонуклеотида к PD-L1, тогда как обработка антителом против PD-L1 не добавляла какого-либо кажущегося дополнительного эффекта к вакцинации ДНК (Фиг. 12). Т-клетки CD8+, продуцирующие IFNγ, нацеленные на антигены оболочки и кора, были выявлены у большинства групп, иммунизированных ДНК (за исключением антитела против PD-L1) (Фиг. 12Б). Большинство S2-S-специфичных Т-клеток продуцировали и IFNγ, и TNFα (Фиг. 12В). Данные результаты также показаны в Таблице 20.

Таблица 20: % Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена HBV (S2-S или кора) из общей популяции клеток, продуцирующих IFNγ или IFNγ плюс TNFα

	ПреS2-S-специфичные Т-клетки (% клеток, секретирующих IFNγ)	Т-клетки, специфичные в отношении кора (% клеток, секретирующих IFNγ)	S2-S-специфичные Т-клетки (% клеток, секретирующих IFNγ плюс TNFα)
	Средн.	Std	Средн.	Std	Средн.	Std
Носитель (Группа 10)	0,15	0,37	0,18	0,43	0,00	0,00
ДНК-вакцина (Группа 11)	1,48	1,10	0,47	0,53	0,42	1,02
ДНК-вакцина + Ab против-PD-L1	1,18	0,95	0	0	0,38	0,49
Носитель (Группа 1)	0,17	0,45	0,11	0,28	0,00	0,00
ДНК-вакцина (Группа 2)	1,70	1,02	0,27	0,51	0,98	0,90
ДНК-вакцина + ASO PD-L1	2,56	1,60	0,78	0,80	1,44	1,55
ДНК-вакцина + ASO GN-PD-L1	3,83	2,18	0,68	1,16	2,62	1,62

Пример 7 - влияние in vivo на антиген HBV и ДНК HBV в сыворотке мышей AAV/HBV

В настоящем исследовании мышей AAV/HBV модели Шанхай (см. раздел Материалы и методы) обрабатывали конъюгированным с GalNAc антисмысловым олигонуклеотидом к PD-L1 CMP ID NO 759_2.

Оценивали, как данная обработка влияла на уровни антигенов HBe и HBs, и ДНК HBV в сыворотке по сравнению с животными, обработанными носителем.

Протокол обработки:

В данном исследовании использовали самцов мышей C57BL/6, инфицированных рекомбинантным аденосателлитным вирусом (AAV), несущим геном HBV (AAV/HBV), как описано в Шанхайской модели в разделе Материалы и методы. Мышам (6 мышей на группу) один раз в неделю в течение 8 недель инъецировали антисмысловой олигонуклеотид CMP ID NO: 759_2 в дозе 5 мг/кг или носитель (физиологический раствор), причем и тот, и другой вводили в виде подкожных инъекций (п.к.). Образцы крови отбирали каждую неделю на протяжении обработки, а также 6 недель после обработки. Уровни ДНК HBV, HВsAg и HВeAg измеряли в образцах сыворотки, как описано ниже. Результаты для первых 10 недель показаны в Таблице 21 и на Фиг. 13. Данное исследование все еще продолжалось во время подачи заявки, поэтому данные для остающихся 4 недель не были получены.

Выявление HBsAg и HBeAg:

Сывороточные уровни HBsAg и HBeAg определяли в сыворотке инфицированных мышей AAV-HBV с использованием хемолюминисцентного иммуноанализа HBsAg (CLIA) и набора для CLIA HBеAg (Autobio diagnostics Co. Ltd., Zhengzhou, Китай, кат. № CL0310-2 и CL0312-2 соответственно) согласно протоколу изготовителя. Вкратце, 50 мкл сыворотки переносили в планшет для микротитрования, покрытый соответствующим антителом, и добавляли 50 мкл реактива с конъюгированным ферментом. Планшет инкубировали в течение 60 мин на шейкере при комнатной температуре перед промывкой всех лунок шесть раз промывочным буфером с использованием автоматической промывающей машины. В каждую лунку добавляли 25 мкл субстрата А и затем 25 мкл субстрата Б. Планшет инкубировали в течение 10 мин при RT (комнатная температура) перед измерением люминисценции с использованием люминисцентного ридера Envision. HBsAg приводится в единицах IU (международные единицы)/мл, где 1 нг HBsAg соответствует 1,14 IU. HBeAg приводится в единицах NCU (национальная клиническая единица)/мл сыворотки.

Экстракция ДНК HBV и кПЦР:

Исходную сыворотку мышей разводили в 10 раз (1:10) фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). ДНК экстрагировали с использованием робота MagNA Pure 96 (Roche). 50 мкл разведенной сыворотки смешивали в картридже для обработки с 200 мкл внешнего лизирующего буфера MagNA Pure 96 (Roche, кат. № 06374913001) и инкубировали в течение 10 минут. ДНК затем экстрагировали с использованием «Набора для маленького объема ДНК и вирусных нуклеиновых кислот MagNA Pure 96» (Roche, кат. № 06543588001) и протокола «Вирусная NA плазма SV внешний лизис 2.0». Объем элюции ДНК составлял 50 мкл.

Количественное измерение экстрагированной ДНК HBV проводили с использованием прибора для кПЦР Taqman (Vii7, Life technologies). Каждый образец ДНК тестировали в ПЦР в двойной повторности. 5 мкл образца ДНК добавляли к 15 мкл мастер-микса для ПЦР, содержащего 10 мкл мастер-микса для экспрессии генов TaqMan (Applied Biosystems, кат. № 4369016), 0,5 мкл праймера/зонда для кПЦР PrimeTime XL (IDT) и 4,5 мкл дистиллированной воды, в 384-луночный планшет, и ПЦР проводили с использованием следующих установок: инкубация UDG (2 мин, 50°С), ферментативная активация (10 мин, 95°С) и ПЦР (40 циклов по 15 с, 95°С для денатурации и 1 мин, 60°С для отжига и элонгации). Число копий ДНК рассчитывали из значений C_t на основе стандартной кривой плазмидной ДНК HBV, полученной программой ViiA7.

Последовательности праймеров и зондов TaqMan (IDT):

Прямой праймер к кору (F3_core): CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO: 784)

Обратный праймер (R3_core): AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO: 785)

Зонд Taqman (P3_core): 56-FAM/AGC TCC AAA /ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G/3IABkFQ (SEQ ID NO: 786).

Таблица 21: уровни ДНК HBV, HBsAg и HBeAg в сыворотке от мышей AAV/HBV после обработки антисмысловым олигонуклеотидом к PD-L1, конъюгированным с GalNAc.

	Физиологический раствор	CMP ID NO: 759_2 в дозе 5 мг/кг
	ДНК HBV	HBsAg	HBeAg	ДНК HBV	HBsAg	HBeAg
Сутки	Средн.	Std	Средн.	Std	Средн.	Std	Средн.	Std	Средн.	Std	Средн.	Std
0	7,46	0,35	3,96	0,48	3,23	0,14	7,44	0,29	3,87	0,40	3,17	0,13
7	7,53	0,23	4,17	0,45	3,35	0,10	7,53	0,20	3,91	0,42	3,19	0,18
14	7,57	0,24	4,12	0,49	3,19	0,11	7,45	0,22	3,90	0,50	2,99	0,27
21	7,47	0,27	3,93	0,51	3,12	0,05	7,33	0,47	3,71	0,76	2,78	0,26
28	7,68	0,26	3,88	0,67	3,18	0,13	7,45	0,46	3,65	0,93	2,67	0,38
35	7,69	0,21	4,03	0,54	2,95	0,08	7,13	0,75	2,98	1,05	2,04	0,38
42	7,58	0,23	3,89	0,65	3,34	0,10	6,69	0,89	2,60	1,05	1,98	0,45
49	7,77	0,17	3,54	1,06	3,08	0,26	6,56	1,26	2,19	0,70	1,47	0,37
56	7,71	0,24	3,99	0,86	3,28	0,05	6,21	1,48	2,28	0,84	1,38	0,30
63	7,59	0,28	3,67	1,07	3,25	0,13	6,08	1,39	2,08	0,71	1,35	0,30

Из данного исследования можно видеть то, что конъюгированный с GalNAc антисмысловой олигонуклеотид к PD-L1 CMP NO 759_2 имеет значимое влияние на уменьшение уровней ДНК HBV, HBsAg и HBeAg в сыворотке после 6 недель обработки, и влияние, которое поддерживается в течение по меньшей мере 2 недель после завершения обработки.

Пример 8 - нокдаун PD-L1 in vitro в человеческих первичных гепатоцитах с использованием олигонуклеотидов к PD-L1, конъюгированных с GalNAc

Способность антисмысловых олигонуклеотидных соединений к PD-L1, конъюгированных с GalNAc, уменьшать уровень транскрипта PD-L1 в первичных человеческих гепатоцитах исследовали с использованием геномики.

Культура клеток

Криоконсервированные человеческие гепатоциты суспендировали в WME, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, пенициллином (100 U/мл), стрептомицином (0,1 мг/мл) и L-глутамином (0,292 мг/мл), при плотности приблизительно 5×10⁶ клеток/мл и высевали в покрытые коллагеном 24-луночные планшеты (Becton Dickinson AG, Allschwil, Швейцария) в плотности 2×10⁵ клеток/лунку. Клетки предкультивировали в течение 4 ч, обеспечивая прикрепление к чашкам для культуры клеток до начала обработки олигонуклеотидами в конечной концентрации 100 мкМ. Использованные олигонуклеотиды показаны в Таблице 21 и Таблице 8, носителем был PBS. Среду для посева заменяли 315 мкл бессывороточной WME (дополненной пенициллином (100 U/мл), стрептомицином (0,1 мг/мл), L-глутамином (0,292 мг/мл)), и в клеточную культуру добавляли 35 мкл 1 мМ маточных растворов олигонуклеотидов в PBS, и оставляли на клетках на 24 часа или 66 часов.

Получение библиотеки

Профилирование экспрессии транскриптов проводили с использованием химии Illumina Stranded mRNA на платформе для секвенирования Illumina с использованием стратегии секвенирования 2×51 п.о. парных концевых считываемых фрагментов и минимальной глубины считывания 30М на образец (Q в квадрате ЕА). Клетки лизировали в лунках посредством добавления 350 мкл буфера RLT от Qiagen, и присваивали им номер доступа по рандомизированной схеме.

мРНК очищали с использованием мининабора Rneasy от Qiagen. мРНК количественно измеряли, и оценивали целостность с использованием биоанализатора Agilent. При исходной оценке качества выделенной РНК наблюдали то, что все образцы удовлетворяли входному показателю качества 100 нг с баллами RIN (число целостности РНК) больше 7,0.

Для всех образцов получали секвенированные библиотеки с использованием препарата библиотеки Illumina TrueSeq Stranded mRNA, начиная со 100 нг общей РНК. Конечные библиотеки кДНК анализировали на распределение размеров с использованием биоанализатора Agilent (набор DNA 1000), количественно измеряли посредством кПЦР (набор KAPA Library Quant) и нормировали к 2 нМ в препарате для секвенирования. Для связывания библиотек кДНК с поверхностью проточной ячейки использовали набор для получения стандартных кластеров v5, а cBot использовали изотермически для амплификации присоединеных конструкций кДНК вплоть до клональных кластеров, каждый из которых состоит из ~1000 копий. Последовательность ДНК определяли технологией секвенирования посредством синтеза с использованием набора TruSeq SBS.

Обработка данных

Считываемые фрагменты секвенирования с парными концами Illumina длиной 2×51 п.о. картировали на человеческом эталонном геноме hg19 с использованием программы для выравнивания коротких считываемых фрагментов GSNAP. Выравнивания в формате SAM превращали в сортированные файлы выравнивания в формате ВАМ с использованием программы SAMTOOLS. Числа считываемых генов оценивали для PD-L1 на основе аннотации экзонов из RefSeq NCBI, определенной соответствующим файлом GTF для hg19. Стадию нормирования, учитывающую разный размер библиотеки каждого образца, применяли с использованием пакета R DESeq2.

Уменьшение уровня транскриптов PD-L1 после инкубирования с антисмысловыми олигонуклеотидными соединениями к PD-L1, конъюгированными с GalNAc, показаны в Таблице 22.

Таблица 22: Уменьшение уровня транскриптов PD-L1 в человеческих первичных гепатоцитах после обработки олигонуклеотидами, конъюгированными с GalNAc, n равно 4.

Соединение	Уровень экспрессии PD-L1 после 24 ч (числа, скоррекрированные в зависимости от размера библиотеки)	Уровень экспрессии PD-L1 после 66 ч (числа, скоррекрированные в зависимости от размера библиотеки)
Носитель	259	156
	159	168
	192	136
202	211
767_2	7	7
	11	14
	22	9
28	15
766_2	16	13
	15	10
	17	11
29	13
769_2	15	21
	18	18
	25	18
26	25
768_2	41	25
	27	48
	31	25
34	22
770_2	21	16
	44	62
	67	51
38	63

Все пять антисмысловых соединений, конъюгированных с GalNAc, демонстрировали значимое уменьшение уровня транскриптов PD-L1 после 24 и 66 часов инкубации по сравнению с образцами, обработанными носителем.

Пример 9 - ЕС50 конъюгированных и голых антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1 в клетках ASGPR-HepaRG, инфицированных HBV

Эффективность двух голых и эквивалентных конъюгированных с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1 сравнивали в клетках ASGPR-HepaRG, инфицированных HBV.

Линия клеток

Клетки HepaRG (Biopredic International, Saint-Gregoire, Франция) культивировали в среде Williams E (дополненной 10% ростовой добавки HepaRG (Biopredic)). Из данной линии клеток получали линию клеток HepaRG, стабильно сверхэкспрессирующую человеческий ASGPR1 и ASGPR2, с использованием лентивирусного способа. Пролиферирующие клетки HepaRG трансдуцировали при MOI (множественность заражения) 300 с использованием лентивируса, произведенного по требованию Sirion biotech (CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro), кодирующего человеческий ASGPR1 и 2 под контролем промотора CMV (цитомегаловирус) и ген устойчивости к пуромицину. Трансдуцированные клетки подвергали селекции с 1 мкг/мл пуромицина в течение 11 суток и затем поддерживали при такой же концентрации антибиотика для обеспечения стабильной экспрессии трансгенов. Сверхэкспрессию ASGPR1/2 подтверждали как на уровне мРНК посредством кПЦР-ОТ (ASGPR1: 8560 раз по сравнению с нетрансдуцированными, ASGPR2: 2389 раз по сравнению с нетрансдуцированными), так и на уровне белка посредством анализа проточной цитометрией.

Клетки дифференцировались с использованием 1,8% DMSO в течение по меньшей мере 2 недель до инфекции. HBV генотипа D получали из супернатанта культуры клеток HepG2.2.15 и концентрировали с использованием осаждения с ПЭГ. Для оценки активности тестируемых соединений против HBV дифференцированные клетки ASGPR-HepaRG в 96-луночных планшетах инфицировали HBV при МОI от 20 до 30 в течение 20 ч до того, как клетки были промыты 4 раза PBS для удаления инокулума HBV.

Эффективность олигонуклеотида

Следующие олигонуклеотиды:

Голый ASO к PD-L1	Эквивалентный конъюгированный с GalNAc ASO к PD-L1
CPM ID NO: 640_1	CPM ID NO: 768_2
CPM ID NO: 466_1	CPM ID NO: 769_2

добавляли к клеткам ASGPR-HepaRG, инфицированным HBV, в сутки 7 и сутки 10 после инфекции с использованием серийных разведений от 25 мкМ до 0,4 нМ (разведения 1:4 в PBS). Клетки отбирали в сутки 13 после инфекции.

Общую мРНК экстрагировали с использованием набора для клеточной РНК в большом объеме MagNA Pure 96 на системе MagNA Pure 96 (Roche Diagnostics) согласно инструкциям изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР-ОТ, как описано в Примере 5.

Данные анализировали с использованием способа 2^-ddct. Актин В использовали в качестве эндогенного контроля для расчета значений dct. Экспрессия PD-L1 приводится относительно эндгенных контролей и относительно солевого носителя.

Расчеты ЕС50 проводили в GraphPad Prism6, и они показаны в Таблице 23.

Таблица 23: ЕС50 в клетках ASGPR-HepaRG, инфицированных HBV, n равно 4.

CMP ID NO	EC50 (мкM)
640_1	2,25
768_2	0,10
466_1	5,82
769_2	0,13

Эти данные явно показывают то, что конъюгирование с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1 значительно улучшает значения ЕС50.

Пример 10 - стимулирование функции Т-клеток в РВМС, полученных от пациентов с хронической инфекцией HBV

Исследовали, могли ли голые антисмысловые соединения к PD-L1 увеличивать функцию Т-клеток пациентов, хронически инфицированных HBV (CHB), после стимулирования одноядерных клеток периферической крови (РВМС) ex vivo антигеном HBV.

Замороженные РВМС от трех пациентов, хронически инфицированных HBV, оттаивали и высевали при плотности 200000 клеток/лунку в 100 мкл среды (RPMI1640 плюс GlutaMax плюс 8% человеческой сыворотки плюс 25 мМ Hepes плюс 1% пенициллин/стрептомицин). На следующие сутки клетки стимулировали 1 мкМ белковой смесью большого белка оболочки HBV или 1 мкМ белковой смесью белка кора HBV (см. Таблицу 9) с 5 мкМ CMP ID NO: 466_1 или CMP ID NO: 640_1 или без них в 100 мкл среды, содержащей 100 пг/мл IL-12 (интерлейкин-12) и 5 нг/мл IL-7 (стимулирование конканавалином применяли только в сутки 8). Через четверо суток обработку антисмысловым олигонуклеотидом к PD-L1 обновляли с использованием среды, содержащей 50 IU IL-2. В сутки 8 после первой стимуляции клетки повторно стимулировали белковой смесью или 5 мкг/мл конканавалина А плюс антисмысловой олигонуклеотид к PD-L1 в течение 24 ч. В течение последних 5 ч стимулирования добавляли 0,1 мкл брефельдина А, 0,1 мкл моненсина и 3 мкл антитела против человеческого CD-107 (APC).

Через 24 ч клетки промывали буфером для окрашивания (PBS плюс 1% BSA плюс 0,09% азид натрия плюс EDTA), и применяли окрашивание поверхности в течение 30 мин при 4°С [антитело против человеческого CD3 (BV 605), антитело против человеческого CD4 (FITC), антитело против человеческого CD8 (BV711), антитело против человеческого PDL1 (BV421), антитело против человеческого PD1 (PerCP-Cy5.5) и окрашивание на живые и мертвые клетки (BV510) (BD Biosciences)]. Клетки фиксировали в фиксирующем буфере BD в течение 15 мин при 4°С. На следующее утро клетки пермеабилизировали буфером для пермеабилизации/промывки BD в течение 15 мин при 4°С, и осуществляли внутриклеточное окрашивание в течение 30 мин при 4°С [антитело против человеческого IFNγ (PE)]. После промывки в буфере для пермеабилизации/промывки клетки растворяли в 250 мкл буфера для окрашивания.

Измерения FACS проводили на BD Fortessa (BD Biosciences). Для анализа всю популяцию клеток сначала сортировали на живые клетки (окрашивание на живые и мертвые, BV510) и затем на клетки CD3+ (BV605). Клетки CD3+ затем обозначали на графике как CD107+ (APC) относительно IFNγ+ (PE). Результаты показаны в Таблице 24.

Таблица 24: эффект обработки ASO к PD-L1 на Т-клетки CD3+ из РВМС, выделенных от трех пациентов, хронически инфицированных HBV.

	Без стимуляции антигеном	Антиген оболочки	Антиген кора
Физ. р-р	CMP 466_1	CMP 640_1	Физ. р-р	CMP 466_1	CMP 640_1	Физ. р-р	CMP 466_1	CMP 640_1
INFγ-/ CD107+	1,16	4,95	4,81	4,7	9,12	8,62	3,84	9,66	7,31
	2,7	3,59	2,74	2,57	3,69	3,2	3,25	3,34	2,92
3	3,87	3,98	4,59	12,5	10,9	9,23	6,11	6,88
INFγ+/ CD107+	0,12	1,03	1,15	3,19	17,3	18,9	2,38	15,1	5,75
	0,49	3,12	1,75	2,73	7	5,34	1,63	2,35	1,9
0,24	1,13	1,5	1,6	8,16	3,06	1,68	1,9	1,91
INFγ+/ CD107-	0,33	1,43	1,08	5,11	7,74	9,47	3,14	7,76	2,83
	0,61	2,9	2,26	7,84	5,79	5,78	2,33	2,82	2,95
0,17	1,57	1,72	1,22	2,58	0,99	0,1	0,61	1,04

Из этих данных можно видеть то, что сама по себе стимуляция антигеном способна индуцировать активацию Т-клеток (увеличение % клеток CD3+, экспрессирующих IFNγ и/или CD107a) в РВМС пациентов СНВ (n равно 3). Добавление антисмыслового олигонуклеотида к PD-L1 CMP 466_1 или 640_1 приводило к дополнительному увеличению ответа Т-клеток CD3+. Данное увеличение, главным образом, наблюдали в группе, стимулированной оболочкой HBV.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ф.Хоффманн-ля Рош АГ

Рош Инновейшен Сентер Копенгаген A/С

<120> ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ДЛЯ ПОНИЖЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ PD-L1

<130> P33358-WO

<160> 786

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20064

<212> ДНК

<213> homo sapiens

<400> 1

ggcgcaacgc tgagcagctg gcgcgtcccg cgcggcccca gttctgcgca gcttcccgag 60

gctccgcacc agccgcgctt ctgtccgcct gcaggtaggg agcgttgttc ctccgcgggt 120

gcccacggcc cagtatctct ggctagctcg ctgggcactt taggacggag ggtctctaca 180

ccctttcttt gggatggaga gaggagaagg gaaagggaac gcgatggtct agggggcagt 240

agagccaatt acctgttggg gttaataaga acaggcaatg catctggcct tcctccaggc 300

gcgattcagt tttgctctaa aaataattta tacctctaaa aataaataag ataggtagta 360

taggataggt agtcattctt atgcgactgt gtgttcagaa tatagctctg atgctaggct 420

ggaggtctgg acacgggtcc aagtccaccg ccagctgctt gctagtaaca tgacttgtgt 480

aagttatccc agctgcagca tctaagtaag tctcttcctg cgctaagcag gtccaggatc 540

cctgaacgga atttatttgc tctgtccatt ctgagaaccc aaaggagtcc taaaagagga 600

atggaggagc ctaagaataa aaatagtata ataaaacatt tcttagacac attgaccttg 660

gcctatgtca aagttcagtc tgggtttgtc ttataacaca aggagtaaaa gtaccattgt 720

tctacctctt tttttaatac ttgaaaaaaa tttactgtgg atgcttttct atgaattaaa 780

taaccttcta aaaaatgttt tcattgctgc attcgattag attgggtaac taaatgaaat 840

taattcctca ctgttgggta taaaggttat ttacagtggt tctgtcttag ccattcactg 900

aactcattgc atatatatct ctggaatatt gctgattgtt tccttcaagt aaacttagaa 960

gtgtaactac ttagtcaaag agcctgaata ttttaaaggc cttttgaaga aaactgaaaa 1020

tgctttccag aaaggatgta tcagttgaca atgacagtcg tcaacagtat ttaaggagaa 1080

ctatgatact ctgaagaaaa acttagcctt tctcagtaaa agtaggtagg cagaggccac 1140

atgacagcag ttagagtgtg gtcttcaagg aagtcacaga aatactgtgg ggaattgaaa 1200

ccccatgtgg aaaatgtaca agagtgtctc agtgtgactg agaaggaggt tgggcatggg 1260

gtttcatgga gtttaataaa gtttggtcac ttagtagagg tttaataaat caactgtctt 1320

aatctttgat cctacttaag aatttttttt ttgtttttgt agagatgggg ctcttgttat 1380

gttgcccagg ctgttctcga actcctagcc tcaggcgatc ctccctcctc aggctccaga 1440

agtcctggga ttactggcgg gagccaccat gcaggcctct tgctcctact tttgagaaag 1500

gaagtttaac cggttttttt tgtctttttt tttttttttt tgagacagag tctcactctg 1560

ttgcccatgc tggagtgcag tggtgcaatc tcagctcact gcctcccggg ttcaagtgat 1620

tctcctgcct cagcctcccg agtagctggg actacaggca cctgccacca cgcccagcta 1680

atttttgtat ttttagtaga aatggggttt caccatattg gccaggctga tctcgaactc 1740

ctgacctcag gtgatccgcc tgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc 1800

cactgctcct ggctgcttaa ctttttctct atctcatcct cctacccatc ctacccttgg 1860

aagatagaga agtagtatta gttccatagt gttatactgg gcttccccca gggacaaacc 1920

cacttcccca acctgaatga gccatcactt cttccccagt ttacatttca ttgctcttta 1980

aatgtctcca ttcggatatg ggaattcaca tatggtcata attcttacct gaagaagatg 2040

tcagtcttct tctcttagac caactgccct gatatgaggt ttagaggtta aagaacatgt 2100

gtgtatttac atgatctttg tattctgcct tttcgtccct cactaatgac agctgcaccc 2160

caaggaaatg gagctgtgga agagagggtt tgataagaaa ttaagtaaat attggatcta 2220

atccatcacc ctccaggaag cctttattac tcctaaaaat ttcaaccaaa ttcattaaag 2280

gacaagaact ccaccagagt aggccataaa cattggcaaa attagttgta atccatgact 2340

agatttaatg tccctttgtt ttattcccat atggttataa tgctttgctt ggcattaggg 2400

gtattttaag ttttcttctg cctagtaagt gaatttgtgt ttataataca ataatcataa 2460

aatatcacat taatatttta taactgtaca gttataaaat attttataag taatatttat 2520

attttataag taatatttta taactgtaca gttaactctg gcccaaggaa aagatagtct 2580

gatagatgct gcagccccat tttagcaaat gtgacctcac aggcctgaat gccatcgcta 2640

ttccacatct acaggataga cggaaaggaa agaaataaaa aaataggtac ctaacactgg 2700

caagaggatg atgactcatg ttatttcact taaccttttt atcttttaac atgaaggact 2760

catacaggtt gataagaaac cagtgacata aacagaccaa aaaatgatca gatctttcaa 2820

attagcaaaa aaataatatt ttttaaacaa tgggtgaaaa tacagtgtaa cagtaccaat 2880

tatcaacatg tgttgagaac cagaaaaatg ttctttttct ttgatcagca acactatttg 2940

ggaaaatcta tcctcagggc ctagcctggg gccctggcac acagtaggca ctcaacgaat 3000

atttgctgaa cacacaaata cttatgatat tttaaaaaat tggcaacaat ctgataccta 3060

acaatagagg gattaaatat tatggaactg ttaaataaga tgcttatgaa taccatgcag 3120

taagatgggc aatatttatg ccataagctt taatgaaaca aatgggtatt aaatgtatga 3180

taaggttata aattactttt taaaagatta cagggaaaaa aattgaaaga tatacactga 3240

aatgtttttt gctcacagtg gtgacaaggt ttctcagcac tggcactgtt gacgttttag 3300

gctgtatgtc tttgctgtgg gaggctggcc tgtgcactgc agggtgtttg gcagcactct 3360

tggcctctgc ccctagatag caatagcagt cctccctcaa ccagcccaat tttgacaacc 3420

aaaaatgttt ccaggcatca ccagatgctc cctgggtgag agtgatgaaa tagtagggga 3480

ttttcccctt cttttcttat tttctgtaat tccattatat tactttaata ataaagaaaa 3540

aaacataaaa aataaacgaa tgttattatt ctacgtcagt ttggatgttt ggactccatt 3600

ttggggttct ttccattata tcacttggtc tgctaaacat tctacggttt ggtaaggtga 3660

agtgattcat gaaattttgg ttttattttt ttcctgatac taaaaataaa acattctttc 3720

acttggaaat ttggacacag aacaccaaaa aaaatccata atctcatctc tctttttctg 3780

tcttttcctt ccttttttcc ctttaaaaac aataaagagt gaaacctacc tgttctccct 3840

ctaatttaat tcctaaatat aatcactgtc aatatcttgg acatttcctg tgtctaaaca 3900

cacacacaca cttttttttt tcagcaaaag tggatttctg ctacatgtag tgttctgcaa 3960

cttactttct atgtgtttac aaaatcagta catgtacata tgctgaattc agtccttaat 4020

ggtattatat tttgtgaata taccaaaatt tgtttaacca cttagacaat ctaggatatt 4080

ctcagtttgc tgttatgagc aatgctcttc ctttacatat acagacatat atatatatat 4140

gtgtgtgtgt gtgtttttgt tttagtagga tagatttcta ggagagggtg aaaggtctta 4200

tgacatccgc atttacgatt gtaataggaa gtatcaaagt gccccctaaa gaaaaaaatc 4260

ctcccattag tgggtaagaa agcctatttg ttcatatctt cacaaacact aaatattaga 4320

aatatttaca attgtggtca agctcataag tgaaaatggt atttcatatc ttatattttt 4380

tattgtgaga ttgaacatct ttcatatgtt tacatgtcac ctgtatttct tattctctga 4440

actatatgtt atgacctttc actttttttc ctcatgggtt atgtgtagtt tgtatagttg 4500

tcttattgat tgttaggagc tatttatata ttaggaacat taatctcctg tcttatatat 4560

acgtggcatc gattagttga tcatttgtga gttcatgtct gtatacaaag attggagagg 4620

cactaagagg gaaaacttac ctctttctta tcaaagtttg taaatatatg tataacagaa 4680

gagggagaaa atattaataa atgcacagat tggctgaaat agagtataaa tcttttactc 4740

ccctacttca acataaactg caaaaggaga gtgacttttc tttcactctg acttccgtat 4800

tcctcatgct taaaatagtg cctagcacag aagaggtgct caatcagtgt ttgctaaacg 4860

aaataattag tcacatttca agcaggatga ctaaatgaag aatagaatct aggcagatac 4920

tctggaagag tggctgtgag tcattcatat cttagtatga attagtcaaa tccaactctc 4980

tccccttccc actccccact gttagtagaa gaatctgttt attgagagaa tagatttata 5040

atttagaata agtgagaggg gcagaagagg agattttgaa ggatggcacc tgaaggagga 5100

ctagcatggc tgagacagtg aagtggaagc cttgaatagc taaagggtaa gatgaaagta 5160

tttagctgta gggggaaaaa gcattgacag gttggaaaag taaaagtcag attctccttg 5220

ctctgaaatt ttgtacaggg caggttctac taggtatgtt acaatgcaga aaaaacatga 5280

aataattgag aggaatttgg tgcaatatta tcttcttggc ttcttttgag tgggcagatt 5340

tttttcacgg cctgtaacta taataaattt gaaacttctc atcttttagt aacttttttc 5400

acttaagttt atgtggctgt gggcaatgga atgaagatat tgaacttcca attccctgtt 5460

gggtttccac aattacaagt caatcatgac tggttattag aagactattt cagttagaac 5520

caccaagtcc catattgtca tattgtatgt ttaattatta agtgaagcag tcttcttttc 5580

gtgttttcca taattagggc attccagaaa gatgaggata tttgctgtct ttatattcat 5640

gacctactgg catttgctga acggtaagac accaaatcct tccattaggt tctatatttt 5700

aaatatttta accatgagtt taaaactaaa atgatcattt aaaatgcatg caattttctt 5760

atagagagaa cattctattc tttcttctac tttacacaat ggcaaagtct tctttctact 5820

ttacgcaatg ataaagttac ctgtgtcatt ttgtaaaaat atagagaata tagacaaatt 5880

gaaagacaca aaataatcta ttacccattt cccagggtta actactgaaa atatctgggg 5940

aaatggcctg tatgtataca tttatttgtt tgctttcaac aaggccaaga tcctttgatc 6000

tttcagtctt ggttgctctg tgacatgcct ttcctgatga ggatacttta aggaagaatt 6060

gtaagataca tggaaaatgt caggctaaca cagtactggc atcaccctgt gctctttcct 6120

gaactccata ccaatgtact tcttgccaga aaactgatca aaagtttagg gaagtaaaaa 6180

gagatgactg ttagaatcta ccattccctc tatgtaggaa gcaaataggt gtcctgtcaa 6240

aggacattct ggggatgtct acatgaaacc aagtctccct ggttgtaagg actccatctc 6300

catataatat ttatacagta atatatgttt ataaattgtg ggggcaactt gtttagctaa 6360

ttttattatt ctgctattgg gacactgtgt ctcagcatga gatatagtgt cccaaaacat 6420

atttcaagcc cattggataa aatatgtgtt tagcaagttc ttaaatataa tgataacata 6480

accgaccaga taaagtgatt tataaacgct gtgccaattt tgtaaatgtt tcgaggaatt 6540

ttcccttttc tgaagattgt ccttctttct ttttagcatt tactgtcacg gttcccaagg 6600

acctatatgt ggtagagtat ggtagcaata tgacaattga atgcaaattc ccagtagaaa 6660

aacaattaga cctggctgca ctaattgtct attgggaaat ggaggataag aacattattc 6720

aatttgtgca tggagaggaa gacctgaagg ttcagcatag tagctacaga cagagggccc 6780

ggctgttgaa ggaccagctc tccctgggaa atgctgcact tcagatcaca gatgtgaaat 6840

tgcaggatgc aggggtgtac cgctgcatga tcagctatgg tggtgccgac tacaagcgaa 6900

ttactgtgaa agtcaatggt aagaattatt atagatgaga ggcctgatct ttattgaaaa 6960

catattccaa gtgttgaaga cttttcattc ttgtaagtcc atacttattt tcaaacagaa 7020

cagcatagtc tgttcattca ttcattcaat tcatgaattc attcacataa ttatccaatt 7080

tcttgagcac ctatttgata gtcactggaa atccagagac aaacaacaca gagccatgtt 7140

ctacagtatg tacagttttc caaaaagaat ttctagtctt tactttttta ttacaaatgg 7200

aatacgtata cttgcaaata attcagatac tgtggaagag atcaaatgaa ttgcaaaagt 7260

gtccctcctc ccttcaccac tatctcccat ggcatgcaga gagagtaacc attatttgtg 7320

tgtccctcca gaaatttttt tattcaacta ctattttttt attttattag gtccgtcagt 7380

tttccttttt tgagcctctc tatatcaaat gcaaataaat atattcagaa caaaccccac 7440

tgtaaggttc acattaaaaa agacttgaag tcaccctatg aagacaaaaa ataatcacat 7500

taagtgtgaa agaacctatt cttccagtac aggataagcc atacttactg ggcatatatt 7560

catcttgaaa atctatactg atgttgtctt ggggaattga aaaggaacta ggagtgttag 7620

ttcctcggta ttgacccaca gttatgttat caggtcactt gagttcaaag ttttgtgttg 7680

gcactagcta agtaaaggaa aacacctctg ctttcattgt tgagtttcac agaattgaga 7740

gctgaaagga tcccaggcag gagcagctaa tccaaactcc cacaaagaac aaaaatcccc 7800

cagaggatct tctgttctta tatttcctgc aatggcgtcc ctgtcatatc ccacaatggc 7860

ctccctgcca tttggatatc ccttccatat cctgttgaaa ttactcccta atagtaagct 7920

gaaatctgcc cctctagttg tagtcttggg attatttcat ttacatgatg accttttaat 7980

atttgactag aattaaatca tctccccttg gtctttccat tcctgggcta actaccatca 8040

atctgagggc taacaataca agtagaaaaa gtatacattt gtcactgatc actgatcaat 8100

tattaatcaa tgatcactga taactataaa ctcaaaaaca aaatcatgtg gggattaaga 8160

gaaatgtatc agttttatgt tgtatttctg gtccctgata ctggctcagg taatgccact 8220

attgtcaaga agataccact tgtaaagtag atttaatttt cattatattt taccatatgc 8280

ttctccattc atgacatctc ttgagatgtt gtggtttata ctttcagttt ttctccagtc 8340

catccgcaaa tatcaggcat ctactgtgtt ccaagatatt aaagaaatca tcatgactta 8400

gcctcatcaa cagcattgct agatctggga tggaaaggaa gagtataatc ctggcagtca 8460

ggaagaaggc agcataaagt ataagtttct gcttccaaaa aaggtctctc atcagcctgt 8520

agggagtgtg tagggaaggg acagctgtcc ttgtagtagg gaagggtttt attcaggtcg 8580

tctgggctcc ataatatccc ttgtgtatct gcagtctcct ttgccatgga tcaacacaat 8640

aggaaatctt ccggcactga tggtttttcc aagggggagt tcttcctgga gcaaagcaaa 8700

tgaccaacca ggtttgagga cctgatttgt ttgacaattc cattttgtat tgtaaattac 8760

ttaattggca ttctactccc aatccatctt gtcatttgca tacagtggtt ttgggattga 8820

gttcagctat accaaaagtc tgaaccttct gcacttagaa caaggcaacc accaagcttc 8880

acttgcactg aggccgtgtc tccaatggaa atgaggcagc tggcttgcag gagcttccca 8940

actcagggaa gtagaactcc tgagtcacct ccatatgcaa atgatttcac agtaatgctg 9000

ttgaacttca cttcccatca cagcaaatgt gtggtaacat agcttcccca caggagttta 9060

ctcaccatgg tattttaaag gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag aatttagttt 9120

tggattcact caattatcac tatcacttcg ggtgttattg cacctttctt gtttgtgagt 9180

ttaaatgcca gactctcagg ccactaactt tcaattaaaa gtgtttttct ttaatcgctg 9240

aacctaacag cagggaaaac gaaatgttca ttcagacttt cagaaccttc aatgagatta 9300

ggcagctgaa agatcaaagt gttgcatagt tgtcccgata aagctatttg gatcatatgg 9360

accaaatcga ctgctgtcat tccccaccaa ccccatctct ccccaaaatt cccagccctg 9420

tttaagtgtt ctctgtagca tttatctcta tctagtatat tgtgtagcat atcatatcat 9480

acttttctgt tttgtttatt gtctctctcc tcctagaata taaactccac aagcacaaag 9540

atttgggcct gttttataat attgttgcat ccccagggcc tgatatacag cagagtggtg 9600

gtacgaaaag agcacacaaa aaaatatttg ttgagtcaat gaatgaatga tttcctcaaa 9660

taggattagc ctaaaatttt ggaaacatga acagatttgg atatgtgaaa atttatttcc 9720

agactgttca tcaggaactg ttagcagctt ctaaagggta cactggagca gcagtagtaa 9780

aaggaggaag aggagcagct ctgctactgc tactatcgag tactactaca attagcactt 9840

gcttattctg tgtgttaggc cctgtactga acactctgtc taaattagtt catttcctcc 9900

tggaaatgac tctagggggt aagtgcttca tcatgtaaga tgagtatttt tcacattttg 9960

ttgtgtctga aatctgagtg tgtctttcaa tgatggaatc tttgattcca tgataagtgg 10020

tattattccc attttaagga tgaggaaact gaggtccaaa gaaattaagt aatttgccca 10080

aattcaccca gcctagaaaa tgataaagct agttctaaac ccaagcagat tagctctgaa 10140

gtctgggccc ttaataacca ctttttattg cctatatttg tacctctggt gtacgtatca 10200

agttatatgt tgacttcaaa actatcatga ccttttcttg gttttgattg tccaacatta 10260

gtatagtgtt ctgggtctgc aaaaattttg attactcatc tcatctgtaa aacattttga 10320

actcgtgtgt ttgtgcatgc acatttgtgt gtaattataa aaattttact ttctgttaat 10380

atataagttg tatcataaga aactgccgtt tttgaagagc aaaaaaaggt tgaatgttac 10440

cagttacatc tggttcaacc taatagacat ttgtacaaaa acagacattt taagaggttg 10500

aaataaaaat ttaataaaca atattttcag tttttactaa ttgtgatgct tcactatcat 10560

tagctaatat gtcaaggcat aatatacctt agggtgaact ttatcattaa caaaggtgga 10620

tggtgtcaat aatcttgagg tttgtgtttt tttatataac actgcgaggt ctaattaagt 10680

acttactgtt taccacctca tacagtggcc gataaaaagt gtcacttctg ctgtttcctc 10740

tgggttgtgc ttgaattatt agtattatct tcagtcctca gtttctttgt gggaaacttt 10800

ttaattagtt gtttaatttt gtaagatggt tagtttagtc aaaattagat aagagaattt 10860

gaaaatccgt agctacccca aagcaaccta cacataagaa ctattatttt tgtgttttga 10920

aatcataatt ttattgattt ccagtgtttc cactggtagt ggtttcattg atataggagt 10980

atcaaaacat cactcattat ttatttcagt ttcatttgat cctagccgtt ttgtattaac 11040

tctctgtgaa gaaattacct cacaaatcta ttgctgtcct tggtaaagga atggagaatt 11100

aaggctctag atcattagtg gttacactat agtattagaa gtaaaaaaaa gattatacca 11160

acaaaataag aacatgttaa tgtacttgta atgaataaac atgaataaag ctcttatgct 11220

atataggtgc actaaacaat ctactagaat tgtcagcaaa ctacgtatct taatcctgaa 11280

agggtcccaa accaatgatc taaaattgaa tcaaactttc ttccttgagc ataattactt 11340

aaatgattta ttaaaatagc cagcatttaa aagcttaaaa tgtaaatatc ataatgtggt 11400

atcctagata gcatcccaga acagaaaaag gatattaggg aaaaactgga ggaatggaat 11460

aaattatgca gtttagttat taataatgta ctaacgtcct tagttatgac gattgtacca 11520

tggtaatgta agatactaac aatagaggaa accgggtaag gagtatacag taactctata 11580

ctatctttgc aacttttttg taaatttaaa acttctaaaa taaagaacaa atttaaacat 11640

taaaaagtat caccaggaac atatatcact gtttacagat gaaatactat gtattttcat 11700

atctaatttc tgatcattga cttcaaatca gaaaagtgaa tgacacctca aaatcaggtt 11760

ttctgtttac tgaagtctaa gaaaagaaag cataccagct ggagagattc atgtttataa 11820

agacagattt ataacaacaa aaataaaata tccaagaata aatttaagaa gaagcacttt 11880

actgagaaac atatgaaaac ctgaacaaat ggagagggat attttgtatt tgaatagaaa 11940

gacttctggt ttaaagataa ttctctttaa attatttttt gtagaaattt aaggggtaca 12000

agagcagtgt tgtcacatgg atatattaca tagtggtgaa gtctggggtt ttagtgtaaa 12060

ttaatcttta cattttgttt gagcccaata aatgtaccaa catgattttt atagaaagat 12120

agtcattcct attaatccaa acttgtccca actttgaatt gaattgaggc agagctagca 12180

ggtgttcccc acggctgagg catctgaaca ttaagcatat ccctctgaga accagcctgc 12240

attgatactc tttctaatgt ggacagcatc aagctatgta cgtagttctg tgctcagcaa 12300

aagccctgac ttctttttgt ttatgtccta gccccataca acaaaatcaa ccaaagaatt 12360

ttggttgtgg atccagtcac ctctgaacat gaactgacat gtcaggctga gggctacccc 12420

aaggccgaag tcatctggac aagcagtgac catcaagtcc tgagtggtaa gaccaccacc 12480

accaattcca agagagagga gaagcttttc aatgtgacca gcacactgag aatcaacaca 12540

acaactaatg agattttcta ctgcactttt aggagattag atcctgagga aaaccataca 12600

gctgaattgg tcatcccagg taatattctg aatgtgtcca ttaaaatatg tctaacactg 12660

tcccctagca cctagcatga tgtctgccta tcatagtcat tcagtgattg ttgaataaat 12720

gaatgaatga ataacactat gtttacaaaa tatatcctaa ttcctcacct ccattcatcc 12780

aaaccatatt gttacttaat aaacattcag cagatattta tggaatatac cttttgttcc 12840

atgcattgta gtactcattg gatacacata gaataataag actcagttca cactcttcag 12900

gaaacagata aaaaactaag aaacaaacaa aaaacaggca atccaacacc atgtgggaaa 12960

tgctttcata gccgggaaac ctggggaata cctgagagga atactcaatt caggccttgt 13020

ttcaggaatc caaatcctgg cacatcagag ctgcttccct ctttccaggg tggcaggaaa 13080

taaatggaac atatttttct atcttatgcc aaacatgagg gaccctttct ccccggtgcc 13140

tctcccaagg tagtctacaa tatttcaact ctagcagtct gcttagtgca tagaacatga 13200

ggctgtgtgt ccctgggcaa attactagac ttctgtgtgc ttcactttcc ctgtaggatt 13260

ataatctact gagcaagctt attgtaaggg tcagattagc aacagtgtat gaaaatgatt 13320

tgagaccatt gcctgcacaa attcaactat ttttttttat ctcactactc tacagaagta 13380

ggtagggtgg gagacagagt ctgatgagag gctcagaatg tgaaagaaag tgaggcgagt 13440

gagcatgata tttaatataa acacaaagat attctgagaa gagctgctca ctgccccctc 13500

ccccaataca tgttgatagg aaaatgccac gtacttcagc aaaaacaact gaaaaattag 13560

atagaaaagt caatcaatag gaaaagataa tccaggacgg tgttgtgaac agaaagaggg 13620

ggaaaaaact ttagaaaatg atggggatgc tcttactggg gtacgagtcc tcaggtattg 13680

aactggcttt cagtaaaagc tagattagtg ggttcctgcc atttacaagc tgttttatga 13740

caacttactt gttgggtggc ctacagtaac tcacctaact gcactgagtc tgtttcctca 13800

tctgtaaatt ggggattttt ttttaaatac ctggcatgcc taactcataa agttgttctg 13860

aaactgaaat aaaacatacg tgaacaggca ttgtaaactg taagttacgg aaaaagctgg 13920

ctgttgttgt gtctttaaag tttcacctgg gtagtcaaag atggatcatg ggtctcagtg 13980

gagagctgag ccaggcagga gctgactaag ggtgagaggt gggagttagc agcctctgaa 14040

catctgtgta ccatgggacc ccctttcctc ctgcatggta ccccagacaa ggagcctagt 14100

aagagatact aatggcttgt tgtccagaga tgttcaaact gcagagaaag ataagacaac 14160

aagcattggc ctccaatcat gatgacagat aggaggaggt gggagctcct tagcagtgct 14220

ggttggcctt ccatgttcta ctgtgggcca tctctgccat gtactgtagg ctactagctt 14280

ctatattaaa gaatgcaaga ggggccagga gcggaggctc atgcctgtaa tctcagcact 14340

ttgggaggcc aaggtgggca gatcacttga ggtcaggagt ttgtgaccag cctggccaac 14400

atggtgaaac tctgccttta ctaaaaatat aaaaattagc tgggtgtggt ggtgtgcacc 14460

tgtaatccca gctactcggg agactgaggc acaagaattg cttgaacctg ggaggcggaa 14520

gttgcagtga gcccagattg cgccactgca ctccaccctg ggcaacagag aaagactctg 14580

cctcaaaaaa aaaaaaaaaa agcaagagga agtgaaataa tcaaggccgc catttaatag 14640

tgagcagcca ctccatgtgg tactgtgcaa gcacattata aatattagcc tcacaagaaa 14700

tgtattagca tttgtatttt gtacactggt taagtatctt gcccaagacc tcaaaactgg 14760

ttaagggcag cagaatttag ccccagcacc accttttcaa agcctgggct tctcacactt 14820

ctccatgctg ttcccatttt aacacaggta tctcgccatt ccagccactc aaactttggc 14880

atttaagaaa attatcctaa agctaaacta aacttcaagg atgaccattc tcctgacccc 14940

ttcccatcaa aattttatct ttagtcagtt tgttttcgtt ttgttttgtt tttcagaact 15000

acctctggca catcctccaa atgaaaggac tcacttggta attctgggag ccatcttatt 15060

atgccttggt gtagcactga cattcatctt ccgtttaaga aaaggtagta tttccttaat 15120

tgcagtggtc tccactgggg gtgaggaagg ggtgagaatt ggatcatggc tgcaaggaaa 15180

cccgacttaa cctctgcaag gtggtgcaaa ggcattccac tgttcaacag caattatatt 15240

gaagctgagt gggatcactg ggtgaagatg aagcgtaagg ggtgaggggc aggagaatgg 15300

gtatggatgg aggtagaaga tgcagtgtca tacagttttt ttctatcatg aaaataacca 15360

cagacttaca gaagagaaag agctaaaatg cccgtcattt tcagttgcat tttagtcttg 15420

cattagttgc aaccagctgg tttctgggta ccctaagtaa taaaaatagt tcctctgtag 15480

aactgtagta tgtttaccat agagtatttt gcaaaatttt tggtagagga tgttacataa 15540

tttgcatgtg ttcatttctc catttacctg tgggaacaat taaaatccag gaaaatgagt 15600

atattcaaat aatttcctcc catttaagat gagtcagagt aaataattcc tccaatactt 15660

agagaagtat accaagagat ccagtgatgg tatagagttg tctgatgtta aatagggaag 15720

tagaatatgg aaggggattc caatagtcgt tgaaaaattc cccataaccc cttacatggg 15780

ggaaagtagt gttaactgag agagtagaga taagctgttt ccaaaaatta tattcttaac 15840

aggactgaga tagccagaat ataaggatca agtttcaatg acagtaagat cctgagatgg 15900

agttgatttg cacaaagaaa taattgttgc cagcatgcat tttgaatatt tctctggaaa 15960

aaaagattag ttggcagtag aaatggatag aaatcaatag atattaaaat acctcagaat 16020

ttggttcatc tctgggaaaa gatgaaaaat aaaagtgtat actcctcaag aacatctagg 16080

atcaaaagca tgtgccctac actattgaat taattaacct cataagttgg gacctgtgga 16140

ataaggatgt ccaccagact tcctagggat tacaaatgtt tcacagaact tgaaatttaa 16200

acttgggtca ctgtatggga tgtagagctg tgctatatgg aaataaaaat gatttctttt 16260

tctcaaggga gaatgatgga tgtgaaaaaa tgtggcatcc aagatacaaa ctcaaagaag 16320

caaagtggta agaatatcag aaggaattgg gaagtaaaag tcaaaggaaa caaaaagcta 16380

aagcaataac aaagagaaat ccatcagtca taatctcctc tccttttaaa gaatgctggt 16440

tcccctttgc ctcacagcta acacaagaac tcctccaccg tctgaggagg tttaggagca 16500

gggaagggga aggagtcagc ttcatttgct aatcttctgt tgccctgcac cctagcagct 16560

ccttgcagca ggggacaagg atgacttagg tggatggata attaattgat tctaaaatat 16620

tgtgtgtcag tattgtaata ctatgttaat tgcaccatgc acggtatctc atttaatccc 16680

ccaccccttg ccattaccaa agagagagag agagagagag agagaaatac tagaatttat 16740

cctcatttta cagtagagaa aacagagggt caagaagata atgtaaagtg cccaagaaca 16800

cacagctgat cacaaaaatc aagcttgggg gccattagcc taaccacaga cccttactct 16860

taacccatct gcttcaatcc attttgctac aaatgtttac atttataagc agggcagaaa 16920

aacctcatcc aggttattga actaagaaga aagttatatt aaggtttcta atttttttaa 16980

tgtagttaga aaccaaactt aacaatgagc ccaagtttaa agcagtctaa ttaacctgga 17040

caagctcagg caagtttcat tctgtggccc atagcatcat ctgtgttgta aagctaagta 17100

gcaaatgttg tttgggtcat gctgggggac aagccatccc aatttgctca ggactgaggg 17160

gttttccagg atatcatgta aggataattg ggtacaaata taacctgctg ctttctctca 17220

tttcaaattt atcatttatc atatcagcaa ctatgagtta tgttttttat tagatttctt 17280

gttacttttt ccccagacca cttcccatga aattaatata ctattatcac tctccagata 17340

cacatttgga ggagacgtaa tccagcattg gaacttctga tcttcaagca gggattctca 17400

acctgtggtt taggggttca tcggggctga gcgtgacaag aggaaggaat gggcccgtgg 17460

gatgcaggca atgtgggact taaaaggccc aagcactgaa aatggaacct ggcgaaagca 17520

gaggaggaga atgaagaaag atggagtcaa acagggagcc tggagggaga ccttgatact 17580

ttcaaatgcc tgaggggctc atcgacgcct gtgacaggga gaaaggatac ttctgaacaa 17640

ggagcctcca agcaaatcat ccattgctca tcctaggaag acgggttgag aatccctaat 17700

ttgagggtca gttcctgcag aagtgccctt tgcctccact caatgcctca atttgttttc 17760

tgcatgactg agagtctcag tgttggaacg ggacagtatt tatgtatgag tttttcctat 17820

ttattttgag tctgtgaggt cttcttgtca tgtgagtgtg gttgtgaatg atttcttttg 17880

aagatatatt gtagtagatg ttacaatttt gtcgccaaac taaacttgct gcttaatgat 17940

ttgctcacat ctagtaaaac atggagtatt tgtaaggtgc ttggtctcct ctataactac 18000

aagtatacat tggaagcata aagatcaaac cgttggttgc ataggatgtc acctttattt 18060

aacccattaa tactctggtt gacctaatct tattctcaga cctcaagtgt ctgtgcagta 18120

tctgttccat ttaaatatca gctttacaat tatgtggtag cctacacaca taatctcatt 18180

tcatcgctgt aaccaccctg ttgtgataac cactattatt ttacccatcg tacagctgag 18240

gaagcaaaca gattaagtaa cttgcccaaa ccagtaaata gcagacctca gactgccacc 18300

cactgtcctt ttataataca atttacagct atattttact ttaagcaatt cttttattca 18360

aaaaccattt attaagtgcc cttgcaatat caatcgctgt gccaggcatt gaatctacag 18420

atgtgagcaa gacaaagtac ctgtcctcaa ggagctcata gtataatgag gagattaaca 18480

agaaaatgta ttattacaat ttagtccagt gtcatagcat aaggatgatg cgaggggaaa 18540

acccgagcag tgttgccaag aggaggaaat aggccaatgt ggtctgggac ggttggatat 18600

acttaaacat cttaataatc agagtaattt tcatttacaa agagaggtcg gtacttaaaa 18660

taaccctgaa aaataacact ggaattcctt ttctagcatt atatttattc ctgatttgcc 18720

tttgccatat aatctaatgc ttgtttatat agtgtctggt attgtttaac agttctgtct 18780

tttctattta aatgccacta aattttaaat tcataccttt ccatgattca aaattcaaaa 18840

gatcccatgg gagatggttg gaaaatctcc acttcatcct ccaagccatt caagtttcct 18900

ttccagaagc aactgctact gcctttcatt catatgttct tctaaagata gtctacattt 18960

ggaaatgtat gttaaaagca cgtattttta aaattttttt cctaaatagt aacacattgt 19020

atgtctgctg tgtactttgc tatttttatt tattttagtg tttcttatat agcagatgga 19080

atgaatttga agttcccagg gctgaggatc catgccttct ttgtttctaa gttatctttc 19140

ccatagcttt tcattatctt tcatatgatc cagtatatgt taaatatgtc ctacatatac 19200

atttagacaa ccaccatttg ttaagtattt gctctaggac agagtttgga tttgtttatg 19260

tttgctcaaa aggagaccca tgggctctcc agggtgcact gagtcaatct agtcctaaaa 19320

agcaatctta ttattaactc tgtatgacag aatcatgtct ggaacttttg ttttctgctt 19380

tctgtcaagt ataaacttca ctttgatgct gtacttgcaa aatcacattt tctttctgga 19440

aattccggca gtgtaccttg actgctagct accctgtgcc agaaaagcct cattcgttgt 19500

gcttgaaccc ttgaatgcca ccagctgtca tcactacaca gccctcctaa gaggcttcct 19560

ggaggtttcg agattcagat gccctgggag atcccagagt ttcctttccc tcttggccat 19620

attctggtgt caatgacaag gagtaccttg gctttgccac atgtcaaggc tgaagaaaca 19680

gtgtctccaa cagagctcct tgtgttatct gtttgtacat gtgcatttgt acagtaattg 19740

gtgtgacagt gttctttgtg tgaattacag gcaagaattg tggctgagca aggcacatag 19800

tctactcagt ctattcctaa gtcctaactc ctccttgtgg tgttggattt gtaaggcact 19860

ttatcccttt tgtctcatgt ttcatcgtaa atggcatagg cagagatgat acctaattct 19920

gcatttgatt gtcacttttt gtacctgcat taatttaata aaatattctt atttattttg 19980

ttacttggta caccagcatg tccattttct tgtttatttt gtgtttaata aaatgttcag 20040

tttaacatcc cagtggagaa agtt 20064

<210> 2

<211> 20261

<212> ДНК

<213> macaca fascicularis

<400> 2

gtaaaatcaa ggtgcgttca gatgttggct tgttgtaaat ttctgtttat attaataaca 60

taccaaatgt ggatttgttt taatcttcgg aactctttcc ggtgaaaacc tcatttacaa 120

gaaaactgga ctgacaggtt tcactttctg tttcatttct atacatagct ttattcctag 180

gacaccaaca ccactcgcta cccaaactga aagcttcccc gattccgccg aaggtcagga 240

aagtccaatg ccgggcaaac tggatttgct gccttgcgca gaggtgggcg ggaccccgcc 300

tccgggccgg gcgccaagtt gagcagctgg cacgcctcgc gaagccccag tcctgaagcc 360

ccagtcctgc gctgcttccc gaggctccgc accagccgcg cttctctctg cctgcaggta 420

gggagcgttg ttcctccgca ggtgcccacg gcccagcatc tctggctaac tcgctgggca 480

ccttaggacg gaggatctct acaccctttc tttgggatgg agagaggagg agggaaaggg 540

aaggcgatgg tctagggggc agtagagcca attacctgtt ggggttaata agaacaggca 600

atgcatctgg gcttcctcca ggcgcaattc agttttgctc taaaaataat ttatacctct 660

aaaaataaat aaggtgggta gtataggata ggtagtcatt cttatgcgac cgtgtgttca 720

gaatatagct ctgatgctag gctggaagtc tggacacggg tcctagtcca ccgtcagctg 780

cttgctagta atatgacttg tgtaagtcat cccagctgca gcagataagt aagtctcttc 840

ctgcgctaag cacgtccagg acccctgaac ggaatttatt tgctctgtcc attctgaaaa 900

cccaaaggag tcctaaaaga ggaatggagg agcctaagaa taaaaatagt ataataaaac 960

atttcttaga catgttgacc ttggcctatg tcaaagttca gtctgggttt gtcttataac 1020

ataaggagta aaagtaccat tgttctacct ctttttttaa tacttgaaaa aaaatttact 1080

gtagatgctt ttctattaat taaataacct tctaaaaaat gtttttagtg ctgcattcga 1140

ttaggttgga taactaaatg aaattaattc ctcactgttg ggtataaagg ttatttacag 1200

tggttctgtc ttagctattc actgaacatc attacataga tatctctgga atattgctga 1260

ttgtttccgt caataaactt agaagtgtaa ctacttagtc aaagagactg aatattttaa 1320

aggcattttg aagaaaactg aaaatgcttt ccagaaagga tgtatcagtt gacaatgatg 1380

gttgtcaaca gtatttaagg agaactatga tactctgaag aaaaacttag cctttctcag 1440

tagaagcagg taggcagagg ccacatgaca gcagttagag tgtggtcttc aaggaagtca 1500

cagaaatact gtggggaatt gaaaccccaa gtggaaaatg tacaagagtg tctcagtgtg 1560

actgagaagg aggttgggct tggggtttaa cttaagaatt tttttctttt tcttttgtgg 1620

agatagggct tttgttatgt tacccaggct ggtcttgaac tcctagcctc aggcgatcct 1680

cccgcctcag gctgcagaag tcctgggatt actggccgga gccaccatgc aggcctcttg 1740

ctcctacttt tgagaaagga agcttaacct tttttttttg tttgtttgtt tttgtttttt 1800

gttttttttg agacgagtct cactctgttg cccaagctgg agtgcagtgg tgccatctca 1860

gctcacggca acctctgcct cctgggttca agtgattctc ctgcctcagc ctcccgagta 1920

gctgggacta caggcaccca ccaccacgcc cggctaattt ttgtattttt agtagagatg 1980

gggtttcacc atattggtca ggctgatctc gaactcctga ctcaggtgat ccacctgcct 2040

cagcctccca aagtgctggg attacaggcg tgagccaccg cgcctggcca cttgactttt 2100

tctctatctc ttccttctac ccatcctacc cttggaagat agagaagtaa tatcagttcc 2160

atcgtgttat actgggcttc ccccagggac aaacccactt ccccaacctg aatgagccat 2220

cacttcttcc ccagtttaca tttcattgct ctttgaatgt ctccgttcgg atatgggaat 2280

tcacatgtgg tcataattct tacctgaaga agactgacgt cttcttctct tagaccaact 2340

gccctgatgt gaggtttaga ggttaaagaa catgtgtgta tttacatgat ctttgtattc 2400

tgccttttcg tccctcacta atgacagctg aaccccaagg aaatagagct gtggaggaga 2460

gggtttgatg agaaagtagg taaatattgg atctaatcca tcatcttcca ggaaacctcc 2520

attacttcta aaaatttcaa ccaaattcgt taaaggacaa gaactccacc agagtagggc 2580

cataaacatt ggcaaaatta gttgtaatct atgactagat ttaatgtccc tttgttttat 2640

tcacatatgg ttataatgct ttgcttggaa ttaggggtat tttaagtttt cttctgccta 2700

gtaagtgtat ttgtgcttat aatacaataa ttataaaata tcacattaat attttataac 2760

tgtacagtta actctggccc aaggaaaaga tagtccggta gatgctgcag cctgattttg 2820

tatctaaccc tggcaagagg ataatgactc atgttatttc acttaccctt tttatctttt 2880

aacatgaagg gctcatatag gtcaataaga aaccagtgat ataaacagac caaaaaatga 2940

tcagatcttt cacattagca aaaaaaaata ttttttaaac aatacccaac tgggtgaaaa 3000

tacagtgtaa cagtaccaaa tatcaacatg tgtcaagaac cagaaaaatg tttgttttct 3060

ttgatcagca acactatttg aggaaatcta tcctcagggc ctagcctggg gcctggcaca 3120

cagtaggcac tgaacaaata tttgctgaac acacacatac ttatgatatt tttaaaattg 3180

gcaacaatcc aatacccaat aatagaggaa ttaaatatta tagaactgtt caataagatg 3240

cttacgaata tcatgcagta agatgggcaa tatttatatc ataagcttaa atgaaacaaa 3300

tgggtattaa aggtatggta aggttataaa ttacttttta agagattaaa gggaaaagac 3360

tgaaagatat atactgaaat gctcacagtg gtgacaaggt tccccagcct tggcactatt 3420

gacattttgg gctatgtctt tgctgtggga ggctggcctg tgctctgcag gaggtttggc 3480

agcactcttg gtttctaccc ctagatagca gtagcaaccc tccctcaacc agcccaattt 3540

tgacaaccaa aaatgtttcc aggcatcacc agattctccc tgggtgagag tgatgaaaca 3600

gtaggtgatt ttccccttct tttctcattt tctgtaattt tgtcacatta cgttaataat 3660

aaggaaaaaa cataaaaaat agatgaattt attattctac ctcagtttgg atgtttggac 3720

tccctttggg ggttctttcc attatatcac ttggtctgct aaacagtcta tggtttggca 3780

aggtgaaatg attcatgaaa ttttgttttt attttttacc tgatactaaa agtaaaacat 3840

tcattcgctt gaaaatttgg acacagaaca ccaaaaaaaa tccataatct catctctctt 3900

tttctgtctt ttccttcctt ttttcccttt aaaaacaaga gtgaaaacct accggttctc 3960

cctccaattt aattcctaaa tataatcact gttaacatct tggacatttc ctgtgtctaa 4020

acacacatac tcactttttc ttttttttag caaaaagtgg atttctgcta catgtagtgt 4080

tccgcaactt cctacatgtt tacaaaatca gtacatttac atatgctgaa ttcagtcctt 4140

aatggtatta tattttgtga atataacaaa atttatttaa ccacttagac aatctaagat 4200

attctcagtt tgctgttatg agcaatgctc ttcctttaca tatacatata tatgtgtgtg 4260

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg ttttagtagg atagatttct aggagagggc 4320

gaaatgtcat atgacatcca catttacaat tgtaatagga agtatcaaag tgccccctaa 4380

aaaaaaaaat tcctcccatt agtgtgtgag aaagcctatt tgttcatatc ttcacaaaca 4440

ctaaatatta gaaatattta caattgtgtt caagctaaga agtgaaaaat ggtatttcat 4500

atcttataat ttttgttgtg agattgaaca tatttcctat gtttacatgt cacctgtatt 4560

tcttattctc tgaactatac gttatgacct ttcacttatt ttcctcatgg gttatgtgta 4620

gtttgtgtag ttgtcttatt gattgttagg agctatttat atattaggaa cattaatctc 4680

ctgtcttata tgtatgtggc attgattagt tgatcatttg tgagttcatg tctgtataca 4740

aagattagag aggcagtaag agggaaaact tacctctttc ttatcaaagt ttgtaaatat 4800

atgtataaca gaagagagag aaaacattaa taaatgctga aataaagtat aaatttttta 4860

ctccactact tcaacataaa ctacaaaagg agagtgactt ttctttcatg ctgacttcca 4920

tattccccat gcctaaaata gtgcctagca cagaagaggt gctcaatcag tgtttgctaa 4980

atgaaagaat tagtaacatt tcaagcagga tgactaaatg aagaatagaa tctaggcaga 5040

tactctggaa gagtgactgt gagtcattca tggtcttggt atgaattagt caaatccagc 5100

tttctcccct tcccactccc cactgttagt agaataatct gtttattgag agaatagatt 5160

tataatttag aataagaggg gcagaagagg agattttgaa ggatggcacc tgaaggagga 5220

ctagcatggc tgagatagtg aagtggaagt cttggaaagc taaagggtaa gatgaaagta 5280

tttagccgta gggggaaaaa gcattgacag gttggaaatg taaaagtcag attctccttg 5340

ctttgaaatt ttgtacaggg caggttctac taggtatgtt acaatgcaga aaaaacatga 5400

aatagttgag aggaatttgg tgaaatatta tcttcctggc ttcttttgag tgagcagatt 5460

tttttcaggg cctgtaacta taataaattt gaaacttctc atcttttagt aacttttttc 5520

acttaagttt atgtggctgt gggcaatgga atgaaggtat tgaacttcct attccctgct 5580

gggtttccac aattacaagt caatcatgac tggttattag aagactattt caattagaac 5640

caccaagtcc cataatgtca tattgtgtgt ttaattatta agtaaagcag tcttcttttt 5700

gtgttttcca taattagcac attccagaaa gatgaggata tttgctgtct ttatattcac 5760

gatctactgg catttgctga atggtaagac accaaatcct tccattaggt tctatatttt 5820

aaatatttta accatgagtt taaaactaaa atgataattt aaaatgcatg caattttctt 5880

atagagagaa tattctcttc tttcttctac tttacacaat gacaaagtct ttcttctgct 5940

ttacacaatg ataaagttcc ctgtgtcatt gtgtaaaaat atagagaata tagacaaatt 6000

gaaagacaca aaataatcta ttacccattt cccagggtta actactgaaa atatctgggg 6060

aaatggcctg tatgtatata tttatttgtt tgttttcaac aaggccagga tctttcaatc 6120

tttcaatctt ggttgctctg tgacatgcct ttcctgatga gaatactcta aggaagaatt 6180

gtaggataca tggaaaatgt cagggtaaca cagtactggc accaccctgc ggtcctttct 6240

gaactccata ccaatgtact tcttgccaga aaactgatca aaagtttagg gaagtaaaaa 6300

gagatgttag aatctaccat tccctctatg taggaagcaa ataggtgtcc agtcaaagga 6360

cattctgggg atgtctacat gaaaccaagt ctcctggttg taagtactcc atctccatat 6420

aatatttcta cagtaatata tgtttataaa ttgtgggggc aacttgttta gctaatttta 6480

ttattctgtt attgggacac tatgtctctg catgagacat agtgtcccaa aacatatttc 6540

aagcccattg gataaaatat gtatttagca agttcttaaa tataatgata acataactga 6600

ccagataagg tgatttttaa atgctgtgcc aactttataa atgttttgag gaattttccc 6660

ttttctgaag gttattcttc tttcttttta gcatttactg tcacggttcc caaggaccta 6720

tatgtggtag agtatggcag caatatgaca attgaatgca aattcccagt agaaaaacaa 6780

ttagacctga cttcactaat tgtctattgg gaaatggagg ataagaacat tattcaattt 6840

gtgcatggag aggaagacct gaaggttcag catagtaact acagacagag ggcccagctg 6900

ttgaaggacc agctctccct gggaaatgct gcacttcgga tcacagatgt gaaattgcag 6960

gatgcagggg tttaccgctg catgatcagc tatggtggtg ccgactacaa gcggattacc 7020

gtgaaagtca atggtaagaa ttattataga tgagaggcct gatctttata gaaaacatat 7080

tctaagtgtt gaagactttt cattcttata agtccatact tattttcaaa cagaatagca 7140

tagtctcttc attcattcat tcagttcatg aattcattca cgtaagtctc caattagcat 7200

ttcttgagca cctatatgat agtcattgga aatccagaga caacacagag ccatgttcta 7260

cggtatgtac agttttccaa aaataattcc tagtctttac ttttttatta taaatgtaat 7320

acatatactt gcaaagaatt cagatactat ggaagagatc aaatgaattg caaaagtgtc 7380

cctcctccct tcaccactat ctcccatgag ataaccaaga gacactccaa gagagtaacc 7440

attatttgtg tgtccctcca gaaccttttt tattcaacta ccattttttt attttattag 7500

gtctgtcagt tttccttttt tgagcctctc tatatcaaat gctaataaat atattcagat 7560

caaaccccac tgtaaggttc atattaaaaa agacttgaag tctccctatg aagacaaaaa 7620

ataatcatat taagtgtaaa agaacttatt cttccagtac agtataaact atactcactg 7680

ggcatatatt catcttgaaa atctatactg atgttgtctt ggggaattga agaggaacta 7740

ggagtgtcaa ttcctgggaa ctgacccaca gttatgtcat caggtcactt gagttcgaag 7800

ttttgtgttg gcactagcta agtaaaggaa aacacctctg ctttcattgt tgagtttcat 7860

agaattgaga gctgaaagga tcccaggcag gagcgactaa tccaaactcc cacaaagaac 7920

aaaaatcccc cagaggatct tctgttcata tatttcctgc agtggcatcc ctgtcatatc 7980

ccacaatggc atccctgcca tttggactcc ccttccatat cctgttgaaa ttactcccta 8040

atagtaagct gaaatctgcc cctctagttg tagttttgga attatttcat ttccatgatg 8100

accttttaat atttgactag aattaaatca tctccccttg gtatttccat tcctggacta 8160

actaccatca atctgagggc taacaataca agtagaaaaa gtctacactt gtcattgatc 8220

actgatcaat gattaatcaa tgatcactga taattataaa ctcaaaaaca aaatcatgta 8280

gggattaaga gaaatgtatc agttttatgt tgtatttctg gtccctgatt ctggctcaaa 8340

taatgctact attgtcaaga agatatcact tgtaaagtag atttaatttt cattatattt 8400

taccatgtgc ttctccattc acggcatttc ttgagatgtt gtggtttata ctttcagttt 8460

ttctccagtc catcagcaaa tatcaggcat ctactgtgtt ccaagatatt aaagaaatca 8520

tcatgactta gcctcatcaa cagcattgct agatctggga tggaaaagaa gagtataatc 8580

ctggcagtca ggaagaaggc tgcataaagt ataagtttct gcttccaaag aagatctctc 8640

atcagcctgt agggagtgta tagggagggg acagctgtcc ttgtagtagc aaagggtttt 8700

attcaggtca tctgggctcc ataatatccc ttgtgtatct gcagtctcct ttgccatgga 8760

tcaacacaat aggaaatctt ccggcactga tggtttttcc aagggggagt tcttcaggga 8820

gcaaagcaaa tgaccaacca ggtttgagga cctgatttga caattccatt ttgtatttta 8880

aattagttaa tttgcattct agtcccaatc catcttgtca tttgcagaca gtggttttgg 8940

ggttgagttg agctatacca aaagtctgaa ccttctgcac ttagaacaag gaaggcaacc 9000

accaagcttc acttgcactg aggcagtgtc tccaatggaa acgaggtagc tggcttgcag 9060

aagctttcca actcagggaa gtagaactcc tgagtcacct ccatatgcaa ataatttcac 9120

agtactgctg ttgaacttca cttcccatca cagcaaatgt gtggtaacat agctttgcca 9180

caggagttta ctcaccatgg gattttaaag gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag 9240

aatttagttt tggattcact caattatcat gatcactttg ggtgttattg cacctttcat 9300

gtttgtgagt ttaaatacca gactctcagg cctctaactt tcaattaaaa gtgtttttct 9360

ttaatcactg aacctaatag tagggaaaac gaaatgttca ttcagacttt caggaccttc 9420

aatgagatga ggcagctgaa agatcaaagt gttgcatagt tatcccagta aagctatttg 9480

gatcgtatgg accagatcaa ctgctgtcat tccccaccaa ccccatcttt ccccaaaatt 9540

cccagccctg tttaagtgtt ctctgtagca tttatctcta tctagtatat tgtgtagcat 9600

atcatatcat acttttctat tttgtttatt gtctctctcc tcctagaata taaactccac 9660

aagcacagag atttgggtct gttttttaat attgttgtat ccccagggct tgacgtaaag 9720

cagagtggta gtatgacaaa agcacacaaa aaaatatttg ttgagtcaat gaatgaatga 9780

tttcctcaaa taggattagc ctaaaatttt ggaaacatga acagacttgg atatatgaaa 9840

atttatttcc aaaactgttc atcaggaact gttagcacct tctaaagggt acactgaagc 9900

agcagtagta aaaggaggag gaggagaagc agctctgcta ctactattat cgagtactac 9960

tacaactatc gagtactact acaactatcg agtactacta caattagcac ttgcttattc 10020

tgtgtgttag gtcctgtact gaacattctg cctaaattag ttcatttcct cctggaaatg 10080

actctgtggg gtaggtgctt catcatgtaa gatgagtatt tttcacactt cactgtctct 10140

gaaatctgag tgtgtctttc aatgatggaa tctttgattt catgataagt ggtattattc 10200

ccattttaag gatgaggaaa ctggggtcca aagaaattaa gtaatttgcc caaattcacc 10260

tagcctcgta aatgataaag ctagttctaa atccaagcag attggctctg aagtctgggc 10320

ccttaataac cacttattgc ctgtatttgc acctctggtg tatgtatcaa gttatatatt 10380

ggcttcaaaa ctatcatgac cttttcttga ttttgattgt tcaatattag tatagtgttc 10440

tagatctagt agaccagggg tctgcaaaaa attttgatta ctcacctcat ctgtaaaaca 10500

ttttaaactt gtgtgtctgt gcaggcacat ttgtgtgtaa ttataaaaaa tttactatct 10560

attaatatat aggttgtacc gtaagaaaaa ttgccatttt tgaagagcaa aaaaggttga 10620

atattaccag tttcatctgg ttcaacctaa tagacatttg tacaaaaaca gacattttaa 10680

gaggatgaaa taaaaattta ataaacaata ttttcaattt ttactaattg tgacgcttca 10740

ctattgttag ctaatatgtc aaggcatgat ataccttagg gtggaattta tcattaacaa 10800

aggtggatag tgtcaataat cttgaggttt gtgttttttt atataacact gtgaggtcta 10860

attaagtact taattgttta caacctcata cagtcgccaa taataagtgt cacttctgct 10920

gtttcctctg ggttgtgctt gaattattag tattatcttc aatcctcagt ttctttgtgg 10980

aaaacttttt aattagttgt ttaattttgt aagatggtta gtttagtcaa aattagataa 11040

gagaatctga aaatccataa ttaccccaaa gcaacccact cataagaact attatttttg 11100

tgttttgaaa tcataatttt attgatttcc agtgtttcca ctggtagtgg tttcattgat 11160

gtaggagtat caaaacatca ctaattattt atttcagttt tgtttgatcc tagctgtttt 11220

gtgttaactt tgaagaaatt acatcacaga tctattgttg tccttggtaa aggaatggag 11280

agttaaggct ctagatcatt agtggttatg ctgtagtatt aggagtaaaa aaaaagatta 11340

tatcaacaaa ataagaacat gttaatgtac ttgtaataga taaacatgaa taaagctctt 11400

atgctatata gatgcactga acaatctact agaattgtca gcaaacggta tcttaatcct 11460

aaaagggtcc caaaccaatg atctaaaatt gaatcaaact ttcttccttg agcataatta 11520

tttaagtgat ttattaaaat agccagcatt taaaagctta aaatataagt atcataatgt 11580

ggtatcctag atagatccca gaacagagaa aggatattag ggaaaaactg gaggaatgga 11640

ataaattatg cagtttagtt attaataatg tactaatgtc cttagttatg accattgtac 11700

catggtaaag taagatacta acaatagagg aaattgggta aggggtatat gtaactctat 11760

actatctttg caattttttt gtaaatttaa aacttctaaa ataaagaaca aatttgaaca 11820

ttaaaaagtg tcgccaggaa catgtatcac tgtttacaga tgaaacagta tgtattttta 11880

tatctaattt ctgatcattg gcttcaaatc agaaaagtga atgacacatc aagatcaggt 11940

tttctgttta ctaaataaag tctaagaaaa caaagcatac cagctggaga gattcatgtt 12000

tataaagaca gatttataac aacaaaaata aaatatccaa gaataaattt aagaagaaat 12060

agggcactat gtaaaaagta tagcacttta ctgagaaaca tatgaaaacc tgaatacatg 12120

gagagaggta ttttatattt gaatagaaag attgctggtt taaagataat tctctttaaa 12180

ttttttttgt agaaatttaa gaggtacaag agcagttttg tcacacggat atattacata 12240

gtggtgaagt ctggggtttt agtgtaaatt aatctttaca ttttgtttga gcccaataaa 12300

tgtaccaaca tgatttttat agcaagatag tcattcctat taacccaaac ttgtcccaac 12360

tttgaactga actgaggcag agctagcagg tgttccccac tgctgaggca tctgaacatt 12420

aagcgtatcc ctctgagaac cagcctgcat tgatcctctt tctaatgtag acagcatcaa 12480

gctatatatc tagttctgtg ctcagcaaaa gccctgactt ctttttgctt atgtcctagc 12540

tccatacaac aaaatcaacc aaagaatttt ggttgtcgat ccagtcacct ctgaacatga 12600

actaacatgt caggctgagg gctaccccaa ggccgaagtc atttggacaa gcagtgacca 12660

tcaagtcctg agtggtaaga ccaccaccac caattccaag agagaggaga agcttttaaa 12720

tgtgaccagc acactgagaa tcaacacaac agctaatgag attttctact gcatttttag 12780

gagattagat cctgaggaaa accatacagc tgaattggtc atcccaggta atattctgaa 12840

tgtgtccatt aaaatatgtc taacactgtc ccctagcacc tagtatgatg tctgcctatc 12900

atagtcattc agtgtttgtt gaataaatga attaatgaat aacattatat ttacaaaatg 12960

tatcctaatt cctcacttcc attcatccaa atcatattgt tacttaataa acattcacca 13020

aatatttatt gaatatgcct tttgttccat gcattgtagt actcatttga cacacataga 13080

ataataagac tcacgttcac actcttcagg aaacagataa aaaacaaatg aacaaacaaa 13140

aaacaggcaa tccaatacca tgtgggaaat gctttcatac catgtgggaa acctggggga 13200

atacctgaga ggaatattca attcaggcca tgtttcagga atccaaatcc tggcacatca 13260

gagccgcctc cttcttacta gggtttctgt ggcaggaaat aaatggaacg tatttttcta 13320

tcttatgcca aacaggaggg accctttctc ccctgtgcct ctcccaaggt agtctacaat 13380

atttcaacgc tagcagtctg tttagtgcac aggacatgag gctgtgtatc cctgggcaaa 13440

ttgctacact tctgtgtgct tcactttctc tgtaggatta taacctactg agcaaggtta 13500

ttgtgggggt caaattagca acagtgtatg aaaatgattt gagaccagtg cctgcacaaa 13560

ttcaactatt tttttttatc tcactactct atagaagtag gtaggatggg agacagagtc 13620

tgatgggagg ctcagaatgt gaaagtaagt gaggtgagtg agcatgatat ttcatataaa 13680

cacaaagata ctctgagaag agcttctcac ttcccccgcc cccaatagat gttgacagga 13740

aaatgccatg tacttcagca aaaacagctg aaaaattaga cataaaagtc aatcaatagg 13800

aaaagataat ccaggatggt cttgtgaaca gaaagaggga aaaaaaaagt ttagaaaatg 13860

atggggatgc tcttactggg gtatgagtcc tcaggtattc aactggcttt cagaaaaagc 13920

tagactagtg ggttcctgcc atttaaaagc tgttttatga caacttactt gttgggtggc 13980

ctacagtaac tcacttaact gtgctgagtc tgtttcctca tctgtaaatt ggggattttt 14040

taaaataact ggcatgccta actcataaag ttgttctgaa actgaaataa aacatatatg 14100

aacaggcatt gtaaactgta agttacggaa aaagctggct gttgttgtgt ctttaaagct 14160

tcacctgggt agttagagat ggatcatggg tctcagtgga gagctgagcc aggcaggagc 14220

tgactaaggg taagaggtgg gagttagcaa tctctgaaca tctgtgtgcc atgggacccc 14280

ttttcctcct gcatggtacc ccagacaagg agcctagtaa gagatactaa tgacttgttg 14340

tccagagatg ttcaaactgc agagaaagat aagacaacaa gcattggcct ccaatcatga 14400

tgacagatag gaggaggtgg gagctcctta gcagtgctgg ttggttttcc atgttctact 14460

gtgggccatc tctgccatgt actgtaggct actaacttct atattaaaaa atgcaagagg 14520

ggccgggagt ggaggctcat gcctgtaatc tcagcacttt gggaggccaa ggtgggcaga 14580

tcacttgagg tcaggagttt gtaaccagcc tggccaacat ggtgaatctc tgcctctact 14640

aaaaatacaa aaattagcca gatgtggtgg cgtgcacccg taatcccagc tactcgggaa 14700

gctgaggcac gagaattgct tgaacctggg aggcggaggt tgcagtgagc caagattgtg 14760

ccactgccct ccagcctggg caacagagaa agactttgcc tcaaaaataa ataaataaat 14820

aaataaataa ataaataaat aaatggaagt gaaataatca aggccaccat ttaatactga 14880

gtagccactc catgtggtac tgtgctaagc acattataaa atattagcct cacaagaaat 14940

gtattagcat ttgtattttg tacactggtt aagtatcttg cccaagacct caaaactggt 15000

taaggggcag cagaatttaa ccccagcgcc accttttcaa agtctgggct tcttacactt 15060

ctccatgctg ttcccatttt aacagatgta tctcgccatt ccagccactc aaactttggc 15120

atttaagaaa attatcctaa agctaaacta aacttcaagg atgactattc tcctgatgac 15180

cccttcccat caaaatttta tctttagtca gtttgttttt gttttgtttt gtttttcaga 15240

actacctctg gcgcttcctc caaatgaaag gactcacttg gtaattctgg gagccatctt 15300

tttactcctt ggtgtagcac tgacattcat cttctattta agaaaaggta gtatttcctt 15360

aattgcagtg gtctccactg gggatgagga gggggtgaga attggatcga tcatggctgc 15420

aaggaaacct gacttaacct ctgcagggtg gtgcaaaggc attccactat tcaacagtaa 15480

ttatattgaa gctgcatggg atcactgggt gaagatgagg tgtaaggggt gagggacagg 15540

agaatgggta tggatggagg tagaagatgc agtgtcatac aatttttttc tatcatgaaa 15600

ataaccacag acttactgta aagaaggagc taaaatgcct gtcattttca gttgcatttt 15660

agttttgcat tagttgcacc cagctggttt ctgggtactc taagtaataa aaatagttcc 15720

tctgtagaac tgtagtattt tcaccataga gtattttgta aaattattgg tagaggatgt 15780

tacataattt gcatgtgttc ctttctccat ttacctgtgg gaacaattaa aatccaggaa 15840

aatgagtata ttcaaataat ttcctcccat ttatgatgat tcagagtaaa taattcctct 15900

gatacttaga gaagtatacc aagagatcca gtgattgtat agagttgtct gatgttaaat 15960

agggaagtag aatatggaag ggaattccaa tagtcgttga aaaattcccc acaacccctt 16020

acatggggga aagtggtgtt aactgagata gtagagataa gctgttacca aaaattatgt 16080

tcttaacagg attgagatag ccagaatata aggatcaagt ttcaatgaca gtaagatcct 16140

gagatgcagt tgatttgcac aaagaaataa ttgttgccag cttgcatttt gaatatttct 16200

ctggaaaaag agattagttg gcagtagaaa tgaatagaaa tcaatagata ttaaaatacc 16260

tcagaatttg attcatctct gggaaaagat gaaaaataaa agtgtatagt cctcaagaaa 16320

atctgggatc aaaagcatgg gccttaccct attgaattaa ttaacctcag aagttgggaa 16380

ctgtggaata aggatgtcca ccagacttcc tagggattac aaatgtttca tagaacttga 16440

aatttaaact tgggtcactg tatgggatgt agagctgtgc tatatggaaa taaaaatgat 16500

ttctttttct caagggagaa tgatggatat gaaaaaatgt ggcattcgag ttacaaactc 16560

aaagaagcaa cgtggtaaga atatcagaag gaattgggaa gtagaaggca aaggaaacaa 16620

aaagctaaag caataacaaa gagaaatcca ttagtcataa tctcctctcc ttttaaagaa 16680

tgctggttcc cctttgcctc acaactaata caagaacttc tccaccatct caggaagttt 16740

agggatggcc ttcaagagta gagagtaggg agcagctctg tggagagagg agaggagcag 16800

ggaaggggaa ggagtcagct tctctttgct aatctgttgc cctgcaccct agcagctccc 16860

tgcagcaggg gacaaggttg acttaggtgg atggataatt aattgattct aaaatattgt 16920

gtgtcagtat tgtatattgt aatactatgt taactgcgcc atgcacggta tctcatttaa 16980

tcccccaccc cttgccatta ccaaaaagag agagagaaaa atactagaat tatcctcatt 17040

ttacagtaga gaaaacagag ggtcaagaag ataaagtaaa gtgcccaaga acacacaact 17100

gatcacaaat atcaagcttg gggtccatta gcctaaccac agacccttac tcttaaccca 17160

tctgcttcaa tccattttgc tacaaatgtt tacatttata tgcagggcag aaaagtctca 17220

tccagtttat tgaactaaga agaaagttat attaaggtgt ctaatttttt ttaatgtagt 17280

tagaaaccaa acttaacaat gagcccaagt ttaaagcagt ctaattaact tgacaagctc 17340

aggcaagttt cattctgtgg cctgtagcat catctgtgtt gtaaagctaa gtagcaaatg 17400

ttatttgggt catcctgggg ggaaagtcat cccaatttgc tcaagactga ggggtttttc 17460

aggatatcat gtaaggataa ttgggtacaa atataacctg cttctttctc tcatttcaaa 17520

tttatcattt atcatctcag caactatgag ttatgttttt tattagattt cttgttactt 17580

tttccccaga ccgctcccca tgaaattaat atactattat cactctccag atacacaatt 17640

ggaggagacg taatccagca ttggaacttc tgatcttcaa gcagggattc tcagcctgtg 17700

gtttgggggt tcgtcagggc tgagcatgac cagaggaatg aatgggcccg tgggatgcat 17760

gcagtatggg acttaaaagg cccaagcact gaaaatggaa cctggcgaaa gcagaggagg 17820

agaatgaaga aaaatggagt tgaacaggga gcgtggaggg agaccttgat actttcaaat 17880

gcctgagggg ctcatcggtg catgtgacag ggagaaagga tacttctgaa caaggagcct 17940

ccaagcaaat catccactgc tcatcttagg aaaacgggtt gagaatccct aatttgaggg 18000

tcagttcctg cagaagtgcc ctttgcctcc actcaatgcc tcaatttgtt ttctgcgtga 18060

ctgagggtcc cagtgttgga acagtattta tgtatgagat tttcctattt attttgagtc 18120

tgtgaggtct tcttgtcatg ggagtgtggt tgtgaatgat ttcttttgaa gatatattgt 18180

agtagatgtt acaattttgt cgccaaacta aacttgatgc ttaatgactt gctcacatct 18240

agtaaaacat ggagtatttg taaggtgctt ggtctcctct ataactacaa gtacacattg 18300

gaagcataaa gatcaaaccg ttgatttgta taggatgtca cctttattta acccattaat 18360

actctgattg acttaatctt attctcagac ctcaagtgtc tgtgcagtat ctgttccatt 18420

taaatatcag ctttataatt atgtggtacc atacacacat aatctccttt catcgctgta 18480

accaccctgt tgtgatgacc actattattt tacccattgt acagctgagg aagcaaacag 18540

attaagtaac ttgccaaaac cagtaaatag cagagctcag actgccaccc actgtccttt 18600

tataatacaa tttacagcta tattttactt taagcaattc atttattcaa aacccattta 18660

ttaagtgccc ttgcaatatc aatcactgta ccaggcattg aatctacaga tgtgagcaag 18720

agaaagtacc tgtcctcaag gagcttggag tataataagg agattaataa gaaaatatat 18780

tattacaatc tagtccagtg tcatagcata aggatgatgt gaggagaaaa gctgagcagt 18840

gttgccaaga ggaggaaata ggccaatgtg gtctgggaca gttgaatgta tttaaacatc 18900

ttaataatca aagtaatttt catttacaaa gagaagtcag tacttaaaat aaccctgaaa 18960

aataacactg gaattccttt tctagcatta tatttatccc tgatttgcct ttgccataca 19020

atctaatgct tgtttatata gtgtctgata ttgtttaaca gttctgtctt ttctattcaa 19080

atgctattaa attttaaatt catacctttc catgattcaa aattcaaaag atcccatggg 19140

agatggtttg aaaatctcca cttcatcctc caagccattc aagtttcctt tccagaagca 19200

actgctactg ccttttattc atatgttctt ctaaagatag tctacatttg gaaatgtatg 19260

ttaaaagcat atatttttaa atttttttcc ctaaatagta acacattata tgtctgctgt 19320

gcactttgct atttttattt attgtagtgt ttcttatgta gcagatggaa tgaatttgaa 19380

gctcccaagg gtcaggacac atgccttctt tgtttctaag ttatctttcc catagctttt 19440

cataatcttt catatgattt agtacatgtt aaatatgtgc tacatataca tttagacaac 19500

cagcatttgt taagtatttg ctctaggact gagtttggat ttatgtttgc tcaaaaggag 19560

acccatgggc tctccagggt gcactgagtc aatctagtcc taaaaagcaa tcttattatt 19620

aactctgtat gacagaatca tatctggaac ttttgttttc tgctttctgt caagtataaa 19680

cttcactttg atgctgtact tgcaaaatca cattttcttt ctggaaattc cagtagtgta 19740

ccttgactgc tagttaccct gtgccagaaa agcctcattc gttgtgcttg aaccctttaa 19800

tgccaccagc tgtcatcact acacaggcct cctaagaggc ttcctggagg ttttgagatt 19860

cagatgccct gagagatccc agagtttcct ttccctcttg gccacattct ggtgtcagtg 19920

acaaggaata ccttcgcttt gccacccgtc aaggttgaag aaacagcgtc tccaacagag 19980

ctccttgtgt tatctgtttg tacatgtgca tttgtacagt aatttgtgtg acagtgttct 20040

ttgtgtgaat tacaggcaag aactgtggct gagcaaggca catagtctac tcagtctatt 20100

cctaactcct ccttttggtg ttggatttgt aaggcacttt atcccttttg tctcatgttt 20160

catcgtaaat ggcataggca gagatgatat ctaattctgc atttgattgt cactttttgt 20220

acctgcatta atttaataaa atatccttat ttattttgtt a 20261

<210> 3

<211> 20340

<212> ДНК

<213> macaca fascicularis

<220>

<221> misc_feature

<222> (1658)..(1881)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2742)..(2745)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2747)..(2747)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2749)..(2749)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4764)..(4802)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8775)..(8778)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8980)..(8984)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9161)..(9293)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9344)..(9348)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9840)..(9874)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9958)..(9973)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10437)..(10452)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10603)..(10603)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10830)..(10830)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10989)..(11006)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (11105)..(11122)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (11457)..(11457)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13710)..(13710)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14015)..(14049)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14518)..(14585)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14689)..(14699)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14707)..(14767)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14837)..(14865)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15703)..(15741)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (17403)..(17415)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19122)..(19135)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 3

ctgaaagctt ccccgattcc gccgaaggtc aggaaagtcc aatgccgggc aaactggatt 60

tgctgccttg cgcagaggtg ggcgggaccc cgcctccggg ccgggcgcca agttgagcag 120

ctggcacgcc tcgcgaagcc ccagtcctga agccccagtc ctgcgctgct tcccgaggct 180

ccgcaccagc cgcgcttctc tctgcctgca ggtagggagc gttgttcctc cgcaggtgcc 240

cacggcccag catctctggc taactcgctg ggcaccttag gacggaggat ctctacaccc 300

tttctttggg atggagagag gaggagggaa agggaaggcg atggtctagg gggcagtaga 360

gccaattacc tgttggggtt aataagaaca ggcaatgcat ctgggcttcc tccagcgcaa 420

ttcagttttg ctctaaaaat aatttatacc tctaaaaata aataaggtgg gtagtatagg 480

ataggtagtc attcttatgc gaccgtgtgt tcagaatata gctctgatgc taggctggaa 540

gtctggacac gggtcctagt ccaccgtcag ctgcttgcta gtaatatgac ttgtgtaagt 600

catcccagct gcagcagata agtaagtctc ttcctgcgct aagcacgtcc aggacccctg 660

aacggaattt atttgctctg tccattctga aaacccaaag gagtcctaaa agaggaatgg 720

aggagcctaa gaataaaaat agtataataa aacatttctt agacaggttg accttggcct 780

atgtcaaagt tcagtctggg tttgtcttat aacataagga gtaaaagtac cattgttcta 840

cctctttttt taatacttga aaaaaaattt actgtagatg cttttctatt aattaaataa 900

ccttctaaaa aatgttttta gtgctgcatt cgattaggtt ggataactaa atgaaattaa 960

ttcctcactg ttgggtataa aggttattta cagtggttct gtcttagcta ttcactgaac 1020

atcattacat agatatctct ggaatattgc tgattgtttc cgtcaataaa cttagaagtg 1080

taactactta gtcaaagaga ctgaatattt taaaggcatt ttgaagaaaa ctgaaaatgc 1140

tttccagaaa ggatgtatca gttgacaatg atggttgtca acagtattta aggagaacta 1200

tgatactctg aagaaaaact tagcctttct cagtagaagc aggtaggcag aggccacatg 1260

acagcagtta gagtgtggtc ttcaaggaag tcacagaaat actgtgggga attgaaaccc 1320

caagtggaaa atgtacaaga gtgtctcagt gtgactgaga aggaggttgg gcttggggtt 1380

taacttaaga attttttctt ttcttttgtg gagatagggc ttttgttatg ttacccaggc 1440

tggtcttgaa ctcctagcct caggcgatcc tcccgcctca ggctgcagaa gtcctgggat 1500

tactggccgg agccaccatg caggcctctt gctcctactt ttgagaaagg aagcttaacc 1560

tttttttttt gtttgttttt gttttttgtt ttttttgtag acgagtctca ctctgttgcc 1620

caagctggag tgcagtggtg ccatctcagc tcacagcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1680

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1740

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1800

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1860

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngactttttc tctatctctt ccttctaccc atcctaccct 1920

tggaagatag agaagtaata tcagttccat cgtgttatac tgggcttccc ccagggacaa 1980

acccacttcc ccaacctgaa tgagccatca cttcttcccc agtttacatt tcattgctct 2040

ttgaatgtct ccgttcggat atgggaattc acatgtggtc ataattctta cctgaagaag 2100

actgacgtct tcttctctta gaccaactgc cctgatgtga ggtttagagg ttaaagaaca 2160

tgtgtgtatt tacatgatct ttgtattctg ccttttcgtc cctcactaat gacagctgaa 2220

ccccaaggaa atagagctgt ggaggagagg gtttgatgag aaagtaggta aatattggat 2280

ctaatccatc atcttccagg aaacctccat tacttctaaa aatttcaacc aaattcgtta 2340

aaggacaaga actccaccag agtagggcca taaacattgg caaaattagt tgtaatctat 2400

gactagattt aatgtccctt tgttttattc acatatggtt ataatgcttt gcttggaatt 2460

aggggtattt taagttttct tctgcctagt aagtgtattt gtgcttataa tacaataatt 2520

ataaaatatc acattaatat tttataactg tacagttaac tctggcccaa ggaaaagata 2580

gtccggtaga tgctgcagcc tgattttgta tctaaccctg gcaagaggat aatgactcat 2640

gttatttcac ttaccctttt tatcttttaa catgaagggc tcatataggt caataagaaa 2700

ccagtgatat aaacagacca aaaaatgatc agatctttca cnnnnanana aaaaaaatat 2760

ttttaaacaa tacccaactg ggtgaaaata caatgtaaca gtaccaaata tcaacatgtg 2820

tcaagaacca gaaaaatgtt tgttttcttt gatcagcaac actatttgag gaaatctatc 2880

ctcagggcct agcctggggc ctggcacaca gtaggcactg aacaaatatt tgctgaacac 2940

acacatactt atgatatttt taaaattggc aacaatccaa tacccaataa tagaggaatt 3000

aaatattata gaactgttca ataagatgct tacgaatatc atgcagtaag atgggcaata 3060

tttatatcat aagcttaaat gaaacaaatg ggtattaaag gtatggtaag gttataaatt 3120

actttttaag agattaaagg gaaaagactg aaagatatat actgaaatgc tcacagtggt 3180

gacaaggttc cccagccttg gcactattga cattttgggc tatgtctttg ctgtgggagg 3240

ctggcctgtg ctctgcagga ggtttggcag cactcttggt ttctacccct agatagcagt 3300

agcaaccctc cctcaaccag cccaattttg acaaccaaaa atgtttccag gcatcaccag 3360

attctccctg ggtgagagtg atgaaacagt aggtgatttt ccccttcttt tctcattttc 3420

tgtaattttg tcacattacg ttaataataa ggaaaaaaca taaaaaatag atgaatttat 3480

tattctacct cagtttggat gtttggactc cctttggggg ttctttccat tatatcactt 3540

ggtctgctaa acagtctatg gtttggcaag gtgaaatgat tcatgaaatt ttgtttttat 3600

tttttacctg atactaaaag taaaacattc attcgcttga aaatttggac acagaacacc 3660

aaaaaaaatc cataatctca tctctctttt tctgtctttt ccttcctttt ttccctttaa 3720

aaacaagagt gaaaacctac cggttctccc tccaatttaa ttcctaaata taatcactgt 3780

taacatcttg gacatttcct gtgtctaaac acacatactc actttttctt ttttttagca 3840

aaaagtggat ttctgctaca tgtagtgttc cgcaacttcc tacatgttta caaaatcagt 3900

acatttacat acgctgaatt cagtccttaa tggtattata ttttgtgaat ataacaaaat 3960

ttatttaacc acttagacaa tctaagatat tctcagtttg ctgttatgag caatgctctt 4020

cctttacata tacatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt 4080

ttagtaggat agatttctag gagagggcga aatgtcatat gacatccaca tttacaattg 4140

taataggaag tatcaaagtg ccccctaaaa aaaaaaattc ctcccattag tgtgtgagaa 4200

agcctatttg ttcatatctt cacaaacact aaatattaga aatatttaca attgtgttca 4260

agctaagaag tgaaaaatgg tatttcatat cttataattt ttgttgtgag attgaacata 4320

tttcctatgt ttacatgtca cctgtatttc ttattctctg aactatacgt tatgaccttt 4380

cacttatttt cctcatgggt tatgtgtagt ttgtgtagtt gtcttattga ttgttaggag 4440

ctatttatat attaggaaca ttaatctcct gtcttatatg tatgtggcat tgattagttg 4500

atcatttgtg agttcatgtc tgtatacaaa gattagagag gcagtaagag ggaaaactta 4560

cctctttctt atcaaagttt gtaaatatat gtataacaga agagagagaa aacattaata 4620

aatgctgaaa taaagtataa atttttactc cactacttca acataaacta caaaaggaga 4680

gtgacttttc tttcatgctg acttccatat tccccatgcc taaaatagtg cctagcacag 4740

aagaggtgct caatcagtgt ttgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4800

nnaaatgaag aatagaatct aggcagatac tctggaagag tgactgtgag tcattcatgg 4860

tcttggtatg aattagtcaa atccagcttt ctccccttcc cactccccac tgttagtaga 4920

ataatctgtt tattgagaga atagatttat aatttagaat aagaggggca gaagaggaga 4980

ttttgaagga tggcacctga aggaggacta gcatggctga gatagtgaag tggaagtctt 5040

ggaaagctaa agggtaagat gaaagtattt agccgtaggg ggaaaaagca ttgacaggtt 5100

ggaaatgtaa aagtcagatt ctccttgctt tgaaattttg tacagggcag gttctactag 5160

gtatgttaca atgcagaaaa aacatgaaat agttgagagg aatttggtga aatattatct 5220

tcctggcttc ttttgagtga gcagattttt ttcagggcct gtaactataa taaatttgaa 5280

acttctcatc ttttagtaac ttttttcact taagtttatg tggctgtggg caatggaatg 5340

aaggtattga acttcctatt ccctgctggg tttccacaat tacaagtcaa tcatgactgg 5400

ttattagaag actatttcaa ttagaaccac caagtcccat aatgtcatat tgtgtgttta 5460

attattaagt aaagcagtct tctttttgtg ttttccataa ttagcacatt ccagaaagat 5520

gaggatattt gctgtcttta tattcacgat ctactggcat ttgctgaatg gtaagacacc 5580

aaatccttcc attaggttct atattttaaa tattttaacc atgagtttaa aactaaaatg 5640

ataatttaaa atgcatgcaa ttttcttata gagagaatat tctcttcttt cttctacttt 5700

acacaatgac aaagtctttc ttctgcttta cacaatgata aagctccctg tgtcattgtg 5760

taaaaatata gagaatatag acaaattgaa agacacaaaa taatctatta cccatttccc 5820

agggttaact actgaaaata tctggggaaa tggcctgtat gtatatattt atttgtttgt 5880

tttcaacaag gccaggatct ttcaatcttt caatcttggt tgctctgtga catgcctttc 5940

ctgatgagaa tactctaagg aagaattgta ggatacatgg aaaatgtcag ggtaacacag 6000

tactggcacc accctgcggt cctttctgaa ctccatacca atgtacttct tgccagaaaa 6060

ctgatcaaaa gtttagggaa gtaaaaagag atgttagaat ctaccattcc ctctatgtag 6120

gaagcaaata ggtgtccagt caaaggacat tctggggatg tctacatgaa accaagtctc 6180

ctggttgtaa gtactccatc tccatataat atttctacag taatatatgt ttataaattg 6240

tgggggcaac ttgtttagct aattttatta ttctgttatt gggacactat gtctctgcat 6300

gagacatagt gtcccaaaac atatttcaag cccattggat aaaatatgta tttagcaagt 6360

tcttaaatat aatgataaca taactgacca gataaggtga tttttaaatg ctgtgccaac 6420

tttataaatg ttttgaggaa ttttcccttt tctgaaggtt attcttcttt ctttttagca 6480

tttactgtca cggttcccaa ggacctatat gtggtagagt atggcagcaa tatgacaatt 6540

gaatgcaaat tcccagtaga aaaacaatta gacctgactt cactaattgt ctattgggaa 6600

atggaggata agaacattat tcaatttgtg catggagagg aagacctgaa ggttcagcat 6660

agtaactaca gacagagggc ccagctgttg aaggaccagc tctccctggg aaatgctgca 6720

cttcggatca cagatgtgaa attgcaggat gcaggggttt accgctgcat gatcagctat 6780

ggtggtgccg actacaagcg gattaccgtg aaagtcaatg gtaagaatta ttatagatga 6840

gaggcctgat ctttatagaa aacatattct aagtgttgaa gacttttcat tcttataagt 6900

ccatacttat tttcaaacag aatagcatag tctcttcatt cattcattca gttcatgaat 6960

tcattcacgt aagtctccaa ttagcatttc ttgagcacct atatgatagt cattggaaat 7020

ccagagacaa cacagagcca tgttctacgg tatgtacagt tttccaaaaa taattcctag 7080

tctttacttt tttattataa atgtaataca tatacttgca aagaattcag atactatgga 7140

agagatcaaa tgaattgcaa aagtgtccct cctcccttca ccactatctc ccatgagata 7200

accaagagac actccaagag agtaaccatt atttgtgtgt ccctccagaa ccttttttat 7260

tcaactacca tttttttatt ttattaggtc tgtcagtttt ccttttttga gcctctctat 7320

atcaaatgct aataaatata ttcagatcaa accccactgt aaggttcata ttaaaaaaga 7380

cttgaagtct ccctatgaag acaaaaaata atcatattaa gtgtaaaaga acttattctt 7440

ccagtacagt ataaactata ctcactgggc atatattcat cttgaaaatc tatactgatg 7500

ttgtcttggg gaattgaaga ggaactagga gtgtcaattc ctgggaactg acccacagtt 7560

atgtcatcag gtcacttgag ttcgaagttt tgtgttagca ctagctaagt aaaggaaaac 7620

acctctgctt tcattgttga gtttcataga attgagagct gaaaggatcc caggcaggag 7680

cgactaatcc aaactcccac aaagaacaaa aatcccccag aggatcttct gttcatatat 7740

ttcctgcagt ggcatccctg tcatatccca caatggcatc cctgccattt ggactcccct 7800

tccatatcct gttgaaatta ctccctaata gtaagctgaa atctgcccct ctagttgtag 7860

ttttggaatt atttcatttc catgatgacc ttttaatatt tgactagaat taaatcatct 7920

ccccttggta tttccattcc tggactaact accatcaatc tgagggctaa caatacaagt 7980

agaaaaagtc tacacttgtc attgatcact gatcaatgat taatcaatga tcactgataa 8040

ttataaactc aaaaacaaaa tcatgtaggg attaagagaa atgtatcagt tttatgttgt 8100

atttctggtc cctgattctg gctcaaataa tgctactatt gtcaagaaga tatcacttgt 8160

aaagtagatt taattttcat tatattttac catgtgcttc tccattcacg gcatttcttg 8220

agatgttgtg gtttatactt tcagtttttc tccagtccat cagcaaatat caggcatcta 8280

ctgtgttcca agatattaaa gaaatcatca tgacttagcc tcatcaacag cattgctaga 8340

tctgggatgg aaaagaagag tataatcctg gcagtcagga agaaggctgc ataaagtata 8400

agtttctgct tccaaagaag atctctcatc agcctgtagg gagtgtatag ggaggggaca 8460

gctgtccttg tagtagcaaa gggttttatt caggtcatct gggctccata atatcccttg 8520

tgtatctgca gtctcctttg ccatggatca acacaatagg aaatcttccg gcactgatgg 8580

tttttccaag ggggagttct tcagggagca aagcaaatga ccaaccaggt ttgaggacct 8640

gatttgacaa ttccattttg tattttaaat tagttaattt gcattctagt cccaatccat 8700

cttgtcattt gcagacagtg gttttggggt tgagttgagc tataccaaaa gtctgaacct 8760

tctgcactta gaacnnnnaa ggcaaccacc aagcttcact tgcactgagg cagtgtctcc 8820

aatggaaacg aggtagctgg cttgcagaag ctttccaact cagggaagta gaactcctga 8880

gtcacctcca tatgcaaata atttcacagt actgctgttg aacttcactt cccatcacag 8940

caaatgtgtg gtaacatagc tttgccacag gagtttactn nnnnccatgg gattttaaag 9000

gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag aatttagttt tggattcact caattatcat 9060

gatcactttg ggtgttattg cacctttcat gtttgtgagt ttaaatacca gactctcagg 9120

cctctaactt tcaattaaaa gtgtttttct ttaatcactg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9180

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9240

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnctgtcat 9300

tccccaccaa ccccatcttt ccccaaaatt cccagccctg tttnnnnngt ttttctttaa 9360

tcactgaacc taatagtagg gaaaacgaaa tgttcattca gactttcagg accttcaatg 9420

agatgaggca gctgaaagat caaagtagtt gcatagttat cccagtaaag ctatttggat 9480

cgtatggacc agatcaactg ctgtcattcc ccaccaaccc catctttccc caaaattccc 9540

agccctgttt aagtgttctc tgtagcattt atctctatct agtatattgt gtagcatatc 9600

atatcatact tttctatttt gtttattgtc tctctcctcc tagaatataa actccacaag 9660

cacagagatt tgggtctgtt ttttaatatt gttgtatccc cagggcttga cgtaaagcag 9720

agtggtagta tgacaaaagc acacaaaaaa tatttgttga gtcaatgaat gaatgatttc 9780

ctcaaatagg attagcctaa aatttggaaa catgaacaga cttggatata tgaaaatttn 9840

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttctaa agggtacact gaagcagcag 9900

tagtaaaagg aggaggagga gaagcagctc tgctactact attatcgagt actactannn 9960

nnnnnnnnnn nnnctacaac tatcgagtac tactacaatt agcacttgct tattctgtgt 10020

gttaggtcct gtactgaaca ttctgcctaa attagttcat ttcctcctgg aaatgactct 10080

gtggggtagg tgcttcatca tgtaagatga gtatttttca cacttcactg tctctgaaat 10140

ctgagtgtgt ctttcaatga tggaatcttt gatttcatga taagtggtat tattcccatt 10200

ttaaggatga ggaaactggg gtccaaagaa attaagtaat ttgcccaaat tcacctagcc 10260

tcgtaaatga taaagctagt tctaaatcca agcagattgg ctctgaagtc tgggccctta 10320

ataaccactt attgcctgta tttgcacctc tggtgtatgt atcaagttat atattggctt 10380

caaaactatc atgacctttt cttgattttg attgttcaat attagtatag tgttctnnnn 10440

nnnnnnnnnn nngggtctgc aaaaaatttt gattactcac ctcatctgta aaacatttta 10500

aacttgtgtg tctgtgcagg cacatttgtg tgtaattata aaaaatttac tatctattaa 10560

tatataggtt gtaccgtaag aaaaattgcc atttttgaag agncaaaaaa ggttgaatat 10620

taccagtttc atctggttca acctaataga catttgtaca aaaacagaca ttttaagagg 10680

atgaaataaa aatttaataa acaatatttt caatttttac taattgtgac gcttcactat 10740

tgttagctaa tatgtcaagg catgatatac cttagggtgg aatttatcat taacaaaggt 10800

ggatagtgtc aataatcttg aggtttgtgn ttttttatat aacactgtga ggtctaatta 10860

agtacttaat tgtttacaac ctcatacagt cgccaataat aagtgtcact tctgctgttt 10920

cctctgggtt gtgcttgaat tattagtatt atcttcaatc ctcagtttct ttgtggaaaa 10980

ctttttaann nnnnnnnnnn nnnnnnaaga tggttagttt agtcaaaatt agataagaga 11040

atctgaaaat ccataattac cccaaagcaa cccactcata agaactatta tttttgtgtt 11100

ttggnnnnnn nnnnnnnnnn nntttccagt gtttccactg gtagtggttt cattgatgta 11160

ggagtatcaa aacatcacta attatttatt tcagttttgt ttgatcctag ctgttttgtg 11220

ttaactttga agaaattaca tcacagatct attgttgtcc ttggtaaagg aatggagagt 11280

taaggctcta gatcattagt ggttatgctg tagtattagg agtaaaaaaa agattatatc 11340

aacaaaataa gaacatgtta atgtacttgt aatagataaa catgaataaa gctcttatgc 11400

tatatagatg cactgaacaa tctactagaa ttgtcagcaa acggtatctt aatcctnaaa 11460

agggtcccaa accaatgatc taaaattgaa tcaaactttc ttccttgagc ataattattt 11520

aagtgattta ttaaaatagc cagcatttaa aagcttaaaa tataagtatc ataatgtggt 11580

atcctagata gatcccagaa cagagaaagg atattaggga aaaactggag gaatggaata 11640

aattatgcag tttagttatt aataatgtac taatgtcctt agttatgacc attgtaccat 11700

ggtaaagtaa gatactaaca atagaggaaa ttgggtaagg ggtatatgta actctatact 11760

atctttgcaa tttttttgta aatttaaaac ttctaaaata aagaacaaat ttgaacatta 11820

aaaagtgtcg ccaggaacat gtatcactgt ttacagatga aacagtatgt atttttatat 11880

ctaatttctg atcattggct tcaaatcaga aaagtgaatg acacatcaag atcaggtttt 11940

ctgtttacta aataaagtct aagaaaacaa agcataccag ctggagagat tcatgtttat 12000

aaagacagat ttataacaac aaaataaaat atccaagaat aaatttaaga agaaataggg 12060

cactatgtaa aaagtatagc actttactga gaaacatatg aaaacctgaa tacatggaga 12120

gaggtatttt atatttgaat agaaagattg ctggtttaaa gataattctc tttaaatttt 12180

ttttgttaga aatttaagag gtacaagagc agttttgtca cacggatata ttacatagtg 12240

gtgaagtctg gggttttagt gtaaattaat ctttacattt tgtttgagcc caataaatgt 12300

accaacatga tttttatagc aagatagtca ttcctattaa cccaaacttg tcccaacttt 12360

gaactgaact gaggcagagc tagcaggtgt tccccactgc tgaggcatct gaacattaag 12420

cgtatccctc tgagaaccag cctgcattga tcctctttct aatgtagaca gcatcaagct 12480

atatatctag ttctgtgctc agcaaaagcc ctgacttctt tttgcttatg tcctagctcc 12540

atacaacaaa atcaaccaaa gaattttggt tgtcgatcca gtcacctctg aacatgaact 12600

aacatgtcag gctgagggct accccaaggc cgaagtcatt tggacaagca gtgaccatca 12660

agtcctgagt ggtaagacca ccaccaccaa ttccaagaga gaggagaagc ttttaaatgt 12720

gaccagcaca ctgagaatca acacaacagc taatgagatt ttctactgca tttttaggag 12780

attagatcct gaggaaaacc atacagctga attggtcatc ccaggtaata ttctgaatgt 12840

gtccattaaa atatgtctaa cactgtcccc tagcacctag tatgatgtct gcctatcata 12900

gtcattcagt gtttgttgaa taaatgaatt aatgaataac attatattta caaaatgtat 12960

cctaattcct cacttccatt catccaaatc atattgttac ttaataaaca ttcaccaaat 13020

atttattgaa tatgcctttt gttccatgca ttgtagtact catttgacac acatagaata 13080

ataagactca cgttcacact cttcaggaaa cagataaaaa acaaatgaac aaacaaaaaa 13140

caggcaatcc aataccatgt gggaaatgct ttcataccat gtgggaaacc tgggggaata 13200

cctgagagga atattcaatt caggccatgt ttcaggaatc caaatcctgg cacatcagag 13260

ccgcctcctt cttactaggg tttctgtggc aggaaataaa tggaacgtat ttttctatct 13320

tatgccaaac aggagggacc ctttctcccc tgtgcctctc ccaaggtagt ctacaatatt 13380

tcaacgctag cagtctgttt agtgcacagg acatgaggct gtgtatccct gggcaaattg 13440

ctacacttct gtgtgcttca ctttctctgt aggattataa cctactgagc aaggttattg 13500

tgggggtcaa attagcaaca gtgtatgaaa atgatttgag accagtgcct gcacaaattc 13560

aactattttt ttttatctca ctactctata gaagtaggta ggatgggaga cagagtctga 13620

tgggaggctc agaatgtgaa agtaagtgag gtgagtgagc atgatatttc atataaacac 13680

aaagatactc tgagaagagc ttctcacttn ccccgccccc aatagatgtt gacaggaaaa 13740

tgccacgtac ttcagcaaaa acagctgaaa aattagacat aaaagtcaat caataggaaa 13800

agataatcca ggatggtctt gtgaacagaa agaggaaaaa aaaagtttag aaaatgatgg 13860

ggatgctctt actggggtat gagtcctcag gtattcaact ggctttcaga aaaagctaga 13920

ctagtgggtt cctgccattt aaaagctgtt ttatgacaac ttacttgttg ggtggcctac 13980

agtaactcac ttaactgtgc tgagtctgtt tcctnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 14040

nnnnnnnnna tgcctaactc ataaagttgt tctgaaactg aaataaaaca tatatgaaca 14100

ggcattgtaa actgtaagtt acggaaaaag ctggctgttg ttgtgtcttt aaagcttcac 14160

ctgggtagtt agagatggat catgggtctc agtggagagc tgagccaggc aggagctgac 14220

taagggtaag aggtgggaat tagcaatctc tgaacatctg tgtgccatgg gacccctttt 14280

cctcctgcat ggtaccccag acaaggagcc tagtaagaga tactaatgac ttgttgtcca 14340

gagatgttca aactgcagag aaagataaga caacaagcat tggcctccaa tcatgatgac 14400

agatagagga ggtgggagct ccttagcagt gctggttggt tttccatgtt ctactgtggg 14460

ccatctctgc catgtactgt aggctactaa cttctatatt aaaaaatgca agaggggnnn 14520

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 14580

nnnnntcagg agtttgtaac cagcctggcc aacatggtga atctctgcct ctactaaaaa 14640

tacaaaaatt agccagatgt ggtggcgtgc acccgtaatc ccagctacnn nnnnnnnnna 14700

ggcacgnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 14760

nnnnnnnagc atgggcaaca gagaaagact ttgcctcaaa aataaataaa aaataaataa 14820

ataaataaat aaataannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnncattt aatactgagt 14880

agccactcca tgtggtactg tgctaagcac attataaaat attagcctca caagaaatgt 14940

attagcattt gtattttgta cactggttaa gtatcttgcc caagacctca aaactggtta 15000

aggggcagca gaatttaacc ccagcgccac cttttcaaag tctgggcttc ttacacttct 15060

ccatgctgtt cccattttaa cagatgtatc tcgccattcc agccactcaa actttggcat 15120

ttaagaaaat tatcctaaag ctaaactaaa cttcaaggat gactattctc ctcatgaccc 15180

cttcccatca aaattttatc tttagtcagt ttgtttttgt tttgttttgt ttttcagaac 15240

tacctctggc gcttcctcca aatgaaagga ctcacttggt aattctggga gccatctttt 15300

tactccttgg tgtagcactg acattcatct tctatttaag aaaaggtagt atttccttaa 15360

ttgcagtggt ctccactggg gatgaggagg gggtgagaat tggatcgatc atggctgcaa 15420

ggaaacctga cttaacctct gcagggtggt gcaaaggcat tccactattc aacagtaatt 15480

atattgaagc tgcatgggat cactgggtga agatggggtg taaggggtga gggacaggag 15540

aatgggtatg gatggaggta gaagatgcag tgtcatacaa tttttttcta tcatgaaaat 15600

aaccacagac ttactgtaaa gaaggagcta aaatgcctgt cattttcagt tgcattttag 15660

ttttgcatta gttgcaccca gctggtttct gggtactcta acnnnnnnnn nnnnnnnnnn 15720

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nccatagagt attttgtaaa attattggca gaggatgtac 15780

ataatttgca tgtgttcctt tctccattta cctgtgggaa caattaaaat ccaggaaaat 15840

gagtatattc aaataatttc ctcccattta tgatgattca gagtaaataa ttcctctgat 15900

acttagagaa gtataccaag agatccagtg attgtataga gttgtctgat gttaaatagg 15960

gaagtagaat atggaaggga ttccaatagt cgttgaaaaa ttccccacaa ccccttacat 16020

gggggaaagt ggtgttaact gagatagtag agataagctg ttaccaaaaa ttatgttctt 16080

aacaggattg agatagccag aatataagga tcaagtttca atgacagtaa gatcctgaga 16140

tgcagttgat ttgcacaaag aaataattgt tgccagcttg cattttgaat atttctctgg 16200

aaaaagagat tagttggcag tagaaatgaa tagaaatcaa tagatattaa aatacctcag 16260

aatttgattc atctctggga aaagatgaaa aataaaagtg tatagtcctc aagaaaatct 16320

gggatcaaaa gcatgggcct taccctattg aattaattaa cctcagaagt tgggaactgt 16380

ggaataagga tgtccaccag acttcctagg gattacaaat gtttcataga acttgaaatt 16440

taaacttggg tcactgtatg ggatgtagag ctgtgctata tggaaataaa aatgatttct 16500

ttttctcaag ggagaatgat ggatatgaaa aaatgtggca ttcgagttac aaactcaaag 16560

aagcaacgtg gtaagaatat cagaaggaat tgggaagtag aaggcaaagg aaacaaaaag 16620

ctaaagcaat aacaaagaga aatccattag tcataatctc ctctcctttt aaagaatgct 16680

ggttcccctt tgcctcacaa ctaatacaag aacttctcca ccatctcagg aagtttaggg 16740

atggccttca agagtagaga gtagggagca gctctgtgga gagaggagag gagcagggaa 16800

ggggaaggag tcagcttctc tttgctaatc tgttgccctg caccctagca gctccctgca 16860

gcaggggaca aggttgactt aggtggatgg ataattaatt gattctaaaa tattgtgtgt 16920

cagtattgta tattgtaata ctatgttaac tgcgccatgc acggtatctc atttaatccc 16980

ccaccccttg ccattaccaa aaagagagag agaaaaatac tagaattatc ctcattttac 17040

agtagagaaa acagagggtc aagaagataa agtaaagtgc ccaagaacac acaactgatc 17100

acaaatatca agcttggggt ccattagcct aaccacagac ccttactctt aacccatctg 17160

cttcaatcca ttttgctaca aatgtttaca ttatatgcag ggcagaaaag tctcatccag 17220

tttattgaac taagaagaaa gttatattaa ggtgtctaat tttttttaat gtagttagaa 17280

accaaactta acaatgagcc caagtttaaa gcagtctaat taacttgaca agctcaggca 17340

agtttcattc tgtggcctgt agcatcatct gtgttgtaaa gctaagtagc aaatgttatt 17400

tgnnnnnnnn nnnnnggtca tcctgggggg aaagtcatcc caatttgctc aagactgagg 17460

ggtttttcag gatatcatgt aaggataatt gggtacaaat ataacctgct tctttctctc 17520

atttcaaatt tatcatttat catctcagca actatgagtt atgtttttta ttagatttct 17580

tgttactttt tccccagacc gctccccatg aaattaatat actattatca ctctccagat 17640

acacaattgg aggagacgta atccagcatt ggaacttctg atcttcaagc agggattctc 17700

agcctgtggt ttgggggttc gtcagggctg agcatgacca gaggaatgaa tgggcccgtg 17760

ggatgcatgc agtatgggac ttaaaaggcc caagcactga aaatggaacc tggcgaaagc 17820

agaggaggag aatgaagaaa aatggagttg aacagggagc gtggagggag accttgatac 17880

tttcaaatgc ctgaggggct catcggtgca tgtgacaggg agaaaggata cttctgaaca 17940

aggagcctcc aagcaaatca tccactgctc atcttaggaa aacgggttga gaatccctaa 18000

tttgagggtc agttcctgca gaagtgccct ttgcctccac tcaatgcctc aatttgtttt 18060

ctgcgtgact gagggtccca gtgttggaac agtatttatg tatgagattt tcctatttat 18120

tttgagtctg tgaggtcttc ttgtcatggg agtgtggttg tgaatgattt cttttgaaga 18180

tatattgtag tagatgttac aattttgtcg ccaaactaaa cttgatgctt aatgacttgc 18240

tcacatctag taaaacatgg agtatttgta aggtgcttgg tctcctctat aactacaagt 18300

acacattgga agcataaaga tcaaaccgtt gatttgtata ggatgtcacc tttatttaac 18360

ccattaatac tctgattgac ttaatcttat tctcagacct caagtgtctg tgcagtatct 18420

gttccattta aatatcagct ttataattat gtggtaccat acacacataa tctcctttca 18480

tcgctgtaac caccctgttg tgatgaccac tattatttta cccattgtac agctgaggaa 18540

gcaaacagat taagtaactt gccaaaacca gtaaatagca gagctcagac tgccacccac 18600

tgtcctttta taatacaatt tacagctata ttttacttta agcaattcat ttattcaaaa 18660

cccatttatt aagtgccctt gcaatatcaa tcactgtacc aggcattgaa tctacagatg 18720

tgagcaagag aaagtacctg tcctcaagga gcttggagta taataaggag attaataaga 18780

aaatatatta ttacaatcta gtccagtgtc atagcataag gatgatgtga ggagaaaagc 18840

tgagcagtgt tgccaagagg aggaaatagg ccaatgtggt ctgggacagt tgaatgtatt 18900

taaacatctt aataatcaaa gtaattttca tttacaaaga gaagtcagta cttaaaataa 18960

ccctgaaaaa taacactgga attccttttc tagcattata tttatccctg atttgccttt 19020

gccatacaat ctaatgcttg tttatatagt gtctgatatt gtttaacagt tctgtctttt 19080

ctattcaatg ctattaattt taaattcata cctttccatg annnnnnnnn nnnnngatcc 19140

catgggagat ggtttgaaaa tctccacttc atcctccaag ccattcaagt ttcctttcca 19200

gaagcaactg ctactgcctt ttattcatat gttcttctaa agatagtcta catttggaaa 19260

tgtatgttaa aagcatatat ttttaaattt ttttccctaa atagtaacac attatatgtc 19320

tgctgtgcac tttgctattt ttatttattg tagtgtttct tatgtagcag atggaatgaa 19380

tttgaagctc ccaaaggtca ggacacatgc cttctttgtt tctaagttat ctttcccata 19440

gcttttcata atctttcata tgatttagta catgttaaat atgtgctaca tatacattta 19500

gacaaccagc atttgttaag tatttgctct aggactgagt ttggatttat gtttgctcaa 19560

aaggagaccc atgggctctc cagggtgcac tgagtcaatc tagtcctaaa aagcaatctt 19620

attattaact ctgtatgaca gaatcatatc tggaactttt gttttctgct ttctgtcaag 19680

tataaacttc actttgatgc tgtacttgca aaatcacatt ttctttctgg aaattccagt 19740

agtgtacctt gactgctagt taccctgtgc cagaaaagcc tcattcgttg tgcttgaacc 19800

ctttaatgcc accagctgtc atcactacac aggcctccta agaggcttcc tggaggtttt 19860

gagattcaga tgccctgaga gatcccagag tttcctttcc ctcttggcca cattctggtg 19920

tcagtgacaa ggaatacctt cgctttgcca cccgtcaagg ttgaagaaac agcgtctcca 19980

acagagctcc ttgtgttatc tgtttgtaca tgtgcatttg tacagtaatt tgtgtgacag 20040

tgttctttgt gtgaattaca ggcaagaact gtggctgagc aaggcacata gtctactcag 20100

tctattccta actcctcctt ttggtgttgg atttgtaagg cactttatcc cttttgtctc 20160

atgtttcatc gtaaatggca taggcagaga tgatatctaa ttctgcattt gattgtcact 20220

ttttgtacct gcattaattt aataaaatat ccttatttat tttgttactt ggtacaccag 20280

catgtccatt ttcttgttta ttttgtgttt cataaaatgc ttagtttaac atcccggtgg 20340

<210> 4

<211> 20641

<212> ДНК

<213> mus musculus

<400> 4

gcctcatgcc aggctgcact tgcacgtcgc gggccagtct cctcgcctgc aggtaaggga 60

gcatcttctc gcggaatccg cttgcagggc actttaaaga gccagaatcc ctagaccttt 120

ttaggacgga gaagggaacc ggtttcctgg gaaagttaag aactcagaat ccgcagtttt 180

gtgtgtttat ggatcttgtg ggtaggtagc tgggtcagaa gagatgaatt aattggtcct 240

agcgcgactt gactgtttgc tagcaatgac tgggtctttc cacttgaagc atctccggag 300

gtcccttcct ctgtcgaggt ctaggatgct ggagcttaag attttcattc tatctgccca 360

gagaacctaa aggatttttg gaagaaaatg tcccaaacag ttcttagata cagtgaccta 420

ggctatgtta aagtttaggt tggggttgtc ataagaggtg aaagtacaat attctatctt 480

tttttaaaaa taaattatta caggtgcttt cctatgaatt acttagccag ttttttttta 540

attgctatat tccattgtgc tgggttatta aagggcatca ctctcccact gaggaatgca 600

caggttagta atagtgcctt actagctcag tcatccactg accatctgtg tatgtgactg 660

tctggaatat ggctaggtat ttcatttaga taaactctta tatgtataag tacttcatta 720

tgtttgagtg tctgaaaggc ctttgtgtag aaaaaaaaaa aacaacaacc tgagaataca 780

ttccagaaag tatccgcagc tgatgatgat agtgaccaag cggtgtttaa ggagaacttt 840

atacagggaa aatattcacc tttcccagct gagcatcata gataggaaga catgatagtg 900

gttatatgct gctctaagga gggatggaga agggatggat ttgagcacag ggttcaggat 960

catttgatag aatttgaaaa ctgggtaaat tttcactctt ttgagaaagg aagtttgcat 1020

ctgcttcccc tccccgcccc aggcactctt ccccccccca tccccccccg tgcccccccc 1080

ccccatggga agataaagaa gtggcgttcc aagatcttca tctggacttc ccctgggaca 1140

aacctatttc cccatcttga atgagcgtca cttctttact ttaaactctg ttctgtgaaa 1200

ggctctcagc tcttgtctgg gaatttgtga aaggttacag tttcttgccg gagggaggga 1260

gaaggtgacc ctggactctt agcccatgta agaggtgcag gtttagaggt caaaggccat 1320

gctgatttac atggtccctg aatttcccct tttgatctac tgctcacacc tgcaccctga 1380

gagccaggga ggggaggata tgatactgaa gaaggtgact atcagaccca acccatcacc 1440

tttcagactt tatactaagc tttaaagcag actcataagc aatagataac tgttccaact 1500

gagtctgcca tcaacgtagg aaaaattagg tacagtcttc agtggatatc atgtacctca 1560

ttgtgactgt ctagtactcg gcttggccat ttctcccagg gcctcattgc aacagtcact 1620

gtgtcctcac aggcctggat gtcatcctgc ctcatctgct tgggcagatg aactggagag 1680

atatgattaa taatgagtca tttgattttg ctctttttgt aaatgtcctt ggtttggttt 1740

ggtttgttta ttttttgttt tgttgttgtt gtttgttttt attttcatgc tcttgttgtt 1800

gtttgagaca gagtctcact atgtagccca ggctagcctc ttcccccagt ctctcagatg 1860

ctgttgcatc tgcccttttc taacatcaat gattcataat aatcagcaag aaggctatga 1920

ccttaacagt caaaataagt aatcaggtaa ttattgagag ctaaatattt atttaaacaa 1980

atcaagttgc atttttcaag aattgaatgg ggggatctaa aaagtaatgt ttgtgctgca 2040

caaagatgta gtggtatcag ttgccatagt ctttctccct agatccgcag atctccttag 2100

ggaaatctat aattcaagcc taaacttgga cctggtacac aactggtact cgcccaaaca 2160

ttggccaagc acacacatat ttgtgactct gaaaaaaggg acaacacata acagcaaagg 2220

cgctccgtgt taggggcctg ttaaatacaa gacttgggga aattatgcca taatcttaca 2280

ttttaaaaat ggctattaca tgtgtgagac aacgggggct ggagagatac ctcagaggta 2340

ctaggcacac atatggcaag cagatgtaca agcaggcaaa acattcttaa aaaacaaaaa 2400

caaaacccca aaacagattt ctttctatat tatttatatg gggttctgcc tgcgtgtaca 2460

cctgaagggc agaggagagc accaggtctc ataggtggtt ggttgtaagc taccatatgg 2520

ttgctaggaa ttaaactcag gactttggta agagcagcca gtgctcttaa cctctgagcc 2580

atccctccag tcccagacaa aacactctta cacataaaat aaatcaatct ttaaaagtgt 2640

agaggaaaat ggctgaacag aaactattga cagacatgct gagagtggtc accgtttctc 2700

cagcttggca ctggtggtgc tgtaggccat ctcagtgtct gtcaccttgg ggcggggcgg 2760

ggggcgggag ggggggaagg cggcagggca gggtcttggc agcatctcgg gcctctattt 2820

catcacatca gtaacagctc tccttcgtcc caagcaagct ttggcaacca aataaatatg 2880

ttagccaata ttaccaaacg gtccctagag gagaatgtgt gtaatgtgcc tacattcgtt 2940

tttataacaa caccaacaat atccaaccat aaaaataaac tgaaatggtc actctacctc 3000

agtgacaacg tctgagctcc gtttcagggt ccctcacaag aaattcgata ggtgtaatga 3060

tttatttttc ctaataagta aaatgattat tcactcattt gaaaattgga cacacacaca 3120

aaaaaatgaa gaaaaaattt gctatttcat ctctcctttt ctatctcttt ccctttaaaa 3180

aaagtataaa tgtgggctaa agagatggct cagcagttaa gagcactggc tgctcttccg 3240

gaggtactga gttcaaactg caccaaccac atggtggctc acaaccatct gtaatgggat 3300

ctgatgccct cttctggtgt gtctagagac agtgacagtg tactcacata cataaaataa 3360

gtaaaaaaaa aaaaaacaaa actttttttt aagtataaat gtgtaagaac ttacctgtct 3420

tccctataaa agccacaatt acctttgcag ataatcactg tcaggcagtg tcttcaagag 3480

aagtggggtt gttctacgac acaagaatat ttttgtttat atactaccct ctaagctcct 3540

tcctacttct ctgcaaactc atcccctgtg catatactga aatctatccg tcacggtatt 3600

ttgagtatac acagttatcc gtcacggtat tttgagtata cacagtttta ttagctaata 3660

catggggtat ttcaagtctg ggactgttgt tggctgtgtc atctctgtta catatgactt 3720

atattttcta agatgaattt ccaagacagg aatagagaga tcatacgaca tgcacagtta 3780

aagttttaag agattacaaa attgaccttt aagaagctat acaatttcac atcctttcca 3840

ggaaaggtca agaaatccct gtatcttcac taatgctacc tatgaggagt ctgtaatttt 3900

ggtagagcag aaggtccaaa tggtatcaca gatcctccat ggactttctt atcgagagcg 3960

ttctttccgc ttttattgat tatccttcga gctatgtgag actctcatcc gtcttcctct 4020

tgaccgatgt atagttttct cactgagttc agaggctagg atgcagaagc cgtcctcgtc 4080

agctttatac acctttcaga ttgactgtga atgagcacac aggtcagaga gacggtaagg 4140

gaagacctac tctcccatga acgttgtaaa catgcgaata acacagaagc agaaaatgta 4200

aactattaga ctggctggaa tgtagcgctc acctttgagc ccactccttt agacaccggt 4260

ttcatggaag aatggctcct gtttcccacc tgctgcttca gcagtgcccc aaatagtgcc 4320

agattcagag gagatactca gtgtttgccg agtgaattag gaaagtgttc agcggagggg 4380

acactagcat tcagacatcc agaccttaga gtaaccgggc cagatggaag tctccttcct 4440

tcccatagct gttaccactg tactgtcttt actggggaaa agatttatca tgtggaatag 4500

gtgcgaggca gaggtgagat tttaatgggg aggaagcatt gaaaagtgaa agtgaaaatt 4560

ggatgctctt tgctttgaag ctttgcctaa agcaggtttt agctttcaaa tacgtttcaa 4620

tgttgaaaga acgcatgata catatggagg ggggcctggg gggggtcctt ggctgagttt 4680

gaatgtacat taacaatctg gggggctaat aactcaatgt aaagctgctg atcccatcat 4740

actgacttct ttccacttgg ttctacatgg ctttgagtta caaaatgaaa gcattgaatt 4800

ttgaactgtt cagctgtgtt tccacacttg caaatcggtt gttggccagc cctcagaatt 4860

gcttcagtta cagctggctc gtctgctctt tccagactgg cttttagggc ttatgtatat 4920

atgagaagga cacatttact agtgtctcct tgctctgcta ttgaaattaa gcagacctct 4980

ctgtgtttcc cgttactaga tagttcccaa aacatgagga tatttgctgg cattatattc 5040

acagcctgct gtcacttgct acggggtaag tcaccaaatc ttttcagtgg gttctatatt 5100

ttcaatattt tagctatgaa ttaaaaatgg aagtaatttg tggggtgtgt atgtgtgtgt 5160

atatgtgtgt gtagaggggg gtctgtgtgt atgtgcagtt gctaggcaca cataaagcgt 5220

tcataggaca acctagagct tagtcctcac cttctacctt gtttgagaca aggtctctta 5280

tttgttgtac attgctgagt cctgtagttc ggctagctca gaacctcctg ggggctctcc 5340

tgtctccacc tcccagtcca ctgagattgt aggcacatgc tactgcacct ggcttctacc 5400

tggtctctgg ggatttgaac ttgggtccat gggctacaca gcaagtcgtt tacttactgg 5460

gcaatcactc catcccctaa gataattata aggaatatac cttgcttatc caaacacatt 5520

ctcattctcc tttgccataa ataagttact tggcaaatat attgtatgta tttttaataa 5580

ataaataaaa tcttaaaaat aaataaaatt atttgtgaag acaaaaaaaa taagttactt 5640

ggaaaggatg aaggaaaata ctggagcttt gggtgtggtt tagtagtaga acacttggct 5700

gatgtaaaaa aaaagcccta ggtgcaatcc caacaccaga aacaaatgaa ggaatgaaca 5760

acaaccgccc ccacccccca ggggatgaat ataaaaatat caggtaatac agaactaaca 5820

ggtgatccgt ttcctatgaa taactactga acattcccag ggaggtggcc cactgataat 5880

atatttttat ttattggttc cttttaaaca agactgggaa tatattatct agcttgcatc 5940

accaccacca ccccccaccc ccgccccatg aagttatttc aaagaagaat tttagtgttc 6000

atgtgattcc ctaaataaaa tgatagtaac cttttaccca ggttttcaga tgtgtttgga 6060

ggagttttct gtcttctgag ggctggtcct ctttcctttt cagcgtttac tatcacggct 6120

ccaaaggact tgtacgtggt ggagtatggc agcaacgtca cgatggagtg cagattccct 6180

gtagaacggg agctggacct gcttgcgtta gtggtgtact gggaaaagga agatgagcaa 6240

gtgattcagt ttgtggcagg agaggaggac cttaagcctc agcacagcaa cttcaggggg 6300

agagcctcgc tgccaaagga ccagcttttg aagggaaatg ctgcccttca gatcacagac 6360

gtcaagctgc aggacgcagg cgtttactgc tgcataatca gctacggtgg tgcggactac 6420

aagcgaatca cgctgaaagt caatggtaag aattaccctg gatggggaag gcttcatccg 6480

tatttaaaac agctccctaa tgttgagagc tcttcattct tgagagttcg cacgcacttc 6540

tcacagaaca acagcagcct gttcttctcg ctcgtttgtt cattcgttcg ttcacacact 6600

tcaccagtga aaaagcctag cactgtgtgt ttgatagtaa cttgagattc agtaccagat 6660

aatactcagc catgctttgc agtcagtacc atgatcttgc aaaggtgaaa tgccaggtgt 6720

ttgtttctta tcataaatgc aatatataat atattacata gatgtataga tataactgtg 6780

taacatgcaa taagatataa tatgcatata tttcatataa cataatgtat aatatataat 6840

gtataataat atatactaca atatatagtt atatgcatag ttatatattg catttatgat 6900

aaaaagcaaa cacctggcat ttcacttttg caagcttttt gaattacttg taaatatata 6960

tacatgcaaa catacataca cacacatgtt tttttacaag taatttgaat gtcatggaaa 7020

gaaatagaat cataaaaatg tccctcctcc ctaactacca tcttctaagc ataaatatac 7080

agtaactact atttgtacat ccctccatga ctttttgatt ggattactgt ttatatttaa 7140

tctatcaggc ttagcacatt ttctttcctt tgaatacctc catacaaaat tcaatgtgtg 7200

tttatatata tatgtatata tatagttata tcatatcata tatcatacaa agttttatat 7260

atgtatacat atataaacac acatatctac acatacatac acatttttta tatatataca 7320

caatatataa tgtatatgtg tgtgtgtgtg catatacctc tatatctatc tatctatcta 7380

tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatagcttct actgtaaggg tcacttttta 7440

aaaaattaag gttaatctat gaaggatgag aagtgaagat cttaagtgta gaagaagccg 7500

ttcttccaca gagatggtac aggctacact cagcaggcat gcattcattt tcagggcctg 7560

catctctggg agtgctgagg aggaactatg agtgtaagtt cctgggtaac gagccacaga 7620

aatgtcatca ggtcccttga gttcacggtt ctgggttgga actaactaag ggaaggaaaa 7680

caccttgcta accacccctg ctttcactgt tgggttgcat agacctgaga gcttcactca 7740

tcgcaggcgt gcacacagcc agcccagttg cccaccagga ctggaaatcc ccaaggctct 7800

cctcttcaca tacctcccac agtggtgtcc ctcgaatcag gtccctttcg tggtctgcgg 7860

aaacttcacc ttgatggaca ctgagccgaa ccccgtcttc tccaggcaga cgttgcagat 7920

ggtctgcctg ctccttttcg gttttcataa taactttaaa actatttggc tagaatcaga 7980

tagtctcctt cgatcttttt actcctaaac tagtgtgaag ctcaatatta tacataggaa 8040

aaattcacat tcctcataag ggatcacggc agttattaac gcaatcttat gtagagatta 8100

ggaaaaatgt gtccattcga cagtttatta atgggtctgt gatggtgggt cgcttagagc 8160

ttatgaagat gccacttgcc ttatttcggt gcttggctct aacttccatt accttttact 8220

tacaattctt catttgtgac actcatgaaa ggagactcgg gatatggttg ttaatatctt 8280

gagcagctgt tagtacatca gcaaatatga ggctcctgtt tggttccaag atttttaaag 8340

acattgtgaa gctggaaggc catgagcagt caaagttgct ggacctgggg cactggaagg 8400

agctcaaggc gggcagtcag gaagaaggga gcagggtgta agcctctgtg acaagaggtc 8460

tctcatggct tgttaggagt aggtgactct ggtaaggagg aatttactct agattatgtg 8520

ctcagtgata tctctgatac caaagacaat cttttggagc gcacggcttc tccacggagg 8580

gacctgtgat gcggcaaagc tggtatccaa gcagtcttga aggcctgctt gactattttg 8640

ttttcttaca gaaatcacta cgtcgatatt ttactcccag ttcaccttgc catttgcatg 8700

cacgttagct ggtctaggcc aagagtctga accttggttg tggctcaaat ctgtaatctc 8760

agctatgtgg gaagctgagg caggagaatc gcgcaattag gacttgtctg agctacgaac 8820

atatagcagg ttcaagagca gcctgggcaa tttggcaaga tccgttctca aagacataca 8880

tacatacata tatttggcaa gatccgttct caaagacata catacataca tacatttggc 8940

aagatccgtt ctcaaagaca tacatacatg catgcatgca taaatacatg tataaatgaa 9000

tataaaatta aaataggaac aggactgagg acatgcccag tgatgtacag gaccctggtt 9060

tcagtttcta gcaccatggt cgctggcatg caaaagcttt ccatgtcaag gaagtagaac 9120

tcctgaattc tgtgctatgc aaatgacttc acagcaaggt tccttcccat cactgcaagt 9180

gtgtggtggt gaagcagccc tacagggagt tcactcgcca tggggtttta aaggtgaatt 9240

atttcaaaac tgaaatctga aagagtgtag ttttggatta actcagtttt tattatctct 9300

ttggataatg ttctaccttc aaaggtttac agaagaccct caggcatcag gcttttaatt 9360

gaaaaatatt cagctttaat cactgacctc aatatcagaa aagaatgaag tgtccattta 9420

gtagtcctcg gaccgtagat ggcattaagc agctgtaaga aacacgctca tcacatggtt 9480

caacaattaa ggattgccat ggtgcacccg atcccccagc tctgtttaaa ccttttctct 9540

gtcatctatg cctatctaag atgtctcagc atatcatgct tattgtctct ttccttctct 9600

tgaacacaag ctctaggggt aggggctttg gtcagtttta ttgttggacc tgttggcctt 9660

gacgtattat gaaggggcag tgtaataaga aaagaaaacc gtgtttgttg atggaatggt 9720

ttaaaaaaaa attagcttaa aatgtatgct atacgaacgg gcatgaatct gggagatttt 9780

agactgttcc ttgtgagccg taggaacttt cttgtttctg tgttcacagt cctccgcagc 9840

tgtgctcatg gtcctccaca tctgcctaac aacagcaggg gtagatgtta taattaacac 9900

tcacagaaca cctgatatgt gagaggttgt gccctgggct tcttgctcat atgaattcat 9960

ttcatcttta acataactct tcgggggagg cacttgccca tgaccatggc ttgttttctt 10020

tcctatcgac tatctttcaa atcggaatgt gtctttccct aggtgacatc tcagattcaa 10080

tgttacacag cactgctgtg cccattttca ggcattaaaa atgcgatccg cctaaattcc 10140

accccgataa aattatgcag ccaggttcgg aacccaacta gcccatctct aaaaatctat 10200

gcccttccta gcctcgcttt gttgcctgtc tttgtacctc tggagtgggt atcaaggaac 10260

agaatggctt taaacatgat ttgaactttt cctggttttt gatcacagca gtaacagagt 10320

gttctagaga taagccagag gtttgaaaac aaacagaact tgtctttgag gtgttataaa 10380

catgtgtgtg attataaagg atatatctgg tgccaatagg tatagcttat attataagaa 10440

atggccattg tgaagatcag aaggagataa ctcactgatt tcaggtggtt gattcaatct 10500

aacacatgat atattctgaa actgtacaaa aaagatattc aaaagaagaa acacatggaa 10560

caaagagtat atggaaattc tgacaactca gaatcagtgt atgttaagat gaagttcatg 10620

attaacaaat ggagatggtc gcagtcatcc tgaagcttat tttagccaat gctttatcac 10680

atccaactca atcttcgttt tttttttttc agatggatct tcccattttt aattaacctt 10740

atcatgatag cccctagtaa ggcatgtcct gacatttctt ttcttttttt ttatagctta 10800

tgtttctttt tttaaaaatt tttttactac atattttcct caattacatt tccaatgcta 10860

tcccaaaagt cccccatacc ctcctccccc actcccctac ccacccactc ccactttttg 10920

gccctggggt tcccctgtac tgggggatat aaagtctgcg tgtccaatgg gcctctcttt 10980

ccagtgatgg cctactaggc catcttttga tacatatgca gcttgagtca agagctccgg 11040

ggtactggtt agttcatagt gttgttccac ctatagggtt gcagatccct ttagttcctt 11100

gggtgctttc tctagcttct ccattgggag ccctgtgatc catccaatag ctgactgtga 11160

gcatccactt ctgtgtttgc taggtcccgg ccaagtctca caagagacag ctatttcagg 11220

gtcctttcag catatgcttg ctagtgtatg caatggtgtc atcgtttgga ggctaattat 11280

gggatggctc cctggatatg gcagtctcta aatggtccat ccttttgtct cagctccaaa 11340

ctttgtctct gtaactcctt tcaatcttcg tttttaatgt ccgaaaatga ctggtaacgt 11400

cactgcttac atttcccttt gctttgtgtt gaattgtgag ctttatcttt gatctggagt 11460

ttctttaaga agactttgta atgtgcttat ttttaaagat ggtgaattca attaaagata 11520

gacaagaggg acgggtctgt atttcatctg gtagagtgct tacctgccat tcatgaagtt 11580

ctggttcgat ccccggcaca gcatagaacc acatgcggtg gcaactcagt tgcctgtgac 11640

cccagcactc aggagctaga ggcaggttac ctttgactac acagcaagtt caaggctagc 11700

ctggtctaca tgcaactctt cctcaaaggg aaaacaaaac aaaaatagac aggagaattg 11760

gaaacatcca tagaaaccca aatatgaatc aatagactcc cctcttcctg tgtcagacat 11820

tcagactcag tgacagccgt caccgtttat gaggcatgac tgattttaca gatcctagag 11880

caagcgtgca caattctggt gtttcctgcc tgcgtcctca cacacacgct caccttaggg 11940

acggaggcag cggaggtcta gtcagtttca gacgaatcca ctcatcagct gctcaccatg 12000

gtcttctagg tgaagcagaa ctctccttcc atcagcaccc gtgaaaaaca aaagtggaaa 12060

gcagatattt cactccgaat gctttatcat tggcagtgat ttcaaattta aaccactaat 12120

ttcccagaag aattaggtca cgggccatgt ggcattagac cctattgtgg tgacattatt 12180

tcctgatgtg cctatttaat aatgtatagt ggtctcatct ttatttagtt ggtcttgaat 12240

gtgataaata caagactggg caagtgttca tcaaagctgt tacttgaaat tgtaattata 12300

cctattttgt tggtggtgtt ttttcttggt tcatggacaa ccaaacacat tacggctttg 12360

ctttgtctta gctactctgt gtcaagttcc tgtgaaaata ccgtattaca gtgctcttat 12420

tacatctttg gtaatgaagt agtcacctaa gcccctatcc tgggctctct atggctcact 12480

aaagaatcgt aagttggata atgattgctg aagaaataga tatgttttat ttacattgag 12540

gtagaaagac ctgtggtttc taggtaacag tttacttaac ttagttgcta catctagttt 12600

gcactcagta aacaccctgg tgtggttttt acaacaacaa ggttgttcct gaagcccaaa 12660

catggcccag atttgaatag aagacctgag gcagactaac actcactccc tgctgccaaa 12720

gtagcagagc cggggacata tttctccaat agccagcccg agttgatgct ctttgtaagc 12780

agacaccaca aagccacacg gctagcccta agatgggaga gccctgacct ctctttgctt 12840

ctgacctagc cccataccgc aaaatcaacc agagaatttc cgtggatcca gccacttctg 12900

agcatgaact aatatgtcag gccgagggtt atccagaagc tgaggtaatc tggacaaaca 12960

gtgaccacca acccgtgagt gggaagagaa gtgtcaccac ttcccggaca gaggggatgc 13020

ttctcaatgt gaccagcagt ctgagggtca acgccacagc gaatgatgtt ttctactgta 13080

cgttttggag atcacagcca gggcaaaacc acacagcgga gctgatcatc ccaggtgagt 13140

tgcctaactc gtccccggat tcctagcacg atggccatcc gccatagtca tttagcagta 13200

gttggccgag tgtatgaata catgaaactt acattggcta gacgtattct agttcctctt 13260

tctcttgcgt gcaagccata atgctacttg gtcaacactc agcaagaatt aagtgtttgc 13320

tcctgacaga cagtatgtta gtcattgagt attcgtggct ggataggaca taagttactc 13380

tgctccagga aacaggtgac agtcgcatgt aggagatgct cttgtaactt gggcaccacg 13440

ggcaacgtga gagcaagctt atgcttcagg aatgtaaacc tttgtcacat caaagctgcc 13500

ctcttccctc ccgggctgct gtagtagaaa gcaaatgcat tgcctttttt tgtatcttat 13560

attcaacagg aagaatcctt tcttcccata ctcctcttca gggcattccc tgatacttca 13620

actccaggaa gtctgcctgt gcatagaaca cgaggctgat gcctatgggc aaccgactag 13680

ctgggttgta actcaccagg ccagggcatt gtagggatag aatgagctgc acgaaaatga 13740

ttgtaggaaa atcgtttgag aattcagctg tctttaaaat tcatttacct tacagaaata 13800

gggccacagg agacagtttg gtgagaggct cagagcatta tatgaatatg aacccagagg 13860

tactcactct gaggagggtt gcttctgcct ccatcgacac ccctttccca atgtatgtca 13920

acagtacatt gatgtctaga gatagctctg tgaagtttag agaagatata taaaactaca 13980

ttaaaaagtc aaccaatatg aaaaatgaag cccaggatgg gcgtggagcc aaaaggagca 14040

cacaagtttg gaaaaatgta aaataaaaag gaagacactc taactagaat tggacttttc 14100

cataaaagct atattgttgg tttcctacca ttaaatgttt tatggggctg gagacgttgt 14160

agctcagttg ggagagtact tgcctagcat ccacaatgct ctgaccccag cgccatataa 14220

acgtatatag ggctcaccta tagtctaaac actttggtgg tggaagccgg agggtcagtt 14280

caaggtcatc ctcagcttca tagcaagttc aaggccagta tggactgact acaagagacc 14340

ctgcctcaaa gacaaaacaa gcaaacatca tcataataaa acagcaaaaa gctgttctct 14400

ggccatttct ttgtaggaca tcctggagta acttaaccac tctgagtgtc tcttctcatc 14460

tgtaacttgg gttcatagtg ggaccaaata ggagctgagt tacaacagga gatggaagtt 14520

agcaatctca gagcatccca gagccctggg acccattttt ctctttctca aaactccagg 14580

cagagaaaca gggagatgtt aatgactgga gtgcccaaga gtctcagaca tggaagaaac 14640

acaacccgca ctggtccaca tttgtgggag acagaagcgg cttagcagtg ccccgctttc 14700

ccatgttcgg gagttggcct tccacaccaa gtcagccatt actgtctata ttaatgagtg 14760

cacaaggaag ttactgcact aaggttacca tttaatattg cagtcacttt ctgtggcaac 14820

atgtcacagg cctggagttc ttctctgtgc tgctcccagt ttcttaggag atctgtcttc 14880

ttcttccaac ccttacctgg acattaactt tcagtgatta agattaccct aagaccaaac 14940

tatatttcag gagtcatcat tcccctgact atggcgcagc aaagccttac cttccatcag 15000

cttctcttta tccttttcca gaactgcctg caacacatcc tccacagaac aggactcact 15060

gggtgcttct gggatccatc ctgttgttcc tcattgtagt gtccacggtc ctcctcttct 15120

tgagaaaaca aggtatttcc tccattgctg tactgcctgc agggaagtgc atgagggtcc 15180

cttcaccatt gccttgagca ggcagtgcca gagatggtac caccctgaca agaacagacc 15240

cacatcacag ggcgtcctac actgcacgct agctgaacct caccaggaaa cactgacttg 15300

aaaggtgctg ccctccattc cctgggcttg ctttcagtta cacagagtaa gttttaacag 15360

tgactctggt gtactgagtc ttccttaagt cctgttcaca ttgttgctct gcgacatctc 15420

ctaccttgga gctcggtgtt ggaccctgtt gtaatatgaa gaggtatcag ttggacaagg 15480

gcgtagggaa gctaaaagac ttagctttca aggcgtgggg gagggggagg gcattgtgag 15540

gttccctgtt cagcggttca gagtaaagct gggcagcaca caagtttaga caacaaggaa 15600

gatgctctaa ctggggttgg aggtcaatgg tgcagggata ggtagcaatg gaggctaaag 15660

aagaaagcca taaggtttct ttctacagac tctgaagaca gagcactgtg gtgcctattg 15720

gtctcaggtg aactcaagtc ttgtgttcct tacaccacct attgagctgg gttctggata 15780

ccctaagtgg aaaaacactt ctgtctaaaa agagctgtgg catctttacc acaaagcact 15840

tttttttttt gcaagatttc tgaagacgaa atgacacagt ttttaaaata atttccatat 15900

atttatttca gtacttaccc ataagaatga ctgaaatcta ggaaaatgaa tatattcaaa 15960

taatgccttc ctattgtaaa gtgacttaga gtaaaccttt tcaccaaata ctttgaaatg 16020

cataccaagt gagccaatga tgcatggact tgtgtgaagc caaatgggga aatagaatat 16080

gggagggaac atcaatcatc agagaggaat tccccatcac ccttttggag ggcgcgtgta 16140

tgggaaaagt gttgtaactg gggcggtagc gaccagctgc ttccaaagaa taagccctga 16200

gcagaaccaa gagggttgcc agggtgtgaa gattaagctt cagagacaca tctggcttag 16260

ggctagccta ggacttgcac aggaccgcag ttgttgccta atggcatctg ggatgattgg 16320

ctgaggatga ggaaagcaga gagtcagtta ggtggtaagc tagctcagga tgtgggacgt 16380

ttctgaggga agggtggaag acaaagtaga cagtcctaaa aaccatctga gaatgaaagt 16440

atgtacccta aattgttgaa taattaactt tgcggcgtgg gatctggaat aaggaagttc 16500

acgggctaaa agcctggtga ttaggggatt gatcggtgtc tcctaaaaac cttaagttga 16560

aaatcgagtc cctgtgggtt gtagtagcat cttgctataa ggaattaaga ttgatttctt 16620

cttctttagt gagaatgcta gatgtggaga aatgtggcgt tgaagataca agctcaaaaa 16680

accgaaatgg taagtgtgag taacgaggga ggggcaagcc gagggaatga gtgggacaga 16740

gcagccaagc agggtcctgc aagggctgca gttccagcgc tctgtaggct gaggcagggg 16800

gatagggagt tccaggccag caaccacaca gccaaaacaa aacaaacaaa acaaaaaaca 16860

aagcaaaagg aagagcagaa aaagctactg ttaccaacaa gagacatact ttagccgtga 16920

tctcctctcc ttccaaagga agctgtttgt gggggctgct ggttcctctg cctaaggatc 16980

gccacatctg agaaaactct gggtttgctg ctgcggtgtc tgtgtggtag ccctgcaacc 17040

agggacgctg ttgacttatt tgaatgggca tttgattaag caaatgattc tgctgtgtgg 17100

ttagctgtta actgtttcat gtgtatgata tggcatttca tttcatcatc ctgcccccaa 17160

tcagataaat atgagaatca tctccattgt atagtaggga aaacagggct gagaagataa 17220

tgcgaggtgc ctaagaacac acagacttgc taccacagac gtccgttctt tgctaggtgc 17280

ttcaatctat gctgctacta atgtctgtat ttataagagt agaaaactct gcccgggcgt 17340

tggtggccca cgcctttaat cccagcactc gggaggcaga ggtagtcgga tttctgagtt 17400

tgaggccagc ctggtctaca gagtgagttc caggacagcc aggctacaca gagaaaccct 17460

gtctcgaaaa aaatcaaaaa agaaaaaaga acaagaaaac tctaactgaa ctatcttgta 17520

gtaaattaca gtgtgttcta attcatttta gtgttgttag aaaccaaaca gtaaggccag 17580

gcagaactaa agtggtttcg ctaacttggg cagacccaag caggttccct cctgtacatt 17640

accatttatt ctgctgagtc accctgagga accggcctgg cttgctcaag actgaggatt 17700

tctcagccat gaacactttc cattttaaaa ctagggcagt cccggacaag caaggatggt 17760

tagtcatcct tcatcatgta agggtagtca gacataggta gtatctgtct ctgtcttacg 17820

gcaacgttac tatctgctct agcaaacatc ccatttgttt atcttacata tcatacgttt 17880

cccccccaca tattccctgc ccctgtgaaa ttattatact atgatcactc tccagataca 17940

caattcgagg agacgtaagc agtgttgaac cctctgatcg tcgattggca gcttgtggtc 18000

tgtgaaagaa agggcccatg ggacatgagt ccaaagactc aagatggaac ctgagggaga 18060

gaaccaagaa agtgttggga gaggagcctg gaacaacgga cattttttcc agggagacac 18120

tgctaagcaa gttgcccatc agtcgtcttg ggaaatggat tgagggttcc tggcttagca 18180

gctggtcctt gcacagtgac cttttcctct gctcagtgcc gggatgagag atggagtcat 18240

gagtgttgaa gaataagtgc cttctattta ttttgagtct gtgtgttctc actttgggca 18300

tgtaattatg actggtgaat tctgacgaca tgatagatct taagatgtag tcaccaaact 18360

caactgctgc ttagcatcct ccgtaactac tgatacaagc agggaacaca gaggtcacct 18420

gcttggtttg acaggctctt gctgtctgac tcaaataatc tttatttttc agtcctcaag 18480

gctcttcgat agcagttgtt ctgtatcagc cttataggtg tcaggtatag cactcaacat 18540

ctcatctcat tacaatagca accctcatca ccatagcaac agctaacctc tgttatcctc 18600

acttcatagc caggaagctg agcgactaag tcacttgccc acagagtatc agctctcaga 18660

tttctgttct tcagccactg tcctttcagg atagaatttg tcgttaagaa attaatttaa 18720

aaactgatta ttgagtagca ttgtatatca atcacaacat gccttgtgca ctgtgctggc 18780

ctctgagcat aaagatgtac gccggagtac cggtcggaca tgtttatgtg tgttaaatac 18840

tcagagaaat gttcattaac aaggagcttg cattttagag acactggaaa gtaactccag 18900

ttcattgtct agcattacat ttacctcatt tgctatcctt gccatacagt ctcttgttct 18960

ccatgaagtg tcatgaatct tgttgaatag ttcttttatt ttttaaatgt ttctatttaa 19020

atgatattga catctgaggc gatagctcag ttggtaaaac cctttcctca caagtgtgaa 19080

accctgagtc ttatccctag aacccacata aaaaacagtt gcgtatgttt gtgcatgctt 19140

ttgatcccag cactagggag gcagaggcag gcagatcctg agctctcatt gaccacccag 19200

cctagcctac atggttagct ccaggcctac aggagctggc agagcctgaa aaacgatgcc 19260

tagacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaccat gtactcatag 19320

acctaagtgc accctcctac acatgcacac acatacaatt caaacacaaa tcaacaggga 19380

attgtctcag aatggtcccc aagacaaaga agaagaaaaa caccaaacca gctctattcc 19440

ctcagcctat cctctctact ccttcctaga agcaactact attgtttttg tatataaatt 19500

tacccaacga cagttaatat gtagaatata tattaaagtg tctgtcaata tatattatct 19560

ctttctttct ttcttccttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt 19620

ctttcttcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc ctttctttct ttctttcttt 19680

ttttctgtct atctgtacct aaatggttgc tcactatgca ttttctgtgc tcttcgccct 19740

ttttatttaa tgtatggata tttatgctgc ttccagaatg gatctaaagc tctttgtttc 19800

taggttttct cccccatcct tctaggcatc tctcacactg tctaggccag acaccatgtc 19860

tgctgcctga atctgtagac accatttata aagcacgtac tcaccgagtt tgtatttggc 19920

ttgttctgtg tctgattaaa gggagaccat gagtccccag ggtacactga gttaccccag 19980

taccaagggg gagccttgtt tgtgtctcca tggcagaagc aggcctggag ccattttggt 20040

ttcttccttg acttctctca aacacagacg cctcacttgc tcattacagg ttctcctttg 20100

ggaatgtcag cattgctcct tgactgctgg ctgccctgga aggagcccat tagctctgtg 20160

tgagcccttg acagctactg cctctcctta ccacaggggc ctctaagata ctgttaccta 20220

gaggtcttga ggatctgtgt tctctggggg gaggaaagga ggaggaaccc agaactttct 20280

tacagttttc cttgttctgt cacatgtcaa gactgaagga acaggctggg ctacgtagtg 20340

agatcctgtc tcaaaggaaa gacgagcata gccgaacccc cggtggaacc ccctctgtta 20400

cctgttcaca caagcttatt gatgagtctc atgttaatgt cttgtttgta tgaagtttaa 20460

gaaaatatcg ggttgggcaa cacattctat ttattcattt tatttgaaat cttaatgcca 20520

tctcatggtg ttggattggt gtggcacttt attcttttgt gttgtgtata accataaatt 20580

ttattttgca tcagattgtc aatgtattgc attaatttaa taaatatttt tatttattaa 20640

a 20641

<210> 5

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 5

taattggctc tactgc 16

<210> 6

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 6

tcgcataaga atgact 16

<210> 7

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 7

tgaacacaca gtcgca 16

<210> 8

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 8

ctgaacacac agtcgc 16

<210> 9

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 9

tctgaacaca cagtcg 16

<210> 10

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 10

ttctgaacac acagtc 16

<210> 11

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 11

acaagtcatg ttacta 16

<210> 12

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 12

acacaagtca tgttac 16

<210> 13

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 13

cttacttaga tgctgc 16

<210> 14

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 14

acttacttag atgctg 16

<210> 15

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 15

gacttactta gatgct 16

<210> 16

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 16

agacttactt agatgc 16

<210> 17

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 17

gcaggaagag acttac 16

<210> 18

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 18

aataaattcc gttcagg 17

<210> 19

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 19

gcaaataaat tccgtt 16

<210> 20

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 20

agcaaataaa ttccgt 16

<210> 21

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 21

cagagcaaat aaattcc 17

<210> 22

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 22

tggacagagc aaataaat 18

<210> 23

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 23

atggacagag caaata 16

<210> 24

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 24

cagaatggac agagca 16

<210> 25

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 25

ttctcagaat ggacag 16

<210> 26

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 26

ctgaactttg acatag 16

<210> 27

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 27

aagacaaacc cagactga 18

<210> 28

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 28

tataagacaa acccagac 18

<210> 29

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 29

ttataagaca aacccaga 18

<210> 30

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 30

tgttataaga caaaccc 17

<210> 31

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 31

tagaacaatg gtacttt 17

<210> 32

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 32

gtagaacaat ggtact 16

<210> 33

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 33

aggtagaaca atggta 16

<210> 34

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 34

aagaggtaga acaatgg 17

<210> 35

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 35

gcatccacag taaatt 16

<210> 36

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 36

gaaggttatt taattc 16

<210> 37

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 37

ctaatcgaat gcagca 16

<210> 38

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 38

tacccaatct aatcga 16

<210> 39

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 39

tagttaccca atctaa 16

<210> 40

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 40

catttagtta cccaat 16

<210> 41

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 41

tcatttagtt acccaa 16

<210> 42

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 42

ttcatttagt taccca 16

<210> 43

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 43

gaattaattt catttagt 18

<210> 44

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 44

cagtgaggaa ttaattt 17

<210> 45

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 45

ccaacagtga ggaatt 16

<210> 46

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 46

cccaacagtg aggaat 16

<210> 47

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 47

tatacccaac agtgagg 17

<210> 48

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 48

ttatacccaa cagtgag 17

<210> 49

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 49

tttataccca acagtga 17

<210> 50

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 50

cctttatacc caacag 16

<210> 51

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 51

taacctttat acccaa 16

<210> 52

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 52

aataaccttt ataccca 17

<210> 53

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 53

gtaaataacc tttata 16

<210> 54

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 54

actgtaaata acctttat 18

<210> 55

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 55

atatatatgc aatgag 16

<210> 56

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 56

agatatatat gcaatg 16

<210> 57

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 57

gagatatata tgcaat 16

<210> 58

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 58

ccagagatat atatgc 16

<210> 59

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 59

caatattcca gagatat 17

<210> 60

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 60

gcaatattcc agagata 17

<210> 61

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 61

agcaatattc cagagat 17

<210> 62

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 62

cagcaatatt ccagag 16

<210> 63

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 63

aatcagcaat attccag 17

<210> 64

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 64

acaatcagca atattcc 17

<210> 65

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 65

actaagtagt tacacttct 19

<210> 66

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 66

ctaagtagtt acacttc 17

<210> 67

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 67

gactaagtag ttacactt 18

<210> 68

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 68

tgactaagta gttaca 16

<210> 69

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 69

ctttgactaa gtagtta 17

<210> 70

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 70

ctctttgact aagtag 16

<210> 71

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 71

gctctttgac taagta 16

<210> 72

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 72

ccttaaatac tgttgac 17

<210> 73

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 73

cttaaatact gttgac 16

<210> 74

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 74

tccttaaata ctgttg 16

<210> 75

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 75

tctccttaaa tactgtt 17

<210> 76

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 76

tatcatagtt ctcctt 16

<210> 77

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 77

agtatcatag ttctcc 16

<210> 78

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 78

gagtatcata gttctc 16

<210> 79

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 79

agagtatcat agttct 16

<210> 80

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 80

cagagtatca tagttc 16

<210> 81

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 81

ttcagagtat catagt 16

<210> 82

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 82

cttcagagta tcatag 16

<210> 83

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 83

ttcttcagag tatcata 17

<210> 84

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 84

tttcttcaga gtatcat 17

<210> 85

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 85

gagaaaggct aagttt 16

<210> 86

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 86

gacactcttg tacatt 16

<210> 87

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 87

tgagacactc ttgtaca 17

<210> 88

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 88

tgagacactc ttgtac 16

<210> 89

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 89

ctttattaaa ctccat 16

<210> 90

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 90

accaaacttt attaaa 16

<210> 91

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 91

aaacctctac taagtg 16

<210> 92

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 92

agattaagac agttga 16

<210> 93

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 93

aagtaggagc aagaggc 17

<210> 94

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 94

aaagtaggag caagagg 17

<210> 95

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 95

gttaagcagc caggag 16

<210> 96

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 96

agggtaggat gggtag 16

<210> 97

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 97

aagggtagga tgggta 16

<210> 98

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 98

caagggtagg atgggt 16

<210> 99

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 99

ccaagggtag gatggg 16

<210> 100

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 100

tccaagggta ggatgg 16

<210> 101

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 101

cttccaaggg taggat 16

<210> 102

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 102

atcttccaag ggtagga 17

<210> 103

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 103

agaagtgatg gctcatt 17

<210> 104

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 104

aagaagtgat ggctcat 17

<210> 105

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 105

gaagaagtga tggctca 17

<210> 106

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 106

atgaaatgta aactggg 17

<210> 107

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 107

caatgaaatg taaactgg 18

<210> 108

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 108

gcaatgaaat gtaaactg 18

<210> 109

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 109

agcaatgaaa tgtaaact 18

<210> 110

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 110

gagcaatgaa atgtaaac 18

<210> 111

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 111

tgaattccca tatccga 17

<210> 112

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 112

agaattatga ccatat 16

<210> 113

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 113

aggtaagaat tatgacc 17

<210> 114

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 114

tcaggtaaga attatgac 18

<210> 115

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 115

cttcaggtaa gaattatg 18

<210> 116

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 116

tcttcaggta agaatta 17

<210> 117

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 117

cttcttcagg taagaat 17

<210> 118

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 118

tcttcttcag gtaagaa 17

<210> 119

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 119

tcttcttcag gtaaga 16

<210> 120

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 120

tggtctaaga gaagaag 17

<210> 121

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 121

gttggtctaa gagaag 16

<210> 122

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 122

agttggtcta agagaa 16

<210> 123

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 123

cagttggtct aagagaa 17

<210> 124

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 124

gcagttggtc taagagaa 18

<210> 125

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 125

cagttggtct aagaga 16

<210> 126

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 126

gcagttggtc taagaga 17

<210> 127

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 127

gcagttggtc taagag 16

<210> 128

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 128

ctcatatcag ggcagt 16

<210> 129

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 129

cacacatgtt ctttaac 17

<210> 130

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 130

taaatacaca catgttct 18

<210> 131

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 131

gtaaatacac acatgttc 18

<210> 132

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 132

tgtaaataca cacatgtt 18

<210> 133

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 133

gatcatgtaa atacacac 18

<210> 134

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 134

agatcatgta aatacaca 18

<210> 135

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 135

caaagatcat gtaaatacac 20

<210> 136

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 136

acaaagatca tgtaaataca 20

<210> 137

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 137

gaatacaaag atcatgta 18

<210> 138

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 138

agaatacaaa gatcatgt 18

<210> 139

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 139

cagaatacaa agatcatg 18

<210> 140

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 140

gcagaataca aagatca 17

<210> 141

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 141

aggcagaata caaagat 17

<210> 142

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 142

aaggcagaat acaaaga 17

<210> 143

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 143

attagtgagg gacgaa 16

<210> 144

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 144

cattagtgag ggacga 16

<210> 145

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 145

gagggtgatg gattag 16

<210> 146

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 146

ttaggagtaa taaagg 16

<210> 147

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 147

ttaatgaatt tggttg 16

<210> 148

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 148

ctttaatgaa tttggt 16

<210> 149

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 149

catggattac aactaa 16

<210> 150

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 150

tcatggatta caacta 16

<210> 151

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 151

gtcatggatt acaact 16

<210> 152

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 152

cattaaatct agtcat 16

<210> 153

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 153

gacattaaat ctagtca 17

<210> 154

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 154

agggacatta aatcta 16

<210> 155

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 155

caaagcatta taacca 16

<210> 156

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 156

acttactagg cagaag 16

<210> 157

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 157

cagagttaac tgtaca 16

<210> 158

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 158

ccagagttaa ctgtac 16

<210> 159

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 159

gccagagtta actgta 16

<210> 160

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 160

tgggccagag ttaact 16

<210> 161

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 161

cagcatctat cagact 16

<210> 162

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 162

tgaaataaca tgagtcat 18

<210> 163

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 163

gtgaaataac atgagtc 17

<210> 164

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 164

tctgtttatg tcactg 16

<210> 165

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 165

gtctgtttat gtcact 16

<210> 166

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 166

tggtctgttt atgtca 16

<210> 167

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 167

ttggtctgtt tatgtc 16

<210> 168

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 168

tcacccattg tttaaa 16

<210> 169

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 169

ttcagcaaat attcgt 16

<210> 170

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 170

gtgtgttcag caaatat 17

<210> 171

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 171

tctattgtta ggtatc 16

<210> 172

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 172

attgcccatc ttactg 16

<210> 173

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 173

tattgcccat cttact 16

<210> 174

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 174

aaatattgcc catctt 16

<210> 175

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 175

ataaccttat cataca 16

<210> 176

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 176

tataacctta tcatac 16

<210> 177

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 177

ttataacctt atcata 16

<210> 178

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 178

tttataacct tatcat 16

<210> 179

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 179

actgctattg ctatct 16

<210> 180

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 180

aggactgcta ttgcta 16

<210> 181

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 181

gaggactgct attgct 16

<210> 182

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 182

acgtagaata ataaca 16

<210> 183

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 183

ccaagtgata taatgg 16

<210> 184

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 184

ttagcagacc aagtga 16

<210> 185

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 185

gtttagcaga ccaagt 16

<210> 186

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 186

tgacagtgat tatatt 16

<210> 187

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 187

tgtccaagat attgac 16

<210> 188

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 188

gaatatccta gattgt 16

<210> 189

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 189

caaactgaga atatcc 16

<210> 190

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 190

gcaaactgag aatatc 16

<210> 191

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 191

tcctattaca atcgta 16

<210> 192

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 192

ttcctattac aatcgt 16

<210> 193

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 193

actaatggga ggattt 16

<210> 194

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 194

tagttcagag aataag 16

<210> 195

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 195

taacatatag ttcaga 16

<210> 196

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 196

ataacatata gttcag 16

<210> 197

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 197

cataacatat agttca 16

<210> 198

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 198

tcataacata tagttc 16

<210> 199

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 199

tagctcctaa caatca 16

<210> 200

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 200

ctccaatctt tgtata 16

<210> 201

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 201

tctccaatct ttgtat 16

<210> 202

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 202

tctatttcag ccaatc 16

<210> 203

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 203

cggaagtcag agtgaa 16

<210> 204

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 204

ttaagcatga ggaata 16

<210> 205

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 205

tgattgagca cctctt 16

<210> 206

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 206

gactaattat ttcgtt 16

<210> 207

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 207

tgactaatta tttcgt 16

<210> 208

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 208

gtgactaatt atttcg 16

<210> 209

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 209

ctgcttgaaa tgtgac 16

<210> 210

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 210

cctgcttgaa atgtga 16

<210> 211

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 211

atcctgcttg aaatgt 16

<210> 212

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 212

attataaatc tattct 16

<210> 213

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 213

gctaaatact ttcatc 16

<210> 214

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 214

cattgtaaca taccta 16

<210> 215

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 215

gcattgtaac atacct 16

<210> 216

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 216

taatattgca ccaaat 16

<210> 217

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 217

gataatattg caccaa 16

<210> 218

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 218

agataatatt gcacca 16

<210> 219

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 219

gccaagaaga taatat 16

<210> 220

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 220

cacagccaca taaact 16

<210> 221

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 221

ttgtaattgt ggaaac 16

<210> 222

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 222

tgacttgtaa ttgtgg 16

<210> 223

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 223

tctaactgaa atagtc 16

<210> 224

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 224

gtggttctaa ctgaaa 16

<210> 225

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 225

caatatggga cttggt 16

<210> 226

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 226

atgacaatat gggact 16

<210> 227

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 227

tatgacaata tgggac 16

<210> 228

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 228

atatgacaat atggga 16

<210> 229

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 229

cttcacttaa taatta 16

<210> 230

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 230

ctgcttcact taataa 16

<210> 231

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 231

aagactgctt cactta 16

<210> 232

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 232

gaatgcccta attatg 16

<210> 233

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 233

tggaatgccc taatta 16

<210> 234

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 234

gcaaatgcca gtaggt 16

<210> 235

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 235

ctaatggaag gatttg 16

<210> 236

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 236

aatatagaac ctaatg 16

<210> 237

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 237

gaaagaatag aatgtt 16

<210> 238

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 238

atgggtaata gattat 16

<210> 239

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 239

gaaagagcac agggtg 16

<210> 240

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 240

ctacatagag ggaatg 16

<210> 241

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 241

gcttcctaca tagagg 16

<210> 242

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 242

tgcttcctac atagag 16

<210> 243

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 243

tgggcttgaa atatgt 16

<210> 244

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 244

cattatattt aagaac 16

<210> 245

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 245

tcggttatgt tatcat 16

<210> 246

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 246

cactttatct ggtcgg 16

<210> 247

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 247

aaattggcac agcgtt 16

<210> 248

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 248

accgtgacag taaatg 16

<210> 249

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 249

tgggaaccgt gacagta 17

<210> 250

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 250

ccacatatag gtcctt 16

<210> 251

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 251

catattgcta ccatac 16

<210> 252

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 252

tcatattgct accata 16

<210> 253

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 253

caattgtcat attgct 16

<210> 254

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 254

cattcaattg tcatattg 18

<210> 255

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 255

tttctactgg gaatttg 17

<210> 256

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 256

caattagtgc agccag 16

<210> 257

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 257

gaataatgtt cttatcc 17

<210> 258

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 258

cacaaattga ataatgttct 20

<210> 259

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 259

catgcacaaa ttgaataat 19

<210> 260

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 260

atcctgcaat ttcacat 17

<210> 261

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 261

ccaccatagc tgatca 16

<210> 262

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 262

accaccatag ctgatca 17

<210> 263

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 263

caccaccata gctgatc 17

<210> 264

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 264

tagtcggcac caccat 16

<210> 265

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 265

cttgtagtcg gcaccac 17

<210> 266

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 266

cttgtagtcg gcacca 16

<210> 267

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 267

cgcttgtagt cggcac 16

<210> 268

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 268

tcaataaaga tcaggc 16

<210> 269

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 269

tggacttaca agaatg 16

<210> 270

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 270

atggacttac aagaat 16

<210> 271

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 271

gctcaagaaa ttggat 16

<210> 272

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 272

tactgtagaa catggc 16

<210> 273

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 273

gcaattcatt tgatct 16

<210> 274

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 274

tgaagggagg agggacac 18

<210> 275

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 275

agtggtgaag ggaggag 17

<210> 276

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 276

tagtggtgaa gggaggag 18

<210> 277

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 277

atagtggtga agggaggag 19

<210> 278

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 278

tagtggtgaa gggagga 17

<210> 279

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 279

atagtggtga agggagga 18

<210> 280

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 280

tagtggtgaa gggagg 16

<210> 281

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 281

atagtggtga agggagg 17

<210> 282

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 282

gatagtggtg aagggagg 18

<210> 283

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 283

atagtggtga agggag 16

<210> 284

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 284

gatagtggtg aagggag 17

<210> 285

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 285

gagatagtgg tgaagg 16

<210> 286

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 286

catgggagat agtggt 16

<210> 287

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 287

acaaataatg gttactct 18

<210> 288

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 288

acacacaaat aatggtta 18

<210> 289

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 289

gagggacaca caaataat 18

<210> 290

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 290

atatagagag gctcaa 16

<210> 291

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 291

ttgatataga gaggct 16

<210> 292

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 292

gcatttgata tagaga 16

<210> 293

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 293

tttgcatttg atatag 16

<210> 294

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 294

ctggaagaat aggttc 16

<210> 295

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 295

actggaagaa taggtt 16

<210> 296

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 296

tactggaaga ataggt 16

<210> 297

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 297

tggcttatcc tgtact 16

<210> 298

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 298

atggcttatc ctgtac 16

<210> 299

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 299

tatggcttat cctgta 16

<210> 300

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 300

gtatggctta tcctgt 16

<210> 301

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 301

atgaatatat gcccagt 17

<210> 302

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 302

gatgaatata tgccca 16

<210> 303

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 303

caagatgaat atatgcc 17

<210> 304

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 304

gacaacatca gtataga 17

<210> 305

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 305

caagacaaca tcagta 16

<210> 306

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 306

cactcctagt tccttt 16

<210> 307

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 307

aacactccta gttcct 16

<210> 308

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 308

taacactcct agttcc 16

<210> 309

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 309

ctaacactcc tagttc 16

<210> 310

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 310

tgataacata actgtg 16

<210> 311

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 311

ctgataacat aactgt 16

<210> 312

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 312

tttgaactca agtgac 16

<210> 313

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 313

tcctttactt agctag 16

<210> 314

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 314

gagtttggat tagctg 16

<210> 315

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 315

tgggatatga caggga 16

<210> 316

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 316

tgtgggatat gacagg 16

<210> 317

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 317

atatggaagg gatatc 16

<210> 318

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 318

acaggatatg gaaggg 16

<210> 319

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 319

atttcaacag gatatgg 17

<210> 320

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 320

gagtaatttc aacagg 16

<210> 321

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 321

agggagtaat ttcaaca 17

<210> 322

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 322

attagggagt aatttca 17

<210> 323

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 323

cttactatta gggagt 16

<210> 324

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 324

cagcttacta ttaggg 16

<210> 325

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 325

tcagcttact attagg 16

<210> 326

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 326

atttcagctt actattag 18

<210> 327

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 327

ttcagcttac tattag 16

<210> 328

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 328

cagatttcag cttact 16

<210> 329

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 329

gactacaact agaggg 16

<210> 330

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 330

agactacaac tagagg 16

<210> 331

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 331

aagactacaa ctagag 16

<210> 332

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 332

atgatttaat tctagtcaaa 20

<210> 333

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 333

tttaattcta gtcaaa 16

<210> 334

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 334

gatttaattc tagtca 16

<210> 335

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 335

atgatttaat tctagtca 18

<210> 336

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 336

gatgatttaa ttctagtca 19

<210> 337

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 337

gatttaattc tagtca 16

<210> 338

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 338

gatgatttaa ttctagtc 18

<210> 339

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 339

tgatttaatt ctagtc 16

<210> 340

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 340

gagatgattt aattcta 17

<210> 341

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 341

gagatgattt aattct 16

<210> 342

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 342

cagattgatg gtagtt 16

<210> 343

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 343

ctcagattga tggtag 16

<210> 344

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 344

gttagccctc agattg 16

<210> 345

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 345

tgtattgtta gccctc 16

<210> 346

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 346

acttgtattg ttagcc 16

<210> 347

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 347

agccagtatc agggac 16

<210> 348

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 348

ttgacaatag tggcat 16

<210> 349

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 349

acaagtggta tcttct 16

<210> 350

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 350

aatctacttt acaagt 16

<210> 351

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 351

cacagtagat gcctgata 18

<210> 352

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 352

gaacacagta gatgcc 16

<210> 353

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 353

cttggaacac agtagat 17

<210> 354

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 354

atatcttgga acacag 16

<210> 355

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 355

tctttaatat cttggaac 18

<210> 356

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 356

tgatttcttt aatatcttg 19

<210> 357

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 357

tgatgatttc tttaatatc 19

<210> 358

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 358

aggctaagtc atgatg 16

<210> 359

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 359

ttgatgaggc taagtc 16

<210> 360

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 360

ccaggattat actctt 16

<210> 361

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 361

gccaggatta tactct 16

<210> 362

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 362

ctgccaggat tatact 16

<210> 363

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 363

cagaaactta tactttatg 19

<210> 364

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 364

aagcagaaac ttatact 17

<210> 365

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 365

gaagcagaaa cttatact 18

<210> 366

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 366

tggaagcaga aacttatact 20

<210> 367

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 367

tggaagcaga aacttatac 19

<210> 368

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 368

aagcagaaac ttatac 16

<210> 369

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 369

tggaagcaga aacttata 18

<210> 370

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 370

aagggatatt atggag 16

<210> 371

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 371

tgccggaaga tttcct 16

<210> 372

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 372

atggattggg agtaga 16

<210> 373

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 373

agatggattg ggagta 16

<210> 374

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 374

aagatggatt gggagt 16

<210> 375

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 375

acaagatgga ttggga 16

<210> 376

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 376

agaaggttca gacttt 16

<210> 377

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 377

gcagaaggtt cagact 16

<210> 378

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 378

tgcagaaggt tcagac 16

<210> 379

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 379

agtgcagaag gttcag 16

<210> 380

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 380

aagtgcagaa ggttca 16

<210> 381

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 381

taagtgcaga aggttc 16

<210> 382

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 382

tctaagtgca gaaggt 16

<210> 383

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 383

ctcaggagtt ctacttc 17

<210> 384

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 384

ctcaggagtt ctactt 16

<210> 385

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 385

atggaggtga ctcaggag 18

<210> 386

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 386

atggaggtga ctcagga 17

<210> 387

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 387

atggaggtga ctcagg 16

<210> 388

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 388

tatggaggtg actcagg 17

<210> 389

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 389

atatggaggt gactcagg 18

<210> 390

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 390

tatggaggtg actcag 16

<210> 391

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 391

atatggaggt gactcag 17

<210> 392

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 392

catatggagg tgactcag 18

<210> 393

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 393

atatggaggt gactca 16

<210> 394

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 394

catatggagg tgactca 17

<210> 395

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 395

catatggagg tgactc 16

<210> 396

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 396

gcatatggag gtgactc 17

<210> 397

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 397

tgcatatgga ggtgactc 18

<210> 398

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 398

ttgcatatgg aggtgactc 19

<210> 399

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 399

tttgcatatg gaggtgactc 20

<210> 400

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 400

gcatatggag gtgact 16

<210> 401

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 401

tgcatatgga ggtgact 17

<210> 402

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 402

ttgcatatgg aggtgact 18

<210> 403

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 403

tttgcatatg gaggtgact 19

<210> 404

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 404

tgcatatgga ggtgac 16

<210> 405

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 405

ttgcatatgg aggtgac 17

<210> 406

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 406

tttgcatatg gaggtgac 18

<210> 407

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 407

tttgcatatg gaggtga 17

<210> 408

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 408

tttgcatatg gaggtg 16

<210> 409

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 409

aagtgaagtt caacagc 17

<210> 410

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 410

tgggaagtga agttca 16

<210> 411

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 411

atgggaagtg aagttc 16

<210> 412

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 412

gatgggaagt gaagtt 16

<210> 413

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 413

ctgtgatggg aagtgaa 17

<210> 414

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 414

attgagtgaa tccaaa 16

<210> 415

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 415

aattgagtga atccaa 16

<210> 416

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 416

gataattgag tgaatcc 17

<210> 417

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 417

gtgataattg agtgaa 16

<210> 418

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 418

aagaaaggtg caataa 16

<210> 419

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 419

caagaaaggt gcaata 16

<210> 420

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 420

acaagaaagg tgcaat 16

<210> 421

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 421

atttaaactc acaaac 16

<210> 422

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 422

ctgttaggtt cagcga 16

<210> 423

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 423

tctgaatgaa catttcg 17

<210> 424

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 424

ctcattgaag gttctg 16

<210> 425

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 425

ctaatctcat tgaagg 16

<210> 426

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 426

cctaatctca ttgaag 16

<210> 427

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 427

actttgatct ttcagc 16

<210> 428

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 428

actatgcaac actttg 16

<210> 429

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 429

caaatagctt tatcgg 16

<210> 430

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 430

ccaaatagct ttatcg 16

<210> 431

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 431

tccaaatagc tttatc 16

<210> 432

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 432

gatccaaata gcttta 16

<210> 433

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 433

atgatccaaa tagctt 16

<210> 434

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 434

tatgatccaa atagct 16

<210> 435

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 435

taaacagggc tgggaat 17

<210> 436

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 436

acttaaacag ggctgg 16

<210> 437

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 437

acacttaaac agggct 16

<210> 438

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 438

gaacacttaa acaggg 16

<210> 439

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 439

agagaacact taaacag 17

<210> 440

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 440

ctacagagaa cactta 16

<210> 441

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 441

atgctacaga gaacact 17

<210> 442

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 442

ataaatgcta cagagaaca 19

<210> 443

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 443

agataaatgc tacagaga 18

<210> 444

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 444

tagagataaa tgctaca 17

<210> 445

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 445

tagatagaga taaatgct 18

<210> 446

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 446

caatatacta gatagaga 18

<210> 447

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 447

tacacaatat actagatag 19

<210> 448

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 448

ctacacaata tactag 16

<210> 449

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 449

gctacacaat atacta 16

<210> 450

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 450

atatgctaca caatatac 18

<210> 451

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 451

tgatatgcta cacaat 16

<210> 452

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 452

atgatatgat atgctac 17

<210> 453

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 453

gaggagagag acaataaa 18

<210> 454

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 454

ctaggaggag agagaca 17

<210> 455

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 455

tattctagga ggagaga 17

<210> 456

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 456

ttatattcta ggaggag 17

<210> 457

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 457

gtttatattc taggag 16

<210> 458

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 458

tggagtttat attctagg 18

<210> 459

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 459

cgtaccacca ctctgc 16

<210> 460

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 460

tgaggaaatc attcattc 18

<210> 461

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 461

tttgaggaaa tcattcat 18

<210> 462

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 462

aggctaatcc tatttg 16

<210> 463

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 463

tttaggctaa tcctat 16

<210> 464

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 464

tgctccagtg taccct 16

<210> 465

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 465

tagtagtact cgatag 16

<210> 466

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 466

ctaattgtag tagtactc 18

<210> 467

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 467

tgctaattgt agtagt 16

<210> 468

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 468

agtgctaatt gtagta 16

<210> 469

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 469

gcaagtgcta attgta 16

<210> 470

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 470

gaggaaatga actaattta 19

<210> 471

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 471

caggaggaaa tgaacta 17

<210> 472

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 472

ccctagagtc atttcc 16

<210> 473

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 473

atcttacatg atgaagc 17

<210> 474

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 474

gacacactca gatttcag 18

<210> 475

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 475

agacacactc agatttcag 19

<210> 476

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 476

aagacacact cagatttcag 20

<210> 477

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 477

agacacactc agatttca 18

<210> 478

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 478

aagacacact cagatttca 19

<210> 479

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 479

aaagacacac tcagatttca 20

<210> 480

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 480

gaaagacaca ctcagatttc 20

<210> 481

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 481

aagacacact cagatttc 18

<210> 482

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 482

aaagacacac tcagatttc 19

<210> 483

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 483

tgaaagacac actcagattt 20

<210> 484

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 484

tgaaagacac actcagatt 19

<210> 485

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 485

tgaaagacac actcagat 18

<210> 486

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 486

attgaaagac acactca 17

<210> 487

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 487

tcattgaaag acacact 17

<210> 488

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 488

ttccatcatt gaaaga 16

<210> 489

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 489

ataataccac ttatcat 17

<210> 490

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 490

ttacttaatt tctttgga 18

<210> 491

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 491

ttagaactag ctttatca 18

<210> 492

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 492

gaggtacaaa tatagg 16

<210> 493

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 493

cttatgatac aactta 16

<210> 494

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 494

tcttatgata caactt 16

<210> 495

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 495

ttcttatgat acaact 16

<210> 496

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 496

cagtttctta tgatac 16

<210> 497

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 497

gcagtttctt atgata 16

<210> 498

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 498

tacaaatgtc tattaggtt 19

<210> 499

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 499

tgtacaaatg tctattag 18

<210> 500

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 500

agcatcacaa ttagta 16

<210> 501

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 501

ctaatgatag tgaagc 16

<210> 502

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 502

agctaatgat agtgaa 16

<210> 503

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 503

atgccttgac atatta 16

<210> 504

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 504

ctcaagatta ttgacac 17

<210> 505

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 505

acctcaagat tattga 16

<210> 506

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 506

aacctcaaga ttattg 16

<210> 507

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 507

cacaaacctc aagattatt 19

<210> 508

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 508

gtacttaatt agacct 16

<210> 509

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 509

agtacttaat tagacc 16

<210> 510

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 510

gtatgaggtg gtaaac 16

<210> 511

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 511

aggaaacagc agaagtg 17

<210> 512

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 512

gcacaaccca gaggaa 16

<210> 513

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 513

caagcacaac ccagag 16

<210> 514

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 514

ttcaagcaca acccag 16

<210> 515

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 515

aattcaagca caaccc 16

<210> 516

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 516

taataattca agcacaacc 19

<210> 517

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 517

actaataatt caagcac 17

<210> 518

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 518

ataatactaa taattcaagc 20

<210> 519

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 519

tagatttgtg aggtaa 16

<210> 520

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 520

agccttaatt ctccat 16

<210> 521

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 521

aatgatctag agcctta 17

<210> 522

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 522

ctaatgatct agagcc 16

<210> 523

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 523

actaatgatc tagagc 16

<210> 524

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 524

cattaacatg ttcttatt 18

<210> 525

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 525

acaagtacat taacatgttc 20

<210> 526

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 526

ttacaagtac attaacatg 19

<210> 527

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 527

gctttattca tgtttat 17

<210> 528

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 528

gctttattca tgttta 16

<210> 529

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 529

agagctttat tcatgttt 18

<210> 530

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 530

ataagagctt tattcatg 18

<210> 531

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 531

cataagagct ttattca 17

<210> 532

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 532

agcataagag ctttat 16

<210> 533

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 533

tagattgttt agtgca 16

<210> 534

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 534

gtagattgtt tagtgc 16

<210> 535

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 535

gacaattcta gtagatt 17

<210> 536

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 536

ctgacaattc tagtag 16

<210> 537

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 537

gctgacaatt ctagta 16

<210> 538

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 538

aggattaaga tacgta 16

<210> 539

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 539

caggattaag atacgt 16

<210> 540

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 540

tcaggattaa gatacg 16

<210> 541

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 541

ttcaggatta agatac 16

<210> 542

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 542

aggaagaaag tttgattc 18

<210> 543

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 543

tcaaggaaga aagtttga 18

<210> 544

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 544

ctcaaggaag aaagtttg 18

<210> 545

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 545

tgctcaagga agaaagt 17

<210> 546

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 546

aattatgctc aaggaaga 18

<210> 547

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 547

taggatacca cattatga 18

<210> 548

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 548

cataatttat tccattcctc 20

<210> 549

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 549

tgcataattt attccat 17

<210> 550

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 550

actgcataat ttattcc 17

<210> 551

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 551

ctaaactgca taatttatt 19

<210> 552

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 552

ataactaaac tgcata 16

<210> 553

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 553

ttattaataa ctaaactgc 19

<210> 554

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 554

tagtacatta ttaataact 19

<210> 555

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 555

cataactaag gacgtt 16

<210> 556

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 556

tcataactaa ggacgt 16

<210> 557

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 557

cgtcataact aaggac 16

<210> 558

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 558

tcgtcataac taagga 16

<210> 559

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 559

atcgtcataa ctaagg 16

<210> 560

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 560

gttagtatct tacatt 16

<210> 561

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 561

ctctattgtt agtatc 16

<210> 562

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 562

agtatagagt tactgt 16

<210> 563

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 563

ttcctggtga tacttt 16

<210> 564

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 564

gttcctggtg atactt 16

<210> 565

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 565

tgttcctggt gatact 16

<210> 566

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 566

ataaacatga atctctcc 18

<210> 567

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 567

ctttataaac atgaatctc 19

<210> 568

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 568

ctgtctttat aaacatg 17

<210> 569

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 569

ttgttataaa tctgtctt 18

<210> 570

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 570

ttaaatttat tcttggata 19

<210> 571

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 571

cttaaattta ttcttgga 18

<210> 572

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 572

cttcttaaat ttattcttg 19

<210> 573

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 573

tatgtttctc agtaaag 17

<210> 574

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 574

gaattatctt taaacca 17

<210> 575

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 575

cccttaaatt tctaca 16

<210> 576

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 576

acactgctct tgtacc 16

<210> 577

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 577

tgacaacact gctctt 16

<210> 578

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 578

tacatttatt gggctc 16

<210> 579

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 579

gtacatttat tgggct 16

<210> 580

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 580

ttggtacatt tattgg 16

<210> 581

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 581

catgttggta catttat 17

<210> 582

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 582

aatcatgttg gtacat 16

<210> 583

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 583

aaatcatgtt ggtaca 16

<210> 584

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 584

gacaagtttg gattaa 16

<210> 585

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 585

aatgttcaga tgcctc 16

<210> 586

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 586

gcttaatgtt cagatg 16

<210> 587

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 587

cgtacatagc ttgatg 16

<210> 588

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 588

gtgaggaatt aggata 16

<210> 589

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 589

gtaacaatat ggtttg 16

<210> 590

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 590

gaaatattgt agacta 16

<210> 591

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 591

ttgaaatatt gtagac 16

<210> 592

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 592

aagtctagta atttgc 16

<210> 593

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 593

gctcagtaga ttataa 16

<210> 594

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 594

catacactgt tgctaa 16

<210> 595

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 595

atggtctcaa atcatt 16

<210> 596

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 596

caatggtctc aaatca 16

<210> 597

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 597

ttcctattga ttgact 16

<210> 598

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 598

tttctgttca caacac 16

<210> 599

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 599

aggaacccac taatct 16

<210> 600

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 600

taaatggcag gaaccc 16

<210> 601

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 601

gtaaatggca ggaacc 16

<210> 602

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 602

ttgtaaatgg caggaa 16

<210> 603

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 603

ttatgagtta ggcatg 16

<210> 604

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 604

ccaggtgaaa ctttaa 16

<210> 605

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 605

cccttagtca gctcct 16

<210> 606

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 606

acccttagtc agctcc 16

<210> 607

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 607

cacccttagt cagctc 16

<210> 608

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 608

tctcttacta ggctcc 16

<210> 609

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 609

cctatctgtc atcatg 16

<210> 610

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 610

tcctatctgt catcat 16

<210> 611

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 611

gagaagtgtg agaagc 16

<210> 612

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 612

catccttgaa gtttag 16

<210> 613

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 613

taataagatg gctccc 16

<210> 614

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 614

caaggcataa taagat 16

<210> 615

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 615

ccaaggcata ataaga 16

<210> 616

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 616

tgatccaatt ctcacc 16

<210> 617

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 617

atgatccaat tctcac 16

<210> 618

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 618

cgcttcatct tcaccc 16

<210> 619

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 619

tatgacactg catctt 16

<210> 620

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 620

gtatgacact gcatct 16

<210> 621

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 621

tgtatgacac tgcatc 16

<210> 622

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 622

ttctcttctg taagtc 16

<210> 623

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 623

ttctacagag gaacta 16

<210> 624

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 624

actacagttc tacaga 16

<210> 625

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 625

ttcccacagg taaatg 16

<210> 626

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 626

attatttgaa tatactcatt 20

<210> 627

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 627

tgggaggaaa ttatttg 17

<210> 628

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 628

tgactcatct taaatg 16

<210> 629

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 629

ctgactcatc ttaaat 16

<210> 630

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 630

tttactctga ctcatc 16

<210> 631

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 631

tattggagga attatt 16

<210> 632

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 632

gtattggagg aattat 16

<210> 633

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 633

tggtatactt ctctaagtat 20

<210> 634

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 634

gatctcttgg tatact 16

<210> 635

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 635

cagacaactc tatacc 16

<210> 636

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 636

aacatcagac aactcta 17

<210> 637

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 637

tttaacatca gacaactc 18

<210> 638

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 638

taacatcaga caactc 16

<210> 639

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 639

atttaacatc agacaa 16

<210> 640

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 640

cctatttaac atcagac 17

<210> 641

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 641

tccctattta acatca 16

<210> 642

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 642

tcaacgacta ttggaat 17

<210> 643

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 643

cttatattct ggctat 16

<210> 644

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 644

atccttatat tctggc 16

<210> 645

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 645

gatccttata ttctgg 16

<210> 646

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 646

tgatccttat attctg 16

<210> 647

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 647

attgaaactt gatcct 16

<210> 648

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 648

actgtcattg aaactt 16

<210> 649

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 649

tcttactgtc attgaa 16

<210> 650

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 650

aggatcttac tgtcatt 17

<210> 651

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 651

gcaaatcaac tccatc 16

<210> 652

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 652

gtgcaaatca actcca 16

<210> 653

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 653

caattatttc tttgtgc 17

<210> 654

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 654

tggcaacaat tatttctt 18

<210> 655

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 655

gctggcaaca attatt 16

<210> 656

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 656

atccatttct actgcc 16

<210> 657

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 657

taatatctat tgatttcta 19

<210> 658

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 658

tcaatagtgt agggca 16

<210> 659

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 659

ttcaatagtg tagggc 16

<210> 660

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 660

aggttaatta attcaatag 19

<210> 661

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 661

catttgtaat ccctag 16

<210> 662

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 662

acatttgtaa tcccta 16

<210> 663

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 663

aacatttgta atccct 16

<210> 664

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 664

taaatttcaa gttctg 16

<210> 665

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 665

gtttaaattt caagttct 18

<210> 666

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 666

ccaagtttaa atttcaag 18

<210> 667

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 667

acccaagttt aaatttc 17

<210> 668

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 668

catacagtga cccaagttt 19

<210> 669

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 669

acatcccata cagtga 16

<210> 670

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 670

agcacagctc tacatc 16

<210> 671

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 671

atatagcaca gctcta 16

<210> 672

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 672

tccatatagc acagct 16

<210> 673

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 673

atttccatat agcaca 16

<210> 674

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 674

tttatttcca tatagca 17

<210> 675

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 675

tttatttcca tatagc 16

<210> 676

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 676

aaggagagga gattatg 17

<210> 677

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 677

agttcttgtg ttagct 16

<210> 678

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 678

gagttcttgt gttagc 16

<210> 679

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 679

attaattatc catccac 17

<210> 680

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 680

atcaattaat tatccatc 18

<210> 681

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 681

agaatcaatt aattatcc 18

<210> 682

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 682

tgagataccg tgcatg 16

<210> 683

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 683

aatgagatac cgtgca 16

<210> 684

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 684

ctgtggttag gctaat 16

<210> 685

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 685

aagagtaagg gtctgtggtt 20

<210> 686

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 686

gatgggttaa gagtaa 16

<210> 687

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 687

agcagatggg ttaaga 16

<210> 688

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 688

tgtaaacatt tgtagc 16

<210> 689

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 689

cctgcttata aatgta 16

<210> 690

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 690

tgccctgctt ataaat 16

<210> 691

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 691

tcttcttagt tcaata 16

<210> 692

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 692

tggtttctaa ctacat 16

<210> 693

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 693

agtttggttt ctaacta 17

<210> 694

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 694

gaatgaaact tgcctg 16

<210> 695

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 695

attatcctta catgat 16

<210> 696

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 696

gtacccaatt atcctt 16

<210> 697

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 697

tgtacccaat tatcct 16

<210> 698

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 698

ttgtacccaa ttatcc 16

<210> 699

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 699

tttgtaccca attatc 16

<210> 700

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 700

agcagcaggt tatatt 16

<210> 701

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 701

tgggaagtgg tctggg 16

<210> 702

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 702

ctggagagtg ataata 16

<210> 703

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 703

aatgctggat tacgtc 16

<210> 704

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 704

caatgctgga ttacgt 16

<210> 705

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 705

ttgttcagaa gtatcc 16

<210> 706

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 706

gatgatttgc ttggag 16

<210> 707

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 707

gaaatcattc acaacc 16

<210> 708

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 708

ttgtaacatc tactac 16

<210> 709

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 709

cattaagcag caagtt 16

<210> 710

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 710

ttactagatg tgagca 16

<210> 711

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 711

tttactagat gtgagc 16

<210> 712

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 712

gaccaagcac cttaca 16

<210> 713

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 713

agaccaagca ccttac 16

<210> 714

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 714

atgggttaaa taaagg 16

<210> 715

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 715

tcaaccagag tattaa 16

<210> 716

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 716

gtcaaccaga gtatta 16

<210> 717

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 717

attgtaaagc tgatat 16

<210> 718

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 718

cacataattg taaagc 16

<210> 719

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 719

gaggtctgct atttac 16

<210> 720

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 720

tgtagattca atgcct 16

<210> 721

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 721

cctcattata ctatga 16

<210> 722

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 722

ccttatgcta tgacac 16

<210> 723

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 723

tccttatgct atgaca 16

<210> 724

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 724

aagatgttta agtata 16

<210> 725

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 725

ctgattatta agatgt 16

<210> 726

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 726

tggaaaggta tgaatt 16

<210> 727

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 727

acttgaatgg cttgga 16

<210> 728

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 728

aacttgaatg gcttgg 16

<210> 729

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 729

caatgtgtta ctattt 16

<210> 730

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 730

acaatgtgtt actatt 16

<210> 731

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 731

catctgctat ataaga 16

<210> 732

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 732

cctagagcaa atactt 16

<210> 733

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 733

cagagttaat aataag 16

<210> 734

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 734

gttcaagcac aacgaa 16

<210> 735

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 735

agggttcaag cacaac 16

<210> 736

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 736

tgttggagac actgtt 16

<210> 737

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 737

aaggaggagt taggac 16

<210> 738

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 738

ctatgccatt tacgat 16

<210> 739

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 739

tcaaatgcag aattag 16

<210> 740

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 740

agtgacaatc aaatgc 16

<210> 741

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 741

aagtgacaat caaatg 16

<210> 742

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 742

gtgtaccaag taacaa 16

<210> 743

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 743

tgggatgtta aactga 16

<210> 744

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 744

agtttacatt ttctgc 16

<210> 745

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 745

tatgtgaaga ggagag 16

<210> 746

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 746

cacctttaaa acccca 16

<210> 747

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 747

tcctttataa tcacac 16

<210> 748

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 748

acggtatttt cacagg 16

<210> 749

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 749

gacactacaa tgagga 16

<210> 750

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 750

tggtttttag gactgt 16

<210> 751

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 751

cgacaaattc tatcct 16

<210> 752

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 752

tgatatacaa tgctac 16

<210> 753

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 753

tcgttgggta aattta 16

<210> 754

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 754

tgctttataa atggtg 16

<210> 755

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 755

caagtttaca ttttctgc 18

<210> 756

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 756

catatgtgaa gaggagag 18

<210> 757

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 757

cacctttaaa acccca 16

<210> 758

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 758

catcctttat aatcacac 18

<210> 759

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 759

caacggtatt ttcacagg 18

<210> 760

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 760

cagacactac aatgagga 18

<210> 761

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 761

catggttttt aggactgt 18

<210> 762

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 762

cacgacaaat tctatcct 18

<210> 763

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 763

catgatatac aatgctac 18

<210> 764

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 764

catcgttggg taaattta 18

<210> 765

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 765

catgctttat aaatggtg 18

<210> 766

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 766

caacaaataa tggttactct 20

<210> 767

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 767

cacagattga tggtagtt 18

<210> 768

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 768

cacctattta acatcagac 19

<210> 769

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 769

cactaattgt agtagtactc 20

<210> 770

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 770

caataaacat gaatctctcc 20

<210> 771

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный мотив

<400> 771

tgatttaatt ctagtca 17

<210> 772

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень

<400> 772

gcagtagagc caatta 16

<210> 773

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 773

Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val

1 5 10

<210> 774

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 774

Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp

1 5 10 15

<210> 775

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 775

Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu

1 5 10 15

<210> 776

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 776

Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser

1 5 10 15

<210> 777

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 777

Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile

1 5

<210> 778

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 778

Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln

1 5 10 15

<210> 779

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 779

Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu

1 5

<210> 780

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 780

Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val

1 5

<210> 781

<211> 21

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 781

Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr

1 5 10 15

Val Trp Leu Ser Val

20

<210> 782

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 782

Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val

1 5 10

<210> 783

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Эпитоп HBV

<400> 783

Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu

1 5 10

<210> 784

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Праймер

<400> 784

ctgtgccttg ggtggcttt 19

<210> 785

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Праймер

<400> 785

aaggaaagaa gtcagaaggc aaaa 24

<210> 786

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Праймер

<400> 786

ttctttataa gggtcgatgt ccatg 25

<---

1. Антисмысловой олигонуклеотид для снижения экспрессии лиганда-1 запрограммированной смерти (PD-L1), где антисмысловой олигонуклеотид имеет формулу CCtatttaacatcAGAC, где заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, а все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.

2. Конъюгат антисмыслового олигонуклеотида для снижения экспрессии PD-L1, содержащий олигонуклеотид по п. 1 и конъюгатную группировку, ковалентно присоединенную к указанному олигонуклеотиду, где конъюгатная группировка представляет собой группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина, где группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, представляет собой трехвалентную N-ацетилгалактозаминную (GalNAc) группировку.

3. Конъюгат антисмыслового олигонуклеотида по п. 2, где присутствует линкер между указанным олигонуклеотидом и указанной конъюгатной группировкой, где указанный линкер представляет собой физиологически лабильный, нуклеазочувствительный линкер, содержащий динуклеотид цитидин-аденозин.

4. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV; паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз; или рака печени или метастазов в печени, содержащая антисмысловой олигонуклеотид по п. 1 или конъюгат антисмыслового олигонуклеотида по п. 2 или 3 и фармацевтически приемлемый разбавитель, растворитель, носитель и/или адъювант.

5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой стерильный фосфатно-солевой буферный раствор.

6. Способ in vivo или in vitro снижения экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспрессирует PD-L1, причем указанный способ включает введение в указанную клетку антисмыслового олигонуклеотида по п. 1, конъюгата олигонуклеотида по п. 2 или 3 или фармацевтической композиции по п. 4 или 5 в эффективном количестве.

7. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 1, конъюгат антисмыслового олигонуклеотида по п. 2 или 3 или фармацевтическая композиция по п. 4 или 5 для применения в восстановлении иммунного ответа против вирусных инфекций печени, таких как HBV, HCV и HDV.

8. Антисмысловой олигонуклеотид, конъюгат антисмыслового олигонуклеотида или фармацевтическая композиция для применения по п. 7, где вирус представляет собой HBV.

9. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 1, конъюгат антисмыслового олигонуклеотида по п. 2 или 3 или фармацевтическая композиция по п. 4 или 5 для применения в восстановлении иммунного ответа против паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз.

10. Антисмысловой олигонуклеотид, конъюгат антисмыслового олигонуклеотида или фармацевтическая композиция для применения по любому из пп. 7-9, где восстановление иммунного ответа представляет собой увеличение в печени уровня Т-клеток CD8+, специфичных в отношении одного или более чем одного антигена HBV, по сравнению с контролем.

11. Антисмысловой олигонуклеотид по п. 1, конъюгат антисмыслового олигонуклеотида по п. 2 или 3 или фармацевтическая композиция по п. 4 или 5 для применения в лечении инфекции HBV.

12. Применение антисмыслового олигонуклеотида по п. 1, конъюгата антисмыслового олигонуклеотида по п. 2 или 3 или фармацевтической композиции по п. 4 или 5 для получения лекарственного средства для лечения инфекции HBV.

13. Способ лечения или предупреждения заболевания, где указанное заболевание представляет собой вирусную инфекцию печени, такую как HBV, HCV и HDV, паразитарную инфекцию, такую как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, или рак печени или метастазы в печени, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества антисмыслового олигонуклеотида по п. 1, конъюгата антисмыслового олигонуклеотида по п. 2 или 3 или фармацевтической композиции по п. 4 или 5 субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.

14. Способ лечения или предупреждения инфекции HBV, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества антисмыслового олигонуклеотида по п. 1, конъюгата антисмыслового олигонуклеотида по п. 2 или 3 или фармацевтической композиции по п. 4 или 5 субъекту, страдающему от или восприимчивому к инфекции HBV.