Пэгилированные биологически активные пептиды и их применение

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к ПЭГилированным аналогам гормона высвобождения гормона роста (GHRH), и может быть использовано в медицине для терапии и диагностики состояния, связанного с дефицитом гормона роста. Предложен аналог GHRH формулы X1-X2-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-X8-X9-Tyr-X11-X12-Val-Leu-X15-Gln-Leu-X18-Ala-X20-X21-X22-Leu-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30, включающий Cys в положении X9, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа. Также аналог может быть ПЭГилирован в 22, 24 и 28 положении. Изобретение обеспечивает получение аналога GHRH с усиленной биологической активностью. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 пр., 2 ил.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США 62/324,600, поданной 19 апреля 2016 г., включенной в настоящее описание во всей своей полноте в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к биологически активным пептидам, конъюгированным с полиэтиленгликолем, и их применению.

ССЫЛКИ НА СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Согласно ст. 37 C.F.R. 1.821(c), к настоящему документу прилагается текстовый файл в формате, совместимом с ASCII, названный ʺSequence_Listing.txtʺ, который был создан 18 апреля 2017 г., размером примерно 26000 бит. Содержание вышеуказанного файла с названием ʺSequence_Listing.txtʺ включено в настоящее описание во всей своей полноте в виде ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гормон высвобождения гормона роста (GHRH), также известный как фактор высвобождения гормона роста (GRF или GHRF), представляет собой пептид из 44 аминокислот, секретируемый нейронами, иннервирующими переднюю долю гипофиза, и вызывающий секрецию гормона роста (ГР, также известного как соматотропин) соматотропными клетками. Было установлено, что минимальная биологически активная конформация пептида GHRH находится в первых 29 аминокислотах пептида полной длины (Frohman et al., 1986a), хотя слабая биологическая активность может наблюдаться у GHRH (1-21) (Ling et al., 1984a); было обнаружено, что пептиды GHRH длиной менее 21 аминокислоты являются неактивными. ГР является физиологическим анаболическим агентом, который участвует в усилении линейного роста, увеличении мышечной, костной и хрящевой массы и уменьшении жировой массы. Известно, что дефицит ГР или снижение секреции ГР связано с низким ростом у детей, увеличением жира, особенно в глубоких абдоминальных отложениях, и повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний.

Терапевтическая польза GHRH заключается в протеолитической лабильности пептида; GHRH быстро инактивируется in vivo дипептидилпептидазой IV (DPPIV) через расщепление связи между Ala2-Asp3 (Frohman et al., 1986b) и другими протеазами путем расщепления связи между Arg11-Lys12 и Lys12-Val13 (Frohman et al., 1989). Для получения протеолитически стабильных аналогов GHRH были использованы различные подходы, в том числе аминокислотные замены, циклизация боковых цепей аминокислот и модификация синтетических полимеров и жирных кислот.

Настоящее описание содержит ссылки на ряд документов, содержание которых включено в настоящее описание во всей их полноте в виде ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к биологически активным пептидам, конъюгированным с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как аналоги GHRH с присоединенным одним или более фрагментами ПЭГ, и их применению.

В одном из аспектов предоставляется аналог гормона высвобождения гормона роста (GHRH), включающий пептид, имеющий последовательность, приведенную в формуле (I) (SEQ ID NO: 1):

X1-X2-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-X8-X9-Tyr-X11-X12-Val-Leu-X15-Gln-Leu-X18-Ala-X20-X21-X22-Leu-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30

(I),

в которой

X1 представляет собой Tyr, His, N-метил-Tyr или дезамино-Tyr,

X2 представляет собой Ala, D-Ala, Ser или альфа-аминоизомасляную кислоту (Aib);

X8 представляет собой Asn, Asp, Ala, Gln, Ser или Aib;

X9 представляет собой Ser, Asp, Ala или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа;

X11 представляет собой Arg или L-гомоаргинин (Har);

X12 представляет собой Lys или L-орнитин (Orn);

X15 представляет собой Gly или Ala;

X18 представляет собой Ser или Ala;

X20 представляет собой Arg или Har;

X21 представляет собой Lys или Orn;

X22 представляет собой Leu, Val, Ala или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа;

X24 представляет собой Gln или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа;

X25 представляет собой Asp или Ala;

X26 представляет собой Ile или Ala;

X27 представляет собой Met, Leu или норлейцин;

X28 представляет собой Ser, Ala или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа;

X29 представляет собой Lys, Arg, Orn, Har или агматин; и

X30 представляет собой NH₂-группу или Asn-NH₂;

где по меньшей мере один из X9, X22, X24 и X28 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном из вариантов осуществления X9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа. В другом варианте осуществления X22 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа. В другом варианте осуществления X24 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа. В другом варианте осуществления X28 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа.

В одном из вариантов осуществления каждый из X9 и X22 независимо представляют собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа. В другом варианте осуществления изобретения каждый из X9 и X24 независимо представляют собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа. В другом варианте осуществления каждый из X9 и X28 независимо представляют собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа

В некоторых вариантах осуществления X1 представляет собой Tyr. В некоторых вариантах осуществления X2 представляет собой Ala или D-Ala. В некоторых вариантах осуществления X2 представляет собой D-Ala. В некоторых вариантах осуществления X8 представляет собой Ala. В некоторых вариантах осуществления X9 представляет собой Ser. В некоторых вариантах осуществления X11 представляет собой Arg или Har; в одном из вариантов осуществления X11 представляет собой Arg. В некоторых вариантах осуществления X12 представляет собой Lys или Orn; в одном из вариантов осуществления X12 представляет собой Orn. В некоторых вариантах осуществления X15 представляет собой Ala. В некоторых вариантах осуществления X18 представляет собой Ser. В некоторых вариантах осуществления X20 представляет собой Arg или Har; в одном из вариантов осуществления X20 представляет собой Arg. В некоторых вариантах осуществления X21 представляет собой Lys или Orn; в одном из вариантов осуществления X21 представляет собой Orn. В некоторых вариантах осуществления X22 представляет собой Ala. В некоторых вариантах осуществления X24 представляет собой Gln. В некоторых вариантах осуществления X25 представляет собой Asp. В некоторых вариантах осуществления X26 представляет собой Ile. В некоторых вариантах осуществления X27 представляет собой Leu. В некоторых вариантах осуществления X28 представляет собой Ser. В некоторых вариантах осуществления X29 представляет собой Lys, Orn или Har; в одном из вариантов осуществления X29 представляет собой Lys; в другом варианте осуществления X29 представляет собой Har. В некоторых вариантах осуществления X30 представляет собой Asn-NH₂.

В некоторых вариантах осуществления формулы (I) описанный в настоящей заявке полимер ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа, представляет собой полимер ПЭГ с молекулярной массой, равной примерно 2 кДа.

В некоторых вариантах осуществления представленный в настоящей заявке аналог GHRH содержит пептид, представляющий собой:

YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALQDILSZ (SEQ ID NO: 2);

YaDAIFTASYROVLAQLSAROC(Peg-5K)LQDILSZ (SEQ ID NO: 3);

YaDAIFTASYROVLAQLSAROALC(Peg-5K)DILSZ (SEQ ID NO: 4);

YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDILC(Peg-5K)Z (SEQ ID NO: 5);

YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROC(Peg-5K)LQDILSZ (SEQ ID NO: 6);

YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALC(Peg-5K)DILSZ (SEQ ID NO: 7); или

YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-5K)Z (SEQ ID NO: 8);

где: a представляет собой D-Ala; O представляет собой L-орнитин (Orn); C(Peg-5K) представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа; и Z представляет собой Lys, Arg, Har или агматин; или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления аналог GHRH содержит пептид, имеющий последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 2-8; в некоторых вариантах осуществления такие аналоги дополнительно содержат одну или более дополнительных аминокислот, связанных с Z.

В некоторых вариантах осуществления представленный в настоящей заявке аналог GHRH представляет собой:

YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)KN-NH₂ (SEQ ID NO: 9);

YaDAIFTASYROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSKN-NH₂ (SEQ ID NO: 10);

YaDAIFTASYROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSKN-NH₂ (SEQ ID NO: 11);

YaDAIFTASYROVLAQLSC(Peg-2K)ROALQDILSKN-NH₂ (SEQ ID NO: 12);

YaDAIFTASYROVLC(Peg-2K)QLSAROALQDILSKN-NH₂ (SEQ ID NO: 13);

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSKN-NH₂ (SEQ ID NO: 14);

YaDAIFTC(Peg-2K)SYROVLAQLSAROALQDILSKN-NH₂ (SEQ ID NO: 15);

YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDC(Peg-2K)LSKN-NH₂ (SEQ ID NO: 16);

YaDAIFTASYROVLAC(Peg-2K)LSAROALQDILSKN-NH₂ (SEQ ID NO: 17);

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILS-(Har)-NH₂ (SEQ ID NO: 18);

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSRNC(Peg-2K)-NH₂ (SEQ ID NO: 19);

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)RN-NH₂ (SEQ ID NO: 20);

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSRN-NH₂ (SEQ ID NO: 21);

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSRN-NH₂ (SEQ ID NO: 22);

YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALQDILS(Har)-NH₂ (SEQ ID NO: 23); или

YaDAIFTAC(Peg-40K)YROVLAQLSAROALQDILS(Har)-NH₂ (SEQ ID NO: 24);

где: a представляет собой D-Ala; O представляет собой L-орнитин (Orn); C(Peg-2K) представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, равной примерно 2 кДа; C(Peg-5K) представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, равной примерно 5 кДа; C(Peg-40K) представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, равной примерно 40 кДа; и Har представляет собой L-гомоаргинин; или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления аналог GHRH или его соль содержит пептид, имеющий последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-11, 14 и 18-24, определенные в настоящей заявке, или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления аналог GHRH или его соль состоит из пептида, имеющего последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-11, 14 и 18-24, определенные в настоящей заявке, или его фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах осуществления представленный в настоящей заявке аналог GHRH представляет собой любую из SEQ ID NO: 9, 10, 11, 14, 18, 20, 21 и 22 или ее фармацевтически приемлемую соль.

В вариантах осуществления представленный в настоящей заявке аналог GHRH или его соль дополнительно содержит (i) группу, модифицирующую концевую аминогруппу; (ii) группу, модифицирующую концевую карбоксигруппу; или (iii) обе (i) и (ii). В варианте осуществления группа, модифицирующая концевую карбоксигруппу, представляет собой NH₂.

В следующем аспекте предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая представленный в настоящей заявке аналог GHRH или его соль. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит один или более фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей и/или разбавителей.

В следующем аспекте предоставляется способ индукции секреции гормона роста у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции.

В следующем аспекте предоставляется способ повышения уровня гормона роста у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции.

В следующем аспекте предоставляется применение описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции для индукции секреции гормона роста у субъекта.

В следующем аспекте предоставляется применение описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции для повышения уровня гормона роста у субъекта.

В следующем аспекте предоставляется применение описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для индукции секреции гормона роста или повышения уровня гормона роста у субъекта.

В следующем аспекте предоставляется описанный в настоящей заявке аналог GHRH или его соль или описанная в настоящей заявке фармацевтическая композиция для применения для индукции секреции гормона роста или повышения уровня гормона роста у субъекта.

В следующем аспекте предоставляется описанный в настоящей заявке аналог GHRH или его соль или описанная в настоящей заявке фармацевтическая композиция для получения лекарственного средства для индукции секреции гормона роста или повышения уровня гормона роста у субъекта.

В следующем аспекте предоставляется способ лечения, профилактики или диагностики связанного с дефицитом ГР состояния у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции. Неограничивающие примеры связанных с дефицитом ГР состояний, которые можно излечить, предотвратить их развитие и/или диагностировать представленными в настоящей заявке способами включают: ВИЧ-ассоциированную липогипертофию; ВИЧ-ассоциированную дисморфию/дисметаболический синдром (HADDS); дефицит гормона роста; гипоталамический дефицит GH-RH; конституциональную задержку роста; гипофизарный нанизм; задержку роста; заживление ран или костей; остеопороз; синдром Тернера; семейный короткий рост; хроническую почечную недостаточность и тяжелые формы задержки роста; задержку внутриутробного развития; дефицит ГР после лучевой терапии гипофизарных или гипоталамических поражений; долгосрочное лечение глюкокортикоидами, связанное с субнормальными темпами роста; и абдоминальное ожирение, связанное с метаболическим синдромом или ВИЧ-ассоциированной липогипертрофией.

В одном из вариантов осуществления предоставляется способ диагностики дефицита гормона роста у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции и измерение ответа гормона роста.

В одном из вариантов осуществления предоставляется способ лечения ВИЧ-ассоциированной липодистрофии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции. В вариантах осуществления лечение включает лечение накопления висцерального жира. В вариантах осуществления субъект получает антивирусную терапию.

В одном из вариантов осуществления предоставляется способ лечения гипофизарного нанизма или задержки роста у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции.

В одном из вариантов осуществления предоставляется способ лечения или заживления ран или костей у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции.

В одном из вариантов осуществления предоставляется способ лечения остеопороза у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции.

В одном из вариантов осуществления предоставляется способ улучшения анаболизма белков у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции.

В одном из вариантов осуществления предоставляется способ индукции липолитического эффекта у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции. В вариантах осуществления субъект страдает клиническим ожирением.

В одном из вариантов осуществления предоставляется способ лечения ВИЧ-ассоциированной дисморфии/дисметаболического синдрома (HADDS) у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции.

В вариантах осуществления описанных в настоящей заявке способов и применений субъекту вводят эффективное количество описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или описанной в настоящей заявке фармацевтической композиции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Для лучшего понимания изобретения и для более четкого описания способов его реализации приведена ссылка на прилагаемые чертежи, которые иллюстрируют аспекты и признаки в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, где:

Фиг.1 представляет собой график зависимости стимуляции секреции гормона роста от времени после введения пептидов, содержащих цепи ПЭГ2K, в восьмом положении (аналог 7 - треугольники), девятом положении (аналог 6 - квадраты) и 28-ом положении (аналог 1 - кружки).

Фиг. 2 представляет собой график зависимости стимуляции секреции гормона роста от времени после введения пептидов, содержащих цепи ПЭГ2K в девятом положении (аналог 10 - треугольники), цепи ПЭГ5K в девятом положении (аналог 15 - кружки) и цепи ПЭГ40K в девятом положении (аналог 16 - квадраты).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

GHRH (или GRF или GHRF) относится к пептиду высвобождения гормона роста или гормону высвобождения гормона роста. Этот гипоталамический гормон представляет собой пептид, состоящий из 44 аминокислот, а биологически активный фрагмент GHRH представляет собой пептид из 29 аминокислот, GHRH_1-29. Таким образом, полноразмерный GHRH_1-44 и биологически активный фрагмент GHRH_1-29 отличаются последовательностью, соответствующей положениям 30-44 в GHRH_1-44.

Нативный человеческий GHRH (также называемый GHRH_1-44) имеет следующую структуру:

YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL-амид (SEQ ID NO: 26).

GHRH_1-29 имеет следующую структуру:

YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR-амид (SEQ ID NO: 25).

Последовательность, соответствующая положениям 30-44 нативного человеческого GHRH, представляет собой: QQGESNQERGARARL (SEQ ID NO: 27).

Промежуточные формы между GHRH_1-29 и GHRH_1-44, например GHRH_1-29 с добавленной к С-концу одной или более аминокислот из первых 14-ти аминокислот (в вариантах осуществления первых 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 смежных аминокислот) последовательности, соответствующей указанным выше положениям 30-44 (SEQ ID NO: 27), также имеют активность GHRH. Все описанные в настоящей заявке пептиды GHRH, содержащие биологически активный сегмент 1-29, или их варианты улучшены и модифицированы, как описано в настоящей заявке.

Клинически полезные терапевтические средства были получены как из полноразмерного пептида, например N-гексеноил-GHRH(1-44)-амида, который имеет N-гексеноильную модификацию на N-конце и коммерчески известен как тезаморелин или Эгрифта®, так и из биологически активного пептида, состоящего из 29 аминокислот, GHRH(1-29)-амида, который коммерчески известен как серморелин или GEREF®, и были предназначены для лечения ВИЧ-ассоциированной липогипертофии и диагностики дефицита гормона роста соответственно. Были изучены различные модификации GHRH (см., например, Campbell et al., 1991, 1992, 1994 и 1997; Cervini et al., 1998; Ling et al., 1984a и 1984b; Kubiak et al., 1993; Sato et al., 1987 и 1990; Felix et al., 1988 и 1995; Hodate et al., 1986; Bokser et al., 1990; Zarandi, et al., 1990, 1992 и 1994; Kovacs et al., 1988; Murphy et al., 1988; Freidman et al. 1991; и патенты США/опубликованные заявки на патенты США US4914189; US20090023646; US20060128615; US8435945; US8481489; US7316997; US8361964; US5023322; US4689318; US4659693; US6551996; US7256258; US20030148948; US5084442; US5137872; US5846936; US4622312; US5696089; US20050059605; US5091365; US5847066; US9096684; US5792747; US20140058068; и US20110288011). Пептиды GHRH, описанные в вышеупомянутых публикациях и патентах, включены в настоящее описание в виде ссылки.

Изучено ПЭГилирование пептида GHRH в определенных положениях. Например, было изучено ПЭГилирование на N-конце (Tyr1), Lys12, Lys21 или на C-конце (с использованием GGC-линкера), и было обнаружено, что присоединение цепей ПЭГ во внутренних положениях, Lys12 и Lys21, уменьшало активность, но увеличивало время полураспада (Campbell et al., 1997; Felix et al., 1995; Youn et al., 2007; Lu et al., 1994; Digilio et al., 2003; Lu et al., 1993; Esposito et al. 2003). Цепи ПЭГ (2K, 5K или 10K) на Asp8 или Lys12 снижают биологическую активность. ПЭГилиррование карбоксильного конца, независимо от молекулярной массы (ММ, MW), повышает биологическую активность (Felix et al., 1995). Поэтому было бы разумно предположить, что ковалентная модификация N-концевой части молекулы GHRH с использованием массивных цепей ПЭГ уменьшит ее биологическую активность, поскольку практически все остатки на N-конце подразумевают контакты внутри рецептора GHRH. Учитывая принятую на сегодняшний день точку зрения относительно связывания с лигандом рецептора GHRH, открытие того, что, как указано в настоящей заявке, ПЭГилирование девятой, а не восьмой аминокислоты GHRH дает биологически эффективный пептид, оказалось неожиданным.

Для изучения новых положений для ПЭГилирования в пептиде GHRH_1-29, автор изобретения разработал новые аналоги GHRH посредством ковалентной модификации GHRH в некоторых новых положениях аминокислот с помощью фрагмента ПЭГ. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) относится к полимерам этиленгликоля, которые коммерчески производятся с различными молекулярными массами (например, 200-50000 кДа или более). Такие модифицированные аналоги получали путем замены некоторых аминокислот в GHRH аминокислотой, имеющей боковую группу, которая может быть модифицирована с помощью подходящего реагента, вступающего в реакцию с этой группой. Например, боковая цепь Cys может быть модифицирована тиол-реакционноспособным агентом, или боковая цепь Lys может быть модифицирована агентом, вступающим в реакцию с амином. Например, замена одним или более остатками Cys с последующей реакцией с тиол-реакционноспособным малеимидо-ПЭГ дает в результате аналоги GHRH, имеющие один или более заместителей Cys и ковалентно модифицированные полимером ПЭГ в боковых цепях Cys. Как описано в настоящей заявке, использовали GHRH_1-29 (т.е. укороченную форму GHRH, содержащую первые 29 аминокислоты и сохранившую биологическую активность), и такую замену и модификацию ПЭГ изучали в положениях 8, 9, 15, 16, 19, 22, 24, 26, 28 и 30 (последний случай представляет собой добавление аминокислоты (например, Cys) к С-концу GHRH_1-29, причем боковая цепь этой аминокислоты модифицирована ПЭГ, с получением аналога GHRH, состоящего из 30 аминокислот, имеющего ПЭГ-модифицированный C-концевой остаток). Как описано в приведенных в настоящей заявке примерах, Cys-замещенные пептиды (в положениях 8, 9, 15, 16, 19, 22, 24, 26, 28 и 30) синтезировали методом твердофазного пептидного синтеза, очищали и вводили в реакцию с малеимидо-ПЭГ (2000 МВ). ПЭГилированные пептиды очищали, лиофилизировали и подвергали дальнейшему анализу.

В настоящей заявке предоставляются аналоги GHRH, которые представляют собой ПЭГ-модифицированный GHRH или его активные фрагменты и/или варианты, например, GHRH или его активные фрагменты и/или варианты, содержащие один или более ковалентно присоединенных фрагментов ПЭГ. Эти аналоги GHRH имеют агонистическую активность в клетках, экспрессирующих рецептор GHRH (GHRHr), и индуцируют секрецию ГР в животных моделях. Термины ʺGHRHʺ (гормон высвобождения гормона роста) и ʺGRFʺ (фактор высвобождения гормона роста) используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Аналогично, термины ʺрецептор GHRHʺ, ʺGHRHrʺ, ʺGRF-рецепторʺ и ʺGRFrʺ используются в настоящем описании взаимозаменяемо.

В одном из аспектов предоставляется аналог гормона высвобождения гормона роста (GHRH), содержащий пептид, имеющий последовательность, приведенную в формуле (I) (SEQ ID NO:1):

X1-X2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-X8-X9-Tyr-X11-X12-Val-Leu-X15-Gln-Leu-X18-Ala-X20-X21-X22-Leu-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30

(I),

где:

X1 представляет собой Tyr, His, N-метил-Tyr или дезамино-Tyr,

X2 представляет собой Ala, D-Ala, Ser или альфа-аминоизомасляную кислоту (Aib);

X8 представляет собой Asn, Asp, Ala, Gln, Ser или Aib;

X9 представляет собой Ser, Asp, Ala или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа;

X11 представляет собой Arg или L-гомоаргинин (Har);

X12 представляет собой Lys или L-орнитин (Orn);

X15 представляет собой Gly или Ala;

X18 представляет собой Ser или Ala;

X20 представляет собой Arg или Har;

X21 представляет собой Lys или Orn;

X22 представляет собой Leu, Val, Ala или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа;

X24 представляет собой Gln или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа;

X25 представляет собой Asp или Ala;

X26 представляет собой Ile или Ala;

X27 представляет собой Met, Leu или норлейцин;

X28 представляет собой Ser, Ala или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа;

X29 представляет собой Lys, Arg, Orn, Har, агматин; и

X30 представляет собой NH₂ группу или Asn-NH₂;

или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один из X9, X22, X24 и X28 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной примерно 5 кДа.

В вариантах осуществления аналог GHRH может содержать, дополнительно к пептиду, имеющему последовательность, указанную в формуле (I), определенной в настоящей заявке, одну или более аминокислот (встречающихся в природе или синтетических), ковалентно связанных с карбоксильным концом пептида. В вариантах осуществления аналог GHRH содержит до 25 дополнительных аминокислот на С-конце пептида, приведенного в формуле (I), определенной в настоящей заявке. В других вариантах осуществления аналог GHRH содержит до 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 дополнительной аминокислоты на С-конце пептида, указанного в формуле (I), определенной в настоящей заявке. В вариантах осуществления аналог GHRH содержит примерно 60 остатков или менее, в других вариантах осуществления примерно 55, примерно 50, примерно 45, примерно 40 или примерно 35 остатков или менее. В вариантах осуществления аналог GHRH содержит от примерно 29 остатков до примерно 60 остатков. В других вариантах осуществления аналог GHRH содержит от примерно 29 остатков до примерно 50 остатков. В других вариантах осуществления аналог GHRH содержит от примерно 29 остатков до примерно 44 остатков.

В вариантах осуществления аналог GHRH может дополнительно содержать N-концевую группу, такую как C₁-C₁₆-ацильная группа (с прямой или разветвленной цепью, насыщенную или ненасыщенную); в еще одном варианте осуществления C₁-C₁₀-ацильную группу (с прямой или разветвленной цепью, насыщенную или ненасыщенную); в следующем варианте осуществления насыщенную C₁-C₆-ацильную группу (с прямой или разветвленной цепью); или ненасыщенную C₃-C₆-ацильную группу (с прямой или разветвленной цепью). В следующем варианте осуществления аналог GHRH может дополнительно содержать ацетильную группу (CH₃-CO-, Ac). В других вариантах осуществления аналог GHRH может дополнительно содержать (C₁-C₆)алкил, (C₂-C₆)алкенил, (C₂-C₆)алкинил, замещенный (C₁-C₆)алкил, замещенный (C₂-C₆)алкенил, замещенный (C₂-C₆) алкинил, пропил, бутилпентил, гексаноил или гексеноил.

В вариантах осуществления аналог GHRH может дополнительно содержать С-концевую группу формулы: NH₂, -NHR или -NRR, где R представляет собой C₁-C₁₆-ацильную группу (с прямой или разветвленной цепью, насыщенную или ненасыщенную); в другом варианте осуществления C₁-C₁₀-ацильную группу (с прямой или разветвленной цепью, насыщенную или ненасыщенную); в следующем варианте осуществления насыщенную C₁-C₆-ацильную группу (с прямой или разветвленной цепью) или ненасыщенную C₃-C₆-ацильную группу (с прямой или разветвленной цепью); в другом варианте осуществления ацетильную группу (CH₃-CO, Ac); в других вариантах осуществления (C₁-C₆)алкил, (C₂-C₆)алкенил, (C₂-C₆)алкинил, замещенный (C₁-C₆)алкил, замещенный (C₂-C₆)алкенил или замещенный (C₂-C₆)алкинил; или в других вариантах осуществления С-концевая группа может представлять собой прямую или разветвленную цепь ПЭГ более 2 кДа

В вариантах осуществления аналог GHRH или его соль содержит пептид, имеющий последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-11, 14 и 18-24, как определено в настоящей заявке.

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) или ПЭГилирование

"Полиэтиленгликоль" или "ПЭГ" относится к полимерам этиленгликоля с разветвленной или прямой цепью, представленным общей формулой HO(CH₂CH₂O)_nH, где n представляет собой целое число, равное по меньшей мере 2. ПЭГ включает полимеры этиленгликоля со средней общей молекулярной массой, выбранной из диапазона от примерно 500 до примерно 50000 дальтон или более. Средняя молекулярная масса цепи ПЭГ, указанная в виде числа, например, ПЭГ-5000 или ПЭГ-5К относится к полиэтиленгликолевой цепи, имеющей среднюю общую молекулярную массу примерно 5000 дальтон или примерно 5 килоДа или кДа или К (1 кДа=1K=1000 дальтон). Полимеры ПЭГ различных размеров являются коммерчески доступными и могут быть использованы в описанных в настоящей заявке продуктах и способах, например, ПЭГ, имеющие средний размер примерно 200, примерно 300, примерно 400, примерно 500, примерно 600, примерно 1000, примерно 1500, примерно 2000, примерно 3000, примерно 3350, примерно 4000, примерно 5000, примерно 6000, примерно 8000, примерно 10000, примерно 12000, примерно 20000, примерно 35000 или примерно 50000 дальтон.

В одном из вариантов осуществления один или более описанных в настоящей заявке фрагментов ПЭГ имеют среднюю молекулярную массу, меньшую или равную примерно 5 кДа (также упоминаемую в настоящем описании как 5К). В других вариантах осуществления один или более описанных в настоящей заявке фрагментов ПЭГ имеют среднюю молекулярную массу от примерно 2 кДа до примерно 5 кДа или примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4 или примерно 5 кДа. В следующем варианте осуществления один или более описанных в настоящей заявке фрагментов ПЭГ имеют молекулярную массу, равную примерно 2 кДа. Кроме того, в вариантах осуществления описанный в настоящей заявке аналог GHRH, имеющий несколько ПЭГ-модификаций, может быть модифицирован фрагментами ПЭГ разных размеров, т.е. один и тот же аналог может иметь прикрепленные к нему фрагменты ПЭГ разных размеров. В следующем варианте осуществления описанный в настоящей заявке аналог GHRH, имеющий несколько ПЭГ-модификаций, может быть модифицирован фрагментами ПЭГ примерно одного размера.

ПЭГилирование (т.е. присоединение фрагмента ПЭГ) описанных в настоящей заявке аналогов GHRH может быть осуществлено способами, известными в данной области. Например, можно использовать реакционноспособный агент ПЭГилирования, который является реакционноспособным в отношении конкретной боковой цепи аминокислоты. Примером является тио- или сульфгидрил-реакционноспособный ПЭГ, например, имеющий малеимидный фрагмент (ПЭГ-малеимид), который может реагировать с боковой цепью Cys. Другим примером является амин-реакционноспособный ПЭГ, например, имеющий N-гидроксисукцинимидный эфир (эфир ПЭГ-NHS), который может взаимодействовать с боковой аминной цепью (например, Lys). В вариантах осуществления модификация ПЭГ может быть осуществлена на N- и/или С-конце с помощью реагентов, которые являются реакционноспособными по отношению к амину или карбоксилу. В других вариантах осуществления модификацию ПЭГ можно осуществлять через линкер, т.е. линкерный или спейсерный фрагмент, расположенный между фрагментом ПЭГ и пептидом. Такие линкеры включают, например, гетеробифункциональные или гомобифункциональные реагенты.

Аминокислоты

"Аминокислота", как используется в настоящей заявке, включает как L-, так и D-изомеры природных аминокислот, а также другие аминокислоты (например, встречающиеся в природе аминокислоты, не встречающиеся в природе аминокислоты, аминокислоты, которые не кодируются последовательностями нуклеиновых кислот и т.д.), используемые в химии пептидов для получения синтетических аналогов пептидов. Другие аминокислоты включают, например, не кодируемые генетически формы аминокислот, такие как бета-аланин, 3-аминопропионовая кислота, 2,3-диаминопропионовая кислота, альфа-аминоизомасляная кислота (Aib), 4-амино-масляная кислота, N-метилглицин (саркозин), гидроксипролин, орнитин (например, L-орнитин), цитруллин, трет-бутилаланин, трет-бутилглицин, N-метилизолейцин, фенилглицин, циклогексилаланин, норлейцин (Nle), норвалин, 2-нафтилаланин, пиридилаланин, 3-бензотиенилаланин, 4-хлорфенилаланин, 2-фторфенилаланин, 3-фторфенилаланин, 4-фторфенилаланин, пеницилламин, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота, бета-2-тиенилаланин, метионинсульфоксид, L-гомоаргинин (Har), N-ацетил-лизин, 2-аминомасляная кислота, 2-аминомасляная кислота, 2,4-диаминомасляная кислота (D- или L-), п-аминофенилаланин, N-метилвалин, гомоцистеин, гомосерин (HoSer), цистеиновая кислота, эпсилон-амино-гексановая кислота, дельта-аминовалериановая кислота или 2,3-диаминомасляная кислота (D- или L-) и т.д.

В вариантах осуществления описанные в настоящей заявке аналоги GHRH могут включать замены функционально эквивалентных аминокислотных остатков. Например, один или более аминокислотных остатков в последовательности могут быть заменены другой аминокислотой, имеющей аналогичные физико-химические свойства, т.е. той же группы или семейства относительно одного или более свойств. Замены, сделанные в пределах семейства аминокислот, обычно считаются консервативными заменами, т.е. консервативные замены могут быть определены как обмен в пределах одной из следующих пяти групп: (i) небольшие алифатические неполярные остатки: Ala, Gly; (ii) большие неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val, Pro; (iii) незаряженные полярные остатки: Ser, Thr, Cys, Tyr, Gly; (iv) полярные отрицательно заряженные остатки: Asp, Glu и их амиды: Asn, Gln; (v) полярные положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys; и (vi) большие ароматические остатки: Phe, Tyr, Trp. Другими примерами аминокислотных замен являются: Tyr (N-метил-Tyr, деамино-Tyr, His, D-Tyr); Ala (D-Ala, Aib, Abu); Val/Leu/Ile (взаимозаменяемые в определенных положениях); Asn (Gln); Met (норлейцин, Leu); Lys (гомолизин, аргинин, гомоаргинин (Har), орнитин, гамма-аминомасляная кислота (Gab), гамма-аминопропионовая кислота (Gap), агматин); Arg (гомоаргинин, лизин, гомолизин, орнитин, гамма-аминомасляная кислота (Gab), гамма-аминопропионовая кислота (Gap), агматин); Asp/Glu (взаимозаменяемы в определенных положениях); и Ser/Thr (взаимозаменяемы в определенных положениях).

Описанные в настоящей заявке аналоги GHRH могут включать все L-аминокислоты или смесь L- и D-аминокислот. В одном из вариантов осуществления представленный в настоящей заявке аналог GHRH включает по меньшей мере одну D-аминокислоту, такую как в одном из вариантов осуществления D-Ala. В одном из вариантов осуществления указанная по меньшей мере одна D-аминокислота расположена в N-концевой части представленного в настоящей заявке аналога GHRH, (например, в пределах последних 2 или 3 N-концевых остатков). Наличие одной или более D-аминокислот обычно дает пептиды, которые имеют повышенную стабильность (например, in vivo) из-за пониженной восприимчивости к расщеплению протеазой/пептидазой, сохраняя при этом биологическую активность.

Пептидный синтез

Пептиды могут быть легко синтезированы вручную и с помощью автоматизированных процедур твердофазного синтеза, хорошо известных в данной области техники. Подходящие способы синтеза могут быть выполнены, например, с помощью процедур "T-boc" или "Fmoc". Методы и процедуры для твердофазного синтеза описаны, например, в Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, by E. Atherton and R. C. Sheppard, опубл. IRL, Oxford University Press, 1989. Альтернативно, пептиды могут быть получены методом сегментной конденсации, описанным, например, у Liu et al., 1996; Baca et al., 1995; Tam et al., 1995; Schnolzer and Kent, 1992; Liu and Tam, 1994a; Liu and Tam, 1994b; и Yamashiro and Li, 1988. Другие методы, описанные для синтеза пептидов, раскрыты у Nakagawa et al., 1985.

Пептиды и пептидные аналоги, содержащие природные аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, также могут быть получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК стандартными методами. Пептиды, полученные методами рекомбинантной технологии, могут быть модифицированы (например, путем ацилирования N-конца, ацетилирования, амидирования C-конца и т.д.) методами, хорошо известными в данной области.

Следовательно, в вариантах осуществления в тех случаях, когда описанный в настоящей заявке аналог GHRH содержит встречающиеся в природе аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, аналог GHRH может быть получен рекомбинантными методами, и в некоторых вариантах осуществления может быть, например, подвергнут описанным выше модификациям (например, ацилированию, амидированию и т.д.). Соответственно, в другом аспекте предлагается нуклеиновая кислота, кодирующая представленный в настоящей заявке аналог GHRH. В другом аспекте представлен рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту; в следующем аспекте предложена клетка-хозяин, включающая рекомбинантный вектор.

Описанные в настоящей заявке аналоги GHRH могут быть очищены многими способами очистки пептидов, хорошо известными в данной области, такими как хроматография с обращенной фазой, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), ионообменная хроматография, гель-проникающая хроматография, аффинная хроматография, гель-электрофорез и т.п. Фактические условия, используемые для очистки конкретного пептида или пептидного аналога, отчасти будут зависеть от стратегии синтеза и от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.п., и будут очевидны для специалистов в данной области техники. Для очистки аффинной хроматографией можно, например, использовать любое антитело, которое специфически связывается с пептидом или пептидным аналогом.

Фармацевтически приемлемые соли

Описанные в настоящей заявке аналоги GHRH являются основными, но содержат как отрицательные, так и положительные заряды; поэтому соли могут быть образованы с помощью как катионов, так и анионов. Таким образом, описанные в настоящей заявке аналоги GHRH могут быть в форме соли, например, фармацевтически приемлемых нетоксичных солей, таких как соли присоединения кислоты. "Фармацевтически приемлемая соль" относится к солям соединений, которые сохраняют биологическую активность исходного соединения и которые не являются биологически или иным образом нежелательными. Такие соли могут быть получены in situ во время окончательного выделения и очистки аналога GHRH или могут быть получены отдельно в результате реакции функциональной группы свободного основания с подходящей кислотой. Многие из описанных в настоящей заявке аналогов GHRH способны образовывать кислые и/или основные соли в силу наличия аминогрупп и/или карбоксильных групп или сходных с ними групп. Примеры фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот включают, без ограничения, гидрохлорид, гидробромид, сульфат, фосфат, фумарат, глюконат, таннат, малеат, ацетат, трифторацетат, цитрат, бензоат, сукцинат, альгинат, памоат, малат, аскорбат, тартарат и т.п. Особенно предпочтительными являются плохо растворимые соли, например низкомолекулярные жирные кислоты (C₄-C₁₂), памоат и т.п. Другие соли включают катионы металлов, такие как Zn⁺² и Mg⁺², которые могут оставаться активными в течение длительного времени.

Композиции/составы

В другом аспекте предоставляется композиция (например, фармацевтическая композиция) или препарат, содержащий описанный в настоящей заявке аналог GHRH или его соль. В одном из вариантов осуществления композиция дополнительно содержит один или более фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей и/или разбавителей.

Используемый в настоящей заявке термин "фармацевтически приемлемый" (или "биологически приемлемый") относится к материалам, которые не имеют (или имеют слабые) токсичные или неблагоприятные биологические эффекты in vivo. Это относится к таким соединениям, композициям и/или лекарственным формам, которые пригодны для применения в контакте с биологическими жидкостями и/или тканями и/или органами субъекта (например, животного, млекопитающего, человека), без проявления чрезмерной токсичности, не вызывая раздражения, аллергического ответа или других проблем или осложнений при разумном соотношении польза/риск.

Термин "фармацевтически приемлемые носители, наполнители и/или разбавители" относится к добавкам, обычно используемым при получении фармацевтических композиций, и включает, например, растворители, дисперсионные среды, солевые растворы, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, лубриканты, эмульгаторы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, хелатирующие агенты, модификаторы рН, успокаивающие агенты, буферы, восстановители, антиоксиданты, изотонические агенты, агенты, замедляющие абсорбцию, и т.п. (см., например, Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, 6^th edition, 2009).

Описанные в настоящей заявке аналоги GHRH также могут быть включены в лекарственную форму с помощью анионных или нейтральных липидов с образованием липосом с пептидами. Например, для предотвращения протеолитической деградации и для повышения биологической активности in vivo в лекарственный состав вместе с анионными фосфолипидами был введен вазоактивный интестинальный пептид (VIP) (Gololobov, et al., 1998). Кроме того, в PCT публикации заявки на патент WO 95/27496 и у Gao et al., 1994, описано использование липосом для доставки VIP в сравнении с его доставкой в водном растворе. На примере гипертонических хомяков, было обнаружено, что инкапсуляция VIP в липосомы защищает пептид от протеолитической деградации и значительно повышает эффективность VIP и снижать среднее артериальное давление по сравнению с VIP в водном растворе. Липосомы могут быть получены из комбинаций липидных материалов, хорошо известных и обычно используемых в данной области техники для получения липосом и включающих по меньшей мере один липидный компонент, ковалентно связанный с водорастворимым полимером. Липиды могут включать относительно твердые виды, такие как сфингомиелин, или жидкие типы, такие как фосфолипиды, имеющие ненасыщенные ацильные цепи.

Описанные в настоящей заявке полимеры могут включать любые соединения, известные и обычно используемые в области технологии(й) SSL, которые полезны для увеличения периода полувыведения белков из кровотока, такие как, например, поливиниловый спирт, полимолочная кислота, полигликолевая кислота, поливинилпирролидон, полиакриламид, полиглицерин, полиаксислин или синтетические липиды с полимерными головными группами. В вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой ПЭГ, имеющий среднюю молекулярную массу от примерно 1000 до примерно 5000 дальтон.

Описанные в настоящей заявке липиды для получения липосом могут включать дистеароилфосфатидилэтаноламин, ковалентно связанный с ПЭГ (ПЭГ-DSPE), фосфатидилхолин (PC) и/или фосфатидилглицерин (PG), также комбинацию с холестерином (Chol). В одном из вариантов осуществления комбинация липидов и холестерина для получения липосом содержит молярное отношение ПЭГ-DSPE:PC:PG:Chol 0,5:5:1:3,5.

Контролируемое высвобождение описанных в настоящей заявке аналогов GHRH также может быть получено путем смешивания высокомолекулярных полимеров и подходящих несущих сред. Такие методы хорошо известны в области контролируемого высвобождения пептидов и малых молекул из инъецируемых лекарственных форм-депо. Полимеры, которые можно использовать в комбинации с представленными в настоящей заявке способами и композициями являются биоразлагаемыми, т.е. они постепенно деградируют, например ферментативно, или подвергаются гидролизу, растворяются, физически разрушаются или иным образом разлагаются в водных жидкостях тела пациента. Как правило, полимеры биологически разлагаются в результате гидролиза или физического разрушения, хотя первичный процесс биоэрозии обычно представляет собой гидролиз или ферментативную деградацию.

Такие полимеры включают, без ограничения, полилактиды, полигликолиды, полимеры на основе капролактона, поликапролактоны, полиангидриды, полиамины, сложные эфиры полиамидов, полиортоэфиры, полидиоксаноны, полиацетали, поликеталы, поликарбонаты, полиортокарбонаты, полифосфазены, сукцинаты, поли(яблочную кислоту), поли(аминокислоту), поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, полигидроксицеллюлозу, полифосфоэфиры гидроксиметилцеллюлозы, сложные полиэфиры, полибутилентерефталат, полисахариды, хитин, хитозан, гиалуроновую кислоту и сополимеры, терполимеры и их смеси. Примеры полимеров, приведенных в US7368126 B2, включают, без ограничения, поли(D,L-лактид-ко-гликолид) 50:50 RESOMER® RG502, поли(D,L-лактид-ко-гликолид) 50:50 RESOMER® RG502H, поли D,L-лактид (RESOMER® R 202, RESOMER® R 203); полидиоксанон (RESOMER® X 210) (Boehringer Ingelheim Chemicals, Inc., Petersburg, Va.). Дополнительные примеры включают, без ограничения, DL-лактид/гликолид 100:0 (MEDISORB® полимер 100 DL High, MEDISORB® полимер 100 DL Low); DL-лактид/гликолид 85/15 (MEDISORB® полимер 8515 DL High, MEDISORB® полимер 8515 DL Low); DL-лактид/гликолид 75/25 (MEDISORB® полимер 7525 DL High, MEDISORB® полимер 7525 DL Low); DL-лактид/гликолид 65/35 (MEDISORB® полимер 6535 DL High, MEDISORB® полимер 6535 DL Low); DL-лактид/гликолид 54/46 (MEDISORB® полимер 5050 DL High, MEDISORB® полимер 5050 DL Low); DL-лактид/гликолид 54/46 (MEDISORB® полимер 5050 DL 2A(3), MEDISORB® полимер 5050 DL 3A(3), MEDISORB® полимер 5050 DL 4A (3)) (Medisorb Technologies International L.P., Cincinnati, Ohio); поли(D,L-лактид-ко-гликолид) 50:50; поли(D,L-лактид-ко-гликолид) 65:35; поли(D,L-лактид-ко-гликолид) 75:25; поли(D,L-лактид-ко-гликолид) 85:15; поли(D,L-лактид); поли(L-лактид); полигликолид; поли-ε-капролактон; поли(D,L-лактид-ко-капролактон) 25:75; и поли(D,L-лактид-ко-капролактон) 75:25 (Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, Ala.).

Способ введения

Описанные в настоящей заявке аналоги GHRH или их соли и их композиции могут быть введены субъектам (например, животным, млекопитающим, людям) подкожно (s.c), внутримышечно (i.m.), внутривенно (i.v), перорально или местно; интраназально или путем легочной ингаляции; путем чрескожной доставки; или в виде депо (например, микрокапсул, микрогранул или цилиндрических стержнеобразных имплантов), состоящих из биоразлагаемого подходящего полимера (такого как D,L-лактид-ко-гликолид). В одном из вариантов осуществления микрокапсулы или микрогранулы используются в качестве депо-формы. Другие эквивалентные способы введения также входят в объем предлагаемых в настоящей заявке способов и композиций, т.е. в виде капельницы для внутривенного вливания, кожных пластырей, депо-инъекций, инфузионного насоса и режимов непрерывного высвобождения, таких как микрокапсулы, и т.п. Введение может осуществляться в любом физиологически приемлемом для инъекций носителе, приемлемом физиологическом солевом растворе, хотя могут быть использованы и другие носители, известные в данной области.

Аналоги GHRH или их соли и их композиции предпочтительно вводят парентерально, внутримышечно, подкожно или внутривенно с фармацевтически приемлемым носителем, таким как изотонический физиологический раствор. Альтернативно, аналоги GHRH или их соли и их композиции можно вводить в виде интраназального спрея с соответствующим носителем или путем легочной ингаляции. В одном из вариантов осуществления подходящий способ введения представляет собой депо-форму, составленную из подходящего биоразлагаемого полимера, например поли-D,L-лактид-ко-гликолида, в виде микрокапсул, микрогранул или цилиндрических имплантов, содержащих диспергированные антагонистические соединения.

Показания к применению

GHRH вызывает пульсирующую секрецию гормона роста (ГР) гипофизом. Поэтому описанные в настоящей заявке аналоги GHRH или их соли могут быть полезными для индукции или стимуляции секреции ГР у субъекта. В одном из аспектов предлагается способ индукции или стимуляции секреции ГР у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или фармацевтической композиции. Также предоставляется применение описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или содержащей их фармацевтической композиции для индукции или стимуляции секреции ГР у субъекта. Также предоставляется применение описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или содержащей их фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства для индукции или стимуляции секреции ГР у субъекта. Также представляется описанный в настоящей заявке аналог GHRH или его соль или содержащая их фармацевтическая композиция для применения для индукции или стимуляции секреции ГР у субъекта.

"Индукция" или "стимуляция", как используется в настоящей заявке, относится к измеримому увеличению биологической активности. В вариантах осуществления увеличение составляет, по меньшей мере, примерно 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95%, 100% (в 2 раза) или 200% (в 3 раза) биологической активности относительно контроля. Например, обнаружено, что аналог GHRH стимулирует активность GHRHr, согласно увеличению уровней ГР, измеренных после введения аналога GHRH или его соли субъекту (например, животному, человеку), по сравнению с уровнями у субъекта до введения или по сравнению с уровнями у контрольного субъекта, которому не был введен аналог GHRH или его соль.

Действие ГР на печень может привести к продуцированию IGF-1 и его основного связывающего белка IGFBP3. Вместе эти биологически активные белки могут оказывать анаболическое действие на мышцы, кости и хондроциты. ГР также может стимулировать липолиз, в частности, из висцеральных жировых отложений. GHRH также может непосредственно и опосредованно воздействовать на сердечную функцию, защиту от ишемических осложнений, неврологическое улучшение, приводящее к улучшению когнитивной функции, стимуляцию волн медленного сна и активности в дневное время. Отсутствие одного или обоих из ГР и GHRH может привести к патологиям, связанным с ГР и IGF-1. Следовательно, представленные в настоящей заявке аналоги GHRH и их соли могут быть использованы для диагностики, а также для лечения или профилактики развития состояний, связанных с дефицитом ГР. Эти состояния могут включать, без ограничения: (1) скрининг на дефицит гормона роста; (2) лечение гипоталамического дефицита GH-RH; (3) конституциональную задержку роста; (4) синдром Тернера; (5) семейный короткий рост; (6) детей препубертатного возраста с хронической почечной недостаточностью и тяжелыми формами задержки роста; (7) младенцев и детей с задержкой внутриутробного развития; (8) детей с дефицитом ГР после лучевой терапии гипофизарных или гипоталамических поражений; (9) детей, получающих долгосрочное лечение глюкокортикоидами и растущих с субнормальной скоростью; и другие упомянутые выше состояния.

Дополнительные клинические применения аналогов GHRH у взрослых могут включать, без ограничений: (1) при процессах старения для уменьшения или предотвращения потери мышечной, костной и кожной массы и уменьшения увеличения жировых отложений в теле, которое обычно наблюдаются при старении; (2) при катаболических состояниях; (3) для заживлению ран; (4) при отсроченном заживлении переломов; (5) при остеопорозе; (6) при абдоминальном ожирении, которое является результатом метаболического синдрома или ВИЧ-ассоциированной липогипертрофии; (7) в качестве добавки к общему парентеральному питанию у пациентов с неполноценными питанием, страдающих хронической обструктивной болезнью легких; (8) при сердечной недостаточности; а также (9) применение во время и после космических полетов для противодействия уменьшению секреции ГР. Невесомость во время космического полета в значительной степени снижает высвобождение гормона роста, что может объяснить потерю костной массы и мышечную слабость, которую испытывают многие астронавты после длительных космических полетов; (10) при умеренных когнитивных расстройствах (MCI), которые являются частью процесса нормального старения или предпосылкой к развитию болезни Альцгеймера или старческого слабоумия, или возникли в результате травматического черепно-мозгового повреждения во время, например, занятия спортом, в результате случайного падения или автомобильной аварии.

Заболевания и состояния, при которых введение аналогов GHRH и их солей может оказаться полезным, подробно описаны в данной области (см., например, WO 2009/009727, WO 2006/042408, WO 2005/037307 и WO 2004/105789). Такие состояния/расстройства/заболевания включают, например, синдромы, связанные с накоплением жира, гиперхолестеринемию, ожирение, синдромом Х, липогипертрофию, липоатрофию, липодистрофию (например, ВИЧ-ассоциированный синдром липодистрофии), нарушенную когнитивную функцию, нарушенную дневную активность, сниженную функцию иммунной системы (например, иммунодефициты, такие как дефицит Т-клеток), катаболизм мышечных белков, заболевания/состояния, связанные с мышечным истощением, такие как саркопения, дряхлость, побочные эффекты, связанные с лучевой терапией и/или химиотерапией (например, у ВИЧ-инфицированных и больных раком), кахексию (например, у больных раком), гипоталамо-гипофизарный нанизм, ожоги, остеопороз, почечную недостаточность, несрастаемый перелом костей, острое/хроническое истощающее заболевание или инфекцию, заживление ран, послеоперационные проблемы, отсутствие лактации, бесплодие у женщин, нейродегенеративные состояния, GHRH рецептор-зависимые опухоли, и состояния, связанные со старением или нарушениями сна/ухудшением состояния.

Следовательно, в других аспектах предлагается способ (1) стимуляции дневной активности и/или когнитивной функции, например, при состояниях, связанных со старением, умеренным когнитивным расстройством (MCI), симптомами, предшествующими развитию болезни Альцгеймера (продромальному периоду болезни Альцгеймера), деменцией и/или ухудшением сна (например, возрастным нарушением сна), (2) улучшения/профилактики/лечения метаболических состояний, связанных с накоплением жира и/или гиперхолестеринемией (ожирением, абдоминальным ожирением/ожирением, абдоминальным ожирением с нарушениями обмена веществ, абдоминальным ожирением с относительным дефицитом ГР, метаболическим синдромом или синдромом X, липогипертрофией, липоатрофией, липодистрофией (например, ВИЧ-ассоциированным синдромом липодистрофии) дислипидемией, гипертриглицеридемией), (3) улучшения анаболизма при состояниях катаболизма/истощения, таких, которые наблюдаются при острой или хронической почечной недостаточности (например, острой или хронической почечной недостаточности), хронической сердечной недостаточности (например, хронической сердечной недостаточности), хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), муковисцидозе (например, истощение при муковисцидозе у взрослых), дряхлости, ожогах, инфекции (сепсисе), мышечной дистрофии, застойной сердечной недостаточности, нейродегенеративных состояниях (синдроме Альцгеймера, синдроме Альцгеймера в продромальном периоде, боковом амиотрофическом склерозе (БАС), СПИДе, недостатке белка в организме после длительной терапии кортикостероидами, после несрастающегося перелома костей, перелома бедра, травмы или крупной операции (постхирургические проблемы), остеопорозе, длительной иммобилизации, кахексии, связанной с раком, саркопении (например, возрастной саркопении), мальабсорбции ЖКТ (синдром короткого кишечника (SBS), болезнь Крона), особенно у пожилых людей, например, для увеличения мышечной массы и/или улучшения функции, (4) улучшения иммунной функции или восстановления при иммунодефицитных состояний (например, Т-клеточных иммунодефицитах), таких как ассоциированное старение, ВИЧ-инфекция/СПИД или химиотерапия интенсивной дозой и/или лучевая терапия (у ВИЧ-инфицированных и больных раком), (5) изменения липидного параметра ((а) снижения уровня холестерина; (б) снижения уровня холестерина не-ЛПВП; (c) снижения уровня триглицеридов; и/или (d) снижения отношения общего холестерина/холестерина ЛПВП); (6) изменения параметра композиционного состава организма ((a) увеличения безжировой массы тела, (b) уменьшения жировых отложений на туловище, (c) уменьшения висцерального жира, (d) уменьшения обхвата живота, (e) уменьшения висцеральной жировой ткани (ВЖТ) и/или (f) уменьшения отношения ВЖТ/подкожной жировой ткани (ПЖТ)), (7) повышения фертильности или лечения бесплодия (у женщин), лечения отсутствия лактации, (8) лечения дефицита ГР (например, дефицита ГР при абдоминальном ожирении), путем предоставления заместительной терапии гормоном роста, например, у взрослых, при лечении идиопатической низкорослости (ISS) (9) лечения опухолей, связанных с рецептором GHRH, (10) лечения гипоталамо-гипофизарного нанизма, (11) улучшения заживления ран, (12) лечения ожогов, (13) лечения острого/хронического изнуряющего заболевания или инфекции и/или (14) профилактики/лечения состояния, характеризующегося недостаточным или сниженным образованием костной ткани (например, остеопороз); причем способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества описанного в настоящей заявке аналога GHRH или его соли или содержащей их композиции (например, вместе с фармацевтически приемлемым носителем/наполнителем).

"Лечить", "лечение" или "лечащий", как используется в настоящей заявке, относится к применению или введению субъекту, имеющему расстройство, заболевание или симптом расстройства или заболевания, с целью излечения, исцеления, облегчения, ослабления, изменения, исправления, устранения, улучшения, уменьшения прогрессирования или оказания влияния на расстройство или заболевание и/или симптомы расстройства или заболевания. "Предотвратить", "профилактика" или "предотвращение", как используется в настоящей заявке, относится к применению или введению субъекту, имеющему предрасположенность к расстройству или заболеванию или имеющему риск развития расстройства или заболевания, с целью профилактики или задержки появления заболевания или расстройства или его симптомов или уменьшения тяжести заболевания или расстройства или его симптомов в случае введения до начала развития или появления заболевания или расстройства или его симптомов.

"Субъект", как используется в настоящей заявке, относится к теплокровным животным. В одном из вариантов осуществления субъект является млекопитающим. В другом варианте осуществления субъект является человеком. В одном из вариантов осуществления субъект является животным.

Дозирование

Используемое в настоящей заявке "эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периода времени, необходимых для достижения желаемой биологической активности (например, индукции секреции ГР) и/или профилактического/терапевтического результата (например, профилактики и/или лечения указанных выше заболеваний и нарушений). "Терапевтически эффективное количество", используемое в настоящей заявке, относится к эффективному количеству в контексте терапии, "профилактически эффективное количество" относится к эффективному количеству в контексте профилактики. Эффективное количество предлагаемого в настоящей заявке соединения или композиции может меняться в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и вес субъекта, а также способности соединения или композиции вызывать желаемый ответ у субъекта. Режимы дозирования можно менять для обеспечения оптимального профилактического/терапевтического ответа. Эффективным количеством также является количество, при котором профилактические/терапевтические полезные эффекты превосходят любые токсические или вредные эффекты соединения.

Необходимое количество аналога GHRH зависит от типа фармацевтической композиции и способа введения. В тех случаях, когда люди-пациенты получают растворы аналога GHRH или его соли, вводимые путем в/м или подкожной инъекции или в виде интраназального спрея или легочной ингаляции, типичные дозы составляют 2-20 мг/сут, которые вводят один раз в сутки или делят на 2-4 введения/сут. В тех случаях, когда аналог GHRH или его соль вводят людям-пациентам внутривенно, типичные дозы находятся в диапазоне 8-80 мкг/кг массы тела/сут, которые делят на 1-4 болюсные инъекции/сут или вводят в виде непрерывной инфузии. В тех случаях, когда используют депо-препараты аналога GHRH или его соли, например, путем в/м инъекции пальмитатных солей или других солей с низкой растворимостью или путем в/м или подкожного введения микрокапсул, микрогранул или имплантов, содержащих аналог GHRH или его соль, диспергированную в биоразлагаемом полимере, типичные дозы составляют от 1 до 10 мг/сут. В некоторых вариантах осуществления аналог GHRH или его соль вводят в суточной дозе от примерно 0,1 мг до примерно 20 мг. В одном из вариантов осуществления аналог GHRH или его соль вводят в суточной дозе примерно 1 мг или примерно 2 мг

Наборы/упаковки

В настоящей заявке также представлены наборы или упаковки, содержащие описанный в настоящей заявке аналог GHRH или его соль или содержащую их композицию. В одном из вариантов осуществления набор или упаковка дополнительно содержит инструкции для применения, например, для индукции или стимуляции секреции ГР у субъекта или для диагностики, лечения или профилактики состояния с дефицитом ГР. Комплект или упаковка могут дополнительно содержать один или более контейнеров.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение более подробно проиллюстрировано приведенными ниже неограничивающими примерами. Примеры приведены для иллюстрации изобретения и не должны быть истолкованы как ограничение его объема каким-либо образом.

Если не определено иное или если иное не следует очевидным образом из контекста, то все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют те же значения, как их обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Следует понимать, что на практике или при тестировании изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящей заявке.

Сокращения:

В настоящем описании используются следующие сокращения:

Abu: альфа-аминомасляная кислота

Aib: аминоизомасляная кислота

BHA: Бензгидриламиновая смола

Boc: т-Бутоксикарбонил

COMU: (1-циано-2-этокси-2- оксоэтилиденаминоокси)диметиламиноморфолино-карбения гексафторфосфат

DIEA: диизопропилэтиламин

DMF: N,N-диметилформамид

EA: акцептор фермента

ED: донор фермента

EFC: комплементация фрагмента фермента

EIA: иммуноферментный анализ

ELISA: фермент-связанный иммуносорбентный анализ

FMOC: флуоренилметоксикарбонил

HCTU: гексафторфосфат 2-(6-хлор-1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

MALDI-TOF: масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией

Nle: L-норлейцин

Orn: L-орнитин

Har: L-гомоаргинин

Pbf: 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил

RLU: относительные световые единицы

ОФ ВЭЖХ: высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенными фазами

t-Bu: трет-бутил

TFA: трифторуксусная кислота

Trt: тритил.

Номенклатура:

Используемая в настоящей заявке номенклатура для определения аминокислотных остатков и синтетических пептидов определена комиссией IUPAC-IUB по биохимической номенклатуре (European J. Biochem., 1984, 138, 9-37). Под природной аминокислотой подразумевается одна из обычно встречающихся в природе аминокислот, находящихся в белках, содержащих Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Ser (S), Thr (T), Lys (K), Arg (R), Asp (D), Asn (N), Glu (E), Gln (Q), Cys (C), Met (M), Phe (F) Y), Pro (P), Trp (W) и His (H). В круглых скобках указаны однобуквенные коды. Другими аббревиатурами являются Nle (норлейцин), Aib (аминоизомасляная кислота), Abu (альфа-аминомасляная кислота), Orn (орнитин) и Har (гомоаргинин). Буквы в нижнем регистре в однобуквенном коде используются для обозначения D-аминокислот, например "a" представляет D-Ala.

Пример 1: Материалы и методы

Синтез и получение аналогов GHRH

Описанные в настоящей заявке аналоги GHRH получали вручную или с помощью автоматизированного метода твердофазного пептидного синтеза, используя флуоренилметоксикарбонил-защищенные альфа-аминокислоты с соответствующей защитой боковой цепи и бензгидриламиновую (BHA) смолу (Bachem AG) в количестве 0,75 ммоль/г. Перед связыванием аминокислот к смоле присоединяли 6-аминогексановую кислоту и линкер Ринка, и затем присоединяли Fmoc-[9H-флуорен-9-илметоксикарбонил]-защищенную аминокислоту, используя [2-(6-хлор-1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния гексафторфосфат] (HCTU) или гексафторфосфат (1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламиноморфолино-карбения (COMU) и диизопропилэтиламин (DIEA) в N,N-диметилформамиде (DMF) в течение примерно 1 часа. Защиту Fmoc снимали с помощью 20% (об./об.) пиперидина в DMF в течение примерно 0,5 часа. Общую процедуру N-кэпирования описанных в настоящей заявке пептидов ацетилом выполняли с помощью ангидрида уксусной кислоты и DIEA. После завершения синтеза пептиды отщепляли от твердофазного носителя с одновременным снятием защиты с боковой цепи. Неочищенные линейные (также называемые прямыми или неразветвленными) пептиды дополнительно очищали препаративной ОФ-ВЭЖХ на C18-колонках в градиенте ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте (TFA). Пептиды сушивали в вакууме для удаления ацетонитрила и лиофилизировали из 0,1% TFA. Чистоту оценивали с помощью аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), и определяли массу методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) с помощью прибора Voyager^TM (PerSeptive Biosystems Inc.). Получали аналоги GGRH 1-16, описанные в таблице 1.

Таблица 1: Аналоги GHRH, полученные в этом исследовании

Название	Последовательность1	Средняя ММ	Чистота (%)	SEQ ID No:
Аналог 1 (C28)	YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)KN-NH2	5342	>95%	9
Аналог 2 (C24)	YaDAIFTASYROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSKN-NH2	5301	>95%	10
Аналог 3 (C22)	YaDAIFTASYROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSKN-NH2	5358	>95%	11
Аналог 4 (C19)	YaDAIFTASYROVLAQLSC(Peg-2K)ROALQDILSKN-NH2	5358	>95%	12
Аналог 5 (C15)	YaDAIFTASYROVLC(Peg-2K)QLSAROALQDILSKN-NH2	5358	>95%	13
Аналог 6 (C9)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSKN-NH2	5342	>95%	14
Аналог 7 (C8)	YaDAIFTC(Peg-2K)SYROVLAQLSAROALQDILSKN-NH2	5358	>95%	15
Аналог 8 (C26)	YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDC(Peg-2K)LSKN-NH2	5316	>95%	16
Аналог 9 (C16)	YaDAIFTASYROVLAC(Peg-2K)LSAROALQDILSKN-NH2	5301	>95%	17
Аналог 10 (C9)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILS(Har)-NH2	5278	>95%	18
Аналог 11 (C9,31)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSRNC(Peg-2K)-NH2	7474.0	>95%	19
Аналог 12 (C9,28)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)RN-NH2	7386.9	>95%	20
Аналог 13 (C9,24)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSRN-NH2	7345.9	>95%	21
Аналог 14 (C9,22)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSRN-NH2	7402.9	>95%	22
Аналог 15 (C9)	YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALQDILS(Har)-NH2	8270.8	>95%	23
Аналог 16 (C9)	YaDAIFTAC(Peg-40K)YROVLAQLSAROALQDILS(Har)-NH2	43270.8	>95%	24

¹a=D-аланин; O=L-орнитин; Har=L-гомоаргинин; C(Peg-2K) представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ размером примерно 2 кДа; C(Peg-5K) представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ размером, меньшим или равным примерно 5 кДа; C(Peg-40K) представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ размером примерно 40 кДа.

Пример 2: Определение активности агониста пегилированных пептидов GHRH в клеточном анализе Hit Hunter® (DiscoveRx^ТМ)

DiscoveRx^ТМ разработала панель клеточных линий, стабильно экспрессирующих немаркированные GPCR, которые передают сигналы через цАМФ. цАМФ анализ Hit Hunter® позволяет отслеживать активацию GPCR через сигналы вторичного мессенджера Gs в формате анализа гомогенного препарата без визуализации, используя технологию, разработанную DiscoveRx^ТМ, названную комплементацией фрагментов ферментов (EFC), с β-галактозидазой (β-Gal) в качестве функционального репортера.

цАМФ Hunter^ТМ клеточные линии размножали из линий, хранившихся в морозильной камере, согласно стандартным процедурам. Клетки высевали в общем объеме 20 мкл в 384-луночные микропланшеты с белыми стенками и инкубировали при 37°С в течение соответствующего времени перед тестированием. Модуляцию цАМФ определяли с помощью анализа HitHunter^ТМ цАМФ XS+ компании DiscoveRx^ТМ. Для определения агониста клетки инкубировали с образцом для индукции ответа. Из клеток аспирировали среду и заменяли ее 15 мкл 2:1 HBSS/10 мМ Hepes:цАМФ XS+ Ab реагент. Промежуточное разбавление образцов исходных веществ проводили для получения образца, разбавленного в 4 раза (4х) в буфере для анализа. 4,5 мкл 4х образца добавляли в клетки и инкубировали при 37°С или комнатной температуре в течение 30 или 60 минут. Концентрация несущей среды составляла 1%. После инкубации соответствующего соединения генерировали аналитический сигнал путем инкубации с 20 мкл цАМФ XS+ ED/CL коктейль для лизиса в течение одного часа с последующей инкубацией с 20 мкл цАМФ XS+ EA реагента в течение трех часов при комнатной температуре. Микропланшеты считывали после генерации сигнала с помощью прибора PerkinElmer Envision^ТМ для обнаружения хемилюминесцентного сигнала. Активность соединения анализировали с помощью пакета для анализа данных CBIS (ChemInnovation, CA). Для анализов в режиме агонистов Gs процентную активность рассчитывали по следующей формуле: % Активности=100% x (среднее значение RLU для тестируемого образца - среднее значение RLU для контрольной несущей среды)/(среднее значение RLU для контрольного MAX - среднее значение RLU для контрольной несущей среды). Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2: Активность (% EC50 по сравнению с исходным уровнем) и эффективность (максимальный ответ (МАХ) [%] по сравнению с исходным уровнем) аналогов GHRH в клеточном анализе, специфическом в отношении человеческого рецептора GHRH

Название	SEQ ID No:	EC50 (нМ)	Активность (%)	Max ответ
GHRH1-29	25	0,36	100	104,41
Аналог 1 (C28)	9	0,29	125	105,09
Аналог 2 (C24)	10	0,28	130	107,97
Аналог 3 (C22)	11	0,25	143	100,17
Аналог 4 (C19)	12	1,32	27	94,913
Аналог 5 (C15)	13	1,38	26	106,95
Аналог 6 (C9)	14	0,29	123	101,87
Аналог 7 (C8)	15	0,69	52	108,48
Аналог 8 (C26)	16	0,98	37	105,6
Аналог 9 (C16)	17	0,92	39	107,12

Результаты показали, что несколько замен Cys-ПЭГ (2 кДа) в положениях 8, 15, 16, 19 и 26 не являются допустимыми, и такие пептиды имеют пониженную активность (например, аналоги 7, 5, 9, 4 и 8, соответственно). Особенно заметным этот неблагоприятный эффект был в N-концевой половине пептида. Удивительным оказалось то, что присоединение ПЭГ 2 кДа в положении 9 (серин 9 в нативной последовательности GHRH) в N-концевой части оказалось не просто допустимым, оно приводило к усилению биологической активности пептида (аналог 6) на 123%. ПЭГилирование в положении 8 (Asn в нативной последовательности GHRH), напротив, оказалось не допустимым (аналог 7).

ПЭГилирование в положениях 22 (Leu 22 в нативном GHRH), 24 (Gln 24 в нативном GHRH) и 28 (Ser 28 в нативном GHRH) также привело к получению пептидов (аналоги 3, 2 и 1, соответственно) с повышенной биологической активностью по сравнению с нативным пептидом (143%, 130%, 125%, соответственно).

Таблица 3: Активность (% EC50 по сравнению с исходным уровнем) и эффективность (максимальный ответ (МАХ) [%] по сравнению с исходным уровнем) аналогов GHRH в клеточном анализе, специфическом в отношении человеческого рецептора GHRH

Название	SEQ ID No:	EC50 (нМ)	Активность (%)	Max ответ (%)
GHRH1-29	25	1,48	100	112,97
Аналог 10 (C9)	18	0,11	1397	96,17
Аналог 11 (C9,31)	19	0,47	314	97,17
Аналог 12 (C9,28)	20	0,36	416	101,66
Аналог 13 (C9,24)	21	0,41	361	103,49
Аналог 14 (C9,22)	22	0,73	203	97,17
Аналог 15 (C9)	23	0,22	669	94,34
Аналог 16 (C9)	24	0,74	200	93,68

В независимом эксперименте получали аналоги GHRH, содержащие цепи ПЭГ размером 2 кДа (также называемые 2K), дополнительно к 9-ому положению, в положениях 22, 24, 28 и 31, которые тестировали в клеточном анализе в отношении рецептора GHRH. Результаты показаны в таблице 3 (аналоги 14, 13, 12 и 11, соответственно). Согласно полученным результатам, дважды ПЭГилированные пептиды, при сохранении максимальной эффективности, также оказались в 2-4 раза эффективнее, чем нативный пептид.

Также была исследована допустимая длина цепи ПЭГ в 9-ом положении путем получения аналогов GHRH, содержащих цепи ПЭГ 5 кДа (также называемые 5К) и 40 кДа (также называемые 40К) (аналоги 15 и 16, соответственно). Испытания in vitro показали, что более длинные цепи ПЭГ могут быть присоединены в 9-м положении без потери биологической активности in vitro, в отличие от результатов in vivo (см. Пример 3). Однако аналог, содержащий ПЭГ 2K (аналог 10), оказался почти в 14 раз более активным, чем нативный пептид, и в 2-6 раз более активным, чем 5К и 40K ПЭГилированные пептиды GHRH (аналоги 15 и 16, соответственно).

Пример 3: Кинетика высвобождения ГР в ответ на подкожную инъекцию выбранных аналогов GHRH у крыс Sprague-Dawley

Протокол: крыс Sprague-Dawley (самки весом от 250 до 300 г) приобретали в компании Charles River Inc. Животных использовали в соответствии с протоколом Комитета по уходу за животными, а также с принципами Руководства по уходу и использованию экспериментальных животных Канадского совета по уходу за животными. Животных содержали на стандартном лабораторном рационе с циклом 12:12 свет-темнота. Их содержали группами по 4 крысы на клетку. Животных анестезировали 2,5% изофлураном. На шее делали отверстие среднего размера для обнажения сонной артерии. В сонную артерию вводили полипропиленовую трубку (PE-50) для взятия крови. После хирургического приготовления крысы получали подкожную инъекцию аналога GHRH (10-100 мкг/кг), растворенного в 20 мМ AcONa+5% маннита (рН 5). Образцы крови (400 мкл/временная точка) собирали из 2-4 животных на группу. Образцы крови собирали через каротидный катетер через 0, 10, 20, 30, 45 и 60 минут после инъекции. Кровь собирали в микропробирки, содержащие K3ЭДТА, смешивали и сразу центрифугировали при скорости 13000 об/мин в настольной центрифуге в течение 2 минут. Плазму собирали и помещали в пробирку Eppendorf^ТМ с пробкой и быстро замораживали в жидком азоте. Затем образцы хранили при -80°С до начала анализа. Определение уровней ГР выполняли, как описано ниже.

Определение уровней ГР в образцах плазмы: образцы плазмы, полученные от крыс и мышей, тщательно перемешивали и центрифугировали при 9000 об/мин в течение 2 мин при 4°С. Дозирование уровней ГР проводили с использованием набора ELISA для гормона роста крыс/мышей (Millipore^ТМ, кат. № EZRMGH-45K). Образцы супернатантов сначала разбавляли в 20 раз буфером для анализа GH методом ELISA, и 10 мкл этого разбавленного образца добавляли в планшет ELISA с 90 мкл буфера для анализа ГР методом EIA. Оставшуюся часть процедуры выполняли в соответствии с инструкциями изготовителя, и полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism^ТМ. Три пептида, содержащие цепи ПЭГ2K в 8-м, 9-м и 28-м положениях в пептиде GHRH, вводили подкожно одной дозой 0,04 мг/кг. Уровни гормона роста определяли в аликвотах крови, полученных в определенных временных точках, и отображали на графике на Фиг.1. Присоединение ПЭГ2K к С-концевой части пептида GHRH (в положении 28) сильно стимулировало секрецию ГР. Как и предполагалось, исходя из результатов по эффективности, полученных в клеточном анализе, присоединение ПЭГ2K в положении 9 (Cmax: 651 нг/мл, AUC (0-90 мин): 29075 нг/мл/90 мин), но не в положении 8 (Cmax: 397 нг/мл, AUC (0-90 мин) 15657 нг/мл/90 мин), вызывало более сильную стимуляцию секреции ГР у крыс. Эти результаты in vivo подтверждают биологические анализы in vitro, свидетельствуя о том, что 9-е положение аминокислоты в последовательности GHRH является положением, которое является допустимым для присоединения короткой цепи ПЭГ, без оказания значимого воздействия на биологическую активность пептида.

Известно, что N-концевая часть пептида GHRH погружена во внеклеточные петли и трансмембранные домены рецептора GHRH, и поэтому почти все аминокислоты в N-концевом домене участвуют в высокоаффинном связывании пептида GHRH с рецептором. Felix и др. (Felix et al., 1995) показали, что ковалентное присоединение ПЭГ (2K и 5K) к Asn8 и Lys12 (которые находятся на N-концевом домене GHRH) приводит к снижению биологической активности GHRH. Поэтому оказалось удивительным, что пептиды GHRH, ПЭГилированные ПЭГ2K в 9-й аминокислоте, полностью сохраняют биологическую активность in vitro и in vivo. Чтобы узнать, какая длина цепи ПЭГ может быть присоединена к 9-й аминокислоте без подавления биологической активности у самок крыс были синтезированы и протестированы пептиды, содержащие цепи ПЭГ 2К, 5К и 40К, согласно описанному выше протоколу. Вкратце, пептиды (0,04 мг/кг) вводили подкожно самкам крыс, и определяли уровни гормона роста по аликвотам крови, полученным от животных в определенных временных точках. Результаты представлены на Фиг. 2. Из пептидов, имеющих цепи ПЭГ длиной 5K и более, гормон роста продуцировался в значительно меньшей степени, чем из пептида, содержащего цепь ПЭГ 2K в аминокислоте в 9-м положении. Этот эксперимент показал, что цепи ПЭГ длиной более 5K, а также более короткие цепи ПЭГ, не являются допустимыми в аминокислоте GHRH в 9-м положении.

Последовательности описанных в настоящей заявке пептидов приведены в таблице 4. В таблице 4 X1, X2, X8, X9, X11, X12, X15, X18, X20, X21, X22, X24, X25, X26, X27, X28, X29, X30, C(Peg-5K, C(Peg-2K) и C(Peg-40K) являются такими, как определено в настоящей заявке; a представляет собой D-аланин, O представляет собой L-орнитин; Har представляет собой L-гомоаргинин; и Z представляет собой Lys, Arg, Har или агматин.

Таблица 4: Последовательности описанных в настоящей заявке пептидов

Название	Последовательность пептида	SEQ ID NO:
Формула (I)	X1-X2-D-A-I-F-T-X8-X9-Y-X11-X12-V-L-X15-Q-L-X18-A-X20-X21-X22-L-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30	1
Пептид C9	YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALQDILSZ	2
Пептид C22	YaDAIFTASYROVLAQLSAROC(Peg-5K)LQDILSZ	3
Пептид C24	YaDAIFTASYROVLAQLSAROALC(Peg-5K)DILSZ	4
Пептид C28	YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDILC(Peg-5K)Z	5
Пептид C(9,22)	YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROC(Peg-5K)LQDILSZ	6
Пептид C(9,24)	YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALC(Peg-5K)DILSZ	7
Пептид C(9,28)	YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-5K)Z	8
Аналог 1 (C28)	YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)KN-NH2	9
Аналог 2 (C24)	YaDAIFTASYROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSKN-NH2	10
Аналог 3 (C22)	YaDAIFTASYROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSKN-NH2	11
Аналог 4 (C19)	YaDAIFTASYROVLAQLSC(Peg-2K)ROALQDILSKN-NH2	12
Аналог 5 (C15)	YaDAIFTASYROVLC(Peg-2K)QLSAROALQDILSKN-NH2	13
Аналог 6 (C9)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSKN-NH2	14
Аналог 7 (C8)	YaDAIFTC(Peg-2K)SYROVLAQLSAROALQDILSKN-NH2	15
Аналог 8 (C26)	YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDC(Peg-2K)LSKN-NH2	16
Аналог 9 (C16)	YaDAIFTASYROVLAC(Peg-2K)LSAROALQDILSKN-NH2	17
Аналог 10 (C9)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILS-(Har)-NH2	18
Аналог 11 (C9,31)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSRNC(Peg-2K)-NH2	19
Аналог 12 (C9,28)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)RN-NH2	20
Аналог 13 (C9,24)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSRN-NH2	21
Аналог 14 (C9,22)	YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSRN-NH2	22
Аналог 15 (C9)	YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALQDILS(Har)-NH2	23
Аналог 16 (C9)	YaDAIFTAC(Peg-40K)YROVLAQLSAROALQDILS(Har)-NH2	24
Человеческий GHRH1-29	YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR-NH2	25
Человеческий GHRH1-44	YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL-NH2	26
Человеческий GHRH30-44	QQGESNQERGARARL	27

Изложенное выше является иллюстрацией настоящего изобретения и не должно быть истолковано как его ограничение. Хотя настоящее изобретение описано выше посредством конкретных вариантов его осуществления, специалисты в данной области легко поймут, что в иллюстративных вариантах возможны многочисленные модификации без существенного отклонения от сути и преимуществ настоящего изобретения. Соответственно, все такие модификации включены в объем настоящего изобретения, определенного формулой изобретения. В формуле изобретения слово "содержащий" используется как открытый термин, по существу эквивалентный фразе "включающий, без ограничения". Формы единственного числа включают соответствующие ссылки на множественное число, если из контекста в явном виде не следует иное.

Литература

Baca et al., J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1887, 1995.

Bokser L et al. 1990. Life Sci. 46(14):999-1005.

Campbell RM et al. 1991. Peptides. 12(3):569-574.

Campbell RM et al. 1994. Peptides. 15(3):489-495.

Campbell, RM et al. 1992. Peptides. 13(4):787-793.

Campbell, RM et al. 1997. J Pept Res. 49(6):527-537.

Cervini LA et al. 1998. J Med Chem. 41(5):717-727.

Digilio G et al. 2003. J. Am. Chem. Soc. 125(12):3458-70.

Esposito P et al. 2003. Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1279-91.

Felix, AM et al. 1988. Int J Pept Res. 32(6):441-454.

Felix, AM et al. 1995. Int J Pept Protein Res. 46(3-4):253-64.

Freidman AR et al. 1991. Int J Pept Res. 37(1):14-20.

Frohman et al. 1986b. J Clin Invest.78(4):906-13.

Frohman LA et al. 1986a. Endocr. Rev. 7:223-233.

Frohman LA et al. 1989. J Clin Invest. 83(5):1533-40.

Gao, et al. 1994. Life Science 54:247-252.

Gololobov, G et al. 1998. J Pharmacol. Expt Therapeut. 285(2):753-758)

Hodate K et al. 1986. Endocrinol. Jpn. 33(4):519-525.

Kovacs M et al. 1988. Life Sci. 42(1):27-35.

Kubiak, TM et al. 1993. J Med Chem. 36(7):888-897.

Ling N, et al. 1984b. Biochem. Biophys. Res. Commun. 122(1):304-10.

Ling N. et al. 1984a. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123(2):854-861.

Liu and Tam, J. Am. Chem. Soc. 116:4149-4153, 1994a.

Liu and Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6584-6588, 1994b.

Liu et al., Tetrahedron Lett. 37:933-936, 1996.

Lu YA et al. 1993, Pept. Res. 6(3):140-6.

Lu YA et al. 1994, Int. J. Peptide Protein Res. 43(2):127-38.

Murphy WA et al. 1988. J Pept Res. 1(1):36-41.

Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092, 1985.

Sato, K et al. 1987. Biochem. Biophys. Res. Commun. 149(2):531-7;

Sato, K et al. 1990. Biochem. Biophys. Res. Commun. 167(1):360-366.

Schnolzer and Kent, Science 256: 221-225, 1992.

Tam et al., Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-216, 1995.

Yamashiro and Li, Int. J. Peptide Protein Res. 31:322-334, 1988).

Youn, YS and Lee, KC 2007. Bioconjug. Chem. 18(2):500-6.

Zarandi, M et al. 1990. Int J Pept Res. 36(6):499-505.

Zarandi, M et al. 1992. Int J Pept Res. 39(3):211-217.

Zarandi, M et al. 1994. Proc Natl Acad Sci USA. 91(25):12298-12302.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> ГРИФФОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ ИНК.

Peri, Krishna G.

<120> ПЭГИЛИРОВАННЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПЕПТИДЫ И ИХ

ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 43370-003

<140> 15/490,618

<141> 2017-04-18

<150> US 62/324,600

<151> 2016-04-19

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Tyr, His, N-метил Тирозин, или Дезамино Tyr

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой Ala, D-Ala, Ser, или альфа-аминоизомасляная кислота (Aib)

<220>

<221> misc_признак

<222> (8)..(8)

<223> Xaa в положении 8 представляет собой Asn, Asp, Ala, Gln, Ser или Aib

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Ser, Asp, Ala, или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (11)..(11)

<223> Xaa в положении 11 представляет собой Arg или L-гомоаргинин (Har)

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой Lys или L-орнитин (Orn);

<220>

<221> misc_признак

<222> (15)..(15)

<223> Xaa в положении 15 представляет собой Gly или Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (18)..(18)

<223> Xaa в положении 18 представляет собой Ser или Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (20)..(20)

<223> Xaa в положении 20 представляет собой Arg или Har

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой Lys или Orn

<220>

<221> misc_признак

<222> (22)..(22)

<223> Xaa в положении 22 представляет собой Leu, Val, Ala, или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (24)..(24)

<223> Xaa в положении 24 представляет собой Gln или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (25)..(25)

<223> Xaa в положении 25 представляет собой Asp или Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (26)..(26)

<223> Xaa в положении 26 представляет собой Ile или Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (27)..(27)

<223> Xaa в положении 27 представляет собой Met, Leu или Норлейцин

<220>

<221> misc_признак

<222> (28)..(28)

<223> Xaa в положении 28 представляет собой Ser, Ala или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой Lys, Arg, Orn, Har или Агматин

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn-NH2 или NH2 группу

<400> 1

Xaa Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Val Leu Xaa Gln

1. 5 10 15

Leu Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25 30

<210> 2

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой Lys, Arg, L-гомоаргинин или Агматин

<400> 2

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ser Xaa

20 25

<210> 3

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (22)..(22)

<223> Xaa в положении 22 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой Lys, Arg, L-гомоаргинин или Агматин

<400> 3

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Xaa Leu Gln Asp Ile Leu Ser Xaa

20 25

<210> 4

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (24)..(24)

<223> Xaa в положении 24 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой Lys, Arg, L-гомоаргинин или Агматин

<400> 4

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Xaa Asp Ile Leu Ser Xaa

20 25

<210> 5

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (28)..(28)

<223> Xaa в положении 28 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой Lys, Arg, L-гомоаргинин или Агматин

<400> 5

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Xaa Xaa

20 25

<210> 6

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (22)..(22)

<223> Xaa в положении 22 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой Lys, Arg, L-гомоаргинин или Агматин

<400> 6

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Xaa Leu Gln Asp Ile Leu Ser Xaa

20 25

<210> 7

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (24)..(24)

<223> Xaa в положении 24 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой Lys, Arg, L-гомоаргинин или Агматин

<400> 7

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Xaa Asp Ile Leu Ser Xaa

20 25

<210> 8

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (28)..(28)

<223> Xaa в положении 28 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой Lys, Arg, L-гомоаргинин или Агматин

<400> 8

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Xaa Xaa

20 25

<210> 9

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (28)..(28)

<223> Xaa в положении 28 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 9

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Xaa Lys Xaa

20 25 30

<210> 10

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (24)..(24)

<223> Xaa в положении 24 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 10

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Xaa Asp Ile Leu Ser Lys Xaa

20 25 30

<210> 11

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (22)..(22)

<223> Xaa в положении 22 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 11

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Xaa Leu Gln Asp Ile Leu Ser Lys Xaa

20 25 30

<210> 12

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (19)..(19)

<223> Xaa в положении 19 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 12

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Xaa Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ser Lys Xaa

20 25 30

<210> 13

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (15)..(15)

<223> Xaa в положении 15 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 13

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Xaa Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ser Lys Xaa

20 25 30

<210> 14

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 14

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ser Lys Xaa

20 25 30

<210> 15

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (8)..(8)

<223> Xaa в положении 8 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 15

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ser Lys Xaa

20 25 30

<210> 16

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (26)..(26)

<223> Xaa в положении 26 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 16

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Xaa Leu Ser Lys Xaa

20 25 30

<210> 17

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (16)..(16)

<223> Xaa в положении 16 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 17

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Ser Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Xaa

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ser Lys Xaa

20 25 30

<210> 18

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой L-гомоаргинин, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 18

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ser Xaa

20 25

<210> 19

<211> 31

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (31)..(31)

<223> Xaa в положении 31 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа и модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 19

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ser Arg Asn Xaa

20 25 30

<210> 20

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (28)..(28)

<223> Xaa в положении 28 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 20

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Xaa Arg Xaa

20 25 30

<210> 21

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (24)..(24)

<223> Xaa в положении 24 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 21

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Xaa Asp Ile Leu Ser Arg Xaa

20 25 30

<210> 22

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (22)..(22)

<223> Xaa в положении 22 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 2 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (30)..(30)

<223> Xaa в положении 30 представляет собой Asn, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 22

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Xaa Leu Gln Asp Ile Leu Ser Arg Xaa

20 25 30

<210> 23

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой L-гомоаргинин, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 23

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ser Xaa

20 25

<210> 24

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой D-Ala

<220>

<221> misc_признак

<222> (9)..(9)

<223> Xaa в положении 9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 40 кДа

<220>

<221> misc_признак

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (21)..(21)

<223> Xaa в положении 21 представляет собой L-орнитин

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой L-гомоаргинин, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 24

Tyr Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Ala Xaa Tyr Arg Xaa Val Leu Ala Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Xaa Ala Leu Gln Asp Ile Leu Ser Xaa

20 25

<210> 25

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (29)..(29)

<223> Xaa в положении 29 представляет собой Arg, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 25

Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Xaa

20 25

<210> 26

<211> 44

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<220>

<221> misc_признак

<222> (44)..(44)

<223> Xaa в положении 44 представляет собой Leu, модифицированный на карбоксильном конеце NH2 группой

<400> 26

Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln

1. 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly

20 25 30

Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Xaa

35 40

<210> 27

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственный пептид

<400> 27

Gln Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu

1. 5 10 15

<---

1. Аналог гормона высвобождения гормона роста (GHRH), содержащий пептид, имеющий последовательность, приведенную в формуле (I) (SEQ ID NO: 1):

X1-X2-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-X8-X9-Tyr-X11-X12-Val-Leu-X15-Gln-Leu-X18-Ala-X20-X21-X22-Leu-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30

(I)

где:

X1 представляет собой Tyr, His, N-метил Tyr или дезамино-Tyr;

X2 представляет собой Ala, D-Ala, Ser или альфа-аминоизомасляную кислоту (Aib);

X8 представляет собой Asn, Asp, Ala, Gln, Ser или Aib;

X9 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа;

X11 представляет собой Arg или L-гомоаргинин (Har);

X12 представляет собой Lys или Orn;

X15 представляет собой Gly или Ala;

X18 представляет собой Ser или Ala;

X20 представляет собой Arg или Har;

X21 представляет собой Lys или Orn;

X22 представляет собой Leu, Val, Ala или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа;

X24 представляет собой Gln или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа;

X25 представляет собой Asp или Ala;

X26 представляет собой Ile или Ala;

X27 представляет собой Met, Leu или норлейцин;

X28 представляет собой Ser, Ala или Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа;

X29 представляет собой Lys, Arg, Orn, Har или агматин; и

X30 представляет собой NH₂ группу или Asn-NH₂;

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Аналог GHRH или его соль по п. 1, где по меньшей мере один из X22, X24 и X28 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа.

3. Аналог GHRH или его соль по п. 1, где X22 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа.

4. Аналог GHRH или его соль по любому одному из пп. 1 и 3, где X24 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа.

5. Аналог GHRH или его соль по любому одному из пп. 1, 3 и 4, где X28 представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа.

6. Аналог GHRH или его соль по п. 1, где полимер ПЭГ с молекулярной массой, меньшей или равной 5 кДа, представляет собой полимер ПЭГ с молекулярной массой 2 кДа.

7. Аналог GHRH или его соль по п. 1 или 2, где указанный аналог GHRH или его соль представляет собой:

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSKN-NH₂ (SEQ ID NO: 14);

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILS-(Har)-NH₂ (SEQ ID NO:18);

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)RN-NH₂ (SEQ ID NO: 20);

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSRN-NH₂ (SEQ ID NO: 21); или

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSRN-NH₂ (SEQ ID NO: 22);

где a представляет собой D-Ala, O представляет собой L-орнитин (Orn), Har представляет собой L-гомоаргинин, и C(Peg-2K) представляет собой Cys, конъюгированный с полимером ПЭГ с молекулярной массой 2 кДа;

или его фармацевтически приемлемая соль.

8. Аналог GHRH или его соль по п. 7, где указанный аналог GHRH или его соль представляет собой:

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSKN-NH₂ (SEQ ID NO: 14).

9. Аналог GHRH или его соль по п. 7, где указанный аналог GHRH или его соль представляет собой:

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILS-(Har)-NH₂ (SEQ ID NO:18).

10. Аналог GHRH или его соль по п. 7, где указанный аналог GHRH или его соль представляет собой:

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)RN-NH₂ (SEQ ID NO: 20).

11. Аналог GHRH или его соль по п. 7, где указанный аналог GHRH или его соль представляет собой:

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSRN-NH₂ (SEQ ID NO: 21).

12. Аналог GHRH или его соль по п. 7, где указанный аналог GHRH или его соль представляет собой:

YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSRN-NH₂ (SEQ ID NO: 22).

13. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, связанного с дефицитом ГР, содержащая терапевтически эффективное количество аналога GHRH или его соли по любому одному из пп. 1-12 и один или более фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей и/или разбавителей.

14. Применение аналога GHRH или его соли по любому одному из пп. 1-12 для индукции секреции гормона роста у субъекта.

15. Применение фармацевтической композиции по п. 13 для индукции секреции гормона роста у субъекта.

16. Применение аналога GHRH или его соли по любому одному из пп. 1-12 или фармацевтической композиции по п. 13 для получения лекарственного средства для индукции секреции гормона роста у субъекта.

17. Применение эффективного количества аналога GHRH или его соли по любому одному из пп. 1-12 или фармацевтической композиции по п. 13 для лечения, профилактики состояния, связанного с дефицитом ГР, у нуждающегося в этом субъекта.

18. Применение эффективного количества аналога GHRH или его соли по любому одному из пп. 1-12 или фармацевтической композиции по п. 13 для диагностики состояния, связанного с дефицитом ГР, у нуждающегося в этом субъекта.

19. Применение по любому одному из пп. 14-18, где указанный аналог GHRH или его соль предназначена для введения в суточной дозе от 0,1 мг до 10 мг.

20. Применение по любому одному из пп. 14, 17 и 19, где указанный аналог GHRH или его соль вводят внутривенным, пероральным, трансдермальным, подкожным мукозальным, внутримышечным, интраназальным способом или путем легочной ингаляции.