Способ для производства d-псикозы из боратного комплекса d-псикозы с использованием хроматографии и содержащая d-псикозу композиция

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ производства D–псикозы, содержащий: стадию помещения композиции, содержащей боратный комплекс D–псикозы, в хроматографическую систему, содержащую двухвалентные катионы; и

стадию разделения композиции, содержащей боратный комплекс D–псикозы, на содержащую D–псикозу фракцию (i) и содержащую борат фракцию (ii), где двухвалентные катионы представляют собой один или более из ионов кальция, ионов бария и ионов стронция. Изобретение позволяет получать D–псикозу с высокой степенью эффективности. 11 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 2 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящая патентная заявка относится к способу для производства D-псикозы из боратного комплекса D-псикозы с использованием хроматографии, а также к композиции, содержащей D-псикозу.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] D-псикоза представляет собой естественный сахар, присутствующий в очень небольшом количестве во фруктах, таких как инжир и изюм, и является моносахаридом, имеющим сладость, равную 70% сладости сахара. Известно, что в отличие от фруктозы или сахара, D-псикоза не метаболизируется в человеческом теле, и таким образом почти не содержит калорий, не влияет на гипергликемию, и является полезной для зубов благодаря своим некариесогенным и антикариесогенным свойствам.

[0003] Таким образом, существует растущий интерес к D-псикозе в качестве подсластителя, но из-за редкого присутствия D-псикозы в природе существует необходимость в разработке технологии, которая бы эффективно производила D-псикозу для применения в пищевой промышленности.

[0004] Таким образом, в качестве способа получения D-псикозы авторы настоящего изобретения сообщили о способе экономичного получения D-псикозы путем изомеризации глюкозы во фруктозу и взаимодействия фруктозы с иммобилизованными бактериальными клетками, которые продуцируют фермент эпимеризации D-псикозы (корейская патентная публикация №10-2011-0035805, в дальнейшем упоминаемая как «способ ферментативного превращения»), и известно, что использование бората в таком способе ферментативного превращения значительно увеличивает коэффициент конверсии D-псикозы (Process Biochemistry 44 (2009) 22-828, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, May 2008, p. 3008-3013).

[0005] Однако для применения способа ферментативного превращения с использованием бората для промышленного производства необходимо разработать процесс с учетом экономической целесообразности, который позволял бы отделять, собирать и повторно использовать бората, используемый в способе ферментативного превращения. Кроме того, поскольку ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) рекомендует, чтобы содержание бора в питьевой воде составляло 0,5 частей на миллион или ниже, существует потребность в удалении бора.

[0006] Борат, используемый в способе ферментативного превращения, присутствует в форме борной кислоты (H₃BO₃) в растворе сахара, сформированном способом ферментативного превращения, и по сути не существует в ионном состоянии, потому что значение pKa бората составляет приблизительно 9, и большая часть бората присутствует в недиссоциированном состоянии в реакционном растворе ферментативного преобразования (имеющем значение pH 5-7).

[0007] Что касается обычных методик удаления бората, описаны способ, в котором борат преобразуется в полиборат путем подачи щелочного агента для доведения значения pH до 9-11, а затем выполняется обратная осмотическая фильтрация низкого давления для удаления бората (корейский патент №10-1384992), а также способ, в котором значение pH доводится до диапазона 9,0-10,5 для удаления накипи, которая снижает эффективность удаления бората, а затем выполняется обратный осмотический процесс для удаления бората (корейская патентная заявка №10-1030192). Однако жидкая псикоза, полученная способом ферментативного превращения, имеет проблемы, заключающиеся в том, что стоимость отбеливания увеличивается из-за быстрого снижения значения цвета, когда pH преобразуется в щелочной диапазон, содержание псикозы изменяется из-за реакции щелочной полимеризации, и экономическая целесообразность промышленной реализации становится низкой из-за необходимости в дополнительном процессе удаления введенного щелочного агента.

[0008] При таких обстоятельствах в результате тщательного проведения исследований по эффективному отделению и удалению бората, остающегося в псикозе, полученной методом ферментативного превращения с использованием бората, авторы настоящего изобретения завершили настоящую патентную заявку, подтвердив, что хроматография с моделируемым подвижным слоем способна эффективно отделять содержащую псикозу фракцию от фракции, содержащей фруктозу и борат.

РАСКРЫТИЕ ЗАЯВКИ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

[0009] Один аспект настоящей патентной заявки предлагает способ для производства D-псикозы, содержащий: стадию помещения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, в хроматографическую систему, содержащую двухвалентные катионы; и стадию разделения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, на содержащую D-псикозу фракцию (i) и содержащую борат фракцию (ii).

[0010] Другой аспект настоящей патентной заявки предлагает содержащую D-псикозу композицию, в которой содержание D-псикозы равно или выше 99 мас. % и ниже чем 100 мас. % по массе сухого твердого вещества, а содержание бората составляет больше 0 и ниже чем 0,5 массовых частей на миллион.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

[0011] Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

[0012] Каждое из описаний и примерных вариантов осуществления, раскрытых в настоящем документе, может быть применено к другим описаниям и примерным вариантам осуществления. Таким образом, все комбинации различных факторов, раскрытых в настоящем документе, принадлежат к области охвата настоящего изобретения. Кроме того, область охвата настоящего изобретения не должна ограничиваться конкретными описаниями, приведенными далее.

[0013] Для того, чтобы достичь цели настоящей патентной заявки, один аспект настоящей патентной заявки предлагает способ для производства D-псикозы, содержащий: стадию помещения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, в хроматографическую систему, содержащую двухвалентные катионы; и стадию разделения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, на содержащую D-псикозу фракцию (i) и содержащую борат фракцию (ii).

[0014] Кроме того, способ для производства D-псикозы в настоящей патентной заявке может дополнительно содержать перед стадией помещения стадию получения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, путем контакта D-фруктозы и бората с ферментом 3-эпимеризации D-псикозы, штаммом, экспрессирующим этот фермент, или культурой этого штамма.

[0015] Используемый в настоящем документе термин «фракционирование» в целом относится к манипуляции выделения каждого компонента или конкретной группы из различных компонентов, смеси или композиции посредством способа хроматографии и т.д. Соответственно вещество, выделенное из конкретных компонентов, полученное с помощью такой манипуляции, в настоящей патентной заявке обозначается как «фракция», чтобы отличить его от фракционирования.

[0016] Следовательно, содержащая D-псикозу фракция относится к веществу, полученному путем манипуляции хроматографического разделения композиций, содержащих боратный комплекс D-псикозы. Кроме того, содержащая борат фракция относится к той фракции среди композиций, содержащих боратный комплекс D-псикозы, которая исключает содержащую D-псикозу фракцию. В частности, разделение фракции псикозы и боратной фракции в настоящей патентной заявке может быть классифицировано как разделение после фракции, в которой количество бората и/или фруктозы максимально по содержанию сухого вещества бората и/или фруктозы, и перед фракцией, в которой количество псикозы максимально по содержанию сухого вещества псикозы во фракции. Дополнительно к этому, после фракции, в которой содержание бората и/или фруктозы является максимальным, фракции могут быть разделены после того, как чистота бората и/или фруктозы составит 80 мас. % или ниже, 15 мас. % или ниже, или 1 мас. % или ниже по сравнению с фракцией, в которой содержание фруктозы является максимальным, и перед фракцией, в которой содержание псикозы является максимальным, классификация может быть сделана до того момента, когда чистота псикозы составит 70 мас. % или ниже, 10 мас. % или ниже, 1 мас. % или ниже или 0,4 мас. % или ниже по сравнению с фракцией, в которой содержание псикозы является максимальным.

[0017]

[0018] Фермент 3-эпимеризации D-псикозы (в дальнейшем называемый «ферментом эпимеризации псикозы») в соответствии с настоящим изобретением может включать в себя, не ограничиваясь этим, любой белок, обладающий активностью эпимеризации D-фруктозы до D-псикозы, и штамм, эндогенно экспрессирующий этот белок, штамм, преобразованный для экспрессирования этого белка, культура штамма или белок, изолированный из этой культуры, может использоваться в качестве фермента эпимеризации псикозы.

[0019] Фермент 3-эпимеризации D-псикозы в соответствии с настоящим изобретением может быть ферментом эпимеризации псикозы немутантного типа, полученным из Agrobacterium tumefaciens или Kaistia granuli или их вариантов, и в частности ферментом эпимеризации псикозы, который имеет генетическую гомологию по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью аминокислот SEQ ID №: 1, 2, 3 или 4. Кроме того, следует понимать, что если последовательность аминокислот с такой гомологией обладает активностью фермента эпимеризации псикозы, эти последовательности аминокислот, некоторые из которых частично удалены, модифицированы, замещены или добавлены, должны быть включены в область охвата последовательности аминокислот настоящей патентной заявки. Более конкретно, фермент эпимеризации псикозы может иметь последовательность аминокислот SEQ ID №: 1 или 4.

[0020] Штамм по настоящему изобретению может представлять собой, не ограничиваясь этим, Corynebacterium glutamicum KCCM11403P (корейский патент №10-1455795).

[0021] D-фруктоза по настоящей патентной заявке может быть произведена путем гидролиза сахарозы или изомеризации глюкозы. Таким образом, массовое производство псикозы возможно путем производства D-псикозы с высоким выходом с использованием обобщенного и недорогого сырья, такого как фруктоза, сахароза и глюкоза. Кроме того, борат представляет собой соль, в которой атом водорода борной кислоты замещен металлическим элементом, и коммерчески доступный продукт может использоваться в том виде, как он есть.

[0022] Дополнительно, способ настоящей патентной заявки для производства D-псикозы может дополнительно содержать стадию удаления ионов металлов путем пропускания раствора сахара через фармацевтическое устройство ионного обмена типа регенерации (например, устройство ионного обмена с двумя слоями и тремя колонками, или устройство ионного обмена с двумя слоями и двумя колонками). Стадия удаления ионов металлов может дополнительно включаться после стадии получения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, и/или перед стадией помещения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, в хроматографическую систему, содержащую двухвалентные катионы.

[0023] Композиция по настоящей патентной заявке, содержащая боратный комплекс D-псикозы, может иметь содержание бората меньше чем 25 мас. % по массе сухого вещества. В частности, композиция по настоящей патентной заявке может иметь содержание бората 6,25-25 мас. % или 6,25-21,05 мас. % по массе сухого вещества.

[0024] В соответствии с настоящей патентной заявкой, фракция, содержащая D-псикозу, может иметь содержание бората меньше чем 0,5 массовых частей на миллион по массе сухого вещества. В частности, содержащая D-псикозу фракция может иметь содержание бората 0,1-0,45 массовых частей на миллион, 0,05-0,45 массовых частей на миллион, 0,1-0,4 массовых частей на миллион, 0,05-0,39 массовых частей на миллион, 0,1-0,39 массовых частей на миллион, или 0,05-0,35 массовых частей на миллион по массе сухого вещества.

[0025] В соответствии с настоящей патентной заявкой, фракция, содержащая D-псикозу, может иметь содержание D-псикозы 85 мас. % или больше по массе сухого вещества. В частности, содержащая D-псикозу фракция может иметь содержание D-псикозы 85-99,9 мас. %, 90-99,9 мас. %, 90-99,5 мас. %, 91-99,9 мас. %, 91-99,5 мас. %, 98,0-99,9 мас. %, 98,0-99,5 мас. %, 99,0-99,9 мас. % или 99,0-99,5 мас. % по массе сухого вещества.

[0026] Кроме того, в соответствии с настоящей патентной заявкой содержащая D-псикозу фракция может содержать D-фруктозу, и в частности может иметь содержание D-фруктозы 10 мас. % или меньше, более конкретно 0,1-9,9 мас. %, 0,1-9,5 мас. %, 0,2-9,5 мас. %, 0,1-9 мас. %, 0,1-5 мас. %, 0,1-2 мас. % или 0,1-1 мас. % по массе сухого вещества.

[0027] В соответствии с настоящей патентной заявкой хроматографическая система представляет собой хроматографическую систему с моделируемым подвижным слоем (SMB) и может содержать столбчатую форму, заполненную катионообменной смолой. Такой двухвалентный катион может быть ионом кальция (Ca²⁺), ионом бария (Ba²⁺), ионом стронция (Sr²⁺) и т.д., и в частности может быть ионом кальция.

[0028] Кроме того, в соответствии с настоящей патентной заявкой хроматографическая система с моделируемым подвижным слоем может содержать 4 или более колонок. Дополнительно к этому, хроматографическая система с моделируемым подвижным слоем по настоящей патентной заявке может выполнять элюцию водой с температурой 50-70°C. В частности, элюция может выполняться водой с температурой 55-65°C или 58-62°C.

[0029] Кроме того, в соответствии с настоящей патентной заявкой композиция, содержащая боратный комплекс D-псикозы, может иметь значение pH 5-7, и значение pH композиции может регулироваться или поддерживаться на уровне 5-7 перед стадией помещения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, в хроматографическую систему, содержащую двухвалентные катионы. За счет значения pH композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, равного 5-7, могут быть предотвращены такие явления, как окрашивание при разложении D-псикозы.

[0030] Кроме того, в соответствии с настоящей патентной заявкой может быть дополнительно включена стадия удаления небольшого количества оставшегося бората путем пропускания содержащей D-псикозу фракции (i) через ионообменную колонку, заполненную бор-селективной ионообменной смолой.

[0031] В качестве катионообменной смолы (адсорбента), заполняющей колонку по настоящей патентной заявке, может использоваться любое вещество, которое может селективно адсорбировать бор, и в частности Amberlite IRA743 и Purolite S108 могут быть примерами, в которых группа многоатомного спирта введена в качестве функциональной группы.

[0032] Кроме того, в соответствии с настоящей патентной заявкой содержащая борат фракция (ii) может составлять 95 или более м.ч. относительно 100 м.ч. содержания бората в композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы.

[0033] Кроме того, в соответствии с настоящей патентной заявкой композиция, содержащая боратный комплекс D-псикозы, может дополнительно содержать фруктозу. В этом случае содержание бората в содержащей борат фракции (ii) может составлять 95 или более м.ч. относительно 100 м.ч. содержания бората в композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, а содержание фруктозы может составлять 95 или более м.ч. относительно 100 м.ч. содержания фруктозы в композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы.

[0034] Содержание бората и содержание фруктозы в содержащей борат фракции (ii) может представлять собой сумму содержащей D-псикозу фракции (i) и содержащей борат фракции (ii), а не массовых частей композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, и в частности содержание бората и содержание фруктозы может составлять 95 или более, 96 или более, 97 или более, 98 или более, 99 или более, 99,1 или более, или 99,5 или более м.ч., и не может превышать 100 м.ч.

[0035] Борат в содержащей борат фракции (ii) может повторно использоваться путем включения бората и фруктозы в содержащую борат фракцию (ii) в вышеупомянутых диапазонах.

[0036] В другом аспекте настоящая патентная заявка предлагает композицию, содержащую D-псикозу, в которой содержание D-псикозы составляет 85-99,9 мас. % по массе сухого вещества, а содержание бората - больше чем 0 и меньше чем 0,5 массовых частей на миллион.

[0037] Композиция, содержащая D-псикозу, содержит 10 мас. % или меньше D-фруктозы по массе сухого вещества. Кроме того, композиция, содержащая D-псикозу, представляет собой фракцию, содержащую D-псикозу, отделенную с помощью хроматографии.

[0038] Подробное описание, относящееся к этому аспекту, будет здесь опущено, поскольку описание, относящееся к вышеупомянутому способу получения D-псикозы, аналогичным образом применимо к этому аспекту.

[0039] Настоящее изобретение будет теперь просто объяснено со ссылкой на Фиг. 4, которая иллюстрирует схему производства D-псикозы. Сначала, в качестве стадии (1), фруктоза и борат смешиваются, и в качестве стадии (2) фермент 3-эпимеризации D-псикозы контактирует со смесью, полученной на стадии (1), для выполнения процесса ферментативной реакции. Затем, в качестве стадии (3), получаются D-псикоза, остаточная фруктоза и боратный комплекс D-псикозы, который является боратом, и после этого, в качестве стадии (4), фракция (i) D-псикозы и боратная фракция (ii) разделяются с использованием SMB-хроматографии. Боратная фракция (ii), полученная на стадии (4), содержит остаточную фруктозу и борат, и может таким образом использоваться повторно на стадии (1). Кроме того, как было упомянуто выше, фракция (i) D-псикозы, полученная на стадии (4), может пропускаться через ионообменную колонку, заполненную бор-селективной ионообменной смолой, чтобы дополнительно удалить небольшое количество оставшегося бората в случае необходимости.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ

[0040] Способ для отделения бората и способ для производства псикозы в настоящей патентной заявке демонстрируют эффект, при котором борат, остающийся в псикозе, которая производится способом ферментативного превращения с использованием бората, может быть эффективно отделен и удален.

[0041] Кроме того, когда способ по настоящей заявке используется для получения псикозы, фруктоза и борат, которые являются сырьем, могут быть эффективно отделены от псикозы, и таким образом обеспечивается возможность вторичной переработки сырья.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0042] Фиг. 1 представляет собой HPLC-хроматограмму для результатов преобразования D-фруктозы в D-псикозу, соответственно получаемую, когда борат добавляется (экспериментальный пример 1) и не добавляется (сравнительный пример 1) к реакции фермента эпимеризации D-псикозы примера 1 настоящей патентной заявки.

[0043] Фиг. 2 представляет собой HPLC-хроматограмму фракции D-псикозы, фракционированной с помощью хроматографии с моделируемым подвижным слоем (SMB) по настоящей патентной заявке.

[0044] Фиг. 3 представляет собой HPLC-хроматограмму боратной фракции, фракционированной с помощью хроматографии с моделируемым подвижным слоем (SMB) по настоящей патентной заявке.

[0045] Фиг. 4 представляет собой схему производства D-псикозы по настоящей патентной заявке.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0046] Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на сопутствующие примеры. Однако эти примеры предназначены только для объяснения настоящей заявки посредством примера, и таким образом область охвата настоящей патентной заявки не ограничивается этими примерами. Детали, не включенные в настоящий документ, являются общеизвестными специалистам в данной области техники на момент подачи настоящей патентной заявки, и поэтому их описание будет опущено.

[0047]

[0048] Пример 1: Производство D-псикозы c использованием бората и способа ферментативного превращения

[0049] Реакция ферментативного превращения выполнялась с использованием Corynebacterium glutamicum (KCCM11403P), которая является рекомбинантным штаммом, о котором известно, что он экспрессирует вариант псикозоэпимеразы, получаемой из Agrobacterium tumefaciens (корейский патент №10-1455759). 0,1 М фруктозы было растворено в воде, и к ней было добавлено 0,05 М бората и 10 мМ MnCl₂ (экспериментальный пример 1), или только 10 мМ MnCl₂ (сравнительный пример 1), чтобы приготовить сырье для реакции ферментативного превращения. Затем штамм (20 мас. %) был добавлен к сырью, и реакция выполнялась в течение 3 час при значении pH 8,0 и температуре 55°C.

[0050] После этого коэффициент конверсии был вычислен путем сравнения значений площади пика субстрата (D-фруктозы) фермента эпимеризации псикозы и продукта (псикозы) с помощью анализа HPLC, и анализ HPLC выполнялся при таких условиях, что образец вводился в колонку (BP-100 Ca²⁺ углеводная колонка) с температурой 80°C, и дистиллированная вода в качестве подвижной фазы пропускалась через колонку со скоростью 0,6 мл/мин.

[0051] В результате коэффициент конверсии в D-псикозу составил 25% для сравнительного примера 1 и 56% для экспериментального примера 1. Таким образом было подтверждено, что коэффициент конверсии экспериментального примера 1 составил 224% по сравнению с коэффициентом конверсии сравнительного примера 1 (см. Фиг. 1).

[0052]

[0053] Пример 2: Отделение бората

[0054] 2-1. Подтверждение отделения бората с использованием SMB-хроматографии

[0055] SMB-хроматография (с моделируемым подвижным слоем) использовалась для выделения D-псикозы, не содержащей бората, из композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы (борат, D-фруктоза и D-псикоза, упоминаемой в дальнейшем как «питание»). SMB-хроматография использовала усовершенствованный инструмент с имитацией системы с подвижным слоем (Organo, Япония), который включает в себя последовательно соединенные шесть колонок (каждая высотой 1,2 м и диаметром 4,3 см), насос питания, насос рециркуляции, насос элюента, теплообменник и клапан для управления скоростью потока. Условия для выполнения SMB-хроматографии показаны в нижеприведенной Таблице 1.

[0056] [Таблица 1]

Питание	Смесь фруктозы, псикозы и бората
Концентрация питания	60 мас. %
Катионообменная смола (адсорбент) в колонках	Amberlite (Amberlite CR-1310; типа Ca)
Размер и количество колонок	43 мм × 1200 мм * 6 колонок
Десорбент (элюент)	O
Скорость потока	2,49 м/час
Температура элюента	60°C

[0057] Кроме того, вместо ионов кальция использовались ионы бария (Ba²⁺) и ионы стронция (Sr²⁺) в качестве двухвалентных катионов, и эксперимент с использованием ионов натрия (Na⁺) в качестве одновалентных катионов был дополнительно выполнен в качестве контрольной группы. В результате было подтверждено, что количество бората, остающегося во фракции псикозы в случае использования ионов кальция, ионов стронция и ионов бария, составляет 0,2 частей на миллион, 0,3 частей на миллион и 0,4 частей на миллион соответственно, что ниже, чем стандарт содержания бора в питьевой воде, рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения, который составляет 0,5 частей на миллион, и коэффициент удаления составил 99,999% мас. % сухого вещества. С другой стороны, было подтверждено, что доля псикозы в случае использования ионов натрия составляет 62100 частей на миллион, что является значительно более высоким значением, чем 0,5 частей на миллион. Кроме того, чистота псикозы во фракциях псикозы составила 99,350 мас. % сухого вещества (Фиг. 3), 99,150 мас. % сухого вещества и 90,850 мас. % сухого вещества, соответственно. Кроме того, по сравнению с питанием, коэффициент извлечения бората составил приблизительно 100% для боратной фракции в случае использования ионов кальция и ионов стронция, а коэффициент извлечения фруктозы составил 99,264%, что является высоким коэффициентом извлечения (содержание бората в боратной фракции / (фракция псикозы+боратная фракция)*100). Таким образом фруктоза и борат, которые являются сырьем, используемым для производства псикозы, могут быть разделены с получением псикозы высокой чистоты путем использования SMB-хроматографии (см. Таблицу 2 и Фиг. 3), и поэтому оказалось возможным подтвердить, что фруктоза и борат, остающиеся после производства псикозы, могут использоваться повторно (Фиг. 4).

[0058] [Таблица 2]

Amberlite (Amberlite CR-1310; типа Ca)	Питание	Фракция псикозы	Фракция бората
Борат (DS, мас. %)	12,050	0,00002	12,050
D-псикоза (DS, мас. %)	49,255	99,350	0,280
D-фруктоза (DS, мас. %)	38,695	0,650	87,670
Amberlite (Amberlite CR-1310; типа Ca)	Питание	Фракция псикозы	Фракция бората
Борат (DS, мас. %)	12,050	0,00003	12,050
D-псикоза (DS, мас. %)	49,255	99,150	0,350
D-фруктоза (DS, мас. %)	38,695	0,850	87,600
Amberlite (Amberlite CR-1310; типа Ca)	Питание	Фракция псикозы	Фракция бората
Борат (DS, мас. %)	12,050	0,00004	12,050
D-псикоза (DS, мас. %)	49,255	90,850	8,750
D-фруктоза (DS, мас. %)	38,695	9,150	79,200
Amberlite (Amberlite CR-1310; типа Ca)	Питание	Фракция псикозы	Фракция бората
Борат (DS, мас. %)	12,050	6,210	8,870
D-псикоза (DS, мас. %)	49,255	55,850	37,280
D-фруктоза (DS, мас. %)	38,695	37,940	53,850

[0059] *DS: Сухое твердое вещество

[0060] 2-2. Подтверждение содержания бората, разделяемого SMB-хроматографией

[0061] Чистота псикозы во фракции псикозы составляла 99 мас. % сухого вещества или выше и рекомендация Всемирной организацией здравоохранения насчет концентрации бора в питьевой воде 0,5 частей на миллион или меньше было удовлетворено, в результате чего было подтверждено, что SMB-хроматография применима для такого содержания бората в питании. Содержания бората, псикозы и D-фруктозы в питании показаны в Таблице 3.

[0062] В результате было подтверждено, что когда количество добавленного бората составляло 21,05 мас. % сухого вещества или меньше, коэффициент удаления бората составлял 99,999%, количество бората, остающегося во фракции псикозы, составляло 0,5 массовых частей на миллион или меньше, и чистота псикозы составляла 99 мас. % сухого вещества или больше (см. Таблицу 3).

[0063] [Таблица 3]

	Экспериментальный пример 2	Экспериментальный пример 3	Экспериментальный пример 4	Экспериментальный пример 5	Экспериментальный пример 6	Экспериментальный пример 7
Содержание бората в питании (DS, мас. %)	0,00	6,25	11,76	16,67	21,05	25,00
Содержание фракции псикозы (DS, мас. %)	Борат	0	0,000015	0,000021	0,000032	0,000044	0,000137
	D-фруктоза	0,78	0,75	0,68	0,56	0,54	1,23
Псикоза	99,22	99,25	99,32	99,44	99,46	98,77

[0064] *DS: Сухое твердое вещество

[0065] Настоящая патентная заявка была подробно описана выше со ссылкой на конкретные особенности, и для специалиста в данной области техники будет очевидно, что это подробное описание относится только к предпочтительному варианту осуществления и не ограничивает область охвата настоящей патентной заявки. Таким образом, существенная область охвата настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Регистрационный номер заявителя или агента P18-6063

Международная заявка №

ПРИЗНАКИ ДЕПОНИРУЕМОГО МИКРООРГАНИЗМА

ИЛИ ДРУГОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

(Правило PCT 13бис)

A. Указанные ниже признаки относятся к депонируемому микроорганизму или другому биологическому материалу, упомянутому в описании на странице __ 3 __, строка __ 32_.
B. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДЕПОНИРОВАНИЯ Дополнительные депонирования идентифицируются на дополнительном листе □
Название депозитного учреждения Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM)
Адрес депозитного учреждения (включая почтовый индекс и страну) Yurim Building, Hongjenae-2ga-gil 45, Seodaemun-Gu, Seoul, 120-091, Republic of Korea
Дата депонирования 28 марта 2013 г.	Инвентарный номер KCCM11403P
C. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ (оставьте незаполненным, если это неприменимо) Эта информация продолжается на дополнительном листе □
D. УКАЗАННЫЕ ГОСУДАРСТВА, ДЛЯ КОТОРЫХ СДЕЛАНЫ ПРИЗНАКИ (если признаки предназначены не для всех указанных государств)
E. ОТДЕЛЬНЫЙ НАБОР ПРИЗНАКОВ (оставьте незаполненным, если это неприменимо)
Упомянутые ниже признаки будут впоследствии переданы Международному бюро (укажите общий характер признаков, например «Инвентарный номер депонирования»)
Только для использования принимающим офисом Этот лист был получен с международной заявкой		Только для использования Международным бюро Этот лист был получен Международным бюро:
Уполномоченное лицо	Уполномоченное лицо

Форма PCT/RO/134 (июль 1998 г.; репринт январь 2004 г.)

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION

<120> СПОСОБ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА D-ПСИКОЗЫ ИЗ БОРАТНОГО КОМПЛЕКСА

D-ПСИКОЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХРОМАТОГРАФИИ И СОДЕРЖАЩАЯ D-ПСИКОЗУ

КОМПОЗИЦИЯ

<130> P18-6063

<160> 4

<170> KopatentIn 3.0

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> Аминокислотные последовательности тройного мутанта из

3-эпимеразы D-псикозы

<400> 1

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu

35 40 45

Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Pro Asp Ala Ala

65 70 75 80

Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val

85 90 95

Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg

115 120 125

Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly

130 135 140

Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu

145 150 155 160

Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe

195 200 205

His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro

210 215 220

Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala

225 230 235 240

Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met

260 265 270

Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly

275 280 285

Gly

<210> 2

<211> 289

<212> PRT

<213> Аминокислотные последовательности двойного мутанта из

3-эпимеразы D-псикозы

<400> 2

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu

35 40 45

Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val

85 90 95

Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg

115 120 125

Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly

130 135 140

Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu

145 150 155 160

Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe

195 200 205

His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro

210 215 220

Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala

225 230 235 240

Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met

260 265 270

Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly

275 280 285

Gly

<210> 3

<211> 289

<212> PRT

<213> Аминокислотные последовательности 3-эпимеразы D-псикозы

<400> 3

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu

35 40 45

Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val

85 90 95

Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg

115 120 125

Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly

130 135 140

Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu

145 150 155 160

Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe

195 200 205

His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro

210 215 220

Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala

225 230 235 240

Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met

260 265 270

Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly

275 280 285

Gly

<210> 4

<211> 297

<212> PRT

<213> Аминокислотные последовательности 3-эпимеразы D-псикозы

из Kaistia granuli

<400> 4

Met Lys Asn Lys Leu Gly Val His Ala Gln Val Trp Val Gly Gly Trp

1 5 10 15

Ser His Ala Glu Ala Glu Arg Ala Ile Ala Ser Thr Ala Ser Leu Gly

20 25 30

Tyr Asp Tyr Ile Glu Ala Pro Ala Leu Asp Pro Ser Leu Ile Asp Ile

35 40 45

Asp Phe Thr Arg Lys Ala Leu Glu Lys His Gly Leu Gly Ile Thr Thr

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Asp Asp Ser Cys Asp Ile Ser Ser Gly Asp Pro Asp

65 70 75 80

Lys Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Leu Met Lys Val Val Ser Thr Thr

85 90 95

Arg Asp Leu Gly Gly Thr His Ile Thr Gly Ile Leu Tyr Ser Gly Phe

100 105 110

Gln Lys Tyr Phe Thr Pro Ala Thr Pro Glu Gly Val Ala Gly Ala Val

115 120 125

Glu Val Leu His His Val Ala Glu Glu Ala Ala Lys Ser Asn Ile Thr

130 135 140

Leu Gly Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Thr Asn Val Ile Asn Thr

145 150 155 160

Ala Ala Gln Gly Val Glu Leu Cys Lys Arg Val Gly Met Pro Asn Val

165 170 175

Lys Val His Leu Asp Cys Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Ala Asp Ala

180 185 190

Glu Arg Ala Ile Ile Asp Thr Gly Asp Tyr Leu Gly Tyr Phe His Thr

195 200 205

Gly Glu Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Ser Ile Asp Phe Thr

210 215 220

Arg Ile Phe Arg Gly Leu Val Lys Ala Asn Tyr Gln Gly Pro Ile Cys

225 230 235 240

Phe Glu Ser Phe Ser Ser Ala Val Ala Gly Glu Pro Leu Ser Gly Ile

245 250 255

Leu Gly Ile Trp Arg Asn Leu Trp Thr Asp Ser Thr Asp Leu Cys Arg

260 265 270

His Ala Met Gln Phe Thr Gln Ala Gln Met Gln Ala Ala Glu Gln Ala

275 280 285

Gln Ser Ile Arg Thr Gly Ala Asp Trp

290 295

<---

1. Способ производства D-псикозы, содержащий:

стадию помещения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, в хроматографическую систему, содержащую двухвалентные катионы; и

стадию разделения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, на содержащую D-псикозу фракцию (i) и содержащую борат фракцию (ii), где двухвалентные катионы представляют собой один или более из ионов кальция, ионов бария и ионов стронция.

2. Способ по п. 1, дополнительно содержащий перед стадией помещения стадию получения композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, путем контакта D-фруктозы и бората с ферментом 3-эпимеризации D-псикозы, штаммом, экспрессирующим этот фермент, или культурой этого штамма.

3. Способ по п. 2, в котором фермент 3-эпимеризации D-псикозы представляет собой фермент эпимеризации псикозы немутантного типа, полученный из Agrobacterium tumefaciens, или Kaistia granuli, или их вариантов.

4. Способ по п. 1, в котором композиция, содержащая боратный комплекс D-псикозы, имеет содержание бората меньше чем 25 мас.% по массе сухого вещества.

5. Способ по п. 1, в котором содержащая D-псикозу фракция (i) имеет содержание бората меньше чем 0,5 массовых частей на миллион по массе сухого вещества.

6. Способ по п. 1, в котором содержащая D-псикозу фракция (i) имеет содержание D-псикозы 85 мас.% или больше по массе сухого вещества.

7. Способ по п. 1, в котором хроматографическая система представляет собой хроматографическую систему с моделируемым подвижным слоем, а двухвалентные катионы включены в столбчатую форму, заполненную катионообменной смолой.

8. Способ по п. 7, в котором хроматографическая система с моделируемым подвижным слоем содержит четыре или более колонок.

9. Способ по п. 7, в котором хроматографическая система с моделируемым подвижным слоем выполняет элюцию водой с температурой 50-70°C.

10. Способ по п. 1, в котором содержание содержащей борат фракции (ii) составляет 95 или более мас.ч. относительно 100 мас.ч. содержания бората в композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы.

11. Способ по п. 1, в котором композиция, содержащая боратный комплекс D-псикозы, дополнительно содержит фруктозу.

12. Способ по п. 11, в котором содержащая борат фракция (ii) имеет содержание бората 95 или более мас.ч. относительно 100 мас.ч. содержания бората в композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы, и имеет содержание фруктозы 95 или более мас.ч. относительно 100 мас.ч. содержания фруктозы в композиции, содержащей боратный комплекс D-псикозы.